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ES2223469T3 - Amplificacion de señal catalizada enzimaticamente. - Google Patents

Amplificacion de señal catalizada enzimaticamente.

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Publication number
ES2223469T3
ES2223469T3 ES00909507T ES00909507T ES2223469T3 ES 2223469 T3 ES2223469 T3 ES 2223469T3 ES 00909507 T ES00909507 T ES 00909507T ES 00909507 T ES00909507 T ES 00909507T ES 2223469 T3 ES2223469 T3 ES 2223469T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amplification
sequence
nucleic acid
stage
mold
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES00909507T
Other languages
English (en)
Inventor
Conor Mulrooney
John Douglas Oultram
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tepnel Medical Ltd
Original Assignee
Tepnel Medical Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Tepnel Medical Ltd filed Critical Tepnel Medical Ltd
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

Procedimiento para detectar una molécula diana (20), que comprende las etapas siguientes: i)poner en contacto una muestra con la sonda localizadora (10, 30) que comprende una porción de unión (11, 31) específica para dicha molécula diana (20) y una secuencia de ácido de amplificación nucleico (12, 32) para producir un complejo de molécula diana-sonda localizadora; ii) producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dichas muestras y sonda localizadora (10, 30) tratándolas con: a) un molde de amplificación de cadena simple (40.50) que comprende: i) colocado en la dirección 5¿ a 3¿: a) una secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51); b) una secuencia de hibridación de ácido nucleico (42) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 52) de la etapa previa de amplificación o, donde no existe etapa previa de amplificación, de la etapa anterior y presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (42, 51); y c) una porción de amplificación (43, 53), limitada en su totalidad excepto la repetición final a una secuencia de ácido nucleico; y ii) opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico. b) un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3¿ de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 53) de la etapa previa de amplificación o, donde no existe etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50); c) un agente separador capaz de eliminar suficientemente dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50) cuando se hibrida a dicha cadena complementaria para permitir la subsiguiente hibridación de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (42, 52) de dicho molde de amplificación (40, 50) a dicha cadena complementaria; y d) los reactivos y condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3¿ de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 53) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una pluralidad de secuencias complementarias de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50); iii) detectar cualquier molde de amplificación unido (40, 50) de la(s) etapa(s) de amplificación; y iv) correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana (20).

Description

Amplificación de señal catalizada enzimáticamente.
La presente invención se refiere a la detección de moléculas señal diana utilizando procedimientos de amplificación catalizados enzimáticamente de diana asociada a estructuras detectables.
Algunas técnicas de amplificación de ácidos nucleicos son ya conocidas, por ejemplo la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). De todas formas muchas de estas técnicas, incluyendo la PCR, adolecen de amplificar específicamente una secuencia diana (amplicon) presente en la muestra de interés. Este amplicon, una vez generado, puede fácilmente contaminar el área de trabajo del laboratorio en la cual no se mantienen controles estrictos. Dicha contaminación puede evitar subsiguientes reacciones de amplificación, y puede requerir una suspensión de las pruebas y del inicio de procesos de descontaminación muy caros.
Técnicas tales como la PCR, la cual detecta la presencia de una secuencia amplificando su número a niveles detectables, se conocen como Sistemas de Amplificación de Dianas. Por el contrario, se sabe que algunas técnicas amplifican una señal a niveles detectables, normalmente seguidos por la unión de unas moléculas detectoras a la molécula de interés, sin la amplificación de dicha molécula. Estas técnicas se conocen como Técnicas de Amplificación de Señales.
Un sistema Chiron Corporation de este tipo (Urdea et al., US 5681697 y referencias citadas en este documento) se conoce como el ``sistema ramificado de ADN (rDNA). Este sistema se basa en la unión a la molécula diana de un gran número de sondas detectoras, las cuales contienen dentro de su secuencia un sitio para hibridación de una secuencia no específica de la diana. Esta secuencia actúa como el sitio para hibridación de una estructura de "ADN ramificado" presintetizado con numerosos sitios para la hibridación de ramificaciones secundarias o de sondas de detección. Una de las desventajas principales de este sistema es el gran número de componentes que sé requieren para generar la estructura final a la cual se adhieren las sondas de detección. Además, los numerosos pasos de hibridación involucrados en el proceso de construcción prevén proporcionar el sistema susceptible de producir una señal de fondo no específica.
Las patentes US 5451503, WO 98/02580, WO 97/42346 y US 5681697 incluyen otros sistemas de detección de diana conocidos en la técnica.
La presente invención proporciona un procedimiento para la amplificación de una señal basada en ácido nucleico. Implica la generación de una estructura repetitiva que contiene copias múltiples de una secuencia detectable, y se produce a través de la acción concertada de una polimerasa (la cual extiende la estructura repetitiva) y un agente separador (el cual descubre los sitios de hibridación para permitir el ensamblado de las repeticiones de secuencia). El procedimiento de la invención ofrece las siguientes ventajas sobre otros procedimientos existentes:
1.
Utiliza un pequeño número de componentes baratos y también evita el alto coste de los problemas de ensayos asociados con otros sistemas de amplificación de señales tales como el rDNA.
2.
Usa una señal de amplificación en vez de un acercamiento de amplificación de la diana, solucionando así los problemas de contaminación asociados con muchas de las metodologías actuales tales como la PCR.
3.
Es un proceso catalizado enzimaticamente que ensambla activamente la estructura generadora de señales en vez de depender de las aproximaciones basadas en hibridación pasiva de los procedimientos no enzimáticos tales como el bDNA.
4.
Posee la habilidad de tratar dianas de ARN y ADN con la misma eficiencia sin pretratamientos, a diferencia por ejemplo de la PCR, la cual requiere un paso de transcripción inversa inicial antes de que las dianas de ARN puedan ser amplificadas.
5.
Como el proceso se utiliza en conjunción con una diana inmovilizada en fase sólida, posee el potencial de ser integrado en aparatos de fase sólida de última tecnología tales como los Biochips.
La molécula diana puede ser inmovilizada inicialmente en una fase sólida antes de aplicar el procedimiento de detección de la presente invención. La invención no está limitada a ello o a otro formato de ensayo específico.
De acuerdo con un primer modo de realización de la presente invención, se ha proporcionado un procedimiento para detectar a la molécula diana, que comprende las siguientes etapas:
i) poner en contacto la muestra con una sonda localizadora que comprende un motivo específico de unión para dicha molécula diana y una secuencia de ácido nucleico de amplificación para producir un complejo de una molécula diana-sonda localizadora;
ii) producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en el paso anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dicha muestra tratada y sonda localizadora con:
a)
Un molde de amplificación de cadena simple que comprende:
i)
Colocado en la dirección 5' a 3':
a)
Una secuencia de extensión de ácido nucleico;
b)
Una secuencia de hibridación de ácido nucleico complementaria a la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa previa y presentando sustancialmente la misma secuencia que la dicha secuencia de extensión de ácido nucleico; y
c)
Una porción de amplificación, limitada en toda su extensión excepto la repetición final a una secuencia de ácido nucleico; y
ii)
Comprendiendo opcionalmente al menos una porción de señal diferente a que excluya a una secuencia de ácido nucleico.
b)
un agente polimerizador capaz de extender la zona terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación, o, donde no etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
c)
un agente separador capaz de extraer, suficiente secuencia de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación cuando sé hibridiza dicha cadena complementaria para permitir la lubrificación subsiguiente de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dicho molde de amplificación a dicha cadena complementaria; y
d)
los reactivos y las condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agentes de polimerización y separación para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación del ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa de amplificación previa, de la etapa previa de la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
iii) detectar cualquier molde de amplificación unido de la etapa o etapas de amplificación; y
iv) correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana.
La referencia en varios modos de realización de la invención a "la etapa anterior" se refiere típicamente a la etapa (i) del procedimiento, aunque no se incluye (ver más adelante) como una "etapa anterior" una etapa de amplificación (es decir, una etapa que produzca una estructura de amplificación) de un diferente modo de realización de la invención.
La separación de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico puede conseguirse usando una exonucleasa 5' de cadena doble cuya actividad es protegida contra la secuencia de hibridación de ácido nucleico. La secuencia de hibridación de ácido nucleico (y otras secuencias, si fuera necesario) puede ser protegida de la actividad de la exonucleasa sustituyendo residuos de 2'-O-metil ARN por residuos normales durante su síntesis.
En un segundo modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar una molécula diana (usando moldes de amplificación cuyas regiones de extensión e hibridación se diferencian tanto que minimizan las reacciones secundarias de interferencia) que comprende las etapas siguientes:
i) poner en contacto una muestra con una sonda localizadora que comprende una porción de unión específica para dicha molécula diana y una secuencia de amplificación de ácido nucleico para producir un compuesto molécula diana-sonda localizadora;
ii) producir una estructura de amplificación unida a cualquier compuesto producido en la etapa anterior, realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dichas muestra y sonda localizadora con:
a)
Un primer molde de cadena sencilla de amplificación que comprende:
i)
Dispuesto en la dirección 5'-3':
a)
Una secuencia de extensión de ácido nucleico;
b)
Una secuencia de hibridación de ácido nucleico complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa de amplificación previa o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa previa y teniendo una secuencia sustancialmente diferente a dicha extensión de secuencia de ácido nucleico; y
c)
Una porción de amplificación, limitada en su totalidad excepto en la repetición final a una secuencia de ácido nucleico; y
ii)
Comprende opcionalmente por lo menos una porción de señal que no sea una secuencia de ácido nucleico.
b)
Un segundo molde de cadena sencilla de amplificación que comprende:
i)
Dispuesto en la dirección 5' a 3'
a)
Una secuencia de extensión de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dicho primer molde de amplificación;
b)
Una secuencia de hibridación de ácido nucleico que comprende la secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho primer molde de amplificación; y
c)
Una porción de amplificación, limitada en su totalidad excepto el paso de amplificación final a una secuencia de ácido nucleico; y
ii) Comprende opcionalmente por lo menos una porción señal que no sea que la secuencia de ácido nucleico;
c)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación del ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa anterior sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación;
d)
un agente separador capaz de extraer suficientemente de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación cuando se hibridizan a dicha cadena complementaria para permitir la hibridación subsiguiente de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación a dicha cadena complementaria; y
e)
los reactivos y condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agente polimerizador y agente separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación del ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay una etapa previa de amplificación, de la etapa previa por la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias de dichas secuencias de extensión de ácidos nucleicos de dichos primer y segundo moldes de amplificación;
iii) detectar cualquier primer y/o segundo molde de amplificación unido de la etapa o etapas de amplificación; y
iv) correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana.
La separación de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación puede lograrse usando una exonucleasa 5' de cadena doble cuya actividad sobre la secuencia de hibridación de dicho ácido nucleico de este primer molde de amplificación y dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de este segundo molde de amplificación están protegidos.
Sonda localizadora
La sonda localizadora presenta dos regiones distintas; la porción de unión de la diana y la secuencia de amplificación de ácido nucleico. La función de la porción de unión de la diana es localizar e interactuar con la molécula diana para ubicarse en ese punto. La porción de unión de la diana puede comprender todo aquello capaz de unirse específicamente a la molécula diana. Por ejemplo en el caso de que la molécula diana fuese una secuencia de ácido nucleico, la porción de unión puede comprender una secuencia de ácido nucleico complementaria de la secuencia diana de ácido nucleico. Alternativamente, puede comprender ARN, una mezcla de ARN y ADN o por ejemplo APN. Alternativamente, la porción de unión puede comprender un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno específico a la molécula diana (Harlow, E. y Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Cork, 1998). Otros mecanismos de unión (por ejemplo los que conllevan los enlaces covalentes) y serán evidentes para el experto en la materia. La secuencia de amplificación de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que no es complementaria de la diana y no debería unirse a ella, por ello posibilitando su acceso a eventos de unión posteriores. Donde la molécula diana es una secuencia de ácido nucleico, la sonda localizadora puede ser construida de tal manera que su porción de unión de diana y la secuencia de amplificación de ácido nucleico son oligonucleótidos unidos mediante una conexión 5'-3', o alternativamente usando una unión 5'-5', de tal forma que cada región presente un terminal libre extensible 3'. Donde la porción de unión diana es un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno, la porción de señal de ácido nucleico puede presentar un enlace covalente a ella mediante procedimientos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ito, W. y Kurosawa, Y. 1993, Journal of Biological Chemistry, 268(27): 20668-20675).
Molde de amplificación primaria y la estructura primaria
El molde de amplificación es diseñado para hibridar a través de su región de hibridación (su secuencia de hibridación de ácido nucleico) con una secuencia complementaria de ácido nucleico. Bajo las condiciones de reacción apropiadas el extremo 3' de este complemento hibridado puede extraerse para crear un complemento para la región de extensión (la secuencia la extensión de ácido nucleico) del molde de amplificación. La eliminación selectiva de la región de extensión del molde de amplificación deja entonces una región sintetizada nueva de cadena simple a la cual puede hibridar un molde adicional de amplificación. Una repetición de las etapas de hibridación, extensión y eliminación se traduce en una estructura extendida compuesta de repeticiones múltiples del molde de amplificación. Para distinguir esta estructura de otras que pueden generadas, posteriormente es referida como Estructura Primaria. Los moldes de amplificación implicados en su construcción son conocidos como moldes de amplificación primarios.
Dentro de la Estructura Primaria están las porciones de amplificación de los moldes de amplificación primarios incorporados. Estas regiones, al no ser complementarias de la diana o de la Estructura Primaria, están disponibles para ser hibridazas con las sondas de detección convenientemente designadas.
Si la región de hibridación del molde de amplificación primario está diseñada por ejemplo para ser complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la sonda localizadora, la Estructura Primaria debería estar entonces adherida a la sonda localizadora, la cual estaría pegada a la diana. La hibridación de las sondas de detección a la Estructura Primaria proporcionaría por ello un número de señales amplificado linealmente generando sitios unidos a la secuencia diana.
Los moldes de amplificación secundaria y la Estructura Secundaria
Como una alternativa para proporcionar secuencias de hibridación de ácido nucleico para la subsiguiente detección usando por ejemplo sondas de detección, las porciones de amplificación del molde primario incorporados en la Estructura Primaria pueden actuar como complementos para la región de hibridación de moldes de amplificación secundaria.
La región de hibridación (es decir, el segundo molde de amplificación de la secuencia de hibridación de ácido nucleico) está diseñada para ser complementaria de la porción de amplificación del molde de amplificación primaria. Bajo las condiciones apropiadas de reacción el extremo 3' del molde de amplificación primaria de la porción puede ser extendido para crear un complemento para la región de extensión del molde de amplificación secundaria. La eliminación selectiva de la región de extensión del molde secundario luego deja entonces una región de cadena sencilla recién sintetizada a la cual puede hibridar un molde de amplificación secundario adicional. Una repetición de los pasos de hibridación, extensión y eliminación proporciona estructuras extendidas múltiples (compuestas de repeticiones múltiples del molde secundario) adheridas a la Estructura Primaria. Esta estructura se refiere a la Estructura Secundaria.
Siendo las porciones de amplificación incorporadas de los moldes secundarios no complementarios a la diana, la Estructura Primaria o Estructura Secundaria están disponibles para ser hibridadas por las sondas de detección convenientemente designada. En general un aumento no lineal en el número de diana asociada a sitios productores de señales es proporcionado por la generación de la Estructura Secundaria.
Cada reacción, que se provoca en la formación de una estructura, se refiere a una repetición. La primera repetición genera la Estructura Primaria, la segunda repetición genera la Estructura Secundaria y así sucesivamente. Estructuras Terciarias y Cuaternarias pueden ser generadas de esta forma llevando a cabo el número apropiado de repeticiones. El número de repeticiones llevado a cabo dependerá de la aplicación y reflejará la sensibilidad requerida.
Agentes separadores
La generación de las estructuras extendidas primaria o secundaria, etc., se basa en la eliminación de la región de extensión del molde de amplificación una vez que se ha realizado el complemento de esa región. El descubrimiento de esta cadena sintetizada nuevamente proporciona un sitio para otro molde de amplificación para hibridar y por ello continuar el proceso de ensamblaje. Los agentes de separación son responsables de la eliminación de la región de extensión. Estos agentes separadores pueden incluir cualquier combinación de los siguientes: una exonucleasa específica de doble cadena 5' (tal como T7 gen 6 exonucleasa, o Lambda exonucleasa); una exonucleasa de restricción; una ARNsa (como ARNsa H); temperatura elevada; o desnaturalización química.
La eliminación selectiva de la región de extensión, si bien asegura que las otras regiones del molde de amplificación incorporado permanecen ancladas a la estructura en crecimiento, requiere algunos medios de control o limitación de la acción de los agentes separadores. La protección contra la exonucleasa puede ser conseguida mediante el uso de nucleótidos análogos o secuencias de ácidos nucleicos sintéticas (por ejemplo, los puentes fósforotioato o 2'-O-Metil ARN respectivamente). La inclusión de estos bloqueadores sintéticos puede restringir la actividad de las exonucleasas a aquellas áreas donde se requiera.
La incorporación de enlaces modificados puede también alterar las actividades de las enzimas de restricción, resultando en una incisión de doble cadena, mella de cadena simple o la no restricción de los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción compuestos por la misma secuencia base. Deoxinucleotido fosforotioatos, nucleótidos metilados y deoxinucleósidos trifosfatos borados son todos los ejemplos de análogos satisfactorios los cuales, cuando se incorporan en los sitios de reconocimiento pueden modificar las actividades de sus enzimas de restricción.
El uso de moldes de amplificación ARN:ADN quimérico permite la eliminación selectiva de las porciones definidas del molde usando RNasa H la cual actúa en la porción de ARN de los híbridos de ARN:ADN.
En el primer y segundo modos de realización, el agente de separación es una exonucleasa específica de cadena doble 5', la región de hibridación de los moldes de amplificación y el terminal 5' de la sonda localizadora estarían protegidos por la inclusión de enlaces modificados o análogos de nucleótidos sintéticos. Si el agente de separación es RNasa H luego la región de extensión de los moldes de amplificación estaría compuesta por lo menos en parte por ARN mientras que la región de hibridación estaría compuesta por ADN. Donde los agentes de separación tienen la temperatura óptima de 37ºC, podrían ser usados en conjunción con una polimerasa como Klenow (exo-) polimerasa. En tal caso, el procedimiento podría operar isotérmicamente a 37ºC. Alternativamente, el procedimiento podría por supuesto ser ejecutado a más de una temperatura.
Si el agente separador usado es una endonucleasa de restricción existe la posibilidad de operar el sistema utilizando una variedad de formatos, ejemplos y ventajas proporcionados a continuación:
1.
El procedimiento puede ser realizado isotérmicamente para proporcionar un resultado rápido cualitativo, o para ciclo de temperatura para proporcionar un resultado menos rápido pero cuantitativo.
2.
El procedimiento puede ser realizado a temperaturas mayores de 37ºC para proporcionar estrechez de temperatura controlada, (un servicio importante dada la longitud y complejidad de los moldes de amplificación usados).
3.
Las actividades de las endonucleasas de restricción están definidas, bien caracterizadas y basadas en secuencia, más aun que las exonucleasas tales como T7 gen exonucleasa y Lambda exonucleasa, cuya especificidad de sustrato puede variar.
4.
La combinación y la acción convenida de las endonucleasas de restricción y polimerasas bajo un solo conjunto de condiciones de reacción ha sido demostrado frecuentemente.
5.
La latitud en temperaturas de operación permite una aproximación más flexible en la lógica de diseño, particularmente con respecto a la utilización de materiales diferentes tales como PNA y 2'-O-Metil ARN.
En el caso de un agente separador que es una endonucleasa de restricción, uno o más sitios de restricción se incorporan en las regiones de extensión e hibridación de los moldes de amplificación. Esos sitios en la región de hibridación pueden ser protegidos por la incorporación de análogos de nucleótidos en el sitio de división enzimática. Esos sitios en la región de extensión no están modificados. La hibridación del molde de amplificación y la creación de un complemento para la región de extensión resulta en la formación de sitios de reconocimiento de doble cadena para las enzimas de restricción. La utilización de uno o más dNTPs modificados en la mezcla de la reacción resulta en una cadena nuevamente sintetizada protegida. La enzima mella los sitios en la región de extensión del molde de amplificación y en la temperatura de operación usada, o elevando la temperatura, los fragmentos resultantes se disocian. Esto proporciona un sitio de cadena sencilla al cual un molde de amplificación adicional puede hibridar para continuar el proceso de ensamblaje.
La enzima de restricción utilizada descrita a continuación debe pertenecer al grupo que es capaz de mellar la cadena desprotegida del sitio de reconocimiento de una enzima semimodificada. También es importante que la secuencia del sitio de reconocimiento no sea palindrómica, así los moldes de amplificación que se autohibridan no son sustratos para la división de cadena doble por la enzima de restricción. Un ejemplo de una enzima apropiada es BsoB1. También es posible utilizar enzimas cuya actividad es naturalmente restringida al mellado de una cadena simple opuesta a una división de cadena doble. Un ejemplo de este tipo de enzima es N.BstNB1 el cual tiene una secuencia de reconocimiento de SEC ID nº: 1. Cuando se utiliza dicha enzima, es innecesario incluir análogos de dNTP en la mezcla de la reacción para proteger la cadena nueva sintetizada.
Si el procedimiento de la presente invención se realiza isotérmicamente, la reacción es relativamente rápida (comparada con procedimientos no isotérmicos) pero cualitativa en la de señal generada. El termociclado (donde fragmentos mellados son disociados a una temperatura más alta que las de las enzimas de restricción) puede ser utilizado para generar un rendimiento de señal que proporcione información cuantitativa.
En un tercer modo real, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar una molécula diana, utilizando una enzima de restricción y polimerasa, y comprende las etapas siguientes:
i)
poner en contacto la muestra con una sonda localizadora que comprende una porción de unión específica para dicha molécula diana y una secuencia de amplificación de ácido nucleico para producir un complejo de molécula diana y sonda localizadora, presentando dicha secuencia de amplificación de ácido nucleico uno o mas sitios de restricción para una endonucleasa de restricción cuando se hibrida a una cadena complementaria;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces el paso de amplificación de tratamiento muestra y sonda localizadora con:
a)
un molde de amplificación de cadena simple que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico;
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico complementaria a la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa anterior teniendo substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico; y
c)
una porción de amplificación, estando limitado en su totalidad excepto en el paso final de amplificación a una secuencia de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente comprende por lo menos una porción de señal que no sea una secuencia de ácido nucleico;
b)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa anterior sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
c)
dicha endonucleasa de restricción; y
d)
los reactivos y condiciones necesarias para:
i)
producir la acción de dicho agente polimerizador y agente separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa previa mediante la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación; y
ii)
efectuar la disociación de las cadenas de ácido nucleico, las cuales han sido cortadas por dicha actividad de endonucleasa de restricción a partir de cadenas complementarias sin dividir mientras que no efectúan la disociación de cadenas de ácido nucleico sin dividir de cadenas complementarias sin dividir;
iii)
detectar algún molde de amplificación unido del paso o pasos de amplificación; y
iv)
correlacionar los resultados del paso de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana.
En particular, el paso de amplificación (ii) puede realizado por lo menos dos veces.
Dicha secuencia de amplificación de ácido nucleico y dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico pueden tener modificaciones de nucleótidos, las cuales previenen particiones por dicha endonucleasa de restricción, y dichos reactivos incluyen por lo menos un nucleótido modificado el cual, cuando es incorporado en dicha cadena complementaria por dicho agente polimerizador, previene la división de dicha cadena complementaria por dicha endonucleasa de restricción.
Dicha hibridación de la secuencia de ácido nucleico puede tener por lo menos una modificación de nucleótido la cual previene la división de dicha endonucleasa de restricción, presentando dicha endonucleasa de restricción una única actividad de mellado de cadena simple.
En los tres primeros modos de realización de la presente invención, en los que la porción de amplificación no es una secuencia de ácido nucleico (es decir, en la repetición final de la etapa de amplificación) necesita no estar localizado en 3' en la secuencia de hibridación de ácido nucleico. En vez de eso, debe estar localizado suficientemente en 3' en la secuencia de extensión de ácido nucleico de modo que no se separe de la secuencia de hibridación de ácido nucleico por un agente de separación.
Por ejemplo, la porción de amplificación puede comprender una molécula de biotina (detectable usando técnicas estándares) conjugada a la secuencia de hibridación de ácido nucleico, probablemente (pero no necesariamente) en su extremo 3'.
Alternativamente, la porción de amplificación puede comprender un fluóforo. Por ejemplo, se puede realizar una técnica de fluóforo/extintor (tal como la de Molecular Beacons) (como la utilización, por ejemplo, en PCR fluorescente). Una porción extintora puede ser conjugada a la región 3' de la secuencia de extensión de ácido nucleico, y una porción de fluóforo conjugada a la región 5' de la secuencia de hibridación de ácido nucleico, tal que cuando la secuencia de extensión de ácido nucleico forme parte del molde de amplificación la fluorescencia es extinguida, y cuando el agente separador ha causado la separación de las secuencias de hibridación y extensión de ácido nucleico, se produce la fluorescencia.
De manera similar, las porciones de señal de la presente invención consideran la producción de una señal cuando son generadas las estructuras de amplificación. Puede ser solamente deseable detectar la producción de la estructura de amplificación cuando la amplificación es completa, en cuyo caso la detección puede conseguirse sin utilizar ninguna porción de señal. Alternativamente, puede ser deseable por ejemplo presentar generación de señales a tiempo real a la vez que se produce la amplificación, en cuyo caso una porción de señal tal como una combinación fluóforo/extintor localizada en las secuencias de hibridación y extensión de ácidos nucleicos como se describen más arriba. Esto permitirá la generación de una señal fluorescente detectable mientras el agente separador elimina la secuencia de extensión de ácido nucleico de los moldes de amplificación.
Los moldes de amplificación comprenden menos de tres regiones. Un cuarto modo de realización de la presente invención emplea los moldes de amplificación que comprenden en la dirección 5-3' una región de extensión del ácido nucleico y una región de hibridación de ácido nucleico. El terminal 3' del molde de amplificación es modificado para prevenir la extensión.
Los pasos de hibridación, extensión y separación pueden ser aplicados como con los primer y segundo modos de realización para generar una Estructura Primaria. Si los moldes de amplificación no presentan enlaces modificados para proteger la región de hibridación, la digestión de exonucleasa puede continuar hasta que el molde de amplificación es completamente extraído. La estructura resultante consistirá en una porción de amplificación de sonda extendida localizadora de cadena simple adherida por vía de la porción de unión de la sonda localizadora a la secuencia diana. Esto puede ser detectado utilizando una sonda de detección marcada complementariamente. Si se requiere la generación de una Estructura Secundaria en vez de la detección, la estructura es puesta en contacto con una sonda adicional secundaria que comprende una región de hibridación de ácido nucleico en la dirección 5-3'y una porción de amplificación. Alguna de estas sondas, que permanecen sin hibridar puede ser retirada lavándola antes de la adición de moldes de amplificación secundaria y la generación de la Estructura Secundaria.
Como en el primer modo de realización, se puede utilizar un único molde de amplificación cuyas regiones de secuencia de extensión e hibridación son sustancialmente las mismas, o como en el segundo modo de realización se pueden utilizar dos moldes de amplificación cuyas regiones de secuencia extensión e hibridación son sustancialmente diferentes.
La Estructura Primaria también puede ser generada utilizando moldes de amplificación compuestos por dos regiones (hibridación y extensión) y una enzima de restricción (como en el tercer modo de realización). La estructura resultante consistirá en repeticiones múltiples de la región de hibridación de molde de amplificación hibridadas a la porción de amplificación extendida de la sonda localizadora. No contendrá porciones de amplificación del molde de amplificación.
En un cuarto modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar una molécula diana que comprende las etapas siguientes:
i)
poner en contacto una muestra con una sonda localizadora que comprende:
a)
una porción de unión específica para dicha molécula diana;
b)
una secuencia de amplificación de ácido nucleico para producir un complejo de molécula diana sonda localizadora; y
c)
opcionalmente, una porción de señal que excluya a una secuencia de ácido nucleico;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces el paso de amplificación de tratamiento de dicho complejo con:
a)
un molde de amplificación de cadena simple que comprende:
i)
colocado en la dirección 5 a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico; y
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay una etapa previa de amplificación, de la etapa previa y presentando sustancialmente la misma secuencia de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente, por lo menos una porción de señal que excluya a una secuencia de ácido nucleico;
b)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
c)
un agente separador capaz de retirar suficiente secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación cuando se hibrida a dicha cadena complementaria para permitir la subsiguiente hibridación de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dicho molde de amplificación a dicha cadena complementaria;
d)
los reactivos y condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agente polimerizador y agente separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no etapa previa de amplificación, del paso precedente sintetizando una pluralidad de secuencias complementarias de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación; y
iii)
opcionalmente la repetición una o más veces de los pasos de tratamiento de productos de la repetición previa o, donde no hay repetición previa, los productos de la etapa (ii) con:
a)
un agente separador capaz de extraer el resto de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dicho molde de amplificación de la repetición previa o etapa (ii) cuando se hibrida a dicha cadena complementaria;
b)
una sonda localizadora adicional que comprende:
i)
una sonda de hibridación de ácido nucleico específica a dicha cadena complementaria de la repetición previa o etapa (ii);
ii)
una porción de amplificación, siendo limitado en su totalidad excepto en la repetición final hasta una secuencia de ácido nucleico; y
c)
realizando la etapa (ii) como se define arriba, opcionalmente se usa un molde de amplificación diferente al utilizado previamente;
iv)
la detección de cualquiera de las sondas localizadoras adicionales o moldes de amplificación del paso o pasos de amplificación; y
v)
la correlación de los resultados del paso de detección (iv) con la presencia de dicha molécula diana.
También es posible llevar a cabo el proceso de amplificación usando moldes de amplificación que comprendan en una dirección 5'-3' una región de hibridación y extensión, y cuyas secuencias difieran unas de otras. En un quinto modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar una molécula diana, utilizando moldes de amplificación cuyas secuencias de hibridación y extensión difieran, y comprende las etapas siguientes:
i)
poner en contacto una muestra con una sonda localizadora que comprende una porción específica de unión para dicha molécula diana y una secuencia de amplificación de ácido nucleico para producir un complejo de molécula diana-sonda localizadora;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dicho complejo:
a)
un primer molde de amplificación de cadena sencilla que comprende:
i)
colocado en la dirección 5'-3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico; y
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no haya etapa previa de amplificación, de la etapa previa presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente, por lo menos una porción de señal diferente a una secuencian de ácido nucleico;
b)
un segundo molde de amplificación de cadena sencilla que comprende:
i)
situado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico que comprende dicho primer molde de amplificación de secuencia de hibridación de ácido nucleico; y
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico que comprende dicho primer molde de amplificación de secuencia de extensión de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente, comprende por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
c)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación del ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay una etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
d)
un agente separador capaz de extraer suficiente de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación cuando se hibridan a dicha cadena complementaria para permitir la subsiguiente hibridación de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación a dicha cadena complementaria;
e)
los reactivos y condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agente polimerizador y agente separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no hay etapa previa de amplificación, de la etapa anterior sintetizando una pluralidad de secuencias complementarias a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
iii)
opcionalmente se repiten una o más veces las etapas de tratamiento de los productos de las repeticiones previas o, donde no hay repetición previa, los productos de la etapa (ii) con:
a)
un agente separador capaz de extraer los restos de dichas secuencias de hibridación de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación de las repeticiones previas o de la etapa (ii) cuando se hibridan a dicha cadena complementaria;
b)
una sonda localizadora adicional que comprende:
i)
una sonda de hibridación de ácido nucleico específica a dicha cadena complementaria de la repetición previa o etapa (ii); y
ii)
una porción de amplificación, limitada en su totalidad excepto la repetición final a la secuencia de ácido nucleico;
c)
realizando la etapa (ii) como se ha expuesto con anterioridad, opcionalmente se utiliza una sonda de amplificación diferente a la usada previamente,
iv)
localizar cualquiera de las sondas localizadoras adicionales unidas o el molde de amplificación del paso o pasos de amplificación; y
v)
correlacionar los resultados de detección de la etapa (iv) con la presencia de dicha molécula diana.
La hibridación de secuencias de ácido nucleico de los moldes de amplificación del cuarto y quinto modos de realización puede ser modificada de tal forma que no puedan ser extendidos en una dirección 3' por el agente polimerizador.
La eliminación de dicho molde de amplificación primaria puede ser conseguida mediante la utilización de una exonucleasa 5' de doble cadena específica.
Con los procedimientos del cuarto y quinto modos de realización, la eliminación de dicho molde de amplificación primario puede ser conseguida mediante la utilización de temperatura elevada. En tal caso, dicha sonda localizadora puede enlazarse de forma covalente a dicha molécula diana antes de la eliminación de dicho molde de amplificación primaria. En particular, el enlace covalente puede ser conseguido antes de la hibridación de los moldes de amplificación.
Antes del paso de detección del primer, segundo y tercer modos de realización, un procedimiento de la etapa (i) a la (iii) del cuarto o quinto modos de realización de la invención puede ser realizado (por lo menos tanto como una estructura de amplificación es generada), y viceversa con las etapas (i) y (ii) del primer, segundo y tercer modo de realización. Cuando la porción de amplificación en una etapa final de amplificación una secuencia de ácido nucleico, puede ser omitida la etapa (i) del subsiguiente procedimiento.
Por ello, en dicho procedimiento para la detección de una molécula diana según con cualquiera del primer, segundo o tercer modos de realización, y donde dicha porción de amplificación de dicho molde de amplificación de dicha etapa final de amplificación comprende una secuencia de ácido nucleico, la etapa (ii) de un procedimiento según cualquiera del cuarto o quinto modos de realización que pueden ser realizados adicionalmente.
Similarmente, en un procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera del cuarto o quinto modos de realización, antes de dicha etapa de detección puede adicionalmente comprender la etapa (ii) de un procedimiento según cualquiera del primer, segundo o tercer modos de realización.
Con el primer, segundo y tercer modos de realización (y los procedimientos cuya etapa final de amplificación o repetición conlleva dichos modos de realización), la etapa de detección de cualquier molde de amplificación unido debe comprender los pasos de:
i)
tratar dicha muestra, sonda localizadora y molde de amplificación o moldes de amplificación con una sonda de detección la cual se une específicamente a dicha porción de amplificación de dichos moldes de amplificación; y
ii)
detectar cualquier sonda de detección unida.
Con el cuarto y quinto modos de realización (y procedimientos cuya etapa final de amplificación o repetición comprende dichos modos de realización), la etapa de detección de cualquier sonda localizadora adicional puede comprender las etapas siguientes:
i)
tratar dicha muestra, sonda localizadora y molde de amplificación con una sonda de detección la cual que se une específicamente a dicha porción de amplificación de dichos moldes de amplificación; y
ii)
detectar cualquier sonda de detección.
La sonda de detección puede tener una marca que es detectada por cualquiera del grupo de luminometría, fluorometría, espectrofotometría, y radiometría. Por ejemplo, la sonda de detección puede marcarse con cualquiera del grupo de FAM (carboxifluoresceína), HEX (hexaclorofluoresceína), TET (tetraclorofluoresceína), ROX (carboxi-X-rodamina), TAMRA (carboxitetrametilrodamina), JOE (carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), o con biotina.
Alternativa o adicionalmente, la etapa de detección puede detectar cualquier porción opcional de señal utilizada en el procedimiento. Como se ha visto anteriormente, tales motivos pueden comprender combinaciones de fluoróforo/extintor (las cuales cuando son detectadas comprenderán solamente la porción fluorófora) o pueden por ejemplo comprender moléculas de biotina. La presencia de porciones de señal hace considerar la detección a tiempo real de la amplificación como son realizados los procedimientos de la presente invención, particularmente cuando las porciones de señal comprenden fluoróforos.
En los diversos modos de realización de la presente invención, la etapa de amplificación puede realizarse dos o más veces, realizándose cada etapa de amplificación utilizando un molde de amplificación con una secuencia de extensión diferente de ácido nucleico, secuencia de hibridación de ácido nucleico y porción de amplificación del molde de amplificación usado en la etapa previa de amplificación.
En los diversos modos de realización de la presente invención, la molécula diana a detectar puede ser una secuencia de ácido nucleico, la porción de unión de dicha sonda localizadora que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de la molécula diana.
Los varios modos de realización de la presente invención pueden ser llevados a cabo usando más de una sonda localizadora, presentando cada sonda localizadora la misma secuencia de amplificación de ácido nucleico.
Los diversos modos de realización de la presente invención pueden comprender por ejemplo dos repeticiones.
Los reactivos que no han reaccionado utilizados en los procedimientos de la presente invención pueden ser eliminados al final de la etapa (i), cada repetición, o etapa de detección, mediante lavado. Los reactivos que no han reaccionado se seleccionan de entre un grupo de sonda localizadora, molde de amplificación, molde de amplificación primaria, molde de amplificación secundaria y sonda de detección.
La detección de las estructuras primaria y secundaria generadas aplicando los modos de realización de uno a cinco de la invención pueden ser llevadas a cabo por varios procedimientos diferentes.
Por ejemplo, las sondas de detección marcadas apropiadamente pueden hibridar con las porciones de amplificación de los moldes de amplificación utilizados en la etapa final del primer, segundo y tercer modos de realización. En el cuarto y quinto modos de realización las sondas de detección pueden hibridar secuencias de amplificación de ácido nucleico de sondas localizadoras. Esto requiere el uso de un agente de separación para eliminar los restos de las regiones de hibridación del molde de amplificación, y para una sonda de detección para luego ser utilizada para la unión de la porción de amplificación extendida de la sonda localizadora utilizada en la repetición previa. Cuando se consigue la separación por desnaturalización luego esto requiere adicionalmente la utilización de una reticulación covalente como se ha mencionado anteriormente arriba (utilizando por ejemplo un agente de reticulación como el DZQ (diaziniridilbenzoquinona)).
Alternativa o adicionalmente, los moldes de amplificación pueden presentar una marca localizada terminalmente en el interior 3' (es decir, una porción de señal) adherida que llega a ser incorporada a las estructuras según son generadas.
Como se ha mencionado anteriormente, los moldes de amplificación pueden también estar diseñados de tal manera que una marca de fluoróforo en la secuencia de región de hibridación, es separada por una marca de extintor en la región de extensión durante la formación de la estructura primaria/secundaria. De esta manera, es posible generar la señal en tiempo real.
La invención se hará más evidente a partir de la siguiente descripción, haciendo referencia a las figuras de los dibujos adjuntos, los cuales muestran, únicamente a modo de ejemplo modos de detección de las moléculas diana y amplificación de señal.
En las Figuras:
la Figura 1 muestra formas de las sondas de localización hibridadas a las secuencias de ácido nucleico diana;
la Figura 2 muestra un molde de amplificación empleado en el primer modo de realización de la presente invención;
la Figura 3 muestra un procedimiento de detección de molécula diana de acuerdo con el primer modo de realización de la presente invención;
la Figura 4 muestra la incorrecta unión del molde de amplificación;
la Figura 5 muestra los moldes de amplificación utilizados en el segundo modo de realización de la presente invención;
la Figura 6 muestra un procedimiento de detección de molécula diana de acuerdo con el tercer modo de realización de la presente invención;
la Figura 7 muestra un molde de amplificación utilizado en el tercer modo de realización de la presente invención;
la Figura 8 muestra el procedimiento del tercer modo de realización de la presente invención;
la Figura 9 muestra el procedimiento del cuarto modo de realización de la presente invención;
Figura 10 muestra los resultados del Ejemplo 6. El eje Y muestra la pendiente (A490/minutos) desde 0 (abajo) a 0.140 (arriba). El eje X muestra (de izquierda a derecha) Positivo 1, Positivo 2, Negativo Klenow y Negativo T7; y
Figura 11 muestra la extensión de cadena por SAEX1 y SAEX22. El eje Y muestra la pendiente (A490/minuto) desde 0 (abajo) hasta 0.200 (arriba). El eje X muestra (fondo-derecha) el control sin enzima y (todas las otras columnas) los positivos.
Definiciones
El término "anticuerpo" en sus varias formas gramaticales se usa aquí para hacer referencia a las moléculas de inmunoglobulina y a las porciones activas inmunológicamente de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de combinación a anticuerpo o paratopo. Tales moléculas son también denominadas "fragmentos de unión a antígenos" de las moléculas de inmunoglobulina.
Moléculas ilustrativas de anticuerpo son las moléculas de inmunoglobulina intacta, sustancialmente las moléculas de inmunoglobulina intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen el paratopo, que incluyen las porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v).
Los anticuerpos y su utilización son muy bien conocidos en la técnica, por ejemplo como muestra Harlow, E. y Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998.
La expresión "ácido nucleico" aquí utilizada incluye ácido nucleico de proteína (PNA) (es decir, ácidos nucleicos cuyas bases están unidas por una cadena polipéptida) así como los ácidos nucleicos que se presentan naturalmente (por ejemplo, ADN y ARN), o análogos de los mismos, que presentan una cadena de azúcar fosfato.
Ejemplo 1
Como se puede ver en la Figura 1a, la sonda localizadora 10 comprende una porción de unión de ácido nucleico 11 unido por un enlace 5'-5' a la porción de amplificación 12. La porción 11 de unión de ácido nucleico hibrida la secuencia 21 diana de ácido nucleico de la molécula diana 20. La Figura 1b muestra la sonda localizadora 30 que comprende la porción de unión 31 que ofrece resistencia a la actividad de exonucleasa por el uso de los residuos de 2'-O-metil-ARN en su síntesis y es unida por un enlace 5'-3' a la porción 32 de amplificación. La porción de unión de ácido nucleico 31 hibrida la secuencia diana de ácido nucleico 21 de la molécula diana 20.
La Figura 2 muestra el molde 40 de amplificación primaria que comprende colocada en la dirección 5'-3' la región 41 de extensión, la región 42 de hibridación resistente a la exonucleasa y la porción 43 de amplificación.
En el procedimiento del primer modo de realización de la presente invención (Figura 3), la región de hibridación 42 del molde de amplificación 40 hibrida a la porción 32 de amplificación de la sonda localizadora 30 (Figura 3a). La actividad de la ADN polimerasa provoca entonces la extensión de la porción 32 de amplificación, usando la región de extensión 40 como un molde de cadena (Figura 3b). Una exonucleasa 5' de cadena doble específica (no mostrada) disuelve entonces el terminal 5' de la región 41 de extensión hibridada. La actividad de exonucleasa es detenida cuando la enzima se encuentra con la región 42 de hibridación resistente a la exonucleasa (Figura 3c). El molde 40 de amplificación adicional es capaz de hibridar a una secuencia 32 extendida de señal de ácido nucleico (Figura 3d) y el proceso de extensión y de descomposición de exonucleasa realizado nuevamente para dar la disposición de la Figura 3e.
Lavada la mezcla de la reacción para extraer el molde 40 de amplificación no hibridado, el proceso es repetido a continuación utilizando el molde de amplificación secundario 50 que comprende la región 51 de extensión, la región 52 de hibridación y la porción 53 de amplificación (Figura 3f). La región de hibridación 52 es complementaria a la porción 43 de amplificación. Las etapas de extensión de la porción 43 de amplificación, la descomposición de la región 51 de extensión y la hibridación de un molde 50 de amplificación adicional acontecen como anteriormente, para crear la Estructura Secundaria. Esto incorpora un gran número de porciones 53 de amplificación, las cuales están disponibles para hibridación (Figuras 3g-3j).
La sonda de detección 60 comprende una secuencia 61 de ácido nucleico de detección de señal complementaria de la porción de amplificación 53, unida a una molécula 62 marcada con biotina. Después de la hibridación de la sonda de Detección 60 y el lavado para eliminar cualquier sonda sin hibridar, las moléculas 62 marcadas con biotina son detectadas mediante técnicas estándares. El resultado de la etapa de detección es entonces correlacionado con la presencia de la secuencia 21 diana.
Como se puede ver en la Figura 4, existen ciertas interacciones indeseables posibles entre por ejemplo la porción de amplificación 32 de la Sonda Localizadora 30 y la región 41 de extensión del molde 40 de amplificación. La Figura 4a muestra la región 41 de extensión hibridando a la porción 32 de amplificación. Esto está a continuación sujeto a la actividad de la exonucleasa (Figura 4b) y, posteriormente, la región de hibridación 42 del molde de amplificación 40 es capaz de hibridar la porción 32 de amplificación. Sin embargo, como el molde 40 de amplificación no posee más que una región 41 de extensión, no es posible extender la secuencia 32 señal de ácido nucleico así como tampoco la formación de la Estructura Primaria.
Ejemplo 2
La Figura 5 muestra pares de moldes de amplificación utilizados en el procedimiento del segundo modo de realización de la presente invención. El molde 70 de amplificación primaria comprende, situados en la dirección 5' a 3', una región 71 de extensión, una región 72 de hibridación y una porción de amplificación 73. El segundo molde de amplificación primaria 80 comprende, situados en la dirección 5' a 3', una región de extensión 81 (la cual tiene la misma secuencia que la región 72 de hibridación) región de hibridación 82 (la cual tiene la misma secuencia que la región 71 de extensión) y una porción 73 de amplificación. La región 71 de extensión y la región 72 de hibridación presentan secuencias diferentes sustancialmente, de tal forma que no hibridarán la misma secuencia de ácido nucleico. El primer molde de amplificación secundaria 90 comprende, colocados en la dirección 5' a 3', la región 91 de extensión, la región 92 de hibridación (la cual es complementaria de la porción 73 de amplificación de la repetición previa) y la porción 93 de amplificación. El segundo molde de amplificación secundaria 100 comprende, situado en la dirección 5' a 3', la región 101 de extensión (la cual tiene la misma secuencia que la región 92 de hibridación), la región 102 de hibridación (la cual tiene la misma secuencia que la región 91 de extensión) y la porción 103 de amplificación. La región de extensión 91 y la región 92 de hibridación substancialmente tienen diferentes secuencias, de tal forma que no hibridarán la misma secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico 72, 82, 92 y 102 contienen secuencias de ácido nucleico sustituidas con 2'-O-metil-ARN, velando por su resistencia a la actividad 5' de la exonucleasa.
En la práctica (Figura 6), la secuencia 21 diana de ácido nucleico de la molécula 20 diana es hibridaza mediante la unión de la secuencia 111 de ácido nucleico de la Sonda Localizadora 110. La porción de unión 111 de ácido nucleico contiene ácidos nucleicos sustituidos que velan por su resistencia a la actividad 5' de la exonucleasa (Figura 6a). La región de hibridación 72 del primer molde de amplificación 70 hibrida a continuación la porción 112 de amplificación de la Sonda Localizadora 110 (Figura 6b). Como la región 71 de extensión es diferente a la región 72 de hibridación, es incapaz de hibridar a la porción 112 de amplificación.
La actividad de la polimerasa de ADN extiende a continuación un extremo libre 3'-OH de la porción 112 de amplificación utilizando la región 71 de extensión como un molde. La actividad 5' de exonucleasa disuelve entonces la región 71 de extensión (Figura 6c).
En este punto es posible para la región 71 de extensión del molde 70 de amplificación hibridar con la porción 112 de amplificación extendida (Figura 6d, arriba). Sin embargo, como la región 71 de extensión no está protegida de la actividad de la exonucleasa 5', es descompuesta dejando una porción 112 de amplificación extendida (Figura 6e.1). Los restos del molde de amplificación 70 parcialmente descompuestos (que comprenden la región 72 de hibridación y la porción 73 de amplificación) son incapaces de hibridar la porción 112 de amplificación extendida.
Alternativamente (Figura 6d, abajo) la región 82 de hibridación del molde 80 de amplificación es capaz de hibridar con la porción 112 de amplificación extendida. La porción 112 de amplificación es además extendida por la actividad de una polimerasa de ADN polimerasa utilizando la región 81 de extensión como un molde. La región 81 de extensión es descompuesta a continuación (Figura 6e.2) y el ensamblaje de la Estructura Primaria continúa, con la región 72 de hibridación del molde 70 de amplificación hibridando la porción 112 de amplificación extendida.
Después de lavar para eliminar los moldes 70 y 80 de amplificación que no han hibridado, el ensamblaje de la Estructura Secundaria es llevada a cabo mediante los moldes de 90 y 100 de amplificación. La Estructura Secundaria es detectada a continuación y los resultados de la detección correlacionados con la presencia de la molécula diana.
Ejemplo 3
La Figura 7 muestra un molde de amplificación empleado en el tercer modo de realización de la presente invención. EL molde 120 de amplificación comprende la región 121 de extensión, presentando la región 122 de hibridación substancialmente la misma secuencia de ácido nucleico como la región 121 de extensión (por lo menos hasta el punto en que ambos son capaces de hibridar la misma secuencia de ácido nucleico), y la porción 123 de amplificación. La región 121 de extensión y la región 122 de hibridación, presentando cada una en este ejemplo tiene dos sitios de restricción 130 siendo los sitios de restricción de la región 121 de extensión tales que cuando hibridan con una secuencia complementaria son capaces de ser partidos por la actividad de la endonucleasa de restricción. Sin embargo, los sitios de restricción de la región 122 de hibridación presentan nucleótidos 2'-O-metil-ARN modificados tales que no están sujetos a la actividad de la endonucleasa de restricción.
La amplificación de señal que utilizan el procedimiento del tercer modo de realización de la presente invención se consigue como se muestra en la Figura 8. La unión de la secuencia 141 de ácido nucleico a la Sonda Localizadora 140 hibrida a la secuencia diana 21 del ácido nucleico de la molécula 20 diana. La porción 142 de amplificación de la Sonda Localizadora es complementario de la región 122 de hibridación del molde 120 de amplificación pero tiene 2'-O-metil-ARN sustituciones de nucleótidos de tal forma que no es sujeto a la actividad de la endonucleasa de restricción. La región de hibridación 122 del molde 120 de amplificación hibrida a continuación a la porción 142 de amplificación (Figura 8a), la cual es a continuación extendida por la actividad de una polimerasa de ADN utilizando la región 121 de extensión como un molde (Figura 8b). Por lo menos uno de los dNTPs en fase de disolución utilizados por la polimerasa es modificado con sustituciones de 2'-O-metil-ARN, de tal forma que su incorporación deja a la cadena sintetizada nuevamente resistente a la actividad de endonucleasa de restricción.
La actividad de endonucleasa de restricción mella a continuación la región 121 de extensión. En un formato de ensayo isotérmico los fragmentos resultantes son diseñados para disociarse en la temperatura de operación utilizada. En un formato de termociclador la temperatura es elevada para permitir la disociación de los fragmentos sin la disociación concomitante de las secuencias sin mellar. El molde 120 de amplificación adicional es entonces capaz de hibridar con la porción 142 de amplificación extendida y la reacción de proceder a ensamblar la Estructura Primaria. La detección o ensamblaje de la Estructura secundaria es posteriormente llevada a cabo por la repetición de los mismos procesos básicos descritos anteriormente.
Ejemplo 4
En el cuarto modo de realización de la presente invención (Figura 9), la secuencia diana 21 de ácido nucleico de la molécula diana 20 es hibridada por la Porción de Unión 151 (la cual tiene modificaciones de nucleótidos para convertirla resistente a la actividad de exonucleasa 5' de doble cadena cuando sea necesario) de la Sonda Localizadora150 (Figura 9a). La porción 152 de amplificación está unido a la secuencia 151 unida de ácido nucleico por el bloqueador de extensión 153 (una adición de 3' propanol) tal que tiene un grupo 3'-OH expuesto. Cuando la porción de amplificación 152 está actuando como la cadena molde para la síntesis de una cadena complementaria, el bloqueador de extensión evita el progreso de cualquier polimerasa de ADN más allá del final de la porción de amplificación, evitando así el desplazamiento de la porción de unión 151 de la secuencia 21 diana de ácido nucleico. Una vez que se desliga, la Sonda Localizadora ha sido eliminada, la porción 151 de unión es opcionalmente reticulado a la secuencia diana 21 previa al ensamblaje de la Estructura Primaria.
La región 161 de hibridación del molde 160 de amplificación hibrida a la porción 152 de amplificación (Figura 9b). La región 161 de hibridación presenta un grupo 3'-OH expuesto, como la porción 152 de amplificación. La región de extensión 162 actúa a continuación como una cadena molde para la extensión de la porción 152 de amplificación, el cual actúa como una cadena molde para la extensión de la región 161 de hibridación hasta el bloqueador 153 de extensión. (Figura 9c). La actividad de la exonucleasa 5' de cadena doble puede luego disolver el molde 160 de amplificación extendido como se muestra en este ejemplo, dejando libre la porción 152 de amplificación extendida (Figura 9d). Alternativamente, los moldes de amplificación pueden ser completamente eliminados mediante el uso de temperatura elevada. Adicionalmente los moldes de amplificación pueden ser diseñados para que contengan sitios de restricción modificados y sin modificar que permitan la partición de la partición de la endonucleasa con el fin de eliminar la región de extensión solo del molde de amplificación.
El molde 160 de amplificación adicional es capaz a continuación de hibridarse con la porción 152 de amplificación extendida (Figura 9e) y la región de extensión 162 otra vez capaz de actuar como cadena de molde para la síntesis de una cadena complementaria, extendiendo además la porción 152 de amplificación. De forma similar, la porción 152 de amplificación es capaz de actuar como cadena de molde para la extensión de la región 161 de hibridación (Figura 9f). La eliminación de parte o todos los moldes 160 de amplificación extendida es llevada a cabo a continuación mediante la actividad 5' de la exonucleasa (como en este ejemplo), o por temperatura elevada, o mediante la endonucleasa de restricción (Figura 9g, 9h).
Una vez que la porción 152 de amplificación ha sido suficientemente extendida, puede ser detectada por la hibridación de Sondas de Detección complementarias de las repeticiones en la cadena extendida. Alternativamente, los moldes de amplificación secundaria, colocados en la dirección 5'-3' de la región 161 de hibridación, el bloqueador 153 de extensión, y la porción de amplificación 173, están hibridados con la porción 152 de amplificación extendido (Figuras 9i, 9j). La región de hibridación puede, si es necesario, incorporar nucleótidos modificados (como en este ejemplo) para crear su resistencia a la actividad de la exonucleasa 5' de doble cadena.
La porción 173 de amplificación es utilizada entonces como la diana para una vuelta adicional de la señal de amplificación realizada como antes utilizando el molde 180 de amplificación comprendido en la dirección 5'-3' de la región 181 de hibridación y la región 182 de extensión (Figuras 9j-9p). Una etapa final de detección de señal es realizada a continuación (Figura 9q), la cual detecta la región de extensión 181 del molde 180 de amplificación.
Ejemplo 5
Los diversos modos de realización (arriba) de la invención son modificados en tanto las secuencias de extensión ácido nucleico 41, 52, 71, 81, 121, 162 y 182 son proporcionadas bajo forma de un motivo de bucle. Como resultado, los nucleótidos dentro de los motivos de bucles son incapaces de hibridar con los nucleótidos complementarios, por ejemplo en secuencias de amplificación de ácido nucleico.
De este modo, los motivos de bucle previenen la hibridación no deseada de las secuencias de ácido nucleico de extensión, estando únicamente las secuencias expuestas cuando el motivo de bucle está linealizado, es decir, por la acción de un agente polimerizador tal como la polimerasa de ADN, ya que sintetiza una cadena complementaria de la secuencia de ácido nucleico de extensión.
Ejemplo 6 Acción concertada de la exonucleasa T7 gen 6 y la polimerasa (exo-) Klenow
CMV-002 (SEC ID nº: 2), una secuencia específica 24-mer para una región conservada en el gen GlyB de CMV, fue enlazada de forma covalente a un soporte de fase sólida y usado como la diana para el Molde de Amplificación SA-EX1 (SEC ID nº: 3). Un Oligonucleótido de Detección SA-B1 (SEC ID nº: 4) fue diseñado para hibridar con el sitio generado por SA-EX1 en combinación con la acción concertada de la polimerasa (exo-) Klenow y la exonucleasa T7 gen 6.
Nucleótidos 1 y 2 de SEC ID nº: 3 contienen enlaces de fosforotioato. Los nucleótidos 20-26 de SEC ID nº: 3 son 2'-O-metil ARN. EL nucleótido de la SEC ID nº: 4 tiene un marcador de biotina agregado. Todos los oligos fueron suministrados por Oswel (Southampton, Reino Unido).
76 pmoles de SA-EX1 fueron añadidos a 2 mg de soporte de CMV-002 en cada uno de los cuatro tubos de eppendorf de 0,2 ml, en un volumen total de 40 ml de tampón 1 x Klenow (exo-). La hibridación procedió a temperatura ambiente durante 10 minutos con un mezclado suave por inversión en intervalos de 1 minuto.
A los tubos A y B, 10 ml del tampón 1 x Klenow que contienen 10 unidades de polimerasa (exo-) Klenow, 100 unidades de T7 exonucleasa gen 6, se les añadió 2 ml de una mezcla 20mM de dNTP. Al tubo C, 10 ml de la misma mezcla omitiendo la polimerasa fue añadida, y al tubo D se le añadieron 10 ml de la mezcla omitiendo la exonucleasa T7. Las muestras fueron mezcladas suavemente e incubadas a 37ºC durante 15 minutos.
Las muestras fueron transferidas a columnas DARAS (RTM) de fondo de cristal vitrificado (Tepnel Medical Limited, UK; www.tepnel.com). 100 ml del Tampón de Muestra 1 x (50mM citrato de sodio, 80mM cloruro sódico, 8 mM de cloruro de magnesio, 10mM Tris.HCl, pH 8.3) fueron preparados a través de cada columna por triplicado.
Se añadieron 50 ml de 1 x Tampón de Muestra que contienen 79 pmoles de SA-B1 a cada columna y los contenidos de las columnas fueron mezclados mediante inversión periódica durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las columnas mediante el paso de 100 ml del Tampón Sistema (10 mM Tris.HCl, pH 8.3) a través de cada una en triplicado.
La presencia de oligonucleótido SA-B1 hibridado se confirmó mediante el protocolo de detección de EDSA1 en el sistema de DARAS (RTM). Los resultados se presentan en la Figura 10 cuando la pendiente de la señal se detectó (cambio de absorbancia en 490 nm/minuto).
Ejemplo 7 Extensión de cadena mediante la hibridación secuencial
CMV-002 (SEC ID nº: 2) fue enlazada covalentemente al soporte de la fase sólida y usada como la diana para el oligonucleótido de Amplificación EDSA SA-EX1 (SEC ID nº: 3). Un segundo Oligonucleótido de Amplificación, SA-EX22 (SEC ID nº: 5), se diseñó para hibridarse con el al sitio generado por SA-EX1 a través de la acción concertada de la polimerasa (exo-) Klenow y la exonucleasa T7. Un oligonucleótido de Detección SA-B2 (SEC ID nº: 6) fue diseñado para hibridarse con el sitio generado por SA-EX22 a través de la acción concertada de la polimerasa (exo-) Klenow y la exonucleasa T7.
Los nucleótidos 1 y 2 de SEC ID nº: 5 contienen enlaces fosforotioato. Los nucleótidos 22-27 de SEC ID nº: 5 son 2'-O-metil ARN. El nucleótido 1 de SEC ID nº: 6 tiene adherido un marcador de biotina. Todos los oligos fueron suministrados por Oswel (Southampton, Reino Unido). Todas las enzimas y tampones fueron suministrados por Amersham Life Sciences Inc.(UK).
Se añadieron 10 pmoles de SA-EX1 a 2 mg del soporte CMV-002 en cada uno de los seis tubos eppendorf de 0,2 ml en un volumen total de 30 ml del tampón 1 x Klenow (exo-) (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT 50 mg/ml BSA). Se permitió a la hibridación proceder a temperatura ambiente durante 10 minutos, con una mezcla suave por inversión en intervalos de un minuto. La fase de disolución se eliminó por aspiración, se añadieron 50 ml del tampón 1 x Klenow. Después del asentamiento de las burbujas, la fase superior se elimina por aspiración. Esto se repite dos veces más.
A los tubos A-E, 30 ml del tampón 1 x Klenow que contienen 15 unidades de la polimerasa (exo-) Klenow, se les añadieron 100 unidades de la exonucleasa T7 gen 6, 2 ml de una mezcla 20 mM de dNTPs y 100 pmoles de SA-EX22. Al tubo F, le fueron añadidos 30 ml de la misma mezcla omitiendo tanto a la polimerasa como a la exonucleasa T7. Las muestras son mezcladas pausadamente e incubadas a 37ºC durante 30 minutos.
Las muestras se trasladaron a columnas Bottom Fritted DARAS (RTM). Se administraron 100 ml de 1 x Tampón Muestra (50mM citrato de sodio, 80 mM de cloruro sódico, 8 mM de cloruro de magnesio, 10mM de Tris.HCl pH 8.3) a través de cada columna por triplicado.
Se añadieron 50 ml del Tampón 1 x Muestra que contienen 1 pmoles de SA-B2 a cada columna y los contenidos de la columna se mezclaron periódicamente por inversión durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las columnas se lavaron pasando 100 ml del Buffer Sistema (10 mM Tris.HCl, pH 8.3) a través de cada una por triplicado.
La presencia del oligonucleótido marcado SA-B2 se confirmó mediante el protocolo de detección EDSA1 en el sistema DARAS (RTM). Los resultados se presentan en la Figura 11 como la pendiente de la señal detectada (cambio de absorbancia en 490 nm/minuto).
<110> TEPNEL MEDICAL LIMITED
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> AMPLIFICACIÓN DE SEÑAL CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> M98/0599/GB
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB9905580.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-03-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: N. BstNB1
\hskip1cm
secuencia de reconocimiento 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtcnnnnn 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citomegalovirus
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Molécula Combinada de ADN/ARN:
\hskip1cm
Secuencia protegida de Endonucleasa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgacggtgg agatacgct gagg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: molde de Amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> um
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
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<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_característica
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<222> (23)
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<223> 2'-O-metiladenosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_característica
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2'-O-metiladenosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctccttcc agttgctacc ucagcagtat ctccac 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Molécula Combinada de ADN/ARN:
\hskip1cm
secuencia protegida de Endonucleasa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótico de Detección
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttctccttcc agttgcta 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: molde de amplificación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (22)
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<223> cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (23)
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<223> um
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (24)
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<223> um
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<220>
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<221> base_modificada
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<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base_modificada
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<222> (26)
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<223> cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_característica
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<222> (27)
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<223> 2'-O-metiladenosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgaagatgt tgcatgttct ccuuccagtt gctacc 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido de detección
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgaagatgt tgcatgtt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (29)

1. Procedimiento para detectar una molécula diana (20), que comprende las etapas siguientes:
i)
poner en contacto una muestra con la sonda localizadora (10, 30) que comprende una porción de unión (11, 31) específica para dicha molécula diana (20) y una secuencia de ácido de amplificación nucleico (12, 32) para producir un complejo de molécula diana-sonda localizadora;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dichas muestras y sonda localizadora (10, 30) tratándolas con:
a)
un molde de amplificación de cadena simple (40.50) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51);
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (42) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 52) de la etapa previa de amplificación o, donde no existe etapa previa de amplificación, de la etapa anterior y presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (42, 51); y
c)
una porción de amplificación (43, 53), limitada en su totalidad excepto la repetición final a una secuencia de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico.
b)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 53) de la etapa previa de amplificación o, donde no existe etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50);
c)
un agente separador capaz de eliminar suficientemente dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50) cuando se hibrida a dicha cadena complementaria para permitir la subsiguiente hibridación de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (42, 52) de dicho molde de amplificación (40, 50) a dicha cadena complementaria; y
d)
los reactivos y condiciones necesarios para efectuar la acción de dicho agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (12, 32, 53) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa previa sintetizando una pluralidad de secuencias complementarias de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) de dicho molde de amplificación (40, 50);
iii)
detectar cualquier molde de amplificación unido (40, 50) de la(s) etapa(s) de amplificación; y
iv)
correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana (20).
2. Procedimiento para detectar la molécula diana según la reivindicación 1, siendo la eliminación de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (41, 51) llevada a cabo utilizando una exonucleasa 5' de cadena doble contra cuya actividad está protegida la secuencia de hibridación de ácido nucleico (42, 52).
3. Procedimiento para detectar una molécula diana (20) que comprende las etapas siguientes:
i)
poner en contacto una muestra con una sonda localizadora (110) que comprende una porción de unión (111) específica para dicha molécula diana (20) y una secuencia de amplificación de ácido nucleico (112) para producir un complejo molécula diana-sonda localizadora;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dichas muestra y sonda localizadora (110) con:
a)
un primer molde de amplificación de cadena sencilla (70, 90) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico (71, 91);
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (72, 92) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (93, 103, 112) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior presentando una secuencia substancialmente diferente a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (71, 91); y
c)
una porción de amplificación (73, 93), limitada en su totalidad excepto la repetición final a la secuencia de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico.
b)
un segundo molde de amplificación de cadena simple (80, 100) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3'
a)
una secuencia de ácido nucleico (81, 101) que comprende dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (72, 92) de dicho primer molde de amplificación (70, 90);
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (82, 102) que comprende la secuencia de ácido de extensión nucleico (71, 91) de dicho primer molde de amplificación (70, 90); y
c)
una porción de amplificación (83, 103), limitada en su totalidad excepto la etapa de amplificación final a la secuencia de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
c)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (93, 103, 112) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, del paso precedente sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (71, 81, 91, 101) de dichos primer y segundo moldes de amplificación(70, 80, 90, 100);
d)
un agente separador capaz de eliminar suficientemente dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (71, 81, 91, 101) de dichos primer y segundo moldes de amplificación (70, 80, 90, 100) cuando se hibridan a dicha cadena complementaria para permitir la hibridación subsiguiente de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (72, 82, 92, 102) de dichos primer y segundo moldes de amplificación (70, 80, 90, 100) a dicha cadena complementaria; y
e)
los reactivos y condiciones necesarios para realizar la acción de dichos agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (93, 103, 112) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior mediante la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias de dichas secuencias de extensión de ácido nucleico (71, 81, 91, 101) de dichos primer y segundo moldes de amplificación (70, 80, 90, 100);
iii)
detectar cualquier primer y/o segundo molde de amplificación ligado (70, 80, 90, 100) de la(s) etapa(s) de amplificación; y
iv)
correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana (20).
4. Procedimiento para detectar una molécula diana (20) según la reivindicación 3, produciéndose la eliminación de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (71, 81, 91, 101) de dichos primer y segundo moldes de amplificación (70, 80, 90, 100) mediante el uso de una exonucleasa 5' de cadena doble contra cuya actividad están protegidas dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (72, 92) de dicho primer molde de amplificación (70, 90) y dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (82, 102) de dicho segundo molde amplificación (80, 100).
5. Procedimiento para detectar una molécula diana (20) que comprende los pasos de:
i)
poner en contacto de la muestra con la sonda localizadora (140) que comprende una porción de unión (141) específica para dicha molécula diana (20) y una secuencia de amplificación de ácido nucleico (142) para producir un complejo de una molécula diana-sonda localizadora, presentando dicha secuencia de amplificación de ácido nucleico (142) uno o más sitios de restricción para una endonucleasa de restricción cuando se hibrida con una cadena complementaria;
ii)
la producción de una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior realizando una o más veces la etapa de amplificación de tratamiento de dichas muestra y sonda localizadora (140) con:
a)
un molde de amplificación de cadena simple (120) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico (121);
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (122) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (123, 142) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior y presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (121), y
c)
una porción de amplificación (123), estando limitada en su totalidad excepto desde la etapa final de amplificación a una secuencia de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
b)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (123, 142) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (121) de dicho molde de amplificación (120);
c)
dicha endonucleasa de restricción; y
d)
los reactivos y condiciones necesarios para:
i)
realizar la acción de dichos agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (123, 142) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior mediante la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (121) de dicho molde de amplificación (120); y
ii)
producir la disociación de fragmentos de cadenas de ácido nucleico las cuales han sido cortadas por dicha actividad de endonucleasa de restricción a partir de cadenas complementarias sin cortar mientras no se produce la disociación de cadenas de ácido nucleico sin cortar de cadenas complementarias sin cortar;
iii)
detectar cualquier molde de amplificación (120) de la(s) etapa(s) de amplificación; y
iv)
correlacionar los resultados de la etapa de detección (iii) con la presencia de dicha molécula diana (20).
6. Procedimiento según la reivindicación 5, presentando dicha secuencia de amplificación de ácido nucleico (123) y dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (122) teniendo modificaciones de nucleótidos que previenen la división por dicha endonucleasa de restricción, y dichos reactivos comprenden por lo menos un nucleótido modificado, el cual, cuando se incorpora a dicha cadena complementaria por dicho agente polimerizador, previene la división de dicha cadena complementaria por dicha endonucleasa de restricción.
7. Procedimiento según la reivindicación 5, presentando por lo menos dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico una modificación de nucleótido que previene la división por dicha endonucleasa de restricción, presentando dicha endonucleasa de restricción una actividad única de mellado en cadena sencilla.
8. Procedimiento según las reivindicaciones 5 a 7, realizado isotérmicamente.
9. Procedimiento según las reivindicaciones 5 a 7, realizado a diversas temperaturas.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, realizándose la etapa de amplificación de la etapa (ii) dos o más veces.
11. Procedimiento para detectar la molécula diana (20) que comprende:
i)
poner en contacto la muestra con una sonda localizadora (150) que comprende:
a)
una porción de unión (151) específica a dicha molécula diana (20);
b)
una secuencia de amplificación de ácido nucleico (152) para producir un complejo de una molécula diana-sonda localizadora, y
c)
opcionalmente que comprenda una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
ii)
la producción de una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior mediante la realización una o más veces de la etapa de amplificación de tratamiento de dicho complejo con:
a)
un molde de amplificación de cadena sencilla (160, 180) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3'':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182); y
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (161, 181) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (152, 173) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior y presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182), y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
b)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (152, 173) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior sintetizando una cadena complementaria de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182) de dicho molde de amplificación (160, 180);
c)
un agente separador capaz de eliminar suficientemente dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182) de dicho molde de amplificación (160, 180) cuando se hibrida con dicha cadena complementaria para permitir subsiguientemente la hibridación subsiguiente de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico (161, 181) de dicho molde de amplificación (160, 180) a dicha cadena complementaria;
d)
los reactivos y condiciones necesarios para producir la acción de dichos agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (152, 173) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior por la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182) de dicho molde de amplificación (160, 180); y
iii)
opcionalmente repitiendo de manera opcional una o más veces las etapas de tratamiento de los productos de la repetición previa o, donde no exista repetición previa, de los productos de la etapa (ii) con:
a)
un agente separador capaz de eliminar el resto de dicha secuencia de hibridación (161, 181) de dicho molde de amplificación de la etapa (160, 180) de la repetición previa o etapa (ii) cuando se hibrida con dicha cadena complementaria;
b)
una sonda localizadora adicional que comprende:
i)
una sonda de hibridación de ácido nucleico (162, 182) específica a dicha cadena complementaria de la etapa o repetición previa o etapa (ii);
ii)
una porción de amplificación (173), limitada en su totalidad excepto la repetición final a una secuencia de ácido nucleico; y
para producir un complejo; y
c)
realizar la etapa (ii) como se describe anteriormente, usando de manera opcional un molde de amplificación (160, 180) diferente al utilizado previamente;
iv)
detectar cualquiera de las sondas localizadoras adicionales o moldes de amplificación (160, 180) de la(s) etapa(s) de amplificación; y
v)
correlacionar los resultados de la etapa de detección (iv) con la presencia de dicha molécula diana (20).
12. Procedimiento para detectar una molécula diana (20) que comprende:
i)
poner en contacto una muestra con una sonda localizadora (150) que comprende un motivo de unión (151) específico para dicha molécula diana (20) y una secuencia de amplificación de ácido nucleico (152) para producir un complejo molécula diana-sonda localizadora;
ii)
producir una estructura de amplificación unida a cualquier complejo producido en la etapa anterior mediante la realización de la etapa de amplificación una o más veces, tratando dicho complejo con:
a)
un primer molde de amplificación de cadena simple (160, 180) que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' a 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico (162, 182);
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico (161, 181) complementaria de la secuencia de amplificación de ácido nucleico (152, 173) de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior, y presentando substancialmente la misma secuencia que dicha secuencia de extensión de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente comprende por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
b)
un segundo molde de amplificación de cadena sencilla que comprende:
i)
colocado en la dirección 5' 3':
a)
una secuencia de extensión de ácido nucleico que comprende dicho primer molde de amplificación de secuencia de hibridación de ácido nucleico; y
b)
una secuencia de hibridación de ácido nucleico que comprende dicho primer molde de amplificación de secuencia de extensión de ácido nucleico; y
ii)
opcionalmente por lo menos una porción de señal diferente a una secuencia de ácido nucleico;
c)
un agente polimerizador capaz de extender el terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior de sintetizando una cadena complementaria a dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
d)
un agente separador capaz de eliminar suficientemente dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dichos primer y segundo moldes de amplificación cuando se hibrida con dicha cadena complementaria para permitir la hibridación subsiguiente de dicha secuencia de hibridación de ácido nucleico de dichos primer y segundo molde de amplificación a dicha cadena complementaria;
e)
los reactivos y condiciones necesarios para producir la acción de dichos agentes polimerizador y separador para permitir la extensión del terminal 3' de la secuencia de amplificación de ácido nucleico de la etapa previa de amplificación o, donde no exista etapa previa de amplificación, de la etapa anterior por la síntesis de una pluralidad de secuencias complementarias de dicha secuencia de extensión de ácido nucleico de dicho molde de amplificación;
iii)
repitiendo de manera opcional una o más veces las etapas de tratamiento de los productos de la repetición previa o, donde no exista repetición previa, de los productos de la etapa (ii) con:
a)
un agente separador capaz de eliminar el resto de dichas secuencias de hibridación de ácido nucleico de dichos primero y segundo moldes de amplificación de la repetición previa o etapa (ii) cuando se hibrida con dicha cadena complementaria;
b)
una sonda localizadora adicional que comprende:
i)
una sonda de hibridación de ácido nucleico específica a dicha cadena complementaria de la repetición previa o etapa (ii);
ii)
una porción de amplificación, limitada en su totalidad excepto la repetición final, a una secuencia de ácido nucleico; y
para producir un complejo; y
c)
realizar la etapa (ii) como se describe anteriormente, utilizando de manera opcional un molde de amplificación diferente al que se utilizó previamente;
iv)
detectar cualquiera de las sondas localizadoras adicionales o moldes de amplificación de la(s) etapa(s) de amplificación; y
v)
correlacionar los resultados de la etapa de detección (iv) con la presencia de dicha molécula diana.
13. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, produciéndose la eliminación de dicho molde de amplificación por el uso de una exonucleasa específica 5' de cadena doble.
14. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, produciéndose la eliminación de dicho molde de amplificación a través de la utilización de temperatura elevada.
15. Procedimiento para detectar una molécula diana según la reivindicación 14, estando dicha sonda localizadora unida de forma covalente a dicha molécula diana antes de la eliminación de dicho molde de amplificación.
16. Procedimiento para detectar la molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además antes de dicha etapa de detección la realización de un procedimiento según las etapas (ii) y (iii) de cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12.
17. Procedimiento para detectar la molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicha porción de amplificación de dicho molde de amplificación de dicha etapa final de amplificación una secuencia de ácido nucleico, y además previamente a dicha etapa de detección las etapas (ii)-(iii) del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 121 ó 12.
18. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, antes de dicha etapa de detección que comprende adicionalmente una etapa de realización (ii) del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 5.
19. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, comprendiendo dicha porción de amplificación de dicha sonda adicional o sonda localizadora adicional de dicha etapa final de amplificación, una secuencia de un ácido nucleico, y que comprende de forma adicional previamente a dicha etapa de detección la etapa de realización (ii) de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 5.
20. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, 18 ó 19, comprendiendo la etapa de detección de cualquier molde de amplificación unido las etapas siguientes:
i)
tratar dicha muestra, sonda localizadora y molde de amplificación o moldes de amplificación con una sonda de detección la cual se une específicamente a dicha porción de amplificación del último de dichos moldes de amplificación; y
ii)
detectar cualquier sonda de detección unida.
21. Procedimiento para detectar una molécula diana según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, comprendiendo la etapa de detección de cualquier molde de amplificación unido las etapas siguientes:
i)
tratar dicha muestra, sonda localizadora y molde de amplificación con una sonda de detección, la cual se une específicamente a dicha porción de amplificación del último de dichos moldes de amplificación; y
ii)
detectar cualquier sonda de detección unida.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, presentando la sonda de detección un marcador, el cual es detectado por cualquiera del grupo de luminometría, fluorometría, espectrofotometría, y radiometría.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, estando la sonda de detección marcada con cualquiera del grupo de FAM (carboxilfluoresceína), HEX (hexaclorofluoresceína), TET (tetraclorofluoresceína), ROX (carboxi-X-rodamina), TAMRA (carboxitetrametilrodamina), JOE (carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-demetoxifluorosceína), o con biotina.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la etapa de amplificación realizada dos o más veces, realizándose cada etapa de amplificación utilizando un molde de amplificación que presenta unas diferentes secuencias de extensión ácido nucleico, secuencia de hibridación de ácido nucleico y una porción de amplificación a las del molde de amplificación utilizado en la etapa previa de amplificación.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo la molécula diana a detectar una secuencia de ácido nucleico y comprendiendo la porción de unión de dicha sonda detectora una secuencia de ácido nucleico complementaria a dicha secuencia diana de molécula de ácido nucleico.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, realizado usando más de una sonda localizadora que presenta la misma secuencia de amplificación de ácido nucleico.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende dos repeticiones.
28. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reclamaciones anteriores, siendo los reactivos que no han reaccionado eliminados mediante lavado al final del paso (i), cada repetición, o paso de detección.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, siendo los reactivos que no han reaccionado seleccionados de entre el grupo de sonda localizadora, molde de amplificación, y sonda de detección.
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