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ES2231773T3 - Virus de la hepatitis c de tipo 4, 5 y 6. - Google Patents

Virus de la hepatitis c de tipo 4, 5 y 6.

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Publication number
ES2231773T3
ES2231773T3 ES94913769T ES94913769T ES2231773T3 ES 2231773 T3 ES2231773 T3 ES 2231773T3 ES 94913769 T ES94913769 T ES 94913769T ES 94913769 T ES94913769 T ES 94913769T ES 2231773 T3 ES2231773 T3 ES 2231773T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
hcv
peptide
peptides
antigenic
mixture
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES94913769T
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Simmonds
Peng Lee Yap
Ian Hugo Pike
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Common Services Agency for Scottish Health Service
Murex Diagnostics Ltd
Original Assignee
Common Services Agency for Scottish Health Service
Murex Diagnostics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB939309237A external-priority patent/GB9309237D0/en
Priority claimed from GB9400263A external-priority patent/GB9400263D0/en
Application filed by Common Services Agency for Scottish Health Service, Murex Diagnostics Ltd filed Critical Common Services Agency for Scottish Health Service
Application granted granted Critical
Publication of ES2231773T3 publication Critical patent/ES2231773T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Abstract

SE DESCRIBEN NUEVAS SECUENCIAS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C DEL TIPO 4 Y 5, JUNTO CON LAS DEL TIPO 6, RECIENTEMENTE DESCUBIERTO. LAS SECUENCIAS DE TIPO ESPECIFICO UNICO EN LAS REGIONES NS4-NS5 Y LAS REGIONES CENTRALES PERMITEN LA DETECCION Y GENOTIPIFICACION DEL HCV DE LOS TIPOS 1 A 6. SE DESCRIBEN PEPTIDOS ANTIGENICOS E INMUNOENSAYOS.

Description

Virus de la hepatitis C de tipo 4, 5 y 6.
Campo técnico
La presente invención se refiere a nuevas secuencias dilucidadas del virus de la hepatitis C tipo 4 (HCV-4), y tipo 5 (HCV-5), y a un tipo 6 (HCV-6) recién descubierto. En particular, la invención se refiere al agente etiológico del virus de la hepatitis C tipo 4, 5 y 6, y a polinucleótidos y polipéptidos inmunorreactivos que son útiles en inmunoensayos para la detección de HCV-4, HCV-5 y HCV-6 en muestras biológicas; así como al uso de polipéptidos antigénicos específicos de HCV-4, HCV-5 y HCV-6 en vacunas.
Antecedentes de la invención
La hepatitis vírica aguda es una enfermedad que puede dar como resultado deterioro crónico del hígado. La misma se diagnostica clínicamente por una serie bien definida de síntomas del paciente, que incluyen ictericia, sensibilidad hepática, y un aumento de los niveles en suero de alanina-aminotransferasa y aspartato-aminotransferasa. Generalmente se realizan inmunoensayos serológicos para diagnosticar el tipo específico del agente vírico causante. Históricamente, los pacientes que presentan síntomas de hepatitis y que no están infectados por lo demás por hepatitis A, hepatitis B, Epstein-Barr o citomegalovirus se diagnosticaban clínicamente por defecto como infectados por hepatitis no-A, no-B (NANBH).
Durante muchos años, el agente de la hepatitis no-A, no-B ha permanecido evasivo. Se ha establecido ahora que muchos casos de NANBH están causados por un virus distinto denominado virus de la hepatitis C (HCV). La Solicitud de Patente Europea EP-A-0318216 describe secuencias de cDNA derivadas de una cepa de HCV, sondas de polinucleótidos y polipéptidos para uso en inmunoensayos. Información adicional sobre dicha cepa se proporciona en la Solicitud de Patente Europea EP-A-0388232.
El genoma del HCV codifica un gran precursor poliproteínico, que contiene regiones estructurales y no estructurales. La proteína simple se escinde aparentemente en una diversidad de proteínas después de su producción. La mayoría de las proteínas estructurales y no estructurales se han identificado ahora por traducción y expresión de RNA in vitro como proteínas recombinantes. Las regiones C y E codifican proteínas estructurales de la nucleocápsida y proteínas estructurales de la envoltura, respectivamente. Siguen al menos cinco regiones adicionales, que codifican proteína no estructural (NS) de función no definida. Se cree que la organización es como sigue (A. Alberti Journal of Hepatology, 1991; 12; 279 a 282)
16
Se han descrito ciertas proteínas inmunorreactivas como proteínas recombinantes, por ejemplo C22 (en la región central), C33 (en la región NS3), 5-1-1 y C100 (ambas en la región NS4), y NS5 (región NS5). El diagnóstico actual de la hepatitis C se basa a menudo en métodos que detectan anticuerpos contra el producto del clon C-100. Este clon se produjo por ligación de clones solapantes para producir un antígeno vírico mayor (C100) correspondiente a parte de la región genómica NS3-NS4. Se fusionó luego C100 con el gen de la superóxido-dismutasa (SOD) humana, se expresó en uso como una proteína de fusión recombinante grande (C100-3) y se utilizó en fase sólida para desarrollar ensayos de inmunosorbente radio-marcado (RIA) y unido a enzima (ELISA).
Polinucleótidos propuestos como útiles para escrutinio de HCV se exponen en la Memoria Descriptiva de la Patente Europea EP-A-0398748. La Memoria Descriptiva de la Patente Europea EP-A-0414475 pretende describir la propagación de HCV en células de cultivo y la producción de antígenos para uso en diagnóstico. La Memoria Descriptiva de la Patente Europea EP-A-0445423 da a conocer lo que se afirma es un inmunoensayo mejorado para detección de anticuerpos HCV.
Los bancos de sangre del Reino Unido llevan a cabo el ensayo rutinario de donantes de sangre respecto a anticuerpos para componentes de HCV. Un ensayo de primera generación implicaba la detección de anticuerpos HCV para polipéptidos C100-3. El anticuerpo C100-3 reconoce un antígeno poliproteínico compuesto dentro de regiones no estructurales del virus y es un marcador consistente de la infección por HCV. Sin embargo, en infecciones agudas este anticuerpo no es fiable debido al retardo (típicamente 22 semanas) en la seroconversión después de la exposición. Adicionalmente, el ensayo del anticuerpo C100-3 carece de especificidad para el virus de la hepatitis C.
Ensayos de anticuerpos de segunda generación emplean antígenos y/o péptidos lineales sintéticos recombinantes que representan antígenos estructurales de la región central altamente conservada del virus así como antígenos no estructurales. Sin embargo, se ha encontrado que algunos ensayos ELISA de segunda generación pueden producir reacciones positivas falsas. El ensayo de inmunotransferencia de recombinantes (RIBA-2) que incorpora cuatro antígenos del genoma de HCV, pretende proporcionar un método para identificar la reactividad anti-HCV genuina. Sin embargo, el resultado puede ser "indeterminado". Los autores de la presente invención han comunicado (The Lancet, 338; 19 de Octubre de 1991) la reactividad variable de donantes de sangre HCV-positivos frente a antígenos
5-1-1, C100, C33 y C22, y han comparado éstos con los resultados de la detección directa del RNA de HCV presente en las muestras de sangre utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar polinucleótidos de HCV. Sin embargo, el trabajo demuestra que el diagnóstico inequívoco de las infecciones por HCV no es posible
todavía.
Recientemente se han descubierto tipos adicionales de HCV que difieren considerablemente en secuencia, y éstos han sido designados HCV-2, 3 y 4. La solicitud de patente WO 93/10239 (publicada el 27 de mayo de 1993) de los autores de la presente invención describe ciertas secuencias antigénicas de HCV-2, 3 y 4. Las secuencias descritas para HCV-4 se encuentran únicamente en las regiones 5' NCR y central. La primera no codifica proteína alguna que pudiera utilizarse en un inmunoensayo para HCV, mientras que la región central tiende a conservar-
se.
Sumario de la invención
La presente invención incluye el descubrimiento de una variante de HCV tipo 6 desconocida con anterioridad, por una comparación de secuencias amplificadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en ciertas regiones del genoma de HCV y confirmadas por análisis filogenético. La invención ha identificado secuencias polinucleotídicas y polipéptidos que son específicos de HCV-4, HCV-5 y HCV-6. Éstas pueden utilizarse para diagnosticar la infección por HCV-4, HCV-5 y HCV-6 y deberían incluirse por consiguiente en cualquier ensayo definitivo para la infección por HCV.
Un aspecto de la presente invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica exclusiva para el virus de la hepatitis tipo 4, 5 ó 6. En particular, la invención proporciona un polinucleótido HCV aislado que tiene una secuencia NS4 seleccionada de las siguientes:
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1 
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Las secuencias son exclusivas para el tipo HCV de que se trata, en el sentido de que la secuencia no es compartida por ningún otro tipo de HCV, y puede utilizarse por tanto para detectar exclusivamente dicho tipo de HCV. La variabilidad de secuencias entre HCV 4, 5 y 6 se ha encontrado particularmente en las regiones NS4, NS5 y central, y es por tanto de estas regiones en particular de las que pueden obtenerse polinucleótidos y péptidos específicos del tipo. El término "específico de tipo" indica que está implicada una secuencia exclusiva para dicho tipo de HCV. Además, dentro de cada tipo de HCV pueden existir varios subtipos que tienen variaciones de secuencia relativamente
pequeñas.
Las secuencias de DNA incluyen secuencias de cDNA. Si es necesario, las secuencias de DNA pueden amplificarse por la reacción en cadena de la polimerasa. Las secuencias de DNA pueden utilizarse como sonda de hibridación. Las secuencias pueden ser recombinantes (es decir, expresadas en células transformadas) o sintéticas y pueden estar comprendidas dentro de secuencias más largas en caso necesario. Del mismo modo, pueden tolerarse también deleciones, inserciones o sustituciones si el polinucleótido puede funcionar todavía como sonda específica. Secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas antigénicas son también particularmente útiles.
Otro aspecto de la invención proporciona un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos exclusiva para el virus de la hepatitis tipo 4, 5 ó 6. En particular, aquélla proporciona un péptido de HCV que tiene una secuencia antigénica NS4 seleccionada de las siguientes:
2 
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Así, la invención incluye un polipéptido antigénico HCV-4, HCV-5 o HCV-6 específico de la región NS4; o polipéptidos que incluyen estos antígenos. Una pluralidad de copias del péptido pueden estar unidas a un núcleo de péptido antigénico múltiple.
El péptido puede marcarse para facilitar la detección, y puede marcarse por ejemplo como polipéptido antigénico específico HCV-4, HCV-5 o HCV-6 de la región NS4; (o mezclas de los mismos) para uso en un inmunoensayo a fin de detectar los anticuerpos correspondientes.
Debe entenderse que los polipéptidos no comprenderán necesariamente la región NS4 entera, sino que pueden emplearse también partes características de la misma (usualmente epítopes característicos) exclusivos para un tipo particular de HCV.
Un aspecto adicional de la invención proporciona anticuerpos para los péptidos, particularmente anticuerpos monoclonales para uso en terapia y diagnosis. Así pues, pueden utilizarse anticuerpos marcados para diagnosis in vivo. Anticuerpos que llevan agentes citotóxicos pueden utilizarse para atacar las células infectadas por HCV-4, HCV-5 o HCV-6.
Un aspecto adicional de la invención proporciona una vacuna que comprende el péptido inmunógeno NS4 de HCV-4, HCV-5 o HCV-6.
Un método de tipificación de HCV in vitro puede comprender la realización de digestión con endonucleasa de una muestra que contiene HCV para proporcionar fragmentos de restricción, siendo el espectro de restricción característico de HCV-4, HCV-5 o HCV-6.
Finalmente, la presente invención abarca también kits de ensayo que incluyen polipéptidos que contienen al menos un epítope de antígeno HCV-4, HCV-5 o HCV-6 (o anticuerpos para el mismo) así como reactivos preparatorios necesarios, reactivos de lavado, reactivos de detección y reactivos de producción de señal.
Las secuencias polinucleotídicas específicas de HCV-4, HCV-5 o HCV-6 pueden utilizarse para identificación del virus HCV propiamente dicho (amplificado usualmente por PCR) por técnicas de hibridación.
Oligonucleótidos correspondientes a regiones variables, v.g. en la región NS4, podrían utilizarse para PCR especifica del tipo. Pueden utilizarse iniciadores de sentido exteriores y de sentido interiores en combinación con los dos iniciadores anti-sentido conservados para un método de detección específica para los tipos de HCV 4, 5 y 6.
La presente invención proporciona también vectores de expresión que contienen las secuencias de DNA como se definen en esta memoria, vectores que son capaces, en un hospedador apropiado, de expresar la secuencia de DNA para producir los péptidos que se definen en esta memoria.
El vector de expresión contiene normalmente elementos de control de DNA que efectúan la expresión de la secuencia de DNA en un hospedador apropiado. Estos elementos pueden variar de acuerdo con el hospedador, pero solamente incluyen un promotor, sitio de fijación de ribosoma, sitios de comienzo y parada de la traducción, y un sitio de terminación de la trascripción. Ejemplos de tales vectores incluyen plásmidos y virus. Los vectores de expresión de la presente invención abarcan tanto vectores extracromosómicos como vectores que están integrados en el cromosoma de la célula hospedadora. Para uso en E. coli, el vector de expresión puede contener la secuencia de DNA de la presente invención opcionalmente como una fusión enlazada a cualquiera de los extremos 5' o 3' de la secuencia de DNA codificante, por ejemplo de B-galactosidasa o el extremo 3' de la secuencia de DNA codificante, por ejemplo, del gen trpE. Para uso en el sistema de baculovirus de insecto (AcNPV), la secuencia de DNA se fusiona opcionalmente a la secuencia codificante de polihedrina.
Una célula hospedadora puede transformarse con vectores de expresión como se definen en esta memoria.
Ejemplos de células hospedadoras de uso con la presente invención incluyen células procariotas y eucariotas, tales como células bacterianas, de levadura, de mamífero y de insecto. Ejemplos particulares de tales células son
E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, células de ovario de hámster chino y células de ratón, así como Spodoptera frugiperda y Tricoplusia ni. La elección de la célula hospedadora puede depender de cierto número de factores pero, si es importante la modificación posterior a la traducción del péptido vírico de HCV, entonces sería preferible un hospedador eucariota.
Un proceso para preparar un péptido como se define en esta memoria comprende:
aislar la secuencia de DNA, como se define en esta memoria, del genoma de HCV, o sintetizar la secuencia de DNA que codifica los péptidos que se definen en esta memoria, o generar una secuencia de DNA que codifica el péptido, insertar la secuencia de DNA en un vector de expresión tal que sea capaz, en un hospedador apropiado, de ser expresada, transformar células hospedadoras con el vector de expresión, cultivar las células hospedadoras trasformadas, y aislar el péptido.
La secuencia de DNA codificante del péptido puede sintetizarse utilizando procedimientos estándar (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984, Oxford, IRL Press).
La secuencia de DNA deseada obtenida como se ha descrito arriba puede insertarse en un vector de expresión utilizando técnicas conocidas y estándar. El vector de expresión se corta normalmente utilizando enzimas de restricción y la secuencia de DNA se inserta utilizando ligación de extremos romos o de extremos cohesivos. El corte se realiza usualmente en un sitio de restricción en una posición conveniente en el vector de expresión tal que, una vez insertadas, las secuencias de DNA se encuentran bajo el control de los segmentos funcionales del DNA que efectúa su expresión.
La trasformación de una célula hospedadora puede realizarse utilizando técnicas estándar. Usualmente se emplea algún marcador fenotípico para distinguir entre los transformantes que han absorbido con éxito el vector de expresión y los que no lo han hecho. El cultivo de la célula hospedadora trasformada y el aislamiento del péptido como se requiere pueden realizarse también utilizando técnicas estándar.
Los péptidos de la presente invención pueden prepararse por tanto por tecnología de DNA recombinante, o pueden sintetizarse, por ejemplo utilizando un sintetizador automático.
El término "péptido" (y "polipéptido") se utiliza en esta memoria para incluir péptidos epitópicos que tienen el número mínimo de residuos de aminoácidos para antigenicidad, pasando por oligopéptidos, hasta llegar a proteínas. El péptido puede ser un péptido recombinante expresado en una célula trasformada, o podría ser un péptido sintético producido por síntesis química.
Un anticuerpo específico para un péptido de la presente invención puede generarse utilizando el péptido. El anticuerpo puede utilizarse en ensayos de control de calidad de lotes de los péptidos; purificación de un péptido o lisado vírico; mapeado de epítopes; cuando está marcado, como un conjugado en un ensayo de tipo competitivo, para detección de anticuerpos; y en ensayos de detección de antígeno.
El anticuerpo policlonal contra un péptido de la presente invención puede obtenerse por inyección de un péptido, acoplado opcionalmente a un portador para promover una respuesta inmune, en un hospedador mamífero, tal como un ratón, rata, oveja o conejo, y recuperar el anticuerpo así producido. El péptido se administra generalmente en forma de una formulación inyectable en la cual el péptido se mezcla con un diluyente fisiológicamente aceptable. Pueden incluirse en la formulación adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund (FCA) o adyuvante incompleto de Freund (FIA). La formulación se inyecta normalmente en el hospedador a lo largo de un periodo de tiempo adecuado, tomándose muestras de plasma a intervalos apropiados para ensayo en cuanto a anticuerpo anti-HCV vírico. Cuando se obtiene un nivel apropiado de actividad, se sangra el hospedador. Se extrae luego el anticuerpo y se purifica del plasma sanguíneo utilizando procedimientos estándar, por ejemplo, por proteína A o cromatografía de intercambio iónico.
Un anticuerpo monoclonal contra un péptido de la presente invención puede obtenerse por fusión de células de una línea de células inmortalizantes con células que producen anticuerpo contra el virus del péptido topográficamente afín, y cultivo de la línea de células inmortalizada fusionada. Típicamente, se inocula con el péptido un hospedador mamífero no humano, tal como un ratón o una rata. Después que ha transcurrido un tiempo suficiente para que el hospedador establezca una respuesta de anticuerpos, se separan las células productoras de anticuerpos, tales como los esplenocitos. Se fusionan células de una línea de células inmortalizante, tal como una línea de células de mieloma de ratón o rata, con las células productoras de anticuerpos y se escrutan las fusiones resultantes para identificar una línea de células, tal como un hibridoma, que secreta el anticuerpo monoclonal deseado. La línea de células fusionada puede cultivarse y el anticuerpo monoclonal puede purificarse del medio de cultivo de una manera similar a la purificación de un anticuerpo policlonal.
Ensayos de diagnóstico basados en la presente invención pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de infección por HCV, así como el tipo de HCV implicado. Aquéllos pueden utilizarse también para monitorizar el tratamiento de dicha infección, por ejemplo en la terapia con interferón.
En un ensayo para el diagnóstico de infección vírica, existen básicamente tres enfoques distintos que pueden adoptarse, que implican la detección del ácido nucleico vírico, el antígeno vírico o el anticuerpo vírico, respectivamente. El ácido nucleico vírico se considera generalmente como el mejor indicador de la presencia del virus propiamente dicho, e identificaría materiales probablemente infecciosos. Sin embargo, la detección del ácido nucleico no es usualmente tan directa como la detección de antígenos o anticuerpos, dado que el nivel de la diana puede ser muy bajo. El antígeno vírico se utiliza como marcador de la presencia del virus y como indicador de infectividad. Dependiendo del virus, la cantidad de antígeno presente en una muestra puede ser muy baja y difícil de detectar. La detección del anticuerpo es relativamente directa debido a que, de hecho, el sistema inmunitario del hospedador está amplificando la respuesta a una infección por producción de grandes cantidades de anticuerpo circulante. La naturaleza de la respuesta de anticuerpos puede ser a menudo clínicamente útil, por ejemplo anticuerpos de la clase IgM en lugar de los de la clase IgG son indicativos de una infección reciente, o la respuesta a un antígeno vírico particular puede estar asociada con el aclaramiento del virus. Así pues, el enfoque exacto adoptado para el diagnóstico de una infección vírica depende de las circunstancias particulares y la información buscada. En el caso de HCV, un ensayo de diagnóstico puede incluir uno cualquiera de estos tres enfoques.
En cualquier ensayo para el diagnóstico de HCV que implica la detección de ácido nucleico vírico, el método puede comprender la hibridación del RNA vírico presente en una muestra de ensayo, o cDNA sintetizado a partir de dicho RNA vírico, con una secuencia de DNA correspondiente a las secuencias nucleotídicas de la presente invención o codificantes de un péptido de la invención, y escrutar los híbridos de ácido nucleico resultantes para identificar cualquier ácido nucleico vírico de HCV. La aplicación de este método está usualmente restringida a una muestra de ensayo de un tejido apropiado, tal como una biopsia de hígado, en la cual el RNA vírico es probable que esté presente a un nivel elevado. La secuencia de DNA correspondiente a una secuencia nucleotídica de la presente invención o codificante de un péptido de la invención puede tomar la forma de un oligonucleótido o una secuencia de cDNA contenida opcionalmente en un plásmido. El escrutinio de los híbridos de ácido nucleico se lleva a cabo preferiblemente por utilización de una secuencia de DNA marcada. Preferiblemente, el péptido de la presente invención forma parte de un oligonucleótido en el cual el marcador está situado a una distancia suficiente del péptido a fin de que la fijación del péptido al ácido nucleico vírico no se vea interferida en virtud de que el marcador esté demasiado próximo al sitio de fijación. Una o más tandas adicionales de escrutinio de una u otra clase puede llevarse a cabo para caracterizar ulteriormente los híbridos e identificar así cualquier ácido nucleico vírico de HCV. Los pasos de hibridación y escrutinio se llevan a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
Un método adicional para la detección del ácido nucleico vírico implica la amplificación de un DNA vírico utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los iniciadores seleccionados pueden ser específicos para la secuencia del tipo de HCV de interés, de tal modo que la amplificación ocurra sólo con dicho tipo de HCV particular. Asimismo, el tamaño y el número de secuencias copia amplificadas pueden ser característicos de tipos particulares de HCV, o aquéllos pueden tener patrones de restricción característicos con endonucleasas seleccionadas.
En un ensayo para el diagnóstico de HCV que implica la detección de antígeno u anticuerpo vírico, el método puede comprender poner en contacto una muestra de ensayo con un péptido de la presente invención o un anticuerpo policlonal o monoclonal contra el péptido y determinar si existe cualquier fijación antígeno-anticuerpo contenida dentro de la muestra de ensayo. Para este propósito, puede proporcionarse un kit de ensayo que comprende un péptido, como se define en esta memoria, o un anticuerpo policlonal o monoclonal para el mismo y medios para determinar si existe cualquier fijación con el anticuerpo o el antígeno contenido respectivamente en la muestra de ensayo para producir un complejo inmune. La muestra de ensayo puede tomarse de cualquiera de los tejidos o fluidos fisiológicos apropiados, tal como sangre (suero o plasma), saliva, orina, fluido cerebroespinal, sudor, lágrimas o exudado de tejidos. Si se obtiene un fluido fisiológico, el mismo puede concentrarse opcionalmente en cualquier antígeno vírico o anticuerpo presente.
Pueden emplearse una diversidad de formatos de ensayo. El péptido puede utilizarse para capturar selectivamente anticuerpos contra HCV de una solución, para marcar selectivamente el anticuerpo ya capturado, o a la vez para capturar y marcar el anticuerpo. Adicionalmente, el péptido puede utilizarse en una diversidad de formatos de ensayo homogéneos en los cuales el anticuerpo reactivo con el péptido se detecta en solución sin separación alguna de
fases.
Los tipos de ensayo en los cuales se utiliza el péptido para capturar anticuerpo de una solución implican inmovilización del péptido sobre una superficie sólida. Esta superficie debería ser susceptible de lavado de algún modo. Ejemplos de superficies adecuadas incluyen polímeros de diversos tipos (moldeados en pocillos de microtitulación; glóbulos, varillas de inmersión de diversos tipos; boquillas de aspiración; electrodos; y dispositivos ópticos), partículas (por ejemplo látex; hematíes estabilizados; células bacterianas o fúngicas; esporas; oro u otros soles metálicos o que contienen metal; y coloides proteináceos) siendo el tamaño usual de la partícula desde 0,02 a 5 micrómetros, membranas (por ejemplo de nitrocelulosa; papel; acetato de celulosa; y membranas de alta porosidad/alta superficie específica de un material orgánico o inorgánico).
La fijación del péptido a la superficie puede ser por adsorción pasiva a partir de una solución de composición óptima que puede incluir agentes tensioactivos, disolventes, sales y/o caotropos; o por enlace químico activo. El enlace activo puede ser a través de una diversidad de grupos funcionales reactivos o activables que pueden estar expuestos en la superficie (por ejemplo agentes de condensación; ésteres de ácidos activos, haluros y anhídridos; grupos amino, hidroxilo o carboxilo; grupos sulfhidrilo; grupos carbonilo; grupos diazo; o grupos insaturados). Opcionalmente, el enlace activo puede ser a través de una proteína (fijada a su vez a la superficie pasivamente o por enlace activo), tal como albúmina o caseína, a la cual puede estar unido el péptido vírico por cualquiera de una diversidad de métodos. El uso de una proteína de este modo puede conferir ventajas debido al punto isoeléctrico, la carga, el carácter hidrófilo u otra propiedad fisicoquímica. El péptido vírico puede fijarse también a la superficie (usualmente, pero no con carácter necesario, una membrana) después de la separación por electroforesis de una mezcla de reacción, tal como inmunoprecipitación.
En la presente invención se prefiere proporcionar péptidos bloqueantes que bloquean cualquier reactividad cruzada y dejan sólo aquellos anticuerpos de HCV en la muestra que reaccionarán exclusivamente con el tipo de antígeno presente en dicha localización de ensayo particular. Por ejemplo, una localización de ensayo destinada a detectar HCV-6 será bloqueada por una mezcla bloqueante que comprende los péptidos HCV-1 a 5, que reaccionarán con todos los anticuerpos que tengan reactividad para los tipos HCV-1 a 5 y dejarán anticuerpos que tienen solamente reactividad de tipo 6.
Después de poner en contacto la superficie portadora del péptido con una muestra de ensayo (en presencia de una mezcla bloqueante en caso requerido), dejar que transcurra el tiempo necesario para la reacción, y, en caso necesario, eliminar el exceso de la muestra por cualquiera de una diversidad de medios (tales como lavado, centrifugación, filtración, magnetismo o acción capilar) el anticuerpo capturado se detecta por cualquier medio que proporcione una señal detectable. Por ejemplo, esto puede conseguirse por el uso de una molécula o partícula marcada como se ha descrito arriba que reaccionará con el anticuerpo capturado (por ejemplo proteína A o proteína G y análogas; sub-tipo anti-especie o anti-inmunoglobulina; factor reumatoide; o anticuerpo para el péptido, utilizado de una manera competitiva o bloqueante), o cualquier molécula que contenga un epítope contenido en el péptido. En la presente invención, se prefiere añadir una IgG anti-humana conjugada a peroxidasa de rábano picante y detectar luego la enzima fijada por reacción con un sustrato para generar un color.
La señal detectable puede producirse por cualquier medio conocido en la técnica tal como medios ópticos, radiactivos o fisicoquímicos, y puede proporcionarse directamente por marcación de la molécula o partícula con, por ejemplo, un colorante, radiomarcador, fluorescente, luminiscente, quimioluminiscente, especie electroactiva, especie magnéticamente resonante o fluoróforo, o directamente por marcación de la molécula o partícula con una enzima propiamente dicha capaz de dar lugar a un cambio medible de cualquier clase. Alternativamente, la señal detectable puede obtenerse utilizando, por ejemplo, aglutinación, o por un efecto de difracción o birrefringencia si la superficie se encuentra en forma de partículas.
Los ensayos en los cuales se utiliza un péptido propiamente dicho para marcar un anticuerpo ya capturado requieren alguna forma de marcación del péptido que permita la detección del mismo. La marcación puede ser directa por fijación química o pasiva, por ejemplo un radiomarcador, una especie magnética resonante, una partícula o un marcador enzimático para el péptido; o indirecta por fijación de cualquier forma de marcador a una molécula que reaccionará por sí misma con el péptido. La química de la unión de un marcador al péptido puede ser directamente a través de un resto ya presente en péptido, tal como un grupo amino, o por un resto intermedio, tal como un grupo maleimido. La captura del anticuerpo puede tener lugar sobre cualquiera de las superficies ya mencionadas en cualquier reactivo con inclusión de adsorción pasiva o activada, lo cual dará como resultado la unión de anticuerpos o complejos inmunes específicos. En particular, la captura del anticuerpo podía ser por un subtipo anti-especie o anti-inmunoglobulina, por un factor reumatoide, proteínas A, G y análogas, o por cualquier molécula que contenga un epítope contenido en el péptido.
El péptido marcado puede utilizarse de una manera de fijación competitiva en la cual su fijación a cualquier molécula específica sobre cualquiera de las superficies citadas anteriormente como ejemplos está bloqueada por el antígeno contenido en la muestra. Alternativamente, aquél puede utilizarse de una manera no competitiva en la cual el antígeno contenido en la muestra se fija de modo específico o inespecífico a cualquiera de las superficies anteriores y se fija también a una molécula específica bi- o poli-valente (v.g. un anticuerpo), utilizándose las valencias restantes para capturar el péptido marcado.
A menudo, en ensayos homogéneos, el péptido y un anticuerpo se marcan separadamente de tal manera que, cuando el anticuerpo reacciona con el péptido recombinante en solución libre, los dos marcadores interaccionan para permitir, por ejemplo, la transferencia no radiativa de la energía capturada por un marcador al otro marcador con detección apropiada del segundo marcador excitado o el primer marcador apagado (v.g. por fluorimetría, resonancia magnética o medida enzimática). La adición del péptido vírico o el anticuerpo en una muestra da como resultado la restricción de la interacción del par marcado y por consiguiente un nivel diferente de señal en el detector.
Otro formato de ensayo posible para detectar anticuerpo de HCV es el formato de inmunoensayo directo de enzima en sándwich (EIA). Un péptido antigénico se aplica en forma de capa sobre pocillos de microtitulación. Se añaden simultáneamente una muestra de ensayo y un péptido al cual está acoplada la enzima. Cualquier anticuerpo HCV presente en la muestra de ensayo se fija tanto al péptido que recubre el pocillo como al péptido acoplado a la enzima. Típicamente, se utiliza el mismo péptido en ambos lados del sándwich. Después del lavado, la enzima fijada se detecta utilizando un sustrato específico que implica un cambio de color.
Es también posible utilizar ELISA de captura de anticuerpos IgG/IgM en el cual un anticuerpo anti-IgG humana y/o anti-IgM humana se aplica en forma de capa sobre un sustrato sólido. Cuando se añade una muestra de ensayo, la IgG y/o la IgM presentes en la muestra se fijarán luego al anticuerpo antihumano. La IgG y/o IgM fijadas representan la población total de dichos anticuerpos. Un péptido de la presente invención se fijará únicamente a estos anticuerpos de IgG y/o IgM producidos en respuesta al o a los determinantes antigénicos presentes en el péptido, es decir a aquellos anticuerpos producidos como resultado de la infección con el tipo de HCV del que se derivaba el péptido. Para la detección del complejo péptido/anticuerpo, el péptido puede haber sido marcado en sí mismo directamente o, después de interacción con los anticuerpos capturados, el péptido puede hacerse reaccionar con una molécula marcada que se fija al péptido.
Puede verse por tanto que los péptidos de la presente invención pueden utilizarse para la detección de la infección por HCV en muchos formatos, a saber, como péptidos libres, en ensayos que incluyen ELISA clásico, ELISA de competición, EIA fijado a membrana, e inmunoprecipitación. Puede utilizarse conjugados peptídicos en ensayos amplificados y ELISA de captura de anticuerpos IgG/IgM.
Un ensayo de la presente invención puede utilizarse, por ejemplo, para escrutar sangre donada o para propósitos clínicos, por ejemplo, en la detección, tipificación y monitorización de infecciones por HCV. Para propósitos de escrutinio, los formatos de ensayo preferidos son aquéllos que pueden automatizarse, en particular, el formato de placa de microtitulación y el formato de glóbulo. Para propósitos clínicos, además de tales formatos, pueden utilizarse también aquéllos que son adecuados para uso en menor escala o para un solo uso, por ejemplo, ensayos en látex. Para ensayos confirmativos en procedimientos de escrutinio, los antígenos pueden presentarse sobre una tira adecuada para uso en ensayos de transferencia Western u otros ensayos de inmunotransferencia.
Como se ha indicado arriba, los ensayos utilizados actualmente para detectar la presencia de anticuerpos anti-HCV en muestras de ensayo, particularmente en el escrutinio de sangre donada, utilizan únicamente péptidos antigénicos obtenidos de HIV tipo 1, y tales antígenos no detectan fiablemente otros genotipos de HCV. De acuerdo con ello, es evidentemente deseable cumplimentar el ensayo para HIV-1 con el ensayo para todos los genotipos restantes, por ejemplo, tipos 2, 3, 4, 5, y 6 y también cualesquiera genotipos que puedan descubrirse en el futuro.
En particular, la invención permite el escrutinio de donantes de sangre por ensayos convencionales (utilizando antígenos codificados de HCV tipo 1) a complementar con un segundo ensayo que contiene oligopéptidos correspondientes a las regiones antigénicas encontradas en la secuencia NS4 de HCV-4, HCV-5 o HCV-6.
Para ensayar un espectro de genotipos, puede proporcionarse una serie de medios de ensayo cada uno de los cuales comprende uno o más péptidos antigénicos de un solo genotipo de HCV, por ejemplo, una serie de pocillos en una placa de microtitulación, o una serie equivalente utilizando el formato de glóbulo. Un formato de ensayo de este tipo puede utilizarse para determinar el tipo de HCV presente en una muestra. Alternativa o adicionalmente, un medio de ensayo puede comprender péptidos antigénicos de más de un tipo, por ejemplo, un micropocillo o un glóbulo puede recubrirse con péptidos de más de un tipo.
Pueden utilizarse también oligopéptidos correspondientes a las regiones antigénicas de HCV-4, HCV-5 o HCV-6 por separado para distinguir individuos infectados con estos tipos diferentes de HCV. Un ensayo de este tipo podría realizarse en el formato de un inmunoensayo enzimático indirecto (EIA) que utilizar conjuntos de pocillos o glóbulos recubiertos con oligopéptidos de las regiones antigénicas para los tipos HCV 4, 5 y 6. Grados menores de reactividad cruzada, en caso de existir, pueden ser eliminados por absorción mediante dilución del suero de ensayo en un diluyente que contenga cantidades bloqueantes de oligopéptidos solubles de tipo heterólogo, para asegurar que únicamente el anticuerpo con reactividad de anticuerpo específica del tipo se fije a la fase sólida.
Puede ser ventajoso utilizar más de un antígeno de HCV para ensayar, en particular, una combinación que comprende al menos un péptido antigénico derivado de la región estructural del genoma y al menos un péptido antigénico derivado de la región no estructural, especialmente una combinación de un antígeno de núcleo y al menos un antígeno seleccionado de las regiones NS3, NS4 y NS5. Los pocillos o glóbulos pueden recubrirse con los antígenos individualmente. Sin embargo, puede ser ventajoso fusionar dos o más péptidos antigénicos como un solo polipéptido, preferiblemente como un polipéptido de fusión recombinante. Ventajas de un método de este tipo son que los antígenos individuales pueden combinarse en una relación fija predeterminada (usualmente equimolar) y que únicamente precisa producirse, purificarse y caracterizarse un solo polipéptido. Pueden utilizarse en un ensayo uno o más polipéptidos de fusión de este tipo, si se desea además de uno o más péptidos no fusionados. Se apreciará que existen muchas combinaciones posibles de antígenos en un polipéptido de fusión; por ejemplo, un polipéptido de fusión puede comprender una gama deseada de antígenos de un solo tipo, o puede comprender antígenos de más de un tipo.
Para obtener un polipéptido que comprende antígenos peptídicos múltiples por una técnica de expresión, un enfoque consiste en fusionar las secuencias codificantes individuales en un solo marco de lectura abierto. Por supuesto, la fusión debería llevarse a cabo de tal manera que la actividad antigénica de cada péptido componente no se vea comprometida significativamente por su posición con relación a otro péptido. Debería prestarse por supuesto atención particular a la naturaleza de las secuencias en la unión real entre los péptidos. La secuencia codificante resultante puede expresarse como por ejemplo, como se ha descrito arriba en relación con péptidos recombinantes en general. Los métodos por los cuales puede obtenerse un polipéptido de fusión de este tipo son conocidos en la técnica, y la producción de un polipéptido de fusión recombinante que comprende antígenos múltiples de una cepa de HCV tipo 1 se describe en el documento GB-A-2 239 245. Pueden utilizarse conjugados peptídicos en ensayos amplificados y ELISA de captura de anticuerpos IgG/IgM.
El péptido de la presente invención puede incorporarse en una formulación de vacuna para inducir inmunidad frente a HCV en el hombre. La vacuna puede incluir antígenos de los tipos HCV 1 a 6. Para este propósito, el péptido puede presentarse en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Para uso en una formulación de vacuna, el péptido puede presentarse opcionalmente como parte de una partícula de fusión central de la hepatitis B, como se describe en Clarke et al. (Nature, 1987, 330, 381-384), o un polipéptido basado en polilisina, como se describe en Tam (PNAS, 1988, 85, 5409-5413).
Alternativamente, el péptido puede unirse opcionalmente a una estructura particulada, tal como liposomas o ISCOMS.
Vehículos farmacéuticamente aceptables para la vacuna incluyen medios líquidos adecuados para uso como vehículos a fin de introducir el péptido en un paciente. Un ejemplo de un medio líquido de este tipo es solución salina. El péptido puede disolverse o suspenderse en forma sólida en el vehículo.
La formulación de vacuna puede contener también un adyuvante para estimular la respuesta inmune y mejorar con ello el efecto de la vacuna. Ejemplos de adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio.
La formulación de vacuna puede contener una concentración final de péptido comprendida en el intervalo de 0,01 a 5 mg/ml, preferiblemente de 0,03 a 2 mg/ml. La formulación de vacuna puede incorporarse en un recipiente estéril, que se cierra luego herméticamente y se guarda a baja temperatura, por ejemplo 4ºC, o puede liofilizarse.
Con objeto de inducir inmunidad en el hombre frente a HCV, pueden administrarse una o más dosis de la formulación de vacuna. Cada dosis puede ser de 0,1 a 2 ml, preferiblemente 0,2 a 1 ml. Un método para inducir inmunidad frente a HCV en el hombre comprende la administración de una cantidad eficaz de una formulación de vacuna, como se define anteriormente en esta memoria.
La presente invención proporciona también el uso de un péptido como se define en esta memoria en la preparación de una vacuna para uso en la inducción de inmunidad frente a HCV en el hombre.
Las vacunas de la presente invención pueden administrarse por cualquier método conveniente para la administración de vacunas, con inclusión de la administración oral e inyección parenteral (v.g. intravenosa, subcutánea o intramuscular). El tratamiento puede estar constituido por una sola dosis de vacuna o una pluralidad de dosis a lo largo de cierto periodo de tiempo.
Descripción de los dibujos
Se describirán a continuación ejemplos de la invención por vía de ejemplo únicamente.
La Figura 1 es una comparación de secuencias de aminoácidos deducidas de parte de la región NS5 de los tipos de HCV 4 y 6 (en comparación con el tipo 1a) del Ejemplo 1. El número de secuencias comparadas se muestra en la segunda columna. Se utilizan códigos de aminoácidos de una sola letra. La posición y frecuencia de variabilidad dentro de un tipo de HCV se indica por un subíndice;
la Figura 2 da secuencias de nucleótidos de DNA correspondientes en la región NS5 de HCV-4 (tres secuencias) y de HCV-6 (una secuencia);
la Figura 3 es un análisis filogenético de secuencias de NS5 procedentes de 67 aislados de HCV, mostrando los tipos de HCV principales (numerados 1-6) y subtipos (designados a, b, c) y demostrando que HCV-4 y HCV-6 son tipos distintos. La distancia de secuencia es proporcional a la separación en el árbol de acuerdo con la escala indicada;
la Figura 4 muestra secuencias iniciadoras de DNA tal como se utilizan en el Ejemplo 2 para la amplificación por PCR de dos regiones de la región NS-4 de HCV-4, HCV-5 y HCV-6; y
la Figura 5 muestra secuencias de DNA y aminoácidos para dos regiones parciales de la región NS4 de HCV-4, HCV-5 y HCV-6 deducidas de las secuencias de nucleótidos dilucidadas en el Ejemplo 2; para comparación, se dan las regiones correspondientes de HCV-1, 2 y 3, y las regiones de HCV-3 1 y 2 correspondientes a los aminoácidos 1691-1708 y 1710-1728 respectivamente de la Figura 9b del documento WO93/10239 (véase también Simmonds et al., 1993, J. Clin. Microb. 31:1493).
Ejemplo 1 HCV-4 y HCV-6; secuencias de la región NS5
Muestras. Se utilizó plasma de un total de 16 donantes de sangre infectados con HCV en Escocia, Egipto y Hong Kong y de un paciente con hepatitis crónica en Lebabon para análisis de las secuencias NS5 de los tipos 4 y 6.
Análisis de la secuencia de nucleótidos. Para obtener secuencias en la región NS5, el RNA vírico se transcribió inversamente y se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en una sola reacción con iniciadores previamente publicados que se considera están altamente conservados entre las diferentes variantes de HCV (Enomoto et al. 1990). Para algunas secuencias, se llevó a cabo una segunda PCR con los iniciadores 554 y 555 (Chan et al., 1992b) en combinación con dos nuevos iniciadores, 122 (orientación de sentido; 5' CTC AAC CGT CAC TGA GAG AGA CAT 3') y 123 (antisentido; 5' GCT CTC AGG TTC CGC TCG TCC TCC 3'). El DNA producido se fosforiló, purificó y clonó en el sitio SmaI de pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) siguiendo los procedimientos descritos en Simmonds y Chang, 1993. Alternativamente, el DNA amplificado se purificó y secuenció directamente como se describe en Simmonds et al., 1990 y Cha et al., 1992. Estos métodos permitieron la comparación de un fragmento de 222 pb de DNA homólogo a las posiciones 7975 a 8196 en el virus prototipo (numerado de acuerdo con Choo et al., 1991). Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2.
Comparaciones de secuencias de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos se alinearon utilizando el programa KLUSTAL V (Higgins et al. 1992) como se aplica en el paquete de análisis de secuencias GDE. Las distancias entre pares de secuencias se estimaron utilizando el programa DNADIST del paquete PHYLIP (versión 3,4) proporcionado amablemente por el Dr. J. Felsenstein (Felsenstein, 1991), utilizando un modelo que permite tasas de transición y transversión diferentes y diferentes frecuencias de los cuatro nucleótidos (Felsenstein, 1991). Se construyeron los árboles filogenéticos utilizando el algoritmo de ensamblamiento de semejantes ("neighbour-joining") en las series previas de distancias apareadas (Saitou et al. 1987) utilizando el programa NEIGHBOR de PHYLIP,. El árbol filogenético representado en la Figura 3 no tiene raíces. Se encontraron también relaciones filogenéticas equivalentes en un análisis de probabilidad máxima (programa DNAMI de PHYLIP; datos no representados), y 200 réplicas autosuficientes de árboles de ensamblamiento de semejantes (programas PHYLIP SEQBOOT y CONSENSE).
Ejemplo 2 HCV-4, -5 y -6; secuencias de la región NS4
Se han realizado intentos para aislar secuencias de DNA procedentes de la región NS4 del virus de la hepatitis C (HCV) tipos 4, 5 y 6 utilizando amplificación por PCR. Se tomó la decisión de utilizar iniciadores que contenían sitios de restricción, permitiendo con ello la clonación de los productos PCR por clonación de extremos cohesivos. Se diseñaron también iniciadores nuevos a partir de regiones relativamente conservadas del gen NS4 de HCV. La estrategia de clonación implicaba varios pasos particulares, como sigue:
(i)
Reparación Klenow. Los términos del DNA amplificado se repararon con DNA-polimerasa Klenow para asegurar que los extremos que contenían los sitios de restricción estaban completos.
(ii)
Quinasación de términos. Los términos del producto PCR se fosforilaron utilizando polinucleotido-quinasa T4. Esto permitió la autoligación de los productos en un paso de concatemerización.
(iii)
Concatemerización de los productos PCR. Los fragmentos de DNA se ligaron juntos para formar series de concatémeros largas. Este paso internalizó los sitios de restricción codificados en los extremos de los iniciadores, lo que aumentaba notablemente la eficiencia del paso de escisión.
(iv)
Digestión de restricción. Los productos PCR se digirieron durante una noche con la enzima de restricción requerida para exponer los extremos cohesivos.
(v)
Ligación al vector de plásmido.
Los procedimientos y reactivos generales se describen en Maniatis et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor: Nueva York.
a) Amplificación por PCR de las secuencias NS4
Después de la síntesis de cDNA utilizando el iniciador 007, se llevaron a cabo tres tandas de amplificación PCR. Los tipos 4 y 5 se amplificaron por una tanda utilizando 007 y 435, seguida por dos tandas utilizando 5351 y 5943 (los dos cuales codifican sitios de restricción BamHI). Las secuencias de tipo 6 se amplificaron por una tanda que utilizaba 007 más 253, 281 y 221, seguida por dos tandas que utilizaban 5351 y 5943. Los productos de un mínimo de cinco reacciones de la tercera tanda se agruparon para los pasos de clonación. La eficiencia de la ligación final en el vector parecía ser dependiente de una alta concentración del DNA amplificado. Las secuencias iniciadoras se enumeran en la Figura 4.
b) Clonación
Los productos PCR se aislaron por escisión a partir de un gel de agarosa convencional (0,5 x Tris-acetato EDTA (TAE)). El DNA se regeneró a partir de la agarosa por centrifugación a través de lana de vidrio. Los materiales eluidos se agruparon con objeto de aumentar la cantidad total de DNA. El DNA se recuperó del material eluido de TAE por precipitación con etanol. (El DNA reducido a un pelet contenía algunos residuos químicamente inertes procedentes de la agarosa, pero esto no interfería con los pasos siguientes antes de la ligación en el vector. Podrían utilizarse columnas Magic prep (Promega), pero la precipitación con etanol es más sencilla, más barata y más eficiente si se realiza tratamiento con un gran volumen de material eluido de TAE.)
c) Reparación Klenow
Los pelets de DNA precipitados se resuspendieron en una mezcla de reacción Klenow de 50 \mul que comprendía:
50 \mul de tampón de polinucleotido-quinasa (10x),
0,5 \mul de dNTPs 3,3 mM (concentración final 33 \muM),
al menos 100 ng de fragmento de PCR purificado,
agua destilada hasta 50 \mul, y
5 unidades de DNA-polimerasa Klenow.
(10x significa que el reactivo se añadió a 10 veces la concentración final deseada en la mezcla de reacción). La incubación se realizó durante 30 min a 37ºC, seguido por desactivación mediante calentamiento durante 10 min a 75ºC.
La reacción Klenow repara los extremos en los que están localizados los sitios de restricción BamHI. La DNA-polimerasa T4 no debería utilizarse para esta reacción, dado que eliminará los sitios por su actividad de exonucleasa.
d) Quinasación de los extremos
A la mezcla de reacción anterior, se añadió lo siguiente:
5 \mul de rATP 100 mM, y
10 unidades de polinucleótido-quinasa T4.
Esta mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 30-60 min y se desactivó por calentamiento como anteriormente.
e) Concatemerización
Los productos PCR se sometieron luego a concatemerización para internalizar los sitios de restricción por BamHI dentro de multímeros grandes.
A la reacción de fosforilación, se añadió lo siguiente:
60 \mul 10x de tampón de ligasa y
5 unidades de DNA-ligasa T4.
La ligación se incubó durante una noche a 15ºC. La reacción de concatemerización se desactivó por calentamiento como se ha descrito previamente.
f) Digestión por restricción
Los productos PCR concatemerizados se digirieron en monómeros utilizando la enzima de restricción BamHI que exponía simultáneamente los extremos cohesivos. Se añadió lo siguiente a la mezcla de reacción de ligación desactivada por calentamiento:
60 \mul 10x tampón B (Boehringer), y
10-20 unidades de BamHI.
La mezcla de digestión se incubó durante una noche a 37ºC. Aunque la enzima no se desactiva totalmente por calentamiento, la mezcla de reacción se trató de todos modos por calentamiento como se ha indicado arriba.
En este punto, el DNA se purificó por medio de una columna Magic prep para separar los extremos escindidos. El DNA se eluyó de la columna Magic prep en 10 \mul con objeto de concentrarlo todo lo posible.
g) Ligación al vector
Se utilizaron en la ligación 100 ng del vector plasmídico bacteriano pUC18. El DNA del vector plasmídico se había escindido con BamHI y purificado utilizando "Geneclean" (Bio 101), pero no se había desfosforilado. (Se encontró que la reacción de desfosforilación disminuía la eficiencia de ligación del vector en alto grado.). Se pensó que la selección del color azul-blanco como se describe más adelante sería suficiente para identificar los clones. La mezcla de reacción de ligación contenía lo siguiente:
10 \mul del DNA de inserción purificado producido como anteriormente
5 \mul de DNA del vector plasmídico,
1,5 \mul 10x tampón de ligasa, y
1 unidad de ligasa.
La mezcla de reacción se incubó durante una noche a 15ºC.
h) Transformación de E. coli
Se llevaron a cabo transformaciones bacterianas utilizando la cepa de células, XL-1 Blue (Stratagene). Las células se hicieron competentes para transformación por métodos estándar con cloruro de calcio y se guardaron congeladas rápidamente en una suspensión de glicerol/cloruro de calcio en partes alícuotas de 200 \mul. Se utilizaron 3 \mul del producto de la reacción de ligación para transformar 100 \mul de células XL-1 Blue competentes descongeladas rápidamente (10 min en hielo, 2 min a 42ºC, 1 hora a 37ºC con agitación mediante sacudidas después de la adición de 1 ml de caldo L). Las células se extendieron en placas en partes alícuotas de 200 \mul sobre placas de Agar L que contenían X-Gal (20 \mug/ml), IPTG (0,1 mM), Ap (50 \mug/ml) y Tet (12,5 \mug/ml). La presencia de los productos químicos
IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido) y X-GAL
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosido) en el medio produce un color azul en las colonias que contienen plásmidos tales como la serie pUC que codifican el péptido enzimático lacZ. La inserción de DNA clonado en la región del polienlazador de estos plásmidos interrumpe la secuencia del péptido lacZ, destruyendo con ello la capacidad del plásmido para producir la enzima. Las colonias bacterianas que contienen plásmidos recombinantes serán, por consiguiente, blancas.
i) Análisis de las colonias blancas
La sección azul-blanca identificaba colonias de células que contenían plásmidos recombinantes. Estas colonias se seleccionaron y se preparó DNA a partir de ellas por preparaciones de mini-plásmido. La digestión del DNA con BamHI confirmó que los plásmidos contenían inserciones clonadas. El DNA plasmídico se purificó con leche de vidrio ("glassmilk") y se secuenció utilizando el kit USB Sequenase con iniciadores M13 directo e inver-
so.
j) Discusión
Aunque este protocolo contiene un gran número de pasos, su ejecución es sencilla. Trabajos posteriores han encontrado que el método tiene un alto grado de reproducibilidad. Teóricamente, esta estrategia de clonación no debería funcionar si el producto PCR contiene un sitio BamHI interno. Sin embargo, la secuencia NS4 que se obtuvo para el tipo 6 contenía un sitio interno de este tipo; y no existen razones obvias por las cuales las secuencias acortadas de tipo 6 no fuesen de hecho el producto predominante del experimento de clonación.
La Figura 5 muestra las secuencias de DNA y de aminoácidos para dos regiones de NS4 con respecto a los tipos de HCV 1 a 3 (para comparación) y los tipos 4 a 6.
Ejemplo 3 Síntesis de péptidos NS4
Se sintetizaron los péptidos siguientes dentro de la región NS4 de los tipos 1 a 6 de HCV. Los tipos 4 a 6 son secuencias nuevas de acuerdo con la presente invención, mientras que los tipos 1 a 3 se presentan para propósitos de comparación y uso en un ensayo completo de serotipificación de HCV.
3
A continuación se muestra un ejemplo típico de la síntesis de uno de los péptidos.
(a) Síntesis del péptido antigénico múltiple MDL029
Para operar satisfactoriamente, el ensayo de serotipificación requiere que los péptidos se sinteticen sobre un soporte especial de resina, que lleva el núcleo del péptido antigénico múltiple (K_{4}K_{2}K) tal como fue desarrollado por Tam (Tam J.P., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413). Todos los péptidos se sintetizaron en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Synergy modelo 472A, que ejecutaba química FASTmoc^{TM}. La síntesis del péptido se realizó utilizando el programa de ejecución estándar sin modificación. Todos los reactivos utilizados fueron suministrados por Applied Biosystems Limited (Kelvin Close, Birchwood Science Park, Warrington, Reino Unido). La resina MAP era un núcleo de hepta-lisilo (K_{4}K_{2}K) sobre un copolímero de polioxietileno/poliestireno con un enlazador HMP y aminoácido de referencia interna \beta-alanina. El grupo N-a-amino de todos los aminoácidos se protegió con el grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Los aminoácidos con grupos laterales reactivos se protegieron como sigue:
Aminoácido Código Grupo Protector
Glutamina Q terc-butil-éster (OtBu)
Cisteína C tritilo (Trt)
Serina S terc-butilo (tBu)
Treonina T terc-butilo (tBu)
Tirosina Y terc-butilo (tBu)
Ácido aspártico D terc-butil-éster (OtBu)
Arginina R 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
(Pmc)
El progreso de la síntesis se monitorizó por medida de la conductividad de las mezclas de acoplamiento y desprotección. No existe anormalidad alguna en la traza de conductividad y se consideró que la síntesis había tenido éxito.
Después de la síntesis, la resina peptídica totalmente protegida se transfirió a un tubo de polipropileno cónico de 50 ml de capacidad y se trató con tioanisol (0,15 ml), etanoditiol (0,15 ml) y ácido trifluoroacético (TFA; 2,7 ml). La mezcla se agitó durante 3 horas a la temperatura ambiente, se filtró luego a través de lana de vidrio en una pipeta Pasteur, dejando caer gota a gota el filtrado en 20 ml de terc-butilmetiléter (TMBE) contenido en un frasco de vidrio con tapón roscado, con lo cual precipitó el péptido. El tubo se centrifugó y se aspiró el líquido, dejando el sedimento de péptido en el tubo. El péptido se lavó con 3 partes alícuotas adicionales de 20 ml de TMBE, utilizando una espátula para disgregar el sedimento y centrifugación para recuperar el péptido. El péptido se secó finalmente a la temperatura ambiente a vacío.
Para analizar la pureza del péptido, se disolvió una pequeña muestra en agua purificada y se sometió a análisis por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC). La columna de fase inversa era de 250 x 4,6 mm, conteniendo una matriz C_{4}. El péptido se eluyó con un gradiente de 3,5% acetonitrilo a 70% acetonitrilo durante 20 minutos a un caudal de 1,5 ml min^{-1}. El eluyente se monitorizó a 214 nm para detectar el péptido.
Ejemplo 4 Ensayo para la determinación de los serotipos 1-6 de HCV
Los autores de la invención han desarrollado un ensayo basado en competición selectiva, que es capaz de distinguir el serotipo de HCV para el cual se han producido los anticuerpos presentes en una muestra biológica. Típicamente, la muestra será suero o plasma de un humano con infección confirmada por hepatitis C.
El ensayo está basado en la selectividad de 17 péptidos sintéticos diferentes que cubren secuencias variables dentro de la proteína NS4 de los tipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del virus de la hepatitis C. Si bien existe cierto grado de reactividad cruzada entre los antisueros generados para NS4 de un serotipo de HCV y la región homóloga de otros serotipos, ésta puede bloquearse sin eliminar por completo la reactividad verdadera. Teniendo en cuenta esto, se ha desarrollado un formato de ensayo que implica recubrir los pocillos de una placa de microtitulación con una cantidad igual de la totalidad de los 17 péptidos. Las muestras se ensayan en ocho pocillos duplicados que reciben cada uno una mezcla diferente de péptidos bloqueantes. Un solo pocillo de ensayo y el pocillo de control incompleto deberían contener coloración al final del protocolo de ensayo, identificando con ello el serotipo del virus de la hepatitis C infectante.
Las placas para los ensayos de serotipificación se preparan por recubrimiento de cantidades aproximadamente equimolares de cada uno de los péptidos sobre placas de micropocillos de poliestireno. Los péptidos se disuelven en agua purificada y se realiza una mezcla a la concentración siguiente:
MDL031)
MDL033)
MDL036) 25 ng/ml
MDL035)
MDL037Q)
MDL038Q)
MDL039)
MDL041)
MDL040)
MDL042)
MDL044)
MDL034) 50 ng/ml
MDL028)
MDL024)
MDL029)
MDL025)
MDL022)
Aunque, hablando estrictamente, cada micropocillo precisa contener únicamente el péptido del tipo que se intentaba detectar, es más conveniente recubrir cada micropocillo con la totalidad de los seis tipos de antígeno.
Se dejó que los péptidos se fijaran a las placas por adición de 100 \mul de la mezcla de péptidos a cada pocillo de la placa e incubación a +4ºC durante una noche.
Para proporcionar diferenciación suficiente entre los diversos serotipos, es necesario añadir luego péptidos heterólogos competidores a la muestra que se ensaya. se preparan soluciones competidoras en un diluyente de la muestra de ensayo para dar un exceso de 100 veces del péptido competidor, con relación a la concentración de recubrimiento. Las diferentes soluciones competidoras se clasifican de acuerdo con el serotipo para el cual son bloqueantes, es decir la Solución Competidora 1 contiene péptidos para los tipos 2-5. Se preparan soluciones competidoras que tengan el exceso requerido en 10 \mul. Las soluciones competidoras son como sigue:
4
5
El protocolo para la utilización del ensayo de serotipificación es como sigue:
1)
se añaden 180 \mul de muestra del diluyente a cada pocillo.
2)
Se añaden 10 \mul de péptidos bloqueantes a los pocillos relevantes.
3)
Se añade una muestra de 10 \mul a cada uno de 6 pocillos.
4)
Se mezcla la placa y se incuba a 37ºC durante 1 hora.
5)
Se lavan tres veces los pocillos.
6)
Se añaden 100 \mul de conjugado a cada pocillo.
7)
Se incuba a 37ºC durante 1 hora.
8)
Se lavan tres veces los pocillos.
9)
Se añaden 100 \mul de solución de TMB (que incluye 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, peróxido de hidrógeno, tampones etc.)
10)
Se incuba a 37ºC durante 30 minutos.
11)
Se para la reacción con ácido sulfúrico; y
12)
se lee la densidad óptica a 450 nm/690 nm.
Las muestras que se sabe contienen anticuerpos anti-HCV se ensayan a una dilución de 1/20 con un exceso de 100 veces de péptidos competidores, en un volumen total de 200 \mul como se ha descrito arriba. Después de la incubación, se retira la muestra y se lavan los pocillos. Se añade una inmunoglobulina G anti-humana conjugada a peroxidasa de rábano picante, y se fija a cualesquiera anticuerpos anti-HCV capturados. El anticuerpo fijado se visualiza luego por tirada del conjugado de enzima y adición de un sustrato y cromógeno, que, en presencia de la enzima, se convierte de una solución incolora en una coloreada. La intensidad del color puede medirse y la misma es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente. Los resultados sobre ciertas muestras se dan en la Tabla 1.
Ejemplo 5 Ensayo para la determinación de los serotipos HCV 4-6
Se ha desarrollado una alternativa al formato de ensayo del Ejemplo 4. Este ensayo es de alcance más limitado, utilizando únicamente los péptidos para los tipos 4, 5 y 6. Para algunas muestras, el ensayo más exhaustivo puede dar resultados erróneos, debido a la mayor reactividad cruzada con los péptidos de tipo 1. El protocolo para realización del ensayo más restringido es idéntico al dado en el Ejemplo 4.
Se preparan placas para el ensayo de los tipos de HCV 4-6 como se ha descrito en el Ejemplo 4, siendo la única diferencia el número reducido de péptidos utilizado. Los péptidos se disuelven en agua purificada y se prepara una mezcla a la concentración siguiente:
MDL034)
MDL028)
MDL024) 50 ng/ml
MDL029)
MDL025)
MDL022)
Se deja que los péptidos se fijen a las placas por adición de 100 \mul de la mezcla de péptidos a cada pocillo de la placa e incubación a +4ºC durante una noche.
Con objeto de proporcionar diferenciación suficiente entre los diversos serotipos, es necesario añadir luego péptidos heterólogos competidores con la muestra que se ensaya. Se preparan soluciones competidoras en diluyente de la muestra de ensayo para dar un exceso de 100 veces de péptido competidor, con relación a la concentración de recubrimiento.
Las diferentes soluciones competidoras se clasifican de acuerdo con el serotipo para el cual son bloqueantes, es decir la Solución Competidora 4 contiene péptidos para los tipos 5 y 6. Las soluciones competidoras se preparan de modo que tengan el exceso requerido en 10 \mul. Las soluciones competidoras son como sigue:
Solución competidora Péptido Concentración
4 MDL024 50 \mug/ml
MDL029 ''
MDL025 ''
MDL022 ''
5 MDL034 50 \mug/ml
MDL028 ''
MDL025 ''
MDL022 ''
6 MDL034 50 \mug/ml
MDL028 ''
MDL024 ''
MDL029 ''
Las muestras que se sabe contienen anticuerpos anti-HCV se ensayan a una dilución de 1/20 con un exceso de 100 veces de péptidos competidores, en un volumen total de 200 \mul, como se describe en el Ejemplo 4. Después de la incubación, se retira la muestra y se lavan los pocillos. Se añade una inmunoglobulina G anti-humana conjugada a peroxidasa de rábano picante, y se fija a cualesquiera anticuerpos anti-HCV capturados. Se visualiza luego el anticuerpo fijado por retirada del conjugado enzimático y adición de un sustrato y cromógeno, que, en presencia de enzima, se convierte de una solución incolora en una coloreada. La intensidad del color puede medirse y es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente.
Los resultados sobre ciertas muestras se dan en la Tabla 2.
TABLA 1 
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados positivos se muestran en negrita.
TABLA 2 
\vskip1.000000\baselineskip
7
Los resultados positivos se muestran en negrita.
NB.- La preponderancia de los resultados del tipo 4 refleja la incidencia y disponibilidad relativas de muestras para los tipos 4, 5, y 6.
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Claims (31)

1. Un péptido HCV que tiene una secuencia antigénica NS4 seleccionada de las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
8
2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que está fijado a un núcleo de péptido antigénico múltiple.
3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
9
donde K_{4}K_{2}K es el núcleo de péptido antigénico múltiple.
4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que está fusionado a otro péptido para formar un péptido de fusión.
5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 4 fusionado a otro péptido seleccionado del grupo constituido por \beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, trpE o secuencia codificante de polihedrina.
6. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está marcado.
7. Un anticuerpo para un péptido antigénico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Una formulación de vacuna que comprende un péptido antigénico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Un dispositivo de inmunoensayo que comprende un sustrato sólido que tiene inmovilizado en él un péptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual una mezcla de péptidos antigénicos de HCV tipo 4, tipo 5, o tipo 6 está inmovilizada sobre el sustrato sólido.
11. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, en el cual una mezcla de péptidos antigénicos de HCV tipos 4, 5 y 6 está inmovilizada sobre el sustrato sólido.
12. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, 10 ó 11 en la cual la mezcla comprende adicionalmente uno o más péptidos antigénicos NS4 de los tipos HCV 1 a 3.
13. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la mezcla es una mezcla de péptidos antigénicos de HCV tipo 1, 2, 3, 4, 5, y 6.
14. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 9, para tipificación de HCV que comprende un sustrato sólido que contiene una serie de localizaciones que contienen respectivamente péptidos antigénicos HCV-4, HCV-5 y
HCV-6.
15. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el cual el sustrato sólido tiene una serie de localizaciones, teniendo cada localización inmovilizado sobre ella el péptido antigénico de dicha mezcla de péptidos antigénicos.
16. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 15, en el cual en cada localización se proporciona adicionalmente una mezcla de péptidos de HCV bloqueantes antigénicos no inmovilizados, excluyendo la mezcla en cada localización el péptido del tipo HCV que dicha localización se propone detectar.
17. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para la detección de los tipos 1 a 6 de HCV.
18. Un kit de inmunoensayo que comprende un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 15; junto con una serie de soluciones, comprendiendo cada solución una mezcla de péptidos de HCV bloqueantes antigénicos, excluyendo la mezcla el péptido del tipo de HCV que cualquier localización particular se propone
detectar.
19. Un kit de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual el dispositivo de inmunoensayo comprende un sustrato sólido que tiene una serie de localizaciones, teniendo cada localización inmovilizada sobre ella una mezcla de péptidos antigénicos de los tipos de HCV 1, 2, 3, 4, 5 y 6; junto con una serie de seis soluciones, comprendiendo cada solución una mezcla de péptidos HCV bloqueantes antigénicos diferentes seleccionados de los péptidos antigénicos de HCV tipo 1, 2, 3, 4, 5 y 6, excluyendo las seis soluciones respectivamente los péptidos antigénicos de un tipo que una localización particular a la cual se aplica la solución se propone detectar.
20. Un dispositivo de inmunoensayo que comprende un sustrato sólido que tiene inmovilizado sobre él un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7.
21. Un método de escrutinio in vitro de una muestra para anticuerpos de HCV que comprende:
realizar un inmunoensayo que emplea un péptido antigénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y detectar cualquier complejo anticuerpo-antígeno producido.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual el péptido antigénico se inmoviliza sobre un sustrato sólido y el anticuerpo de HCV a detectar que puede estar presente en la muestra se fija al péptido.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en el cual una mezcla de péptidos antigénicos se inmoviliza sobre el sustrato sólido.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual la mezcla es una mezcla de péptidos antigénicos de HCV tipo 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
25. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el cual la muestra y una mezcla de péptidos de HCV bloqueantes antigénicos se aplican al o a los péptidos antigénicos inmovilizados sobre el sustrato sólido, excluyendo la mezcla de péptidos bloqueantes aquellos péptidos del tipo de HCV que se trata de detec-
tar.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual el sustrato sólido tiene una serie de localizaciones, teniendo cada localización inmovilizada sobre ella una mezcla de péptidos antigénicos; y en el cual la mezcla de péptidos de HCV bloqueantes antigénicos que se aplica al sustrato sólido excluye los péptidos del tipo de HCV que cualquier localización particular se propone detectar.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual el sustrato comprende una serie de seis localizaciones, teniendo cada localización inmovilizada sobre ella una mezcla de péptidos antigénicos de HCV tipos 1, 2, 3, 4, 5 y 6;
y en el cual la mezcla de péptidos bloqueantes antigénicos que se aplica a cada localización excluye los péptidos antigénicos del tipo de HCV que la localización se propone detectar.
28. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en el cual cualesquiera anticuerpos HCV presentes en la muestra se capturan sobre el sustrato, y se aplica después a ellos el péptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 6 para detección de cualesquiera anticuerpos de HCV capturados.
29. Un polinucleótido de HCV aislado que tiene una secuencia NS4 seleccionada de las siguientes:
10
30. Un polinucleótido que codifica un péptido de la reivindicación 1.
31. Un método de ensayo in vitro de una muestra para HCV que comprende someter a transcripción inversa cualquier polinucleótido de HCV presente en la muestra, amplificarlo por la reacción en cadena de la polimerasa, y detectar el polinucleótido de HCV amplificado empleando como sonda un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 y 30.
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