ES2299486T5 - Beta-glucanasas de Talaromyces emersonii - Google Patents

Description

β-glucanasas de Talaromyces emersonii

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con (β-)glucanasas novedosas (y también con celulasas) del hongo Talaromyces, en particular Talaromyces emersonii, y su uso para degradar glucano en celulosa.

Antecedentes de la invención

La composición de una pared celular vegetal es compleja y variable. Los polisacáridos se encuentran principalmente en la forma de cadenas largas de celulosa (el componente estructural principal de la pared celular vegetal), hemicelulosa (que comprende varias cadenas de β-xilano, tales como xiloglucanos) y pectina.

El beta-glucano (o, más propiamente, (1-3)(1-4)β-D-glucano), Peso molecular de 10 a 14 kDa, es un componente de hemicelulosa vegetal (Peso Molecular de aproximadamente 700 kDa) y consiste de una estructura de residuos de glucopiranosa β-1,4 y 1,3-enlazados. Otro componente es el xilano que consiste de residuos de xilosa β-1,4enlzados, opcionalmente sustituidos con cadenas laterales tales como arabinosa y/o residuos de ácido glucurónico.

Existen diferencias básicas entre monocotiledones (por ejemplo, cereales y pastos) y dicotiledones (por ejemplo, trébol, colza y frijol de soja) y entre la semilla y partes vegetativas de la planta. Los monocotiledones se caracterizan por la presencia de un complejo de arabinoxilano como la estructura hemicelulosa principal, y la estructura principal de hemicelulosa en dicotiledones es un complejo de xiloglucano. Se encuentra mayores concentraciones de pectina en los dicotiledones que en los monocotiledones. Las semillas son generalmente altas en sustancias pécticas pero relativamente bajas en material celulósico.

Las enzimas que degradan la celulosa se utilizan para el procesamiento del material vegetal en alimentos así como también aplicaciones de alimento o como aditivos de comida o de alimento debido a su capacidad de actuar sobre los sustituyentes principales de la pared celular de la planta.

La mayoría de las enzimas que degradan la celulosa disponibles para la industria parecen ser las glucanasas con un peso molecular relativamente bajo y una estabilidad moderada a temperaturas altas. MOLONEY A. P. et al. (BIOCHEMICAL JOURNAL, Vol. 225, No. 2. 1985, páginas 365-374) divulga cuatro endo-Glucanasas de T. emersonii que muestran una actividad óptima a un pH de 5,5 a 5,8 y a una temperatura de 75 ºC a 70 ºC. Sin embargo, para ciertas aplicaciones es deseable utilizar una glucanasa con una termoestabilidad relativamente alta. Si la glucanasa se va a utilizar como un aditivo de alimento animal se prefiere entonces la alta termoestabilidad debido a las condiciones de alta temperatura aplicadas durante la peletización del alimento animal.

Resumen de la invención

Se suministran ahora β-glucanasas novedosas (o celulasas) las cuales son capaces de escindir β-D-glucano (o celulosa) tal como está presente en el material vegetal.

Se provee un polipéptido aislado, el cual es una β-glucanasa obtenible de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa) que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.2; o

(ii)

una variante de (i) la cual es capaz de escindir el β-D-glucano que tiene una identidad de al menos 80% sobre la longitud completa de Seq ID No. 2

En su aspecto más amplio, la invención se relaciona con β-glucanasas (o celulasas) de Talaromyces, tales como Talaromyces emersonii (un hongo). Estas β-glucanasas pueden escindir el β-D-glucano o la celulosa, por ejemplo ellas son β-1,4-endoglucanasas, o tienen la actividad EC 3.2.1.4.

Las glucanasas pueden tener:

a.

un pH óptimo por debajo de 7.0 o 5.4, tal como 5.0, por ejemplo desde 4.4 hasta 5.2 o desde 3.0 a 6.0 o 7.0; o

b.

una temperatura óptima de al menos 72ºC, 75ºC o aún 81ºC, tal como desde 78ºC hasta 85ºC o desde 83ºC hasta 87ºC.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se provee un polinucleótido aislado el cual comprende:

(a)

la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID No. 1, o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

(b)

una secuencia la cual es complementaria a, o que se hibrida a bajo condiciones de alta rigurosidad, una secuencia como se define en (a) en toda la longitud;

(c)

un fragmento de cualquier secuencia en (a) o (b);

(d)

una secuencia que tiene al menos 75%, preferiblemente 80%, de identidad con cualquier secuencia como se define en (a), o

(e)

una secuencia que se degenera como resultado del código genético a cualquiera de las secuencias como se define en (a).

La invención también provee:

-

un vector (por ejemplo, expresión) que comprende un polinucleótido de la invención y el cual puede ser capaz de expresar un polipéptido de la invención;

-

una línea celular o cepa que comprende un vector de la invención;

-

un método para producir un polipéptido de la invención cuyo método comprende mantener una línea celular o cepa de la invención bajo condiciones adecuadas para obtener la expresión del polipéptido y, si es necesario, aislar el polipéptido;

-

un método para degradar β-D-glucano, el método comprende poner en contacto un material que comprende β-Dglucano con un polipéptido de la invención;

-

un método para la identificación de un compuesto que modula la actividad de β-glucanasa, cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba en la presencia de β-Dglucano y monitorear o detectar cualquier modulación de la actividad;

-

un método para tratar un sujeto que tiene hiperlipidemia cuyo método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido de la invención; y

-

el uso de un polipéptido en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de hiperlipidemia. Breve descripción de las secuencias SEQ ID No. 1 es una secuencia de ADN de una primera β-glucanasa (CEA) de la invención de Talaromyces

emersonii, SEQ ID No. 2 es la secuencia de aminoácido de la primera β-glucanasa, CEA; SEQ ID Nos. 7 y 8 son cebadores de PCR que hibridizan con SEQ ID No. 1 (y se utilizaron para reclonar insertos de

cADN durante el análisis genético de transformantes positivos). Descripción Detallada de la Invención

A. Polinucleótidos.

La presente invención provee un polinucleótido aislado (por ejemplo, aislado y purificado) que codifica polipéptidos de la invención. La presente invención provee así un polinucleótido que codifica una β-glucanasa cuya secuencia de aminoácido se establece en la SEQ ID No. 2. La presente invención provee además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una homología de secuencia de aminoácido sustancial con la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 2. También se incluye un polinucleótido seleccionado de:

(a)

un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótido como se define en la SEQ ID No. 1, o el complemento de la misma;

(b)

un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido capaz de hibridar (por ejemplo, selectivamente) a una secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 1 o un fragmento de la misma:

(c)

un polinucleótido que comprende una secuencia capaz de hibridar (por ejemplo, selectivamente) al complemente de la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 1, o un fragmento de la misma; y/o

(d)

un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que se degenera como resultado del código genético a un polinucleótido definido en (a), (b) o (c).

Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que:

(a)

codifica un polipéptido que tiene actividad de β-glucanasa, cuyo polinucleótido es:

(1)

la secuencia de codificación de SEQ ID No. 1;

(2)

una secuencia que hibrida selectivamente al complemento de la secuencia definida en (1), o

(3)

una secuencia que se degenera como un resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en

(1)

o (2); o

(b)

es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a).

Secuencias hibridizables

El término "capaz de hibridar" significa que el polinucleótido objetivo de la invención puede hibridar al ácido nucleico utilizado como una sonda (por ejemplo la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 1, o un fragmento de la misma o el complemento de la misma) a un nivel significativamente por encima del fondo. La invención también incluye secuencias de nucleótido que codifican para β-glucanasa o variantes de las mismas así como también las secuencias de nucleótido que son complementarias de las mismas. La secuencia de nucleótido puede ser ARN o ADN y así incluye ADN genómico, ADN sintético o cADN. Preferiblemente la secuencia de nucleótido es una secuencia de ADN y más preferiblemente, una secuencia de cADN. Típicamente un polinucleótido de la invención comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es capaz de hibridar bajo condiciones selectivas a la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de la SEQ ID No. 1, según sea apropiado. Tales nucleótidos se pueden sintetizar de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica1.

Un polinucleótido de la invención puede hibridar la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de la SEQ ID No. 1 (según sea apropiado) a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridación del fondo puede ocurrir, por ejemplo, debido a otros cADN presentes en una biblioteca de cADN. El nivel de señal (por ejemplo, generado por la interacción entre un polinucleótido de la invención y la secuencia codificante

o complemento de la secuencia codificante de la SEQ ID No. 1) es típicamente al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100 veces, tan intensa como las interacciones entre los otros polinucleótidos y la secuencia codificante de la SEQ ID No. 1. La intensidad de interacción se puede medir, por ejemplo, mediante radio marcación de la sonda, por ejemplo, con 32P. La hibridación selectiva se puede lograr típicamente utilizando condiciones de exigencia bajas (cloruro de sodio 0.3M y citrato de sodio 0.3M a aproximadamente 40ºC), exigencia media (por ejemplo, cloruro de sodio 0.3M y citrato de sodio 0.03M a aproximadamente 50ºC) o exigencia alta (por ejemplo, cloruro de sodio 0.3M y citrato de sodio 0.03M a aproximadamente 60ºC). La hibridación se puede llevar a cabo bajo cualquier condición adecuada conocida en la técnica1 y, como una guía, la exigencia baja puede ser 2 x SSC a 55ºC, la exigencia media puede ser 0.5 a 1.0 x SSC a 60ºC y la exigencia alta puede ser 0.1 o 0.2 x SSC a 60ºC (por ejemplo, a 68ºC), todos a SDS al 0.5%.

Modificaciones

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Ellos pueden ser de cadena simple o doble. Ellos también pueden ser polinucleótidos que incluyen dentro de ellos uno o más nucleótidos sintéticos o modificados. Un número de diferentes tipos de modificaciones a los polinucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen estructuras de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, se debe entender que los polinucleótidos descritos aquí se pueden modificar mediante cualquier método disponible en la técnica.

Se debe entender que las personas expertas pueden, utilizando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótido que no afecten la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso del codón de cualquier organismo anfitrión particular, por ejemplo en la cual los polipéptidos de la invención son para ser expresados.

La secuencia de codificación de la SEQ ID No. 1 se puede modificar por sustituciones de nucleótido, por ejemplo, desde o hasta 1, 2 o 3 a 10, 25, 50 o 100 sustituciones. El polinucleótido puede ser alternativa o adicionalmente modificado por una o más inserciones y/o supresiones y/o por una extensión en uno o ambos extremos. El polinucleótido modificado generalmente codifica un polipéptido el cual tiene una actividad de β-glucanasa. Se pueden hacer sustituciones degeneradas y/o se pueden hacer sustituciones que darían como resultado una sustitución de aminoácido conservadora cuando se traduce la secuencia modificada, por ejemplo como se discute después con referencia a los polipéptidos.

Homólogos

Una secuencia de nucleótido que es capaz de hibridarse selectivamente a (por ejemplo, el complemento de) la secuencia de codificación de ADN de la SEQ ID No. 1 puede tener al menos 50% o 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de la identidad de secuencia (u homología) conla secuencia de codificación de la SEQ ID No. 1. Ésta puede estar sobre una región de al menos 20, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos contiguos u óptimamente sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 1. Para la SEQ ID No. 1, la identidad de secuencia es preferiblemente al menos 75% u 80%.

Cualquier combinación de los grados anteriormente mencionados de homología y el tamaño minimizado se pueden utilizar para definir los polinucleótidos de la invención, con las combinaciones más restrictivas (es decir, homología más alta sobre longitudes más largas) que son las preferidas. Así por ejemplo un polinucleótido que es al menos 80% o 90% homólogo sobre 25, preferiblemente sobre 30 nucleótidos forman un aspecto de la invención, como lo hace un polinucleótido que es al menos 90% homólogo sobre 40 nucleótidos.

Los homólogos de las secuencias de polinucleótido (o proteína) típicamente tienen al menos 70% de homología, preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, 97% o 99% de homología, por ejemplo sobre una región de al menos 15, 20, 30, 100 nucleótidos más contiguos (o aminoácidos). La homología se puede calcular sobre la base de la identidad del aminoácido (a veces denominado como "homología dura")

Por ejemplo el Paquete UWGCG provee el programa BESTFIT el cual se puede utilizar para calcular la homología (por ejemplo utilizada sobre sus configuraciones5 por defecto). Los algoritmos PILEUP y BLAST se pueden utilizar para calcular la homología o alinear secuencias (tales como identificar las secuencias equivalentes o correspondientes de identificación, por ejemplo sobre sus configuraciones6,7 por defecto).

El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra identificar primero un par de secuencias de alta calificación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coincide o satisface alguna puntuación de umbral T valorado positivamente cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina como el umbral6,7 de puntuación de la palabra vecina. Estos aciertos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar los HSP que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto que la calificación del alineamiento acumulado se puede incrementar. Las extensiones para los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación del alineamiento acumulado cae por la cantidad X, desde su máximo valor logrado; la puntuación acumulada va a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuo con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST utiliza por defecto la longitud de palabra (W) de 11, los alineamientos de la matriz8 de puntuación BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias9. Una medida de la similitud suministrada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual provee una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido ocurriría por casualidad. Por ejemplo, se considera que una secuencia es similar a otra secuencia si la probabilidad de la suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferiblemente menos de aproximadamente 0.1, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001.

Cebadores y sondas

Los polinucleótidos de la invención incluyen y se pueden utilizar como cebadores, por ejemplo, un cebador PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, o los polinucleótidos se pueden clonar en vectores. Tales cebadores, sondas y otros fragmentos serán al menos hasta de 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud. Ellos serán típicamente de hasta 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 o 300 nucleótidos de longitud, o aún hasta unos pocos nucleótidos (tal como 5 o 10 nucleótidos) cortos de la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 1.

En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, involucrando la manufactura paso a paso de la secuencia de ácido nucleico deseada un nucleótido a la vez. Las técnicas para lograr esto utilizando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica. Ejemplos de cebadores de la invención se establecen en la SEQ ID No. 7 y 8.

Los polinucleótidos más largos generalmente serán producidos utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando técnicas de clonación como técnicas de clonación PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto

involucrará elaborar un par de cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15-30 nucleótidos) a una región de la βglucanasa que se desea clonar, llevando los cebadores a contacto con el mARN o cADN obtenido de una célula objetivo (por ejemplo, de levadura, bacteriana, de planta, procariota o fúngica), preferiblemente de una cepa de Talaromyces, que lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa bajo condiciones que causan la amplificación de la región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, mediante la purificación de la mezcla de reacción sobre un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores se pueden diseñar para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuadas de tal forma que el ADN amplificado se puede clonar en un vector de clonación adecuado.

Tales técnicas se pueden utilizar para obtener todo o parte de la secuencia de β-glucanasa descrita aquí. Los clones genómicos que corresponden al cADN de la SEQ ID No. 1 o el gen de β-glucanasa que contiene, por ejemplo, los intrones y las regiones promotoras también se encuentran dentro de la invención y también se pueden obtener también de manera análoga (por ejemplo, medios recombinantes, PCR, técnicas de clonación), iniciando con el ADN genómico proveniente de un hongo, levadura, bacteriana, planta o célula procariota.

Los polinucleótidos o cebadores pueden llevar un marcador de revelado, por ejemplo, un marcador radioactivo o no radioactivo. Los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como 32P o 35S, marcadores de enzimas, u otros marcadores de proteína tales como la biotina. Tales marcadores se pueden agregar a polinucleótidos o cebadores de la invención y se pueden detectar utilizando técnicas conocida per se.

Los polinucleótidos, marcados y no marcados se pueden utilizar en pruebas basadas en ácido nucleico para detectar

o secuenciamiento de β-glucanasa o una variante de la misma en una muestra (por ejemplo, fúngica). Tal prueba para detectar comprende generalmente llevar una muestra (por ejemplo, fúngica) que (se sospecha) que contiene ADN en contacto con una sonda o cebador de la invención bajo condiciones de hibridación y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico en la muestra. Tal detección se puede lograr utilizando técnicas tales como PCR o al inmovilizar la sonda sobre un soporte sólido, remover el ácido nucleico en la muestra que no se hibrida a la sonda, y luego detectar el ácido nucleico que se hibridó en la sonda. Alternativamente, el ácido nucleico de muestra se puede inmovilizar sobre un soporte sólido, y la cantidad de sonda unida a un soporte tal se puede detectar.

Las sondas de la invención pueden ser convenientemente empacadas en la forma de un kit de prueba en un recipiente adecuado. En tales kits la sonda se puede enlazar a un soporte sólido donde el formato de ensayo para el cual se diseña el kit requiere tal enlace. El kit también puede contener reactivos adecuados para tratar la muestra a ser probada, hibridando la sonda al ácido nucleico en la muestra, los reactivos de control, instrucciones, y similares.

Preferiblemente, el polinucleótido de la invención es obtenible a partir del mismo organismo que el polipéptido, tal como un hongo, en particular un hongo del género Talaromyces.

Los polinucleótidos de la invención también incluyen variantes de la secuencia de la SEQ ID No. 1 que tiene actividad de β-glucanasa. Las variantes se pueden formar mediante adiciones, sustituciones y/o eliminaciones y pueden tener la capacidad de escindir un polímero de β-D-glucano.

Producción de polinucleótidos

Los polinucleótidos que no tienen 100% de identidad con la SEQ ID No. 1 pero que caen dentro del alcance de la invención se pueden obtener de numerosas maneras. Así las variantes de la secuencia de β-glucanasa descritas aquí se pueden obtener por ejemplo al sondear las bibliotecas de ADN genómico hechas de un rango de organismos, por ejemplo aquellos discutidos como fuentes de los polipéptidos de la invención. Además, se pueden obtener otros hongos, plantas u homólogos procariotas de la β-glucanasa y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar a la SEQ ID No. 1. Tales secuencias se pueden obtener al sondear bibliotecas de cADN o bibliotecas de ADN genómico de otras especies, y sondear tales bibliotecas con sondas que comprenden todo o parte de la SEQ ID No. 1 bajo condiciones de media a alta rigurosidad (como se describió anteriormente). Las sondas de ácido nucleico que comprenden todo o parte de la SEQ ID No. 1 se pueden utilizar para sondear bibliotecas de cADN provenientes de otras especies, tales como aquellas descritas como fuentes de los polipéptidos de la invención.

Los homólogos de las especies también se pueden obtener utilizando PCR degenerado el cual utilizará cebadores diseñados para apuntar a secuencias dentro de las variantes y los homólogos que codifican las secuencias de aminoácido conservadas. Los cebadores pueden contener una o más posiciones degeneradas y se utilizarán en condiciones de exigencia inferiores que aquellas utilizadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia única contra secuencias conocidas.

Alternativamente, tales polinucleótidos se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida al sitio de las secuencias de β-glucanasa o las variantes de la misma. Esto puede ser útil cuando por ejemplo se requieren cambios de codones silenciosos a las secuencias para optimizar las preferencias de codón para una célula anfitriona particular

en la que las secuencias de polinucleótidos están siendo expresadas. Otros cambios de secuencias se pueden desear con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzima de restricción, o alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

La invención incluye polinucleótidos de cadena doble que comprenden un polinucleótido de la invención y su complemento.

La presente invención también suministra polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención descritos adelante. En razón a que tales polinucleótidos serán útiles como secuencias para la producción recombinante de polipéptidos de la invención, no es necesario para ellos ser capaces de hibridar con la secuencia de la SEQ ID No. 1, aunque esto será generalmente deseable. De otra forma, tales polinucleótidos pueden ser marcados, utilizados, y si se desea hacer como se describió anteriormente.

B. Polipéptidos.

La presente invención se relaciona con unas β-glucanasas aisladas (por ejemplo (sustancialmente) purificadas y aisladas) (o celulasas) y variantes de las mismas. Los polipéptidos de la invención pueden consistir esencialmente de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2 o de una variante de esa secuencia. Los polipéptidos también se pueden codificar mediante un polinucleótido de la invención como se describió anteriormente.

Se entenderá que el polipéptido aislado de la invención se puede mezclar con portadores o diluyentes que no interferirán con el propósito pretendido y/o la función del polipéptido y aún se considerará como sustancialmenteaislado. Éste generalmente comprenderá el polipéptido en un preparación en la cual más del 20%, por ejemplo, más del 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95%, o 99%, en peso del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la invención. Los métodos de rutina se pueden emplear para purificar y/o sintetizar las proteínas de acuerdo con la invención1. Para algunas formulaciones (por ejemplo: para usos no farmacéuticos) la cantidad del polipéptido presente puede ser pequeña, por ejemplo, de 0.01 a 10%, tal como desde 0.1 hasta 5%, o 2% o aún desde 0.2 hasta 1%.

Preferiblemente, el polipéptido de la invención es obtenible a partir de un microorganismo que posee un gen que codifica una enzima con actividad de β-glucanasa (o celulosa). Más preferiblemente el microorganismo es fúngico, y óptimamente un hongo filamentoso. Los organismos preferidos son por lo tanto del género Talaromyces, tales como la especie Talaromyces emersonii.

Actividad

Un polipéptido de la invención puede tener una o más de las siguientes características, a saber:

(1)

posee actividad de β-glucanasa (o celulasa),

(2)

tiene un rango de pH óptimo desde 3 hasta 6.5 o 7.0, tal como desde 4 hasta 5.5 o 6.0, óptimamente desde 4.5 hasta 5.0;

(3)

tiene una actividad óptima a una temperatura desde 30ºC hasta 100ºC, tal como 60 hasta 95ºC, óptimamente desde 75ºC u 80ºC hasta 90ºC. Preferiblemente la temperatura óptima es de al menos 75ºC, tal como al menos 85ºC;

(4)

tiene un peso molecular (desglicolizado) desde 20 hasta 60 kDa, preferiblemente desde 20 hasta 25, 35 hasta 45

o 23 hasta 50 kDa, óptimamente desde 36 hasta 40 kDa o (glicosilado) o desde 40 hasta 45 kDA;

(5)

tiene un punto isoeléctrico desde 3.0 hasta 3.6 o 5.0, 3.8 hasta 4.5, 4.5 hasta 5.0 o desde 6.0 hasta 7.0; y/o

(6)

posee una actividad hidrolítica sobre el β-glucano de cereal o exhibe actividad hidrolítica por debajo de pH 7.

El polipéptido puede tener la actividad de EC.3.2.1.4 (o actividad de endoclucanasas). En general ésta puede ser endohidrólisis de enlaces de 1,4-β-D-glucosídico en Celulosa. "La actividad de β-glucanasa" es la capacidad de escindir la celulosa o un polímero de β-glucano (por ejemplo como se encuentra en las plantas, por ejemplo, avena o cebada). La actividad permite así la escisión entre unidades terminales y/o no terminal de glucopiranosa adyacentes. Preferiblemente, la escisión ocurre en un enlace [glucosa (1-4), (1-3) o (1-6) glucosa]. El polipéptido puede preferencialmente escindirse entre dos unidades adyacentes (por ejemplo, glucosa no sustituida). Éste puede tener así una actividad endo (es decir, ser una endogluconasa). El polímero del sustrato puede o puede no ser sustituido. Preferiblemente el polipéptido no tendrá actividad de xilanasa.

El polipéptido también puede tener la actividad de celulasa, es decir es activa sobre, o puede escindir, celulosa. Como el β-glucano es un componente de la celulosa, todas las glucanasas caen dentro del término más amplio de

las celulasas. Los polipéptidos de la presente invención son por lo tanto celulasas porque ellas pertenecen a las subclases de glucanasas. Otros tipos de clases de actividad dentro de las celulasas, aparte de la endoglucanasa (EC 3.2.1.4, como se mencionó anteriormente) son exo-glucanasa/celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91), β-glucosidasa (EC 3.2.1:21), endo-1,6-glucanasa (EC 3.2.1.75), exo-1,3-glucanasa (EC 3.2.1.58), mananasa (EC 3.2.1.78), y endoglicoceraniidasa (EC 3.2.1.123). Se cree que algunos de los polipéptidos tienen uno, dos o más de estas actividades adicionales con base en su estructura y secuencia, mediante la comparación con las enzimas conocidas y la familia de las hidrolasas en las cuales ellas caen. Así, en la especificación, donde el contexto es apropiado, la actividad glucanasa puede significar actividad celulasa. Una lista de actividades (celulasa) de los polipéptidos se provee posteriormente en el Ejemplo 11.

Preferiblemente el polipéptido cae en una de las familias 5, 7 o 45, de acuerdo con la clasificación del glicósido hidrolasa (CAZy). El polipéptido puede ser un donante de nucleófilo/protón glu/glu o asp/asp.

Variantes y Homólogos

Un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 2 o una secuencia sustancialmente homóloga, o un fragmento de cualquier secuencia y puede tener una actividad de βglucanasa. En general, se prefiere la secuencia de aminoácido de origen natural mostrada en la SEQ ID No. 2.

En particular, el polipéptido de la invención puede comprender:

a.

la secuencia de polipéptido de la SEQ ID No. 2;

b.

una variante de origen natural o especies homólogas de las mismas; o

c.

una proteína con al menos 80, al menos 90, al menos 95, al menos 98 o al menos 99% de identidad de secuencia con (a) o (b).

Una variante puede ser una que ocurre naturalmente, por ejemplo en células fúngicas, bacterianas, de levaduras o vegetales y que pueden funcionar de una manera sustancialmente similar a la proteína de la SEQ ID No. 2, por ejemplo ésta tiene una actividad de β-glucanasa. Similarmente una especie homóloga de la proteína será la proteína equivalente que ocurre naturalmente en otras especies y que pueden funcionar como un enzima de β-glucanasa. Las variantes incluyen variantes alélicas de la misma cepa que el polipéptido de la invención o de diferente cepa, pero del mismo género, o de la misma especie.

Las variantes y las especies homólogas se pueden obtener mediante los siguientes procedimientos descritos aquí para la producción del polipéptido de la SEQ ID No. 2 y llevando a cabo tales procedimientos sobre una fuente celular adecuada, por ejemplo una célula bacteriana, de levadura, fúngica o vegetal. También será posible utilizar una sonda como se definió anteriormente para sondear las bibliotecas hechas de células de levadura, bacterianas, fúngicas o vegetales con el fin de obtener clones que incluyen las variantes o la homología de especies. Los clones se pueden manipular mediante técnicas convencionales para generar un polipéptido de la invención que se puede entonces producir mediante técnicas recombinantes o sintéticas conocidas per se.

El polipéptido de la invención tiene preferiblemente al menos 80% de identidad de secuencia con la proteína de la SEQ ID No. 2, más preferiblemente al menos 90%, al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% de la identidad de secuencia a la misma sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 2. Para la SEQ ID No. 2, la identidad de secuencia es al menos del 80%.

La secuencia del polipéptido de la SEQ ID No. 2 y de las variantes y especies homólogas de este modo se puede modificar para proveer los polipéptidos de la invención. Las sustituciones de aminoácido se pueden hacer, por ejemplo desde o hasta 1, 2 o 3 a 10, 20, 30, 50 o 100 sustituciones. También se puede hacer el mismo número de eliminaciones e inserciones. Estos cambios se pueden hacer por fuera de regiones críticas a la función del polipéptido y aún así pueden resultar en una enzima activa. El polipéptido modificado generalmente retiene la actividad como una β-glucanasa.

Los polipéptidos de la invención pueden si es necesario ser producidos por medios sintéticos aunque usualmente serán hechos recombinantemente como se describe más adelante. Ellos se pueden modificar por ejemplo mediante la adición de residuos de histidina o una etiqueta T7 para ayudar a su identificación o purificación o mediante la adición de una secuencia de señal para promover su secreción de una célula.

El término "variantes" se refiere a los polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o la funcionalidad biológica básica como la β-glucanasa (o celulasa), e incluyen las variantes alélicas. El carácter esencial de la β-glucanasa es que ésta es una enzima que exhibe actividad EC 3.2.1.4 Preferiblemente un polipéptido variante tiene la misma actividad que la β-glucanasa. Un polipéptido que tiene el mismo carácter esencial que la β-glucanasa se puede

identificar mediante el uso de un ensayo de degradación de celulosa o β-glucano, por ejemplo como se describió posteriormente.

Las variantes de la SEQ ID No. 2 también incluye secuencias que varían de la SEQ ID No. 2 pero que no necesariamente se derivan de la proteína de β-glucanasa de origen natural. Estas variantes se pueden describir como que tienen un % de homología de la SEQ ID No. 2 que tiene un número de sustituciones dentro de esta secuencia. Alternativamente se puede codificar una variante mediante un polinucleótido que hibrida a la SEQ ID No.

1.

Las variantes se pueden definir de manera similar a las variantes de la SEQ ID No. 1. Así las variantes pueden comprender secuencias variantes derivadas de otras cepas de Talaromyces. Se pueden identificar otras variantes a partir de otras cepas de Talaromyces mediante la búsqueda de la actividad de β-D-glucanasa y la clonación y el secuenciamiento como antes. Las variantes pueden incluir la eliminación, modificación o adición de aminoácidos individuales o grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de proteína, ya que el péptido mantiene la funcionalidad biológica básica de la β-glucanasa.

Las sustituciones conservadoras se pueden hacer, por ejemplo de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden ser sustituidos entre sí. Preferiblemente las sustituciones no afectan el plegamiento o la actividad del polipéptido.

ALIFÁTICO

No polar G A P

I L V

Polar no cargado

C S T M

N Q

Polar cargado

D E

K R

AROMÁTICO

H F W Y

Las secuencias de polipéptido más cortas están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un péptido de al menos 50 aminoácidos o hasta de 60, 70, 80, 100, 150 o 200 aminoácidos de longitud se considera que cae dentro del alcance de la invención ya que demuestra la funcionalidad biológica básica de la β-glucanasa. En particular, pero no exclusivamente, este aspecto de la invención abarca la situación cuando la proteína es un fragmento de la secuencia de proteína completa y puede comprender o representa una región de enlace de β-D-glucano (o manosa)

o una región de escisión de β-D-glucano (o celulosa).

Modificaciones

Los polipéptidos de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, modificados posttraslacionalmente. Por ejemplo, pueden ser glicosilados (una o más veces, por el mismo o diferentes azúcares) o comprender residuos de aminoácido modificados. También se pueden modificar mediante la adición de residuos de histidina (para ayudar a su purificación) o mediante la adición de una secuencia de señal (para promover la inserción en la membrana celular). El polipéptido puede tener una o más extensiones (N) amino o (C) carboxil-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido enlazante de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una extensión (pequeña) que facilita la purificación, tal como una poli-histidina o etiqueta T7, un epítopo antigénico o un dominio14 de enlace (por ejemplo, maltosa) (por ejemplo en el terminal C). Estas extensiones pueden

o no agregarse a través de un enlazante.

Un polipéptido de la invención puede ser marcado con una etiqueta de revelado. La etiqueta de revelado puede ser cualquier etiqueta adecuada que le permita al polipéptido ser detectado. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos, por ejemplo, 125I, 35S, enzimas, anticuerpos, polinucleótidos y enlazantes tales como la biotina.

Los polipéptidos se pueden modificar para incluir los aminoácidos de origen ocurrencia no natural o para incrementar la estabilidad del polipéptido. Cuando las proteínas o los péptidos se producen por medios sintéticos, tales aminoácidos se pueden introducir durante la producción. Las proteínas o los péptidos también se pueden modificar siguiendo bien sea la producción sintética o la recombinante.

Los polipéptidos de la invención también se pueden producir utilizando, o comprenden, (un o más) D-aminoácidos

Un número de modificaciones de cadena lateral se conocen en la técnica y se pueden hacer a las cadenas laterales de las proteínas o péptidos de la presente invención. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones de aminoácidos por alquilación reductiva mediante la reacción con un aldehído seguido por la reducción con NaBH4, la amidinación con metilacetimidato o la acilación con anhídrido acético.

Las secuencias proporcionadas por la presente invención también se pueden utilizar como materiales de partida para la construcción de enzimas de "segunda generación". Las glucanasas de "segunda generación" son glucanasas, alteradas por técnicas de mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio), que tienen propiedades que difieren de aquellas de las glucanasas tipo silvestre o de las glucanasas recombinantes tales como aquellas producidas por la presente invención. Por ejemplo, la temperatura o el pH óptimo, la actividad específica, la afinidad de sustrato o la termoestabilidad se pueden alterar con el fin de ser más adecuadas para la aplicación en un proceso definido.

Los aminoácidos esenciales para la actividad de las glucanasas de la invención, y por lo tanto preferiblemente sujetas a la sustitución, se pueden identificar de acuerdo a los procedimientos conocidos en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida al sito o mutagénesis10 de barrido de alanina. En la última técnica se introducen mutaciones en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (por ejemplo, actividad de glucanasa) para identificar los residuos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción enzima-sustrato también se pueden determinar mediante análisis de la estructura de cristal como se determinó por tales técnicas como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía o marcación11,12,13 de foto-afinidad o modelado molecular

Se espera que el uso de levadura o células anfitrionas fúngicas suministre tales modificaciones post-traslacionales (por ejemplo, procesamiento proteolítico, miristilación, glicosilación, truncamiento, y fosforilación de tirosina, serina o treonina) como puede ser necesario para conferir la actividad biológica óptima sobre los productos de expresión recombinantes de la invención.

Los polipéptidos aislados de la invención se pueden proveer en una forma tal que están por fuera de su ambiente celular natural. Así, pueden estar en una célula que no son de origen natural, por ejemplo, una célula de otras especies fúngicas, animales, levadura o bacterias.

C. Aspectos Recombinantes.

La invención también provee vectores que comprenden un polinucleótido de la invención, que incluye vectores de clonación y de expresión, y métodos de crecimiento, transformación o transfectación de tales vectores en una célula anfitriona adecuada, por ejemplo, bajo condiciones en las cuales ocurre la expresión de un polipéptido de la invención. También se proveen células anfitrionas que comprenden un polinucleótido o vector de la invención en donde el polinucleótido es heterólogo al genoma de la célula anfitriona. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula anfitriona, significa que el polinucleótido no ocurre naturalmente en el genoma de la célula anfitriona o que el polipéptido no es producido naturalmente por esa célula. Preferiblemente, la célula anfitriona es una célula de levadura, por ejemplo una célula de levadura del género Kluyveromices o Saccharomices o una célula fúngica, por ejemplo del género Aspergillus.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser incorporados en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede ser utilizado para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. Así en una realización adicional, la invención provee un método de fabricación de polinucleótidos de la invención mediante la introducción de un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula anfitriona compatible, y haciendo crecer la célula anfitriona bajo condiciones que originan la replicación del vector. El vector puede ser recuperado de la célula anfitriona. Las células anfitrionas adecuadas se describen adelante en conexión con los vectores de expresión.

Vectores

El polinucleótido de la invención se puede insertar en un casete de expresión. El vector en el cual el casete de expresión o polinucleótido de la invención se inserta puede ser cualquier vector que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula anfitriona en la cual se va a introducir. Así, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, es decir, un vector que existe como una entidad extra-cromosómico, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula anfitriona, se integra en un genoma de célula anfitriona y se replica junto con los cromosomas en los cuales ha sido integrado.

Preferiblemente, un polinucleótido de la invención en un vector está enlazado operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de proveer la expresión de la secuencia codificante por la célula anfitriona, es decir, el vector es un vector de expresión. El término "enlazado operativamente" se refiere a la yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Una secuencia

reguladora tal como un promotor, potenciador u otra señal de regulación de la expresión "enlazado operativamente" a una secuencia de codificación se posiciona de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

El vector puede ser un plásmido, cósmido, virus o vector de fago, proporcionado usualmente con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un potenciador y/o un regulador del promotor. Una secuencia terminadora puede estar presente, como puede ser una secuencia de poliadenilación. El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina (en el caso de un plásmido bacteriano) o un gen de resistencia a la neomicina (para un vector de mamífero). Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo, para la producción del ARN o utilizado para transfectar o transformar una célula anfitriona. Ellos pueden comprender dos o más polinucleótidos de la invención, por ejemplo para sobreexpresión.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido se introduce preferiblemente en un anfitrión adecuado como parte de un casete de expresión (o construcción) en la cual la secuencia de ADN está enlazada operativamente con las señales de expresión que son capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ADN en las células anfitriona. Para la transformación del anfitrión adecuado con la construcción de expresión están disponibles los procedimientos de transformación que son bien conocidos por la persona experta3,4. El constructo de expresión puede ser utilizado para la transformación del anfitrión como parte de un vector que lleva un marcador seleccionable, o el constructo de expresión puede ser co-transformado como una molécula separada junto con el vector que lleva un marcador seleccionable. El vector puede comprender uno o más genes marcadores seleccionables.

Los marcadores15,16 seleccionables preferidos incluyen pero no se limitan a aquellos que complementan un defecto en la célula anfitriona o confieren resistencia a un fármaco. Ellos incluyen por ejemplo, genes marcadores versátiles que se pueden utilizar para la transformación de la mayoría de hongos filamentosos y levaduras tales como los genes de acetamidasa o los cADN (los genes amdS, niaD, facA o los cADN de A.nidulans, A. oryzae, o A.niger), o genes que proveen resistencia a antibióticos como resistencia al G418, higromicina, bleomicina, canamicina, fleomicina o benomilo (benA). Alternativamente, los marcadores de selección específicos se pueden utilizar tales como marcadores auxotrópicos que requieren las correspondientes cepas anfitrionas mutantes: por ejemplo, URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras), pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger), argB (de A. nidulans

o A. niger) o trpC. En una realización preferida el marcador de selección es eliminado de la célula anfitriona transformada después de la introducción del constructo de expresión con el fin de obtener células anfitrionas transformadas capaces de producir el polipéptido que es libre de genes21,22 marcadores de selección.

Otros marcadores incluyen la ATP sintetasa, subunidad 9 (oilC), orotidina-5’-fosfato-descarboxilasa (pvrA), el gen de resistencia al G418 bacteriano (esto también se puede utilizar en levaduras, pero no en hongos), el gen de resistencia a la ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen E. coli uidA, que codifica la β-glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizado para transfectar o transformar una célula anfitriona.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el vector o el constructo de expresión se integra preferiblemente en el genoma de la célula anfitriona con el fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también están disponibles vectores episomales adecuados en los cuales el constructo de expresión puede ser incorporado para la expresión estable y de alto nivel, ejemplos de éstos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2μ y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo, AMA1 de Aspergillus3,20). En el caso de que los constructos de expresión estén integrados en el genoma de las células anfitrionas, los constructos están integrados en locus aleatorios en el genoma, o en locus objetivo predeterminados que utilizan recombinación homóloga, en cuyo caso el locus objetivo comprende preferiblemente un gen altamente expresado. Un gen altamente expresado es un gen cuyo mARN puede constituir al menos 0.01% (p/p) del mARN celular total, por ejemplo, bajo condiciones inducidas,

o alternativamente, un gen cuyo producto de gen puede constituir al menos 0.2% (p/p) de la proteína celular total, o, en caso del producto de gen secretado, se puede secretar a un nivel de al menos 0.05 g/l. U número de ejemplos de genes altamente expresados adecuados se proveen más adelante.

Un vector o constructo de expresión para una célula anfitriona dada puede comprender los siguientes elementos enlazados operativamente uno al otro en un orden consecutivo desde el extremo 5’ al extremo 3’ relativo a la cadena de codificación de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención:

(1)

una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido en la célula anfitriona dada.

(2)

opcionalmente, una secuencia de señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido desde la célula anfitriona dada en un medio de cultivo;

(3)

una secuencia de ADN que codifica una forma madura y preferiblemente activa del polipéptido; y preferiblemente también

(4)

una región de terminación de transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido

Corriente abajo de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido puede haber una región no traducida 3’ que contiene uno o más sitios de terminación de transcripción (por ejemplo, un terminador). El origen del terminador es menos crítico. El terminador puede, por ejemplo, ser nativo a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Sin embargo, preferiblemente un terminador de levadura se utiliza en las células anfitrionas de levadura y un terminador fúngico filamentoso se utiliza en células anfitrionas fúngicas filamentosas. Más preferiblemente el terminador es endógeno a la célula anfitriona (en la cual la secuencia de ADN que codifica al polipéptido se va a expresar).

La expresión potenciada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención también se puede lograr por medio de la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, las regiones promotora, de secreción líder y/o terminadora, que pueden servir para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés desde el anfitrión de expresión y/o para proveer el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.

Aparte del promotor nativo al gen que codifica el polipéptido de la invención, otros promotores se pueden utilizar para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficiencia en dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el anfitrión de expresión deseado.

Los promotores/potenciadores y otras señales de regulación de expresión se pueden seleccionar para ser compatibles con la célula anfitriona para la cual se diseña el vector de expresión. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores procariotas, en particular aquellos adecuados para uso en cepas de E. coli. Cuando la expresión se lleva a cabo en células de mamífero, se pueden utilizar los promotores de mamífero. También se pueden utilizar los promotores específicos de tejido, por ejemplo los promotores específicos de célula de hepatocito. También se pueden utilizar los promotores virales, por ejemplo la repetición terminal larga del virus de leucemia de murino Moloney (MML LTR), el promotor del virus de sarcoma rous (RSV) promotor LTR, el promotor SV40 (por ejemplo, el antígeno T largo), el promotor IE citomegalovirus humano (CMV), los promotores del virus herpes simplex o los promotores de adenovirus, los promotores HSV tales como los promotores HSV IE), o los promotores HPV, particularmente la región regulatoria corriente arriba HPV (URR). Los promotores de levadura incluyen S. cerevisiae GAL4 y los promotores ADH, el promotor S. pombe nmt 1 y adh. Los promotores de mamíferos incluyen el promotor de metalotioneína que se puede inducir en respuesta a metales pesados tales como promotores de cadmio y βactina. Los promotores específicos de tejido, en particular los promotores específicos de célula endotelial o neuronal (por ejemplo son especialmente preferidos los promotores DDAHI y DDAHII),.

Se puede utilizar una variedad de promotores15,16 que sean capaces de dirigir la transcripción en las células anfitrionas es de la invención. Preferiblemente la secuencia promotora se deriva de un gen altamente expresado como se definió previamente. Ejemplos de genes altamente expresados preferidos de los cuales los promotores se derivan preferiblemente y/o que están comprendidos en locus objetivo predeterminados preferidos para la integración de constructos de expresión, incluyen pero no se limitan limitados a genes que codifican enzimas glicolíticas tales como isomerasas triosa-fosfato (TPI), gliceraldehído-fosfato deshidrogenasas (GAPDH), fosfoglicerato quinasas (PGK), piruvato quinasas (PYK), alcohol deshidrogenasas (ADH), así como también los genes que codifican amilasas, glucoamilasas, proteasas, xilanasas, celobiohidrolasas, β-galactosidasas, alcohol (metanol) oxidasas, factores de elongación y proteínas ribosomales. Ejemplos específicos de los genes altamente expresados adecuados incluyen por ejemplo, el gen LAC4 de Kluyveromices sp., los genes de metanol oxidasa (AOX y MOX) de Hansenula y Pichia, respectivamente, los genes de glucoamilasa (glaA) de A. niger y A. awamori, el gen de TAKAamilasa de A. oryzae, el gen de gpdA de A. nidulans y los genes de celubiohidrolasa de T. reesei.

Ejemplos de promotores fuertes constitutivos y/o inducibles que son preferidos para uso en anfitriones15,16 de expresión fúngica son aquellos que obtenibles de los genes fúngicos para xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, la subunidad 9 (oilC), la triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), α-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG proveniente del gen glaA), acetamidasa (amdS) y los promotores de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de promotores fuertes de levadura son aquellos obtenibles de los genes de alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato quinasa y triosefosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores fuertes bacterianos son la α-amilasa y los promotores SPo2 así como también los promotores de los genes de proteasa extracelular.

Los promotores adecuados para las células vegetales incluyen napalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs), manopina sintasa (mas), subunidad pequeña de ribulosa (rubisco ssu), histona, actina de arroz, faseolina, virus del

mosaico de la coliflor (CMV) 35S y 19S y los promotores circovirus. Todos estos promotores están disponibles en la técnica.

El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido dando origen a ARN que comprende secuencias homólogas con las secuencias genómicas eucarióticas, preferiblemente las secuencias genómicas de mamífero, o las secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de las células eucarióticas o los virus de recombinación homóloga. En particular, se puede utilizar un vector plásmido que comprende el casete de expresión flanqueado por secuencias virales para preparar un vector viral adecuado para suministrar los polinucleótidos de la invención a una célula de mamífero. Otros ejemplos de vectores virales adecuados incluyen los vectores18,19 virales de herpes simplex, y los retrovirus, incluyendo los lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus HPV (tales como HPV-16 o HPV-18). Las técnicas de transferencia de gen que utilizan estos virus se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo se pueden utilizar los vectores de retrovirus para integrar establemente el polinucleótido que da origen al ARN antisentido en el genoma anfitrión. Por contraste los vectores de adenovirus de replicación defectuosa permanecen episomales y por lo tanto permiten la expresión transiente.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proveer la producción de ARN antisentido. Esto puede ser usado para reducir, si se desea, los niveles de expresión del polipéptido.

Células Anfitrionas y Expresión

En un aspecto adicional la invención provee un proceso para preparar un polipéptido de acuerdo con la invención que comprende cultivar una célula anfitriona (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente) bajo condiciones para proveer la expresión (por el vector) de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperar el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, por ejemplo, un vector de expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. Así en una realización adicional, la invención provee un método para hacer un polinucleótido de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula anfitriona compatible, y haciendo crecer la célula anfitriona bajo condiciones que originan la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula anfitriona. Las células anfitrionas adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levadura, líneas celulares de mamífero y otras líneas celulares eucariotas, por ejemplo, células de insecto tales como células Sf9 y células fúngicas (por ejemplo, filamentosas)

Preferiblemente el polipéptido se produce como una proteína secretada en cuyo caso la secuencia de ADN que codifica una forma madura del polipéptido en el constructo de expresión está enlazado operativamente a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de señal. Preferiblemente la secuencia de señal es nativa (homóloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Alternativamente la secuencia de señal es extraña (heteróloga) a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia de señal es preferiblemente endógena a la célula anfitriona en la cual la secuencia de ADN se expresa. Ejemplos de secuencias de señal adecuadas para las células anfitrionas de levadura son las secuencias de señal derivadas de los genes del factor a de levadura. Similarmente, una secuencia de señal adecuada para las células anfitrionas fúngicas filamentosas es por ejemplo, una secuencia de señal derivada del gen de amiloglucosidasa fúngica filamentosa (AG), por ejemplo, el gen A. niger glaA. Esto puede ser utilizado en combinación con el propio promotor de amiloglucosidasa (también llamado (gluco)amilasa), así como también en combinación con otros promotores. Las secuencias de señal híbrida también se pueden utilizar en el contexto de la presente invención.

Secuencias líder de secreción heteróloga preferidas son aquellas que se originan del gen de amiglucosidasa fúngica (AG) (glaA – tanto versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo de Aspergillus), el gen del factor α (levaduras, por ejemplo, Saccharomices y Kluyveromices) o el gen de α-amilasa (Bacillus).

Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula anfitriona adecuada como se describió anteriormente para facilitar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula anfitriona transformada con un vector de expresión como se describió anteriormente bajo condiciones para facilitar la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido.

Un aspecto adicional de la invención suministra así células anfitrionas transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. Preferiblemente el polinucleótido se lleva en un vector para la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se escogerán para ser compatibles con dicho vector y pueden por ejemplo ser procariotas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levadura o células vegetales.

Un anfitrión heterólogo también se puede escoger en donde el polipéptido de la invención se produce en una forma que sea sustancialmente libre de otras enzimas degradantes de celulosa. Esto se puede lograr al escoger un anfitrión que normalmente no produzca enzimas tales como Kluyveromyces lactis.

La invención abarca procesos para la producción del polipéptido de la invención por medio de la expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Para este propósito la secuencia de ADN de la invención se puede utilizar para la amplificación del gen y/o el intercambio de señales de expresión, tales como promotores, secuencias de señal de secreción, con el fin de permitir la producción económica del polipéptido en una célula anfitriona homóloga o heteróloga adecuada. Una célula anfitriona homóloga se define aquí como una célula anfitriona que es de la misma especie o que es una variante dentro de las mismas especies como las especies de las cuales se deriva la secuencia de ADN.

Las células anfitrionas adecuadas son preferiblemente microorganismos procariotas tales como bacterias, o más preferiblemente organismos eucariotas, por ejemplo, hongos, tales como levaduras u hongos filamentosos, o células vegetales. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngicas porque ellas son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son bien sea pobremente secretadas a partir de levaduras, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levadura). En estos casos, se debe seleccionar un organismo anfitrión fúngico.

La célula anfitriona puede sobre-expresar el polipéptido, y las técnicas para trabajar por ingeniería sobre-expresión son bien conocidas3. El anfitrión puede tener así dos o más copias del polinucleótido de codificación (y en consecuencia el vector puede así tener dos o más copias).

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como anfitrionas heterólogos por su capacidad a secretar proteína en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como anfitrionas son las del género Streptomyces y Pseudomonas. Una célula anfitriona de levadura preferida para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido es de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, y Schizosaccharomyces. Más preferiblemente una célula anfitriona de levadura se selecciona del grupo que consiste de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocida como Kluyveromices marxianus var. Lactis), Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica,y Schizosaccharomyces pombe.

Más preferidas son, sin embargo, las células anfitrionas fúngicas (por ejemplo, filamentosas). Las células anfitrionas fúngicas filamentosas preferidas son seleccionadas del grupo que consiste del género Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, y Talaromyces. Más preferiblemente una célula anfitriona fúngica filamentosa es de las especies Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o una especie del Grupo Aspergillus niger (como se define por Raper y Fennell, The Genus Aspergillus, The Willams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965). Estos incluyen pero no se limitan a Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae and Aspergillus ficuum, y que consiste además de las especies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum y Thielavia terrestris.

Ejemplos de anfitriones de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención son hongos tales como las especies Aspergillus (descritas en la EP-A-184,438 y la EP-A-284,603) y las especies Trichoderma; bacterias tales como las especies Bacillus (descritas en la EP-A-134,048 y la EP-A-253,455), por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, las especies Pseudomonas; y levaduras tales como las especies Kluyveromices (descritas en la EP-A-096,430, por ejemplo, Kluyveromices lactis en la EP-A-301,670) y las especies Saccharomices, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.

Las células anfitrionas de acuerdo con la invención incluyen células vegetales, y por lo tanto la invención se extiende a organismos transgénicos, tales como plantas y partes de las mismas, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o modificada genéticamente) puede por lo tanto tener insertada (por ejemplo, establemente) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de las células vegetales se puede llevar a cabo utilizando técnicas conocidas, por ejemplo utilizando un plásmido Ti o Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) puede contener así secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plásmidos Ti y/o Ri.

Alternativamente se puede efectuar la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta técnica la planta a ser infectada puede ser herida, por ejemplo se corta la planta con una cuchilla o se punciona la planta con una aguja o se frota la planta con un abrasivo. La herida es inoculada entonces con el Agrobacterium. La planta o la parte de la planta puede entonces hacerse crecer en un medio de cultivo adecuado y se permite que se desarrolle en una planta adulta. La regeneración de las células transformadas en plantas modificadas genéticamente se puede lograr utilizando técnicas conocidas, por ejemplo seleccionando brotes transformados utilizando un antibiótico y por sub-cultivo de los brotes en un medio que contiene los nutrientes apropiados, las hormonas vegetales y similares17.

Cultivos de células anfitrionas y producción recombinante

La invención también incluye células que han sido modificadas para expresar la β-glucanasa o una variante de la mismas. Tales células incluyen líneas celulares eucariotas superiores, transientes, o preferiblemente estables, tales como células de mamífero o células de insecto, células eucariotas inferiores, tales como levadura y células fúngicas (por ejemplo, filamentosas) o células procariotas tales como células bacterianas.

También es posible para las proteínas de la invención ser expresadas transientemente en una línea celular o sobre una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas, que se adaptan para expresar las proteínas de acuerdo con la invención, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido de la invención se puede efectuar mediante el cultivo de anfitriones de expresión microbiano, que han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutriente convencional.

Las células anfitrionas recombinantes de acuerdo con la invención se pueden cultivar utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula anfitriona, condiciones de cultivo que son propicias están disponibles para la expresión de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad de la célula deseada o el título del polipéptido el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera utilizando procedimientos conocidos

El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, molasas, celulosa, β-glucano, etc.), una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, etc.); una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.) y fuentes de nutrientes inorgánicas (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, se puede incluir un inductor (por ejemplo, celulosa, β-glucano, maltosa o maltodextrina).

La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del anfitrión de expresión y/o basar en los requerimientos reglamentarios del constructo de expresión. Tales medios son conocidos por aquellos expertos en la técnica. El medio puede, si se desea, contener los componentes adicionales que favorecen los anfitriones de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

La fermentación se puede llevar a cabo durante un período de 0.5-30 días. Puede ser un proceso por lotes, continuo

o de alimentación por lotes, adecuadamente a una temperatura en el rango de entre 0 y 45ºC y, por ejemplo, a un pH entre 2 y 10. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el rango de entre 20 y 37ºC y/o un pH entre 3 y 9. Las condiciones apropiadas son usualmente seleccionadas con base en la elección del anfitrión de expresión y la proteína a ser expresada.

Después de la fermentación, si es necesario, las células se pueden remover del caldo de fermentación por medio de centrifugación o filtración. Después de que la fermentación se ha detenido o después de la remoción de las células, el polipéptido de la invención se puede entonces recuperar y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales.

D. Usos de los polipéptidos y métodos para procesar la planta o materiales que contienen celulosa

Los polipéptidos de la invención que poseen actividad de β-glucanasa (o celulasa) se pueden utilizar para tratar material fúngico o vegetal que incluye pulpa vegetal y extractos de planta. Por ejemplo, se pueden utilizar para tratar cereales, vegetales, frutas o extractos de los mismos. También se pueden utilizar en composiciones de lavado (líquido o sólido, por ejemplo, polvo) y/o en composiciones detergentes. Convenientemente el polipéptido de la invención se combina con portadores o diluyentes adecuados (sólidos o líquidos) que incluyen reguladores para producir una preparación de composición/enzima. El polipéptido se puede unir a o mezclar con un portador, por ejemplo, inmovilizado sobre un portador sólido. Así la presente invención provee en un aspecto adicional una composición que comprende un polipéptido de la invención. Esto puede estar en una forma adecuada para empaque, transporte y/o almacenamiento, preferiblemente donde se retiene la actividad de glucanasa. Las composiciones incluyen pasta, líquido, emulsión, polvo, hojuelas, gránulos, pellas u otras formas de extrudidos.

La composición puede comprender además ingredientes adicionales tales como una o más enzimas, por ejemplo, pectinasas, que incluyen una (por ejemplo, endo)-arabinasa y ramnogalacturonasa, otras celulasas, xilanasas, galactanasas, manasas y/o xiloglucanasas. El polipéptido es típicamente establemente formulado en forma líquida o seca. Típicamente, el producto se hace como una composición que opcionalmente incluirá, por ejemplo, un regulador y/o conservante estabilizante. Las composiciones también pueden incluir otras enzimas capaces de digerir material o celulosa vegetal, por ejemplo otras celulasas, por ejemplo, (β-D-)glucanasas. Para ciertas aplicaciones, se puede preferir la inmovilización de la enzima sobre una matriz sólida o la incorporación sobre o en partículas

portadoras sólidas. La composición también puede incluir una variedad de otras enzimas degradantes de material vegetal, por ejemplo, (otras) celulasas y otras pectinasas.

Los polipéptidos y composiciones de la invención se pueden utilizar por lo tanto en un método de procesamiento de material vegetal para degradar o modificar los constituyentes de celulosa (por ejemplo, β-D-glucano) de las paredes celulares de la planta o material fúngico. Así en un aspecto adicional, la presente invención provee un método para degradar o modificar una célula vegetal o celulosa cuyo método comprende poner en contacto la planta, la célula fúngica o la celulosa con un polipéptido o composición de la invención.

La invención suministra también un método de procesamiento de un material vegetal cuyo método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material vegetal. Preferiblemente el material vegetal es una pulpa de planta o un extracto de planta.

En particular, la degradación preferiblemente comprende escindir las subunidades de β-glucano de un componente de celulosa de la pared de la célula vegetal. El material vegetal es preferiblemente un cereal, vegetal, fruta o vegetal

o pulpa o extracto de fruta. La presente invención provee además un material vegetal procesado obtenible al poner en contacto un material vegetal con un polipéptido o composición de la invención.

La presente invención también suministra un método para reducir la viscosidad de un extracto de planta cuyo método comprende poner en contacto el extracto de planta con un polipéptido o composición de la invención en una cantidad efectiva para degradar la celulosa (o β-D-glucano) contenida en el extracto vegetal.

La planta y los materiales que contienen celulosa incluyen pulpa vegetal, partes de planta y extractos de plantas. En el contexto de esta invención un extracto de un material vegetal es cualquier sustancia que se pueda derivar del material vegetal mediante la extracción (mecánica y/o química), procesamiento o por otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base, o concentrados hechos de los mismos. El polipéptido se puede utilizar en licuefacción (por ejemplo, total) y/o maceración (avanzada), por ejemplo, para preparar zumos (de fruta). El material vegetal puede comprender o ser derivado de vegetales, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soja, fríjol de soja, guisantes) o frutas, por ejemplo, pomos o frutas de semilla (manzanas, peras, membrillo, etc.), uvas tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina), melones, ciruelas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas, frambuesas, fresas, arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por ejemplo, polen, provenientes de árboles de pino), o cereales (avena, cebada, trigo, maíz, arroz).

Los polipéptidos de la invención se pueden así utilizar para tratar material vegetal que incluye pulpa de plantas y extractos de plantas. Ellos también se pueden utilizar para tratar productos alimenticios líquidos y sólidos o ingredientes de productos alimenticios comestibles.

Típicamente, los polipéptidos de la invención se utilizan como una preparación de composición/enzima como se describió anteriormente. La composición generalmente se agregará a la pulpa de la planta obtenible mediante, por ejemplo procesamiento mecánico tal como macerar o moler material de planta. La incubación de la composición con la planta típicamente será llevada a cabo durante un tiempo desde 10 minutos hasta 5 horas, tal como 30 minutos hasta 2 horas, preferiblemente durante aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es preferiblemente 10-55ºC, por ejemplo, de 15 a 25ºC, óptimamente aproximadamente 20ºC y uno puede utilizar 10300 g, preferiblemente 30-70 g, óptimamente aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material a ser tratado. Todas las enzimas o sus composiciones utilizadas se pueden agregar secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa de la planta. Dependiendo de la composición de preparación de la enzima del material vegetal se puede primero macerar (por ejemplo, a un puré) o licuar. Se pueden mejorar utilizando los polipéptidos de los parámetros de procesamiento de la invención tal como el rendimiento de la extracción, viscosidad del extracto y/o la calidad del extracto.

Alternativamente, o además de lo anterior, el polipéptido de la invención se puede agregar a un jugo crudo obtenido de presionar o licuar la pulpa vegetal. El tratamiento del jugo crudo se llevará a cabo de una manera similar a la pulpa vegetal con respecto a la dosificación, temperatura y tiempo de retención. De nuevo, se pueden incluir otras enzimas tales como aquellas que se discutieron previamente. Las condiciones de incubación típicas son como se describe en el párrafo previo. Una vez que el jugo crudo se ha incubado con los polipéptidos de la invención, el jugo es luego centrifugado o (ultra) filtrado para producir el producto final.

Una composición que contiene un polipéptido de la invención también se puede utilizar durante la preparación de purés de fruta o vegetal.

El polipéptido de la invención también se puede utilizar en fabricación de cerveza, elaboración de vino, destilados u horneados. Se puede por lo tanto utilizar en la preparación de bebidas alcohólicas tales como vino y cerveza, por ejemplo para mejorar la filtrabilidad o claridad del vino. Al hornear el polipéptido se puede mejorar la estructura de la masa, modificar su pegajosidad o flexibilidad, mejorar el volumen de la hogaza y/o la estructura de la migaja.

El polipéptido de la invención se puede utilizar en fabricación de cerveza. En la fabricación de cerveza, pueden surgir problemas de filtración en mezcla de granos, que incluyen maltas sobre modificadas, debido a la presencia de β-glucanos liberados a altas temperaturas. La reducción en la velocidad de la filtración del mosto puede ser uno de los principales problemas encontrados. Los problemas adicionales son la estabilidad coloidal y la formación de turbiedades en la cerveza terminada. Éstos se pueden originar por los mismos complejos de carbohidrato, especialmente durante el madurado de alta gravedad. Los polipéptidos de la invención pueden ser capaces de mejorar la filtrabilidad del mosto, por ejemplo después de maceramiento. De esta manera, se puede retener menos licor de mosto en los granos gastados, y el rendimiento del extracto se puede mejorar. Una filtración más eficiente puede resultar en un incremento de la eficiencia del madurador. Así, en general, los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para mejorar la filtrabilidad o la rata de filtración de la cerveza (por ejemplo, terminada).

Los polipéptidos de la invención también pueden impedir o por lo menos mitigar la formación de turbiedad durante la manufactura de la cerveza. Los β-glucanos encontrados en las paredes del endosperma de los cereales se pueden llevar a la cerveza terminada. Esto puede originar turbiedad y pérdida de claridad, los polipéptidos de la invención pueden impedir o al menos mitigar la acumulación de partículas debido a la hidrólisis de β-glucano. Por lo tanto los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para incrementar la estabilidad coloidal de la cerveza (por ejemplo, terminada).

Los polipéptidos encuentran uso en un número de áreas industriales debido a su actividad glucanasa. Estos pueden incluir no solamente producción de alcohol, sino también biometanación, en la elaboración de pan y el horneado, en higiene dental (por ejemplo composiciones dentales u orales), en el tratamiento de telas, prendas o manufactura de cueros, en la manufactura de papel, en productos farmacéuticos, en té, en la preparación o el tratamiento de textiles, en las composiciones detergentes o de lavado, y en el tratamiento de desperdicios. Un aspecto de la invención es por lo tanto un alimento o sustancia alimenticia que comprende el polipéptido, tal como una bebida alcohólica, pan, masa o té. El polipéptido se puede formular en composiciones adecuadas para cualquiera de estos usos. El polipéptido puede estar presente en una composición acuosa (por ejemplo, agua caliente) preferiblemente con uno o más fungicidas, con el fin de tratar el material vegetal (por ejemplo, bulbos), especialmente para controlar insectos parásitos, ácaros y nemátodos.

Como los polipéptidos de la invención pueden degradar el glucano éste se puede agregar a alimentos o productos alimenticias (por ejemplo, por el consumo de humanos). Es conocido que el β-D-glucano soluble se asocia con la disminución del colesterol y triglicéridos séricos, y por lo tanto los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para bajar los niveles del colesterol y los triglicéridos en humanos o animales, por ejemplo individuos hiperlipémicos. La invención incluye por lo tanto composiciones farmacéuticas y veterinarias que comprenden el polipéptido de la invención y el portador farmacéutica o veterinariamente aceptable. Los polipéptidos se pueden así utilizar en la elaboración de un medicamento para evitar o tratar la hiperlipidemia, o niveles de colesterol y triglicéridos altos en el suero o los trastornos que resultan de éstos.

Los polipéptidos de la invención también pueden desplegar actividad anti-fúngica. Ellos pueden ser capaces de degradar las paredes celulares fúngicas, y así se pueden emplear para la lisis de pared celular fúngica, con el fin de abrir las células. Esto puede liberar las proteínas intracelulares. De esta manera los polipéptidos se pueden utilizar para preparar levaduras y/o extractos fúngicos.

E. Alimentos para animales

La invención adicionalmente se relaciona con productos alimenticios o composiciones de alimentos para animales que comprenden uno o más polipéptidos de la invención. El polipéptido puede estar presente en la alimentación a concentraciones diferentes de su concentración natural. Las cantidades preferidas son desde 0.1 a 100, tal como 0.5 a 50, preferiblemente 1 a 10, mg por kg de alimento.

La invención también se relaciona con un proceso para la preparación de una composición de alimento para animal, el proceso comprende agregar una o más sustancias de alimento comestibles o ingredientes a un polipéptido de la invención. Los polipéptidos se pueden agregar a la composición de alimento para animal separadamente de las sustancias o ingredientes de alimentación, individualmente o en combinación con otros aditivos de alimento. El polipéptido puede ser una parte integral de una de las sustancias o ingredientes alimenticios.

Los polipéptidos de la invención también se pueden agregar a los alimentos para animales ricos en celulosa para mejorar la descomposición de la pared de la célula vegetal que conduce a una utilización mejorada de los nutrientes vegetales por el animal. Los polipéptidos de la invención se pueden agregar al alimento o ensilaje si se prefieren dietas pre-remojadas o húmedas. Ventajosamente, los polipéptidos de la invención pueden continuar degradando la celulosa en el alimento in vivo. En particular polipéptidos fúngicos derivados de la invención generalmente tienen menor pH óptimo y son capaces de liberar importantes nutrientes en tales ambientes ácidos como el estómago de un animal. La invención también contempla así alimentos o materias alimenticias (por ejemplo, animales) que comprenden uno o más polipéptidos de la invención.

Los polipéptidos de la invención también se pueden utilizar durante la producción de sustitutos de leche (o reemplazos) de fríjol de soja. Estos sustitutos de leche se pueden consumir tanto por humanos como animales. Un problema típico durante la preparación de estos sustitutos de leche es la alta viscosidad de la suspensión de frijol de soja, que resulta en la necesidad de una dilución indeseada de la suspensión a una concentración de sólidos secos de 10 a 15%. Una preparación de enzima que contiene un polipéptido de la invención se puede agregar a, o durante el procesamiento de, la suspensión, posibilitando el procesamiento a una concentración más alta (típicamente 40 a 50%) de sólidos secos. La enzima también se puede utilizar en la preparación de productos sazonados, por ejemplo, de frijol de soja.

La composición puede comprender adicionalmente (particularmente cuando se formula para uso en alimento animal) uno o más ionóforos, agentes de oxidación, surfactantes, aminoácidos protegidos de rumen, enzimas mejoradoras o enzimas que se pueden producir naturalmente en el tracto gastrointestinal de los animales a ser alimentados.

Cuando se agregan a los alimentos (incluyendo el silaje) para los rumiantes o animales monogástricos (por ejemplo, aves de corral o cerdos) los alimentos pueden comprender cereales tales como cebada, trigo, maíz, centeno o avenas o sub-productos de cereales tales como salvado de trigo o salvado de maíz, u otros materiales vegetales tales como frijol de soja y otras leguminosas. Las enzimas pueden mejorar significativamente la descomposición de las paredes celulares vegetales que conducen a una mejor utilización de los nutrientes de la planta por los animales. Como consecuencia, se pueden mejorar la rata de crecimiento y/o la conversión de alimento. Los polipéptidos de la invención se pueden agregar al alimento (directamente o como un aditivo o ingrediente) o se puede agregar en su lugar celulosa tratada (por ejemplo, glucano).

Un método particularmente preferido para la adición (exógena) de la β-glucanasa es agregar al polipéptido de la invención como material vegetal transgénico y/o semilla (por ejemplo, transgénica). El polipéptido puede haber sido así sintetizado a través de una expresión de gen heteróloga, por ejemplo el gen que codifica la enzima deseada se puede clonar en un vector de expresión vegetal, bajo el control de las señales de expresión vegetal apropiadas, por ejemplo, un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de semilla. El vector de expresión que contiene el gen que codifica el polipéptido se puede transformar posteriormente en células vegetales, y se pueden seleccionar células transformadas para la regeneración en todas las plantas. Las plantas transgénicas así obtenidas se pueden hacer crecer y cosechar, y aquellas partes de las plantas que contienen el polipéptido heterólogo (a la planta) se puede incluir en una de las composiciones, como tal o para procesamiento adicional posterior. Se conocen23 métodos generales para la expresión de enzimas (heterólogas) en plantas (transgénicas), que incluyen métodos para expresión específica de semilla de enzimas. El polipéptido heterólogo puede estar contenido en la semilla de las plantas transgénicas o éste puede estar contenido en otras partes de planta tales como raíces, tallos, hojas, madera, flores, corteza y/o fruto. La planta puede ser un monocotiledón o un dicotiledón. Las plantas adecuadas incluyen cereales, tales como avena, cebada, trigo, maíz y arroz. Preferiblemente el polinucleótido de la invención está establemente incorporado en el genoma de la planta.

La adición del polipéptido en la forma de un material vegetal transgénico, por ejemplo, en semilla transgénica puede requerir el procesamiento del material vegetal con el fin de hacer la enzima disponible, o al menos mejorar su disponibilidad. Tales técnicas de procesamiento pueden incluir técnicas mecánicas (por ejemplo, molido y/o macerado) o tratamientos termomecánicos tales como la extrusión o la expansión.

La presente invención se relaciona así con procesos para promover el crecimiento y/o la conversión de alimento en un animal monogástrico o no rumiantes, el proceso comprende alimentar el polipéptido animal de la invención. Los animales adecuados incluyen animales de granja, monogástricos y/o no rumiantes tales como cerdos (o lechones), aves de corral (tales como pollos, pavos), terneras o terneros o animales acuáticos (por ejemplo, marinos) (por ejemplo, peces).

Ensayos para enzimas que degradan celulosa

También dentro de la presente invención está el uso de polipéptidos de acuerdo con la invención para seleccionar métodos para identificar compuestos que pueden actuar como agonistas o antagonistas que puedan modular la βglucanasa. En términos generales, tales métodos de selección pueden involucrar poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba y luego medir la actividad o incubar un polipéptido de la invención con una sustancia de prueba y luego detectar cualquier modulación de la actividad de β-glucanasa. Los agentes que se enlazan a los polipéptidos de la presente invención también se pueden identificar mediante ensayos de unión.

La actividad moduladora se puede determinar al poner en contacto las células que expresan un polipéptido de la invención con una sustancia bajo investigación y al monitorear el efecto mediado por los polipéptidos. Las células que expresan el polipéptido pueden ser in vitro y preferiblemente, el ensayo se lleva a cabo in vitro utilizando células que expresan polipéptido recombinante.

Los ensayos y los sustratos descritos aquí han permitido la identificación y la confirmación de la actividad de βglucanasa. Sin embargo, estos ensayos se pueden utilizar para detectar otras enzimas que degradan celulosa, sean

o no que ellas tengan actividad de β-glucanasa. El sustrato que se puede utilizar para este ensayo puede comprender β-glucano.

Otro aspecto de la invención se relaciona con un ensayo para identificar o detectar un polipéptido que es capaz de degradar celulosa. La actividad puede ser una glucanasa (por ejemplo, β-glucanasa) o celulasa o xiloglucanasa. El ensayo puede comprender:

(a)

suministrar, como sustrato para un compuesto candidato (usualmente un polipéptido) el sustrato descrito en el párrafo anterior; y

(b)

poner en contacto el sustrato con un compuesto candidato, y detectar si se produce cualquier carbohidrato.

La cantidad de estos carbohidratos se pueden medir. Si es necesario, se pueden comparar con la cantidad de los carbohidratos producidos en un experimento de control, en la ausencia del compuesto candidato.

Los ensayos anteriores se pueden emplear para identificar los moduladores de la actividad β-glucanasa.

Los rasgos y características preferidas de un aspecto de la invención son aplicables a otro aspecto mutatis mutandis.

La invención será ahora descrita con referencia a los siguientes Ejemplos que pretenden ser ilustrativos solamente y no limitantes.

EJEMPLOS

Procedimientos Generales

Las técnicas de clonación molecular estándar tales como el aislamiento de ADN, la electroforesis de gel, las modificaciones de restricción enzimática de los ácidos nucleicos, el análisis Southern, la transformación de E. coli, los levantamientos de colonias e hibridaciones de filtro, etc., se desarrollaron utilizando técnicas estándar1,2. Los oligo desoxinucleótidos sintéticos se obtuvieron de ISOGEN Bioscience (Maarssen, Los Países Bajos). Los análisis de secuencia de ADN se desarrollaron sobre un secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373A, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

La marcación y la hibridación del ADN se condujeron de acuerdo a la marcación de ácido nucleico directa ECLTM y a los sistemas de detección (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Inglaterra) o de acuerdo con las técnicas de marcación radioactiva estándar1.

Ejemplo 1: Aislamiento de ARN a partir de T. emersonii y síntesis de cADN

La cepa de T. emersonii CBS 393,64 se fermentó bajo condiciones inductoras de celulasa. En varios puntos de tiempo los sobrenadantes del micelio y cultivo se cosecharon mediante filtración utilizando un envoltorio de filtración Miracloth. El micelio se lavó extensivamente con agua desmineralizada y se exprimió entre toallas de papel para remover el exceso de agua. El micelio de puntos de tiempo seleccionados (con base en las mediciones de celulasa en los sobrenadantes de cultivo) se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se molió hasta un polvo fino utilizando un mortero y macerador. El polvo resultante se transfirió a un tubo estéril de 50 ml y se pesó: para cada 11,2 g del micelio molido se agregaron 10 ml del reactivo TRIzol (Gibco/BRL) (máximo a 25 ml por tubo). El polvo micelial se solubilizó inmediatamente mediante mezclado riguroso (sometiendo a vórtex, 1 min), seguido de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente con mezclado ocasional. Se agregó un volumen de cloroformo 0.2 (TRIzol original) (así 2 ml por cada 10 ml de TRIzol utilizados originalmente), se sometió a vórtex y dejados a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente, la mezcla se centrifugó a 4ºC, 6.000 g durante 30 minutos. La fase acuosa superior se transfirió a un tubo fresco y se precipitó ARN total mediante la adición de un volumen 0.5 (TRIzol original) de isopropil alcohol (así 5 ml de isopropil alcohol para cada 10 ml de TRIzol originalmente utilizados). Después de 10 minutos de precipitación a temperatura ambiente, el ARN se recuperó mediante centrifugación durante 30 minutos a 6000 g. A la remoción del sobrenadante la pella de ARN se enjuagó con un volumen de 70% de etanol. Después de la remoción del etanol, la pella de ARN se secó al aire. La pella de ARN seco se disolvió en regulador GTS 3 ml (100 mM Tris-Cl, pH 7.5, guanidinio tiocianato 4 M, lauril sarcosinato de sodio al 0,5%). Se utilizó 10 μl de solución de ARN para determinar la calidad y la concentración de los ácidos nucleicos.

Se desarrolló análisis Northern3 y se purificó adicionalmente ARN aislado1,3. Para el aislamiento de mARN se utilizó un protocolo modificado (utilizando flujo de gravedad en lugar de centrifugación) del kit de purificación PHARMACIA (Cat no. 27-9258-02)3. Para la síntesis de cADN se utilizó un KIT de Síntesis de cADN STRATAGENE de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto para un número de optimizaciones para utilizar los vectores pGBFIN con mayores cambios como se describió previamente3.

La cantidad de cADN sintetizado se estimó mediante la precipitación de TCA y subsecuentemente se analizó por a través de electroforesis en geles de agarosa alcalina3.

Ejemplo 2: Preparación de una biblioteca de cADN de mARN de T. emersonii

El grupo de cADN obtenido en el Ejemplo 1 fue despuntado, ligado con adaptadores y digerido con enzimas de restricción3.

La clonación de cADN en el vector de expresión pGBFIN-11 (véase WO-99/32617 para la construcción de este vector) requiere la presencia de un sitio EcoRI en el extremo 5’ de un sitio Xhol sobre el extremo 3’ del cADN. Por lo tanto el primer oligonucleótido cebador de cadena y las secuencias adaptadoras utilizadas (Pharmacia) se escogieron para cumplir con los prerrequisitos establecidos para el vector de expresión.

Los cADN obtenidos se separaron a través de fraccionamiento de tamaño a través de una matriz de SEPHAROSE CL-2B, luego de lo cual el tamaño de las reservas individuales obtenidas se analizaron a través de electroforesis de gel no desnaturalizante3. Dos grupos de cADN, obtenidos a través de cortes de a 0.5 kb y 1.0 kb respectivamente, se seleccionaron para la construcción de la biblioteca de cADN en el pGBFIN-11. Para el pGBFIN-11, se preparó un grupo de un vector pGBFIN-11 completamente digerido doble (EcoRI-Xhol) (ligación de fondo < 1%). Las reservas de cADN seleccionadas, se ligaron en el vector pGBFIN-11 y se transformaron en células bacterianas de E. coli XL10-Gold para generar dos librerías de cADN primarias. Las frecuencias de transformación de las dos reservas fueron ambas >1.0 x 106. De la fracción de ambas la biblioteca de cADN de E. coli, se seleccionaron colonias aleatoriamente y se aisló el plásmido de ADN. Los análisis de este plásmido de ADN demostraron que ambas bibliotecas de cADN tuvieron porcentajes de inserción entre 90 y 95%.

Adicionalmente, los levantamientos de colonia se llevaron a cabo a partir de una fracción de la biblioteca y los filtros generados se hibridaron subsecuentemente con el gen gpdA de T. emersonii, que codifica un gen de gliceraldehído3-fosfato desidrogenasa. Luego, el plásmido de ADN se aisló y a través del análisis de restricción demostró que todo el plásmido contenía insertos individuales en la orientación correcta. Secuenciando los extremos 5’ del cADN dentro de estos plásmidos que contienen gpdA de T. emersonii se demostró que > 85% era de longitud completa.

Ejemplo 3: Transformación de la colección de la biblioteca de expresión a A. niger

El ADN se aisló de la biblioteca de cADN de E. coli como se describió anteriormente. El ADN del plásmido se digirió durante 4 horas a 37ºC con Notl para eliminar las secuencias de plásmido derivadas de E. coli. Después de la purificación, el ADN se disolvió en agua desmineralizada estéril.

Varias transformaciones de DS2978 A. niger se llevaron a cabo3 utilizando protoplastos 1.5 x 107 B 3.0 x 107 y 10 ug del ADN de plásmido por transformación. Los transformantes se seleccionaron para la presencia del marcador de selección amdS mediante crecimiento sobre acetamida como la única fuente de N. En razón a que ambos marcadores de selección amdS y el casete de expresión de cADN están presentes en el crecimiento del fragmento de integración sobre acetamida es indicativo para la presencia de un casete de expresión de cADN.

Después de aproximadamente 7-10 días de incubación a 30ºC, se purificaron 10,000 transformantes: los transformantes de Aspergillus niger se transfirieron robóticamente (FlexysJcolony picker automater) de las placas de transformación hacia Placas MTP Master de 96 pozos (MP) que contienen 150 μl por pozo de medio selectivo solidificado (SM) (por 1000 ml: KCl 0.52 g, K2 HPO4 1.52 g, MgSO4 0.52 g, glucosa 20 g, acetamida 1g, regulador MES 0.1M, agar 15 g, 1 ml de solución de elemento en traza [solución de elementos de traza (que contienen por 1 litro): ZnSO4 2.2 g /7H2O, H3BO3 1.1 g, FeSO4 0.5 g/7H2O, CoCl2 0.17g/6H2O, CuSO4 0.16g/5H2O, NaMoO4 0.15 g/2H2O, EDTA 5.0g, pH 6.5] pH 5.5. Los transformantes se cultivaron sobre SM durante 5 días a 34ºC. El conjunto así generado de MP se utilizó para 1) inocular los MTP para crecimiento y subsecuente detección de enzima y 2) placas de respaldo (BP) de la biblioteca de cADN que se almacenó a -80ºC.

Ejemplo 4: Análisis de la biblioteca de expresión de T. emersonii

Los MP crecidos con 5 días de edad se utilizaron como patrón de replicación y las replicas fueron puestas en placas sobre placas de medio selectivo fresco (SM), que contienen por litro: KCl 0.52 g, K2HPO4 1.52 g, MgSO4 0.52 g, glucosa 20 g, acetamida 1g, regulador MES 0.1 M, agar 15 g, 1 ml de solución de elemento de traza [solución de elementos de traza (por 1 litro): ZnSO4 2.2 g /7H2O, H3BO3 1.1 g, FeSO4 0.5 g/7H2O, CoCl2 0.17 g/6H2O, CuSO4 0.16 g /5H2O, NaMoO4 0.15 g /2H2O, EDTA 5.0 g, pH 6.5] pH 5.5.

las placas una vez inoculadas se incubaron a 34ºC durante 48 horas. Subsecuentemente las placas se llenaron con carboximetilcelulosa que contiene agar en la parte superior (CMC) (agarosa 5g, CMC 0.5 g (Sigma ref C4888) preparada en 1000 ml de regulador de fosfato 50 mM pH 7). Una vez que se solidificó el agar superior, las placas se elevaron a 65ºC durante 4 horas. Para la visualización de la actividad, las placas se tiñeron con solución de rojo Congo (Rojo Congo 10 g en regulador de fosfato 1000 ml pH7) durante 15 minutos. La solución teñida se descartó y

las placas se lavaron con NaCl 1M (58.44 g en 1 litro de agua destilada). Esta etapa final se repitió dos veces. Los clones positivos aparecieron al formar un halo claro pálido sobre un fondo rojo.

Los clones de celulasa positivos de esta primera selección (que demuestran un halo claro después de la selección del rojo congo) se reinocularon sobre un medio SM fresco y crecieron durante 5 días a 34ºC. La placa de patrón así obtenida se replicó entonces sobre un medio selectivo y sobre un medio selectivo que contiene 0.075% (p/v) de AZCL-celulosa (catálogo de Megazime ref. I-AZCEL). Las placas SM se trataron y se calificaron como se describió previamente (crecidas a 34ºC y selección subsecuente a través de un sobrepuesto que contiene celulosa y un teñido con rojo Congo) mientras que las placas con SM-AZCEL-celulosa se incubaron a 34ºC durante 48 horas y luego se incubaron adicionalmente a 65ºC durante 8 horas. Las placas con SM-AZCL-celulosa se calificaron antes y después de la incubación a alta temperatura. Los clones con celulasa positiva dieron como resultado un halo azul difuso.

Finalmente, se identificaron 20 clones de celulasa positivos. La celulasa que produce los transformantes de Aspergillus, como se identificó en el ensayo de placa de xilanasa, crecieron en la fermentación de frasco agitado3. Las muestras del medio se tomaron después de 5 días de fermentación y se analizaron para actividad de celulasa como se describe después.

Ejemplo 5: Análisis genético de Transformantes positivos

Los transformantes positivos (re-confirmados) identificados crecieron en medio líquido, el micelio se cosechó y se aisló el ADN total (cromosómico) utilizando el Sistema de Aislamiento Puregene (Biozym B.V.) para el aislamiento de ADN a partir de hongos filamentosos. El aislamiento y la purificación de ADN se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante, pero ligeramente modificado: se repitieron las etapas de precipitación 3 y 4 de proteína.

El ADN cromosómico se utilizó como un patrón en una reacción PCR que utiliza los cebadores 12207 (SEQ ID No. 8) y 11937 (SEQ ID No. 7) para amplificar los insertos presentes en el casete de expresión integrado en el ADN cromosómico.

Los PCR directos sobre los transformantes se llevaron a cabo de acuerdo con una versión adaptada de un protocolo4 conocido donde el micelio obtenido se trató subsecuentemente con GlucanexJ (Novo Nordisk) a concentraciones de 5 mg/ml en lugar del NOVOzyme.

Las reacciones de PCR contenidas en el regulador eLONGaseTM B (Life Technologies, Breda, Países Bajos), los dNTP (200 μM de cada uno), Mezcla de Enzima eLONGaseTM 1 μl, un patrón 1-5 μl, y 10-30 pmol de cada oligo, en un volumen final de 50 μl. La cantidad óptima de oligos se determinó experimentalmente para cada lote adquirido. En promedio, se utilizaron 10 a 30 pmol. Las reacciones se llevaron a cabo con las siguientes condiciones de ciclo: 1 x (2 min)94ºC, 35 x (1 min 94ºC, 1 min 55ºC, 6 min 72ºC), 1 x (7 min 72ºC). Las muestras se cargaron sobre geles de agarosa para análisis de los productos PCR.

El producto PCR así obtenido se subclonó en un vector de clonación E. coli pcr2.1 (Invitrogen, de acuerdo a las instrucciones del proveedor), dando como resultado un plásmido pGBCEA-1.

El producto PCR subclonado se secuenció. La secuencia de nucleótido resultante de la región codificante se representó en la SEQ ID NO 1 y la secuencia de aminoácido deducida de la proteína en la SEQ ID NO 2. Esta proteína había sido denominada CEA.

Ejemplo 6: Selección viscométrica de la Biblioteca de Expresión de cADN utilizando el Visco robot Hamilton

Mediciones Viscométricas

Los viscómetros capilares son los tipos más comúnmente utilizados de viscómetros utilizados para las mediciones de líquidos viscosos. En general, el líquido de interés se hace para fluir a través de un tubo capilar bajo unas diferencias de presión conocidas. Luego la rata de flujo se mide, usualmente al notar el tiempo tomado para un volumen dado de líquido para pasar una marca de graduación. Otros tipos de viscómetros capilares fuerzan el líquido a través de un capilar a una rata predeterminada de flujo, y la caída de la presión producida de esta manera a través del capilar se mide con el fin de determinar la viscosidad de líquidos. La degradación enzimática controlada de las soluciones viscosas poliméricas se puede utilizar para determinar la actividad de la enzima. Es conocido que proveyendo las relaciones numéricas entre la viscosidad y la concentración del líquido, se pueden estimar los parámetros cinéticos tales como la constante de Michaelis-Menten.

I. El sistema de detección

(a) La configuración del visco robot Hamilton

El robot de pipeteo Hamilton (Hamilton Workstation Microlab 2200, Hamilton Company, Reno, EEUU) se controló mediante un programa de software denominado Eclipse (Hamilton Company). Este software le permite al usuario

dirigir la sonda-brazo a cierta posición dentro del espacio de trabajo del Hamilton. Se desarrolló un programa Eclipse de visco-ensayo estándar. Este programa trabaja sobre los MTP de 96 pozos, donde cada pozo puede ser dirigido individualmente. Las jeringas se utilizan para aspirar o dispensar líquido de muestra en una posición específica Eclipse a través del orificio de la aguja. Tanto la aspiración como la velocidad de dispersión (en seg/ml) así como también la aspiración y la dispersión de los volúmenes (en μl) se especificaron según se deseara. Al implementar las definiciones de bastidor, los recipientes de múltiples reactivos se pueden acceder de una manera eficiente y de ahorro de tiempo. Es traspaso del líquido de la muestra de una etapa de pipeteo a la siguiente se evitó mediante la instrucción a Eclipse de enjuagar el tubo con fluido del sistema. La velocidad de aspiración de 10 seg/ml (algunas veces 15 seg/ml) fue adecuada para distinguir la mayoría de las viscosidades al mirar en las alturas pico. Usualmente 200 – 250 μl del líquido de muestra se aspiraron y dispensaron.

(b)

Configuración del Hamilton

La aspiración del líquido de muestra produce una caída de presión a través de la tubería llena de agua. La magnitud de la caída de la presión depende tanto de la velocidad de aspiración (o movimiento del émbolo) como sobre la viscosidad del líquido de muestra. La caída de presión más alta se crea en la punta de la aguja, en razón a que el radio es más pequeño (aproximadamente 0,3 mm). La aspiración del líquido de muestra origina cambios en la presión, que son relevados de la unión T del transductor de presión. El transductor (Dépex B.V., de Bilt, Los Países Bajos) convierte la magnitud de la presión baja en una corriente eléctrica. La corriente eléctrica es leída por un Datataker una vez por segundo, y posteriormente almacenada en la memoria del Datataker en un formato digital. Un ordenador que es conectado al Datataker posibilita (a través del software Delogger) la descarga de la memoria del Datataker en archivos. Ellos a su vez pueden ser leídos y analizados por programas de hojas de cálculo comunes (tales como Microsoft Excel). En razón a que la presión se midió con tiempo, la salida final se puede visualizar al graficar la magnitud de la presión baja (en mV) contra el tiempo (en segundos). Luego del desplazamiento de la unión T a una posición derecha detrás de la aguja, la señal de presión es menos dependiente del volumen de la aspiración.

(c)

Preparación de curvas de calibración permite la determinación de la viscosidad de cualquier líquido.

De acuerdo con la Ley de Poisseuille, la caída de presión medida debe ser directamente proporcional a la viscosidad, en razón de que

Con esta fórmula es posible relacionar la salida a presión baja en mili-Volt a la viscosidad desconocida del líquido de muestra. Esto se hizo mediante la aspiración de un volumen constante definido de líquido de calibración (usualmente glicerol, ya que esto cubre un amplio rango de viscosidades y se comporta de una manera Newtoniana) en varias concentraciones. La presión baja así creada se relaciona con la salida mV por un factor desconocido F. En razón a que las viscosidades absolutas de varias concentraciones de glicerol son conocidas, la gráfica de la salida a presión baja en mV para varias concentraciones de glicerol conocidas contra las viscosidades absolutas conocidas de las mismas concentraciones de glicerol producen una línea recta a través del origen (en razón a que P = (mV)*F = η/k).

(d) Programa de Eclipse utilizado para la Selección a Escala Completa.

Un ciclo de medición individual consiste de la aspiración de la muestra de 250 μl y la mezcla de sustrato sobrenadante) a una velocidad de aspiración de 10 seg/ml. Antes de la aspiración del fluido de muestra, se aspiró 40μl de aire para separar el sistema del fluido de muestra. Una vez que la aspiración del líquido de muestra era completa, es seguida por la dispersión de 290 μl de la muestra y aire. Este ciclo de medición se repitió seis veces, y se siguió por una etapa de lavado de 5 ml con el fin de limpiar la tubería.

II. Desarrollo de Ensayo

(e) Establecer la mezcla de sustrato óptima de pectina y xilano para selección.

Utilizando más de un sustrato viscoso a la vez tuvo varias ventajas. Uno puede seleccionar diferentes tipos de enzimas al mismo tiempo. Esto ahorró una gran cantidad de esfuerzo y tiempo mientras se requirieron menos sustrato. Además del xilano de espelta de avena se decidió utilizar pectina como el segundo sustrato. Una solución

1:1 de pectina al 1% y xilano de espelta de avena al 7% parece ser el más adecuado para seleccionar. En razón a que hubo proporcionalmente menos clones positivos en la biblioteca, la mayoría de los picos tuvo una altura aproximada de 435 mV. En el caso de la muestra de xilanasa positiva, la totalidad o la mayoría del xilano se

degradará, de tal forma que solamente 0,5% de la pectina se dejó. De esta manera, el clon de xilanasa positivo produjo una altura pico de 280 mV. En caso de un clon degradante de pectina, la altura del pico fue de 220mV.

(f)

Determinación de la actividad de xilanasa mínima necesaria para ser detectada con el visco robot Hamilton

La selección se llevó a cabo con muy pequeños volúmenes de tanto el sustrato como el sobrenadante, en razón a que un pozo MTP individual mantiene como máximo 360 μl. Además, entre más sobrenadante se agregue, más sustrato se diluye, y más viscosidad inicial se reduce. 250 μl de 6% de xilano de espelta de avena se dispensó en los pozos de un MTP. La disolución de una serie de una xilanasa de referencia (xilanasa de A. tubigensis con una actividad de 685,400 EXU/g, donde 1 EXU = 4.53 moles de azúcares reductores/min/g) se prepararon y 30 μl de cada disolución se agregó al sustrato. Después de la incubación durante 24 horas a 50ºC, se midió la viscosidad de cada muestra. La concentración de enzima detectable más baja se corresponde con 53.6 ng/ml o 0.0367 EXU/ml. De esta manera, la adición de 20 μl de sobrenadante a 300 μl de sustrato permitirá la detección de actividades de enzima extremadamente bajas.

(g)

Configurar la selección para la identificación de enzimas termoestables.

Con el fin de recoger solamente las enzimas termoestables de la biblioteca y con el fin de evitar la interferencia de la actividad de las enzimas de A. niger anfitrión, las placas con los clones que contienen las enzimas candidato termoestables se sometieron a tratamiento con calor. El sistema fue validado utilizando cepas anfitrionas vacías, las cepas anfitrionas que expresan enzimas termolábiles y cepas anfitrionas que expresan enzimas termoestables. Después del crecimiento de las cepas y la producción de la enzima las placas MTP se calentaron a 72ºC durante 30 minutos. Subsecuentemente 20 μl de sobrenadante se agregaron a 300 μl de xilano de espelta de avena al 6%. Junto con los controles negativos (adición de 20 μl de agua), las placas que contienen las muestras se sellaron con un cinta adhesiva y se incubaron a 60ºC en el horno. La temperatura alta puede incrementar cualquier actividad de enzima termoestable pero destruye tanto la enzima de A. niger anfitrión de fondo que interfiere la actividad y las actividades de enzima no termoestable expresadas por la biblioteca. Después de 20 horas de incubación, ninguna disminución notable en el pico alto se encontró para los clones de xilanasa termolábiles, indicando que la actividad de la xilanasa anfitriona se había inactivado completamente. Además los clones de la enzima de xilanasa termolábil xynB de Aspergillus niger se incluyeron como un control. En este caso ninguna actividad residual pudo ser detectada, aunque de otra parte la xilanasa resistente al calor que se incluyó como control estaba aún activa. la inactivación del calor durante 30 minutos a 72ºC y los tiempos de incubación de la muestra de 24 horas o menos los posibilitaron a detectar específicamente las xilanasas termoestables de T. emersonii.

III. Selección de la biblioteca de expresión de cADN utilizando el Visco-robot Hamilton

(h) Replicación de la biblioteca de expresión de cADN y la expresión de la biblioteca.

Un ciclo de replicación involucra la inoculación de dos veces tanto el medio selectivo (SM) (que contienen por litro: KCl 0.52 g, K2BPO4 1.52 g, MgSO4 0.52 g, glucosa 20 g, acetamida 1 g, regulador MES 0.1 M, agar 15 g, 1 ml de solución de elemento traza [solución de elementos traza (por 1 litro): ZnSO4 2.2 g/7H2O, H3BO3 1.1 g, FeSO4 0.5 g/7H2O, CoCl20.17g/6H2O, CuSO4 0.16 g/5H2O, NaMoO4 0.15 g/2H2O, EDTA 5.0 g, pH 6.5] pH 5.5) y el medio de crecimiento líquido (GM) (que contiene, por litro, glucosa 70 g, hidrolizado de caseína 25 g, extracto de levadura

12.5 g, KH2PO4 1 g, K2SO4 0.5 g, MgSO4 2 g, ZnCl2 0.03 g, CaCl2 0.02 g, MnSO4 0.01, FeSO4 0.3 g, pH 5.6). La biblioteca se almacenó en los MTP estándar, donde las colonias de A. niger recombinantes esporuladas crecieron en cada pozo sobre SM en la presencia de glicerol al 10%. Durante el almacenamiento, estas placas (placas maestras, las MP) se mantuvieron en un estado congelado (-80ºC). Antes de la replicación de las MP, ellas se descongelaron durante una hora en una cabina para gases esterilizada para evitar la contaminación microbiana. La replicación de las MP se llevó a cabo con un Replicador PBA Flexys-Colony. Las Placas Maestras con crecimiento de 5 días se utilizaron como patrón de replicación y la réplica se puso en placas en los MTP de 96 pozos llenados con medio de crecimiento líquido (GM). Las placas de agar SM recientemente inoculadas se colocaron en una incubadora a 32ºC y posteriormente se almacenaron a -80ºC después de la adición de 150 μl de glicerol al 10% por pozo. Las placas de producción GM se incubaron en un Agitador Tomtec Quadrastor de agua saturada 96000 (32ºC). Las placas mostraron micelio en crecimiento después de 2-3 días. Las placas GM se incubaron durante 6 días.

(i)

Muestra de los sobrenadantes después de que se completa el crecimiento.

Después de 6 días de crecimiento, el medio de crecimiento líquido GM restante (que contiene productos de expresión extracelular) se extrajo y se transfirió a los MTP frescos. Los sobrenadantes se transfirieron a los MTP frescos utilizando un robot de pipeteo Tecan de 4 canales. El volumen promedio del sobrenadante recuperado estuvo entre 120 y 140 μl. Estas placas sobrenadantes se congelaron y se ensayaron subsecuentemente para actividad de xilanasa.

(j)

Preparaciones de la selección con escala completa.

Las placas sobrenadantes de la biblioteca de expresión se descongelaron y se colocaron en un baño de agua cerrado a los 72ºC durante 35-40 minutos. Utilizando una pipeta de 12 canales y las puntas de pipeta prepreparadas comerciales en bastidores con formato MTP desechable (suministradas por Eppendorf), 20 μl de cada sobrenadante se transfirió a la mezcla de sustrato que contiene MTP que se había calentado a 60ºC antes de agregar los sobrenadantes. La mezcla del sustrato consistió de una mezcla 1:1 de pectina al 1% (véase (k) adelante) y xilano de espelta de avena al 7% (véase (1) adelante), con un pH final de 4.12. Los MTP de ensayo se llenaron con 310 ml de sustrato/pozo. La mezcla de los sobrenadantes con la mezcla del sustrato se logró mediante agitación de las puntas de la pipeta en los pozos de muestra directamente después de dispensar los sobrenadantes. Subsecuentemente las placas se colocaron en un horno a 60ºC durante un período de incubación de 18-24 horas. Después de la incubación, a los MTP se les permitió enfriarse y se seleccionaron para una disminución de viscosidad utilizando el visco-robot Hamilton (Hamilton Company, Reno, EE.UU).

(k)

Preparación de pectina al 1%, pH 4.1

Un regulador de fosfato de ácido cítrico (regulador Mc llvaine) se preparó al agregar una solución de NaHPO4 0.2M a 250 ml de la solución de ácido cítrico 0.1M hasta que se obtuvo un pH de 5.5. Esto se hizo hasta un litro con agua destilada, y el pH se reajustó si era necesario. Una solución de pectina al 0.5% se hizo al agregar lentamente 0.5 g de pectina altamente metilada (tipo Ruban Brun) a un matraz que contiene 50 ml del regulador Mcllvaine anterior y 25 ml de agua destilada a 60ºC. La agitación vigorosa aseguró que la pectina se disolviera bien. Esto se hizo hasta 100 ml, y el pH se verificó de nuevo. La pectina utilizada aquí bajó el pH de la solución, de tal forma que bajo estas condiciones la solución tuvo un pH de 5.1. Si la solución de pectina estaba turbia, fue útil centrifugar la solución a 15 g durante 15 minutos con el fin de eliminar cualquier partícula no disuelta.

(l)

Preparación de xilano de espelta de avena tratado con alcalino al 7%, pH 4,4.

Se calentaron 20 ml de NaOH 2M hasta 60ºC en un vaso de precipitados de 150 ml. En un vaso de precipitados separado se agregaron 7 g de xilano de espelta de avena (de Sigma Company) a 20 ml de agua, de tal forma que se formó una masa café brillante. Si es necesario, se agrega más agua, pero no más de 30 ml en total. Utilizando una cuchara de acero, esta masa de xilano de espelta de avena en agua se agregó lentamente a la solución de NaOH caliente. Se requirió un dispositivo de agitación poderoso para disolver el xilano en la solución de hidróxido, manteniendo de esta manera la temperatura a una constante de 60ºC. Una vez que todo el xilano se disolvió, la solución se volvió café oscura y se semejó a un jarabe claro muy viscoso. Entonces el resto del agua se agregó de tal forma que se hubiera agregado la cantidad total de 50 ml. la solución se dejó enfriar y se agregó HCl 4N hasta que se logró el pH deseado (usualmente un pH 4.1-4,2). La solución se completó hasta 100 ml y el pH se reajustó si era necesario. La centrifugación de 20,000 g durante 15 minutos a 10ºC produjo un sobrenadante claro amarillento (cuya viscosidad dependió de la cantidad inicial agregada de xilano de espelta de avena).

(m)

La selección de la biblioteca

El resultado de la selección de la biblioteca de Talaromices emersonii clonada en A. niger fue de 119 gráficos que corresponden con los 119 MTP probados. Cada gráfico mostró la viscosidad de los 96 pozos representados como 96 picos los cuales midieron la presión baja por pozo en mV. Los gráficos se analizaron para los picos bajos, lo que indicó viscosidad reducida. Los picos que eran inferiores a la altura de pico promedio se seleccionaron para reensayo. Algunas placas produjeron muy poca variación, de tal forma que la selección de los clones positivos putativos para reensayo fue fácil. Otras placas mostraron una gran cantidad de variación, de esta manera a menudo más de 5 o 6 clones putativos se seleccionaron para reensayo. Para tener un control positivo, después de la incubación se agregaron 10μl de una endoxilanasa a una placa al azar en una posición fija. A partir de aquellos controles positivos, se encontró que si hay actividad de xilanasa, nosotros deberíamos esperar una altura de pico entre 240 y 280 mV.

Las placas de la biblioteca de Talaromyces que se probaron también contenían cinco clones de xilanasa termoestable confirmados que se encontraron antes de utilizar un ensayo de detección de tinte con base en la solubilización de los tintes que fueron químicamente unidos al sustrato polimérico insoluble. Sin excepción, aquellos cinco clones fueron independientemente encontrados con el ensayo de viscometría ya en la ronda de selección primaria. Todos los picos de los clones conocidos estuvieron a un nivel muy inferior que el resto de los picos (a 250 mV). En total, 118 pozos de cultivo se seleccionaron para reensayo, excluyendo aquellos con clones de xilanasa previamente encontrados.

(n) Reensayo de 118 clones putativos

El reensayo se basó en el ensayo de viscometría de acuerdo con el principio utilizado con la selección a escala completa. Esta vez, sin embargo, se utilizó un mayor volumen de ensayo, en razón a que se podía hacer una distinción clara entre la actividad de enzima termoestable y los picos bajos irregulares. Dos MTP grandes (2ml/pozo) se llenaron con 1.2 m1 de xilano de espelta de avena al 9%. A los primeros dos pozos de cada fila se les agregó 50 μl de agua (control negativo). Al último pozo de cada hilera, se le agregó 50 μl de una solución de endoxilanasa de

referencia con el fin de tener un control positivo, también. Los pozos 3 a 11 de cada fila se utilizaron para reensayar los clones de xilanasa putativos (adición de 50 μl de sobrenadante). Después de mezclar e incubar durante 24 horas a 60ºC, las viscosidades se midieron con un programa Eclipse diseñado específicamente (Volumen de aspiración: 800 μl, Velocidad de aspiración: 10 seg/ml).

Se identificaron varios clones positivos en razón a que sus picos estaban exactamente en el mismo nivel como los controles positivos, indicando la degradación completa del xilano. En total trece cepas putativas se identificaron en el reensayo de viscoselección. Los insertos de cADN se clonaron directamente en el vector pCR2.1 a través de amplificación PCR ejecutada sobre ADN cromosómico. De cepas de 12 bibliotecas se obtuvieron dieciséis insertos de cADN, utilizando dos polimerasas y un grupo de cebador 2 (11397/12207, SEQ ID Nos. 7 y 8). La orientación del inserto de cADN en el vector pCR2.1 se determinó mediante digestión de Xhol, que estuvo localizada en el vector y en el 3’ del cADN. El análisis de la secuencia de ADN se ejecutó sobre el extremo 5’ de los insertos de cADN.

El reensayo para posibles enzimas que degradan pectina se llevó a cabo de una manera similar que para la xilanasa, excepto que se utilizó pectina al 1% en lugar de xilano de espelta de avena al 9%. Solamente diez clones posibles se reensayaron, que fueron aquellos que produjeron picos muy bajos en la ronda de selección primaria pero no mostraron ninguna actividad durante el reensayo de xilanasa. De manera reproducible un clon produjo una enzima que degrada pectina. El valor de la presión medida de 200 mV corresponde a la viscosidad del agua pura. En razón a que la pectina utilizada no fue completamente metilada, ésta podría haber sido degradada por una poligalacturonasa termoestable, pectato liasa o pectina liasa.

(o) Beneficios de la Viscoselección

El desarrollo de un método de selección viscométrico para identificar las enzimas termoestables se facilitó por tres factores clave. Primero, la posibilidad de la termo-activación de la actividad de xilanasa anfitriona nativa permitió un desarrollo más rápido de las condiciones de reacción apropiadas. Segundo, el hecho de cuando se ensayaron los clones con enzimas termolábiles conocidas, la termo-activación destruyó toda actividad de tal forma que solamente se recogieron las enzimas más termoestables. En tercer lugar las temperaturas elevadas incrementaron las actividades enzimáticas de tal forma que la selección se volvió aún más sensible. Sobre el Xilano de espelta de avena (Sigma) se identificaron once clones que eran capaces de reducir la viscosidad significativamente y sobre la pectina se identificó un clon degradante de pectina definido. Adicionalmente, cinco clones de xilanasa termoestable que se identificaron previamente fueron independientemente re-descubiertos.

Ejemplo 7: Caracterización de la primera -glucanasa termoestable de Talaromyces emersonii (CEA) del transformante A. Níger.

Ensayos de Actividad y definiciones

Definición de la Unidad PAHBAH de Celulasa (CPU)

Una unidad de actividad de celulasa se define como la cantidad de enzima requerida para liberar un μmol de azúcares reductores producidos por minuto a un pH de 5.0 y 60ºC a una concentración de sustrato de Carboxi Metil Celulosa al 5% (CMC), utilizando una curva de calibración de glucosa.

La actividad de la enzima de acuerdo con el método CPU se midió al detectar azúcares reductores utilizando hidracida de ácido 4-hidroxi-benzoico (PAHBAH). El ensayo se basó en Lever, M., Powell. J.C., Killip, M., Small,

C.W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82, 649-655 con algunas modificaciones. Las modificaciones es al reactivo PAHBAH como sigue: citrato de trisodio 0.05 M, Na2SO3 0.1 M, CaCl2 0.02 M, NaOH 0.5 M y hidracida de ácido phidoxibenzoico 0.1 M (PAHBAH). El pH final fue 12. El reactivo que contiene PAHBAH en solución alcalina, almacenado a temperatura ambiente, se debe utilizar en un día. La glucosa se utilizó como azúcar reductor de referencia (curva de calibración). Para la curva de calibración de este ensayo, las concentraciones finales de glucosa estuvieron entre 0-300 mM. La actividad CPU se ensayó al mezclar 100 μl de la solución de enzima con 400 μl de CMC al 5% en un regulador de acetato de sodio 0.1 M (pH 5.0). Las copas Eppendorf con el sustrato (CMC) se preincubaron durante 5 minutos a 60ºC. La reacción se inició al agregar la solución de enzima. Después de 15 minutos la reacción se detuvo al agregar el reactivo PAHBAH 1.0 ml. Las copas Eppendorf se calentaron durante 5 minutos a 100ºC y luego enfriadas sobre hielo. Las muestras se centrifugaron a la velocidad apropiada con el fin de decantar cualquier material sólido (1 minuto a velocidad completa en una Beckman Microfuge E). La absorbancia se midió a 420 nm. Se preparó un blanco al agregar 100 μl de regulador de acetato de sodio 0.1 M en lugar de la solución de enzima.

Definición de la Unidad de Beta Glucanasa (BGU)

La Unidad de Beta Glucanasa es la actividad requerida para liberar 0.258 μmol de azúcares reductores (medidos como equivalentes de glucosa) por minuto a pH 3.5 y 40ºC, a una concentración de sustrato de β-glucano al 0.5% de cebada.

Así además de la determinación anterior de la actividad de celulasa (CPU), un ensayo más específico se llevó a cabo para detectar la actividad de β-glucanasa. El principio del ensayo es la velocidad en la cual la viscosidad disminuye de una solución de viscosidad media de β-glucano de cebada (Megazyme, Australia, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) luego de la adición de una cierta cantidad de enzima. El β-glucano de cebada, viscosidad media (Megazyme, Australia), se disolvió en regulador de citrato de sodio 0.425 M pH 3.5 a una concentración de 6.25 mg/ml. El sustrato se incubó a 40ºC durante 10 minutos. Subsecuentemente una pequeña cantidad de enzima (en el rango de 0.005-0.062 Unidades/ml) se agregó y a la reacción se dejó proceder. A 60 minutos de tiempo de reacción la viscosidad de la muestra se determinó con relación a la muestra de referencia que se incubó con una endo-glucanasa estándar de actividad enzimática conocida. Las actividades absolutas para el estándar se determinaron al reducir el método de azúcar utilizando Fe-III-hexacianuro y 4.76 mg/ml de β-glucano de cebada como concentración de sustrato inicial.

Definición de la Unidad de Endo Xilanasa (EXU)

La unidad de la actividad de xilanasa (EXU) se definió como la cantidad de enzima (endol endo-1,4-β-xilanasa de Asp. niger, como se describió en la EP-A-0,463,706 (Gist-brocades B.V.)) que libera 4.53 μmol de azúcares reductores (medidos como los equivalentes de xilosa) por minuto bajo condiciones de ensayo. Las condiciones de ensayo comprenden: arabinoxilano 5mg/ml proveniente de harina de trigo (Megazyme, Australia 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) en regulador de citrato de sodio 100mM (pH 3.5), temperatura 40ºC, a un tiempo de reacción de 60 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de NaOH 1 M. La detección se hizo colorimétricamente a 420 nm después de incubar las muestras con Fe-III-hexacianuro durante 15 minutos en agua hirviendo. El reactivo de hexacianoferrato se hizo al disolver KFe(CN) 1.17 g y carbonato de sodio anhidro 19.5 g en 1 litro de agua.

Además de la determinación absoluta anterior de la actividad de xilanasa, se utilizó un método relativo que siguió la disminución en la viscosidad de una solución con arabinoxilano de trigo (Megazyme, Australia 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) luego de la adición de cierta cantidad de enzima. El arabinoxilano de trigo se disolvió en regulador de citrato de sodio 0.425 M (pH 3.5) a una concentración de 8.3 mg/ml. El sustrato se incubó a 55ºC durante 10 minutos. Subsecuentemente se agregó una pequeña cantidad de enzima (en el rango de 0.01-0.05 Unidades/ml) y a la reacción se le permitió proceder. Después de 60 minutos de tiempo de reacción la viscosidad de la muestra se determinó con relación a una referencia que se incubó con un estándar de endo-xilanasa de Aspergillus niger de actividad EXU conocida (EP-A-0,463,706). Las actividades absolutas en EXU para el estándar se determinaron por el método de azúcar reductor utilizando Fe-III-hexacianuro como se describió anteriormente. La viscosidad de determinó manualmente utilizando un aparato de viscosidad de caída bola Haake.

Definición de la Unidad de Celulasa (CXU)

La unidad de la actividad de beta-glucanasa (BGU) se define como la cantidad de celulasa que hidroliza en una hora un número de enlaces glicosídicos equivalentes a la producción de 0.5 mg de glucosa bajo las condiciones de ensayo. Las condiciones de ensayo comprenden: carboximetilcelulosa 9 mg/ml en regulador de de acetato de sodio 5mM (pH=4.6), temperatura 37ºC. La glucosa liberada se determinó mediante el método de azúcar reductor utilizando el reactivo DNS.

Además de la determinación absoluta anterior de la actividad celulasa, se utilizó un método relativo que siguió la disminución en viscosidad de una solución de carboximetilcelulosa luego de la adición de una cierta cantidad de enzima. La carboximetilcelulosa se disolvió en un regulador de citrato de sodio 5 mM (pH=4.6) a una concentración que depende de la viscosidad del lote. El sustrato se incubó a 37ºC durante 10 minutos. Subsecuentemente se agregó una pequeña cantidad de enzima y la reacción se dejó proceder. Después de 60 minutos el tiempo de reacción de la viscosidad de la muestra se determinó con relación a una referencia que se incubó con un estándar de actividad CXU conocida.

Actividad wrt de pH

La β-glucanasa de T. emersonii fue producida mediante los transformantes A. niger apropiados en matraces de agitación como se describió en el Ejemplo 3 después de hacer crecer micelio el cual se eliminó mediante filtración. El filtrado se utilizó para este experimento. La actividad del filtrado se midió a valores diferentes de pH a una temperatura fija de 60ºC. La actividad se midió de acuerdo con el método CPU en lugar de utilizar el pH fijo del pH 5.0, el sustrato CMC se diluyó con un regulador de citrato del pH apropiado con el fin de obtener el pH de la medición. El experimento se repitió dos veces y los resultados se muestran en la Tabla 1 abajo. El pH óptimo de la enzima se encontró que era entre pH 4.5 y 5.0, hasta aproximadamente pH 4,8.

Tabla 1: perfil de pH a 60ºC

pH

actividad (μM de glucosa/15 minutos) a 60ºC (mediciones duplicadas)

3

27.2 27.7

3.5

66.6 64.2

4

109.3 102.6

4.5

133.8 120.6

5

121.3 135.5

5.5

116.4 107.4

6

68.7 69.3

Actividad wrt de Temperatura

La actividad de esta β-glucanasa se midió entonces a diferentes temperaturas. Las mediciones de actividad se llevaron a cabo de acuerdo con el método CPU a un pH 4.0. En lugar de incubar a una temperatura fija de 60ºC, las incubaciones se llevaron a cabo a varias temperaturas. El experimento se llevó a cabo dos veces y los resultados se muestran en la Tabla 2 adelante. Se encontró que la temperatura óptima estaba entre 80ºC y 85ºC. El Topt parece ser de aproximadamente 84ºC (aunque éste puede ser de 82ºC, 83ºC, u 85ºC, dependiendo de cómo las líneas se dibujan y se interpolan entre los puntos de datos).

Tabla 2: Perfil de temperatura a pH 4

Temperatura (ºC)

actividad (μM glucosa/15 minutos): (mediciones duplicadas)

60

87.8 102.1

70

156.4 154.6

80

208.5 213.1

90

185.4 176.4

Actividad wrt de otras enzimas

[0198] Además la actividad a 30-60ºC se midió utilizando el método BGU para la β-glucanasa y se comparó con un caldo libre de célula de T. reesei comercialmente disponible que tiene actividad de celulasa y glucanasa como una referencia. El caldo libre de célula de T. reesei consistió de una mezcla de diferentes enzimas entre las cuales están

15 una o más β-glucanasas pero donde estas actividades no se han caracterizado. Para comparar las actividades de βglucanasa de T. emersonii de la invención y de las celulasas/glucanasas de T. reesei, las enzimas se dosificaron aproximadamente a actividad igual a 40ºC. La actividad de β-glucanasa A de T. emersonii a 40ºC se estableció en una y así otras actividades son relativos a este. Los resultados se muestran abajo en la Tabla 3.

Tabla 3: actividad relativa wrt de enzimas T. reesei

Temperatura (ºC)

Actividad Relativa: β-glucanasa (CEA) Actividad Relativa: T. reesei Celulasas/glucanasas

30

0.50 0.44

40

1.00 1.13

50

1.57 1.32

60

2.40 1.59

A temperaturas por encima de 40ºC la actividad de celulasa/glucanasa de T. reesei comenzó a nivelarse cuando se comparó con la β-glucanasa de T. emersonii. Por encima de 40ºC la divergió, siendo el CEA más activo. También, aunque la actividad relativa fue mayor a temperaturas elevadas, a temperaturas moderadas la actividad se mantuvo con relación a la mezcla de T. reesei. Esto ilustra el rango de amplias temperatura sobre el cual la β-glucanasa es activa.

Purificación y Actividad Específica

La purificación de la β-glucanasa de T. emersonii comenzó a partir del filtrado. Aproximadamente 25 ml de un caldo libre de células se desalinizó con una columna PD10 y se colocó sobre una columna de intercambio de recursos Q 6 ml anión que se equilibró en un regulador de acetato de sodio 10 mM (pH 5.0). La elusión se llevó a cabo con un gradiente lineal de regulador de acetato de sodio 10-300 mM (pH 5.0). (El gradiente lineal A a B; rata de flujo: 6 ml/min; tiempo de ejecución: 54 minutos; monitor de longitud de onda: 280 nm, 254 nm, 214 nm). Las fracciones activas se recolectaron (20 ml), se concentraron con concentradores Microsep (3.5 ml, 10 K) y se lavaron dos veces con regulador de fosfato de sodio 0.1 M (pH 5.0). La pureza de las fracciones se analizó mediante HPL-SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) y SDS-PAGE.

Mediciones de actividad específica

El coeficiente de extinción molar calculado de la β-glucanasa a 280 nm es de 81550 M-1.cm-1. La concentración de proteína de la enzima purificada se derivó de las mediciones de E280 utilizando una absorción específica de E2801cm=2,33 para 1mg/ml. La actividad específica de la muestra purificada se determinó en BGU (sustrato: betaglucano de cebada) y fue de 1027 BGU/mg. Utilizando el método CPU la actividad específica fue de 628 unidades/mg. Como la actividad de acuerdo con el método viscosimétrico produjo un alto número en comparación con el método de azúcar reductor, éste concluyó que la β-glucanasa de T. emersonii exhibe una actividad de endoglucanasa significativa. Una exo-glucanasa típica se ejecutaría muy bien en un ensayo de azúcar reductor aunque se ejecutaría muy mal en el ensayo viscosimétrico.

Punto Iso-Eléctrico

El IEF-PAGE se desarrolló como sigue, el Equipo fue el sistema Fast (Pharmacia Biotech), IEF 3-9 PhastGel (Pharmacia Biotech). Los geles se corrieron y se tiñeron (Coomassie) de acuerdo con los métodos estándar del sistema Phast. El Punto Iso Eléctrico se determinó sobre un PhastGel IEF3-9 y resultó ser 3.3.

Determinación del peso molecular

El SDS-PAGE se ejecutó como sigue. El equipo fue de nuevo el sistema Phast (Pharmacia Biotech); geles homogéneos al 12.5% (Pharmacia Biotech); tiras de regulador SDS (Pharmacia Biotech). Tratamiento de muestra: un regulador de volumen (5 muestras) (Tris-HCl 500 mM, pH 6.8, SDS al 10%, azul de bromofenol al 0.1%) se mezcló con 4 volúmenes de muestra y se hirvió durante 3 minutos. Los geles se ejecutaron y se tiñeron (Coomassie) de acuerdo con los métodos estándar del sistema Phast. La cromatografía de exclusión por tamaño HPLC se llevó a cabo utilizando una Columna: TSK G3000SW, cat. No. 05103 (TosoHaas). Método: los eluyentes fueron: regulador de fosfato de sodio 0.1 M pH 7.0, rata de flujo: 1ml/min, Tiempo de ejecución: 30 minutos, monitor de longitud de onda: 280nm. Desglicosilación de la enzima: mezcla 5μl de la enzima purificada (7 mg/ml) con 20 μl de SDS al 0,5% y 25 μl de β-mercaptoetanol al 1%. Esta mezcla se hirvió durante 4 minutos. Después de enfriar, se agregaron Nglicosidasa F 20 μl (500 U/ml) y 20 μl de Triton X-100 al 3% en regulador de fosfato de sodio 1 M pH 7.0. Esto se incubó durante toda la noche y la desglicosilación se analizó con SDS-PAGE.

El peso molecular determinado sobre gel de SDS-PAGE y HP-SEC resultó ser de 43 kDa. Después de la desglicosilación sobre SDS-PAGE fue vista una banda recta de 37 kDa.

Termoestabilidad

La termoestabilidad T50 se determinó con las celulasas/glucanasas de T. reesei como referencia. T50 es la temperatura en la cual, después de 20 minutos de incubación, 50% de la actividad se deja. La Tabla 4 muestra las diferencias en la termoestabilidad T50 entre la β-glucanasa purificada de T. emersonii y la mezcla de celulasa/glucanasas de T. reesei utilizadas anteriormente en este Ejemplo (la actividad inicial se ajustó a uno: las enzimas se incubaron durante 20 minutos y después la actividad de enfriamiento se midió utilizando el método CPU). Cada experimento se repitió dos veces y así la Tabla 4 muestra las mediciones duplicadas. La termoestabilidad T50 de la β-glucanasa purificada se encuentra alrededor de 93.4ºC y la termoestabilidad T50 de la celulasa/glucanasas de T. reesei alrededor de 64.9ºC.

Tabla 4: termoestabilidad wrt de enzimas T. reesei

Temperatura (ºC)

Actividad Residual (%): celulasas/glucanasa T. reesei Actividad Residual (%): β-glucanasa (CEA)

40

97 98

50

96 100 100 99

60

85 83 100 99

70

14 14 98 95

75

0 0 93 96

80

0 0 88 90

85

0 0 89 94

90

0 0 65 64

110

0 0

Ejemplo 8: Mediciones de actividad

Las dos cepas de biblioteca que se identificaron en la viscoselección en el Ejemplo 6, utilizando un Xilano de espelta de avena como un sustrato, se fermentaron en matraces de agitación utilizando el medio GM (las cepas originales 5 se marcaron AD009.21 y AD011.31). Además se incluyó la cepa marcada AD021.B6 (CEA) la cual se identificó en los Ejemplos 4 y 5 para expresar la actividad de β-glucanasa. Se llevaron a cabo varios ensayos y los resultados se muestran adelante. De manera sorprendente las cepas AD009.21 y AD011.31 mostraron poca actividad xilanasa. Por el contrario parece que la AD009.21 y AD011.31 tienen actividad celulasa aunque los clones se identificaron en la viscoselección utilizando xilano de espelta de avena. En particular la βD009.21 es muy activa sobre β-glucano de

10 cebada.

Tabla 5: Fermentación en matraz de agitación de cepas de celulasa: Actividad de xilanasa

(EXU/ml), β-glucanasa (BGU/ml) y celulasa (CXU/ml)

Cepa (y designación de glucanasa)

EXU/ml BGU/ml CXU/ml

AD021.B6 (CEA)

<10 160 524

AD009.21 (CEB)

<10 884 254

AD011.31 (CEC)

<10 <10 7

Los límites de la detección se establecieron por debajo de 10 para los ensayos EXU y BGU, y 5 para el ensayo CXU.

Los análisis de ADN de las cepas AD 009.21 y AD 011.31 (como se describió anteriormente en el Ejemplo 6) mostraron dos nuevas de β-glucanasas, denominadas CEB y CEC. Las secuencias de nucleótido de las regiones de 15 codificación son las SEQ ID Nos. 3 y 5 y las secuencias de aminoácido correspondientes son las SEQ ID Nos. 4 y 6, respectivamente.

La cepa CEB muestra alta actividad de β-glucanasa. La cepa CEA muestra una actividad de celulasa relativamente alta en comparación con la cepa CEB. La relación entre la actividad de la de β-glucanasa y la actividad de la celulasa es diferente para CEA y CEB. La cepa CEC mostró actividad celulasa pero su actividad de β-glucanasa o

20 xilanasa estuvo por debajo de los límites de detección en estos ensayos. Sin embargo, los estudios de homología sugieren fuertemente actividad de β-glucanasa, y se cree que ésta puede ser mucho más alta a diferente pH.

Utilizar más de un sustrato es factible para la selección. De manera sorprendente se notó que en lugar de dos sustratos a la vez, se podrían utilizar tres diferentes sustratos en la viscoselección. Uno de los sustratos fue una impureza de polímero de glucosa, probablemente glucano o material de celulosa. Se mostró que el uso del xilano de espelta de avena, pectina y material similar a celulosa dio como resultado en la identificación de tres tipos de 5 enzimas, xilanasas, pectinasas y celulasas en una ronda de selección. El ensayo viscométrico mantiene una gran ventaja con respecto al ensayo de detección de colorante común. Las bases del ensayo de detección de colorante sobre los colorantes químicamente enlazados a un sustrato. Esta clase de sustrato está comercialmente disponible para solamente unos pocos compuestos. El ensayo viscométrico, sin embargo, puede trabajar con cualquier tipo de sustrato viscoso, aún los naturales que no requieran ningún pre-tratamiento químico. Este aspecto es de importancia

10 ya que, desde un punto de vista comercial e industrial, uno puede seleccionar para actividades de enzima sobre sustratos cuya viscosidad disminuye (es decir, zumos de fruta) o incremento de la viscosidad (es decir, productos lácteos) es de importancia comercial.

Ejemplo 11

Una comparación de algunas de las propiedades moleculares y bioquímicas de las tres glucanasas se provee en las 15 Tablas siguientes.

Glucanasa

Peso Molecular (después de desglicosilación) Longitud (residuos de aminoácido) Actividad Familia No.* pH óptimo pI Temperatura óptima

CEA

43kDa (37 kDa) 335 3.2.1.4 (endoglucanasa) 5 (estructura 3D: barril a8�8 TIM) 4.8 3.3 (4.5+) 85°C

2. CEB

44kDa+ 414 3.2.1.4 (endoglucanasa) 7 (estructura 3D: rollo �gelatina) 4.2 >75°C

CEC

23kDa+ 222 3.2.1.4 (endoglucanasa) 45 (estructura 3D: barril � mezclado) 4.0 >75°C

* Basado en la clasificación glicósido hidrolasa (CAZy) + Predicción de la secuencia de aminoácido

Glucanasa/ Celulasa

Familia Actividades conocidas Actividades conocidas Conclusión

CEA

5 EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.75 EC 3.2.1.58 EC 3.2.1.78 EC 3.2.1.123 celulasa endo 1,6 glucanasa exo 1,3 glucanasa mananasa endoglicoceramidasa Actividad BGU/CXU Considerada improbable

CEB

7 EC 3.2.1.4 EC 3.2.1.91 celulasa celobiohidrolasa Actividad BGU/CXU considerada improbable

CEC

45 EC 3.2.1.4 celulasa Actividad BGU/CXU pero a diferente pH de aquel ensayado

Glucanasa/ Celulasa

Familia 3D Nucleófilo/Donador de Protón Mecanismo

CEA

5 TIM 8 glu/glu reteniendo

CEN

7 Rollo de gelatina glu/glu reteniendo

CEC

45 Barril mezclado asp/asp Invirtiendo

16

Rollo de gelatina glu/glu reteniendo

CEB, CEC son todas las celulasas que exhiben actividad EC 3.2.1.4. Muchas celulasas también pueden hidrolizar enlaces 1,4 en el glucano de cebada que las hace particularmente útiles para ciertas aplicaciones tales como por

5 ejemplo, eliminar factores anti-nutricionales en la alimentación. Como la actividad se midió a través del ensayo de viscosidad es probable que la celulasa exhiba actividad endo. Sin embargo no se puede excluir que también los enlaces 1,3 se hidrolicen. De esta manera, en las observaciones, las actividades EC 3.2.1.73, 3.2.1.39 y 3.2.1.6 no puedan ser descartadas aunque estas actividades se encuentren en la familia 16: las características de las familias 7 y 16 parecen bastante similares.

10 Puramente como explicación, las celulasas (EC 3.2.1.4) son usualmente capaces de catalizar la endo hidrólisis de enlace 1,4-D-glucósido en celulosa. El nombre sistemático de las celulasas es 1,4-(2,3;1,4)-D-glucan 4glucanohidrolasa. La endo-1,4-D-glucanasa y endoglucanasa D son sinónimos de 1,4-(1,3;1,4)-D-glucan 4glucanohidrolasa. La celulasa también puede hidrolizar enlaces 1,4 en D-glucanos que contienen también enlaces 1,3, que los hace particularmente útiles en ciertas aplicaciones tales como por ejemplo la eliminación de los factores

15 anti-nutricionales en la alimentación. Tales enzimas que exhiben actividad endo-glucanasa se denominan en general como glucanasas. Además la hidrólisis del glucano se puede lograr mediante liquenasa (1,3-1,4-D-glucano glucanohidrolasa (EC 3.2.1.73)) y endo-1,3(4)-glucanasa (1,3-(1,3;1,4)-D-glucano 3(4) glucanohidrolasa (EC 3.2.1.6)).

Una revisión de las actividades de celulasa se muestra en la tabla siguiente.

Número EC

Actividad Nombre sistemático Recomendado Sinónimo

3.2.1.4

Endo Hidrólisis del enlace 1,4--Dglucosídico en celulosa. También hidroliza enlaces 1,4en -D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. 1,4-(1,3;1,4)--Dglucano 4glucanohidrolasa celulasa Endo-1,4--Dglucanasa endoglucanasa D

3.2.1.73

Hidrólisis de enlaces 1,4--D-glicosídicos en -D-glucanos que contienen enlaces 1,3 y 1,4. Actúan sobre liqueina y -Dglucanos de cereal, pero no sobre -Dglucanos que contienen solo enlaces 1,3 o solo enlaces 1,4. 1,3-1,4--D-glucano glucanohidrolasa Liquenasa

(continuación)

Número EC

Actividad Nombre sistemático Recomendado Sinónimo

3.2.1.39

Hidrólisis de los enlaces 1,3 -Dglucosídicos en 1,3 -D-glucanos. Actividad limitada sobre los -Dglucanos (1,3-1,4) 1,3--D-glucan glucanohidrolasa Glucano endo-1,3glucosidasa - endo 1,3 -Dglucanasa 1,3 glucanasa Oligo 1,3 glucosidasa

3.2.1.58

Hidrólisis sucesiva de unidades de -Dglucosa de los extremos no reductores de los 1,3-D-glucanos, liberando a-glucosa 1,3--D-glucano glucohidrolasa glucano 1,3glucosidasa - exo -1,3-glucanasa

3.2.1.75

Hidrólisis aleatoria de enlaces 1,6 en 1,6-D-glucosidasas. Actúan sobre lutean, pustulano, 1,6-oligo-D-glucósidos 1,6--D-glucano glucanohidrolasa glucano endo-1,6glucosidasa - endo--1,6-glucanasa -1,6-glucano hidrolasa

3.2.1.6

Endohidrólisis de enlaces 1,3 o 1,4 en -D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor está involucrado en el enlace para ser hidrolizado es en sí mismo sustituido en C-3. Los sustratos incluyen D-glucanos de cereal, laminarina, liquenina 1,3-(1,3;1,4)--Dglucano 3(4) glucanohidrolasa endo-1,3(4)-glucanasa -1,3-glucanasa beta1,3-1 ,4-giucanase endo-,1,3 (4)glucanasa

3.2.1.91

Hidrólisis de enlaces 1,4--D-glucosídicos en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa del extremo no reductor 1,4-D-glucano celobiohidrolasa celulosa 1,4-celobiosidasa exoglucanasa celobiohidrolasa exocelobiohidrolasa

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WO-A-91/14772

Lista de secuencias

<110> DSM NV

<120> BETA GLUCANASA NOVEDOSA

<130> N78454A

<140>

<141>

<150> GB 00302263.9

<151> 2000-03-20

<160> 8

<170> PatentIn version 3.0

<210> 1.

<211> 1008

<212> DNA

<213> Talaromyces emersonii <220>

<221> CDS

<222> (1)..(1008)

<400> 1 55 <210> 2

<211> 335

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 2

<210> 3

<211> 1245

<212> ADN

<213> Talaromyces emersonii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1245)

<400> 3

<210> 4

<211> 414

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 4

<210> 5

<211> 669

<212> ADN

<213> Talaromyces emersonii

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(669)

<400> 5

<210> 6

<211> 222

<212> PRT

<213> Talaromyces emersonii

<400> 6

<210> 7

<211> 28 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 7 10 tatagcgaaa tggattgatt gtacgctc

<210> 8

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido

<400> 8 atccccagca tcattacacc tcagtg

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido aislado, que es una β-glucanasa obtenible de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromices emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende:

   (i)

   la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2; o

   (ii)

   una variante de (i) que es capaz de escindir el β-D-glucano que tiene al menos 80% de identidad sobre la longitud completa de la SEQ ID No. 2

2. 2.

   El polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 en donde la variante (ii) tiene al menos 85% de identidad con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 2

3. 3.

   Un polinucleótido aislado que comprende:

   (a)

   la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID No. 1 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente;

   (b)

   una secuencia que es complementaria a, o que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad, una secuencia como se define en (a) sobre la longitud completa;

   (c)

   una secuencia modificada de la SEQ ID No. 1 con hasta 100 sustituciones de nucleótido que codifican un polipéptido que tiene una actividad β-Glucanasa.

   (d)

   una secuencia que tiene al menos 75%, preferiblemente 80%, de identidad con una secuencia como se definió en (a); o

   (e)

   una secuencia que se degenera como un resultado del código genético con una cualquiera de las secuencias como se definió en (a).

4. 4.

   El polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 3 en donde la secuencia codifica un polipéptido que tiene actividad β-glucanasa.

5. 5.

   El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 4, que es una secuencia de ADN.

6. 6.

   Un vector que comprende una secuencia de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 5.

7. 7.

   El vector de acuerdo a la Reivindicación 6, que es un vector de expresión, tal como cuando una secuencia de ADN de acuerdo con la Reivindicación 6 está enlazado operativamente a una secuencia reguladora

8. 8.

   Una célula anfitriona, que comprende, como una secuencia heteróloga, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 5.

9. 9.

   Una célula anfitriona, que expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2.

10. 10.

    Una célula anfitriona transformada con la secuencia de ADN de la Reivindicación 4 o un vector de la Reivindicación 6.

11. 11.

    Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2, el proceso comprende cultivar una célula anfitriona como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 8 a 10 bajo condiciones que facilitan la expresión del polipéptido.

12. 12.

    El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de hiperlipidemia y/o altos niveles de colesterol y triglicéridos en el suero en un individuo.

13. 13.

    Un método para identificar un compuesto que modula la actividad de β-glucanasa, el método comprende poner en contacto un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 2 con un compuesto de prueba y el seguimiento de la actividad de β-glucanasa.

14. 14.

    Una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2.

15. 15.

    La composición de acuerdo con la Reivindicación 14, que comprende además un polipéptido que tiene actividad de celulasa, endo-arabinasa, ramnogalacturonasa o poligalacturonasa.

16. 16.

    Un método para tratar material vegetal, el método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 14 o Reivindicación 15.

17. 17.

    Un método de acuerdo con la Reivindicación 16 en donde el tratamiento comprende degradar o modificar la celulosa, tal como β-glucano, en el material vegetal

18. 18.

    Un método de acuerdo con la Reivindicación 17 para degradar o modificar las paredes de la célula vegetal

19. 19.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 16 a 18 en donde el tratamiento comprende la escisión de las subunidades de glucosa de un componente de β-D-glucano del material.

20. 20.

    Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 16 a 18 en donde el material comprende una planta, una pulpa de planta, extracto de planta o un alimento comestible o ingrediente del mismo, o una tela, textil o ropa que contienen material vegetal.

21. 21.

    Un método para reducir la viscosidad del material vegetal, el método comprende poner en contacto el material vegetal con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 14 o Reivindicación 15 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para degradar la celulosa contenida en el material

22. 22.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 14 o la Reivindicación 15 en un método para tratar el material vegetal.

23. 23.

    Uso de acuerdo con la Reivindicación 22 en donde el tratamiento comprende escindir los polímeros de β-Dglucano en el material vegetal

24. 24.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 14 o la Reivindicación 15 en un método de procesamiento de pulpa, jugo o extracto de planta cuyo método comprende incubar la pulpa, jugo o extracto con el polipéptido o composición a por lo menos celulosa parcialmente degradada.

25. 25.

    Un alimento (animal) que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a

26. 2.

27. 26.

    Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2 en preparación de cerveza, destilación, biometanación, higiene dental, tratamiento de cuero, manufactura de papel, tratamiento o manufactura textil, horneado o elaboración de pan, lavado o tratamiento con detergente, tratar bulbos de flores o en alimento animal.

28. 27.

    Un alimento o producto alimenticio que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 2.

29. 28.

    Un alimento o producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 27, que es una bebida alcohólica, pan, masa o té.

30. 29.

    Un organismo de planta transgénica que comprende una célula de acuerdo con la Reivindicación 9 o 10.