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ES2359562T3 - Agentes de unión que inhiben miostatina. - Google Patents

Agentes de unión que inhiben miostatina. Download PDF

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ES2359562T3
ES2359562T3 ES03814258T ES03814258T ES2359562T3 ES 2359562 T3 ES2359562 T3 ES 2359562T3 ES 03814258 T ES03814258 T ES 03814258T ES 03814258 T ES03814258 T ES 03814258T ES 2359562 T3 ES2359562 T3 ES 2359562T3
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Spain
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myostatin
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gly
peptide
binding
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ES03814258T
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Hq Han
Hosung Min
Thomas Charles Boone
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Original Assignee
Amgen Inc
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Abstract

Un agente de unión que comprende al menos un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.

Description

Campo de la invención
La invención se refiere a factores de crecimiento y, en particular, al factor de crecimiento miostatina y a agentes que se unen a miostatina e inhiben su actividad.
Antecedentes
La miostatina, también conocida como factor de crecimiento/diferenciación 8 (GDF-8), es un miembro de la familia del factor de crecimiento transformante-B (TGF-) que se sabe que está implicado en la regulación de la masa de músculo esquelético. La mayoría de los miembros de la familia TGF--GDF se expresan de forma no específica en muchos tipos de tejidos y ejercen una diversidad de acciones pleitrópicas. Sin embargo, la miostatina se expresa en gran medida en las células de tejido muscular esquelético en desarrollo y adulto que desempeñan un papel esencial en el control negativo del crecimiento del músculo esquelético (McPherron y col Nature (London) 387, 83-90 (1997)). Sin embargo, ciertos estudios recientes indican que pueden medirse bajos niveles de expresión de miostatina en tejidos cardiaco, adiposo y preadiposo.
La proteína miostatina está muy conservada evolutivamente (McPherron y col PNAS USA 94:12457-12461(1997)). La región C-terminal biológicamente activa de la miostatina tiene una identidad de secuencia del 100 por cien entre las secuencias de ser humano, ratón, rata, vaca, pollo y pavo. La función de la miostatina también parece estar conservada entre especies. Esto es evidente por los fenotipos de animales que tienen una mutación en el gen de la miostatina. Dos razas de vacas, la Belgian Blue ((Hanset R., Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production, eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, The Hague, The Netherlands) pág. 437-449) y la Piedmontese ((Masoero, G. & Poujardieu, B, Muscle Hypertrophy of Genetic Origin and its Use to Improve Beef Production., eds, King, J.W.G. & Menissier, F. (Nijhoff, La Haya, Países Bajos) pág. 450-459) se caracterizan por un fenotipo “double muscling” y aumento de masa muscular. Se demostró que estas razas contenían mutaciones en la región codificante del gen de la miostatina (McPherron y col. (1997) supra). Además, los ratones que contenían una deleción dirigida del gen que codifica la miostatina (Mstn) demuestran un aumento espectacular de masa muscular sin un aumento correspondiente de grasa. Los músculos individuales de los ratones Mstn-/- pesan aproximadamente de un 100 a 200 por ciento más que los de los animales de control y como resultado de una hipertrofia e hiperplasia de las fibras musculares (Zimmers y col. Science 296, 1486 (2002)).
La administración de miostatina a ciertas cepas de ratones, según se ha demostrado, crean una afección similar a los trastornos de desgaste muscular encontrados asociados con cáncer, SIDA y distrofia muscular, por ejemplo. La miostatina administrada como células CHO productoras de miostatina a ratones desnudos atímicos dio como resultado un efecto de desgaste con un alto grado de pérdida de peso, una reducción de hasta un 50% de masa del de músculo esquelético además de desgaste de grasa, e hipoglucemia severa (Zimmers y col. supra).
La pérdida de miostatina parece dar como resultado la retención de masa muscular y una reducción de la acumulación de grasa con el envejecimiento. Se han demostrado que los aumentos relacionados con la edad en la masa de tejido adiposo y la reducción de la masa muscular eran proporcionales a los niveles de miostatina, tal como se determina por una comparación de la masa de grasa y musculo en Mstn+/+ cuando se compara con ratones knockout adultos Mstn-/- (McFerron y col. J. Clin. Invest 109, 595 (2002)). Los ratones Mstn-/- mostraron una reducción de acumulación de grasa con la edad en comparación con los ratones Mstn+/+.
Además, la miostatina puede desempeñar un papel en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre y puede influir en el desarrollo de la diabetes en ciertos casos. Se sabe que, por ejemplo, la resistencia del musculo esquelético a la captación de glucosa estimulada por insulina es la manifestación conocida antes de la diabetes mellitus no dependiente de insulina (tipo 2) (Corregan y col. Endocrinology 128:1682 (1991)). Ahora se ha demostrado que la ausencia de miostatina atenúa parcialmente los fenotipos obesos y de diabetes de dos modelos de ratón, el agoutí amarillo letal (Ay) (Yen y col FASEB J. 8:479 (1994)), y obeso (Lepob/ob). La acumulación de grasa y el peso corporal total del ratón doble mutante Ay/a, Mstn-/- se redujo espectacularmente en comparación con el ratón Ay/a, Mstn+/+ (McFerron y col., (2002) supra). Además, los niveles de glucosa en sangre en los ratones Ay/a, Mstn-/- fue espectacularmente menor que en los ratones Ay/a, Mstn+/+ después de una carga de glucosa exógena, lo que indica que la ausencia de miostatina mejoraba el metabolismo de la glucosa. De forma similar, los ratones Lepob/ob Mstn-/-mostraban una reducción de acumulación de grasa en comparación con el fenotipo Lepob/ob Mstn+/+.
Por lo tanto, existen indicios considerables por los fenotipos de animales knockout y de sobreexpresión de que la miostatina puede desempeñar un papel en la contribución a varios trastornos metabólicos incluyendo trastornos que dan como resultado un desgaste muscular, diabetes, obesidad y hiperglucemia.
La publicación de Patente Internacional WO 02/09641 desvela péptidos capaces de unirse a miostatina que son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con la miostatina, incluyendo diabetes de tipo II y obesidad.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a agentes de unión que se unen a miostatina e inhiben su actividad. Los agentes de unión comprenden al menos un péptido capaz de unirse a miostatina. Los péptidos de unión a miostatina tienen una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, preferentemente una longitud comprendida entre 10 y 30 aminoácidos, y más preferentemente una longitud comprendida entre 10 y 25 aminoácidos. El péptido de unión a miostatina usado en el contexto de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos WMCPP (SEC ID Nº: 633).
El péptido de unión a miostatina comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R: b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q: b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y en el que el péptido de la presente invención tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
En una realización, los agentes de unión de la presente invención comprenden además al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fc, y pueden comprender además al menos una secuencia de ligador. El esta realización, los agentes de unión de la presente invención se construyen de forma que al menos un péptido de unión a miostatina está unido a al menos un vehículo. El péptido o los péptidos se unen directa o indirectamente a través de una secuencia de ligador al vehículo en el extremo N, extremo C o una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En está realización, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada:
(X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma;
en la que F1 es un vehículo, y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
y - (L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e -P3-(L4) -P4;
en los que P1, P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unirse a miostatina; y L1, L2, L3, y L4 son, cada uno, ligadores; y a, b, c, d , e y f son cada uno independientemente 0 ó 1,
a condición de que al menos uno de a y b sea 1 y sales fisiológicamente aceptables de los mismos.
En diversas realizaciones de agentes de unión que tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3, y P4 se seleccionan independientemente de uno o más de cualquiera de los péptidos, y cada uno comprende las secuencias de la SEC ID Nº: 353.
En una realización adicional, los agentes de unión comprenden péptidos fusionados a un dominio Fc, directa o indirectamente, proporcionando de esta manera pepticuerpos. Los pepticuerpos de la presente invención presentan una alta afinidad de unión a miostatina y pueden inhibir la actividad de la miostatina tal como se demuestra tanto in vitro usando ensayos basados en células como en animales.
La presente invención también proporciona moléculas de acido nucleico que comprenden polinucleótidos que codifican los péptidos, pepticuerpos y variantes de péptidos y pepticuerpos y derivados de la presente invención.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden uno o más agentes de unión de la presente invención.
Los agentes de unión de la presente invención inhiben la actividad de la miostatina in vitro e in vivo. Los agentes de unión de la presente invención aumentan la masa muscular magra en un animal tratado y reducen la masa de grasa como porcentaje de peso corporal del animal. Los gentes de unión a miostatina de la presente invención aumentan la resistencia muscular en modelos animales tratados.
La presente divulgación proporciona procedimientos para inhibir la actividad de la miostatina en animales que incluyen seres humanos mediante la administración de una dosificación eficaz de uno o más agentes de unión al sujeto. La presente divulgación proporciona procedimientos para aumentar la masa muscular magra en animales que incluyen seres humanos mediante la administración de una dosificación eficaz de uno o más agentes de unión. La presente divulgación proporciona además procedimientos para tratar trastornos relacionados con miostatina mediante la administración de una dosificación terapéuticamente eficaz de uno o más agentes de unión a miostatina en una composición farmacéuticamente aceptable a un sujeto. La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar trastornos de desgaste muscular que incluyen distrofia muscular, desgate muscular debido a cáncer, SIDA, artritis reumatoide, insuficiencia renal, uremia, insuficiencia cardiaca crónica, sarcopenia relacionada con la edad, reposo en cama prolongado, lesión de la médula espinal, ictus y fractura ósea. La presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar trastornos metabólicos que incluyen obesidad, diabetes, hiperglucemia y pérdida de masa ósea.
La presente invención también proporciona el uso de la invención para aumentar la masa muscular en animales destinados a alimento mediante la administración de una dosificación eficaz de uno o más agentes de unión a miostatina al animal.
La presente invención proporciona ensayos que utilizan uno o más agentes de unión a miostatina para identificar y cuantificar la miostatina en una muestra. Los ensayos pueden ser ensayos de diagnostico para medir o supervisar los niveles de miostatina en individuos con un trastorno o una enfermedad relacionada con miostatina.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la actividad de miostatina medida por actividad de luciferasa expresada (eje y) frente a concentración (eje x) para el péptido TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (Sec ID Nº: 32) y el pepticuerpo (pc) TN8-19 para determinar el valor de CI50 para cada uno usando el ensayo de luciferasa C2C12 pMARE descrito en los ejemplos proporcionados más adelante. El pepticuerpo tiene un valor de CI50 menor en comparación con el péptido.
La figura 2 es un gráfico que muestra el aumento del peso corporal total para ratones CD1 nu/nu tratados con dosificaciones crecientes del pepticuerpo 1x mTN8-19-21 durante un periodo de catorce días en comparación con ratones tratados con un control huFc, tal como se describe en el ejemplo 8.
La figura 3A muestra el aumento de la masa del músculo gastrocnemio en la necropsia de los ratones tratados en la figura 2 (ejemplo 8). La figura 3B muestra el aumento de la masa magra tal como se determina por RMN el día 0 en comparación con el día 13 del experimento descrito en el ejemplo 8.
La figura 4 muestra el aumento de la masa corporal magra para ratones CD1 nu/nu tratados con inyecciones bisemanales de dosificaciones crecientes de pepticuerpo 1x mTN8-19-32 tal como se determina por RMN el día 0 y el día 13 del experimento descrito en el ejemplo 8.
La figura 5A muestra el aumento del peso corporal para ratones CD1 nu/nu tratados con inyecciones bisemanales de 1x mTN8-19-7 en comparación con 2x mTN8-19-7 y el animal de control durante 35 días tal como se describe en el ejemplo 8. La figura 5B muestra el aumento del peso magro del esqueleto en la necropsia para las versiones 1x y 2x a 1 mg/kg y 3 mg/kg en comparación con los animales que reciben el vehículo (huFc) (controles).
La figura 6A muestra el aumento de la masa muscular magra frente al peso corporal para ratones mdx de edad avanzada tratados con pepticuerpo 1x mTN88-19-33 madurado por afinidad o vehículo huFc a 10 mg/kg por vía subcutánea un día sí y otro no durante tres meses. La figura 6B muestra la modificación de masa de grasa en comparación con el peso corporal tal como se determina por RNM para los mismos ratones después de tres meses de tratamiento.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona agentes de unión capaces de unirse a miostatina y de inhibir su actividad. Los agentes de unión a miostatina pueden usarse en ensayos para identificar, cuantificar o supervisar el nivel de miostatina en un animal. Los agentes de unión a miostatina de la presente invención reducen la actividad de la miostatina. Los agentes de unión a miostatina de la presente invención aumentan la masa muscular magra en animales, reducen la masa de grasa como porcentaje del peso corporal y aumentan la resistencia muscular. Los agentes de unión a miostatina de la presente invención pueden usarse para tratar una diversidad de trastornos metabólicos en los que interviene la miostatina, incluyendo trastornos de desgaste muscular tales como distrofias musculares, desgaste muscular debido a cáncer, SIDA, artritis reumatoide, insuficiencia renal, uremia, insuficiencia cardiaca crónica, reposo en cama prolongado, lesión de la médula espinal, ictus y sarcopenia relacionada con la edad así como otros trastornos metabólicos que incluyen diabetes, obesidad, hiperglucemia y perdida de masa ósea, mediante la administración de una dosificación terapéutica de uno o más agentes de unión en una composición farmacéuticamente aceptable a un sujeto .
Miostatina
Se sabe que la miostatina, un factor de crecimiento también conocido como GDF-8, es un regulador negativo del tejido del músculo esquelético. La miostatina se sintetiza como una preproproteína inactiva que se activa por escisión proteolítica (Zimmers y col., supra (2002)). La proteína precursora se escinde para producir un prodominio inactivo NH2-terminal y una proteína COOH-terminal de aproximadamente 109 aminoácidos en forma de un homodímero de aproximadamente 25 kDa, que es la forma madura activa (Zimmers y col, supra (2002)). Ahora se cree que el dímero maduro circula en la sangre como un complejo latente inactivo unido al propéptido (Zimmers y col., supra (2002)).
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “miostatina de longitud completa” se refiere a la secuencia de la preproproteína humana de longitud completa descrita en McPherron y col supra (1997), así como polipéptidos de longitud completa relacionados que incluyen variantes alélicas y homólogos interespecie que también se describen en McPherron y col. (1997). Tal como se usa en el presente documento, el termino “prodominio” o “propéptido” se refiere a la proteína NH2-terminal inactiva que se retira por escisión para liberar la proteína COOH-terminal activa. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “miostatina” o “miostatina madura” se refiere al polipéptido COOH-terminal maduro biológicamente activo, en forma monomérica, dimérica, multimérica u otra forma. “Miostatina” o “miostatina madura” también se refiere a fragmentos de la miostatina madura biológicamente activa, así como a polipéptidos relacionados que incluyen variantes alélicas, variantes de corte y empalme y péptidos y polipéptidos de fusión. Se ha notificado que la proteína COOH-terminal de la miostatina madura tiene una identidad de secuencia del 100% entre muchas especies que incluyen ser humano, ratón, pollo, cerdo, pavo y rata (Lee y col PNAS 98, 9306 (2001)). La miostatina puede incluir o no residuos terminales adicionales tales como secuencias dirigidas, o residuos de metionina y lisina y/o secuencias de etiquetas o de proteínas de fusión, dependiendo de cómo se prepare.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “capaz de unirse a miostatina” o “que tiene una afinidad de unión por miostatina” se refiere a un agente de unión o péptido que se une a miostatina tal como se demuestra por el ensayo ELISA en fagos, los ensayos BIAcone® o KinExA™ descritos en los ejemplos proporcionados a continuación.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión ”capaz de modificar la actividad de la miostatina” se refiere a la acción de un agente como un agonista o un antagonista con respecto al menos a una actividad biológica de la miostatina. Tal como se usa en el presente documento, actividad “agonista” o ”mimética” se refiere a un agente que tiene actividad biológica comparable a una proteína que interacciona con una proteína de interés, tal como se describe, por ejemplo, la solicitud internacional WO 01/83525, presentada el 2 de mayo de 2001.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “inhibición de la actividad de la miostatina” o “que tiene actividad antagonista” se refiere a la capacidad de un péptido o agente de unión de reducir o bloquear la actividad de la miostatina o la señalización tal como se demuestra por ensayos in vitro tales, por ejemplo, el ensayo de la actividad de la miostatina basado en células C2C12 PARE o por pruebas en animales in vivo tal como se describe más adelante.
Estructura de los agentes de unión a miostatina
En una realización, los agentes de unión de la presente invención comprenden al menos un péptido de unión a miostatina unido covalentemente a al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fc. La unión de los péptidos de unión a miostatina a al menos un vehículo pretende aumentar la eficacia del agente de unión como producto terapéutico al aumentar la actividad biológica del agente y/o reducir la degradación in vivo, al aumentar la semivida in vivo, al reducir la toxicidad o inmunogenicidad in vivo. Los agentes de unión de la presente invención pueden comprender además una secuencia de ligador que conecta el péptido y el vehículo. El péptido o los péptidos se unen directa o indirectamente a través de una secuencia de ligador al vehículo en el extremo N, el extremo C o una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En esta realización, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura:
(X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma;
en la que F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan, cada uno independientemente de
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)c-P3;
y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)c -P3-(L4)f-P4;
en los que P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unirse a miostatina; y
L1, L2, L3 y L4 son, cada uno, ligadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b sea 1.
Cualquier péptido que contiene un residuo de cisteínilo puede formar enlaces cruzados con otro péptido que contiene Cys, pudiendo estar unidos uno o los dos a un vehículo. Cualquier péptido que tiene más de un residuo de Cys puede formar un enlace de disulfuro intrapeptídico también.
En una realización, el vehículo es un dominio Fc, definido más adelante. Está realización se denomina “pepticuerpo”. Tal como se usa en el presente documento, el término “pepticuerpo” se refiere a una molécula que comprende un dominio Fc de anticuerpo unido a al menos un péptido. La producción de pepticuerpos generalmente se describe en la publicación PCT WO 00/24782, publicada el 4 de mayo de 2000. Se proporcionan pepticuerpos a modo de ejemplo como configuraciones 1x y 2x con una copia y dos copias del péptido (unidas en tándem) respectivamente, tal como se describe en los ejemplos proporcionados a continuación.
Péptido
Tal como se usa en el presente documento el término “péptido” se refiere a moléculas de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Los péptidos de la presente invención tienen una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, más preferentemente una longitud comprendida entre aproximadamente 10 y 30 aminoácidos, y lo más preferentemente una longitud comprendida entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos, y son capaces de unirse a la proteína miostatina.
Los péptidos de la presente invención pueden comprender parte de una secuencia de proteínas que se producen de manera natural, pueden ser secuencias aleatorizadas derivadas de proteínas que se producen de manera natural, o pueden ser secuencias completamente aleatorizadas. Los péptidos de la presente invención pueden generarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo síntesis química, digestión de proteínas o tecnología recombinante. La presentación en fago y la selección de ARN-péptido y otras técnicas de selección por afinidad son particularmente útiles para generar péptidos capaces de unirse a miostatina.
La tecnología de presentación en fago se describe, por ejemplo, en Scott y col. Science 249: 386 (1990); Devlin y col, Science 249: 404 (1990); patente estadounidense n.º 5.223.409, emitida el 29 de junio de 1993; patente estadounidense n.º 5.733.731, emitida el 31 de marzo de 1998; patente estadounidense n.º 5.498.530, emitida el 12 de marzo de 1996; patente estadounidense n.º 5.432.018, emitida el 11 de julio de 1995; patente estadounidense n.º 5.338.665, emitida el 16 de agosto de 1994; patente estadounidense n.º 5.922.545, emitida el 13 de julio de 1999; documento WO 96/40987, publicado el 19 de diciembre de 1996; y el documento WO 98/15833, publicado el 16 de abril de 1998. Con el uso de bibliotecas de fago, se presentan secuencias peptídicas aleatorias mediante fusión con proteínas de cubierta de fago filamentoso. Normalmente, los péptidos presentados se eluyen por afinidad específicamente o no específicamente frente a la molécula diana. Los fagos retenidos pueden enriquecerse mediante ciclos sucesivos de repropagación y purificación por afinidad. Los mejores péptidos de unión se seleccionan por otro análisis, por ejemplo, mediante el uso de ELISA de fagos, descrito a continuación, y entonces se secuencian. Opcionalmente, pueden crearse bibliotecas de mutagénesis y seleccionarse para optimizar adicionalmente la secuencia de los mejores agentes de unión (Lowman, Ann Rev Biophys Biomol Struct 26:401-24 (1997)).
Otros procedimientos para generar los péptidos de unión a miostatina incluyen técnicas de selección por afinidad adicionales conocidas en la técnica. Una biblioteca de péptidos puede fusionarse en el extremo carboxilo terminal del represor lac y expresarse en E. coli. Otro procedimiento basado en E. coli permite la presentación en la membrana externa de la célula mediante fusión con una lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL). A continuación en el presente documento, estos procedimientos y procedimientos relacionados se denominan de manera colectiva “presentación en E. coli”. En otro procedimiento, se interrumpe la traducción de ARN aleatorio antes de liberar ribosomas, dando como resultado una biblioteca de polipéptidos con su ARN asociado todavía unido. A continuación en el presente documento, este procedimiento y procedimientos relacionados se denominan de manera colectiva “presentación en ribosomas”. Otros procedimientos emplean enlace químico de péptidos a ARN. Véase, por ejemplo, Roberts y Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12297-303 (1997). A continuación en el presente documento, este procedimiento y procedimientos relacionados se denominan de manera colectiva “selección de ARN-péptido”. También pueden usarse procedimientos de selección de dos híbridos de levadura para identificar péptidos de la invención que se unen a miostatina. Además, se han desarrollado bibliotecas de péptidos derivados químicamente en las que los péptidos están inmovilizados en materiales no biológicos, estables, tales como varillas de polietileno o resinas permeables a disolventes. Otra biblioteca de péptidos derivados químicamente utiliza fotolitografía para explorar péptidos inmovilizados en portaobjetos. A continuación en el presente documento, estos procedimientos y procedimientos relacionados se denominan de manera colectiva “selección de compuesto químico-péptido”. La selección de compuesto químico-péptido puede ser ventajosa porque permite usar Daminoácidos y otros análogos, así como elementos no peptídicos. Tanto procedimientos biológicos como químicos se revisan en Wells y Lowman, Curr Opiri Biotechnol 3: 355-62 (1992).
Adicionalmente, los péptidos seleccionados capaces de unirse a miostatina pueden mejorarse además a través del uso de “diseño racional”. En este enfoque, se realizan cambios graduales a una secuencia de péptido y el efecto de la sustitución sobre la especificidad o afinidad de unión del péptido o alguna otra propiedad del péptido se observa en un ensayo apropiado. Un ejemplo de esta técnica es sustituir un residuo individual a la vez por alanina, denominado un “paseo con alanina” o una “exploración con alanina”. Cuando se sustituyen dos residuos, se denomina un “paseo con alanina doble”. El péptido resultante que contiene sustituciones de aminoácidos se somete a prueba para determinar un aumento de la actividad o alguna propiedad ventajosa adicional.
Además, puede usarse también el análisis de la estructura de una interacción proteína-proteína para sugerir péptidos que imitan la interacción de una proteína más grande. En un análisis de este tipo, la estructura cristalina de una proteína puede sugerir la identidad y orientación relativa de residuos críticos de la proteína, a partir de los cuales puede diseñarse un péptido. Véase, por ejemplo, Takasaki y col, Nature Biotech 15:1266 (1977). Estos procedimientos también pueden usarse para investigar la interacción entre una proteína dirigida y péptidos seleccionados mediante presentación en fago u otros procedimientos de selección por afinidad que sugieren de ese modo modificaciones adicionales de péptidos para aumentar la afinidad de unión y la capacidad del péptido para inhibir la actividad de la proteína.
En una realización, los péptidos de la presente invención se generan como familias de péptidos relacionados. Ciertos péptidos a modo de ejemplo se representan por la SEC ID Nº: 1 a 132. Estos péptidos a modo de ejemplo se derivaron a través de un procedimiento de selección en el que los mejores agentes de unión generados mediante la tecnología de presentación en fago se analizaron adicionalmente mediante ELISA de fagos para obtener péptidos candidatos mediante una técnica de selección por afinidad tal como la tecnología de presentación en fago, tal como se describe en el presente documento. Sin embargo, los péptidos de la presente invención pueden producirse mediante cualquiera de varios procedimientos conocidos que incluyen la síntesis química tal como se describe a continuación.
Los péptidos de la presente invención pueden mejorarse adicionalmente mediante el procedimiento de “maduración por afinidad”. Este procedimiento se refiere a aumentar la afinidad o la actividad de los péptidos y pepticuerpos de la presente invención usando la tecnología de presentación en fago u otras tecnologías de selección. Basándose en una secuencia consenso, pueden generarse bibliotecas de presentación en fago secundarias dirigidas, por ejemplo, en las que los aminoácidos de “núcleo” (determinados a partir de la secuencia consenso) se mantienen constantes o están predispuestos en frecuencia de aparición. Como alternativa, una secuencia de péptido individual puede usarse para generar una biblioteca de presentación en fago dirigida. El cribado de tales bibliotecas en condiciones más rigurosas puede proporcionar péptidos con unión potenciada a miostatina, unión selectiva a miostatina, o con alguna propiedad deseada adicional. Sin embargo, los péptidos que tienen las secuencias maduradas por afinidad pueden producirse entonces mediante cualquiera de varios procedimientos conocidos incluyendo síntesis química o de manera recombinante. Estos péptidos se usan para generar agentes de unión tales como pepticuerpos de diversas configuraciones que muestran actividad inhibidora mayor en ensayos basados en células y ensayos in vivo.
El ejemplo 6, a continuación, describe la maduración por afinidad de los péptidos de “primera ronda” descritos anteriormente para producir péptidos madurados por afinidad. Ciertos pepticuerpos madurados por afinidad a modo de ejemplo se presentan en las tablas IV y V. Los pepticuerpos 1x y 2x resultantes preparados a partir de estos péptidos se caracterizaron entonces adicionalmente para determinar la afinidad de unión, la capacidad para neutralizar la actividad de la miostatina, la especificidad para miostatina a diferencia de otros miembros de la familia de TNF, y para determinar la actividad in vitro e in vivo adicional, tal como se describe a continuación. Los pepticuerpos y péptidos madurados por afinidad se denominan mediante el prefijo “m” antes de su nombre de familia para distinguirlos de los péptidos de primera ronda de la misma familia.
Ciertos péptidos de primera ronda a modo de ejemplo elegidos para la maduración por afinidad adicional según la presente invención incluían los siguientes péptidos: TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID Nº: 33), y los péptidos lineales Lineal-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEC ID Nº: 104), Lineal-15 HHGWNYLRKCSAPQWFEAWV (SEC ID Nº: 117), Lineal-17, RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEC ID Nº: 119), Lineal-20 YRBMSMLEGILDVLERLQHY (SEC ID Nº: 122), Lineal-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEC ID Nº: 123), Lineal-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEC ID Nº: 126). Las familias maduradas por afinidad de cada uno de estos se presentan a continuación en las tablas IV y V.
Vehículos
Tal como se usa en el presente documento, el término “vehículo” se refiere a una molécula que puede unirse a uno o más péptidos de la presente invención. Preferentemente, los vehículos confieren al menos una propiedad deseada a los agentes de unión de la presente invención. Los péptidos solos son probablemente eliminados in vivo o bien mediante filtración renal, mediante mecanismos de aclaramiento celular en el sistema reticuloendotelial o bien mediante degradación proteolítica. La unión a un vehículo mejora el valor terapéutico de un agente de unión mediante la reducción de la degradación del agente de unión y/o el aumento de la semivida, la reducción de la toxicidad, la reducción de la inmunogenicidad y/o el aumento de la actividad biológica del agente de unión.
Los vehículos a modo de ejemplo incluyen dominios Fc; polímeros lineales tales como polietilenglicol (PEG), polilisina, dextrano; un polímero de cadena ramificada (véase por ejemplo la patente estadounidense n.º 4.289.872 concedida a Denkenwalter y col, presentada el 15 de septiembre de 1981; la patente estadounidense n.º 5.229.490 concedida a Tam, presentada el 20 de julio de 1993; el documento WO 93/21259 por Frechet y col, publicado el 28 de octubre de 1993); un lípido; un grupo de colesterol (tal como un esteroide); un hidrato de carbono u oligosacárido;
o cualquier proteína, polipéptido o péptido naturales o sintéticos que se unen a un receptor de tipo salvaje.
En una realización, los agentes de unión a miostatina de la presente invención tienen al menos un péptido unido a al menos un vehículo (F1, F2) a través del extremo N terminal, extremo C terminal o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácido del (de los) péptido(s). También pueden usarse vehículos múltiples; tales como un dominio Fc en cada extremo terminal o un dominio Fc en un extremo terminal y un grupo PEG en el otro extremo terminal o una cadena lateral.
Un dominio Fc es un vehículo preferido. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “dominio Fc” engloba secuencias y moléculas de Fc nativo y variantes de Fc tal como se define a continuación. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “Fc nativo” se refiere a un fragmento de unión a no antígeno de un anticuerpo o la secuencia de aminoácidos de ese fragmento que se produce mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Un Fc preferido es un Fc completamente humano y puede originarse a partir de cualquiera de las inmunoglobulinas, tales como IgG1 e IgG2. Sin embargo, las moléculas de Fc que son parcialmente humanas o se originan a partir de especies no humanas también se incluyen en el presente documento. Las moléculas de Fc nativo están constituidas por polipéptidos monoméricos que pueden unirse para dar formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo oscila entre 1 y 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero con enlace disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG (véase Ellison y col (1982), Nucl Acids Res 10: 4071-9). La expresión “Fc nativo” tal como se usa en el presente documento se usa para hacer referencia a las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “variante de Fc” se refiere a una forma modificada de una secuencia de Fc nativo siempre que se mantenga la unión al receptor de tipo salvaje, tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 97/34631 y el documento WO 96/32478. Pueden construirse variantes de Fc por ejemplo, mediante sustitución o deleción de residuos, inserción de residuos o truncamiento de partes que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos modificados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser deseables por varios motivos, varios de los cuales se describen a continuación. Las variantes de Fc a modo de ejemplo incluyen moléculas y secuencias en las que:
1.
se eliminan los sitios implicados en la formación de enlace disulfuro. Tal eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula huésped usada para producir las moléculas de la invención. Para este fin, puede truncarse el segmento que contiene cisteína en el extremo N terminal o pueden delecionarse los residuos de cisteína o sustituirse por otros aminoácidos (por ejemplo, alanilo, serilo). Incluso cuando se eliminan los residuos de cisteína, los dominios de Fc de cadena sencilla pueden formar todavía un dominio de Fc dimérico que se mantiene unido de manera no covalente.
2.
Se modifica un Fc nativo para hacerlo más compatible con una célula huésped seleccionada. Por ejemplo, puede eliminarse la secuencia PA próxima al extremo N terminal de un Fc nativo típico, que puede reconocerse por una enzima de digestión en E. coli tal como prolina iminopeptidasa. También puede añadirse un residuo metionilo N terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana tal como
E. coli.
3.
Una parte del extremo N terminal de un Fc nativo se elimina para evitar la heterogeneidad N terminal cuando se expresa en una célula huésped seleccionada. Para este fin, puede delecionarse cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácido en el extremo N terminal, particularmente aquéllos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5.
4.
Se eliminan uno o más sitios de glicosilación. Los residuos que se glicosilan normalmente (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Tales residuos pueden delecionarse o sustituirse por residuos no glicosilados (por ejemplo, alanina).
5.
Se eliminan sitios implicados en la interacción con el complemento, tales como el sitio de unión a C1q. Por ejemplo, puede delecionarse o sustituirse la secuencia EKK de IgG1 humana. La recuperación del complemento puede no ser ventajosa para las moléculas de esta invención y de ese modo puede evitarse con una variante de Fc de este tipo.
6.
Se eliminan sitios que afectan a la unión a receptores de Fc distintos de un receptor de tipo salvaje. Un Fc nativo puede tener sitios para la interacción con ciertos glóbulos blancos que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de ese modo pueden eliminarse.
7.
Se elimina el sitio ADCC. Se conocen en la técnica sitios ADCC. Véase, por ejemplo, Molec Immunol 29 (5):633-9 (1992) con respecto a sitios ADCC en IgG1. Estos sitios tampoco se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y de ese modo pueden eliminarse.
8.
Cuando el Fc nativo se deriva de un anticuerpo no humano, puede humanizarse el Fc nativo. Normalmente, para humanizar un Fc nativo, se sustituirán residuos seleccionados en el Fc nativo no humano por residuos que se encuentran normalmente en Fc nativo humano. Se conocen bien en la técnica técnicas para la humanización de anticuerpos.
La expresión “dominio Fc” incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sean digeridas a partir de anticuerpo completo o producidas por otros medios. Tal como se usa en el presente documento, el término “multímero” como se aplica a dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc se refiere a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas covalentemente, no covalentemente o mediante interacciones tanto covalentes como no covalentes. Las moléculas de IgG normalmente forman dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Pueden formarse multímeros mediante el empleo de la secuencia y la actividad resultante de la fuente de Ig nativa del Fc o mediante la derivatización de un Fc nativo de este tipo. El término “dímero” como se aplica a dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc se refiere a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas covalentemente o no covalentemente.
Adicionalmente, un vehículo alternativo según la presente invención es una proteína, polipéptido, péptido, fragmento de anticuerpo o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) de dominio no Fc capaz de unirse a un receptor de tipo salvaje. Por ejemplo, podría usarse como vehículo un polipéptido tal como se describe en la patente estadounidense n.º 5.739.277, presentada el 14 de abril de 1998 concedida a Presta y col. También podrían seleccionarse péptidos mediante presentación en fago para la unión al receptor de tipo salvaje FcRn. Tales compuestos de unión al receptor de tipo salvaje también se incluyen dentro del significado de “vehículo” y se encuentran dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos deben seleccionarse para un aumento de la semivida (por ejemplo, evitando secuencias reconocidas por proteasas) y una reducción de la inmunogenicidad (por ejemplo, favoreciendo secuencias no inmunogénicas, tal como se determinan en la humanización de anticuerpos).
Además, también pueden usarse vehículos poliméricos para construir los agentes de unión de la presente invención. Diversos medios para la unión de restos químicos útiles como vehículos están actualmente disponibles, véase, por ejemplo, la publicación internacional del tratado de cooperación en materia de patentes (“PCT”) n.º WO 96/11953, con título “N-Temnnally Chemically Modified Protein Compositions and Methods”. Esta publicación PCT da a conocer, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al extremo N terminal de las proteínas.
Un vehículo polimérico preferido es polietilenglicol (PEG). El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG oscilará preferentemente entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa, más preferentemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, lo más preferentemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG se unirán generalmente a los compuestos de la invención por medio de acilación o alquilación reductora a través de un grupo reactivo en el resto PEG (por ejemplo, un grupo aldehído, amino, tiol o éster) para dar un grupo reactivo en el compuesto inventivo (por ejemplo, un grupo aldehído, amino o éster). Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste en combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en disolución, un péptido y un resto de PEG, teniendo cada uno una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva una hacia la otra. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con síntesis en fase sólida convencionales tal como se conocen en la técnica. Los péptidos se “activan previamente” con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y se caracterizan completamente antes de que reaccionen con el resto de PEG. El enlace del péptido con PEG tiene lugar usualmente en fase acuosa y puede supervisarse fácilmente mediante HPLC analítica en fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente mediante HPLC preparativa y caracterizarse mediante HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas mediante desorción por láser.
Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que pueden usarse para la modificación de proteínas. Los dextranos son polímeros de polisacárido compuestos por subunidades individuales de glucosa predominantemente unidas mediante enlaces 1-6. El dextrano está disponible por sí mismo en muchos intervalos de peso molecular, y está disponible fácilmente en pesos moleculares desde aproximadamente 1 kDa hasta aproximadamente 70 kDa. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para su uso en la presente invención como vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fc). Véase, por ejemplo, el documento WO 96/11953 y el documento WO 96/05309. Se ha notificado el uso de dextrano conjugado a inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico; véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n.º 0 315
456. Se prefiere dextrano de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa cuando se usa dextrano como vehículo según la presente invención.
Ligadores
Los agentes de unión de la presente invención pueden comprender opcionalmente además un grupo “ligador”. Los ligadores sirven principalmente como espaciador entre un péptido y un vehículo o entre dos péptidos de los agentes de unión de la presente invención. En una realización, el ligador está constituido por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos, preferentemente desde 1 hasta 20 aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos, en el que los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden glicosilarse, tal como entienden los expertos en la técnica. En una realización, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un ligador está constituido por una mayor parte de aminoácidos que están estéricamente impedidos, tales como glicina y alanina. Por tanto, ligadores a modo de ejemplo son poliglicinas (particularmente (Gly)5, (Gly)8), poli(Gly-Ala), y polialaninas. Tal como se usa en el presente documento, la designación “g” se refiere a un ligador de homopéptido de glicina. Tal como se muestra en la tabla II, “gn” se refiere a un ligador de a 5x gly en el extremo N terminal, mientras que “gc” se refiere a un ligador 5x gly en el extremo C terminal. También se prefieren combinaciones de Gly y Ala. Una secuencia de ligador a modo de ejemplo útil para la construcción de los agentes de unión de la presente invención es la siguiente: gsgsatggsgstassgsgsatg (Sec ID Nº: 305). Esta secuencia de ligador se denomina la secuencia “k” o 1k. Las designaciones “kc”, tal como se encuentran en la tabla II, se refiere al ligador k en el extremo C terminal, mientras que la designación “kn”, se refiere al ligador k en el extremo N terminal.
Los ligadores de la presente invención pueden ser también ligadores no peptídicos. Por ejemplo, pueden usarse ligadores alquílicos tales como -NH-(CH2)s-C(O)-, en el que s = 2-20. Estos ligadores alquílicos pueden sustituirse además por cualquier grupo no de impedimento estérico tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6), acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenilo, etc. Un ligador no peptídico a modo d ejemplo es un ligador de PEG, y tiene un peso molecular de 100 kDa a 5000 kDa, preferentemente de 100 kDa a 500 kDa. Los ligadores peptídicos pueden modificarse para formar derivados de la misma manera que anteriormente.
Agentes de unión a modo de ejemplo
Los agentes de unión de la presente invención comprenden al menos un péptido capaz de unirse a miostatina. El péptido de unión a miostatina de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos Cb1b2Wb3MMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y en la que el péptido tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
Una realización relacionada el péptido de unión a miostatina comprende la fórmula:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPPd10d11d12d13 (SEC ID Nº: 355), en la que
d1 está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d3 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d4 está ausente o es cualquier aminoácido; d5 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d6 está ausente o un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico; d7 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; d8 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; d9 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y d10 a d13 se selecciona de cualquier aminoácido,
y en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 20 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo. Ciertas realizaciones adicionales de agentes de unión comprenden al menos uno de los siguientes péptidos:
(1)
un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia WYe1e2Ye3G, (SEC ID Nº: 356) en la que e1 es P, S o Y,
e2 es C o Q, y e3 es G o H, en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 7 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
(2)
Un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia f1EMLf2SLf3f4LL, (SEC ID Nº: 455), en la que f1 es M o I, f2 es cualquier aminoácido, f3 es L o F,
f4 es E, Q o D; y en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 7 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
(3) Un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia Lg1g2LLg3g4L, (SEC ID Nº: 456), en la que
g1 es Q, D o E,
g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, g4 es L, W, F o Y, y en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 8 y 50 aminoácidos, y sales
fisiológicamente aceptables del mismo.
(4) Un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia h1h2h3h4h5h6h7h8h9 (SEC ID Nº: 457), en la que
h1 es R o D, h2 es cualquier aminoácido, h3 es A, T, S o Q, h4 es L o M, h5 es L o S, h6 es cualquier aminoácido, h7 es F o E, h8 es W, F o C, h9 es L, F, M o K, y en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 9 y 50 aminoácidos, y sales
fisiológicamente aceptables del mismo. En una realización, los agentes de unión de la presente invención comprenden además al menos un vehículo tal como un polímero o un dominio Fc, y pueden comprender además al menos una secuencia de ligador. En esta realización, los agentes de unión de la presente invención se construyen de modo que al menos un péptido de unión a miostatina está unido covalentemente a al menos un vehículo. El péptido o los péptidos están unidos directa o indirectamente a través de una secuencia de ligador al vehículo en el extremo N terminal, el extremo C terminal o
una cadena lateral de aminoácidos del péptido. En esta realización, los agentes de unión de la presente invención tienen la siguiente estructura generalizada: (X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma; en la que F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
en los que P1, P2, P3 y P4 son péptidos capaces de unirse a miostatina; y
L1, L2, L3 y L4 son cada uno ligadores; y a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b sea 1.
En una realización de los agentes de unión que tienen esta estructura generalizada, los péptidos P1, P2, P3 y P4 pueden seleccionarse de uno o más de cualquiera de los péptidos que comprenden la secuencias proporcionadas anteriormente. Los péptidos P1, P2, P3 y P4 pueden seleccionarse de uno o más péptidos que comprenden cualquiera de las siguientes secuencias: SEC ID Nº: 633, SEC ID Nº: 352, SEC ID Nº: 353, SEC ID Nº: 354, SEC ID Nº: 355, SEC ID Nº: 356, SEC ID Nº: 455, SEC ID Nº: 456, o SEC ID Nº: 457.
En una realización adicional, los vehículos de agentes de unión que tienen la fórmula general anterior son dominios Fc. Por tanto, los péptidos se fusionan a un dominio Fc, o bien directa o bien indirectamente, proporcionando de ese modo pepticuerpos. Los pepticuerpos de la presente invención presentan una alta afinidad de unión para miostatina y pueden inhibir la actividad de miostatina tal como se demuestra mediante ensayos in vitro y pruebas in vivo en animales proporcionados en el presente documento.
La presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención. A continuación se proporcionan secuencias de nucleótidos a modo de ejemplo.
Variantes y derivados de péptidos y pepticuerpos
Los agentes de unión de la presente invención también engloban variantes y derivados de los péptidos y pepticuerpos descritos en el presente documento. Puesto que tanto los péptidos como los pepticuerpos de la presente invención pueden describirse en cuanto a su secuencia de aminoácidos, puede decirse que los términos “variantes” y “derivados” se aplican a un péptido solo, o un péptido como componente de un pepticuerpo.
Las variantes de péptidos y pepticuerpos también incluyen péptidos y pepticuerpos maduros en los que se eliminan secuencias líder o de señal, y las proteínas resultantes que tienen residuos amino terminales adicionales, cuyos aminoácidos pueden ser naturales o no naturales. Se contemplan pepticuerpos con aun residuo de metionilo adicional en la posición de aminoácido -1 (Met-1-pepticuerpo), ya que son pepticuerpos con residuos de metionina y lisina adicionales en las posiciones -2 y -1 (Met-2-Lys-1-). Ciertas variantes que tienen residuos Met, Met-Lys, Lys adicionales (o uno o más residuos básicos, en general) son particularmente útiles para una producción de proteínas recombinantes potenciada en células huéspedes bacterianas.
Las variantes de péptido o pepticuerpo de la presente invención también incluyen péptidos que tienen residuos de aminoácidos adicionales que surgen del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, el uso de vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte del producto de fusión de glutatión-Stransferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina adicional en la posición de aminoácido -1 tras la escisión del componente GST del polipéptido deseado. También se contemplan variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de vector, incluyendo aquéllas en las que se incorporan etiquetas de histidina en la secuencia de aminoácidos, generalmente en el extremo carboxilo terminal y/o amino terminal de la secuencia.
En un ejemplo, se proporcionan variantes de inserción en las que uno o más residuos de aminoácidos, aminoácidos
o bien que se producen de manera natural o bien que se producen no de manera natural, se añaden a una secuencia de aminoácidos peptídicos. Las inserciones se ubican en uno cualquiera o ambos extremos terminales de la proteína. Las variantes de inserción con residuos adicionales en uno cualquiera o ambos extremos terminales pueden incluir, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen marcas o etiquetas de aminoácidos. Las variantes de inserción incluyen péptidos en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden a la secuencia de aminoácidos peptídicos.
Las variantes de inserción también incluyen proteínas de fusión en las que los extremos amino terminal y/o carboxilo terminal del péptido o pepticuerpo se fusionan con otro polipéptido, un fragmento del mismo o aminoácidos que no se reconocen generalmente que son parte de cualquier secuencia de proteínas específica. Ciertos ejemplos de tales proteínas de fusión son polipéptidos inmunógenos, proteínas con semividas de circulación grandes, tales como regiones constantes de inmunoglobulinas, proteínas marcadoras, proteínas o polipéptidos que facilitan la purificación del péptido o pepticuerpo deseado y secuencias de polipéptidos que promueven la formación de proteínas multiméricas (tales como motivos de cremallera de leucina que son útiles en la formación/estabilidad de dímeros).
Este tipo de variante de inserción tiene generalmente toda o una parte sustancial de la molécula nativa, unida en el extremo N o C terminal a toda o una parte de un segundo polipéptido. Por ejemplo, las proteínas de fusión emplean normalmente secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Otra proteína de fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en
o próximo a la unión de fusión facilitará la eliminación del polipéptido foráneo tras la purificación. Otras fusiones útiles incluyen enlaces de dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales dirigidas celulares o regiones transmembrana.
Existen diversos sistemas de expresión de proteínas de fusión comercialmente disponibles que pueden usarse en la presente invención. Los sistemas particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a, el sistema glutatión-Stransferasa (GST) (Pharmacia), el sistema de proteína de unión a maltosa (NEB, Beverley, MA), el sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) y el sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estos sistemas pueden producir péptidos y/o pepticuerpos recombinantes que portan sólo un número pequeño de aminoácidos adicionales, que no es probable que afecten significativamente a la actividad del péptido o pepticuerpo. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG como el sistema 6xHis añaden sólo secuencias cortas, que se conocen ambos que son poco antigénicos y que no afectan de manera adversa al plegamiento de un polipéptido con respecto a su conformación nativa. Otra fusión N terminal que se considera que es útil, es la fusión de un dipéptido de Met-Lys en la región N terminal de la proteína o los péptidos. Una fusión de este tipo puede producir aumentos beneficiosos de la actividad o expresión de proteína.
Otros sistemas de fusión producen híbridos polipeptídicos en los que es deseable escindir el componente de fusión del péptido o pepticuerpo deseado. En una realización, el componente de fusión está unido al pepticuerpo recombinante mediante una secuencia peptídica que contiene una secuencia de reconocimiento específico para una proteasa. Ciertos ejemplos de secuencias adecuadas son las reconocidas por la proteasa del virus del grabado de tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).
La invención también proporciona polipéptidos de fusión que comprenden todo o parte de un péptido o pepticuerpo de la presente invención, en combinación con el factor tisular truncado (tTF). El tTF es un agente dirigido vascular que está constituido por una forma truncada de una proteína inductora de la coagulación humana que actúa como agente de coagulación de vasos sanguíneos tumorales, tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os: 5.877.289; 6.004.555; 6.132.729; 6.132.730; 6.156.321; y la patente europea n.º EP 0988056. La fusión de tTF al pepticuerpo o péptido anti-miostatina, facilita la administración de antagonistas de anti-miostatina a la célula diana, por ejemplo, células de músculo esquelético, células de músculo cardiaco, fibroblastos, preadipocitos y posiblemente adipocitos.
Puede calcularse fácilmente la afinidad y la similitud de péptidos y pepticuerpos relacionados mediante procedimientos conocidos. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo y col, SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
Ciertos procedimientos preferidos para determinar la relación o la identidad en porcentaje de dos péptidos o polipéptidos, o un polipéptido y un péptido, se diseñan para proporcionar el apareamiento más grande entre las secuencias sometidas a prueba. Se describen procedimientos para determinar la identidad en programas informáticos públicamente disponibles. Los procedimientos de programa informático preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y col, J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX está públicamente disponible por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y col, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul y col, supra (1990)). Puede usarse el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.
Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado el apareamiento de sólo una región corta de las dos secuencias, y está región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta incluso si existe relación no significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, el procedimiento de alineación seleccionado dará como resultado una alineación que abarca al menos el diez por ciento de la longitud completa del polipéptido diana que está comparándose, es decir, al menos 40 aminoácidos contiguos cuando están comparándose secuencias de al menos 400 aminoácidos, 30 aminoácidos contiguos cuando están comparándose secuencias de al menos 300 a aproximadamente 400 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos contiguos cuando están comparándose secuencias de 200 a aproximadamente 300 aminoácidos, y al menos 10 aminoácidos contiguos cuando están comparándose secuencias de aproximadamente 100 a 200 aminoácidos. Por ejemplo, usando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), dos polipéptidos para los que va a determinarse el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para obtener el apareamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (el “tramo apareado”, tal como se determina por el algoritmo). En ciertas realizaciones, una sanción por apertura de huecos (que se calcula normalmente como 3X la diagonal promedio; la “diagonal promedio” es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que está usándose; la “diagonal” es la puntuación o número asignado a cada aminoácido perfecto apareado mediante la matriz de comparación particular) y una sanción de extensión de huecos (que es normalmente 1/10 veces la sanción de apertura de huecos), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan conjuntamente con el algoritmo. En ciertas realizaciones, el algoritmo también usa una matriz de comparación convencional (véase Dayhoff y col, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff y col, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:1091510919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62).
En ciertas realizaciones, por ejemplo, los parámetros para una comparación de secuencias polipeptídicas pueden realizarse con lo siguiente: algoritmo: Needleman y col, J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff y col, supra (1992); sanción de huecos: 12; sanción de longitud de huecos: 4; umbral de similitud: 0, sin ninguna sanción por huecos de extremo.
En ciertas realizaciones, los parámetros para comparaciones de secuencias de moléculas de polinucleótidos (a diferencia de una secuencia de aminoácidos) pueden realizarse con lo siguiente: algoritmo: Needleman y col, supra (1970); matriz de comparación: apareamientos = +10, apareamiento erróneo = 0; sanción de huecos: 50: sanción de longitud de huecos: 3
Pueden usarse otros algoritmos, sanciones de apertura de huecos, sanciones de extensión de huecos, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc. a modo de ejemplo, incluyendo aquéllos expuestos en el Manual de Programas, Paquete de Wisconsin, Versión 9, septiembre de 1997. Las selecciones particulares que van a realizarse serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica y dependerán de la comparación específica que va a realizarse, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN; y adicionalmente si la comparación es entre pares de secuencias dados (en cuyo caso se prefieren generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una base de datos grande de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).
Ciertos estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales (que se producen de manera natural), aminoácidos que no se producen de manera natural tales como aminoácidos -,-disustituido, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para péptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos que no se producen de manera
5 natural incluyen, por ejemplo: ácido aminoadípico, beta-alanina, beta-aminopropiónico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminoisobutírico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, Nmetilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, oritina, 4-hidroxiprolina, -carboxiglutamato, -N,N,N-trimetillisina, -N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, -Nmetilarginina y otros aminoácidos y aminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina).
Los residuos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases (de solapamiento) basándose en propiedades de cadena lateral comunes:
1) hidrófobos neutros: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Met, Phe;
15 2) polares neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Gly;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) básicos: His, Lys, Arg;
5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
6) aromáticos: Tip, Tyr, Phe.
En ciertas realizaciones, las variantes de péptido o pepticuerpo incluyen variantes de glicosilación, en las que uno o más sitios de glicosilación, tales como un sitio de glicosilación N-enlazado, se han añadido al pepticuerpo. Un sitio de glicosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución o adición de residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un posible sitio nuevo para la adición de una
25 cadena de hidrato de carbono N-enlazada. Como alternativa, las sustituciones que eliminan está secuencia retirarán una cadena de hidrato de carbono N-enlazada existente. También se proporciona una transposición de cadenas de hidratos de carbono N-enlazadas en las que se eliminan uno o más sitios de glicosilación N-enlazados (normalmente aquéllos que se producen de manera natural) y se crean uno o más sitios N-enlazados nuevos.
La invención también proporciona “derivados” de los péptidos o pepticuerpos de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado” se refiere a modificaciones distintas de, o además de, inserciones, deleciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que conservan la capacidad de unirse a miostatina.
Preferiblemente, las modificaciones realizadas a los péptidos de la presente invención para producir derivados son de naturaleza covalente, e incluyen por ejemplo, enlace químico con polímeros, lípidos, otros restos orgánicos e
35 inorgánicos. Pueden prepararse derivados de la invención para aumentar la semivida de circulación de un pepticuerpo, o pueden diseñarse para mejorar la capacidad de selección como diana del pepticuerpo a las células, tejido u órganos deseados.
La invención abarca además agentes de unión derivados modificados covalentemente para incluir una o más uniones de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol, tal como se describe en las patentes estadounidenses n.os: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; y 4.179.337. Todavía otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en hidratos de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y poli(alcohol vinílico), así como mezclas de estos polímeros. Se prefieren particularmente pepticuerpos
45 modificados covalentemente con subunidades de polietilenglicol (PEG). Los polímeros solubles en agua pueden unirse en posiciones específicas, por ejemplo en el extremo amino terminal de los pepticuerpos, o unirse aleatoriamente a una o más cadenas lateral es del polipéptido. El uso de PEG para mejorar la capacidad terapéutica de agentes de unión, por ejemplo, pepticuerpos, y de anticuerpos humanizados en particular, se describe en la patente estadounidense n.º 6.133. 426 concedida a Gonzales y col, presentada el 17 de octubre de 2000.
La invención también contempla derivatizar la parte de péptido y/o vehículo de los agentes de unión a miostatina. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica y similares de los compuestos. Los restos pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario no deseable de los compuestos y similares. Los derivados a modo de ejemplo incluyen compuestos en los que:
1. El derivado o alguna parte del mismo es cíclico. Por ejemplo, la parte de péptido puede modificarse para 55 contener dos o más residuos de Cys (por ejemplo, en el ligador), que podría ciclarse mediante la formación de enlaces disulfuro.
2.
El derivado está reticulado o se vuelve capaz de reticular entre moléculas. Por ejemplo, la parte de péptido puede modificarse para contener un residuo de Cys y de ese modo poder formar un enlace disulfuro intermolecular con una molécula similar. El derivado puede reticularse además a través de su extremo C terminal.
3.
Uno o más enlaces (uniones) peptidílicos [-C(O)NR-] se sustituyen por un enlace no peptidílico. Los enlaces peptidílicos a modo de ejemplo son -CH2-carbamato [-CH2-OC(O)NR-], fosfonato, -CH2-sulfonamida [-CH2-S(O)2NR-], urea [-NHC(O)NH-], -CH2-amina secundaria y péptido alquilado [-C(O)NR6- en el que R6 es alquilo inferior].
4.
El extremo N terminal está derivatizado. Normalmente, el extremo N terminal puede acilarse o modificarse para dar una amina sustituida. Los grupos derivados N terminales a modo de ejemplo incluyen NRR1 (distinto de -NH2), -NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR1, sucinimida o benciloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-), en los que R y R1 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en los que el anillo de fenilo puede sustituirse con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que está constituido por alquilo C1-C4, alcoxilo C1-C4, cloro y bromo.
5.
El extremo C terminal libre está derivatizado. Normalmente, el extremo C terminal está esterificado o amidado. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos descritos en la técnica para añadir (NH- CH2- CH2NH2)2 a compuestos de esta invención en el extremo C terminal. Asimismo, pueden usarse procedimientos descritos en la técnica para añadir -NH2, (o “terminación de cadena” con un grupo -NH2) a compuestos de esta invención en el extremo C terminal. Los grupos derivados C terminales a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, -C(O)R2 en el que R2 es alcoxilo inferior o -NR3R4 en el que R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C8 (preferiblemente alquilo C1-C4).
6.
Un enlace disulfuro se sustituye por otro resto de reticulación, preferiblemente más estable (por ejemplo, un alquileno). Véase, por ejemplo, Bhatnagar y col, J Med Chem 39: 3814-9 (1996), Alberts y col, Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993).
7.
Uno o más residuos de aminoácidos individuales están modificados. Se sabe que diversos agentes de derivatización reaccionan de manera específica con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales, tal como se describe en detalle a continuación.
Pueden hacerse reaccionar residuos de lisinilo y residuos amino terminales con anhídridos de ácido succínico u otro ácido carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y la reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.
Pueden modificarse residuos de arginilo mediante la reacción con uno cualquiera o combinación de varios reactivos convencionales, incluyendo fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginilo requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la alta pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como el grupo épsilonamino de arginina.
Se ha estudiado extensamente la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de etiquetas espectrales en residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Lo más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies O-acetil-tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente.
Pueden modificarse selectivamente grupos carboxilo de cadena lateral (aspartilo o glutamilo) mediante la reacción con carbodiimidas (R’-N=C=N-R’) tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4dimetilpentil)carbodiimida. Además, residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio.
Pueden desamidarse residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo. Como alternativa, estos residuos se desamidan en condiciones ácidas suaves. Cualquier forma de estos residuos se encuentra dentro del alcance de esta invención.
Pueden sustituirse residuos de cisteínilo por residuos de aminoácidos u otros restos o bien para eliminar enlaces disulfuro o bien, de manera inversa, para estabilizar las reticulaciones. Véase, por ejemplo, Bhatnagar y col, (supra).
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares. Los agentes de reticulación comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos tales como 3,3’-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato proporcionan compuestos intermedios fotoactivables que pueden formar reticulaciones en presencia de luz. Como alternativa, se emplean matrices insolubles en agua reactivas tales como hidratos de carbono activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes estadounidenses n.os 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 para la inmovilización de proteínas.
Los grupos hidratos de carbono (oligosacárido) pueden unirse de manera conveniente a sitios que se sabe que son sitios de glicosilación en proteínas. Generalmente, oligosacáridos O-enlazados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras que oligosacáridos N-enlazados se unen a residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos que se producen de manera natural distinto de prolina. Son distintas las estructuras de oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es ácido N-acetilneuramínico (denominado ácido siálico). El ácido siálico es normalmente el residuo terminal de oligosacáridos tanto N-enlazados como O-enlazados y, en base a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Tal(es) sitio(s) puede(n) incorporarse en el ligador de los compuestos de esta invención y está(n) preferiblemente glicosilado(s) mediante una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipeptídicos (por ejemplo, en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS). Sin embargo, tales sitios pueden glicosilarse adicionalmente mediante procedimientos sintéticos o semisintéticos conocidos en la técnica.
Otras posibles modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pág. 79-86 (1983)].
Los compuestos de la presente invención pueden modificarse también en el nivel de ADN. La secuencia ADN de cualquier parte del compuesto puede modificarse para dar codones más compatibles con la célula huésped seleccionada. Para E. coli, que es la célula huésped preferida, se conocen en la técnica codones optimizados. Pueden sustituirse codones para eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el tratamiento del ADN en la célula huésped seleccionada. El vehículo, el ligador y las secuencias de ADN peptídicas pueden modificarse para incluir cualquiera de los cambios de secuencia anteriores.
También se contemplan derivados adicionales que incluyen análogos no peptídicos que proporcionan una estructura estabilizada o biodegradación disminuida. Pueden prepararse análogos de peptidomiméticos basándose en un péptido inhibidor seleccionado mediante sustitución de uno o más residuos de restos no peptídicos. Preferiblemente, los restos no peptídicos permiten que el péptido conserve su conformación natural o que estabilice una conformación preferida, por ejemplo bioactiva, que conserva la capacidad de reconocer y unirse a miostatina. En un aspecto, el mimético/análogo resultante muestra un aumento de la afinidad unión para miostatina. Un ejemplo de procedimientos para la preparación de análogos de miméticos no peptídicos a partir de péptidos se describe en Nachman y col, Regul Pept 57:359-370 (1995). Si se desea, los péptidos de la invención pueden modificarse, por ejemplo, mediante glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación, o mediante la creación de sales de adición de ácido, amidas, ésteres, en particular ésteres C terminales, y N-acil derivados de los péptidos de la invención. Los pepticuerpos también pueden modificarse para crear derivados peptídicos formando complejos covalentes o no covalentes con otros restos. Pueden prepararse complejos unidos covalentemente mediante el enlace de restos químicos a grupos funcionales de las cadenas laterales de aminoácidos que comprenden los pepticuerpos, o en el extremo N o C terminal.
En particular, se anticipa que los péptidos pueden conjugarse con un grupo indicador, incluyendo, pero sin limitarse a, un radiomarcador, un marcador fluorescente, una enzima (por ejemplo, que cataliza una reacción colorimétrica o fluorimétrica), un sustrato, una matriz sólida o un vehículo (por ejemplo, biotina o avidina). Por consiguiente, la invención proporciona una molécula que comprende una molécula de pepticuerpo, comprendiendo además preferiblemente la molécula un grupo indicador seleccionado del grupo que está constituido por un radiomarcador, un marcador fluorescente, una enzima, un sustrato, una matriz sólida y un vehículo. Tales marcadores se conocen bien por los expertos en la técnica, por ejemplo, se contemplan particularmente marcadores de biotina. El uso de tales marcadores se conoce bien por los expertos en la técnica y se describe en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.817.837; 3.850.752; 3.996.345; y 4.277.437. Otros marcadores que serán útiles incluyen, pero no se limitan a marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes y marcadores quimioluminiscentes. Las patentes estadounidenses que se refieren al uso de tales marcadores incluyen, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; y 3.996.345. Cualquiera de los pepticuerpos de la presente invención puede comprender uno, dos o más de cualquiera de estos marcadores.
Procedimientos para preparar péptidos y pepticuerpos
Los péptidos de la presente invención pueden generarse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales péptidos pueden sintetizarse en disolución o sobre un soporte sólido según las técnicas convencionales. Están disponibles comercialmente diversos sintetizadores automáticos y pueden usarse según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young (supra); Tam y col, J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meienhofer, eds, Academic Press, Nueva York, 1-284; Barany y col, Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987); y la patente estadounidense n.º 5.424.398,
Los procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida usan un copoli(estireno-divinilbenceno) que contiene aminas 0,1-1,0 mM/g de polímero. Estos procedimientos de síntesis de péptidos usan protección de butiloxicarbonilo (t-BOC) o 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) de grupos alfa-aminos. Ambos procedimientos implican la síntesis por etapas mediante la cual se añade un único aminoácido en cada etapa comenzando desde el extremo C terminal del péptido (véase, Coligan y col, Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). Al termino de la síntesis química, el péptido sintético puede desprotegerse para eliminar los grupos t-BOC o FMOC que bloquean al aminoácido y escindirse del polímero mediante el tratamiento con ácido a temperatura reducida (por ejemplo, HF líquido-anisol al 10% durante aproximadamente 0,25 a aproximadamente 1 horas a 0ºC). Tras la evaporación de los reactivos, se extraen los péptidos del polímero con disolución de ácido acético al 1% que se liofiliza entonces para proporcionar el material bruto. Esto puede purificarse normalmente mediante técnicas tales como filtración en gel en Sephadex G-15 usando ácido acético al 5% como disolvente. La liofilización de fracciones apropiadas de la columna proporcionará los péptidos homogéneos o derivados de péptidos que pueden caracterizarse entonces mediante técnicas convencionales tales como análisis de aminoácidos, cromatografía en capa fina, cromatografía de líquidos de alta resolución, espectroscopia de absorción de ultravioleta, rotación molar, solubilidad, y pueden cuantificarse mediante la degradación de Edman en fase sólida.
Las técnicas de presentación en fago pueden ser particularmente eficaces para identificar los péptidos de la presente invención tal como se describió anteriormente. Brevemente, se prepara una biblioteca de fagos (usando por ejemplo fago M13, fd o lambda), presentando insertos desde 4 hasta aproximadamente 80 residuos de aminoácidos. Los insertos pueden representar, por ejemplo, un alineamiento sesgado o degenerado completamente. Se seleccionan insertos que portan fagos que se unen al antígeno deseado y este procedimiento se repite a través de varios ciclos de nueva selección de fago que se une al antígeno deseado. Se realiza la secuenciación de ADN para identificar las secuencias de los péptidos expresados. La parte lineal mínima de la secuencia que se une al antígeno deseado puede determinarse de este modo. El procedimiento puede repetirse usando una biblioteca sesgada que contiene insertos que contienen parte o toda la parte lineal mínima más uno o más residuos degenerados adicionales en el sentido de 5’ o en el sentido de 3’ de los mismos. Estas técnicas pueden identificar péptidos de la invención con todavía mayor afinidad de unión para miostatina que los agentes ya identificados en el presente documento.
Independientemente de la manera en la que se preparan los péptidos, puede generarse una molécula de ácido nucleico que codifica cada péptido de este tipo usando procedimientos de ADN recombinantes convencionales. La secuencia de nucleótidos de tales moléculas puede manipularse en caso apropiado sin modificar la secuencia de aminoácidos que codifican para justificar la degeneración del código de ácido nucleico así como para justificar la preferencia de codones en células huéspedes particulares.
La presente invención proporciona también moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de polinucleótidos que codifican los péptidos y pepticuerpos de la presente invención. Estas moléculas de ácido nucleico incluyen vectores y constructos que contienen polinucleótidos que codifican los péptidos y pepticuerpos de la presente invención, así como variantes y derivados de péptidos y pepticuerpos. Se proporcionan moléculas de ácido nucleico a modo de ejemplo en los ejemplos a continuación.
Las técnicas de ADN recombinantes también proporcionan un procedimiento conveniente para preparar pepticuerpos de longitud completa y otros agentes de unión a polipéptidos grandes de la presente invención, o fragmentos de los mismos. Un polinucleótido que codifica el pepticuerpo o fragmento puede insertarse en un vector de expresión, que puede insertarse a su vez en una célula huésped para la producción de los agentes de unión de la presente invención. La preparación de pepticuerpos a modo de ejemplo de la presente invención se describen en el ejemplo 2 a continuación.
Una variedad de sistemas de vector de expresión/huésped pueden utilizarse para expresar los péptidos y pepticuerpos de la invención. Estos sistemas incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de cósmido, plásmido o bacteriófago recombinante; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células animales. Una línea de células huésped preferida es la cepa 2596 de E. coli (n.º ATCC 202174), usada para la expresión de pepticuerpos tal como se describe a continuación en el ejemplo 2. Las células de mamífero que son útiles en la producción de proteínas recombinantes incluyen pero no se limitan a células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tales como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 y 293.
La expresión “vector de expresión” se refiere a un plásmido, fago, virus o vector, para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de polinucleótidos. Un vector de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una estructura o secuencia que codifica el agente de unión que se transcribe en ARNm y se traduce en una proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción apropiadas. Las unidades estructuras pretendidas para su uso en sistemas de expresión de levadura o eucariotas preferiblemente incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de proteína traducida mediante una célula huésped. Como alternativa, si se expresa proteína recombinante sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionilo amino terminal. Este residuo puede o no escindirse posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto peptídico final.
Por ejemplo, los péptidos y pepticuerpos pueden expresarse de manera recombinante en levaduras usando un sistema de expresión comercialmente disponible, por ejemplo, el sistema de expresión Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia pre-proalfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto se conduce mediante el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) tras la inducción mediante metanol. El péptido secretado se purifica del medio de crecimiento de levaduras usando los procedimientos utilizados para purificar el péptido de los sobrenadantes celulares de mamífero y bacterianos.
Como alternativa, el ADNc que codifica el péptido y los pepticuerpos puede clonarse en el vector de expresión de baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Este vector puede usarse según las direcciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medios sin proteínas sF9 y para producir proteína recombinante. La proteína recombinante puede purificarse y concentrarse a partir de los medios usando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia).
Como alternativa, el péptido o pepticuerpo puede expresarse en un sistema de insectos. Los sistemas de insectos para la expresión de proteínas se conocen bien por los expertos en la técnica. En un sistema de este tipo, puede usarse el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Puede clonarse la secuencia que codifica el péptido en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción satisfactoria del péptido hará que el gen de polihedrina sea inactivo y producirá un virus recombinante que carezca de cubierta de proteína de cubierta. Los virus recombinantes pueden usarse para infectar células S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa el péptido (Smith y col, J Virol 46: 584 (1983); Engelhard y col, Proc Nat Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994)).
En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el péptido puede amplificarse mediante PCR y clonarse en un vector apropiado por ejemplo, pGEX-3X (Pharmacia). El vector pGEX se diseña para producir una proteína de fusión que comprende glutatión-S-transferasa (GST), codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR pueden generarse para incluir por ejemplo, un sitio de escisión apropiado. Si se usa el resto de fusión únicamente para facilitar la expresión o no es deseable de otro modo como unión al péptido de interés, entonces puede escindirse la proteína de fusión recombinante de la parte de GST de la proteína de fusión. El constructo peptídico pGEX-3X/agente de unión específico se transforma en células E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA), y se aíslan y se hacen crecer transformantes individuales. Puede purificarse el ADN de plásmido de transformantes individuales y secuenciarse parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del inserto de ácido nucleico que codifica el agente de unión específico deseado en la orientación apropiada.
La proteína de fusión, que puede producirse como cuerpo de inclusión insoluble en las bacterias, puede purificarse tal como sigue. Se recogen células huéspedes mediante centrifugación; se lavan en NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; y se trata con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutes a temperatura ambiente. El lisado puede eliminarse mediante sonicación, y los residuos celulares pueden sedimentarse mediante centrifugación durante 10 minutos a 12.000 X g. Puede resuspenderse el sedimento que contiene proteína de fusión en Tris 50 mM, pH 8, y EDTA 10 mM, colocarse en capa sobre glicerol al 50% y centrifugarse durante 30 min. a 6000 X g. Puede resuspenderse el sedimento en solución salina tamponada con fosfato (PBS) convencional libre de Mg++ y Ca++. La proteína de fusión puede purificarse adicionalmente mediante el fraccionamiento del sedimento resuspendido en un SDS-PAGE desnaturalizante (Sambrook y col, supra). Puede empaparse el gel en KCl 0,4 M para visualizar la proteína, que puede escindirse y electroeluirse en gel SDS que carece de tampón de corrida. Si la proteína de fusión/GST se produce en bacterias tal como una proteína soluble, pueden purificarse usando el módulo de purificación GST (Pharmacia).
La proteína de fusión puede someterse a digestión para escindir la GST del péptido de la invención. La reacción de digestión (20-40 mg de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg, Sigma) en 0,5 ml de PBS puede incubarse 16-48 h a temperatura ambiente y cargarse en un gel SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los productos de reacción. El gel puede empaparse en KCl 0,4 M para visualizar las bandas de proteínas. Puede confirmarse la identidad de la banda de proteína correspondiente al peso molecular esperado del péptido mediante análisis de secuencia de aminoácidos usando un secuenciador automático (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA). Como alternativa, la identidad puede confirmarse mediante la realización de HPLC y/o espectrometría de masas de los péptidos.
Como alternativa, puede clonarse una secuencia de ADN que codifica el péptido en un plásmido que contiene un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder (Better y col, Science 240:1041-43 (1988)). La secuencia de este constructo puede confirmarse mediante la secuenciación automática. El plásmido puede transformarse entonces en la cepa MC1061 de E. coli usando procedimientos convencionales que emplean la incubación con CaCl2 y tratamiento de choque térmico de las bacterias (Sambrook y col, supra). Las bacterias transformadas pueden hacerse crecer en medio LB complementado con carbenicilina, y la producción de la proteína expresada puede inducirse mediante el crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder puede realizar la secreción del péptido y puede escindirse durante la secreción.
Los expertos en la técnica conocen bien los sistemas huéspedes de mamífero para la expresión de péptidos y pepticuerpos recombinantes. Pueden seleccionarse cepas de células huéspedes de una capacidad particular para tratar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones post-traduccionales que serán útiles para proporcionar actividad de proteína. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Diferentes células huéspedes tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, y similares tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades posttraduccionales y pueden elegirse para garantizar el tratamiento y modificación correctos de la proteína foránea introducida.
Es preferible que las células transformadas se usen para la producción de proteínas de alto rendimiento, a largo plazo. Una vez que se han transformado tales células con vectores que contienen marcadores seleccionables así como el casete de expresión deseado, las células pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se pasen a medios selectivos. El marcador seleccionable se diseña para dejar que crezcan y se recuperen las células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Pueden proliferarse grupos resistentes de células transformadas de manera estable usando técnicas de cultivo tisular apropiadas a la línea celular empleada.
Pueden usarse varios sistemas de selección para recuperar las células que se han transformado para la producción de proteínas recombinantes. Tales sistemas de selección incluyen, pero no se limitan a, genes de timidina cinasa de VHS, de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y de adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede usarse la resistencia anti-metabolitos como la base de selección para dhfr que confiere resistencia a metotrexato; gpt que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo que confiere resistencia al aminoglicósido G418 y confiere resistencia a clorsulfurón; e hygro que confiere resistencia a higromicina. Los genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, que deja que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que deja que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Los marcadores que proporcionan una indicación visual para la identificación de transformantes incluyen antocianinas, -glucuronidasa y su sustrato, GUS y luciferasa y su sustrato, luciferina.
Purificación y replegamiento de agentes de unión
En algunos casos, los agentes de unión tales como los péptidos y/o pepticuerpos de esta invención pueden necesitar “replegarse” y oxidarse para dar una estructura terciaria apropiada y enlaces disulfuro generados con el fin de ser biológicamente activos. El replegamiento puede realizarse usando varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, exponer el agente polipeptídico solubilizado a un pH normalmente superior a 7 en presencia de un agente caotrópico. La selección de un caótropo es similar a las selecciones usadas para la solubilización de cuerpos de inclusión, sin embargo un caótropo se usa normalmente a una concentración inferior. Los agentes caotrópicos a modo de ejemplo son guanidina y urea. En la mayoría de los casos, la disolución de replegamiento/oxidación contendrá también un agente reductor más su forma oxidada en una proporción específica para generar un potencial redox particular que permite que se produzcan intercambios de disulfuro para la formación de puentes de cisteína. Algunas parejas redox usadas comúnmente incluyen cisteína/cistamina, glutatión/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT, y 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. En muchos casos, puede usarse un codisolvente para aumentar la eficacia del replegamiento. Los codisolventes comúnmente usados incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares y arginina.
Puede ser deseable purificar los péptidos y pepticuerpos de la presente invención. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de purificación de proteínas. Estas técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento bruto de las fracciones proteináceas y no proteináceas. Con la separación del péptido y/o pepticuerpo de otras proteínas, el péptido o polipéptido de interés puede purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o la purificación hasta la homogeneidad). Ciertos procedimientos analíticos adecuados para la preparación de pepticuerpos y péptidos de la presente invención son cromatografía de intercambios iónico, cromatografía de exclusión; electroforesis en gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Un procedimiento particularmente eficaz de purificación de péptidos es la cromatografía líquida rápida de proteínas o incluso la HPLC.
Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, a la purificación sustancial de un pepticuerpo o péptido de la presente invención. La expresión “pepticuerpo o péptido purificado” tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a una composición, que puede aislarse de otros componentes, en la que el pepticuerpo o péptido está purificado hasta un grado con respecto a su estado que puede obtenerse de manera natural. Por tanto, un péptido o pepticuerpo purificado se refiere también a un pepticuerpo o péptido que está libre del entorno en el que puede producirse de manera natural.
Generalmente, “purificado” se referirá a una composición de péptido o pepticuerpo que se ha sometido a fraccionamiento para eliminar diversos otros componentes, y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Si se usa la expresión “sustancialmente purificado”, esta denominación se referirá a una composición de péptido o pepticuerpo en la que el pepticuerpo o péptido forma el componente principal de la composición, tal como que constituye aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o más de las proteínas en la composición.
Los expertos en la técnica conocerán diversos procedimientos para cuantificar el grado de purificación del péptido o pepticuerpo en vista de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad de unión específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de péptido o pepticuerpo dentro de una fracción mediante análisis de SDS/PAGE. Un procedimiento preferido para evaluar la pureza de una fracción de péptido o pepticuerpo es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla con la actividad de unión del extracto inicial, y de ese modo para calcular el grado de purificación, en el presente documento evaluado por un “número de veces de purificación”. Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión dependerá, desde luego, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación y si el pepticuerpo o péptido muestra o no una actividad de unión detectable.
Los expertos en la técnica conocerán bien diversas técnicas adecuadas para su uso en la purificación. Éstas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpo (inmunoprecipitación) y similares o mediante desnaturalización térmica, seguida de centrifugación; etapas de cromatografía tales como cromatografía de afinidad (por ejemplo, proteína-A-Sepharose), cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de fase inversa, de hidroxiapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de tales y otras técnicas. Tal como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de realización de las diversas etapas de purificación puede cambiarse o que ciertas etapas puedan omitirse, y todavía de como resultado un procedimiento adecuado para la preparación de un agente de unión sustancialmente purificado.
No existe ningún requisito general de que los agentes de unión de la presente invención se proporcionen siempre en su estado más purificado. De hecho se contempla que productos de agentes de unión purificados de manera menos sustancial tendrán utilidad en ciertas realizaciones. Puede realizarse la purificación parcial usando pocas etapas de purificación en combinación, o utilizando formas diferentes del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC dará como resultado generalmente una purificación “tantas veces” mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los procedimientos que muestran un grado inferior de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del péptido o pepticuerpo o en el mantenimiento de actividad de unión del péptido o pepticuerpo.
Se sabe que la migración de un péptido o polipéptido puede variar, algunas veces de manera significativa, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi y col, Biochem Biophys Res Comm, 76: 425 (1977)). Por tanto, se apreciará que en condiciones de electroforesis diferentes, pueden variar los pesos moleculares aparentes de productos de expresión de agentes de unión purificados o parcialmente purificados.
Actividad de agentes de unión a miostatina
Tras la construcción de los agentes de unión de la presente invención, se someten a prueba para determinar su capacidad de unirse a miostatina e inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Cualquier número de ensayos o pruebas en animales puede usarse para determinar la capacidad del agente de inhibir o bloquear la actividad de la miostatina. Varios ensayos usados para caracterizar los péptidos y pepticuerpos de la presente invención se describen en los ejemplos a continuación. Un ensayo es el ensayo C2C12 pMARE-luc que utiliza una línea celular que responde a miostatina (mioblastos C2C12) transfectada con un vector indicador de luciferasa que contiene elementos de respuesta a miostatina/activina (MARE). Se someten a ensayo pepticuerpos a modo de ejemplo incubando previamente una serie de diluciones de pepticuerpo con miostatina, y exponiendo entonces las células a la mezcla de incubación. Se determina la actividad luciferasa resultante y se genera una curva de titulación a partir de la serie de diluciones de pepticuerpo. Entonces se determinó la CI50 (la concentración de pepticuerpo para lograr el 50% de inhibición de la actividad de la miostatina tal como se mide mediante la actividad luciferasa). Un segundo ensayo descrito a continuación es un ensayo BlAcore® para determinar los parámetros cinéticos ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación), y KD (constante de equilibrio de disociación) para los agentes de unión a miostatina. Las constantes de equilibrio de disociación inferiores (KD, expresadas en nM) indicaban una afinidad mayor del pepticuerpo para miostatina. Los ensayos adicionales incluyen ensayos de bloqueo para determinar si un agente de unión tal como un pepticuerpo es neutralizante (evita la unión de miostatina a su receptor), o no neutralizante (no evita la unión de miostatina a su receptor); ensayos de selectividad, que determinan si los agentes de unión de la presente invención se unen selectivamente a miostatina y no a otros miembros de la familia TGF; y ensayos KinEx ATM o ensayos de equilibrio a base de disoluciones, que también determinan KD y se considera que son más sensibles en algunas circunstancias. Estos ensayos se describen en el ejemplo 3.
La figura 1 muestra la CI50 de un péptido en comparación con la CI50 de la forma de pepticuerpo del péptido. Esto demuestra que el pepticuerpo es más significativamente eficaz en la inhibición de la actividad de la miostatina que el péptido solo. Además, los pepticuerpos madurados por afinidad generalmente muestran valores de CI50 y KD mejorados en comparación con los péptidos y pepticuerpos originales. Los valores de CI50 para varios pepticuerpos madurados por afinidad a modo de ejemplo se muestran en la tabla VII, ejemplo 7 a continuación. Adicionalmente, en algunos casos, al realizar una versión 2x de un pepticuerpo, en el que dos péptidos se unen en tándem, aumenta la actividad del pepticuerpo tanto in vitro como in vivo.
Se demuestran las actividades in vivo en los ejemplos a continuación. Las actividades de los agentes de unión incluyen actividad anabólica que aumenta la masa muscular magra en modelos de animal, así como que reduce la masa grasa con respecto al peso corporal total en modelos de animal tratado, y que aumenta la resistencia muscular en modelos de animal.
Usos de los agentes de unión a miostatina
Los agentes de unión a miostatina de la presente invención se unen a miostatina y bloquean o inhiben la señalización de miostatina dentro de las células seleccionadas como diana. La presente invención proporciona reactivos para su uso para reducir la cantidad o actividad de miostatina en una animal mediante la administración de una dosificación eficaz de uno o más agentes de unión a miostatina al animal. En un aspecto, la presente invención proporciona reactivos para su uso para tratar trastornos relacionados con miostatina en un animal que comprende administrar una dosificación eficaz de uno o más agentes de unión al animal. Estos trastornos relacionados con miostatina incluyen pero no se limitan a diversas formas de desgaste muscular, así como trastornos metabólicos tales como diabetes y trastornos relacionados, y enfermedades degenerativas óseas tales como la osteoporosis.
Tal como se muestra en el ejemplo 8 a continuación, los pepticuerpos a modo de ejemplo de la presente invención aumentan drásticamente la masa muscular magra en el modelo de ratón CD1 nu/nu. Esta actividad in vivo se correlaciona con la actividad inhibidora y de unión in vitro descrita a continuación para los mismos pepticuerpos.
Los trastornos de desgaste muscular incluyen distrofias tales como la distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb y distrofia muscular neuroaxonal infantil. Por ejemplo, el bloqueo de miostatina mediante el uso de anticuerpos in vivo mejoró el fenotipo distrófico del modelo de ratón mdx de distrofia muscular de Duchenne (Bogdanovich y col, Nature 420, 28 (2002)). Los pepticuerpos de la presente invención aumentan la masa muscular magra como porcentaje del peso corporal y reduce la masa grasa como porcentaje del peso corporal cuando se administra a un modelo de ratón mdx de edad avanzada.
Ciertos trastornos de desgaste muscular adicionales surgen de enfermedad crónica tal como la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, cáncer, SIDA, insuficiencia renal y artritis reumatoide. Por ejemplo, se indujo caquexia o desgaste muscular y pérdida del peso corporal en ratones desnudos atímicos mediante una miostatina administrada de manera sistémica (Zimmers y col, supra). En otro ejemplo, se encontró que las concentraciones séricas e intramusculares de la proteína inmunorreactiva miostatina aumentaban en hombres que mostraban desgaste muscular relacionado con SIDA y estaba relacionado de manera inversa con la masa sin grasa (Gonzalez-Cadavid y col, PNAS USA 95: 14938-14943 (1998)). Ciertas afecciones adicionales que dan como resultado el desgaste muscular pueden surgir de la inactividad debido a una discapacidad tal como el confinamiento en una silla de ruedas, reposo en cama prolongado debido a ictus, enfermedad, lesión de la médula espinal, fractura ósea o traumatismo, y atrofia muscular en un entorno de microgravedad (viaje espacial). Por ejemplo, se encontró que la proteína inmunorreactiva miostatina plasmática aumentaba tras el reposo en cama prolongado (Zachwieja y col J Gravit Physiol. 6(2):11(1999). También se encontró que los músculos de ratas expuestos a un entorno de microgravedad durante un vuelo corto espacial expresaban un aumento de la cantidad de miostatina en comparación con los músculos de ratas que no se expusieron (Lalani y col, J. Endocrin 167 (3):417-28 (2000)).
Además, aumentos relacionados con la edad de proporciones grasa con respecto a músculo y la atrofia muscular relacionada con la edad parecen estar relacionados con miostatina. Por ejemplo, la proteína inmunorreactiva miostatina sérica promedio aumentó con la edad en grupos de mujeres y hombres jóvenes (19-35 años de edad), de mediana edad (36-75 años de edad) y ancianos (76-92 años de edad), mientras que la masa sin grasa y la masa muscular promedio se redujo con la edad en estos grupos (Yarasheski y col J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). También se ha demostrado que la desactivación del gen de miostatina en ratones aumentó la miogénesis y redujo la adipogénesis (Lin y col, Biochem Biophys Res Commun 291(3):701-6 (2002), dando como resultado adultos con un aumento de masa muscular y una reducción de la acumulación de grasa y secreción de leptina. Ciertos pepticuerpos a modo de ejemplo mejoran la proporción de masa muscular magra a la grasa en ratones mdx de edad avanzada tal como se muestra a continuación.
Además, se ha encontrado ahora que miostatina se expresa en niveles bajos en musculo cardiaco y la expresión está regulada por incremento después de cardiomiocitos tras un infarto (Sharma y col, J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999)). Por tanto, la reducción de niveles de miostatina en el músculo cardiaco puede mejorar la recuperación del músculo cardiaco tras un infarto.
La miostatina también parece influir en trastornos metabólicos que incluyen diabetes tipo 2, diabetes mellitus no insulinodependiente, hiperglucemia y obesidad. Por ejemplo, se ha demostrado que la falta de miostatina mejora los fenotipos obeso y diabético de dos modelos de ratón (Yen y col supra). Se ha demostrado en los ejemplos a continuación que la reducción de la actividad de la miostatina mediante la administración de los inhibidores de la presente invención reducirá la proporción de grasa a músculo en un animal, incluyendo modelos de animal de edad avanzada. Por tanto, la reducción de la composición de grasa mediante la administración de los inhibidores de la presente invención mejorará la diabetes, obesidad y afecciones hiperglucémicas en animales.
Además, el aumento de la masa muscular mediante la reducción de los niveles de miostatina puede mejorar la resistencia ósea y reducir la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas. Se ha encontrado, por ejemplo, que ratones deficientes de miostatina mostraron un aumento del contenido mineral y la densidad del húmero de ratón y un aumento del contenido mineral del hueso tanto trabecular como cortical en las regiones en las que se agregaran músculos, así como un aumento de la masa muscular (Hamrick y col Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002)).
La presente invención también proporciona procedimientos y reactivos para aumentar la masa muscular en animales destinados a alimento mediante la administración de una dosificación eficaz del agente de unión a miostatina al animal. Puesto que el polipéptido de miostatina C terminal maduro es idéntico en todas las especies sometidas a prueba, se esperaría que los agentes de unión a miostatina fueran eficaces para aumentar la masa muscular y reducir la grasa en cualquier especie importante en agricultura incluyendo ganado, pollo, pavos y cerdos.
Los agentes de unión de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para potenciar sus efectos terapéuticos o reducir los posibles efectos secundarios. Los agentes de unión de la presente invención tienen una o más propiedades deseables pero de combinación inesperada de las mismas para mejorar el valor terapéutico de los agentes. Estas propiedades incluyen un aumento de la actividad, un aumento de la solubilidad, degradación reducida, un aumento de la semivida, toxicidad reducida e inmunogenicidad reducida. De ese modo, los agentes de unión de la presente invención son útiles para regímenes de tratamiento prolongados. Además, las propiedades de hidrofilicidad e hidrofobicidad de los compuestos de la invención están bien equilibradas, potenciando de ese modo su utilidad para usos tanto in vitro como especialmente in vivo. Específicamente, los compuestos de la invención tienen un grado apropiado de solubilidad en medios acuosos que permiten la absorción y la biodisponibilidad en el organismo, mientras que tienen también un grado de solubilidad en lípidos que permite que los compuestos atraviesen la membrana celular hasta un supuesto sitio de acción, tal como una masa muscular particular.
Los agentes de unión de la presente invención son útiles para tratar un “sujeto” o cualquier animal, incluyendo seres humanos, cuando se administran en una dosificación eficaz en una composición adecuada.
Además, los agentes de unión a miostatina de la presente invención son útiles para detectar y cuantificar miostatina en varios ensayos. Estos ensayos se describen en más detalle a continuación.
En general, los agentes de unión de la presente invención son útiles como agentes de captura para unirse a e inmovilizar miostatina en una variedad de ensayos, de manera similar a los descritos, por ejemplo, en Asai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., Nueva York (1993). El agente de unión puede estar marcado de alguna manera o puede reaccionar con una tercera molécula tal como un anticuerpo antiagente de unión que está marcado para permitir que se detecte y se cuantifique miostatina. Por ejemplo, un agente de unión o una tercera molécula puede modificarse con un resto detectable, tal como biotina, que puede unirse entonces por una cuarta molécula, tal como estreptavidina marcada con enzima, u otras proteínas. (Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585(1997)).
A lo largo de cualquier ensayo particular, pueden requerirse etapas de incubación y/o lavado tras cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar desde aproximadamente 5 segundos hasta varias horas, preferiblemente desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, volumen de disolución, concentraciones, y similares. Normalmente, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse sobre un intervalo de temperaturas.
Ensayos de unión no competitivos:
Los ensayos de unión pueden ser del tipo no competitivo en los que la cantidad de miostatina capturada se mide directamente. Por ejemplo, en un ensayo tipo “sándwich” preferido, el agente de unión puede unirse directamente a un sustrato sólido en el que se inmoviliza. Estos agentes inmovilizados se unen entonces a miostatina presente en la muestra de prueba. La miostatina inmovilizada se une entonces con un agente de marcado, tal como un anticuerpo marcado frente a miostatina, que puede detectarse. En otro ensayo tipo “sándwich” preferido, puede añadirse un segundo agente específico para el agente de unión que contiene un resto detectable, tal como biotina, al que puede unirse específicamente una tercera molécula marcada, tal como estreptavidina. (véase, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988).
Ensayos de unión competitivos:
Los ensayos de unión pueden ser del tipo competitivo. La cantidad de miostatina presente en la muestra se mide indirectamente mediante la medición de la cantidad de miostatina desplazada, o sometida a competición fuera, de un agente de unión mediante la miostatina presente en la muestra. En un ensayo de unión competitivo preferido se añade una cantidad conocida de miostatina, normalmente marcada, a la muestra y se pone en contacto entonces la muestra con el agente de unión. La cantidad de miostatina marcada unida al agente de unión es inversamente proporcional a la concentración de miostatina presente en la muestra. (siguiendo los protocolos encontrados en, por ejemplo Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, capítulo 14, pág. 579-583, supra).
En otro ensayo de unión competitivo preferido, el agente de unión se inmoviliza sobre un sustrato sólido. La cantidad de miostatina unida al agente de unión puede determinarse o bien midiendo la cantidad de miostatina presente en un complejo de miostatina/agente de unión, o bien como alternativa midiendo la cantidad de miostatina que no forma complejo restante.
Otros ensayos de unión
La presente invención también proporciona procedimientos de inmunotransferencias tipo Western para detectar o cuantificar la presencia de miostatina en una muestra. La técnica generalmente comprende separar proteínas de muestra mediante electroforesis en gel en base al peso molecular y transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado, tal como filtro de nitrocelulosa, un filtro de nailon, o filtro de nailon derivatizado. La muestra se incuba con los agentes de unión o fragmento de los mismos que se unen a miostatina y se detecta el complejo resultante. Estos agentes de unión pueden marcarse directamente o como alternativa pueden detectarse posteriormente usando anticuerpo marcados que se unen específicamente al agente de unión.
Ensayos de diagnóstico
Los agentes de unión o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico de afecciones o enfermedades caracterizadas por un aumento de cantidades de miostatina. Los ensayos de diagnóstico de altos niveles de miostatina incluyen procedimientos que utilizan un agente de unión y un marcador para detectar miostatina en fluidos corporales humanos, extractos de células o extractos de tejido específicos. Por ejemplo, los niveles séricos de miostatina pueden medirse en un individuo a lo largo del tiempo para determinar la aparición de desgaste muscular asociado con el envejecimiento o la inactividad, tal como se describe, por ejemplo, en Yarasheski y col, supra. Se mostró que un aumento de niveles de miostatina estaba correlacionado con una reducción promedio de la masa muscular y masa libre de grasa en grupos de hombres y mujeres de edades crecientes (Yarasheski y col, supra). Los agentes de unión de la presente invención pueden ser útiles para supervisar aumentos o reducciones de los niveles de miostatina con un individuo dado a lo largo del tiempo, por ejemplo. Los agentes de unión pueden usarse en tales ensayos con o sin modificación. En un ensayo de diagnóstico preferido, los agentes de unión se marcarán mediante la unión, por ejemplo, de un marcador o una molécula indicadora. Se conoce una amplia variedad de marcadores y moléculas indicadoras, algunas de las cuales se han descrito ya en el presente documento. En particular, la presente invención es útil para el diagnóstico de enfermedad humana.
Se conocen en la técnica una variedad de protocolos para medir proteínas miostatina usando agentes de unión a miostatina. Ciertos ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas realizaciones, los agentes de unión de la presente invención normalmente se marcarán con un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que pueda producir,
o bien directa o bien indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, -galactosidasa, o peroxidasa de rábano (Bayer y col, Meth Enz, 184: 138 (1990)).
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de agentes de unión a miostatina tales como los pepticuerpos descritos en el presente documento están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un agente de unión a miostatina, fragmento, variante o derivado del mismo tal como se describe en el presente documento, en mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden agentes de unión antagonistas que inhiben la miostatina parcial o completamente en mezcla con un agente farmacéuticamente aceptable. Normalmente, los agentes de unión a miostatina se purificarán de manera suficiente para la administración a un animal.
La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la transparencia, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); agentes antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina
o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); agentes de relleno; monosacáridos; disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes; agentes aromatizantes y de dilución; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones de formación de sal (tal como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino (preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18º edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
La composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración pretendida, el formato de administración y la dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de eliminación in vivo del agente de unión.
El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para la administración parenteral. Otros vehículos a modo de ejemplo son solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica. Otras composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En una realización de la presente invención, pueden prepararse composiciones de agente de unión para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulación opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, el producto de agente de unión puede formularse como liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para administración parenteral. Como alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración enteral tal como por vía oral, por vía auditiva, por vía oftálmica, por vía rectal por vía vaginal. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de los conocimientos de la técnica.
Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.
Cuando se considera la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una disolución acuosa, parenteralmente aceptable, libre de pirógeno que comprende el agente de unión deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que un agente de unión se formula como una disolución isotónica, estéril, conservada de manera apropiada. Aún otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico)), perlas o liposomas, que proporciona la liberación controlada o sostenida del producto que puede administrarse entonces por medio de una inyección de liberación lenta. También puede usarse ácido hialurónico y esto puede tener el efecto de promocionar la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de administración de fármacos implantables.
En otro aspecto, pueden formularse formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los vehículos y disolventes lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácido graso sintético, tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. También pueden usarse para la administración aminopolímeros policatiónicos no lipídicos. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores adecuados o agentes para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas. En otra realización, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. Por ejemplo, un agente de unión puede formularse como polvo seco para inhalación. También pueden formularse disoluciones de inhalación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido con un agente propelente para la administración de aerosol. Aún en otra realización, pueden nebulizarse disoluciones. Se describe además la administración pulmonar en la solicitud PCT n.º PCT/US94/001875, que describe la administración pulmonar de proteínas químicamente modificadas.
También se contempla que ciertas formulaciones pueden administrarse por vía oral. En una realización de la presente invención, las moléculas de agente de unión que se administran de este modo pueden formularse con o sin los vehículos usados normalmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la molécula de agente de unión. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral también pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, pastillas, grajeas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones y similares, para la ingestión por el paciente.
Las preparaciones farmacéuticas para su uso oral pueden obtenerse a través de la combinación de compuestos activos con excipiente sólido y el tratamiento de los gránulos resultantes (opcionalmente, tras el molido) para obtener comprimidos o núcleos de grajeas. Si se desea pueden añadirse agentes auxiliares adecuados. Los excipientes adecuados incluyen agentes de relleno de hidratos de carbono o proteínas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sódica; gomas, incluyendo arábiga y tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar y ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.
Pueden usarse núcleos de grajeas conjuntamente con revestimientos adecuados, tales como disoluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes orgánicos adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de grajeas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral también incluyen cápsulas duras preparadas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas preparadas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con agentes de relleno o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.
Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de agente de unión en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Mediante la disolución de los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que implican moléculas de agente de unión en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica conocen también técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como vehículos de liposoma, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de liberación lenta. Véase por ejemplo, el documento PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la administración de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (documentos U.S. 3.773.919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y col, Biopolymers, 22:547-556 (1983), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer y col, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer y col, Chem. Tech., 12: 98-105(1982)), acetato de etilenvinilo (Langer y col, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Eppstein y col, PNAS (EE.UU.), 82:3688 (1985); documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949.
La composición farmacéutica que va a usarse para la administración in vivo normalmente debe ser estéril. Esto puede realizarse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Si la composición está liofilizada, la esterilización usando este procedimiento puede realizarse o bien antes de o bien tras la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en disolución. Además, las composiciones parenterales se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, un vial o bolsa de disolución intravenosa que tiene un tapón puncionable mediante una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse o bien en forma lista para su uso o bien en forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere la reconstitución antes de la administración.
En una realización específica, la presente invención se refiere a kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits pueden contener daca uno tanto un primer recipiente que tiene una proteína secada como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También están incluidos dentro del alcance de esta invención kits que contienen jeringas precargadas de una única cámara o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos y liojeringas).
Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos y contexto terapéuticos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variará por tanto dependiendo , en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que está usándose la molécula de agente de unión, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y estado (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede valorar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede oscilar desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosificación puede oscilar desde 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg; o de 5 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o en modelos de animal tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. Un modelo de animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede usarse entonces para determinar dosis útiles y vías de administración en seres humanos.
La dosificación exacta se determinará en vista de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y frecuencia de administración, combinación (combinaciones) de fármacos, sensibilidades de reacción y respuesta a la terapia. Pueden administrarse composiciones farmacéuticas de acción duradera cada 3 a 4 días, cada semana o bisemanalmente dependiendo de la semivida y tasa de eliminación de la formulación particular.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de agente de unión en la formulación usada. Normalmente, una composición se administra hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. La composición puede administrarse por tanto como dosis única, o como dosis múltiple (en las concentraciones/dosificaciones iguales o diferentes) con respecto al tiempo o como infusión continua. Se realiza de manera rutinaria un perfeccionamiento adicional de la dosificación apropiada. Pueden comprobarse dosificaciones apropiadas mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.
La vía de administración de la composición farmacéutica es según los procedimientos conocidos, por ejemplo por vía oral, a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, intralesional, medios intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmico, subcutáneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópico, sublingual, uretral, vaginal o rectal, mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse mediante inyección en bolo o de manera continua mediante infusión, o mediante dispositivo de implantación.
Como alternativa o adicionalmente, la composición puede administrarse por vía local por medio de implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por medio de difusión, bolo de liberación gradual o administración continua.
En algunos casos puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de manera ex vivo. En tales casos, las células, los tejidos u órganos que se han extraído del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas tras lo cual las células, los tejidos y/u órganos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.
En otros casos, un agente de unión de la presente invención tal como un pepticuerpo puede administrarse mediante la implantación de ciertas células que se han modificado mediante ingeniería genética, usando procedimientos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas o xenogénicas. Opcionalmente, las células pueden inmortalizarse. Con el fin de reducir la probabilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son normalmente membranas o envolturas poliméricas, semipermeables, biocompatibles que permiten la liberación del (de los) producto(s) de proteína pero evita la destrucción de las células mediante el sistema inmunitario del paciente o mediante otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
Se administran composiciones farmacéuticas que contienen los agentes de unión de la presente invención a un sujeto para tratar cualquier trastorno relacionado con miostatina. Estos incluyen trastornos de desgaste muscular incluyendo, pero sin limitarse a distrofia muscular, desgaste muscular en cáncer, SIDA, atrofia muscular, artritis reumatoide, insuficiencia renal/uremia, insuficiencia cardiaca crónica, reposo en cama prolongado, lesión de la médula espinal, ictus y sarcopenia relacionada con el envejecimiento. Además. Estas composiciones se administran para tratar la obesidad, diabetes, hiperglucemia, y aumentar la densidad ósea.
Habiéndose descrito la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación. Sólo estos péptidos mencionados en los ejemplos que comprenden las secuencias de aminoácidos tal como se expone en SEC ID Nº : 353 son una realización de la presente invención. Todos los otros péptidos se mencionan sólo para fines de ilustración.
Ejemplo 1
Identificación de péptidos de unión a miostatina
Se usaron tres bibliotecas de fagos filamentosos, TN8-IX (5X109 transformantes independientes), TN12-I (1,4X109 transformantes independientes), y lineal (2,3X109 transformantes independientes) (Dyax Corp.) para seleccionar el fago de unión a miostatina. Se incubó cada biblioteca en superficies cubiertas con miostatina y se sometió a diferentes condiciones de cribado: elución no específica y elución específica usando la quimera IIB/Fc de receptor de activina humano recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), o elución de propéptido de miostatina tal como se describe a continuación. Para las tres bibliotecas, se eluyeron los fagos de una manera no específica para la primera ronda de selección, mientras que el receptor y promiostatina se usó en las rondas segunda y tercera de selección. Los procedimientos de selección se llevaron a cabo tal como se describe a continuación.
Preparación de miostatina
Se produjo la proteína miostatina de manera recombinante en la cepa K-12 2596 de E.coli (n.º ATCC 202174) tal como sigue. Se clonaron los polinucleótidos que codifican la molécula de promiostatina humana en el vector de expresión pAMG21 (n.º ATCC 98113), que se derivaba del vector de expresión pCFM1656 (n.º ATCC 69576) y el sistema de vectores de expresión descrito en la patente estadounidense n.º 4.710.473, siguiendo el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional publicada WO 00/24782. Se obtuvieron los polinucleótidos que codifican promiostatina de un vector de expresión de mamífero. Se amplificó la región codificante usando un procedimiento de PCR convencional y los siguientes cebadores de PCR para introducir el sitio de restricción para NdeI y BamHI.
cebador 5’: 5’-GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGCAAAAAG-3’ (SEC ID Nº: 292)
cebador 3’: 5’-AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3’ (SEC ID Nº: 293). Se digirieron el producto de PCR y el vector con ambas enzimas, se mezclaron y se ligaron. Se transformó el producto de la ligación en la cepa n.º 2596 de E. coli. Se inspeccionaron microscópicamente las colonias individuales para determinar la expresión de proteína recombinante en forma de cuerpos de inclusión. Se aisló el plásmido y se secuenció a través de la región codificante del gen recombinante para verificar la fidelidad genética.
Se generó una pasta bacteriana a partir de una fermentación de 10 l usando un procedimiento discontinuo a 37ºC. Se indujo el cultivo con HSL a una densidad celular de 9,6 DO600 y se recogió seis horas más tarde a una densidad de 104 DO600. Se conservó la pasta a -80ºC. Se lisó la pasta de E.coli que expresaba promiostatina en un microfluidizador a 16.000 psi, se centrifugó para aislar la fracción de cuerpos de inclusión insoluble. Se resuspendieron los cuerpos de inclusión en clorhidrato de guanidina que contenía ditiotreitol y se solubilizaron a temperatura ambiente. Esto se diluyó entonces 30 veces en un tampón acuoso. Entonces se concentró la promiostatina replegada y se cambió el tampón por Tris 20 mM pH 8,0, y se aplicó a una columna de intercambio aniónico. Se eluyó la columna de intercambio aniónico con un gradiente de cloruro de sodio creciente. Se combinaron las fracciones que contenían promiostatina. La promiostatina producida en E. coli carece de los primeros 23 aminoácidos y comienza con una metionina antes del residuo 24 de asparagina. Para producir miostatina madura, la promiostatina combinada se escindió enzimáticamente entre el extremo C terminal de miostatina madura y propéptido. Se aplicó entonces la mezcla resultante a una columna C4-rpHPLC usando un gradiente creciente de acetonitrilo que contenía ácido trifluoroacético al 0,1%. Se combinaron las fracciones que contenían miostatina madura y se secaron en un concentrador speed-vac.
Se sometió a prueba la miostatina madura recombinante producida a partir de E. coli en el ensayo basado en mioblastos C2C12 descrito a continuación y se encontró que estaba completamente activa en comparación con miostatina murina recombinante producida comercialmente en un sistema de células de mamífero (R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). Se usó la miostatina madura producida en E. coli en los ensayos de presentación en fago y selección descritos a continuación.
Preparación de tubos cubiertos con miostatina
Se inmovilizó miostatina en tubos ImmunoTM (NUNC) de 5 ml a una concentración de 8 ug de proteína miostatina en 1 ml de tampón carbonato de sodio 0,1 M (pH 9,6). Se incubo el tubo ImmunoTM cubierto con miostatina con agitación orbital durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se bloqueo el tubo ImmunoTM cubierto con miostatina añadiendo 5 ml de PBS-leche al 2% e incubando a temperatura ambiente durante 1 hora con rotación. Se lavó entonces el tubo ImmunoTM cubierto con miostatina resultante tres veces con PBS antes de someterse a los procedimientos de selección. También se prepararon tubos ImmunoTM adicionales para selecciones negativas (sin miostatina). Para cada condición de cribado, se sometieron de cinco a diez tubos ImmunoTM al procedimiento anterior excepto porque se cubrieron los tubos ImmunoTM con 1 ml de PBS-BSA al 2% en lugar de proteína miostatina.
Selección negativa
Para cada condición de cribado, se tomaron alícuotas de aproximadamente 100 equivalentes de biblioteca aleatoria de bibliotecas TN8-IX y TN12-I (5X1011 ufp para TN8-IX, y 1,4X1011 ufp para TN12-I) y aproximadamente 10 equivalentes de biblioteca aleatoria de la biblioteca lineal (2,3X1010 ufp) a partir de la disolución madre de bibliotecas y se diluyeron hasta 1 ml con PBST (PBS con Tween-20 al 0,05%). El 1 ml de disolución madre de bibliotecas diluida se añadió a un tubo ImmunoTM preparado para la selección negativa y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación orbital. Se extrajo el sobrenadante de fagos y se añadió al segundo tubo ImmunoTM para otra etapa de selección negativa. De este modo, se realizaron de cinco a diez etapas de selección negativa.
Selección para la unión a miostatina
Tras la última etapa de selección negativa anterior, se añadió el sobrenadante de fagos a los tubos ImmunoTM cubiertos con miostatina preparados. Se incubó el tubo ImmunoTM con agitación orbital durante una hora a temperatura ambiente, dejando que el fago específico se uniera a miostatina. Después de descartar el sobrenadante, se lavó el tubo ImmunoTM aproximadamente 15 veces PBS-leche al 2%, 10 veces con PBST y dos veces con PBS para las tres rondas de selección con las tres bibliotecas (bibliotecas TN8-1X, TN12-I y lineal) excepto porque para la segunda ronda de selecciones con bibliotecas TN8-IX y TN12-I, se lavó el tubo ImmunoTM aproximadamente 14 veces con PBS-leche al 2%, dos veces con PBS-BSA al 2%, 10 veces con PBST y una vez con PBS.
Elución no específica
Tras la última etapa de lavado, se eluyeron los fagos unidos del tubo ImmunoTM añadiendo 1 ml de disolución de trietilamina 100 mM (Sigma, St. Louis, Missouri) con incubación de 10 minutos con agitación orbital. Entonces se neutralizó el pH de la disolución que contenía fagos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5).
Elución de receptor (receptor de activina humano) de fago unido
Para la ronda 2 y 3, tras la última etapa de lavado, se eluyeron los fagos unidos del tubo ImmunoTM añadiendo 1 ml de proteína receptora 1 M (quimera IIB/Fc de receptor de activina humano recombinante, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) con una incubación de 1 hora para cada condición.
Elución de propéptido de fago unido
Para la ronda 2 y 3, tras la última etapa de lavado, se eluyeron los fagos unidos del tubo ImmunoTM añadiendo 1 ml de proteína propéptido 1 M (preparada tal como se describió anteriormente) con una incubación de 1 hora para cada condición.
Amplificación de fagos
Se hizo crecer cultivo nuevo de E. coli. (XL-1 Blue MRF’) hasta DO600 = 0,5 en medios LB que contenían 12,5 ug/ml de tetraciclina. Para cada condición de cribado se congelaron en hielo y se centrifugaron 20 ml de este cultivo. Se resuspendió el sedimento de bacterias en 1 ml de la disolución de sales min A.
Se añadió cada mezcla de diferentes procedimientos de elución a una muestra de bacterias concentrada y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 2 ml de medio NZCYM (2x NZCYM, 50 ug/ml de ampicilina) a cada mezcla y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Se colocaron en placa los 4 ml de disolución resultante en una placa grande de agar con NZCYM que contenía 50 ug/ml de ampicilina y se incubó durante la noche a 37ºC.
Cada mezcla de bacterias/fago que se hizo crecer durante la noche en una placa grande de agar con NZCYM se eliminó por rascado en 35 ml de medio LB, y se enjuagó adicionalmente la placa de agar con 35 ml adicionales de medio LB. Se centrifugó la mezcla de bacterias/fago resultante en medio LB para separar por sedimentación las bacterias. Se transfirieron 50 ul del sobrenadante de fagos a un tubo nuevo y se añadieron 12,5 ml de disolución de PEG (20% de PEG8000, acetato de amonio 3,5 M) y se incubó en hielo durante 2 horas para precipitar los fagos. Se centrifugaron hacia abajo los fagos precipitados y se resuspendieron en 6 ml del tampón de resuspensión de fago (NaCl 250 mM, Tris 100 mM pH 8, EDTA 1 mM). Esta disolución de fago se purificó adicionalmente separando por centrifugación las bacterias restantes y precipitando el fago por segunda vez añadiendo 1,5 ml de la disolución de PEG. Tras una etapa de centrifugación, se resuspendió el sedimento de fago en 400 ul de PBS. Esta disolución se sometió a una centrifugación final para deshacerse de los residuos bacterianos restantes. Se valoró la preparación de fago resultante mediante un ensayo de formación de placas convencional (Molecular Cloning, Maniatis y col, 3ª edición).
Rondas adicionales de selección y amplificación
En la segunda ronda se usó el fago amplificado (1011 ufp) de la primera ronda como fago de entrada para realizar las etapas de selección y amplificación. Se usó a su vez el fago amplificado (1011 ufp) de la segunda ronda como fago de entrada para realizar la tercera ronda de selección y amplificación. Tras las etapas de elución de la tercera ronda, se colocó en placa una pequeña fracción del fago eluido tal como en el ensayo de formación de placas anterior. Se cogieron placas individuales y se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían 100 ul de tampón TE en cada pocillo. Se incubaron estas placas madre a 4ºC durante la noche para dejar que los fagos eluyan en el tampón TE.
Análisis clonal
ELISA de fagos
Los clones de fagos se sometieron a ELISA de fagos y entonces se secuenciaron. Las secuencias se clasificaron tal como se trata a continuación.
Se realizó ELISA de fagos tal como sigue. Se hizo crecer un cultivo de XL-1 Blue MRF’ de E. coli hasta que DO600 alcanzó 0,5. Se repartieron alícuotas de 30 ul de este cultivo en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron 10 ul de fago eluido a cada pocillo y se dejó que las bacterias se infectaran durante 15 min. a temperatura ambiente. Se añadieron a cada pocillo aproximadamente 120 ul de medio LB que contenía 12,5 ug/ml de tetraciclina y 50 ug/ml de ampicilina. Entonces se incubó la placa de microtitulación con agitación durante la noche a 37ºC. Se dejó que la proteína miostatina (2 ug/ml en tampón carbonato de sodio 0,1 M, pH 9,6) cubriera placas MaxisorpTM de 96 pocillos (NUNC) durante la noche a 4ºC. Como control se cubrió una placa MaxisorpTM separada con BSA al 2% preparada en PBS.
Al día siguiente, se descartó el líquido en las placas MaxisorpTM cubiertas con proteína, se lavaron tres veces con PBS y se bloqueó cada pocillo con 300 ul de disolución de leche al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Se descartó la disolución de leche y se lavaron los pocillos tres veces con la disolución de PBS. Tras la última etapa de lavado, se añadieron aproximadamente 50 ul de PBST-leche al 4% a cada pocillo de las placas MaxisorpTM cubiertas con proteína. Se transfirieron aproximadamente 50 ul de cultivos durante la noche de cada pocillo en la placa de microtitulación de 96 pocillos a los correspondientes pocillos de las placas cubiertas con miostatina así como las placas cubiertas con BSA al 2% de control. Se incubaron 100 ul de mezcla en los dos tipos de placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Se descartó el líquido de las placas MaxisorpTM, y se lavaron los pocillos aproximadamente tres veces con PBST seguido de dos veces con PBS. Se diluyó el anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) hasta aproximadamente 1:7.500, y se añadieron 100 ul de la disolución diluida a cada pocillo de las placas MaxisorpTM durante 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Se descartó de nuevo el líquido y se lavaron los pocillos aproximadamente tres veces con PBST seguido de dos veces con PBS. Se añadieron 100 ul de sustrato quimioluminiscente LumiGloTM (KPL) a cada pocillo de las placas MaxisorpTM y se incubaron durante aproximadamente 5 minutos para que se produjera la reacción. Se leyó la unidad quimioluminiscente de las placas MaxisorpTM en un lector de placas (Lab System).
Secuenciación de los clones de fagos
Para cada clon de fago se preparó el molde de secuenciación mediante un procedimiento de PCR. Se usó el siguiente par de oligonucleótidos para amplificar un fragmento de 500 nucleótidos: cebador n.º 1: 5’CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’ (SEC ID Nº: 294) y cebador n.º 2: 5’CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’ (SEC ID Nº: 295). Se preparó la siguiente mezcla para cada clon.
Reactivos
Volumen (l) / tubo
H2O destilada
26,25
Glicerol al 50%
10
10 tampón de PCR (sin MgCl2)
5
MgCl2 25 mM
4
Mezcla de dNTP 10 mM
1
Cebador 1 100 M
0,25
Cebador 2 100 M
0,25
Taq polimerasa
0,25
Fago en TE (sección 4)
3
Volumen de reacción final
50
Se usó un termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem) para ejecutar el siguiente programa: [94ºC durante 5 min.; 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 45 s] x30 ciclos; 72ºC durante 7 min.;
5 enfriar hasta 4ºC. Se purificó el producto de PCR de cada reacción usando el kit de purificación para PCR QIAquick Multiwell (Qiagen), siguiendo el protocolo del fabricante. Se verificó el producto purificado de PCR haciendo correr 10 ul de cada reacción de PCR mezclados con 1 ul de colorante (10X colorante de carga de gel de agarosa BBXS) en un gel de agarosa al 1%. Entonces se secuenció el producto restante usando el secuenciador ABI 377 (Perkin Elmer) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.
10 Análisis y clasificación de secuencias
Las secuencias de péptido que se tradujeron a partir de las secuencias de nucleótidos estaban correlacionadas con los datos de ELISA. Se identificaron los clones que mostraron altas unidades de quimioluminiscencia en los pocillos cubiertos de miostatina y bajas unidades de quimioluminiscencia en los pocillos cubiertos de BSA al 2%. Se identificaron las secuencias que se producían múltiples veces. Las secuencias candidatas seleccionadas basándose 15 en sus criterios se sometieron a análisis adicionales como pepticuerpos. Se analizaron aproximadamente 1200 clones individuales. De éstos se seleccionaron aproximadamente 132 péptidos para generar los pepticuerpos de lapresente invención. Éstos se muestran en la tabla I a continuación. Se usaron los péptidos que tenían la SEC ID Nº: 1 a 129 para generar pepticuerpos del mismo nombre. Los péptidos que tienen la SEC ID Nº: 130 a 141 mostrados en la tabla 1 comprenden dos o más péptidos de la SEC ID Nº: 1 a 132 unidos mediante una secuencia de ligador.
20 También se usaron la SEC ID Nº: 130 a 141 para generar pepticuerpos del mismo nombre.
Se determinaron las secuencias consenso para el grupo de péptidos derivado de TN-8. Éstos son como sigue:
KDXCXXWHWMCKPX (SEC ID Nº: 142)
WXXCXXXGFWCXNX (SEC ID Nº: 143)
IXGCXWWDXXCYXX (SEC ID Nº: 144)
25 XXWCVSPXWFCXXX (SEC ID Nº: 145)
XXXCPWFAXXCVDW (SEC ID Nº: 146)
Para todas las secuencias consenso anteriores, las “secuencias de núcleo” subrayadas de cada secuencia consenso son los aminoácidos que siempre se producen en esa posición. “X” se refiere a cualquier aminoácido que se produce de manera natural o modificado. Las dos cisteínas contenidas con las secuencias de núcleo eran
30 aminoácidos fijados en la biblioteca TN8-IX.
TABLA I
NOMBRE DE PEPTICUERPO SEC. ID Nº
SECUENCIA DE PÉPTIDO
Miostatina-TN8-Con1
KDKCKMWHWMCKPP
Miostatina-TN8-Con2
KDLCAMWHWMCKPP
Miostatina-TN8-Con3
KDLCKMWKWMCKPP
Miostatina-TN8-Con4
KDLCKMWHWMCKPK
Miostatina-TN8-Con5
WYPCYEFHFWCYDL
Miostatina-TN8-Con6
WYPCYEGHFWCYDL
Miostatina-TN8-Con7
IFGCKWWDVQCYQF
Miostatina-TN8-Con8
IFGCKWWDVDCYQF
Miostatina-TN8-Con9
ADWCVSPNWFCMVM
Miostatina-TN8-Con10
HKFCPWWALFCWDF
Miostatina-TN8-1
KDLCKMWHWMCKPP
Miostatina-TN8-2
IDKCAIWGWMCPPL
Miostatina-TN8-3
WYPCGEFGMWCLNV
Miostatina-TN8-4
WFTCLWNCDNE
Miostatina-TN8-5
HTPCPWFAPLCVEW
Miostatina-TN8-6
KEWCWRWKWMCKPE
Miostatina-TN8-7
FETCPSWAYFCLDI
Miostatina-TN8-8
AYKCEANDWGCWWL
Miostatina-TN8-9
NSWCEDQWHRCWWL
Miostatina-TN8-10
WSACYAGHFWCYDL
Miostatina-TN8-11
ANWCVSPNWFCMVM
Miostatina-TN8-12
WTECYQQEFWCWNL
Miostatina-TN8-13
ENTCERWKWMCPPK
Miostatina-TN8-14
WLPCHQEGFWCMNF
Miostatina-TN8-15
STMCSQWHWMCNPF
Miostatina-TN8-16
IFGCHWWDVDCYQF
Miostatina-TN8-17
IYGCKWWDIQCYDI
Miostatina-TN8-18
PDWCIDPDWWCKFW
Miostatina-TN8-19
QGHCTRWPWMCPPY
Miostatina-TN8-20
WQECYREGFWCLQT
Miostatina-TN8-21
WFDCYGPGFKCWSP
Miostatina-TN8-22
GVRCPKGHLWCLYP
(cont.) (cont.) (cont.) (cont.)
NOMBRE DE PEPTICUERPO
SEC. ID Nº SECUENCIA DE PÉPTIDO
Miostatina-TN8-23
33 HWACGYWPWSCKWV
Miostatina-TN8-24
34 GPACHSPWWWCVFG
Miostatina-TN8-25
35 TTWCISPMWFCSQQ
Miostatina-TN8-26
36 HKFCPPWAIFCWDF
Miostatina-TN8-27
37 PDWCVSPRWYCNMW
Miostatina-TN8-28
38 VWKCHWFGMDCEPT
Miostatina-TN8-29
39 KKHCQIWTWMCAPK
Miostatina-TN8-30
40 WFQCGSTLFWCYNL
Miostatina-TN8-31
41 WSPCYDHYFYCYTI
Miostatina-TN8-32
42 SWMCGFFKEVCMWV
Miostatina-TN8-33
43 EMLCMIHPVFCNPH
Miostatina-TN8-34
44 LKTCNLWPWMCPPL
Miostatina-TN8-35
45 VVGCKWYEAWCYNK
Miostatina-TN8-36
46 PIHCTQWAWMCPPT
Miostatina-TN8-37
47 DSNCPWYFLSCVIF
Miostatina-TN8-38
48 HIWCNLAMMKCVEM
Miostatina-TN8-39
49 NLQCIYFZGKCIYF
Miostatina-TN8-40
50 AWRCMWFSDVCTPG
Miostatina-TN8-41
51 WFRCFLDADWCTSV
Miostatina-TN8-42
52 EKICQMWSWMCAPP
Miostatina-TN8-43
53 WFYCHLNKSECTEP
Miostatina-TN8-44
54 FWRCAIGIDKCKRV
Miostatina-TN8-45
55 NLGCKWYEVWCFTY
Miostatina-TN8-46
56 IDLCNMWDGMCYPP
Miostatina-TN8-47
57 EMPCNIWGWMCPPV
Miostatina-TN12-1
58 WFRCVLTGIVDWSECFGL
Miostatina-TN12-2
59 GFSCTFGLDEFYVDCSPF
Miostatina-TN12-3
60 LPWCHDQVNADWGFCMLW
Miostatina-TN12-4
61 YPTCSEKFWIYGQTCVLW
Miostatina-TN12-5
62 LGPCPIHHGPWPQYCVYW
Miostatina-TN12-6
63 PFPCETHQISWLGHCLSF
Miostatina-TN12-7
64 HWGCEDLMWSWHPLCRRP
NOMBRE DE PEPTICUERPO
SEC. ID Nº SECUENCIA DE PÉPTIDO
Miostatina-TN12-8
65 LPLCDADMMPTIGFCVAY
Miostatina-TN12-9
66 SHWCETTFWMNYAKCVHA
Miostatina-TN12-10
67 LPKCTHVPFDQGGFCLWY
Miostatina-TN12-11
68 FSSCWSPVSRQDMFCVFY
Miostatina-TN12-13
69 SHKCEYSGWLQPLCYRP
Miostatina-TN12-14
70 PWWCQDNYVQHMLHCDSP
Miostatina-TN12-15
71 WFRCMLMNSFDAFQCVSY
Miostatina-TN12-16
72 PDACRDQPWYMFMGCMLG
Miostatina-TN12-17
73 FLACFVEFELCFDS
Miostatina-TN12-18
74 SAYCITTESDPYVLCVPL
Miostatina-TN12-19
75 PSICESYSTMWLPMCQHN
Miostatina-TN12-20
76 WLDCHDDSWAWTKMCRSH
Miostatina-TN12-21
77 YLNCVMMNTSPFVECVFN
Miostatina-TN12-22
78 YPWCDGFMIQQGITCMFY
Miostatina-TN12-23
79 FDYCTWLNGFKDWKCWSR
Miostatina-TN12-24
80 LPLCNLKEISHVQACVLF
Miostatina-TN12-25
81 SPECAFARWLGIEQCQRD
Miostatina-TN12-26
82 YPQCFNLHLLEWTECDWF
Miostatina-TN12-27
83 RWRCEIYDSEFLPKCWFF
Miostatina-TN12-28
84 LVGCDNVWHRCKLF
Miostatina-TN12-29
85 AGWCHVWGEMFGMGCSAL
Miostatina-TN12-30
86 HHECEWMARWMSLDCVGL
Miostatina-TN12-31
87 FPMCGIAGMKDFDFCVWY
Miostatina-TN12-32
88 RDDCTFWPEWLWKLCERP
Miostatina-TN12-33
89 YNFCSYLFGVSKEACQLP
Miostatina-TN12-34
90 AHWCEQGPWRYGNICMAY
Miostatina-TN12-35
91 NLVCGKISAWGDEACARA
Miostatina-TN12-36
92 HNVCTIMGPSMKWFCWND
Miostatina-TN12-37
93 NDLCAMWGWRNTIWCQNS
Miostatina-TN12-38
94 PPFCQNDNDMLQSLCKLL
Miostatina-TN12-39
95 WYDCNVPNELLSGLCRLF
Miostatina-TN12-40
96 YGDCDQNHWMWPFRCLSL
Miostatina-TN12-41
97 GWMCHFDLHDWGATCQPD
NOMBRE DE PEPTICUERPO
SEC. ID Nº SECUENCIA DE PÉPTIDO
Miostatina-TN12-42
98 YFHCMFGGHEFEVHCESF
Miostatina-TN12-43
99 AYWCWHGQCVRF
Miostatina-Lineal-1
100 SEHWTFTDWDGNEWWVRPF
Miostatina-Lineal-2
101 MEMLDSLFELLKDMVPISKA
Miostatina-Lineal-3
102 SPPEEALMEWLGWQYGKFT
Miostatina-Lineal-4
103 SPENLLNDLYILMTKQEWYG
Miostatina-Lineal-5
104 FHWEEGIPFHVVTPYSYDRM
Miostatina-Lineal-6
105 KRLLEQFMNDLAELVSGHS
Miostatina-Lineal-7
106 DTRDALFQEFYEFVRSRLVI
Miostatina-Lineal-8
107 RMSAAPRPLTYRDIMDQYWH
Miostatina-Lineal-9
108 NDKAHFFEMFMFDVHNFVES
Miostatina-Lineal-10
109 QTQAQKIDGLWELLQSIRNQ
Miostatina-Lineal-11
110 MLSEFEEFLGNLVHRQEA
Miostatina-Lineal-12
111 YTPKMGSEWTSFWHNRIHYL
Miostatina-Lineal-13
112 LNDTLLRELKMVLNSLSDMK
Miostatina-Lineal-14
113 FDVERDLMRWLEGFMQSAAT
Miostatina-Lineal-15
114 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
Miostatina-Lineal-16
115 VESLHQLQMWLDQKLASGPH
Miostatina-Lineal-17
116 RATLLKDFWQLVEGYGDN
Miostatina-Lineal-18
117 EELLREFYRFVSAFDY
Miostatina-Lineal-19
118 GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG
Miostatina-Lineal-20
119 YREMSMLEGLLDVLERLQHY
Miostatina-Lineal-21
120 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ
Miostatina-Lineal-22
121 WREHFLNSDYIRDKLIAIDG
Miostatina-Lineal-23
122 QFPFYVFDDLPAQLEYWIA
Miostatina-Lineal-24
123 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN
Miostatina-Lineal-25
124 EALFQNFFRDVLTLSEREY
Miostatina-Lineal-26
125 QYWEQQWMTYFRENGLHVQY
Miostatina-Lineal-27
126 NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS
Miostatina-Lineal-29
127 FLDELKAELSRHYALDDLDE
Miostatina-Lineal-30
128 GKLIEGLLNELMQLETFMPD
Miostatina-Lineal-31
129 ILLLDEYKKDWKSWF
NOMBRE DE PEPTICUERPO
SEC. ID Nº SECUENCIA DE PÉPTIDO
Miostatina-2xTN8-19 kc
130 imagen1
Miostatina-2xTN8-con6
131 imagen1
Miostatina-2xTN8-5 kc
132 imagen1
Miostatina-2xTN8-18 kc
133
Miostatina-2xTN8-11 kc
134
Miostatina-2xTN8-25 kc
135 imagen1
Miostatina-2xTN8-23 kc
136 imagen1
Miostatina-TN8-29-19 kc
137 imagen1
Miostatina-TN8-19-29 kc
138 imagen1
Miostatina-TN8-29-19 kn
139 imagen1
Miostatina-TN8-29-19-8g
140 imagen1
Miostatina-TN8-19-29-6gc
141 imagen1
Ejemplo 2 Generación de pepticuerpos Construcción de ADN que codifica proteínas de fusión péptido-Fc
Se usaron péptidos capaces de unirse a miostatina solos o en combinación entre sí para construir proteínas de fusión en las que se fusionó un péptido con el dominio Fc de IgG1 humana. La secuencia de aminoácidos de la parte Fc de cada pepticuerpo es tal como sigue (desde el extremo amino terminal hasta el extremo carboxilo terminal):
imagen1
El péptido se fusionó en la configuración N (se unió el péptido al extremo N terminal de la región Fc), la configuración C (se unió el péptido al extremo C terminal de la región Fc), o la configuración N, C (péptido unido 10 tanto en el extremo N terminal como C terminal de la región Fc). Se usaron vectores separados para expresar fusiones N-terminales y fusiones C-terminales. Se construyó cada pepticuerpo mediante el apareamiento de pares de oligonucleótidos (“oligos”) al ácido nucleico de fago seleccionado para generar una secuencia de nucleótidos bicatenaria que codifica el péptido. Se construyeron estas moléculas de polinucleótidos como fragmentos ApaL a XhoI. Se ligaron los fragmentos en o bien el vector N terminal pAMG21-Fc para la orientación N terminal, o bien el 15 vector C terminal pAMG21-Fc para la orientación C terminal que se habían digerido previamente con ApaLI y XhoI. Se transformaron las mezclas de ligación resultantes mediante electroporación en células de cepa 2596 ó 4167 de
E. coli (una variante hsdR- de células de cepa 2596) usando procedimientos convencionales. Se seleccionaron clones para determinar la capacidad de producir el producto de proteína recombinante y para tener la fusión génica con una secuencia de nucleótidos correcta. Se seleccionó un clon individual de este tipo por cada uno de los
20 péptidos modificados.
Muchos de los constructos se crearon usando un vector alternativo designado pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc. Este vector es similar al vector descrito anteriormente excepto porque se realizó la digestión del vector con BsmBI. Algunos constructos fusionaron secuencias de péptido en ambos extremos de la Fc. En algunos casos, el vector era un producto compuesto de pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc y pAMG21-2xBs-C-Fc.
25 Construcción de pAMG21
El plásmido de expresión pAMG21 (n.º ATCC 98113) se deriva del vector de expresión pCFM1656 (n.º ATCC 69576) y el sistema de vectores de expresión descrito en la patente estadounidense n.º 4.710.473, siguiendo el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional publicada WO 00/24782, todos los cuales se incorporan en el presente documento como referencia.
30 Vector N terminal de Fc
Se construyó el vector N terminal de Fc usando el vector pAMG21 Fc_GIy5_ Tpo como molde. Se diseñó un cebador para PCR en 5’ (a continuación) para eliminar la secuencia de péptido Tpo en pAMG Tpo Gly5 y sustituirla por un poliligador que contenía sitios ApaLI y XhoI. Con el uso de este vector como molde se realizó la PCR con polimerasa Expand Long, usando el siguiente cebador en 5’ y un cebador en 3’ universal:
35 cebador en 5’:
imagen1
cebador en 3’: 5’-GGTCATTACTGGACCGGATC-3’ (Sec ID Nº: 298)
Se purificó en gel el producto de PCR resultante y se digirió con enzimas de restricción NdeI y BsrGI. Se purificaron en gel tanto el plásmido como el polinucleótido que codifica el péptido de interés junto con su ligador usando
40 columnas de centrifugado de purificación en gel Qiagen (Chatsworth, CA). Entonces se ligaron el plásmido y el insertó usando procedimientos de ligación convencionales y se transformó la mezcla de ligación resultante en células de E. coli (cepa 2596). Se seleccionaron clones individuales y se realizó la secuenciación de ADN. Se identificó un clon correcto y se usó éste como fuente de vector para los péptidos modificados descritos en el presente documento.
Construcción de vector C terminal de Fc
Se construyó el vector C terminal de Fc usando el vector pAMG21 Fc_Gly5_ Tpo como molde. Se diseñó un cebador de PCR en 3’ para eliminar la secuencia de péptido Tpo y sustituirla por un poliligador que contenía sitios ApaLI y XhoI. Se realizó la PCR con polimerasa Expand Long usando un cebador en 5’ universal y el cebador en 3’.
cebador en 5’: 5’-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3’ (Sec ID Nº: 299)
cebador en 3’:
imagen1
Se purificó en gel el producto de PCR resultante y se digirió con enzimas de restricción BsrGI y BamHI. Se purificaron en gel tanto el plásmido como el polinucleótido que codifica cada uno de los péptidos de interés junto con 10 su ligador por medio de columnas de centrifugación de purificación en gel Qiagen. Entonces se ligaron el plásmido y el inserto usando procedimientos de ligación convencionales y se transformó la mezcla de ligación resultante en células de E. coli (cepa 2596). La cepa 2596 (n.º ATCC 202174) es una cepa de E. coli K-12 modificada para que contenga el promotor lux y dos represores lambda sensibles a la temperatura, el represor cI857s7 y el lac IQ. Se seleccionaron clones individuales y se realizó la secuenciación de ADN. Se identificó un clon correcto y se usó como
15 fuente de cada pepticuerpo descrito en el presente documento.
Expresión en E. coli.
Se hicieron crecer cultivos de cada uno de los constructos de fusión pAMG21-Fc en la cepa 2596 de E. coli a 37ºC en medio Terrific Broth (véase Tartof y Hobbs, “Improved media for growing plasmid and cosmid clones”, Bethesda Research Labs Focus, volumen 9, página 12, 1987, citado en la referencia de Sambrook y col mencionada 20 anteriormente). Se logró la inducción de la expresión de producto génico a partir del promotor luxPR tras la adición del autoinductor sintético, N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina lactona, al medio de cultivo a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro (ng/ml). Se incubaron los cultivos a 37ºC durante seis horas adicionales. Entonces se examinaron los cultivos bacterianos por microscopio para determinar la presencia de cuerpos de inclusión y se recogieron mediante centrifugación. Se observaron cuerpos de inclusión refráctiles en cultivos inducidos, lo que
25 indica que las fusiones de Fc se producían lo más probablemente en la fracción insoluble en E. coli. Se lisaron los sedimentos celulares directamente mediante la resuspensión en tampón de muestra Laemmli que contenía mercaptoetanol al 10% y entonces se analizaron mediante SDS-PAGE. En la mayoría de los casos, se observó una banda teñida de coomassie intensa del peso molecular apropiado en un gel SDS-PAGE.
Plegamiento y purificación de pepticuerpos
30 Se rompieron las células en agua (1/10 volumen por volumen) mediante homogeneización a alta presión (3 pases a
15.000 PSI) y se recogieron los cuerpos de inclusión mediante centrifugación (4000 RPM en J-6B durante 30 minutos). Se solubilizaron los cuerpos de inclusión en guanidina 6 M, Tris 50 mM, DTT 8 mM, pH 8,0 durante 1 hora a una proporción 1/10 a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla solubilizada 25 veces en urea 4 M, glicerol al 20%, Tris 50 mM, arginina 160 mM, cisteína 3 mM, cistamina 1 mM, pH 8,5. Se incubó la mezcla durante la noche 35 en frío. Entonces se dializó la mezcla frente a Tris 10 mM pH 8,5, NaCl 50 mM, urea 1,5 M. Tras una diálisis durante la noche se ajustó el pH del dializado hasta pH 5 con ácido acético. Se eliminó el precipitado mediante centrifugación y se cargó el sobrenadante en una columna de flujo rápido SP-Sepharose equilibrada en NaAc 10 mM, NaCl 50 mM, pH 5, 4ºC). Tras la carga se lavó columna hasta la línea basal con NaAc 10 mM, NaCl 50 mM, pH 5,2. Se desarrolló la columna con un gradiente de 20 volúmenes de columna desde NaCl 50 mM-500 mM en el
40 tampón acetato. Como alternativa, tras el lavado hasta la línea basal, se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de fosfato de sodio 10 mM pH 7,0 y se desarrolló la columna con un gradiente de 15 volúmenes de columna desde NaCl 0-400 mM en tampón fosfato. Se analizaron las fracciones de columna mediante SDS-PAGE. Se combinaron las fracciones que contenían pepticuerpo dimérico. Se analizaron también las fracciones mediante filtración en gel para determinar si estaba presente cualquier agregado.
45 Se prepararon varios pepticuerpos a partir de los péptidos de la tabla I. Se unieron los péptidos a la molécula de Fc de IgG1 humana para formar los pepticuerpos de la tabla II. Con respecto a los pepticuerpos de la tabla II, la configuración C indica que el péptido mencionado estaba unido a los extremos C terminales de la Fc. La configuración N indica que el péptido mencionado estaba unido a los extremos N terminales de la Fc. La configuración N, C indica que un péptido estaba unido a los extremos N terminales y otro a los extremos C
50 terminales de cada molécula Fc. La designación 2x indica que los dos péptidos mencionados estaban unidos en tándem entre sí y también a los extremos N terminal o C terminal, o ambos al N, C de la Fc, separados por el ligador indicado. Dos péptidos unidos en tándem separados por un ligador se indican, por ejemplo, como Miostatina-TN829-19-8g, que indica que el péptido TN8-29 está unido por medio de un ligador (gly)8 al péptido TN8-19. El (los) péptido(s) estaba(n) unido(s) a la Fc por medio de una secuencia de ligador (gly)5 a menos que se especifique lo
55 contrario. En algunos casos, el (los) péptido(s) estaba(n) unido(s) por medio de un ligador k. El ligador designado k o 1k se refiere a la secuencia de ligador gsgsatggsgstassgsgsatg (Sec ID Nº: 301), refiriéndose kc al ligador unido al extremo C terminal de la Fc, y refiriéndose kn al ligador unido al extremo N terminal de la Fc. En la tabla II a continuación, la columna 4 se refiere a la secuencia de ligador que conecta la Fc con el primer péptido y la quinta columna se refiere a la configuración N o C o ambas. Puesto que la molécula Fc dimeriza en disolución, un pepticuerpo construido de modo que tenga un péptido será realmente un dímero con dos copias del péptido y dos
5 moléculas Fc, y la versión 2X con dos péptidos en tándem será realmente un dímero con cuatro copias del péptido y dos moléculas Fc.
Puesto que los pepticuerpos proporcionados en la tabla II se expresan en E. coli, el primer residuo de aminoácido es Met (M). Por tanto, los pepticuerpos en la configuración N son Met-péptido-ligador-Fc, o Met-péptido-ligador-péptidoligador-Fc, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración C están dispuestos como Met-Fc-ligador-péptido o
10 Met-Fc-ligador-péptido-ligador-péptido, por ejemplo. Los pepticuerpos en la configuración C, N son una combinación de ambos, por ejemplo, Met-péptido-ligador-Fc-ligador-péptido.
Se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican pepticuerpos a modo de ejemplo a continuación en la tabla
II. Las secuencias de polinucleótidos que codifican un pepticuerpo a modo de ejemplo de la presente invención incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de polipéptido de Fc tal como la siguiente:
imagen2
Además, se incluyen los polinucleótidos que codifican el ligador ggggg tal como el siguiente:
5’-GGTGGAGGTGGTGGT-3’ (Sec ID Nº: 302)
el polinucleótido que codifica el pepticuerpo también incluye el codón que codifica el ATG de metionina y un codón de terminación tal como TAA.
20 Por tanto, la estructura del primer pepticuerpo en la tabla II es TN8-Con1 con una configuración C y un ligador (gly)5 es tal como sigue: M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP (Sec ID Nº: 303). Los polinucleótidos a modo de ejemplo que codifican este pepticuerpo serían:
imagen1
TABLA II
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN8-con1
KDKCKMWHWMCKPP imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-con2
KDLCAMWHWMCKPP imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-con3
KDLCKMWKWMCKPP imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-con4
KDLCKMWHWMCKPK 5 gly C
Miostatina-TN8-con5
WYPCYEFHFWCYDL 5 gly C
Miostatina-TN8-con5
WYPCYEFHFWCYDL 5 gly N
Miostatina-TN8-con6
WYPCYEGHFWCYDL imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-con6
WYPCYEGHFWCYDL 5 gly N
Miostatina-TN8-con7
IFGCKWWDVQCYQF 5 gly C
Miostatina-TN8-con8
IFGCKWWDVDCYQF 5 gly C
Miostatina-TN8-con8
IFGCKWWDVDCYQF imagen1 5 gly N
(cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.)
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN8-con9
ADWCVSPNWFCMVM 5 gly C
Miostatina-TN8con10
HKFCPWWALFCWDF 5 gly C
Miostatina-TN8-1
KDLCKMWHWMCKPP 5 gly C
Miostatina-TN8-2
IDKCAIWGWMCPPL imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-3
WYPCGEFGMWCLNV imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-4
WFTCLWNCDNE 5 gly C
Miostatina-TN8-5
HTPCPWFAPLCVEW 5 gly C
Miostatina-TN8-6
KEWCWRWKWMCKPE 5 gly C
Miostatina-TN8-7
FETCPSWAYFCLDI 5 gly C
Miostatina-TN8-7
FETCPSWAYFCLDI 5 gly N
Miostatina-TN8-8
AYKCEANDWGCWWL 5 gly C
Miostatina-TN8-9
NSWCEDQWHRCWWL 5 gly C
Miostatina-TN8-10
WSACYAGHFWCYDL 5 gly C
Miostatina-TN8-11
ANWCVSPNWFCMVM 5 gly C
Miostatina-TN8-12
WTECYQQEFWCWNL 5 gly C
Miostatina-TN8-13
ENTCERWKWMCPPK 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN8-14
WLPCHQEGFWCMNF 5 gly C
Miostatina-TN8-15
STMCSQWHWMCNPF 5 gly C
Miostatina-TN8-16
IFGCHWWDVDCYQF 5 gly C
Miostatina-TN8-17
IYGCKWWDIQCYDI 5 gly C
Miostatina-TN8-18
PDWCIDPDWWCKFW 5 gly C
Miostatina-TN8-19
QGHCTRWPWMCPPY 5 gly C
Miostatina-TN8-20
WQECYREGFWCLQT 5 gly C
Miostatina-TN8-21
WFDCYGPGFKCWSP 5 gly C
Miostatina-TN8-22
GVRCPKGHLWCLYP 5 gly C
Miostatina-TN8-23
HWACGYWPWSCKWV 5 gly C
Miostatina-TN8-24
GPACHSPWWWCVFG 5 gly C
Miostatina-TN8-25
TTWCISPMWFCSQQ imagen1 5 gly C
Miostatina-TN8-26
HKFCPPWAIFCWDF 5 gly N
Miostatina-TN8-27
PDWCVSPRWYCNMW 5 gly N
Miostatina-TN8-28
VWKCHWFGMDCEPT 5 gly N
Miostatina-TN8-29
KKHCQIWTWMCAPK 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN8-30
WFQCGSTLFWCYNL 5 gly N
Miostatina-TN8-31
WSPCYDHYFYCYTI 5 gly N
Miostatina-TN8-32
SWMCGFFKEVCMWV 5 gly N
Miostatina-TN8-33
EMLCMIHPVFCNPH 5 gly N
Miostatina-TN8-34
LKTCNLWPWMCPPL 5 gly N
Miostatina-TN8-35
VVGCKWYEAWCYNK imagen1 5 gly N
Miostatina-TN8-36
PIHCTQWAWMCPPT 5 gly N
Miostatina-TN8-37
DSNCPWYFLSCVIF 5 gly N
Miostatina-TN8-38
HIWCNLAMMKCVEM 5 gly N
Miostatina-TN8-39
NLQCIYFLGKCIYF 5 gly N
Miostatina-TN8-40
AWRCMWFSDVCTPG 5 gly N
Miostatina-TN8-41
WFRCFLDADWCTSV 5 gly N
Miostatina-TN8-42
EKICQMWSWMCAPP 5 gly N
Miostatina-TN8-43
WFYCHLNKSECTEP imagen1 5 gly N
Miostatina-TN8-44
FWRCAIGIDKCKRV 5 gly N
Miostatina-TN8-45
NLGCKWYEVWCFTY imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN8-46
IDLCNMWDGMCYPP 5 gly N
Miostatina-TN8-47
EMPCNIWGWMCPPV 5 gly N
Miostatina-TN12-1
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-2
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-3
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-4
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-5
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-6
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-7
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-8
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-9
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-10
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-11
imagen1 imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-13
imagen1 imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN12-14
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-15
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-16
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-17
FLACFVEFELCFDS imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-18
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-19
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-20
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-21
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-22
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-23
imagen1 imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-24
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-25
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-26
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-27
imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN12-28
LVGCDNVWHRCKLF 5 gly N
Miostatina-TN12-29
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-30
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-31
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-32
imagen1 imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-33
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-34
imagen1 5 gly C
Miostatina-TN12-35
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-36
imagen1 imagen1 5 gly N
imagen1
C
Miostatina-TN12-37
imagen1 imagen1 5 gly NC
Miostatina-TN12-38
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-39
imagen1 5 gly N
Miostatina-TN12-40
imagen1 5 gly NC
Miostatina-TN12-41
imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-TN12-42
imagen1 5 gly NC
Miostatina-TN12-43
AYWCWHGQCVRF 5 gly N
Miostatina-Lineal-1
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-2
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-3
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-4
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-5
imagen1 5 gly N
Miostatina- Lineal-6
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-7
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-8
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-9
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-10
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-11
imagen1 imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-12
imagen1 5 gly N
imagen1
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-Lineal-13
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-14
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-15
imagen1 imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-16
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-17
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-18
EELLREFYRFVSAFDY 5 gly N
Miostatina-Lineal-19
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-20
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-21
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-22
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-23
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-24
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-25
imagen1 5 gly NC
Miostatina-Lineal-26
imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-Lineal-27
imagen1 5 gly NC
Miostatina-Lineal-29
imagen1 5 gly N
Miostatina-Lineal-30
imagen1 5 gly NC
Miostatina-Lineal-31
ILLLDEYKKDWKSWF 5 gly N
Miostatina-2XTN8-19 kc
imagen1 1k N
Miostatina-2XTN8CON6
imagen1 imagen1 5 gly C
Miostatina-2XTN8-5 kc
imagen1 imagen1 1k C
Miostatina-2XTN8-18 kc
imagen1 1k C
Miostatina-2XTN8-11 kc
imagen1 1k C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (Sec ID Nº)
Miostatina-2XTN8-25 kc
imagen1 1k C
Miostatina-2XTN8-23 kc
imagen1 1k C
Miostatina-TN8-2919 kc
imagen1 1k C
Miostatina-TN8-1929 kc
imagen1 1k C
imagen1
imagen1
Miostatina-TN8-2919 kn
imagen1 imagen1 1k N
Miostatina-TN8-2919-8g
imagen1 8 gly C
Miostatina-TN8-1929-6gc
imagen1 6 gly C
Ejemplo 3
Ensayos in vitro
Ensayo de actividad de miostatina basado en células C2C12
Este ensayo demuestra la capacidad neutralizante de miostatina del inhibidor que está sometiéndose a prueba mediante la medición del grado que está inhibida la unión de miostatina a su receptor.
Se generó una línea de células indicadoras que respondían a miostatina mediante la transfección de mioblastocitos C2C12 (n.º ATCC: CRL-1772) con un constructo pMARE-luc. Se preparó el constructo pMARE-luc mediante la clonación de doce repeticiones de la secuencia CAGA, que representa los elementos de respuesta a miostatina/activina (Dennler y col EMBO 17: 3091-3100 (1998)) en un vector indicador pLuc-MCS (n.º de cat. Stratagene 219087) en el sentido de 5’ de la caja TATA. Los mioblastocitos C2C12 expresan naturalmente receptores de miostatina/activina en su superficie celular. Cuando se une miostatina a los receptores celulares, se activa la ruta de Smad, y Smad fosforilado se une al elemento de respuesta (Macias-Silva y col Cell 87:1215 (1996)), dando como resultado la expresión del gen de luciferasa. Entonces se mide la actividad luciferasa usando un kit de ensayo de indicador de luciferasa comercial (n.º cat. E4550, Promega, Madison, WI) según el protocolo del fabricante. Se usó una línea estable de células C2C12 que se habían transfectado con pMARE-luc (clon C2C12/pMARE n.º 44) para medir la actividad de la miostatina según el siguiente procedimiento
Se colocaron en placa igual número de células indicadoras (clon C2C12/pMARE n.º 44) en cultivos de 96 pocillos. Se realizó una primera ronda de selección usando dos diluciones de pepticuerpos con la concentración de miostatina fijada en 4 nM. Se incubó previamente la miostatina madura recombinante durante 2 horas a temperatura ambiente con pepticuerpos a 40 nM y 400 nM respectivamente. El cultivo de células indicadoras se trató con la miostatina con o sin pepticuerpos durante seis horas. Se midió la actividad de la miostatina determinando la actividad luciferasa en los cultivos tratados. Este ensayo se usó para identificar inicialmente casos de pepticuerpos que inhibían la actividad de señalización de miostatina en el ensayo de indicador. Posteriormente, se generó una curva de titulación de nueve puntos con la concentración de miostatina fijada en 4 nM. Se incubó previamente la miostatina con cada una de las siguientes nueve concentraciones de pepticuerpos: 0,04 mM, 0,4 nM, 4 nM, 20 nM, 40 nM, 200 nM, 400 nM, 2 uM y 4 uM durante dos horas antes de añadir la mezcla al cultivo de células indicadoras. Los valores de CI50 fueron para varios pepticuerpos a modo de ejemplo, que se proporcionan en la tabla III y para pepticuerpos madurados por afinidad, en la tabla VIII.
Ensayo BIAcore®
Se realizó un análisis de afinidad de cada pepticuerpo de miostatina candidato en un aparato BIAcore®3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ), que usa un chip sensor CM5, y el 0,005 por ciento de tensioactivo P20 (Biacore, Inc.) como tampón de corrida. Se inmovilizó la proteína miostatina madura recombinante en chip sensor CM5 de calidad para investigación (Biacore, Inc.) por medio de grupos amino primarios usando el kit Amine Coupling (Biacore, Inc.) según el protocolo sugerido por el fabricante.
Se usaron ensayos de unión directos para seleccionar y clasificar los pepticuerpos en orden de su capacidad de unirse a miostatina inmovilizada. Se llevaron a cabo ensayos de unión mediante inyección de dos concentraciones (40 y 400 nM) de cada pepticuerpo de unión a miostatina candidato a la superficie de miostatina inmovilizada a una velocidad de flujo de 50 l/min. durante 3 minutos. Tras un tiempo de disociación de 3 minutos, se regeneró la superficie. Se compararon curvas de unión cualitativamente para determinar la intensidad de señal de unión, así como velocidades de disociación. Se determinaron parámetros cinéticos de unión de pepticuerpos incluyendo ka (constante de velocidad de asociación), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (constante de equilibrio de disociación) usando el programa informático BIA evaluation 3.1 (Biacore, Inc.). Cuanto menores sean las contantes de equilibrio de disociación (expresadas en nM), mayor es la afinidad del pepticuerpo por la miostatina. En la tabla III y tabla VI se muestran ejemplos de valores de KD de pepticuerpo para pepticuerpos madurados por afinidad a continuación.
Ensayo de bloqueo en superficie de ActRIIB/Fc
Se llevaron a cabo ensayos de bloqueo usando ActRIIB/Fc inmovilizado (R&D Systems, Minneapolis, MN) y miostatina en presencia y ausencia de pepticuerpos con el sistema de ensayo BIAcore®. Se usaron ensayos para clasificar pepticuerpos como no neutralizantes (aquéllos que no evitaron la unión de miostatina a ActRIIB/Fc) o neutralizantes (aquéllos que evitaron la unión de miostatina a ActRIIB/Fc). La unión de miostatina-ActRIIB/Fc inicial se determinó por primera vez en ausencia de cualquier pepticuerpo.
Para estudios de selección temprana, se diluyeron pepticuerpos hasta 4 nM, 40 nM y 400 nM en tampón de muestra y se incubaron con miostatina 4 nM (también diluida en tampón de muestra). Se dejó que las mezclas pepticuerpo:ligando alcanzaran el equilibrio a temperatura ambiente (al menos 5 horas) y entonces se inyectaron sobre la superficie de ActRIIB/Fc inmovilizado durante 20 a 30 minutos a una velocidad de flujo de 10 ul/min. Un aumento de la respuesta de unión (con respecto a la unión control sin pepticuerpo) indicaba que la unión de pepticuerpo a miostatina era no neutralizante. Una respuesta de unión reducida (en comparación con el control) indicaba que la unión de pepticuerpo a miostatina bloqueaba la unión de miostatina a ActRIIB/Fc. Se caracterizaron además pepticuerpos adicionales usando el ensayo de bloqueo de una serie de concentración completa con el fin de derivar valores de CI50 (para pepticuerpos neutralizantes) o CE50 (para pepticuerpos no neutralizantes). Se diluyeron las muestras de pepticuerpos en serie desde 200 nM hasta 0,05 mM en tampón de muestra y se incubaron con miostatina 4 mM a temperatura ambiente para alcanzar el equilibrio (mínimo de cinco horas) antes de inyectarse sobre la superficie de ActRIIB/Fc inmovilizado durante 20 a 30 minutos a una velocidad de flujo de 10 ul/min. Tras la inyección de muestras, se dejó que el ligando unido se disociara del receptor durante 3 minutos. Con el trazado de la señal de unión frente a concentración de pepticuerpo, se calcularon los valores CI50 para cada pepticuerpo en presencia de miostatina 4 nM. Se encontró, por ejemplo, que los pepticuerpos TN8-19, L2 y L17 inhiben la actividad de la miostatina en el ensayo basado en células, pero la unión de TN-8-19 no bloquea las interacciones de miostatina/ActRIIB/Fc, lo que indica que TN-8-19 se une a un epítopo diferente del que se observa para los otros dos pepticuerpos.
Unión a epítopos para pepticuerpos
Se inmovilizó un pepticuerpo purificado sobre un chip BIAcore para capturar miostatina antes de la inyección de un segundo pepticuerpo, y se determinó la cantidad de pepticuerpo secundario unido a la miostatina capturada. Sólo los pepticuerpos con epítopos distintos se unirán a la miostatina capturada, permitiendo de ese modo la unión de pepticuerpos con propiedades de unión a epítopos similares o distintas. Por ejemplo, se demostró que los pepticuerpos TN8-19 y L23 se unen a diferentes epítopos en la miostatina.
Ensayos de selectividad
Se realizaron estos ensayos usando la tecnología BIAcore®, para determinar la selectividad de unión de los pepticuerpos a otros miembros de la familia TGF. Se acoplaron covalentemente ActRIIB/Fc, TGFRII/Fc y BMPR-1A/Fc (todos obtenidos de R & D Systems, Minneapolis, MN) a chips sensores de calidad para investigación según el protocolo sugerido por el fabricante. Ya que el ensayo de BIAcore detecta cambios en el índice de refracción, la diferencia entre la respuesta detectada con la inyección sobre las superficies de receptor inmovilizado en comparación con la respuesta detectada con la inyección sobre la superficie control en ausencia de cualquier pepticuerpo representa la unión real de activina A, TGF1, TGF3 y BMP4 a los receptores, respectivamente. Con la incubación previa de pepticuerpos y moléculas TGF, un cambio (aumento o disminución) de la respuesta de unión indica la unión de pepticuerpo a la familia TGF de moléculas. Los pepticuerpos de la presente invención se unen todos a miostatina pero no a activina A, TGF1, TGF3 o BMP4.
Ensayos de equilibrio KinEx ATM
Se usaron ensayos de unión de equilibrio basados en disolución que utilizan la tecnología KinExATM (Sapidyne Instruments, Inc.) para determinar el equilibrio de disociación (KD) de la unión de miostatina a moléculas de pepticuerpo. Este ensayo basado en disolución se considera que es más sensible que el ensayo de BIAcore en algunos casos. Se cubrió previamente 6x el Reacti-GelTM con aproximadamente 50 ug/ml de miostatina durante la noche y entonces se bloqueo con BSA. Se incubaron 30 pM y 100 pM de muestras de pepticuerpo con diversas concentraciones (de 0,5 pM a 5 nM) de miostatina en tampón de muestra a temperatura ambiente durante 8 horas antes de que se hicieran correr a través de las perlas cubiertas de miostatina. Se cuantificó la cantidad del pepticuerpo unido a perlas mediante anticuerpo de cabra anti-Fc humana marcado de manera fluorescente (Cy5) a 1 mg/ml en SuperBlock. La señal de unión es proporcional a la concentración de pepticuerpo libre en equilibrio con una concentración de miostatina dada. Se obtuvo KD a partir de la regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogéneo de un sitio de doble curva proporcionado en el software KinEx ATM (Sapidyne Instruments, Inc.).
Ejemplo 4
Comparación de inhibidores de miostatina
Se comparó la capacidad de tres pepticuerpos de primera ronda a modo de ejemplo de unirse a (KD) e inhibir (CI50) con los valores de KD y CI50 obtenidos para la proteína de fusión receptora soluble actRIIB/Fc (R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.). Se determinaron los valores de CI50 usando el ensayo basado en células pMARE luc descrito en el ejemplo 3 y se determinaron los valores de KD usando el ensayo Biacore® descrito en el ejemplo 3.
TABLA III
Inhibidor
CI50 (nM) KD (nM)
ActRIIB/Fc
~83 ~7
2xTN8-19-kc
~9 ~2
TN8-19
~23 ~2
TN8-29
~26 ~60
TN12-34
~30 ----
Lineal-20
~11 -----
Los pepticuerpos tienen un CI50 que está mejorada con respecto al inhibidor de receptor/Fc y las afinidades de unión que son comparables en dos pepticuerpos con el receptor/Fc.
5 Ejemplo 5
Comparación de la capacidad de péptido y pepticuerpo para inhibir miostatina
La siguiente secuencia de péptido: QGHCTRWPWMCPPY (TN8-19) (SEC ID Nº: 33) se usó para construir el correspondiente pepticuerpo TN8-19 (pepticuerpo) según el procedimiento descrito en el ejemplo 2 anteriormente. Se seleccionó tanto el péptido solo como el pepticuerpo para determinar la actividad inhibidora de miostatina usando
10 el ensayo basado en C2C12 descrito en el ejemplo 3 anteriormente. Puede observarse a partir de la figura 1 que la CI50 (concentración eficaz para el cincuenta por ciento de inhibición de miostatina) del pepticuerpo es significativamente menor que la del péptido, y por tanto la capacidad del péptido para inhibir la actividad de la miostatina ha mejorado sustancialmente colocándola en la configuración de pepticuerpo.
Ejemplo 6
15 Generación de péptidos y pepticuerpos madurados por afinidad
Se seleccionaron varios de los péptidos de primera ronda usados para la generación de pepticuerpos para la maduración por afinidad. Los péptidos seleccionados incluían los siguientes: la cisteína restringida TN8-19, QGHCTRWPWMCPPY (SEC ID Nº: 33), y los péptidos lineales Lineal-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEC ID Nº: 104); Lineal-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEC ID NO: 117); Lineal-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEC ID 20 Nº: 119); Lineal-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEC ID Nº: 122), Lineal-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEC ID Nº: 123), Lineal-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEC ID Nº: 126). Basándose en una secuencia consenso, se generaron bibliotecas de presentación en fago secundarias dirigidas en las que los aminoácidos de “núcleo” (determinados a partir de la secuencia consenso) o bien se mantenían constantes o bien sesgados en frecuencia de aparición. Como alternativa, podría usarse una secuencia de péptido individual para generar una biblioteca de
25 presentación en fago dirigida, sesgada. Con la selección de tales bibliotecas en condiciones más rigurosas pueden proporcionarse péptidos con unión potenciada a miostatina, unión selectiva a miostatina, o con alguna propiedad deseada adicional.
Producción de oligos dopados para bibliotecas
Se sintetizaron oligonucleótidos en un sintetizador de ADN que estaban “dopados” al 91% en las secuencias de
30 núcleo, es decir, cada disolución era el 91% de la base representada (A, G, C, o T), y el 3% de cada uno de los otros 3 nucleótidos. Para la familia TN8-19, por ejemplo, un oligo dopado al 91% usado para la construcción de una biblioteca de fagos secundaria era la siguiente:
imagen1
en la que “N” indica que cada uno de los cuatro nucleótidos A, T, C y G estaban representados igualmente, K indica
35 que G y T estaban representados igualmente, y la letra en minúscula representa una mezcla del 91% de la base indicada y el 3% de cada uno de las otras bases. La familia de oligonucleótidos preparada de esta manera se amplificó por PCR tal como se describió anteriormente, se ligó en un vector fagémido, por ejemplo, un plásmido pCES1 modificado (Dyax), o cualquier vector fagémido disponible según el protocolo descrito anteriormente. las bibliotecas de fagos secundarias generadas estaban todas dopadas al 91% y tenían entre 1 y 6,5x 109 transformantes independientes. Se cribaron las bibliotecas tal como se describió anteriormente, pero con las
siguiente condiciones:
Cribado de 1ª ronda:
Número de fago de entrada:
1012 - 1013 ufc de fagémido
Procedimiento de selección:
selección con tubos Nunc-Immuno
Selección negativa:
2 X con tubos Nunc-Immuno cubiertos con BSA al 2% a 10 min. cada uno
Revestimiento de cribado:
cubrir con 1 g de proteína miostatina en 1 ml de tampón carbonato de sodio
0,1 M (pH 9,6)
Tiempo de unión:
3 horas
Condiciones de lavado:
6 X PBST-leche al 2%; 6 X PBST; 2 X PBS
Condición de elución:
elución con TEA 100 mM
Cribado de 2ª ronda:
Número de fago de entrada:
1011 ufc de fagémido
Procedimiento de selección:
selección con tubos Nunc-Immuno
Selección negativa:
2 X con tubos Nunc-Immuno cubiertos con BSA al 2% a 30 min. cada uno
Revestimiento de cribado:
cubrir con 1 g de proteína miostatina en 1 ml de tampón carbonato de sodio
0,1 M (pH 9,6)
Tiempo de unión:
1 hora
Condiciones de lavado:
15 X PBST-leche al 2%, 1 X PBST-leche al 2% durante 1 h, 10 X PBST-BSA
al 2%, 1 X PBST-BSA al 2% durante 1 h, 10 X PBST y 3 X PBS
Condición de elución:
elución con TEA 100 mM
Cribado de 3ª ronda:
Número de fago de entrada:
1010 ufc de fagémido
Procedimiento de selección:
selección con tubos Nunc-Immuno
Selección negativa:
6 X con tubos Nunc-Immuno cubiertos con BSA al 2% a 10 min. cada uno
Revestimiento de cribado:
cubrir con 0,1 g de proteína miostatina en 1 ml de tampón carbonato de
sodio 0,1 M (pH 9,6)
Tiempo de unión:
1 hora
Condiciones de lavado:
15 X PBST-leche al 2%, 1 X PBST-leche al 2% durante 1 h, 10 X PBST-BSA
al 2%, 1 X PBST-BSA al 2% durante 1 h, 10 X PBST y 3 X PBS
Condición de elución:
elución con TEA 100 mM
El cribado de las bibliotecas secundarias proporcionó péptidos con unión potenciada a miostatina. Se sometieron a ELISA de fago clones individuales seleccionados, tal como se describió anteriormente, y se secuenciaron.
La siguiente familia de péptidos TN8-19 madurada por afinidad se muestra en la tabla IV a continuación.
Pepticuerpo madurado por afinidad mTN8-19-1 mTN8-19-2 mTN8-19-3 mTN8-19-4 mTN8-19-5 mTN8-19-6 mTN8-19-7 mTN8-19-8 mTN8-19-9 mTN8-19-10
TABLA IV SEC ID Nº: 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 Secuencia de péptido VALHGQCTRWPWMCPPQREG YPEQGLCTRWPWMCPPQTLA GLNQGHCTRWPWMCPPQDSN MITQGQCTRWPWMCPPQPSG AGAQEHCTRWPWMCAPNDWI GVNQGQCTRWRWMCPPNGWE LADHGQCIRWPWMCPPEGWE ILEQAQCTRWPWMCPPQRGG TQTHAQCTRWPWMCPPQWEG VVTQGHCTLWPWMCPPQRWR
mTN8-19-11
315 IYPHDQCTRWPWMCPPQPYP
mTN8-19-12
316 SYWQGQCTRWPWMCPPQWRG
mTN8-19-13
317 MWQQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-14
318 EFTQWHCTRWPWMCPPQRSQ
mTN8-19-15
319 LDDQWQCTRWPWMCPPQGFS
mTN8-19-16
320 YQTQGLCTRWPWMCPPQSQR
mTN8-19-17
321 ESNQGQCTRWPWMCPPQGGW
mTN8-19-1
322 WTDRGPCTRWPWMCPPQANG
mTN8-19-19
323 VGTQGQCTRWPWMCPPYETG
mTN8-19-20
324 PYEQGKCTRWPWMCPPYEVE
mTN8-19-21
325 SEYQGLCTRWPWMCPPQGWK
mTN8-19-22
326 TFSQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-23
327 PGAHDHCTRWPWMCPPQSRY
mTN8-19-24
328 VAEEWHCRRWPWMCPPQDWR
(cont.)
Pepticuerpo madurado por afinidad
TABLA IV SEC ID Nº: Secuencia de péptido
mTN8-19-25
329 VGTQGHCTRWPWMCPPQPAG
mTN8-19-26
330 EEDQAHCRSWPWMCPPQGWV
mTN8-19-27
331 ADTQGHCTRWPWMCPPQHWF
mTN8-19-28
332 SGPQGHCTRWPWMCAPQGWF
mTN8-19-29
333 TLVQGHCTRWPWMCPPQRWV
mTN8-19-30
334 GMAHGKCTRWAWMCPPQSWK
mTN8-19-31
335 ELYHGQCTRWPWMCPPQSWA
mTN8-19-32
336 VADHGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-33
337 PESQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-34
338 IPAHGHCTRWPWMCPPQRWR
mTN8-19-35
339 FTVHGHCTRWPWMCPPYGWV
mTN8-19-36
340 PDFPGHCTRWRWMCPPQGWE
mTN8-19-37
341 QLWQGPCTQWPWMCPPKGRY
mTN8-19-38
342 HANDGHCTRWQWMCPPQWGG
mTN8-19-39
343 ETDHGLCTRWPWMCPPYGAR
mTN8-19-40
344 GTWQGLCTRWPWMCPPQGWQ
mTN8-19 con1
345 VATQGQCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19 con2
346 VATQGQCTRWPWMCPPQRWG
mTN8 con6-1
347 QREWYPCYGGHLWCYDLHKA
mTN8 con6-2
348 ISAWYSCYAGHFWCWDLKQK
mTN8 con6-3
349 WTGWYQCYGGHLWCYDLRRK
mTN8 con6-4
350 KTFWYPCYDGHFWCYNLKSS
mTN8 con6-5
351 ESRWYPCYEGHLWCFDLTET
La secuencia consenso derivada de las TN-8-19-1 a Con2 (excluyendo las secuencias mTN8 con6) maduras por
afinidad mostradas anteriormente es: Ca1a2Wa3WMCPP (SEC ID Nº: 352). Todos estos péptido comprenden la
5 secuencia WMCPP (SEC ID Nº: 633). Los aminoácidos subrayados representan los aminoácidos de núcleo
presentes en todos las realizaciones, y a1, a2 y a3 se seleccionan de un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o
básico. En una realización de esta secuencia consenso, Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), b1 se selecciona de
uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; y b3 se selecciona de uno
cualquiera de P, R y Q. Todos los péptidos comprenden la secuencia WMCPP (SEC ID Nº: 633). Un análisis más 10 detallado de las secuencias TN8 maduradas por afinidad que comprenden SEC ID Nº: 352 proporciona la siguiente
fórmula:
c1c2c3c4c5c6Cc7c8Wc9WMCPPc10c11c12c13 (SEC ID Nº: 354), en la que:
c1 está ausente o es cualquier aminoácido;
c2 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido;
15 c3 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido;
c4 está ausente o es cualquier aminoácido;
c5 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; c6 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico; c7 es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico; c8 es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico;
5 c9 es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico; y en la que c10 a c13 es cualquier aminoácido. En una realización de la formulación anterior, b7 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b8 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; y b9 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q. Esto proporciona la siguiente secuencia:
10 d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPPd10d11d12d13 (SEC ID Nº: 355). d1 está ausente o es cualquier aminoácido; d2 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d3 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d4 está ausente o es cualquier aminoácido;
15 d5 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o ácido; d6 está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico; d7 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; d8 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; d9 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q
20 y d10 a d13 se seleccionan de cualquier aminoácido.
La secuencia consenso de la serie mTN8 con6 es WYe1e2Ye3G, (SEC ID Nº: 356) en la que e1 es P, S o Y; e2 es C o Q, y e3 es G o H. Además de la familia madurada por afinidad TN-19, se produjeron péptidos madurados por afinidad adicionales a partir de los péptidos de primera ronda L-2, L-15, L-17, L-20, L-21 y L-24 lineales. Estas familias se presentan en la
25 tabla V a continuación.
Pepticuerpo madurado por afinidad
TABLA V SEC ID Nº: Secuencia de péptido
L2mL2-Con1mL2-Con2mL2-1mL2-2mL2-3mL2-4mL2-5mL2-6mL2-7
104 357 358 359 360 361 362 363 364 365 MEMLDSLFELLKDMVPISKA RMEMLESLLELLKEIVPMSKAG RMEMLESLLELLKEIVPMSKAR RMEMLESLLELLKDIVPMSKPS GMEMLESLFELLQEIVPMSKAP RMEMLESLLELLKDIVPISNPP RIEMLESLLELLQEIVPISKAE RMEMLQSLLELLKDIVPMSNAR RMEMLESLLELLKEIVPTSNGT RMEMLESLFELLKEIVPMSKAG
(cont.) (cont.) (cont.)
Pepticuerpo madurado por afinidad mL2-8mL2-9 mL2-10mL2-11mL2-12mL2-13mL2-14mL2-15mL2-16mL2-17mL2-18mL2-19mL2-20mL2-21mL2-22mL2-23mL2-24mL2-25
TABLA V SEC ID Nº: 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380 381 382 383 Secuencia de péptido RMEMLGSLLELLKEIVPMSKAR QMELLDSLFELLKEIVPKSQPA RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR RMEMLESLLELLHEIVPMSQAG QMEMLESLLQLLKEIVPMSKAS RMEMLDSLLELLKDMVPMTTGA RIEMLESLLELLKDMVPMANAS RMEMLESLLQLLNEIVPMSRAR RMEMLESLFDLLKELVPMSKGV RIEMLESLLELLKDIVPIQKAR RMELLESLFELLKDMVPMSDSS RMEMLESLLEVLQEIVPRAKGA RMEMLDSLLQLLNEIVPMSHAR RMEMLESLLELLKDIVPMSNAG RMEMLQSLFELLKGMVPISKAG RMEMLESLLELLKEIVPNSTAA RMEMLQSLLELLKEIVPISKAG RIEMLDSLLELLNELVPMSKAR
L-15
117 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
mL15-con1
384 QVESLQQLLMWLDQKLASGPQG
mL15-1
385 RMELLESLFELLKEMVPRSKAV
mL15-2
386 QAVSLQHLLMWLDQKLASGPQH
mL15-3
387 DEDSLQQLLMWLDQKLASGPQL
mL15-4
388 PVASLQQLLIWLDQKLAQGPHA
mL15-5
389 EVDELQQLLNWLDHKLASGPLQ
my15-6
390 DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG
mL15-7
391 QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV
mL15-8
392 GDESLQHLLMWLEQKLALGPHG
mL15-9
393 QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAF
mL15-10
394 EVDSLQQLLMWLDQKLASGPQA
mL15-11
395 EDESLQQLLIYLDKMLSSGPQV
mL15-12
396 AMDQLHQLLIWLDHKLASGPQA
mL15-13
397 RIEMLESLLELLDEIALIPKAW
Pepticuerpo madurado por afinidad mL15-14mL15-15mL15-16mL15-17mL15-18mL15-19mL15-20mL15-21mL15-22mL15-23mL15-24mL15-25
TABLA V SEC ID Nº: 398 399 400 401 402 403 404 405 406 407 408 409 Secuencia de péptido EVVSLQHLLMWLEHKLASGPDG GGESLQQLLMWLDQQLASGPQR GVESLQQLLIFLDHMLVSGPHD NVESLEHLMMWLERLLASGPYA QVDSLQQLLIWLDHQLASGPKR EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG EVDSLQQLLMWLDQKLASGPHA EVDSLQQLLMWLDQQLASGPQK GVEQLPQLLMWLEQKLASGPQR GEDSLQQLLMWLDQQLAAGPQV ADDSLQQLLMWLDRKLASGPHV PVDSLQQLLIWLDQKLASGPQG
L-17
119 RATLLKDFWQLVEGYGDN
mL17-con1
410 DWRATLLKEFWQLVEGLGDNLV
mL17-con2
411 QSRATLLKEFWQLVEGLGDKQA
mL17-1
412 DGRATLLTEFWQLVQGLGQKEA
mL17-2
413 LARATLLKEFWQLVEGLGEKVV
mL17-3
414 GSRDTLLKEFWQLVVGLGDMQT
mL17-4
415 DARATLLKEFWQLVDAYGDRMV
mL17-5
416 NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW
mL17-6
417 GVRETLLYELWYLLKGLGANQG
mL17-7
418 QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS
mL17-8
419 QERATLLKEFWQLVAGLGQNMR
mL17-9
420 SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW
mL17-10
421 TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW
mL17-11
422 GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG
mL17-12
423 DERETLLKEFWQLVHGWGDNVA
mL17-13
424 GGRATLLKELWQLLEGQGANLV
mL17-14
425 TARATLLNELVQLVKGYGDKLV
mL17-15
426 GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM
mL17-16
427 STRATLLNDLWQLMKGWAEDRG
mL17-17
428 SERATLLKELWQLVGGWGDNFG
mL17-18
429 VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR
mL17-19
430 EIRATLLKEFWQLVDEWREQPN
Pepticuerpo madurado por afinidad mL17-20mL17-21mL17-22mL17-23M17-24mL17-25mL17-26mL17-27
TABLA V SEC ID Nº: 431 432 433 434 435 436 437 438 Secuencia de péptido QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS TQRATLLKEFWQLIEGLGGKHV HYRATLLKEFWQLVDGLREQGV QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM WDRATLLNDFWHLMEELSQKPG QERATLLKEFWRMVEGLGKNRG NERATLLREFWQLVGGYGVNQR
L-20
122 YREMSMLEGLLDVLERLQHY
mL20-1
439 HQRDMSMLWELLDVLDGLRQYS
mL20-2
440 TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR
mL20-3
441 TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR
mL20-4
442 MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI
mL20-5
443 WNRDMRMLESLFEVLDGLRQQV
mL20-6
444 GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL
mL20 con1
445 TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR
mL20 con2
446 WYRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR
L-21
123 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ
mL21-1
447 TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG
mL21-2
448 MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG
mL21-3
449 HDNSRQMLLSDLLHLVGTMIQG
L21-4
450 MENSRQNLLRELIMLVGNMSHQ
mL21-5
451 QDTSRHMLLREFMMLVGEMIQG
mL21 con1
452 DQNSRQMLLSDLMILVGSMIQG
L-24mL24-1mL24-2
126 453 454 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN NVFFQWVQKHGRVVYQWLDINV FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV
Los péptidos madurados por afinidad proporcionados en las tablas IV y V se ensamblan entonces para dar pepticuerpos tal como se describió anteriormente y se someten a ensayo usando los ensayos in vivo.
Los péptidos L2 madurados por afinidad comprenden una secuencia consenso de f1EMLf2SLf3f4LL, (SEC ID Nº: 5 455), en la que f1 es M o I; f2 es cualquier aminoácido; f3 es L o F; y f4 es E, Q o D.
La familia de péptidos L15 madurados por afinidad comprenden la secuencia consenso Lg1g2LLg3g4L, (SEC ID Nº: 456), en la que g1 es Q, D o E, g2 es S, Q, D o E, g3 es cualquier aminoácido, y g4 es L, W, F o Y. La familia L17 madurada por afinidad comprende la secuencia: h1h2h3h4h5h6h7h8h9 (SEC ID Nº: 457) en la que h1 es R o D; h2 es cualquier aminoácido; h3 es A, T. S o Q; h4 es L o M; h5 es L o S; h6 es cualquier aminoácido; h7 es F o E; h8 es W, F
10 o C; y h9 es L, F, M o K. También pueden determinarse las secuencias consenso para las familias de péptidos mL20, mL21 y mL24 mostradas anteriormente. 59
Se construyeron pepticuerpos a partir de estos péptidos madurados por afinidad tal como se describió anteriormente, usando un ligador unido a al dominio Fc de IgG1 humana, que tiene la SEC ID Nº: 296, en el extremo N terminal (configuración N), en el extremo C terminal (configuración C) del Fc, o en ambos de los extremos N y C terminal (configuraciones N,C), tal como se describió en el ejemplo 2 anteriormente. Se unieron los péptidos 5 mencionados a los extremos C o N terminal por medio de una 5 glicina (5G), 8 glicina o k secuencia de ligador. En la versión 2X pepticuerpo, los péptidos se enlazaban con ligadores tales como 5 gly, 8 gly o k. Los péptidos y pepticuerpos madurados por afinidad se designan con una “m” minúscula tal como mTN8-19-22 por ejemplo. Los pepticuerpos de la presente invención contienen además dos sitios de corte y empalme en los que los péptidos se cortan y empalman en los vectores de fagémido. La posición de estos sitios de corte y empalme es AQ-péptido-LE.
10 Los pepticuerpos generalmente incluyen estos aminoácidos adicionales (aunque no están incluidos en las secuencias de péptido enumeradas en las tablas). En algunos pepticuerpos, los aminoácidos LE se eliminan de las secuencias de péptidos. Estos pepticuerpos se designan LE.
A continuación en la tabla VI se proporcionan pepticuerpos a modo de ejemplo, y secuencias de polinucleótidos a modo de ejemplo que los codifican. Esta tabla incluye ejemplos de secuencias de pepticuerpo (a diferencia de
15 péptido sólo), tales como las 2x mTN8-19-7 (SEC ID Nº: 615) y el pepticuerpo con las secuencias LE delecionadas (SEC ID Nº: 617). A modo de explicación, las secuencias de ligador en las versiones 2x se refieren al ligador entre los péptidos en tándem. Estas secuencias de pepticuerpo contienen las secuencias de Fc, de ligadores, AQ y LE. La secuencia de nucleótidos adjunta codifica la secuencia de péptido además de las secuencias de ligador AQ/LE, si está presente, pero no codifica el ligador designado.
20 TABLA VI
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL2-Con1
imagen1 imagen1 5 gly N
mL2-Con2
imagen1 5 gly N
mL2-1
imagen1 5 gly N
mL2-2
imagen1 5 gly N
mL2-3
imagen1 5 gly N
(cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.) (cont.)
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL2-4
imagen1 5 gly N
mL2-5
imagen1 5 gly N
mL2-6
imagen1 5 gly N
mL2-7
imagen1 imagen1 5 gly N
mL2-8
imagen1 5 gly N
mL2-9
imagen1 5 gly N
my2-10
imagen1 5 gly N
mL2-11
imagen1 5 gly N
mL2-12
imagen1 5 gly N
mL2-13
imagen1 5 gly N
mL2-14
imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL2-15
imagen1 5 gly N
mL2-16
imagen1 5 gly N
mL2-17
imagen1 5 gly N
mL2-18
imagen1 5 gly N
mL2-19
imagen1 imagen1 5 gly N
mL2-20
imagen1 5 gly N
mL2-21
imagen1 5 gly N
mL2-22
imagen1 5 gly N
mL2-23
imagen1 5 gly N
mL2-24
imagen1 imagen1 5 gly N
mL2-25
imagen1 imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL17-Conl
imagen1 5 gly N
mL17-1
imagen1 5 gly N
mL17-2
imagen1 5 gly N
mL17-3
imagen1 5 gly N
mL17-4
imagen1 5 gly N
mL17-5
imagen1 imagen1 5 gly N
mL17-6
imagen1 5 gly N
mL17-7
imagen1 5 gly N
mL17-8
imagen1 5 gly N
mL17-9
imagen1 5 gly N
mL17-10
imagen1 5 gly N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL17-11
imagen1 5 gly N
mL17-12
imagen1 5 gly N
mL17-13
imagen1 5 gly N
mL17-14
imagen1 5 gly N
mL17-15
imagen1 imagen1 5 gly N
mL17-16
imagen1 imagen1 5 gly N
mL17-17
imagen1 5 gly N
mL17-18
imagen1 5 gly N
2x mTN8- Con6-(N)-1K
imagen1 1K N
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
2x mTN8- Con6-(C)-1K
imagen1 imagen1 1K C
2x mTN8- Con7-(N)-1K
imagen1 imagen1 1K N
2x mTN8- Con7-(C)-1K
imagen1 imagen1 1K C
2x mTN8- Con8-(N)-1K
imagen1 1K N
2x mTN8- Con8-(C)-1K
imagen1 imagen1 1K C
ML15-Con1
imagen1 imagen1 5 gly C
ML15-1
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL15-2
imagen1 5 gly C
mL15-3
imagen1 5 gly C
mL15-4
imagen1 5 gly C
mL15-5
imagen1 5 gly C
mL15-6
imagen1 5 gly C
mL15-7
imagen1 imagen1 5 gly C
mL15-8
imagen1 imagen1 5 gly C
mL15-9
imagen1 5 gly C
mL15-10
imagen1 5 gly C
mL15-11
imagen1 5 gly C
mL15-12
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL15-13
imagen1 5 gly C
mL15-14
imagen1 5 gly C
mL15-15
imagen1 5 gly C
mL15-16
imagen1 5 gly C
mL15-17
imagen1 5 gly C
mL15-18
imagen1 5 gly C
mL15-19
imagen1 5 gly C
mL15-20
imagen1 imagen1 5 gly C
mL15-21
imagen1 5 gly C
mL15-22
imagen1 5 gly C
mL15-23
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL15-24
imagen1 5 gly C
mL15-25
imagen1 5 gly C
mL17-Con2
imagen1 5 gly C
mL17-19
imagen1 5 gly C
mL17-20
imagen1 5 gly C
mL17-21
imagen1 5 gly C
mL17-22
imagen1 5 gly C
mL17-23
imagen1 5 gly C
mL17-24
imagen1 5 gly C
mL17-25
imagen1 5 gly C
mL17-26
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL17-27
imagen1 5 gly C
mTN8Con61
imagen1 5 gly C
mTN8Con62
imagen1 5 gly C
mTN8Con63
imagen1 5 gly C
mTN8Con64
imagen1 5 gly C
mTN8Con65
imagen1 5 gly C
mL24-1
imagen1 5 gly C
mL24-2
imagen1 5 gly C
mL20-1
imagen1 imagen1 5 gly C
mL20-2
imagen1 imagen1 5 gly C
mL20-3
imagen1 imagen1 5 gly C
mL20-4
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mL20-5
imagen1 5 gly C
mL20-6
imagen1 5 gly C
mL20 Con1
imagen1 5 gly C
mL20 Con2
imagen1 5 gly C
mL21-1
imagen1 5 gly C
mL21-2
imagen1 5 gly C
mL21-3
imagen1 5 gly C
mL21-4
imagen1 5 gly C
mL21-5
imagen1 5 gly C
mL21 Con1
imagen1 5 gly C
mTN8-19-1
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mTN8-19-2
imagen1 5 gly C
mTN8-19-3
imagen1 5 gly C
mTN8-19-4
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-5
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-6
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-7
imagen1 5 gly C
mTN8-19-8
imagen1 5 gly C
mTN8-19-9
imagen1 5 gly C
mTN8-19-10
imagen1 5 gly C
mTN8-19-11
imagen1 5 gly C
mTN8-19-12
imagen1 5 gly C
mTN8-19-13
imagen1 5 gly C
mTN8-19-14
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mTN8-19-15
imagen1 5 gly C
mTN8-19-16
imagen1 5 gly C
mTN8-19-17
imagen1 5 gly C
mTN8-19-18
imagen1 5 gly C
mTN8-19-19
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-20
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-21
imagen1 5 gly C
mTN8-19-22
imagen1 5 gly C
mTN8-19-23
imagen1 5 gly C
mTN8-19-24
imagen1 5 gly C
mTN8-19-25
imagen1 5 gly C
mTN8-19-26
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-27
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mTN8-19-28
imagen1 5 gly C
mTN8-19-29
imagen1 5 gly C
mTN8-19-30
imagen1 5 gly C
mTN8-19-31
imagen1 5 gly C
mTN8-19-32
imagen1 imagen1 5 gly C
mTN8-19-33
imagen1 5 gly C
mTN8-19-34
imagen1 5 gly C
mTN8-19-35
imagen1 5 gly C
mTN8-19-36
imagen1 5 gly C
mTN8-19-37
imagen1 5 gly C
mTN8-19-38
imagen1 5 gly C
mTN8-19-39
imagen1 5 gly C
mTN8-19-40
imagen1 5 gly C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
mTN8-19 Con1
imagen1 5 gly C
mTN8-19 Con2
imagen1 5 gly C
2X mTN819-7
imagen1 1K C
2X mTN819-7 ST-GG del2x LE
imagen1 1K C
2X mTN819-21
imagen1 1K C
2X mTN819-21 STGG del2x LE
imagen1 1K C
Nombre de pepticuerpo
Péptido Secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº) Ligador Extremo terminal
2X mTN819-22
imagen1 imagen1 1K C
2X mTN819-32
imagen1 imagen1 1K C
2X mTN819-32 STGG del2x LE
imagen1 imagen1 1K C
2X mTN819-33
imagen1 imagen1 1K C
2X mTN819-33 STGG del2x LE
imagen1 imagen1 1K C
Ejemplo 7 Selección in vitro de pepticuerpos madurados por afinidad
Se seleccionaron los siguientes pepticuerpos a modo de ejemplo según los protocolos expuestos anteriormente para 75
obtener los siguientes valores de KD y CI50. La tabla VII muestra el intervalo de valores de KD para pepticuerpos madurados por afinidad seleccionados en comparación con los pepticuerpos originales, tal como se determina mediante ensayos basados en disolución KinExATM o ensayos BIAcore®. Estos valores demuestran un aumento de la afinidad de unión de los pepticuerpos madurados por afinidad por miostatina en comparación con los pepticuerpos originales. La tabla VIII muestra valores de CI50 para varios pepticuerpos madurados por afinidad. En esta tabla se proporciona un intervalo de valores.
TABLA VII
pepticuerpos
KD
TN8-19 (original)
> 1 nM
2x mTN8-19 (original)
> 1 nM
1x mTN8-19-7
10 pM
2x mTN8-19-7
12 pM
1x mTN8-19-21
6 pM
2x mTN8-19-21
6 pM
1x mTN8-19-32
9 pM
1x mTN8-19-33
21 pM
2x mTN8-19-33
3 pM
1x mTN8-19-22
4 pM
1x mTN8-19-con1
20 pM
TABLA VIII
Pepticuerpo madurado por afinidad
CI50 (nM)
mTN8-19 Con1
1,0 - 4,4
mTN8-19-2
7,508-34,39
mTN8-19-4
16,74
mTN8-19-5
7,743 - 3,495
mTN8-19-6
17,26
mTN8-19-7
1,778
mTN8-19-9
22,96-18,77
mTN8-19-10
5,252 - 7,4
mTN8-19-11
28,66
mTN8-19-12
980,4
mTN8-19-13
20,04
mTN8-19-14
4,065 - 6,556
mTN8-19-16
4,654
mTN8-19-21
2,767-3,602
(cont.)
Pepticuerpo madurado por afinidad
CI50 (nM)
mTN8-19-22
1,927-3,258
mTN8-19-23
6,584
mTN8-19-24
1,673-2,927
mTN8-19-27
4,837-4,925
mTN8-19-28
4,387
mTN8-19-29
6,358
mTN8-19-32
1,842-3,348
mTN8-19-33
2,146-2,745
mTN8-19-34
5,028 - 5,069
mTN8Con6-3
86,81
mTN8Con6-5
2385
mTN8-19-7(-LE)
1,75-2,677
mTN8-19-21(-LE)
2,49
mTN8-19-33(-LE)
1,808
2xmTN8-19-7
0,8572 -2,649
2xmTN8-19-9
1,316-1,228
2xmTN8-19-14
1,18-1,322
2xmTN8-19-16
0,9903 -1,451
2xmTN8-19-21
0,828 -1,434
2xmTN8-19-22
0,9937-1,22
2xmTN8-19-27
1,601-3,931
2xmTN8-19-7(-LE)
1,077-1,219
2xmTN8-19-21 (-LE)
0,8827-1,254
2xmTN8-19-33(-LE)
1,12-1,033
mL2-7
90,24
mL2-9
105,5
mL15-7
32,75
mL15-9
354,2
mL20-2
122,6
mL20-3
157,9
mL20-4
160
Ejemplo 8
Actividad anabólica in vivo de pepticuerpos a modo de ejemplo
Se usó el modelo de ratón CD1 nu/nu (Charles River Laboratories, Massachusettes) para determinar la eficacia in vivo de los pepticuerpos de la presente invención que incluían la región Fc humana (huFc). Este modelo respondía a los inhibidores de la presente invención con una respuesta anabólica rápida que estaba asociada con un aumento de la masa de músculo seco y un aumento de las proteínas miofibrilares pero no estaba asociada con la acumulación del contenido de agua corporal.
En un ejemplo, se demostró la eficacia de 1x pepticuerpo mTN8-19-21 in vivo mediante el siguiente experimento. Se trató un grupo de 10 ratones CD1 nu/nu de 8 semanas de edad dos veces semanalmente o una vez semanalmente con dosificaciones de 1 mg/kg, 3 mg/kg y 10 mg/kg (inyección subcutánea). El grupo control de 10 ratones CD1 nu/nu de 8 semanas de edad recibió una inyección dos veces semanalmente (subcutánea) de huFc (vehículo) a 10 mg/kg. Se pesaron los animales un día sí y otro no y se determinó la masa corporal magra mediante RMN el día 0 y el día 13. Se sacrifican entonces los animales en el día 14 y se determina el tamaño del músculo gastrocnemio. Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3. La figura 2 muestra el aumento del peso corporal total de los ratones a lo largo de 14 días para las diversas dosificaciones de pepticuerpo en comparación con el control. Tal como puede observarse a partir de la figura 2, todas las dosificaciones han mostrado un aumento del peso corporal en comparación con el control, mostrando todas las dosificaciones aumentos estadísticamente significativos con respecto al control en el día 14. La figura 3 muestra la modificación de la masa corporal magra el día 0 y día 13 tal como se determina mediante RMN, así como la modificación de peso del músculo gastrocnemio diseccionado de los animales en el día 14.
En otro ejemplo, se administró el pepticuerpo 1x mTN8-19-32 a ratones CD1 nu/nu en una inyección bisemanalmente de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg en comparación con el control huFc (vehículo). Los animales tratados con pepticuerpo muestran un aumento del peso corporal total (no mostrado) así como la masa corporal magra el día 13 en comparación con el día 0 tal como se determina mediante medición por RMN. El aumento de la masa corporal magra se muestra en la figura 4.
En otro ejemplo, se comparó un pepticuerpo 1x madurado por afinidad con un pepticuerpo 2x madurado por afinidad para determinar la eficacia anabólica in vivo. Se trataron ratones macho CD1 nu/nu (10 animales por grupo) con inyecciones dos veces semanalmente de 1 mg/kg y 3 mg/kg de 1x mTN8-19-7 y 2x mTN8-19-7 durante 35 días, mientras que el grupo control (10 animales) recibió inyecciones dos veces semanalmente de huFc (3 mg/kg). Tal como se muestra en la figura 5, el tratamiento con el pepticuerpo 2x dio como resultado un aumento de peso corporal mayor y el peso de la canal magra en necropsia en comparación con el pepticuerpo 1x o control.
Ejemplo 9
Aumento de la resistencia muscular
Se trataron ratones C57B/6 macho de 4 meses de edad macho de la misma edad normales durante 30 días con 2 inyecciones por semana, inyecciones subcutáneas 5 mg/kg por semana de 2x mTN8-19-33, 2x mTN8-19-7, y grupo control de vehículo huFc (10 animales/grupo). Se dejó que los animales se recuperaran sin ninguna inyección adicional. Se midió la resistencia a la tracción el día 18 del periodo de recuperación. Se midió la resistencia a la tracción usando un medidor Columbia Instruments, modelo 1027 dsm (Columbus, Ohio). El tratamiento con pepticuerpos dio como resultado un aumento significativo de la resistencia a la tracción, mostrando los animales pretratados con 2x mTN8-19-33 un aumento del 14% de la resistencia a la tracción en comparación con los ratones tratados control, mientras que 2x mTN8-19-7 mostró un aumento del 15% de la resistencia a la tracción en comparación con los ratones tratados control.
Ejemplo 10
Farmacocinética
Se realizaron experimentos farmacocinéticos in vivo usando pepticuerpos representativos sin las secuencias LE. Se administraron dosificaciones 10 mg/kg y 5 mg/kg a ratones CD1 nu/nu y se determinaron los siguiente parámetros: Cmáx (ug/ml), área bajo la curva (AUC) (ug-h/m) y semivida (h). Se encontró que las versiones 2x de los pepticuerpos madurados por afinidad tienen una semivida significativamente mayor que las versiones 1x. Por ejemplo 1x mTN8-19-22 madurado por afinidad tiene una semivida en los animales de aproximadamente 50,2 horas, mientras que 2x mTN8-19-22 tiene una semivida de aproximadamente 85,2 horas. El 1x mTN8-7 madurado por afinidad tiene una semivida de aproximadamente 65 horas, mientras que 2x mTN8-19-7 tiene una semivida de aproximadamente 106 horas.
Ejemplo 11
Tratamiento de ratones mdx
Los pepticuerpos de la presente invención han demostrado que aumentan la masa muscular magra en un animal y
5 son útiles para el tratamiento de una variedad de trastornos que implican el desgaste muscular. La distrofia muscular es uno de esos trastornos. El modelo de ratón para la distrofia muscular de Duchenne es el ratón Duchenne mdx (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). A ratones mdx de edad avanzada (10 meses de edad) se les inyectó o bien el pepticuerpo 1x mTN8-19-33 (n=8/grupo) o bien la proteína huFc de vehículo (N=6/grupo) durante un periodo de tiempo de tres meses. El programa de dosificación era un día sí y un día no, 10 mg/kg, mediante inyección
10 subcutánea. El tratamiento con pepticuerpos tenía un efecto positivo sobre el aumento y mantenimiento de la masa corporal para los ratones mdx de edad avanzada. Se observaron aumentos significativos del peso corporal en el grupo tratado con pepticuerpos en comparación con el grupo control tratado con hu-Fc, tal como se muestra en la figura 6A. Además, el análisis de RMN reveló que la proporción de masa corporal magra a masa grasa aumentó también significativamente en los ratones mdx de edad avanzada como resultado del tratamiento con pepticuerpos
15 en comparación con el grupo control, y que el porcentaje de grasa del peso corporal disminuyó en los ratones tratados con pepticuerpos en comparación con el grupo control, tal como se muestra en la figura 6B.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> AMGEN, INC. Han, HQ
20 Min Hosung Boone, Thomas Charles
<120> AGENTES DE UNIÓN QUE INHIBEN LA MIOSTATINA
25 <130> A-828 (WO)
<140> Ser transferida
<141> 19-12-2003
30 <150> US 60/435.923
<151> 20-12-2002
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35 <170> PatentIn versión 3.2
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<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
<400> 99
imagen1
15 <210> 100
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 20 <223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 100
imagen1
25 <210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
30 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 101
imagen6
<210> 102
<211> 19
<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
15 <400> 102
imagen1
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
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imagen1
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
<400> 104
imagen1
15 <210> 105
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
20 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 105
imagen5
<210> 106
5
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10
<400> 106
imagen1
<210> 107
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 20
<400> 107
imagen1
25 <210> 108
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30 <220>
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<400> 108
imagen6
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
15 <400> 109
imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen5
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
10
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15
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20
imagen1
<210> 115
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
5
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imagen1
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imagen1
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imagen4
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
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imagen1
5
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imagen1
<210> 122
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imagen1
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
<400> 123
imagen1
15 <210> 124
<211> 19
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20 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 124
imagen5
<210> 125
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<220>
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<400> 125
imagen1
10
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20
imagen1
<210> 127
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imagen1
5 <210> 128
<211> 20
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<400> 128
imagen2
<210> 129
<211> 15
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
25 <400> 129
imagen1
<210> 130
<211> 50
<212> PRT
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen4
<210> 131
<211> 43
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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5
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<400> 141
imagen1
15 <210> 142
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
20 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE 25 <222> (3)..(3)
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<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(6)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 142
imagen1
<210> 143
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 143 <210> 144
imagen1
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(10)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 144
imagen1
<210> 145 <211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC-FFATURE
<222> (12)..(14)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 145
imagen1
<210> 146
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(10)
<223> Xaa = cualquier aminoácido
<400> 146
imagen1
<210> 147
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 147
imagen1
<210> 148
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 148 <210> 149
imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 149
imagen1
<210> 150
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 150
imagen1
<210> 151
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 152
imagen1
<210> 153
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 153
imagen1
<210> 154
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 155
imagen1
<210> 156
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 156
imagen1
<210> 157
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 158
imagen1
<210> 159
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 159
imagen1
<210> 160
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 160 <210> 161
imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 161
imagen1
<210> 162
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 162
imagen1
<210> 163
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 163 <210> 164
imagen1
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 164
imagen1
<210> 165
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 165
imagen1
<210> 166
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 166
imagen1
<210> 167
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 167
imagen1
<210> 168
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 168
imagen1
<210> 169
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 169
imagen1
<210> 170
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 170
imagen1
<210> 171
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 171
imagen1
<210> 172
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 172
imagen1
<210> 173
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 173
imagen1
<210> 174
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 174
imagen1
<210> 175
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 175
imagen1
<210> 176
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 176
imagen1
<210> 177
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 177
imagen1
<210> 178
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 178
imagen1
<210> 179
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 179
imagen1
<210> 180
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 180
imagen1
<210> 181
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 181
imagen1
<210> 182
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 182
imagen1
<210> 183
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 183
imagen1
<210> 184
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 184
imagen1
<210> 185
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 185
imagen1
<210> 186
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 186
imagen1
<210> 187
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 187
imagen1
<210> 188
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 188
imagen1
<210> 189
<211> 42
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 283
imagen4
<210> 284
<211> 150
<212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
20 <400> 284
imagen1
<210> 285 25 <211> 129
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<400> 285
imagen1
5 <210> 286
<211> 150
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
10 <220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 286
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<210> 287
<211> 150
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
25 <400> 287
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 288
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<211> 150
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imagen1
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 292
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<210> 294
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 294
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<211> 227
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 296
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<220>
191
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<210> 298
<211> 20
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
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<400> 300
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<213> Secuencia Artificial
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imagen1
<210> 303
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
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<211> 20
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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20 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 329
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<211> 20
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
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<212> PRT
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 337
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<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
15 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 338
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<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 339
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 340
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<210> 341
<211> 20
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 20
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
15 <400> 345
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<400> 347
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 349
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 30
<400> 351
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<210> 352
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa se selecciona de un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa se selecciona de un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<400> 352
imagen1
<210> 353
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q.
<400> 353
imagen1
<210> 354
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa está ausente o es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o acídico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa está ausente o es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o acídico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(9)
<223> Xaa es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(20)
<223> Xaa es cualquier aminoácido
<400> 354 <210> 355
imagen1
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa está ausente o es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o acídico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa está ausente o es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o acídico
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa está ausente o es un aminoácido hidrófobo neutro, polar neutro o básico
<220>
<221> MISC_FEATURE 5 <222> (8)..(8)
<223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(9)..(9) 10 <223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(11)..(11) 15 <223> Xaa se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
(17)..(20) 20 <223> Xaa es cualquier aminoácido
<400> 355
imagen1
25
<210> 356
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
30
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es P, S o Y
5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es C o Q
10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es G o H
15
<400> 356
imagen1
20 <210> 357
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
25 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 357
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<210> 358
<211> 22 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 358
imagen1
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<211> 22
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<213> Secuencia Artificial
15
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 359
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 30
<400> 360
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<220> 10 <223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 361
imagen1
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<213> Secuencia Artificial
20
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 362
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<210> 365
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imagen1
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<220>
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imagen1
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25 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 367
imagen1
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<213> Secuencia Artificial
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imagen1
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20 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen4
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imagen1
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imagen1
5
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imagen5
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen5
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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20 <220>
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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imagen1
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5
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imagen4
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imagen1
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5
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imagen1
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen5
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen4
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<211> 22
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
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imagen1
5
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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15
imagen1
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido de Unión a Miostatina 25
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imagen1
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
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imagen1
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen5
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 431
imagen4
<210> 432
<211> 22
<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
20 <400> 432
imagen1
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<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
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imagen1
5 <210> 434
<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
10 <220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen2
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<211> 22
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
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<220>
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imagen1
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<211> 22
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 437
imagen5
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<211> 22
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
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imagen1
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<212> PRT
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imagen1
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<211> 22
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<220>
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imagen1
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imagen1
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<211> 22
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 442
imagen1
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<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
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imagen1
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imagen5
<210> 445
5
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<400> 445
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<213> Secuencia Artificial
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<400> 446
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<213> Secuencia Artificial
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<400> 447
imagen6
<210> 448
<211> 22
<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
15 <400> 448
imagen1
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<212> PRT
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imagen1
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<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina 10
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imagen1
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<211> 22
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<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 451
imagen5
<210> 452 <211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 452
imagen4
<210> 453
<211> 22
<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
20 <400> 453
imagen1
<210> 454 25 <211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 454
imagen6
<210> 455
<211> 11
<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
15 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa es M o I
20 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es cualquier aminoácido
25 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa es L o F
30 <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa es E, Q o D
<400> 455
imagen1
<210> 456
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa es Q, D o E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es S, Q, D o E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa es L, W, F o Y
<400> 456 <210> 457
imagen1
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de Unión a Miostatina
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa es R o D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa es cualquier aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa es A, T, S o Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa es L o M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa es L o S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa es cualquier aminoácido
<220>
<221>
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<223> Xaa es F o E
<220>
<221>
MISC_FEATURE 10 <222> (8)..(8)
<223> Xaa es W, F o C.
<220>
<221>
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<223> Xaa es L, F, M o K
<400> 457
imagen1
20
<210> 458
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30 <400> 458
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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imagen1
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<221> MISC_FEATURE
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imagen4
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imagen1
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<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1) 10 <223> Xaa = Fc
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imagen1
15
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<211> 129
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imagen1
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<220>
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<212> ADN
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<211> 66
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 543
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<210> 544
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina <400> 544
<400> 544
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<210> 545
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
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<220>
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 588
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 590
imagen1
<210> 591
<211> 60
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
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<220>
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 609
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<211> 60
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<211> 74
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
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<211> 74
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imagen1
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<211> 70
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imagen1
<210> 622
<211> 186
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imagen1
<210> 623 10 <211> 74
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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imagen1
<211> 198 5 <212> ADN
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<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina 10
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<210> 625 15 <211> 74
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa = Fc
<400> 625
imagen1
<210> 626
<211> 198 10 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina 15
<400> 626
imagen1
<210> 627
<211> 70
<212> PRT
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<220>
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5
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Fc
10
<400> 627
imagen1
15 <210> 628
<211> 186
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<213> Secuencia Artificial
20 <220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 628
imagen1
<210> 629
<211> 74
5
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Pepticuerpo
10
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Fc
15
<400> 629
imagen1
<210> 630
<211> 198
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
<400> 630
imagen1
<210> 631
<211> 70
10
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Pepticuerpo
15
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa= Fc
20
<400> 631
imagen1
<210> 632
<211> 186
<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos que codifica péptido de unión a miostatina
10 <400> 632
imagen1
<210> 633 15 <211> 5
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220> 20 <223> Péptido de Unión a Miostatina
<400> 633
imagen1
25
<210> 634
<211> 90
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial 30
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos generada aleatoriamente <220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> N = A, T, C o G están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> N = A, T, C o G están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> N = A, T, C o G están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220> <221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(68)
<223> N = A, T, C o G están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> K = G y T están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(71)
<223> N = A, T, C o G están representadas por igual
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223>
K = G y T están representadas por igual 5
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(74)
<223>
N = A, T, C o G están representadas por igual 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223>
K = G y T están representadas por igual 15
<400> 634
imagen1

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un agente de unión que comprende al menos un péptido capaz de unirse a miostatina, en el que el péptido comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q;
    b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, en el que el péptido tiene una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
  2. 2.
    El agente de unión según la reivindicación 1, en el que el péptido se selecciona de uno cualquiera de SEC ID Nº: 305-308, 310-313, 315-331, 333 y 335-346.
  3. 3.
    Un agente de unión, en el que dicho agente tiene la estructura: (X1)a-F1-(X2)b, o multímeros de la misma; en la que F1 es un vehículo; y X1 y X2 se seleccionan cada uno independientemente de
    -(L1)c-P1;
    -(L1)c-P1-(L2)d-P2;
    -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
    y -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
    en los que P1, P2, P3 y P4 son cada uno péptidos capaces de unirse a miostatina; y cada uno comprende la secuencia Cb1b2Wb3WMCPP (SEC ID Nº: 353), en la que b1 se selecciona de uno cualquiera de los aminoácidos T, I o R; b2 se selecciona de uno cualquiera de R, S, Q; b3 se selecciona de uno cualquiera de P, R y Q, y en los que L1, L2, L3 y L4 son cada uno ligadores; y en los que a, b, c, d, e y f son cada uno independientemente 0 ó 1, a condición de que al menos uno de a y b sea
    1, y en los que los péptidos P1, P2, P3 y P4 tienen cada uno una longitud comprendida entre 10 y 50 aminoácidos, y sales fisiológicamente aceptables del mismo.
  4. 4.
    El agente de unión según la reivindicación 3, en el que los péptidos se seleccionan independientemente de una cualquiera de SEC ID Nº: 305-308, 310-313, 315-331, 333 y 335-346.
  5. 5.
    El agente de unión según la reivindicación 3, en el que a es 0 y b es 1, o en el que a es 1 y b es 0.
  6. 6.
    El agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en el que el vehículo es un dominio Fc.
  7. 7.
    Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica los agentes de unión según la reivindicación 6.
  8. 8.
    La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en la que el polinucleótido se selecciona de una cualquiera de SEC ID Nº: 573 a 614 y 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632.
  9. 9.
    Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.
  10. 10.
    Una célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 9.
  11. 11.
    La célula huésped según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula procariota.
  12. 12.
    La célula huésped según la reivindicación 10, en la que la célula es una célula eucariota.
  13. 13.
    Un procedimiento para preparar un agente de unión a miostatina que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 en condiciones que promueven la expresión de la proteína recombinante, y recuperar la proteína.
  14. 14.
    Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo.
  15. 15.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para inhibir la actividad de la miostatina en un sujeto que necesita del mismo.
  16. 16.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para aumentar la masa muscular magra y resistencia en un sujeto que necesita del mismo.
  17. 17.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para aumentar la proporción de masa muscular magra a grasa en un sujeto que necesita del mismo.
  18. 18.
    La composición según la reivindicación 17, en la que el sujeto es un animal destinado a alimento.
  19. 19.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno
    o una enfermedad del degaste muscular en un sujeto que necesita del mismo.
  20. 20.
    La composición según la reivindicación 19, en la que el trastorno o la enfermedad de desgaste muscular se selecciona de lo siguiente: distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardiaca crónica, cáncer, caquexia, SIDA, insuficiencia renal, uremia, sarcopenia relacionada con la edad, artritis reumatoide y desgaste muscular debido a reposo en cama prolongado, ictus, lesión de la médula espinal, enfermedad, fractura ósea, traumatismo, envejecimiento y exposición a microgravedad.
  21. 21.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en un procedimiento para tratar un trastorno metabólico en un sujeto.
  22. 22.
    La composición según la reivindicación 21, en la que el trastorno metabólico se selecciona de los siguientes trastornos: diabetes tipo 2, diabetes mellitus no insulinodependiente, hiperglucemia, pérdida de masa ósea y obesidad.
  23. 23.
    El agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un procedimiento para detectar o diagnosticar un trastorno relacionado con la miostatina en un sujeto.
  24. 24.
    Un procedimiento para medir miostatina en una muestra ex vivo o in vitro que comprende poner en contacto la muestra con el agente de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y medir el complejo unido.
  25. 25.
    La composición farmacéutica según la reivindicación 14 para su uso en terapia.
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