ES2264142T3

ES2264142T3 - Proteina analoga a transcetolasa.

Info

Publication number: ES2264142T3
Application number: ES96928338T
Authority: ES
Inventors: Annemarie Poustka; Johannes Coy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-07-27
Filing date: 1996-07-26
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2016-07-26
Also published as: EP0840789B1; DE19527552A1; JPH11510382A; DE19527552C2; WO1997005253A3; ATE328088T1; WO1997005253A2; EP0840789A2; US6133005A; DE59611353D1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UNA PROTEINA DERIVADA DE LA TRANSCETOLASA, UN ADN QUE LA CODIFICA Y DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE LA MISMA. ADEMAS, LA INVENCION TRATA DEL EMPLEO DEL ADN Y LA PROTEINA, ASI COMO DE LOS ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEINA.

Description

Proteína análoga a transcetolasa.

La presente invención se refiere a una proteína análoga a transcetolasa, a un ADN que la codifica y a un procedimiento para la preparación de la misma. La invención se refiere además al uso del ADN y de la proteína así como a anticuerpos dirigidos contra la proteína.

La transcetolasa es una enzima dependiente de tiamina que asocia el ciclo del fosfato de pentosa con la glicólisis. El ciclo de fosfato de pentosa proporciona fosfatos de azúcar y NADPH. La transcetolasa introduce los fosfatos de azúcar en exceso en la glicólisis, con lo que la puesta a disposición de NADPH está garantizada en distintas condiciones metabólicas. El NADPH es esencial para el mantenimiento del glutatión en el cerebro.

Una deficiencia de tiamina está asociada a enfermedades neurológicas, como beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff. El beriberi se manifiesta como insuficiencia cardiaca aguda, mientras que el síndrome de Wernicke-Korsakoff como encefalopatía aguda, seguida de daño crónico de la memoria a corto plazo.

Las investigaciones indican que la deficiencia de tiamina no es la causante de las enfermedades anteriores. También, en pacientes con estas enfermedades, por ejemplo, en pacientes de síndrome de Wernicke-Korsakoff, no se presenta transcetolasa mutada. La causa de las enfermedades anteriores no es por tanto conocida hasta ahora.

La presente invención se basa por tanto en el objetivo de poner a disposición un agente con el que se investiguen las causas de las enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina, especialmente beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff, y dado el caso con el que puedan tratarse terapéuticamente.

Según la invención, se consigue esto mediante los objetos de las reivindicaciones.

Es por tanto objeto de la presente invención una proteína análoga a transcetolasa, en la que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1.

La presente invención se basa en el conocimiento de los solicitantes de que en animales, especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos, existe una proteína que presenta homologías con una transcetolasa, dado el caso una actividad de transcetolasa, pero que se diferencia de una transcetolasa al nivel de ADN por su hibridación en condiciones habituales. Dicha proteína presenta al menos la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1. Además, con uno o varios aminoácidos distintos en la secuencia de aminoácidos, la proteína se presenta en distinta forma en distintos tejidos, por ejemplo, cerebro y corazón.

En la presente invención se designa la proteína anterior como "proteína análoga a transcetolasa" (PAT).

En una forma de realización preferida, una (PAT) presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2. Dicha (PAT) se encuentra especialmente en el cerebro de animales, especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos.

En otra forma de realización preferida, una (PAT) presenta la secuencia de aminoácidos de la Fig. 3. Dicha (PAT) se encuentra especialmente en el corazón de animales, especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos.

Es otro objeto de la presente invención un ácido nucleico que codifica una (PAT). Éste puede ser un ARN o un ADN. Éste último puede ser, por ejemplo, un ADN genómico o un ADNc. Preferiblemente, es un ADN que comprende lo siguiente: el ADN de la Fig. 1.

Se prefiere especialmente el ADN de la Fig. 2 y la Fig. 3. El ADN de la Fig. 2 codifica una (PAT) que se presenta especialmente en el cerebro de animales, especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos. El ADN de la Fig. 3 codifica una (PAT) que se presenta especialmente en el corazón de animales, especialmente mamíferos, muy especialmente seres humanos. El ADN de la Fig. 2 se depositó en la DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) como JFC 317 con la referencia DSM 9994 el 23 de mayo de 1995.

A continuación, se describe un ADN según la invención en forma de un ADNc. Éste representa, por ejemplo, cada ADN que entra dentro de la presente invención.

Para la preparación de un ADNc según la invención es beneficioso partir de una biblioteca de cósmido, por ejemplo, q1Z (véase Dietrich, A. y col., Nucleic Acids Res. 19, (1991), 2567-2572), que comprende el clon de la región Xq28 del genoma humano. Dichos clones se fijan a una membrana de filtro y se hibridan con conjuntos de ADNc marcados obtenidos mediante transcripción inversa de ARNm de tejidos de cerdo, por ejemplo, cerebro, músculo, hígado, corazón (véase Coy, J.F., y col., Mammalian Genome, 5, (1994), 131-137). Aquellos clones que presentan una señal de hibridación con los conjuntos de ADNc se usan para el examen de una biblioteca de ADNc humano, por ejemplo, de tejido de cerebro o corazón fetal. Para ello es especialmente adecuada la biblioteca de ADNc \lambda-Zap, Stratagene, nº de cat. 936206. Se obtiene un ADNc según la invención.

Un ADNc según la invención puede presentarse en un vector o vector de expresión. Los ejemplos de los mismos son conocidos por el experto. En el caso de un vector de expresión para E. coli estos son, por ejemplo, pGEMEX, derivados de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8, prefiriéndose el último. Para la expresión en levadura han de citarse, por ejemplo, pY100 e Ycpad1, mientras que para la expresión en células animales han de darse, por ejemplo, pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4. Para la expresión en células de insecto es especialmente adecuado el vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A.

El experto conoce las células adecuadas para expresar un ADN presente en un vector de expresión según la invención. Los ejemplos de dichas células comprenden las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 y SG 13009, prefiriéndose la última, la cepa de levadura de Saccharomyces cerevisiae y las células animales L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y HeLa, así como las células de insecto sf9.

El experto sabe de qué manera insertar un ADNc según la invención en un vector de expresión. Le es también conocido que este ADN puede insertarse en combinación con un ADN que codifica otra proteína o péptido, de modo que el ADNc según la invención puede expresarse en forma de una proteína de fusión.

Además, el experto conoce las condiciones de cultivo de células transformadas o transfectadas. Le son también conocidos procedimientos para aislar y purificar la proteína expresada mediante el ADN según la invención. Dicha proteína, que puede ser también una proteína de fusión, es por tanto igualmente objeto de la presente invención.

Es otro objeto de la presente invención un anticuerpo dirigido contra una proteína o proteína de fusión anterior. Dicho anticuerpo puede prepararse mediante procedimientos habituales. Puede ser policlonal o monoclonal. Para su preparación es beneficioso inmunizar animales, especialmente conejos o gallinas para un anticuerpo monoclonal y ratones para uno monoclonal, con una proteína (de fusión) anterior o fragmentos de la misma. Pueden realizarse "recuerdos" adicionales a los animales con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal puede obtenerse a partir del suero o la yema de huevo del animal. Para los anticuerpos monoclonales, se fusionan células de bazo de los animales con células de mieloma.

La presente invención posibilita investigar la causa de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina, como beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff. Con un anticuerpo según la invención, pueden detectarse (PAT) en los fluidos corporales de personas. Puede establecerse una relación de la (PAT) con el origen y formación de las enfermedades anteriores. Además, con una (PAT) según la invención puede detectarse un autoanticuerpo dirigido contra esta proteína. Ambas detecciones pueden realizarse mediante procedimientos habituales, especialmente una transferencia Western, un ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia. Además, con un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN y cebadores derivados del mismo, puede detectarse la expresión del gen que codifica la (PAT). Esta detección puede realizarse de modo habitual, especialmente en una transferencia Southern.

Además, la presente invención es adecuada para tomar medidas a favor y en contra de la presencia de (PAT) en personas. Con un anticuerpo según la invención, puede inhibirse la (PAT) en personas. Por otro lado, con una (PAT) según la invención, especialmente después de acoplamiento con una proteína no considerada extraña por el cuerpo, por ejemplo transferrina o BSA, aumenta la cantidad de (PAT) en las personas. Puede conseguirse correspondientemente también con un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN que está establecido bajo el control de un promotor inducible en tejidos determinados, por ejemplo, cerebro, corazón, y que después de su expresión conduce a la puesta a disposición de (PAT) en estos tejidos. Además, puede usarse también un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN, para la inhibición de (PAT). Para ello, se usa el ácido nucleico, por ejemplo, como base para la elaboración de oligonucleótidos sin sentido para la inhibición de la expresión del gen que codifica la (PAT).

La presente invención representa por tanto una gran contribución para el registro diagnóstico y terapéutico de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina, especialmente beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff.

Descripción breve de las figuras

La fig. 1 muestra la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT) según la invención,

La fig. 2 muestra la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT) específica de cerebro según la invención (las flechas indican la situación de (PAT) de la Fig. 1), y

La fig. 3 muestra la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos derivada de la misma de una (PAT) específica de corazón según la invención (las flechas indica la situación de (PAT) de la Fig. 1).

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación y purificación de una (PAT) según la invención

Para la preparación de una (PAT) según la invención se usó el ADN de la Fig. 2 o 3 como molde. Se llevó a cabo un procedimiento de PCR. Respecto al ADN de la Fig. 2, se usó como par cebador: 5'-CAGAGATCTATGAGGTA
CAAGCAGTCAG-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. Respecto al ADN de la Fig. 3, se usó como par cebador: 5'-CAGAGATCTATGTGGCGTATCCATGC-3' y 5'-GGGAAGCTTTTAGTTCAGCAACATGC-3'. La preparación de PCR o las condiciones de PCR fueron respectivamente las siguientes:

Preparación de PCR

ADN molde (Fig. 1):	1 \mul= 1 ng
Pfu polimerasa, tampón 10x:	10 \mul= 1 x
DMSO:	10 \mul= 10%
dNTP:	1 \mul= 200 \muM cada uno
oligonucleótido, 1,5 \mul cada uno:	3 \mul= 150 ng cada uno
H_{2}O bidest.:	hasta 99 \mul.

Condiciones de PCR

- 92ºC, 5 min

- adición de 1 \mul de pfu polimerasa (Stratagene)= 2,5 unidades

- adición de parafina

PCR

92ºC, 1 min

58ºC, 1 min 1 ciclo

72ºC, 10 min

92ºC, 1 min

58ºC, 1 min 39 ciclos

72ºC, 2 min

72ºC, 10 min 1 ciclo

\vskip1.000000\baselineskip

El ADN amplificado se escindió respectivamente con BglII y HindIII y se insertó en los vectores de expresión pEQ-8 (Diagen) escindidos con BglII y HindIII. Se obtuvo el plásmido de expresión pQ/TVP-G (pQ/TVP-H). Éste codifica una proteína de fusión de 6 restos de histidina (asociado N-terminal) y la (PAT) según la invención de la Fig. 2 (Fig. 3) (asociado C-terminal). Se usó pQ/TVP-G (pQ/TVP-H) para la transformación de SG 13009 de E. coli (véase Gottesman, S. y col., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273). Se cultivaron las bacterias en un medio LB con ampicilina 100 \mug/ml y kanamicina 25 \mug/ml, y se indujeron durante 4 h con \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) 60 \muM. Mediante la adición de clorhidrato de guanidinio 6 M, se consiguió la lisis de las bacterias, a continuación se llevó a cabo con el lisado una cromatografía (Ni-resina NTA) en presencia de urea 8 M correspondientemente a los datos del fabricante (Diagen) del material de cromatografía. Se eluyó la proteína de fusión unida en un tampón a pH 3,5. Después de su neutralización, se sometió la proteína de fusión a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se tiñó con azul de Coomasie (véase Thomas, J.O. y Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).

Se ha mostrado que puede prepararse una proteína (de fusión) según la invención en forma altamente pura.

Ejemplo 2

Preparación y detección de un anticuerpo según la invención

Se sometió una proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de SDS poliacrilamida al 18%. Después de teñir el gel con acetato de sodio 4 M, se recortó una banda de aprox. 59 (16,5) kDa del gel y se incubó en disolución de sal común tamponada con fosfato. Sedimentaron trozos de gel antes de determinar la concentración de proteína del sobrenadante mediante una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a la que siguió una tinción con azul de Coomasie. Con la proteína de fusión purificada en gel se inmunizaron animales del modo siguiente:

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en conejos

Se utilizaron 35 \mug de proteína de fusión purificada en gel por inmunización en 0,7 ml de PBS y 0,7 ml de coadyuvante de Freund completo e incompleto.

Día 0:: 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).

Día 14:: 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, CFI).

Día 28:: 3ª inmunización (CFI).

Día 56:: 4ª inmunización (CFI).

Día 80:: Desangrado.

Se ensayó el suero del conejo por inmunotransferencia. Para ello, se sometió una proteína de fusión del ejemplo 1 según la invención a una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfirió a un filtro de nitrocelulosa (véase Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth., 10, (1984), 203-209). El análisis de transferencia Western se llevó a cabo como se describe en Bock, C.-T. y col., Virus Genes 8, (1994), 215-229. Para ello, se incubó el filtro de nitrocelulosa durante una hora a 37ºC con un primer anticuerpo. Este anticuerpo era el suero del conejo (1:10.000 en PBS). Después de varias etapas de lavado con PBS, se incubó el filtro de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo era un anticuerpo de IgG monoclonal de cabra anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Dianova) (1:5.000) en PBS. Después de 30 min de incubación a 37ºC, siguieron varias etapas de lavado con PBS y a continuación la reacción de detección de fosfatasa alcalina con disolución de revelado (fosfato de 5'-bromo-4-cloro-3-indolilo 36 \muM, azul de nitrotetrazoilo 400 \muM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5 mM) a temperatura ambiente hasta que fueron visibles las bandas.

Se ha mostrado que pueden prepararse anticuerpos policlonales según la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpos policlonales en gallina

Se utilizan 40 \mug de proteína de fusión purificada en gel en 0,8 ml de PBS y 0,8 ml de coadyuvante de Freund completo o incompleto por inmunización.

Día 0:: 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).

Día 28:: 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto; CFI).

Día 50:: 3ª inmunización (CFI).

Se extrajeron anticuerpos de yema de huevo y se ensayaron en transferencia Western. Se detectaron anticuerpos policlonales según la invención.

Protocolo de inmunización para anticuerpos monoclonales de ratón

Se utilizaron 12 \mug de proteína de fusión purificada por gel en 0,25 ml de PBS y 0,25 ml de coadyuvante de Freund completo o incompleto por inmunización; en la 4ª inmunización, se disolvió la proteína de fusión en 0,5 ml (sin coadyuvante).

Día 0:: 1ª inmunización (coadyuvante de Freund completo).

Día 28:: 2ª inmunización (coadyuvante de Freund incompleto, CFI).

Día 56:: 3ª inmunización (CFI).

Día 84:: 4ª inmunización (PBS).

Día 87:: Fusión.

Se ensayaron los sobrenadantes de los hibridomas por transferencia Western. Se detectaron anticuerpos monoclonales según la invención.

Claims

1. Proteína análoga a transcetolasa, en la que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1.

2. Proteína análoga a transcetolasa, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 2.

3. Proteína análoga a transcetolasa, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la Fig. 3.

4. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia de bases de la Fig. 1.

5. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia de bases de la Fig. 2.

6. Ácido nucleico, caracterizado porque comprende la secuencia de bases de la Fig. 3.

7. Plásmido de expresión, caracterizado porque comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Transformante, caracterizado porque contiene el plásmido de expresión según la reivindicación 7.

9. Procedimiento para la preparación de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende el cultivo del transformante según la reivindicación 8.

10. Anticuerpo, caracterizado porque se dirige específicamente contra una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Uso de una proteína según una de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un agente para el diagnóstico o la terapia de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina como, por ejemplo, beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff.

12. Uso de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 6, para la preparación de un agente para el diagnóstico o la terapia de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina como, por ejemplo, beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff.

13. Uso de un anticuerpo según la reivindicación 10 para la preparación de un agente para el diagnóstico o la terapia de enfermedades neurológicas que están asociadas a una deficiencia de tiamina como, por ejemplo, beriberi y síndrome de Wernicke-Korsakoff.