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ES2292103T3 - Formulacion liquida de eritropoyetina. - Google Patents

Formulacion liquida de eritropoyetina. Download PDF

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ES2292103T3
ES2292103T3 ES05707735T ES05707735T ES2292103T3 ES 2292103 T3 ES2292103 T3 ES 2292103T3 ES 05707735 T ES05707735 T ES 05707735T ES 05707735 T ES05707735 T ES 05707735T ES 2292103 T3 ES2292103 T3 ES 2292103T3
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ES
Spain
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formulation according
formulation
erythropoietin
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concentration
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ES05707735T
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Christof Schumann
Jan-Ole Hesse
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Bioceuticals Arzneimittel AG
Original Assignee
Bioceuticals Arzneimittel AG
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Abstract

Formulación líquida de eritropoyetina estable durante el almacenamiento que (i) contiene al menos cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico y fenilalanina (ii) está exenta de conservantes, urea y HSA y (iii) no se ha reconstituido a partir de un liofilizado.

Description

Formulación líquida de eritropoyetina.
La presente invención se refiere a formulaciones líquidas de eritropoyetina estables durante el almacenamiento y a procedimientos para su preparación. En especial, la invención se refiere a formulaciones líquidas de eritropoyetina que contienen al menos cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico y fenilalanina y en las cuales se puede prescindir de la adición de conservantes, urea o albúmina sérica humana.
La eritropoyetina, denominada abreviadamente EPO, es una glucoproteína que estimula la formación de eritrocitos en la médula ósea. La EPO se forma principalmente en los riñones y alcanza desde allí su destino a través de la circulación. En el caso de insuficiencia renal, los riñones dañados producen demasiado poca o absolutamente nada de EPO, lo que da como resultado que se produzcan demasiados pocos eritrocitos a partir de las células madre de la médula ósea. Esta anemia real puede tratarse mediante la administración de EPO en cantidades fisiológicas, que estimulan la formación de eritrocitos en la médula ósea. La EPO que se usa para la administración se puede obtener a partir de orina humana o mediante procedimientos de ingeniería genética. Dado que la EPO está contenida en el cuerpo humano únicamente en escasas trazas, el aislamiento de EPO a partir de la fuente natural es prácticamente imposible para las aplicaciones terapéuticas. Por lo tanto, los procedimientos de ingeniería genética ofrecen la única posibilidad rentable de producir esta sustancia en cantidades mayores.
La fabricación recombinante de eritropoyetina es posible desde la identificación del gen de la eritropoyetina humana en el año 1984. Desde principios de los años 90 se han desarrollado varios fármacos que contienen eritropoyetina humana que se ha producido por medio de ingeniería genética en células eucariotas, sobre todo en células CHO (ovario de hámster chino, chinese hamster ovary). La fabricación de eritropoyetina recombinante humana se describe, por ejemplo, en EP-A-0148605 y EP-A-205564.
La EPO se formula normalmente en forma líquida y se inyecta como tal por vía intravenosa o subcutánea. No obstante, en el caso de la formulación líquida de EPO surgen problemas en lo que respecta a la estabilidad. Estos se deben posiblemente a una destrucción de las moléculas de eritropoyetina a través de efectos catalíticos de la superficie de los recipientes que sirven para la conservación. Además se sospecha que se produce una adsorción de las moléculas de EPO en las paredes del recipiente y con ello se da una pérdida de proteína y de actividad. Por lo tanto, en el pasado se han realizado distintos intentos de estabilizar formulaciones líquidas de EPO mediante la adición de diferentes sustancias. A estos compuestos estabilizantes pertenecen, por ejemplo, sustancias poliméricas como polietilenglicol, dextranos y gelatinas, así como diferentes azúcares y alcoholes de azúcares, sales inorgánicas y compuestos de tiol. A menudo se añaden también proteínas séricas como albúmina sérica humana (HSA). El uso de estas proteínas séricas no es deseable sin embargo desde el punto de vista alergénico e inmunológico.
En EP-A-0306824 se describe el uso de diferentes aminoácidos como estabilizantes en formulaciones de EPO, utilizándose los aminoácidos junto con urea para la estabilización de la EPO. Para ello, el almacenamiento de las formulaciones descritas en EP-A-0306824 no se produce en forma líquida, sino como liofilizado, que se reconstituye con agua inmediatamente antes de la aplicación.
En EP-A-0607156 se describen formulaciones de EPO que son estables y conservables gracias a la presencia de un conservante.
Es un objeto de la presente invención preparar una preparación de EPO estable durante el almacenamiento que se pueda almacenar en forma líquida durante un tiempo prolongado y que no necesite de aditivos tales como HSA, urea o conservantes. De esta forma se debe preparar una formulación líquida de EPO estable que evite en lo posible cualquier riesgo para la tolerabilidad de la formulación.
Este objetivo se consigue según la invención mediante el objeto de la reivindicación 1. En las reivindicaciones subordinadas se definen formas de realización preferidas.
Se ha descubierto que composiciones de EPO que contienen una determinada combinación de aminoácidos, incluso en ausencia de HSA, urea o estabilizantes poliméricos se pueden almacenar de forma estable en forma líquida durante un tiempo prolongado sin que se produzcan pérdidas de estabilidad significativas.
La presente invención se refiere por lo tanto a una formulación líquida de eritropoyetina que
(i) contiene al menos cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico y fenilalanina
(ii) está exenta de conservantes, urea y proteínas séricas y
(iii) no se ha reconstituido a partir de un liofilizado.
En una forma de realización especialmente preferida está contenido adicionalmente el aminoácido glicina.
La formulación líquida según la invención no sólo ofrece la ventaja de que prescinde de compuestos potencialmente inmunogénicos y en conjunto contiene una cantidad lo más pequeña posible de clases de compuestos distintas, sino que tampoco requiere en ninguna fase de la preparación una liofilización. Gracias a esto se ahorran por una parte los costes asociados a una liofilización y por otra se evitan los riesgos de problemas mecánicos, por ejemplo, si el liofilizado no se puede reconstituir de forma completa o suficiente.
Con el término "estable durante el almacenamiento", se entiende en el marco de la invención que el contenido en moléculas de EPO activas después de tres meses de almacenamiento de la formulación líquida de EPO a 25ºC asciende todavía al 80% o más de la concentración de partida, Preferiblemente, el contenido restante de actividad de EPO después de tres meses de almacenamiento a 25ºC asciende todavía al 85%, aún más preferiblemente al menos al 90% y de la forma más preferida, al menos al 95% de la actividad de partida. La actividad de la eritropoyetina se puede determinar por medio de ensayos de actividad habituales, como ya se han descrito para la EPO en el estado de la técnica, véase para completar también la farmacopea europea, 01/2002:1316 (4a. edición).
Con el término "formulación líquida", en el marco de la invención se entiende que la formulación de eritropoyetina junto con el resto de las sustancias contenidas en la formulación no se liofiliza en ninguna fase del procedimiento de preparación, es decir ni antes ni durante ni después de la mezcla de las sustancias y la formulación está prevista para la administración por vía intravenosa o subcutánea como solución de inyección o infusión.
La formulación según la invención no contiene ningún aminoácido que no sea leucina, isoluecina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico, fenilalanina o glicina. Preferiblemente, la formulación no contiene ningún otro aminoácido que no sea leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y glicina. En especial, la formulación de EPO según la presente invención no contiene ningún aminoácido acético. La obligatoria ausencia de proteínas séricas u otras proteínas estabilizantes, de urea y conservantes en la formulación según la invención ya se ha comentado anteriormente.
La concentración de isoleucina y leucina, siempre que estos aminoácidos estén contenidos en la formulación, asciende respectivamente a 0,25 a 1,5 g/l, preferiblemente 0,5 a 1,25 g/l y con especial preferencia 1,0 g/l.
La concentración de ácido glutámico y ácido aspártico, siempre que estos aminoácidos estén contenidos en la formulación, asciende respectivamente a 0,1 a 0,5 g/l, preferiblemente 0,2 a 0,4 g/l y con especial preferencia 0,25 g/l.
La concentración de treonina, siempre que este aminoácido esté contenido en la formulación, asciende a 0,1 a
0,5 g/l, preferiblemente 0,2 a 0,4 g/l y con especial preferencia 0,25 g/l.
La concentración de fenilalanina, siempre que este aminoácido esté contenido en la formulación, asciende a 0,2 a 1,0 g/l, preferiblemente 0,3 a 0,8 g/l y con especial preferencia 0,5 g/l.
La concentración de glicina, siempre que este aminoácido esté contenido en la formulación, asciende a 2,0 a
10,0 g/l, preferiblemente 5,0 a 8,0 g/l y con especial preferencia 7,5 g/l.
La eritropoyetina que es adecuada para su uso en las formulaciones según la invención es eritropoyetina recombinante, preparada en células eucariotas. La eritropoyetina recombinante se prepara preferiblemente en células de mamífero, con especial preferencia en células CHO, como se describe por ejemplo en EP-A-0205564 y EP-A-0148605. Tras la fermentación, que se lleva a cabo siguiendo protocolos convencionales, tiene lugar una purificación de la eritropoyetina recombinante por medio de procedimientos cromatográficos. Tanto la fermentación como la purificación de la proteína se han descrito igualmente en el estado de la técnica, por ejemplo en EP-A-0830376. La purificación de eritropoyetina también es objeto de EP-A-0228452, EP-A-0428267 y WO-A-03/045996. También se pueden aplicar no obstante otras técnicas y procesos de purificación convencionales.
Por "eritropoyetina", en el marco de la invención se entiende toda aquella proteína que es capaz de estimular la formación de eritrocitos en la médula ósea y que se puede identificar de forma inequívoca como eritropoyetina según el ensayo descrito en la farmacopea europea (Ph. Eur.; 01/2002:1316) (determinación de la actividad en ratones policitémicos o normocitémicos). En el caso de la eritropoyetina se puede tratar de la eritropoyetina humana de tipo natural o de una variante de la misma con una o varias sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. De la misma forma, en el caso de la eritropoyetina contenida en la presente invención se puede tratar de un conjugado en el que la proteína esté presente en forma conjugada, por ejemplo con polímeros como por ejemplo polialquilenglicoles, la llamada eritropoyetina pegilada.
En una forma de realización preferida, la formulación según la invención no contiene ni azúcares ni alcoholes de azúcares para la estabilización. También se prefiere que la formulación no contenga ningún compuesto polimérico como estabilizante. La formulación está además exenta de conservantes, entendiéndose en este sentido sustancias que normalmente se utilizan como conservantes para aumentar la capacidad de conservación y funcionan como bactericidas en las concentraciones normales para ello. En especial, la formulación no contiene ningún conservante como cloroetano, alcohol bencílico, p-cloro-m-cresol y dialquiléster de ácido pirocarbónico y cloruro de benzalconio.
El valor de pH de la formulación no se encuentra demasiado por encima del valor de pH de la sangre, es decir, a ser posible no por encima de 7,4. El valor de pH de la formulación asciende por lo general a entre 6,0 y 7,4, preferiblemente entre 6,5 y 7,4, y de forma especialmente preferida entre 7,0 y 7,4. El valor de pH, en caso de que sea necesario un ajuste en el intervalo de pH pretendido, se ajusta mediante disolventes adecuados, cuando se pretende reducir el valor de pH, con soluciones ácidas y cuando se debe alcanzar un aumento, con soluciones básicas. Preferiblemente, el valor de pH se ajusta con HCl o NaOH.
Como disolvente se usa preferiblemente agua pura para inyección. No obstante, también se pueden utilizar otros disolventes adecuados y habituales para preparaciones farmacéuticas.
En el caso del tampón utilizado se puede tratar de cualquier tampón fisiológicamente compatible, que permita tamponar concentraciones necesarias en las soluciones de inyección o infusión en el intervalo de pH mencionado anteriormente. Son tampones adecuados, por ejemplo, fosfato, citrato, carbonato y HEPES. Se prefiere el uso de un tampón fosfato. El compuesto o compuestos de tampón se utilizan en una concentración de aproximadamente 20 a 100 mM, preferiblemente de 30 a 80 mM y con especial preferencia de 40 a 60 mM.
Como otros componentes, la formulación según la invención contiene en una forma de realización preferida un agente tensiactivo. El uso de un detergente debe disminuir la adsorción de EPO a las paredes del recipiente. Para esto normalmente son suficientes pequeñas cantidades de un detergente. En principio, en el marco de la invención se puede utilizar cualquier detergente fisiológicamente compatible. Son especialmente adecuados alquiléster de polioxietilensorbitán u oleato de sorbitán, siendo especialmente preferidos los alquilésteres de polioxietilensorbitán. En el caso de los alquilésteres de polioxietilensorbitán se trata preferiblemente de polisorbato 20 y/o porlisorbato 80, siendo el más preferido polisorbato 20. La concentración del detergente asciende a entre 0,01 y 1,0 g/l, preferiblemente entre 0,05 y 0,2 g/l, y de la forma más preferida 0,1 g/l.
Además, en formas de realización preferidas, la formulación contiene pequeñas cantidades de un formador de complejos fisiológicamente compatible. En el caso del formador de complejos se trata por ejemplo de sales de calcio, citrato o EDTA. En el marco de la invención se prefieren especialmente sales que contienen calcio, como por ejemplo cloruro de calcio. La concentración de la sal de calcio asciende a entre 0,005 g/l y 0,05 g/l, preferiblemente entre 0,008 y 0,012 g/l y con especial preferencia, 0,01 g/l.
Para ajustar la osmolalidad, se puede emplear cualquier sal adecuada. A este respecto se usa preferiblemente cloruro de sodio. En este sentido, la concentración del cloruro de sodio se encuentra en el intervalo de 0,5 a 2,5 g/l, preferiblemente entre 1,0 y 2,0 g/l y con especial preferencia entre 1,3 y 1,6 g/l.
La osmolalidad de la formulación líquida asciende a 200 a 400 mosmol/kg, preferiblemente 250 a 300 mosmol/kg y de la forma más preferida 260 a 290 mosmol/kg.
Una forma de realización preferida de la invención prevé una formulación líquida de EPO que además del principio activo EPO contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y glicina, así como cloruro de calcio, polisorbato, tampón fosfato y cloruro de sodio, no estando presente ningún otro componente.
La eficacia de la eritropoyetina empleada no debería estar por debajo de 100.000 UI/mg, (véase también la farmacopea europea, 01/2002:1316, 4a. edición). La EPO tiene preferiblemente una actividad de al menos 110.000 UI/mg, con especial preferencia de al menos 120.000 UI/mg.
La concentración de eritropoyetina se rige por la concentración de principio activo deseada correspondiente en la inyección preparada. Las concentraciones de EPO típica se encuentran entre 1500 UI/ml y 40.000 UI/ml, véanse por ejemplo los productos comerciales NeoRecormon® y Erypo® en LISTA ROJA 2004.
Los componentes de la formulación se pueden obtener de fuentes habituales, por ejemplo de la empresa Sigma o de la empresa Merck.
La preparación de la formulación se puede llevar a cabo según procedimientos habituales en el estado de la técnica.
La invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de la formulación líquida de EPO según la invención. A este respecto se disuelven los componentes de la formulación anteriormente mencionados en un tampón acuoso. En el caso del tampón acuoso se trata, como se ha mencionado anteriormente, preferiblemente de un tampón fosfato.
En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención para la preparación de la formulación líquida, en primer lugar se dispone en disolvente, preferiblemente agua para inyección y a continuación se disuelven en el disolvente dihidrógenofosfato de sodio-dihidratado y dihidrógenofosfato de disodio-dihidratado como tampón, cloruro de calcio, cloruro de sodio, y los aminoácidos utilizados, tratándose preferiblemente de glicina, leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico y fenilalanina. Tras la disolución completa de los componentes se añade una solución de polisorbato (en el disolvente correspondiente). A continuación, en la siguiente etapa se añade una solución de eritropoyetina (en el disolvente correspondiente).
Durante la preparación y al final de la preparación se determina el valor de pH de la solución y, en caso de que sea necesario se corrige en el intervalo entre 7,0 y 7,4, utilizando soluciones adecuadas, en especial NaOH ó HCl.
Finalmente, la formulación líquida preparada se envasa en un recipiente adecuado, en el que se almacena hasta su administración. En el caso del recipiente se trata especialmente de inyecciones listas para su uso, botellas transparentes o ampollas.
Los siguientes ejemplos deben explicar la invención sin limitarla.
Ejemplos 1. Formulación líquida de eritropoyetina Preparación de una formulación líquida de eritropoyetina con una potencia de principio activo de 3.333 UI/ml
1
Todos los componentes presenten una calidad según la farmacopea europea (Ph. Eur.).
2. Preparación de una formulación líquida para eritropoyetina con una potencia de principio activo de 10.000 UI/ml
Las cantidades de los componentes individuales por inyección preparada corresponden, a excepción de la cantidad de eritropoyetina, a las del ejemplo 1. La cantidad de eritropoyetina asciende en este caso a 10.000 UI/ml.
Las formulaciones se envasan en inyecciones de vidrio y se almacenan como inyecciones listas para su uso.
3. Preparación de una formulación líquida de EPO con un tamaño de preparación de un litro
En el caso ilustrativo de un tamaño de preparación de 1 l, un contenido ilustrativo de proteína de 1.000 \mug/ml y una actividad de 130.000 UI/mg de proteína resulta la composición descrita en la tabla a continuación (densidad asumida del principio activo a granel: 1,008 g/l).
A este respecto se prepara una solución de principio activo que contiene eritropoyetina, dihidrógenofosfato de sodio-dihidratado y monohidrógenofosfato de sodio-dihidratado, cloruro de sodio y agua, cuya composición influye también en el cálculo de las cantidades que se van a pesar de los respectivos componentes.
3
4. Procedimiento para la preparación de la formulación líquida de EPO
Se dispone el 80% del agua para inyección en el recipiente de preparación. Se controla la temperatura del agua, que debe ser menos de 25ºC. A continuación se lleva a cabo, con agitación suave y en atmósfera protectora de nitrógeno la adición de las cantidades pesadas correspondientes según la composición mencionada anteriormente: dihidrógenofosfato de sodio-dihidratado, hidrógenofosfato de disodio-dihidratado, cloruro de calcio, glicina, leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y cloruro de sodio. La solución se agita hasta que todos los componentes se han disuelto completamente, al menos 15 minutos. A continuación se añade el polisorbato 20 en forma de una solución preparada por separado en agua para inyección en el recipiente de preparación. La solución se agita al menos durante 15 minutos.
Para el ajuste del pH se comprueba en el recipiente de preparación la temperatura y el valor de pH de la preparación. La temperatura debe encontrarse entre 18 y 25ºC. El valor de pH debe encontrarse en un intervalo de 7,0-7,4. En caso de que el valor de pH se encuentre por encima de 7,4, se ajusta con ácido clorhídrico 0,1 n. En caso de que el valor de pH se encuentre por debajo de 7,0, la corrección se realiza con solución de hidróxido de sodio 0,1 n. Se agita la solución durante 10 minutos en el recipiente de preparación.
Después del ajuste del valor de pH, se añade la cantidad correspondiente de la proteína eritropoyetina en el recipiente de preparación.
Se comprueba de nuevo la temperatura (debe estar entre 18 y 25ºC) y el valor de pH de la preparación. En caso de que el valor de pH se encuentre por encima de 7,4 o por debajo de 7,0, se corrige con ácido clorhídrico 0,1 n o solución de hidróxido de sodio 0,1 n, respectivamente.
La solución se envasa en recipientes de preparación con agua para inyección hasta el peso final calculado y a continuación se agita durante al menos 15 minutos. Dado el caso, el valor de pH se debe corregir otra vez como se ha descrito anteriormente en el intervalo entre 7,0 y 7,4. La formulación líquida de EPO preparada se envasa en inyecciones listas pasa su uso, que se sellan con émbolos tras el envasado.
5. Estabilidad a largo plazo de las formulaciones de EPO según la invención
La estabilidad a largo plazo de las formulaciones de EPO según la invención se comprobó en comparación con el patrón BRP como referencia. El ensayo se basa en el hecho de que, cuando se almacenan soluciones de EPO aparecen reacciones de degradación y secundarias, que puede conducir entre otros a la oxidación de cadenas laterales de metionina y cisteína. En especial, la Met54 de EPO se oxida con la formación del correspondiente sulfóxido. Este sulfóxido de metionina puede detectarse tras la digestión proteica de la EPO con tripsina mediante un análisis de HPLC-rp. La proporción de la especie de metionina oxidada es, en este sentido, un indicador de la estabilidad a largo plazo, es decir, cuanto mayor sea la proporción, menor es la estabilidad a largo plazo, La determinación de la proporción de la especie de metionina oxidada en las formulaciones según la invención a diferentes temperaturas de almacenamiento (2-8ºC, 25ºC y 40ºC) y diferentes periodos de almacenamiento (6 semanas, 12 semanas y 6 meses) en comparación con formulaciones del estado de la técnica mostró que las formulaciones según la invención presentan una estabilidad que es comparable con las formulaciones del estado de la técnica.

Claims (19)

  1. \global\parskip0.940000\baselineskip
    1. Formulación líquida de eritropoyetina estable durante el almacenamiento que
    (i)
    contiene al menos cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico y fenilalanina
    (ii)
    está exenta de conservantes, urea y HSA y
    (iii)
    no se ha reconstituido a partir de un liofilizado.
  2. 2. Formulación según la reivindicación 1, que además contiene glicina.
  3. 3. Formulación según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende adicionalmente un detergente no iónico.
  4. 4. Formulación según la reivindicación 3, en la que en el caso del detergente se trata de un alquiléster de polioxietilensorbitán.
  5. 5. Formulación según la reivindicación 4, en la que en el caso del alquiléster de polioxietilensorbitán se trata de polisorbato 20 o polisorbato 80.
  6. 6. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la osmolalidad asciende a 250 mosmol/kg hasta 300 mosmol/kg.
  7. 7. Formulación según la reivindicación 6, en la que la osmolalidad se ajusta con cloruro de sodio.
  8. 8. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 7, que contiene adicionalmente un tampón fisiológicamente compatible.
  9. 9. Formulación según la reivindicación 8, en la que el tampón es un tampón fosfato.
  10. 10. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el valor de pH se encuentra entre 7,0 y 7,4.
  11. 11. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 10, que contiene adicionalmente iones de calcio.
  12. 12. Formulación según la reivindicación 11, en la que los iones de calcio provienen de cloruro de calcio.
  13. 13. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la concentración de isoleucina y leucina, siempre que estén contenidas, asciende respectivamente a 0,25 a 1,5 g/l.
  14. 14. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la concentración de ácido glutámico y ácido aspártico, siempre que estén contenidos, asciende a 0,1 a 0,5 g/l.
  15. 15. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la concentración de treonina, siempre que esté contenida, asciende a 0,1 a 0,5 g/l.
  16. 16. Formulación según una de las reivindicaciones 1 a 15, en la que la concentración de fenilalanina, siempre que esté contenida, asciende a 0,2 a 1,0 g/l.
  17. 17. Formulación según una de las reivindicaciones 2 a 16, en la que la concentración de glicina, siempre que esté contenida, asciende a 2,0 a 10,0 g/l.
  18. 18. Procedimiento para la preparación de una formulación líquida de eritropoyetina estable durante el almacenamiento que comprende: disolver los componentes eritropoyetina, los aminoácidos leucina, isoleucina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y glicina así como cloruro de calcio, alquiléster de polioxietilensorbitán, cloruro de sodio en un tampón acuoso, en el que la formulación no se liofiliza en ninguna fase del procedimiento y la formulación está exenta de urea.
  19. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que los componentes se disuelven en el siguiente orden:
    a)
    cloruro de calcio
    b)
    cloruro de sodio
    c)
    leucina, isoluecina, treonina, ácido glutámico, fenilalanina y glicina
    d)
    alquiléster de polioxietilensorbitán y
    e)
    eritropoyetina.
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