ES2274649T3

ES2274649T3 - Influencia sobre la angiogenesis mediante cd66a.

Info

Publication number: ES2274649T3
Application number: ES99960927T
Authority: ES
Inventors: Christoph Wagener; Suleyman Ergun
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: EP1133311B1; DE19852804C1; WO2000029015A2; JP2002529516A; WO2000029015A3; CA2351585A1; EP1133311A2; DE59913915D1; ATE342063T1

Abstract

Uso de una o varias sustancias para la preparación de una composición farmacéutica para influir sobre la angiogénesis, en el que las sustancias comprenden: (a) para la regulación positiva: CD66a, fragmentos de CD66a o glicoestructuras derivadas de CD66a, o ligandos de CD66a, así como ADN que codifica CD66a, isoformas de CD66a o fragmentos de CD66a que inducen la expresión de CD66a o del ligando de CD66a, o (b) para la regulación negativa anticuerpos que se unen específicamente a uno o varios de los dominios funcionales de CD66a o sus ligandos, u oligonucleótidos antisentido o ARN antisentido que inhiben la expresión de CD66a o del ligando de CD66a.

Description

Influencia sobre la angiogénesis mediante CD66a.

La invención se refiere a una composición farmacéutica para influir sobre la angiogénesis. En un caso, puede potenciarse la angiogénesis mediante la administración de CD66a o sustancias que inician la formación de CD66a, mientras que en otro caso puede inhibirse la angiogénesis mediante el uso de sustancias que reducen la interacción entre CD66a y ligandos de CD66a.

La formación de vasos sanguíneos (angiogénesis) es una etapa importante para muchas enfermedades, que por una parte puede contribuir a la curación, pero también en otros casos es deseable evitar. Es muy deseable una potenciación de la angiogénesis, por ejemplo, para enfermedades cardiocirculatorias, por ejemplo, para el tratamiento de angina de pecho o infartos cardiaco o cerebral. Por otro lado, la inhibición del abastecimiento de vasos a tumores sólidos malignos en hombres y animales es un enfoque prometedor en la terapia tumoral. Los inhibidores de la angiogénesis como, por ejemplo, endostatina, atacan directamente a células endoteliales normales y, por tanto genéticamente estables, de los vasos sanguíneos que abastecen un tumor, las eliminan, y evitan así el abastecimiento de células tumorales con sangre que contiene nutrientes (véase Kerbel, R., Nature, 390, pág. 335 y siguientes, 1997). De esta manera, se llega a una regresión de los vasos sanguíneos y la masa tumoral. Ya que las células endoteliales, en contraposición con las células tumorales, son genéticamente estables, no se llega a la formación de resistencias, como es el caso, por ejemplo, en la terapia cistostática dirigida directamente a células tumorales. Mediante la inhibición de la angiogénesis, puede bloquearse en modelos experimentales el crecimiento de tumores humanos. Mientras tanto, se han encontrado algunos inhibidores de la angiogénesis en ensayos clínicos (véase Hanahan y col., Cell 86, 353-364
(1996)).

El abastecimiento de tejidos con nuevos vasos es un proceso complejo en el que participan una pluralidad de biomoléculas. Los tumores producen, por ejemplo, mediadores solubles que inician la formación de nuevos vasos. En el desarrollo posterior de la angiogénesis, las moléculas de adhesión desempeñan un papel crucial, controlan la comunicación de las células de vasos entre sí y con el tejido conectivo circundante. Finalmente, participan en la neoformación de vasos también distintas proteinasas.

La presente invención se basa en el objetivo de proporcionar la posibilidad de poder potenciar o inhibir la angiogénesis, según sea necesario. En caso de inhibición de la angiogénesis, debe proporcionarse por tanto una forma de terapia de cáncer sin desarrollo de resistencias, es decir, debe intervenirse especialmente sobre la angiogénesis concomitante en un tumor en el sentido de una reducción o inhibición.

Según la invención, se consigue este objetivo mediante los objetos de las reivindicaciones.

Es objeto de la presente solicitud especialmente el uso de determinadas sustancias para la preparación de una composición farmacéutica que es adecuada para la regulación de la angiogénesis. Las sustancias comprenden:

(a) para la regulación positiva:

CD66a, fragmentos de CD66a o de glicoestructuras derivadas de CD66a, o ligandos de CD66a, así como ADN que codifica CD66a, isoformas de CD66a o fragmentos de CD66a, que inducen la expresión de CD66a o del ligando de CD66a, o

(b) para la regulación negativa

anticuerpos que se unen específicamente a uno o varios de los dominios funcionales de CD66a o sus ligandos, u oligonucleótidos antisentido o ARN antisentido que inhiben la expresión de CD66a o del ligando de CD66a.

La proteína CD66a, que también se designa como glicoproteína biliar (BGP), "antígeno carbonembriónico transmembrana" o C-CAM humana, es una molécula de adhesión especial. En adelante, se usa la referencia CD66a. El gen que codifica CD66a se ha clonado ya (Hinoda y col., PNAS 85, 6969-6963, 1988). Los solicitantes de la presente solicitud describieron ya en 1991 el anticuerpo monoclonal específico de CD66a único en el mundo (Drzeniek y col., Cancer Letters 56, 173-179 (1991); Stoffel y col., J. Immunol. 150, 4978-4984 (1993)). Este anticuerpo se designa como 4D1/C2 y se depositó el 22 de octubre de 1998 en la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (colección alemana de microorganismos y cultivos celulares), Mascheroder Weg, Braunschweig, con el número de depósito DSM ACC2371.

Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que el factor CD66a se expresa en capilares tumorales, mientras que los vasos sanguíneos del correspondiente tejido normal son negativos.

En un tumor de células de Leydig humano, pueden seguirse exactamente los estados individuales de neoformación de vasos. En este sentido, se ha encontrado que determinados estados de la neoformación de vasos pueden correlacionarse con la aparición de los siguientes factores:

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1. Proliferación de células endoteliales: VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), receptores de VEGF

2. Formación de lúmenes de vasos: CD66a

3. Siguiente etapa de diferenciación: endostatina

4. Siguiente etapa de diferenciación: angiostatina.

En los primeros ensayos de los inventores con embriones de pollo pudo demostrarse que la CD66a es un potente factor angiogenético y potencia la neoformación de vasos en tejidos normal y tumoral.

Pudo mostrarse igualmente que mediante un anticuerpo dirigido contra CD66a se producía el bloqueo de CD66a y se inhibía la formación de capilares, que es necesaria para el crecimiento tumoral. Ya no puede tener lugar ningún crecimiento tumoral.

La CD66a puede detectarse en tumores humanos en vasos sanguíneos formados de nuevo (capilares) en una ventana de diferenciación definida, concretamente, en el estado de formación de lumen. En un modelo de diferenciación in vitro, un anticuerpo monoclonal de CD66a inhibe la formación de tubos de vasos (tube formation) mediante células endoteliales humanas. Estos resultados apoyan que la CD66a desempeña un papel esencial en la angiogénesis. A partir de la expresión de CD66a en vasos tumorales y la inhibición de la formación de estructuras capilares in vitro mediante un anticuerpo monoclonal de CD66a, se deduce que la angiogénesis tumoral puede inhibirse mediante el bloqueo funcional de CD66a.

Los ensayos con transfectomas han mostrado que la CD66a se une a sí misma (unión homotípica) y a otro miembro de la familia de CD66. La localización de CD66a en endotelio formado de nuevo en el polo celular basal, así como la inhibición de la formación de capilares, es un indicio de que la CD66a interacciona con componentes de la matriz extracelular.

Para la inhibición pretendida por una parte según la invención de CD66a, son especialmente adecuados anticuerpos que se unen específicamente a uno o varios de los dominios funcionales de CD66a o sus ligandos. Se prefiere usar anticuerpos monoclonales que están dirigidos contra dominios adhesivos funcionales significativos de CD66a. Además, CD66a posee glicoestructuras que pueden ser angiogenéticamente activas como, por ejemplo, grupos LewisX y sialil-LewisX. Preferiblemente, se usa el anticuerpo monoclonal de CD66a ya citado anteriormente 4D1/C2. De esta manera, se llega a una inhibición de la angiogénesis tumoral mediante una inactivación funcional de CD66a. La inactivación funcional de CD66a se realiza a este respecto mediante inhibición de la interacción entre CD66a y posibles ligandos. En este momento, se bloquean estructuras que median la interacción. Además, pueden utilizarse también ligandos solubles o dominios de ligando solubles para bloquear la interacción. La invención se refiere también al uso de dominios recombinantes que corresponden a un fragmento de CD66a, así como a fragmentos de anticuerpos que reaccionan esencialmente con el epítopo de CD66a. De esta manera, se bloquea la cascada de señales procedente de CD66a. Los compuestos utilizados pueden modificarse también de modo adecuado de modo que, por ejemplo, se unan irreversiblemente al receptor.

Para la potenciación pretendida por otra parte según la invención de la angiogénesis, son especialmente adecuados CD66a en forma de molécula entera, dominios de CD66a, así como glicoestructuras específicas de CD66a. En estos casos, se administra la forma molecular soluble a lugares del cuerpo en los que debe provocarse la angiogénesis (por ejemplo, en músculo cardiaco). Además, puede encontrar uso también un ADN que codifica CD66a o partes de la proteína CD66a. El ADN puede estar también integrado en vectores que son convencionales en la terapia génica (por ejemplo, adenovirus). También mediante la adición de ADN de plásmido sencillo, puede conseguirse una síntesis de la proteína. La influencia positiva sobre la angiogénesis se produce mediante una potenciación de las interacciones entre CD66a y ligandos de CD66a.

Los procedimientos para la obtención de los anticuerpos anteriormente citados, que pueden utilizarse para la inhibición de la angiogénesis, son conocidos por el experto y comprenden, por ejemplo, respecto a anticuerpos policlonales, el uso de CD66a o un fragmento del mismo como inmunógeno para inmunización de animales adecuados y la obtención de suero. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos monoclonales son igualmente conocidos por el experto. Para ello, se producen, por ejemplo, híbridos celulares de células productoras de anticuerpos y células tumorales de médula ósea (células de mieloma), y se clonan. A continuación, se selecciona un clon que produce un anticuerpo que es específico de CD66a. Este anticuerpo se prepara después según procedimientos convencionales. Son ejemplos de células que producen anticuerpos células de bazo, células de nódulos linfáticos, linfocitos B, etc. Son ejemplos de animales que pueden inmunizarse con este fin ratones, ratas, caballos, cabras y conejos. Las células de mieloma pueden obtenerse a partir de ratones, ratas, hombres u otras fuentes. La fusión celular puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el procedimiento general conocido de Köhler y Milstein. Los hibridomas obtenidos mediante fusión celular se analizan mediante CD66a según el procedimiento de enzima-anticuerpo o según un procedimiento similar. Se obtienen clones, por ejemplo, con el procedimiento de dilución límite. Los clones obtenidos se implantan por vía intraperitoneal en ratones BA-LB/c, después de 10 a 14 días se extrae el fluido ascítico del ratón, y se purifica el anticuerpo monoclonal mediante procedimientos conocidos (por ejemplo, fraccionamiento con sulfato de amonio, fraccionamiento con PEG, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de afinidad). El anticuerpo obtenido puede usarse directamente o puede usarse un fragmento del mismo. A este respecto, el término "fragmento" significa todas las partes del anticuerpo (por ejemplo, fragmentos Fab, Fv o "Fv monocatenario") que presentan la misma especificidad de epítopo que el anticuerpo completo.

En una forma de realización, el anticuerpo monoclonal citado es un anticuerpo procedente de un animal (por ejemplo ratón), un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo. Los anticuerpos quiméricos, anticuerpos semejantes a humanos o humanizados posee una antigenicidad potencial reducida, sin embargo su afinidad contra el objetivo no está reducida. La preparación de anticuerpos quiméricos y humanizados o de anticuerpos similares a anticuerpos humanos se ha descrito detalladamente (Noguchi, Nippon Rinsho, 1997, 55(6), pág. 1543-1556; van Hogezand, Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1997, 223, pág. 105-107). Las inmunoglobulinas humanizadas presentan regiones variables de estructura base que proceden esencialmente de una inmunoglobulina humana (con la referencia inmunoglobulina aceptora) y regiones determinantes de la complementariedad que proceden esencialmente de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón) (con la referencia inmunoglobulina donante). La(las)
región(es) constante(s) procede(n), en caso de existir, también esencialmente de una inmunoglobulina humana. En la administración a pacientes humanos, los anticuerpos anti-CD66a humanizados según la invención (así como los humanos) ofrecen una serie de ventajas frente a anticuerpos de ratones u otras especies: (a) el sistema inmune humano no debería reconocer la estructura base o la región constante del anticuerpo humanizado como extraño y, por tanto, debería resultar una respuesta de anticuerpo contra uno de dichos anticuerpos inyectados menor que contra un anticuerpo de ratón totalmente extraño o un anticuerpo quimérico parcialmente extraño; (b) ya que la región efectora del anticuerpo humanizado es humana, debería interaccionar mejor con otras partes del sistema inmune humano, y (c) los anticuerpos humanizados inyectados presentan una semivida que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos humanos de origen natural, lo que permite administrar dosis menores y menos frecuentes en comparación con anticuerpos de otras especies.

La tecnología convencional anteriormente descrita puede completarse o sustituirse también mediante el uso de bibliotecas de fagos recombinantes (Felici y col., Biotechnol. Rev., 1, pág. 149-183 (1995); Hoogenboom y col., Immunotechnology 4, pág. 1-20 (1998)). Las bibliotecas de fagos recombinantes pueden presentar aleatoriamente estructuras peptídicas en las regiones de unión a antígeno de los fragmentos de anticuerpo presentadores de fago. La ventaja de esta tecnología se basa, entre otras cosas, en que en fagos clonados la información sobre la secuencia de aminoácidos de las estructuras de unión a antígeno está inmediatamente disponible.

Los dominios de CD66a o de ligandos de CD66a cuyo bloqueo produce una inactivación funcional de CD66a pueden recombinarse de cualquier modo y usarse incorporados a moléculas que son adecuadas con fines terapéuticos (por ejemplo, para conseguir mejor compatibilidad inmunológica). Los dominios reactivos pueden expresarse también según procedimientos de biología molecular convencionales, por ejemplo, en células bacterianas o de insectos.

Preferiblemente, la inhibición de la interacción entre CD66a y los ligandos potenciales se realiza de los siguientes modos (regulación negativa):

-: inhibición mediante anticuerpos y fragmentos de anticuerpo contra los dominios funcionales de CD66a,

-: inhibición mediante anticuerpos y fragmentos de anticuerpo contra los dominios funcionales de ligandos de CD66a,

-: inhibición mediante el dominio funcional de CD66a,

-: inhibición mediante el dominio funcional de ligandos de CD66a,

-: inhibición de la formación endógena de CD66a o ligandos de CD66a mediante el uso de oligonucleótidos antisentido.

Preferiblemente, la potenciación de la interacción entre CD66a y ligandos potenciales se realiza de los siguientes modos (regulación positiva):

-: administración de la molécula nativa purificada mediante procedimientos bioquímicos.

-: administración de fragmentos recombinantes de CD66a,

-: administración de glicoestructuras angiogenéticas activas aisladas a partir de CD66a.

-: administración de glicoestructuras preparadas totalmente sintéticas o parcialmente sintéticas cuya estructura se ha derivado de glicoestructuras angiogenéticas activas de CD66a,

-: administración de un ADN que codifica la proteína CD66a completa en forma de vectores o plásmidos adecuados,

-: administración de un ADN que codifica isoformas o fragmentos de CD66a en forma de vectores o plásmidos adecuados.

Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden administrarse por cualquier vía que sea adecuada para alcanzar los tejidos pretendidos. Preferiblemente, la administración se realiza por vía parenteral, preferiblemente oral, intravenosa o intratumoral. Para la administración, se usa la sustancia en una formulación adecuada para el tipo de administración respectivo con la ayuda de los correspondientes excipientes farmacéuticos habituales. El desarrollo de fármacos de administración oral se realiza de dos modos. Por un lado, puede modelizarse la interacción entre ligando y receptor, por ejemplo, mediante análisis de estructura de rayos X o espectroscopía de RMN. Por otro lado, pueden usarse bibliotecas combinatorias químicas (Myers, Current Opinion in Biotechnology 8, pág. 701-717 (1997). Aquí, se investiga la interacción del ligando o receptor en primer lugar con compuestos químicos combinados en gran medida aleatoriamente. Cuando se ha detectado una unión, pueden estrecharse más las propiedades de unión mediante la elección de compuestos similares.

El médico determina la dosificación y la posología de la administración de compuestos según la invención mediante parámetros específicos del paciente como, por ejemplo, edad, peso, sexo, gravedad de la enfermedad, etc.

Correspondientemente al tipo de administración, se formula el medicamento de modo adecuado, por ejemplo, en forma de disoluciones, suspensiones, como polvos, comprimidos o cápsulas o preparados de inyección que se preparan según procedimientos galénicos habituales.

Las disoluciones de infusión o inyección son preferiblemente disoluciones o suspensiones acuosas en las que es posible preparar éstas antes del uso, por ejemplo, a partir de preparados liofilizados que contienen el principio activo solo o junto con un vehículo como manitol, lactosa, glucosa, albúmina y similares. Las disoluciones listas para uso se esterilizan y, dado el caso, se mezclan con coadyuvantes, por ejemplo, con conservantes, estabilizantes, emulsionantes, mediadores de la disolución, tampones y/o sales para la regulación de la presión osmótica. La esterilización puede conseguirse mediante esterilización por filtración a través de un filtro con un tamaño de poro pequeño, tras de lo cual puede liofilizarse, dado el caso, la composición. Pueden añadirse también antibióticos para contribuir al mantenimiento de la esterilidad.

Las composiciones farmacéuticas contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una o varias de las sustancias activas dadas anteriormente, junto con coadyuvantes y vehículos. Estos son preferiblemente vehículos orgánicos o inorgánicos líquidos farmacéuticamente compatibles que son adecuados para la administración pretendida, y que interaccionan con los ingredientes activos de forma no desventajosa.

Los preparados farmacéuticos según la invención se suministran en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, como ampollas.

La invención se refiere también a un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que se caracteriza porque el compuesto según la invención se mezcla con un vehículo farmacéuticamente compatible.

Las "sustancias que inhiben la expresión de CD66a o ligando de CD66a" se administran preferiblemente a modo de terapia génica, insertando en células tumorales, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido de CD66a y/o ligando de CD66a. Estos oligonucleótidos derivan de las secuencias conocidas de CD66a o ligando de CD66a (Hinoda y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, pág. 6959 (1988)). Los oligonucleótidos antisentido pueden alcanzar también el tamaño de un ARN que es complementario de las regiones de ARNn del gen y se une a éstas. Se forma entonces una molécula doble que está desprovista de traducción del ARNm. Por tanto, puede alcanzarse una inhibición de la expresión génica. La expresión "oligonucleótido antisentido" comprende cualquier molécula de ADN o ARN que sea complementaria de las regiones de ARN de CD66a o ARN de ligando de CD66a, especialmente ARNm, y muy especialmente elementos de regulación del mismo, y que mediante unión a estas regiones produzca una inhibición de la expresión génica. Los oligonucleótidos antisentido pueden presentarse como tales o, cuando son más largos, en forma de un vector o constructo de vector que los codifica, que se designa ocasionalmente también como "minigén". Uno de dichos vectores puede ser un vector de expresión habitual. Puede ser conveniente cuando la expresión de la secuencia que los codifica está bajo el control de un promotor constitutivo o inducible, como un promotor específico de tejido o tumor. La incorporación de la molécula antisentido puede realizarse mediante procedimientos habituales. En caso de presentarse los oligonucleótidos antisentido como tales o en forma de un vector que los codifica, son adecuadas, por ejemplo, técnicas de transfección o es adecuado, por ejemplo, un empaquetamiento en liposomas.

Las "sustancias que inducen la expresión de CD66a o ligando de CD66a" son, por ejemplo, moléculas de ADN que codifican CD66a o fragmentos de CD66a angiogenéticos activos, o también ligandos de CD66a o fragmentos de ligandos angiogenéticos activos. La expresión se regula mediante secuencias reguladoras adecuadas. La administración del ADN se realiza según protocolos que son conocidos por un experto en terapia génica. Así, se tienen en cuenta, por ejemplo, el empaquetamiento en partículas virales (por ejemplo, adenovirus) o también la adición de ADN de plásmido desnudo.

Según la invención, con la composición farmacéutica inhibidora de la angiogénesis puede inhibirse el crecimiento de todos los tumores sólidos del cuerpo. Son ejemplos tumores epiteliales (por ejemplo, epitelio escamoso, cilíndrico, glandular, transicional), tumores mesenquimáticos (por ejemplo, fibras, músculos, cartílagos y tejidos óseos), tumores mixtos (epitelial mixto, mesenquimático mixto, epitelial-mesenquimático), tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfáticos (médula ósea, tejidos linfáticos), tumores de cavidades serosas (por ejemplo, cavidad pleural, pericardio, peritoneo, membrana sinovial), tumores del sistema nervioso (por ejemplo, células ganglionares, neuroepitelio, neuroglía, meninges, sistema simpático, nervios periféricos), tumores del tracto gastrointestinal y tumores de órganos individuales. Se prefiere según la invención inhibir el crecimiento de tumores de bronquios y pulmones, de mama, de hígado, de vesícula biliar, de páncreas, de riñones y órganos urinarios, de estómago, de intestino grueso, de recto, de próstata y de útero.

Según la invención, con la composición farmacéutica potenciadora de la angiogénesis puede inducirse la nueva formación de vasos en aquellas enfermedades en las que el cierre patológico de vasos conduce a un menor abastecimiento del tejido con oxígeno y nutrientes. Como ejemplos se citan enfermedades cardiacas coronarias o circulación reducida de las extremidades de diabéticos, grandes fumadores o pacientes con presión sanguínea elevada.

La invención se describe detalladamente mediante las figuras:

Fig. 1 Localización de CD66a en los vasos de un tumor de células de Leydig humano. La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo con el anticuerpo 4D1/C2.

Fig. 1a: uno de los capilares tumorales teñidos está marcado con una flecha (x 350)

Fig. 1b: ampliación de una región de la Fig. 1a. La flecha señala la tinción de una célula endotelial (x 950).

Fig. 2 Efecto quimiotáctico de CD66a (=BGP) sobre HDMEC.

Fig. 3 Proliferación de HDMEC después de estimulación con CD66a (=BGP).

Fig. 4 Efecto de CD66a sobre la formación de tubos de vasos similares a capilares en cultivo celular.

La invención se ilustrará detalladamente mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

Localización de CD66a en capilares tumorales

Usando el anticuerpo monoclonal anti-CD66a 4D1/C2, se colorearon inmunohistoquímicante tumores y se examinaron mediante microscopía de luz. En este momento, se utilizó adicionalmente al procedimiento inmunohistoquímico anteriormente empleado (Prall y col., (1996), J. Histochem. Cytochem. 44, 35-41) un procedimiento de amplificación con níquel y glucosa oxidasa. Además, se llevaron a cabo análisis de microscopía electrónica después de la tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo monoclonal 4D1/C2 (véase la Fig. 1).

Se examinaron inmunohistoquímicamente tumores de testículo, tumores de cerebro, así como carcinomas de próstata, vejiga urinaria y riñones humanos. La CD66a se localizó en células endoteliales y en la membrana basal de capilares tumorales. Los vasos envejecidos no proliferantes inactivos de los órganos examinados eran negativos. En caso de dividirse el tumor según los puntos de vista funcionales en distintos cortes zonales, a saber, células tumorales, borde tumoral y entorno tumoral, entonces se encuentra inmunorreacción positiva en los capilares tumorales formados de nuevo en el borde tumoral. Esto sugiere una función de CD66a en fases muy tempranas de la neoformación de vasos (neoangiogénesis).

Ejemplo 2

Efecto de CD66a sobre la proliferación y el quimiotactismo de células endoteliales cultivadas

Para ensayar el efecto de CD66a sobre la proliferación y el quimiotactismo de células endoteliales cultivadas, se purificó la glicoproteína a partir de fracciones de membrana de granulocitos humanos. El aislamiento de la fracción de membrana siguió procedimientos establecidos (Drzeniek y col. (1991), Cancer Letters 56, 173-179; Stoffel y col. (1993), J. Immunol. 150, 4978-4984). Después de la extracción de las glicoproteínas de membrana con un detergente no iónico, se unieron estas a un anticuerpo monoclonal anti-CD66 inmovilizado y se eluyeron con HCl de glicina a pH 2,2. Se separó de nuevo el eluido por cromatografía en gel sobre Superdex 200 (Pharmacia) después de neutralización. Se combinaron las fracciones positivas de CD66a. Se separaron las impurezas de la región de bajo peso molecular mediante ultrafiltración usando un filtro con una exclusión de 100 kDa. Mediante PAGE-SDS en gel de plata, se mostró con relación a una transferencia Western que el sobrenadante contenía exclusivamente CD66a. Esta fracción se relacionó para ensayos de cultivo celular con células endoteliales.

Se llevaron a cabo los ensayos con dos formas de células endoteliales humanas distintas, a saber, con HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) y células HDMEC (células endoteliales microvasculares dérmicas humanas).

Se comprobó el efecto de CD66a sobre la proliferación en cultivo de monocapa. Se sembraron las células endoteliales en un número definido sobre una placa de microvaloración. Después de 72 horas, se compararon el número de células endoteliales en cultivos estimulados y no estimulados. Se mostró que CD66a estimulaba la proliferación de ambas líneas celulares de modo dependiente de la dosis.

Se ensayó el efecto de CD66a sobre el quimiotactismo en un sistema de cultivo de dos cámaras (denominado cámara Boyden). En la cámara superior, se cultivan las células, la cámara inferior contiene sustancias quimiotácticas. Ambas cámaras están separadas por un filtro de policarbonato que permite el paso de células. Después de la adición de CD66a a la cámara inferior, se mostró un efecto quimiotáctico dependiente de la dosis en ambas líneas de células endoteliales. El efecto de CD66a era comparable con el efecto de VEGF. Como se observa a partir de la Fig. 2, CD66a (=BGP) posee a partir de una concentración de 100 ng/ml un efecto quimiotáctico. A una concentración de 150 ng/ml, el efecto quimiotáctico es sólo ligeramente menor que el de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular).

Se analizó el efecto quimiotáctico de CD66a también en combinación con VEGF y bFGF ("factor de crecimiento de fibroblasto básico"). El efecto quimiotáctico de VEGF o bFGF aumentó mediante CD66a respectivamente en aproximadamente un 30%.

Se incubaron fibroblastos dérmicos microvasculares humanos cultivados con CD66a (=BGP) a concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 600 ng/ml. A partir de una concentración de 200 ng/ml, había un efecto aumentador de la proliferación de CD66a. Esto se muestra en la Fig. 3.

Con el efecto positivo sobre la proliferación y el quimiotactismo, la CD66a satisface los criterios principales de los factores de angiogénesis.

Ejemplo 3

Efecto de CD66a sobre la formación de tubos de vasos similares a capilares en cultivo celular

Los resultados de ensayo descritos en el ejemplo 2 sugieren la suposición de que CD66a participa casualmente en la formación de nuevos vasos (neoangiogénesis). Para ensayar esta hipótesis, lo más adecuado serían ensayos animales. Sin embargo, ya que en CD66a se trata de una glicoproteína humana, ha de reconocerse por tanto que el efecto en animales de ensayo no es marcado o sólo ligeramente debido a las diferencias de especie. Para esta suposición, se enuncia el descubrimiento de que el anticuerpo monoclonal anti-CD66a 4D1/C2 muestra una buena reacción en tejidos humanos. En los correspondientes tejidos de rata y ratón, la reacción es débil y sólo difícilmente se diferencia de una reacción de fondo inespecífica. El anticuerpo 4D1/C2 se une al parecer a una estructura antigénica que no aparece en esta forma en roedores.

Para evitar los problemas condicionados por las diferencias de especie, se usan modelos de cultivo celular en los que crecen células endoteliales en condiciones determinadas hasta tubos de vasos que corresponden a capilares formados de nuevo (en inglés: "tube formation"). Para ello, se cultivan las células en presencia de factores de crecimiento específicos como, por ejemplo, VEGF ("factor de crecimiento endotelial vascular") o FGF-2 ("factor de crecimiento de fibroblastos") en una matriz de tejido conectivo. Esta forma de cultivo representa una buena aproximación a las condiciones in vivo.

Para investigar la importancia de CD66a para la formación de capilares, se cultivan células HUVEC y HDMEC en geles de colágeno I tridimensionales. En presencia de factores de crecimiento como VEGF y FGF-2, las células endoteliales forman estructuras tubulares que corresponden a los capilares formados de nuevo. En presencia del anticuerpo monoclonal de CD66a 4D1/C2, se inhibió la formación de tubos de vasos. Un segundo anticuerpo monoclonal, que está dirigido contra otro epítopo de CD66a, no tenía efecto sobre la formación de túbulos. Estos ensayos apoyan una relación funcional entre la expresión de CD66a y la neoformación de tubos de vasos similares a capilares. Con ayuda del anticuerpo, se define además el dominio funcional de CD66a.

Los resultados del ensayo anterior se muestran en la Fig. 4:

En presencia del factor de angiogénesis VEGF (50 ng/ml), se forman estructuras similares a capilares (véase la Fig. 4a). Las estructuras similares a capilares se manifiestan en tubos ("tubes") en los que las células endeoteliales extraídas alargadas se disponen paralelamente. Estos tubos son comparables a los hilos de pesca. En el medio de la Fig. 4a se encuentra una región en la que las células endoteliales están redondeadas. No son "tubos".

En la Fig. 4b se representa el resultado de un experimento en el que se ha examinado la formación de capilares en presencia de VEGF (50 ng/ml) y CD66a (150 ng/ml). En comparación con la Fig. 4a, casi todas las células endoteliales participan en la formación de "tubos". Además, es reconocible un patrón de ramificación que habla a favor de una diferenciación adicional del proceso de angiogénesis. La CD66a refuerza por tanto el efecto angiogenético de VEGF.

En la Fig. 4c, se han cultivado células endoteliales en presencia de CD66a (300 ng/ml) y en ausencia de VEGF. No se muestran estructuras similares a capilares.

En la Fig. 4d, se representa el resultado de un experimento en el que se han cultivado las células endoteliales en presencia del anticuerpo monoclonal 4D1/C2. La formación de capilares está totalmente inhibida. A partir de este experimento, se deduce que el anticuerpo 4D1/C2 se une a un dominio de CD66a que es esencial para la formación de capilares.

Claims

1. Uso de una o varias sustancias para la preparación de una composición farmacéutica para influir sobre la angiogénesis, en el que las sustancias comprenden:

(a) para la regulación positiva:

CD66a, fragmentos de CD66a o glicoestructuras derivadas de CD66a, o ligandos de CD66a, así como ADN que codifica CD66a, isoformas de CD66a o fragmentos de CD66a que inducen la expresión de CD66a o del ligando de CD66a, o

(b) para la regulación negativa

2. Uso según la reivindicación 1(b), caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD66a.

3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal anti-CD66a 4D1/C2, que se ha depositado en la DSMZ, Braunschweig, el 22 de octubre de 1998 como DSM ACC2371.

4. Uso según una de las reivindicaciones 1(b) a 3, caracterizado porque es capaz de interrumpir la angiogénesis tumoral de cáncer de pulmón, mama e intestino grueso.