ES2242193T3 - Vacuna polinucleotida contra la tuberculosis. - Google Patents

Abstract

SE DUPLICARON GENES QUE CODIFICAN PROTEINAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (M. TB.) EN VECTORES DE EXPRESION EUCARIOTICA PARA EXPRESAR LAS PROTEINAS CODIFICADAS EN CELULAS DE MUSCULO DE MAMIFERO IN VIVO. SE INMUNIZO ANIMALES MEDIANTE INYECCION DE ESTAS CONSTRUCCIONES DE ADN, SE HIZO ACEPTAR VACUNAS DE POLINUCLEOTIDO O PNV, EN SUS MUSCULOS. SE PRODUJO ANTISUERO INMUNE CONTRA ANTIGENOS M. TB. SE DETECTARON RESPUESTAS DE CELULAS T ESPECIFICAS EN CELULAS DE BAZO EN DE RATONES VACUNADOS Y EL PERFIL DE SECRECION DE CITOQUINA EN RESPUESTA AL ANTIGENO (85) FUE INDICATIVO DE UN TIPO T{SUB,H}1 DE LA RESPUESTA DE LAS CELULAS T AUXILIARES (ES DECIR, IL-2 E IFN-{GA} ELEVADAS). SE DEMOSTRO UNA EFICACIA PROTECTORA DE UNA VACUNA DE ADN DE M. TB. EN RATONES TRAS EL RETO CON M.BOVIS BCG, MEDIDO POR UNA REDUCCION EN LA MULTIPLICACION MICOBACTERIANA EN LOS BAZOS Y PULMONES DE RATONES VACUNADOS CON ADN DE M.TB COMPARADOS PARA CONTROLAR RATONES VACUNADOS CON ADN O INFECCION PRIMARIA EN RATONES NATIVOS.

Description

Vacuna polinucleotida contra la tuberculosis.

Antecedentes de la invención

Un obstáculo principal para el desarrollo de las vacunas contra virus o bacterias, particularmente aquellos con múltiples serotipos de un alto grado de mutación, contra la cual es deseable la facilitación de anticuerpos neutralizantes y/o las respuestas inmunes mediadas por células, es la diversidad de las proteínas externas entre diferentes aislados o cepas. Dado que los linfocitos T-citotóxicos (CTL) tanto en ratones como en humanos son capaces de reconocer epítopos derivados de proteínas internas víricas conservadas [J.W. Yewdell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 82, 1785 (1985); A.R.M. Townsend y col., Cell 44, 959 (1986); A.J. McMichael y col., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin y col., J. Exp. Med., 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend y H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601 (1989)]; y se piensa que son importantes en la respuesta inmune contra virus [Y.-L. Lin y B.A. Askonas, J. Exp. Med.154, 225 (1981); I. Gardner y col., Eur. J. Immunol. 4, 68 (1974); K.L. Yap y G.L.Ada, Nature 273, 238 (1978); A.J. McMichael y col., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P.M. Taylor y B.A. Askonas, Inmunol. 58, 417 (1986)], se han dirigido esfuerzos hacia el desarrollo de vacunas CTL capaces de proporcionar protección heteróloga contra diferentes cepas víricas.

Se sabe que los CTL matan células infectadas víricamente o bacterianamente cuando sus receptores de células T reconocen péptidos extraños asociados con moléculas MHC de clase I y/o de clase II. Estos péptidos se pueden derivar de moléculas extrañas sintetizadas de forma endógena, a pesar de la localización o función de la proteína en el patógeno. Mediante el reconocimiento de epítopos de proteínas conservadas, los CTL pueden proporcionar protección heteróloga. En el caso de bacterias intracelulares, las proteínas segregadas mediante o liberadas a partir de la bacteria se procesan y presentan mediante moléculas MHC de clase I y de clase II, generando de este modo respuestas de células T que juegan un papel en reducir o eliminar infección.

La mayoría de los esfuerzos realizados para generar respuestas de los CTL han usado bien vectores de replicación para producir el antígeno dentro de la célula [J.R. Bennik, ibid. 311, 578 (1984); J.R. Bennik y J.W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C.K. Stover y col., Nature 351, 546 (1991); A. Aldovini y R.A. Young, Nature 351, 479 (1991); R. Schafer y col., J. Immunol. 149, 53 (1992); C.S. Hahn y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89, 2679 (1992)], o bien se han centrado en la introducción de péptidos en el citosol [F.R. Carbone y M.J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres y col., Nature 342, 561 (1989); H., Takahashi y col., ibid. 344, 873 (1990); D.S. Collins y col., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M.J. Newman y col., ibid. 148, 2357 (1992)]. Ambas de estas aproximaciones tienen limitaciones que pueden reducir su utilidad como vacunas. Los vectores retrovirales tiene restricciones en el tamaño y estructura de polipéptidos que se pueden expresar como proteínas de fusión mientras mantienen su capacidad de los virus recombinantes para replicarse [A.D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)], y la efectividad de los vectores tales como vaccinia para inmunizaciones subsiguientes se puede comprometer mediante respuestas inmunes contra vaccinia [E.L. Cooney y col., Lancet 337, 567 (1991)]. Además, los vectores virales y los patógenos modificados tienen riesgos inherentes que pueden dificultar su uso en humanos [R.R. Redfield y col., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola y col., Arch. Intern. Med. 149, 1569 (1989)]. Además, la selección de epítopos de péptidos a estar presentes es dependiente de la estructura de antígenos individuales de MHC y, por lo tanto, las vacunas de péptidos pueden tener efectividad limitada debida a la diversidad de haplotipos de MHC en poblaciones exógamas.

Benvenisty, N, y Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] mostraron que se puede expresar el DNA, precipitado mediante CaCl_{2}, introducido dentro de los ratones intraperitonealmente (i.p.), intravenosamente (i.v.) o intramuscularmente (i.m.). Se ha demostrado que la inyección intramuscular (i.m.) de los vectores de expresión de DNA en ratones da como resultado la captación de DNA mediante las células musculares y la expresión de la proteína codificada mediante el DNA [J.A. Wolff y col., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi y col., Nature 352, 815 (1991)]. Se mostró que los plásmidos se mantenían episomalmente y no replicaban. Subsiguientemente, se ha observado expresión persistente después de la inyección i.m. en el músculo esquelético de ratas, peces y primates, y músculo cardíaco de ratas [H. Lin y col., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 4138 (1991); E. Hansen y col., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao y col., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff y col., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)]. La técnica de usar ácidos nucleicos como agentes terapéuticos se comunicó en el documento WO90/11092 (4 de octubre de 1990), en el cual los polinucleótidos desnudos se usaron para vacunar vertebrados.

Recientemente, se revisaron los papeles coordinados de B7 y el complejo principal de histocompatibilidad en la presentación de epítopos en la superficie de las células presentadoras de antígenos en activar CTL para la eliminación de tumores [Edigton, Biotecnology 11, 1117-1119, 1993]. Una vez la molécula MHC sobre la superficie de una célula presentadora de antígenos (APC) presenta un epítopo a un receptor de célula T (TCR), B7 expresada sobre la superficie de la misma APC actúa como una señal secundaria uniéndose a CTLA-4 o CD28. El resultado es división rápida de las células T ayudantes CD4+ las cuales dan la señal a las células T CD8+ para proliferar y matar la APC.

No es necesario para el éxito del medio que la inmunización sea intramuscular. Así, Tang y col., [Nature, 356, 152-154 (1992)] describe que la introducción de microproyectiles de oro recubiertos con DNA que codifica la hormona del crecimiento bovina (BGH) dentro de la piel de ratones dio como resultado la producción de anticuerpos anti-BGH en el ratón. Furth y col., [Analitical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)] mostró que se puede usar un inyector a chorro para transfectar piel, músculo, grasa, y tejidos mamarios de animales vivos. Diversos procedimientos para introducir ácidos nucleicos se han revisado recientemente [Friedman, T., Science, 244, 1275-1281 (1989)]. Véase también Robinson y col., [Abstracts of Papers Presented at the 1992 meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, p92; Vaccine 11, 957 (1993)], donde se alegó que la administración i.m., i.p., e i.v. del DNA de la gripe aviar en pollos ha proporcionado protección contra desafío letal. La inyección intravenosa de un complejo DNA: liposoma catiónico en ratones se mostró por Zhu y col., [Science 261, 209-211 (9 de julio de 1993); véase también el documento WO93/24640, 9 de diciembre de 1993] para dar como resultado expresión sistémica de un transgen clonado. Recientemente, Ulmer y col., [Science 259, 1745-1749, (1993)] informaron sobre la protección heteróloga contra infección por el virus de la gripe mediante inyección de DNA que codifica proteínas del virus de la gripe.

Wang y col. [P.N.A.S. U.S.A. 90, 4156-4160 (mayo, 1993)] informó sobre la facilitación de respuestas inmunes en ratones contra VIH mediante inoculación intramuscular con un gen clonado, genómico (no sometido a "splicing") de VIH. Sin embargo, el nivel de respuestas inmunes logradas fue muy bajo, y el sistema utilizó partes del promotor repetido terminal largo (LTR) del virus del tumor mamario de ratones (MMTV) y partes del promotor y el terminador del virus de simios 40 (SV40). Se sabe que el SV40 transforma células, posiblemente a través de integración dentro del DNA del hospedador celular. Así, el sistema descrito por Wang y col., es completamente inapropiado para su administración a humanos, la cual es uno de los objetos de la presente invención.

El documento WO 93/17706 describe un procedimiento para vacunar un animal contra un virus, en el que las partículas transportadoras se recubrieron con una construcción génica y las partículas recubiertas se aceleran dentro de las células de un animal.

Estudios por Wolff y col. (supra) demostraron originalmente que la inyección intramuscular de DNA plasmídico codifica un gen notificador lo que da como resultado la expresión de tal gen en miocitos y cerca del sitio de inyección. Las notificaciones recientes demuestran la inmunización exitosa de ratones contra gripe mediante la inyección de plásmidos que codifican hemaglutinina A de la gripe (Montgomery, D.L., y col., 1993, Cell Biol., 12, páginas 777-783), o nucleoproteína de la gripe (Montgomery, D.L., y col., supra; Ulmer J.B. y col., 1993, Science, 259, páginas 1745-1749). Se ha descrito el primer uso de la inmunización de DNA para un herpes virus (Cox y col., 1993, J. Virol., 67, páginas 5664-5667). La inyección de un plásmido que codifica glicoproteína g IV del herpesvirus 1 bovino (BHV-1) dio origen a anticuerpos anti-g IV en ratones y terneros. En el desafío intranasal con BHV-1, los terneros inmunizados mostraron síntomas reducidos y difundieron sustancialmente menos virus que los controles.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica del pulmón causada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis. TB es una de las infecciones mundiales más clínicamente significativas, con una incidencia de 3 millones de muertes y 10 millones de nuevos casos cada año. Se ha estimado que tanto como un tercio de la población mundial puede estar infectada y, en los países en desarrollo, se han descrito 55 millones de casos de TB activa. Hasta el cambio de siglo, TB fue la causa principal de muerte en los Estados Unidos. Pero, con las condiciones sanitarias mejoradas y el advenimiento de los fármacos antimicrobianos, la incidencia de la mortalidad declinó constantemente hasta el punto en el que se predijo que la enfermedad se erradicaría en el año 2000. Sin embargo, en los países más desarrollados el número de casos de TB activa se ha elevado cada año a partir de la mitad de los 80. Parte de este resurgimiento se ha atribuido a la inmigración y al número creciente de individuos inmunocomprometidos, infectados con VIH. Si se deja sin disminución, se predice que la tuberculosis reclamará más de 30 millones de vidas humanas en los siguientes 10 años. Aún pudiendo parecer tan alarmantes estas imágenes, lo es incluso más el que hayan surgido cepas multifármacoresistentes (MDR). Estas cepas MDR no son tratables mediante terapia de fármacos tradicional y han sido responsables de varios brotes recientes de TB, particularmente en centros urbanos. Por lo tanto, uno de los componentes clave en el manejo de TB a largo plazo será una vacuna efectiva [para revisar véase Bloom y Murray, 1993, Science 257, 1055].

La M. tuberculosis es un patógeno intracelular que infecta macrófagos y es capaz de sobrevivir en el ambiente severo del fagolisosoma en este tipo de célula. La mayoría de los bacilos inhalados se destruyen mediante macrófagos alveolares activados. Sin embargo, los bacilos supervivientes se pueden multiplicar en macrófagos y se liberan en la muerte celular, la cual es señal para la infiltración de linfocitos, monocitos y macrófagos al sitio. La lisis de los macrófagos cargados de bacilos está mediada por la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) y da como resultado el desarrollo de un tubérculo similar al queso sólido rodeando el área de las células infectadas. La DTH continuada causa que el tubérculo se licue, liberando de este modo el bacilo atrapado. La gran dosis de bacilo extracelular activa DTH adicional, causando daño a los bronquios y diseminación por las vías linfática, hematógena y bronquial, y permitiendo eventualmente a los bacilos infecciosos dispersarse mediante la respiración.

La inmunidad de TB implica varios tipos de células efectoras. La activación de macrófagos por citoquinas, tales como interferón-\gamma, es un medio efectivo de minimizar la multiplicación micobacteriana intracelular. Sin embargo, la erradicación completa de los bacilos mediante este procedimiento a menudo no se logra. La adquisición de protección contra TB requiere linfocitos T. Entre éstos, tanto las células CD8+ como las células CD4+ parecer ser importantes [Orme y col., 1993, I. Infect. Dis. 167, 1481]. Estos tipos celulares segregan interferón-\gamma en respuesta a micobacterias, indicadoras de una respuesta inmune T_{h}1, y poseen actividad citotóxica para células diana sometidas a un pulso con micobacterias. En estudios recientes usando microglobulina-\beta-2 y ratones deficientes en CD8, las respuestas CTL han estado mostrando ser críticas en proporcionar protección contra M. tuberculosis [Flynn y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 12013; Flynn y col., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249; Cooper y col., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243]. En contraste, los linfocitos B no parecen estar implicados, y la transferencia pasiva de anticuerpos antimicobacterianos no proporciona protección. Por lo tanto, las vacunas efectivas contra TB deben generar respuestas inmunes mediadas por células T.

La estimulación antigénica de las células T requiere presentación mediante moléculas MHC. Con el fin de que los antígenos micobacterianos logren acceso a la ruta de presentación antigénica deben liberarse de la bacteria. En macrófagos infectados, esto se puede lograr mediante secreción o lisis bacteriana. La micobacteria posee muchos antígenos potenciales de célula T y varios no Han sido identificados [Andersen 1994, Dan. Med. Bull. 41, 205]. Algunos de estos antígenos se segregan por las bacterias. Se cree generalmente que la inmunidad contra TB está mediada por células T CD8+ y CD4+ dirigidas contra esos antígenos segregados. En modelos de TB de ratones y conejillos de indias, la protección al desafío bacteriano, como se mide mediante pérdida de peso reducida, se ha logrado usando una mezcla de antígenos micobacterianos [Pal y Horowitz, 1992, Infect. Immunity 60, 4781; Andersen 1994, Infect. Immunity 62, 2536; Collins, 1994, Veterin. Microbiol. 40, 95].

Varios antígenos de células T potencialmente protectores se han identificado en M. tuberculosis y algunos de éstos y algunos de estos se están investigando como dianas de vacunas. El trabajo reciente ha indicado que los antígenos de la célula T predominantes son aquellas proteínas que se segregan mediante micobacterias durante su residencia en macrófagos, tales como: i) el complejo de proteínas antígeno 85 (85A, 85B, 85C) [Wiker y Harbor, 1992, Microbiol. Rev. 56, 648], ii) una proteína de 6 kDa llamada ESAT-6 [Andersen 1994, Infect. Immunnity 62, 2536], iii) una lipoproteína de 38 kDa con homología PhoS [Young y Garbe, 1991, Res. Microbiol. 142, 55; Andersen, 1992, J. Infect. Dis. 166, 874], iv) la proteína de choque térmico de 65 kDa GroEL [Siva y Lowrie, 1994, Immunol. 82, 244}, v) una proteína de 55 kDa rica en prolina y treonina [Romaní y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 5322], y vi) una lipoproteína de 19 kDa [Faith y col., 1991, Immunol. 74, 1].

Los genes para cada una de las tres proteínas del antígeno 85 (A, B, y C) se han clonado y secuenciado [Borremens y col., 1989, Infect. Immunity 57, 3123; Content y col., Infect. Immunity 59, 3205, DeWit y col., DNA Seq. 4, 267]. Además, estas proteínas estructuralmente relacionadas son dianas para respuestas fuertes de células T tanto después de infección como después de vacunación [Huygen y col., 1988, Scand. J. Immunol., 27, 187; Launois y col., 1991, Clin. Exp. Immunol. 86, 286; Huygen y col., 1992, Infect. Immunity 60, 2880, Punk y col., 1994, Infect. Immunity 62, 726; Launois y col., 1994, Infect Immunity 62, 3679]. Por lo tanto, las proteínas del antígeno 85 se considera que son buenas dianas de vacuna.

Sumario de la invención

Para probar la eficacia de la inmunización con DNA en la prevención de enfermedad por M. tb, las secuencias del DNA que codifican M. tb se clonaron dentro de vectores de expresión eucariotas. Estas construcciones de DNA facilitan una respuesta inmune cuando se inyectan dentro de animales. Los animales inmunizados están infectados con micobacterias para evaluar si la inmunización directa con DNA con el gen (u otros genes de M. tb) podría protegerlos de la enfermedad. Los ácidos nucleicos, incluyendo construcciones de DNA y transcritos de RNA, capaces de inducir expresión in vivo de proteínas en introducción directa dentro de tejidos animales por medio de inyección o de otro modo se discuten por lo tanto. La inyección de estos ácidos nucleicos puede facilitar las respuestas inmunes las cuales resultan en la producción de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para antígenos M. tb, igual que la generación de respuestas de linfocitos T ayudantes específicas de M. tb, las cuales son protectoras en el desafío subsiguiente. Estos ácidos nucleicos son útiles como vacunas para inducir inmunidad a M. tb., las cuales pueden prevenir infección y/o mejorar la enfermedad relacionada con M. tb.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Se muestra principio general para clonar genes de M. tb dentro de vectores de expresión.

Figura 2. Se muestra mapa de vectores de V1Jns.tPA85A.C1.

Figura 3. Se muestra mapa de vectores de V1Jns.tPA85A.C2.

Figura 4. Se muestra mapa de vectores de V1Jns.tPA85A.C3.

Figura 5. Se muestra mapa de vectores de V1Jns.tPA85A.C1.

Figura 6. Se muestra mapa de vectores de V1Jns.tPA85C.C1.

Figura 7. Se muestra secuencia N-terminal de verificación de las construcciones.

Figura 8: Se muestra expresión de proteínas M. tb en cultivo de tejidos.

Figura 9: Se muestra la producción de anticuerpos específicos del antígeno 85A en ratones vacunados con DNA.

Figura 10: Se muestra producción de IL-2 en ratones BALB/c mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 11: Se muestra producción de IL-2 en ratones C57BL/6 mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 12: Se muestra producción de IL-\gamma en ratones BALB/c mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 13: Se muestra producción de IL-\gamma en ratones C57BL/6 mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 14: Se muestra la falta de producción de IL-4 en ratones BALB/c mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 15: Se muestra la falta de producción de IL-6 en ratones mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 16: Se muestra la falta de producción de IL-10 en ratones mediante una vacuna de DNA de Tb.

Figura 17: Se muestra la reducción de la multiplicación de BCG en pulmones de ratones C57BL/6 vacunados con una vacuna de DNA de Tb.

Figura 18: Se muestra la reducción de la multiplicación de BCG en pulmones de ratones BALB/c vacunados con una vacuna de DNA de Tb.

Figura 19: Se muestra la reducción de la multiplicación de BCG en bazos de ratones BALB/c vacunados con una vacuna de DNA de Tb.

Figura 20: Se muestra la reducción de la multiplicación de BCG en bazos de ratones C57BL/6 vacunados con una vacuna de DNA de Tb.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona polinucleótidos los cuales, cuando se introducen directamente dentro de un vertebrado in vivo, incluyendo mamíferos tales como humanos, inducen la expresión de proteínas codificadas dentro del animal. Como se usa en el presente documento, un polinucleótido es un ácido nucleico el cual contiene elementos reguladores esenciales tales que tras la introducción en una célula viva de vertebrado son capaces de dirigir la maquinaria celular para producir productos de traducción codificados por los genes que comprenden el polinucleótido. En una realización de la invención, el polinucleótido es un ácido polidesoxirribonucleico que comprende genes de Mycobacterium tuberculosis (M. tb) unidos operativamente a un promotor transcripcional. En otra realización de la invención la vacuna de polinucleótidos comprende ácido polirribonucleico que codifica genes M. tb los cuales son susceptibles de traducción mediante la maquinaria celular eucariota (ribosomas, RNAt, y otros factores de traducción). Donde la proteína codificada por el polinucleótido es una la cual normalmente no se da en ese animal excepto en condiciones patológicas (es decir, una proteína heteróloga) tal como proteínas asociadas con M. tb, el sistema inmune del animal se activa para desplegar una respuesta inmune protectora. Debido a que estas proteínas exógenas se producen por los propios tejidos del animal, las proteínas expresadas se procesan por el sistema principal de histocompatibilidad (MHC) en un modo análogo a cuando tiene lugar una infección real. El resultado, como se muestra en esta discusión, es la inducción de respuestas inmunes contra M.tb. Los polinucleótidos para el propósito de generar respuestas inmunes a una proteína codificada se refieren en la presente discusión como vacunas polinucleotídicas o PNV.

Hay muchas realizaciones en la presente invención, las cuales pueden apreciar los expertos en la técnica a partir de la especificación. Así, se pueden usar exitosamente diferentes promotores transcripcionales, terminadores, vectores transportadores o secuencias específicas de genes.

Así, se ha proporcionado una vacuna como se reivindica en la reivindicación 1. Se ha proporcionado adicionalmente un plásmido como se reivindica en la reivindicación 10.

La presente invención proporciona un procedimiento para usar un polinucleótido el cual, tras su introducción en tejido de mamífero, induce la expresión, in vivo, del polinucleótido que produce de este modo la proteína codificada. Es fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que se pueden producir las variaciones de los derivados de la secuencia nucleotídica que codifican una proteína que altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. La proteína expresada de forma alterada puede tener una secuencia de aminoácidos alterada, facilita respuestas inmunes las cuales reaccionan con la proteína micobacteriana todavía aún, y se consideran equivalentes funcionales. Además, fragmentos de los genes en su entera longitud los cuales codifican partes de la proteína en su entera longitud se pueden construir también. Estos fragmentos pueden codificar una proteína o péptido el cual facilita anticuerpos los cuales reaccionan con la proteína micobacteriana, y se consideran equivalentes funcionales.

En una realización de la invención, un gen que codifica un producto génico de M. tb se incorpora en un vector de expresión. El vector contiene un promotor transcripcional reconocido por la RNA polimerasa eucariota, y un terminador de transcripción al final de la secuencia codificante del gen. En una realización preferida, el promotor es el promotor de citomegalovirus con la secuencia del intrón A(CMV-intA), aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que se pueden usar cualesquiera de una serie de otros promotores conocidos tales como la inmunoglobulina fuerte, u otros promotores de genes eucarióticos. Un terminador de transcripción preferido es el terminador de la hormona del crecimiento bovina. Se prefiere la combinación del terminador CMVintA-BGH. Además, para ayudar en la preparación de los polinucleótidos en células procariotas, se incluye también opcionalmente un marcador de resistencia a antibióticos en el vector de expresión bajo control transcripcional de un promotor procariota adecuado. Se pueden usar los genes de resistencia a ampicilina, los genes de resistencia a neomicina o cualquier otro marcador de resistencia adecuado. En una realización preferida de esta invención, el gen de resistencia a antibióticos codifica un producto génico para la resistencia a neomicina/kanamicina. Adicionalmente, para ayudar en el alto nivel de producción del polinucleótido por crecimiento en organismos procariotas, es ventajoso para el vector contener un origen de replicación de procariotas y ser de alto número de copias. Cualquiera de una serie de vectores de clonación procariotas disponible comercialmente proporciona estos elementos. En una realización preferida de esta invención, estas funcionalidades se proporcionan mediante los vectores comercialmente disponibles conocidos como series pUC. Puede ser deseable, por lo tanto, eliminar secuencias de DNA no esenciales. Así, las secuencias codificantes lacZ y lacI de pUC se pueden eliminar. También es deseable que los vectores no sean capaces de replicarse en células eucariotas. Esto minimiza el riesgo de integración de secuencias de vacunas polinucleotídicas dentro del genoma del receptor.

En otra realización, se usa el vector de expresión pnRSV, en la que la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV) se usa como el promotor. En aún otra reivindicación, V1, se usa un vector pBR322 mutado dentro del cual están clonados el promotor CMV y el terminador de transcripción BHG. En una realización preferida de esta invención, los elementos de V1 y pUC19 se han combinado para producir un vector de expresión llamado V1J.

Dentro de V1J, V1JtPA u otro vector de expresión deseable, se clona un gen M. tb, tal como uno de los genes del complejo antígeno 85, o cualquier otro gen de M. tb el cual puede inducir respuestas inmunes anti-M. tb (CTL, linfocitos T ayudantes y anticuerpos. En otra realización, el gen de resistencia a ampicilina se elimina de V1J y se reemplaza con un gen de resistencia a neomicina, para generar V1J-neo, dentro del cual cualquiera de una serie de diferentes genes de M. tb se puede clonar para usar de acuerdo a esta invención. En aún otra realización, el vector es V1Jns, el cual es el mismo que V1Jneo excepto en que un único sitio de restricción Sfi1 se ha modificado en el sitio individual Kpn1 en la posición 2114 de V1J-neo. La incidencia de sitios Sfi1 en el DNA genómico humano es muy baja (aproximadamente 1 sitio por cada 100.000 bases). Así, este vector permite la monitorización cuidadosa para la integración del vector de expresión dentro del DNA del hospedador, simplemente mediante digestión con Sfi1 o DNA genómico extraído. En una realización adicional, el vector es V1R. En este vector, se "recorta" tanto DNA no esencial como es posible para producir un vector altamente compacto. Este vector permite insertos más grandes para usarse, con menos en los que se refiere a secuencias indeseables se codifican y se optimiza la captación por células cuando los genes del virus específicamente codificados en la construcción se introducen dentro del tejido circundante. Los procedimientos usados en producir las siguientes modificaciones del vector y procedimientos de desarrollo se pueden realizar de acuerdo con procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

A partir de este trabajo aquellos expertos en la técnica reconocerán que una de las utilidades de la invención actual es para proporcionar un sistema para prueba y análisis in vivo igual que in vitro tal que se puede hacer una correlación de diversidad de secuencia de M. tb con respuestas proliferativas de CTL y células T igual que con otros parámetros. El aislamiento y clonación de estos genes diversos se puede llevar a cabo de acuerdo a procedimientos conocidos en la técnica por aquellos expertos en la técnica. Esta invención proporciona adicionalmente un procedimiento para la identificación sistemática de cepas M. tb y secuencias para la producción de vacunas. La incorporación de genes a partir de aislados primarios de cepas M. tb proporciona un inmunógeno el cual induce una respuesta inmune contra aislados clínicos del organismo y así se encuentra una necesidad como aún no se ha encontrado en el campo. Además, si los aislados virulentos cambian, el inmunógeno se puede modificar para reflejar nuevas secuencias según sea necesario.

En una realización de esta invención, un gen que codifica una proteína M. tb se une directamente a un promotor transcripcional. El uso de promotores o potenciadores específicos de tejido, por ejemplo el elemento potenciador de la creatina quinasa del músculo (MCK) puede ser deseable para limitar la expresión del polinucleótido a un tipo de tejido particular. Por ejemplo, los miocitos son células diferenciadas de forma terminal las cuales no se dividen. La integración de DNA extraño dentro de los cromosomas parece requerir tanto división celular como síntesis de proteínas. Así, puede ser preferible limitar la expresión de proteínas a las células que no se dividen tales como miocitos. Sin embargo, el uso del promotor CMV es adecuado para lograr la expresión en muchos tejidos dentro de los cuales se introduce PNV.

Genes de M. tb y otros están preferiblemente ligados dentro de un vector de expresión el cual se ha optimizado específicamente para vacunaciones con polinucleótidos. Los elementos incluyen un promotor transcripcional, epítopos inmunogénicos, y cistrones adicionales que codifican genes inmunopotenciados o inmunomoduladores, con sus propios promotores, terminador de transcripción, origen de replicación bacteriano y gen de resistencia a antibióticos, como se describe en el presente documento. Opcionalmente, el vector puede contener sitios de entrada al ribosoma internos (IRES) para la expresión de un RNAm policistrónico. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el RNA el cual se ha transcrito in vitro para producir RNAm policistrónicos codificados por los equivalentes de DNA está dentro del alcance de esta invención. Para este propósito, es deseable usar como el promotor transcripcional promotores de RNA polimerasa poderosos tales como los promotores T7 o SP6, y llevar a cabo transcripción continuada in vitro con una plantilla de DNA linealizada. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica.

La eficacia protectora de inmunógenos de M. tb polinucleotídicos contra el desafío subsiguiente se demuestra mediante inmunización con el DNA de esta invención. Esto es ventajoso dado que no está implicado ningún agente infeccioso, no se requiere ningún ensamblaje/replicación de bacterias, y se permitiría selección determinante. Además, debido a que la secuencia de productos de genes micobacterianos se puede conservar entre diversas cepas de M. tb, se obtiene protección contra el desafío subsiguiente mediante otra cepa de M. tb.

La inyección de un vector de expresión de DNA que codifica antígeno 85A, B o C puede dar como resultado la generación de inmunidad protectora significativa contra el desafío subsiguiente. En particular, se pueden producir CTL específicos y respuestas de linfocitos T ayudantes.

Debido a que cada uno de los productos de genes de M. tb muestran un alto grado de conservación entre las diversas cepas de M. tb y debido a que las respuestas inmunes se pueden generar en respuesta a expresión intracelular y procesamiento de MHC, se espera que muchas construcciones PNV de M. tb diferentes puedan dar origen a respuesta inmunes de reactividad cruzada.

La invención ofrece un medio para inducir inmunidad heteróloga protectora sin la necesidad de autorreplicar agentes o coadyuvantes. La generación de anticuerpos de valoraciones alta contra proteínas expresadas después de la inyección de DNA de proteína viral y de la hormona del crecimiento humana [Tang, y col., Nature 356, 152, 1992], indica que éste es un medio fácil y altamente efectivo de hacer vacunas basadas en anticuerpos, bien por separado o bien en combinación con vacunas de linfocitos T citotóxicos y linfocitos T ayudantes dirigidos contra antígenos conservados.

La facilidad de producir y purificar construcciones de DNA se compara preferiblemente con la purificación tradicional de proteínas, facilitando la generación de vacunas de combinación. Así, se pueden preparar, mezclar y coadministrar construcciones múltiples, por ejemplo genes codificadores del complejo antígeno 85 y cualquier otro gen de M. tb incluyendo también genes que no son de M. tb. Adicionalmente, la expresión de proteína se mantiene tras la inyección de DNA (H. Lin y col., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88, 4138 (1991); E. Hansen y col., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao y col., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff y col., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)], la persistencia de células B y T de memoria se puede potenciar [D. Gray y P. Matzinger, J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S. Oehen y col., ibid, 176, 1273 (1992)], generando de este modo inmunidad de larga vida mediada por células y humoral.

La cantidad de DNA expresable o RNA transcrito para introducirse dentro de un recipiente de vacuna tendrá un muy amplio intervalo de dosificación y puede depender de la fuerza de los promotores de transcripción y traducción usados. Además, la magnitud de la respuesta inmune dependerá del nivel de expresión de proteína y de la inmunogenicidad del producto del gen expresado. En general unos intervalos de dosis efectivos varían de aproximadamente 1 ng a 5 mg, de 100 ng a 2,5 mg, de 1 \mug a 150 \mug, y preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a 300 \mug de DNA se administran directamente dentro del tejido muscular. También son adecuadas la inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel, y otros modos de administración tales como administración intraperitoneal, intravenosa, o por dispositivo de inhalación. Se contempla también que se pueden proporcionar vacunaciones de refuerzo. Tras la vacunación con inmunógeno polinucleotídico de M. tb, se contempla también el refuerzo con inmunógenos proteicos de M. tb tales como los productos génicos del complejo antígeno 85. Puede ser ventajosa la administración parenteral, tal como administración intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios de administración de la proteína interleucina-12 (u otras citoquinas, por ejemplo GM-CSF), concurrentemente con o subsiguiente a la introducción parenteral del PNV de esta invención.

El polinucleótido puede estar desnudo, es decir, no asociado con proteínas, coadyuvantes u otros agentes cualesquiera los cuales afecten el sistema inmune de los receptores. En este caso, es deseable para el polinucleótido estar en una disolución fisiológicamente aceptable, tal como, pero no limitada a, disolución salina estéril o disolución salina tamponada estéril. Alternativamente, el DNA se puede asociar con liposomas, tales como liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de liposomas, o el DNA puede estar asociado con un coadyuvante conocido en la técnica por reforzar respuestas inmunes, tales como una proteína u otro vehículo. Agentes los cuales ayudan en la captación celular de DNA, tales como, pero no limitados a, iones de calcio, también se pueden usar. Estos agentes se refieren generalmente en el presente documento como reactivos facilitadores de la transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Las técnicas para recubrir microproyectiles recubiertos con polinucleótido se conocen en la técnica y son también útiles en la conexión con esta invención. Para el DNA deseado para usar en humanos puede ser útil tener el producto final de DNA en un vehículo farmacéuticamente aceptable o disolución tampón. Los vehículos farmacéuticamente aceptables o la disoluciones tampón se conocen en la técnica e incluyen aquellas descritas en una diversidad de textos tales como Remington's Pharmaceutical Sciences.

En otra realización, la invención es un polinucleótido el cual comprende secuencias contiguas de ácidos nucleicos capaces de expresarse para producir un producto génico en la introducción de dicho polinucleótido en tejidos eucariotas in vivo. El producto codificado en el gen actúa preferiblemente bien como un inmunoestimulador o bien como un antígeno capaz de generar una respuesta inmune. Así, las secuencias de ácidos nucleicos en esta realización codifican un epítopo de M. tb inmunogénico, y opcionalmente una citoquina o un elemento coestimulatorio de células T, tales como un miembro de la familia de proteínas B7.

Hay varias ventajas de inmunización con un gen más que con su producto génico. La primera es la relativa simplicidad con la cual el antígeno nativo o cercano al nativo se puede presentar al sistema inmune. Las proteínas de mamífero expresadas recombinantemente en bacterias, levadura, o incluso células de mamíferos requieren a menudo tratamiento extensivo para asegurar antigenicidad apropiada. Una segunda ventaja de inmunización con DNA es el potencial del inmunógeno para entrar en la ruta del MHC de clase I y provocar una respuesta de células T citotóxicas. La inmunización de ratones con DNA que codifica la nucleoproteína A de la gripe (NP) facilitó una respuesta CD8+ a NP que protegió a los ratones contra desafío con cepas heterólogas de gripe (Montgomery, D.L., y col., supra; Ulmer, J. y col., supra).

Hay evidencia fuerte de que la inmunidad mediada por células es importante en controlar la infección por M. tb [Orme y col., 1993, J. Infect. Dis. 167, 1481; Cooper y col., 1993, J. Exp. Med. 178, 2243; Flynn y col., 1993, J. Exp. Med. 178, 2249: Orme y col., 1993, J. Immunol. 151, 518]. Dado que la inmunización con DNA puede provocar tanto respuestas inmunes humorales como respuestas inmunes mediadas por células, su ventaja mayor puede ser que proporciona un procedimiento relativamente simple para sobrevivir un gran número de genes de M. tb por su potencial de vacuna.

La inmunización mediante inyección de DNA permite también, como se discute anteriormente, el ensamblaje fácil de subunidades de vacunas multicomponentes. Se ha descrito recientemente la inmunización simultánea con genes múltiples de la gripe (Donnelly, J. y col., 1994, Vaccines, páginas 55-59). La inclusión de genes en una vacuna contra M. tb cuyos productos activan diferentes ramas del sistema inmune pueden proporcionar también protección a fondo contra el desafío subsiguiente.

Las vacunas de la presente invención son útiles para administración a animales domesticados o agrícolas, igual que a humanos. Las vacunas de la presente invención se pueden usar para prevenir y/o combatir la infección decualesquiera animales agrícolas, incluido pero no limitados a, ganado vacuno lechero, el cual es susceptible de infección micobacteriana. Las técnicas para administrar estas vacunas a animales y humanos se conocen por aquellos expertos en los campos de la salud humana y veterinaria, respectivamente.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención sin, sin embargo, limitar la misma a aquellos.

Ejemplo 1 Vectores para la producción de vacunas A) Vector de expresión V1

El vector de expresión V1 se construyó a partir de pCMVIE-AKI-DHFR [Y. Whang y col., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Los genes AKI y DHFR se eliminaron cortando el vector con EcoRI y autoligando. Este vector no contiene intrón A en el promotor CMV, de tal forma que se añadió como un fragmento que tiene un sitio SAC I interno eliminado [en 1855 según la numeración en B.S. Cahpman y col., Nuc. Acids Res. 19, 3979 (1991)]. La plantilla usada para las reacciones de PCR fue pCMVintA-Lux, fabricada ligando los fragmentos Hind III y Nhe I de pCMV6a120 [véase B.S. Champan y col., ibid], los cuales incluyen el potenciador/promotor de hCMV-IE1 y el intrón A, dentro del los sitios Hind III y Xba I de pBL3 para generar pCMVIntBL. El fragmento del gen de la luciferasa de 1881 pares de bases (Hind III-Sma I rellenado con Klenow) de RSV-Lux [J.R. de Wet y col., Mol. Cell. Biol. 7, 725, 1987] se clonó dentro del sitio Sal I del pCMVIntBL, el cual se rellenó con Klenow y se trató con fosfatasa.

Los cebadores que abarca el intrón A son:

cebador 5', SEQ. ID. 1:

5'-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3'; el cebador 3', SEQ ID: 2:

5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3'.

Los cebadores usados para eliminar el sitio Sac I son:

cebador en sentido correcto, SEQ ID 3:

5'-GTATGTGTCTGAAAATGAGGGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3'

y el cebador antisentido, SEQ ID: 4:

5'-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3'.

El fragmento de PCR se cortó con SacI y Bgl II y se insertó en el vector el cual se ha cortado con las mismas enzimas.

B) Vector de expresión V1J

El propósito al crear V1J fue eliminar el promotor y los elementos de terminación de la transcripción a partir del vector V1 con el fin de situarlos en un contexto más definido, crear un vector más compacto, y mejorar los rendimientos de purificación del plásmido.

V1J se deriva de los vectores V1 y pUC18, un plásmido comercialmente disponible. V1 se digirió con las enzimas de restricción Ssp I y Eco RI produciendo dos fragmentos de DNA. El menor de estos fragmentos, que contenía el promotor CMVintA y los elementos de terminación de la transcripción de hormona del crecimiento bovina (BGH) los cuales controlan la expresión de genes heterólogos, se purificaron a partir de un gel de electroforesis de agarosa. Los extremos de este fragmento de DNA se "hicieron romos" usando la DNA polimerasa T4 con el fin de facilitar su ligazón a otro fragmento de DNA "de extremos que se han hecho romos".

Se eligió pUC18 para proporcionar el "armazón" del vector de expresión. Se sabe que produce grandes producciones de plásmido, está bien caracterizado en secuencia y función, y es de pequeño tamaño. El operón lac completo se eliminó de este vector mediante digestión parcial con la enzima de restricción Hae II. El plásmido restante se purificó a partir de un gel de electroforesis de agarosa, los extremos se hicieron romos con la DNA polimerasa T4 y se trataron con la fosfatasa alcalina intestinal de ternero, y se ligaron al elemento CMVintA/BHG descrito anteriormente. Se obtuvieron los plásmidos que exhiben una de dos orientaciones posibles de los elementos del promotor con el armazón de pUC. Uno de estos plásmidos dio producciones mucho mayores de DNA en E. coli y de designó V1J. Esta estructura de vector se verificó mediante análisis de secuencia de las regiones de articulación y se demostró subsiguientemente para dar expresión comparable o más amplia de genes heterólogos comparados con V1.

C) Vector de expresión V1Jneo

Fue necesario eliminar el gen amp^{r} usado para selección de antibióticos de bacterias que contienen V1J porque la ampicilina puede no ser deseable en fermentos a gran escala. El gen amp^{r} del armazón de pUC de V1J se eliminó mediante digestión con SsPI y enzimas de restricción Eam1105I. El plásmido restante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, y los extremos se hicieron romos con la DNA polimerasa T4, y después se trataron con la fosfatasa alcalina intestinal de ternero. El gen comercialmente disponible kan^{r}, derivado del trasposón 903 y contenido en el plásmido pUCK, se escindió usando la enzima de restricción PstI, se purificó mediante gel de electroforesis de agarosa, y los extremos se hicieron romos con la DNA polimerasa T4. Este fragmento se ligó con la estructura V1J y se derivaron plásmidos con el gen kan^{r} en cualquier orientación los cuales se designaron como V1Jneo #'s 1 y 3. Cada uno de estos plásmidos se confirmó mediante análisis por digestión con enzimas de restricción, secuenciación de DNA de las regiones de articulación, y mostró producir cantidades similares de plásmido como V1J. La expresión de productos de genes heterólogos fue también comparable a V1J para esos vectores V1Jneo. Se seleccionó el V1Jneo#3, referido como V1Jneo en una parte subsiguiente de este documento, el cual contenía el gen kan^{r} en la misma orientación que el gen amp^{r} en V1J como la construcción de la expresión.

D) Vector de expresión V1Jns

Un sitio Sfi I se añadió a V1Jneo para facilitar los estudios de integración. Un ligando de Sfi I de 13 pares de bases comercialmente disponible (New England Biolabs) se añadió en el sitio Kpn I, se purificó en gel, se hizo romo mediante la DNA polimerasa T4, y se ligó al ligando romo de Sfi I. Los aislados clonales se eligieron mediante mapeo de restricción y se verificaron mediante secuenciación por el ligando. El nuevo vector se designó V1Jns. La expresión de geles heterólogos en V1Jns (con Sfi I) fue comparable a la expresión de los mismos genes en V1Jneo (con Kpn I).

E) V1Jns-tPA

Con el fin de proporcionar una secuencia de péptido líder heterólogo a proteínas segregadas y/o de membrana, V1Jns se modifico para incluir el activador de plasminógeno específico de tejido humano (tPA). Dos oligómeros sintéticos complementarios se fusionaron y después se ligaron en V1Jn el cual se ha digerido con Bg III. Los oligómeros en sentido correcto y antisentido fueron 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3', SEQ. ID: 5, y 5'-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3', SEQ. ID: 6. La secuencia Kozak está subrayada en el oligómero con sentido correcto. Estos oligómeros tienen bases salientes compatibles para la ligazón con secuencias escindidas con Bg III. Después de la ligazón el sitio Bg III se destruyó mientras el Bg III más adelante en la cena se mantiene para ligazones subsiguientes. Tanto los sitios de articulación como la secuencia líder completa tPA se verificaron mediante secuenciación de DNA. Adicionalmente, con el fin de buscar conformidad con el vector optimizado consenso V1Jns (= V1Jneo con un sitio Sfi I), se situó un sitio de restricción Sfi I en el sitio cPU en la región terminadora BGH de V1Jn-tPA haciendo romo el sitio Kpn I con DNA polimerasa T4 seguido por ligazón con un ligando SfiI (catálogo #1138, New England Biolabs). Esta modificación se verificó mediante digestión de restricción y electroforesis con gen de agarosa.

F) pGEM-3-X-IRES-B7

(Donde X = cualquier gen antigénico). Como un ejemplo de una construcción de vacuna dicistrónica la cual proporciona expresión coordinada de un gen que codifica una proteína inmunoestimuladora, el gen B7 murino se amplificó mediante PCR a partir de la línea celular CH1 del linfoma B (obtenida a partir de ATCC). B7 es un miembro de una familia de proteínas la cual proporciona coestimulación esencial de activación de células T mediante antígeno en el contexto del los complejos principales de histocompatibilidad I y II. Las células CH1 proporcionan una buena fuente de RNAm de B7 debido a que tienen el fenotipo de activarse constitutivamente y B7 se expresa principalmente mediante células presentadoras de antígeno activadas tales como células B y macrófagos. Estas células se estimularon adicionalmente in Vitro usando CMPC o IL-4 y el RNAm se preparó usando este RNAm usando el kit de PCR RNA GeneAmp (Perkin-Elmer CETUS) y un oligómero que ceba (5'-GTA CCT CAT CAG CCA CAT AAT ACC ATG-3', SEQ. ID: 7) específico para B7 localizado más adelante en la cadena de la fase de lectura traduccional abierta. B7 se amplificó mediante PCR usando los siguientes oligómeros en sentido correcto o antisentido: 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3', SEQ. ID: 8, y 5'-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAG GAA GAC GGT CTG TTC-3', SEQ. ID:9, respectivamente. Estos oligómeros proporcionan sitios de la enzima de restricción Bg III en los extremos del inserto igual que una secuencia de iniciación de la traducción conteniendo un sitio de restricción Nco I y un sitio de restricción adicional Nco I localizado inmediatamente antes del sitio 3'-terminal Bg III. La digestión con Nco I produjo un fragmento adecuado para clonar dentro de pGEM-3-IRES el cual se digirió con Nco I. El vector resultante pGEM-3-IRES-B7, contiene una cassette IRES-B7 la cual puede transferirse fácilmente a VIJns-X, donde X representa un gen que codifica un antígeno.

G) pGEM-3-X-IRES-GM-CSF

(Donde X = cualquier gen antigénico). Este vector contiene una cassette análoga a aquella descrita en el item C anterior excepto en que el gen de la citoquina inmunoestimuladora, GM-CSF, se usa más que B7. CM-CSF es una citoquina de diferenciación y estimulación de macrófagos la cual ha mostrado facilitar potentes actividades de células T antitumorales in vivo [G. Dranoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A, 90, 3539 (1993)].

H) pGEM-3-X-IRES-IL-12

(Donde X = cualquier gen antigénico). Este vector contiene una cassette análoga a aquella descrita en el item C anterior excepto en que el gen de la citoquina inmunoestimuladora, IL-12, se usa más que B7. Se ha demostrado que IL-12 tiene un papel influyente en cambiar las respuestas inmunes hacia las rutas celulares, dominadas por las células T en oposición a las respuestas humorales [L. Alfonso y col., Science, 263, 235, 1994].

Ejemplo 2 Preparación del vector V1R

En un esfuerzo por continuar optimizando el vector de vacunación básico, se preparó un derivado de V1Jns, designado VR1. El propósito para esta construcción vector fue obtener una vacuna de tamaño mínimo sin secuencias de DNA innecesarias, las cuales retienen aún sus características de expresión de genes heterólogos optimizados en general y altas producciones de plásmidos que proporcionan V1J y V1Ins. Se determinó a partir de la literatura igual que mediante experimentos que (1) las regiones en el armazón de pUC comprenden el origen de replicación de E. coli se pueden eliminar sin afectar la producción de plásmidos de la bacteria; (2) la región 3' del gen kan^{r} tras la fase de lectura abierta de kanamicina se pudo eliminar si se insertó un terminador bacteriano en este lugar; y, (3) \simeq 300 pares de bases de la mitad 3' del terminador BCH se pueden eliminar sin afectar su función reguladora (tras el sitio original de la enzima de restricción Kpn I en el elemento BGH).

Se construyó V1R usado PCR para sintetizar tres segmentos de DNA a partir de los cuales V1Jns representa el promotor CMVintA/terminador BGH, origen de replicación, y elementos de resistencia a kanamicina, respectivamente. Las enzimas de restricción únicas para cada segmento se añadieron a cada extremo de los segmentos usando los oligómeros de PCR: SspI y XhoI para CMVintA/BGH; EcoR V y Bamh I para el gen kan^{r}; y, Bcl I y Sal I para el ori^{r}. Estos sitios de enzimas se eligen porque permiten ligazón direccional de cada uno de los segmentos de DNA derivados de PCR con pérdida subsiguiente de cada sitio: EcoR V y Ssp I deja los DNA de extremos romos los cuales son compatibles para ligazón mientras BamH I y Bc II dejan extremos complementarios que sobresalen como hacen Sal I y Xho I. Después de obtener estos segmentos mediante PCR cada segmento se digirió con las enzimas de restricción apropiadas indicadas anteriormente y después se ligaron juntos en una mezcla de reacción simple que contiene todos los tres segmentos de DNA. El extremo 5' del ori^{r} se diseñó para incluir el terminador independiente de rho que se encuentra normalmente en esta región de tal forma que puede proporcionar información de terminación para el gen de resistencia a la kanamicina. El producto ligado se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción (>8 enzimas) igual que mediante secuenciación de DNA de las articulaciones de ligazón. Los productos del plásmido de DNA y la expresión heteróloga que usa genes virales con V1R parecen similares a V1Jns. La reducción neta lograda en tamaño del vector fue de 1346 pb (V1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb).

Las secuencias de oligómero de PCR usadas para sintetizar V1R (sitios de enzimas de restricción están subrayadas e identificadas entre paréntesis a continuación de la secuencia):

(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [Sssp I], SEQ. ID.: 10,

(2) 5'-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [Xho I], SEQ. ID.: 11.

(para el segmento CMVintA/BHG)

(3) 5'-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3'[EcoR V], SEQ. ID.: 12

(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamH I], SEQ. ID.: 13

(para el segmento del gen de resistencia a kanamicina)

(5) 5-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3'[BCL I], SEQ. ID.: 14,

(6) 5-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [Sal I], SEQ. ID.: 15

(para el origen de replicación de E. coli)

Ejemplo 3 Cultivo celular y transfección

Para la preparación de líneas celulares que expresan antígenos M. tb. establemente transfectadas se dejaron crecer a 37ºC células RD (células de rabdosarcoma humano ATCC CCL 136) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 20 mM HEPES, L-glutamina 4 mM, y 100 \mug/ml cada uno de penicilina y estreptomicina. Las células se sembraron a 1,5 x 10^{6}células/100 mm^{2} de placa y se dejaron crecer durante 18 horas. Las células se transfectaron con 10 \mug/placa de la construcción de TB y 10 \mug de Cat cotransfectado usando el kit CellPhect (Pharmacia), y se las sometió a un choque de glicerol (glicerol al 15% en PBS, a pH 7,2 durante 2,5 minutos) 5 horas después se añadió DNA a las células. Los cultivos se recogieron 72 horas después de la transfección lavando las placas con 2x-10 ml de ml de PBS frío, pH 7,2, añadiendo 5 ml de tampón TEN frío (TRIS-Cl 40 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) y raspando. Para análisis de la expresión de proteínas, los sedimentos se lisaron en 50 \mul de Tampón de Lisis Detergente Simple (tirs-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NaN3 0,02%, Nonidet P-40 al 1%, PMSF 100 mM, aprotinina 2 \mug/ml, leupeptina 2 \mug/ml, y pepstatina A 1 \mug/ml) y sonicado en hielo (ráfagas de 2-15 segundos). Los lisados se centrifugaron a 13.000 x g, 4ºC, durante 10 minutos. La concentración de proteínas se determinó mediante el procedimiento Bradford y se aplicaron 20 \mug de proteína de extracto celular por carril a un gel de poliacrilamida con un 10% de poliacrilamida (Novex), después se transfirió a membrana Immobilon P (Millipore). Los inmunoblots se hicieron reaccionar durante toda una noche con una dilución 1:20 del anticuerpo monoclonal de ratón TD 17-4 [Huygen y col., 1994, Infect. Immunity 62, 363], seguido por 1,5 horas de reacción con una dilución 1:1000 de peroxidasa IgGFc de cabra antirratón (Jackson). Las bandas se desarrollaron usando el kit ECL (Amersham).

Ejemplo 4 Clonación y preparación del DNA

1. La construcción de V1Jns-tPA-85A (contiene Ag85A maduro con secuencia señal de tPA) se hizo usando los siguientes cebadores:

cebador de sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 16]

GC AAG ATC TTT TCC CGG CCG GGC TTG CCG {}\hskip1cm Bgl II

cebador antisentido 85A [SEQ. ID. Nº.: 17]

GGAAGATCTTGTCTGTTCGGAGCTAGGC.

El Ag85 de M. tuberculosis se amplificó a partir de plásmido p85A.tub, el cual se preparó ligando un fragmento Hind III a un fragmento Hind III-Sph I de 1600 pb a partir de la figura 2 de Borremans y col., 1989 [Infect. Immunity 57, 3123]. El inserto resultante de 2400 pb se subclonó en los sitios Hind III y Sph I en el M13+ BlueScribe. La secuencia codificante completa y las regiones flanqueantes en el M13+ Bluescribe (VCS/Stratagene) se amplificaron mediante PCR con los cebadores indicados en las siguientes condiciones. Cada 100 \mul de reacción contienen 2,5 unidades clonadas de DNA polimerasa Pfu (Stratagene), dNTP 200 mM, 0,5 \mug de cada cebador y 250 ng de DNA plantilla en el tampón de reacción suplementado con el enzima (Stratagene). El Reactor Termal Hybaid se programó como sigue: 5 minutos de desnaturalización a 94ºC seguidos por 95 ciclos (1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3 minutos a 72ºC) finalizando con 10 minutos de extensión a 72ºC.

El DNA amplificado se digirió con 50 \mug/ml de proteinasa K (Boehringer Mannheim) durante 30 minutos a 37ºC, se calentó 10 minutos a 95ºC seguidos por 2 extracciones con fenol (cloroformo-alcohol isoamílico) y se precipitó con 1 volumen de isopropanol, se lavó dos veces con etanol al 70%, se secó y se disolvió en 20 \mul de H_{2}O. Se digirieron 3 \mug de DNA amplificado con 40 unidades de Bgl II (Boehringer Mannheim) y el fragmento de 907 pb (en el caso de 85A-l) se aisló en un gel de agarosa al 1% y se extrajo en "prep. A Gene" (Biorad) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Cincuenta ng de este fragmento se ligaron a 20 ng del vector V1Jns.tPA digerido con Bg1 II y defosforilado en 10 \mul de reacción conteniendo 2,5 unidades de DNA T4 ligasa (Amersham) en tampón de ligazón durante 16 horas a 14ºC, se transformaron en E. coli (BRL) DH5 competentes y se plaquearon en kanamicina (50 \mug/ml) conteniendo medio LB con agar. Los transformantes se recogieron y su DNA plasmídico se digirió con enzima de restricción Bgl II (para confirmar la presencia del inserto) y con Pvu II para definir su orientación.

2. La construcción de V1Jns-85A [C2] (contiene Ag85A maduro sin ninguna secuencia señal) se hizo usando los siguientes cebadores:

85A C2 en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 18]

GGAAGATCTACC ATG GGC TTT TCC CGG CCG CCG GGC TTG C

85A antisentido [SEQ. ID. Nº.: 17]

GGAAGATCTTGCTGTGTTCGGAGCTAGGC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la clonación fue en V1Jns.

3. La construcción de V1Jns-85A [C3] (contiene Ag85A con su propia secuencia señal) se hizo usando los cebadores:

85A C2 en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 19]

GGAAGATCTACC ATG GCA CAG CTT GTT GAC AGG GTT

85A antisentido [SEQ. ID. Nº.: 17]

GGAAGATCTTGCTGTGTTCGGAGCTAGGC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la clonación fue en V1Jns.

4. La construcción de V1Jns-tPA-85B [C1] (contiene Ag85B con la secuencia señal tPA) se hizo usando los siguientes cebadores:

85B [C1] en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 20]

GGAAG ATC TCC TTC TCC CGG CCG GGG CTG CCG GTC GAG

85B antisentido [SEQ. ID. Nº.: 21]

GGAAGATCTAACCTTCGGTTGATCCCGTGCAGCC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la plantilla para PCR fue p85B.tub.

5. La construcción de V1Jns-tPA-85C [C1] (contiene Ag85B con la secuencia señal tPA) se hizo usando los siguientes cebadores:

85C [C1] en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 22]

GGAAG ATC TCC TTC TCT AGG CCC GGT CTT CCA

85C antisentido [SEQ. ID. Nº.: 23]

GGAAGATCTTGCCGATGCTGGCTTGCTGGCTCAGGC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la plantilla para PCR fue p85B.tub.

6. La construcción de V1Jns-85B [C2] (contiene Ag85B con la secuencia señal tPA) se hizo usando los siguientes cebadores:

85B [C2] en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 24]

GGA AGA TCT ACC ATG GGC TTC TCC CGG CCG GGG CTG C

85B antisentido [SEQ. ID. Nº.: 21]

GGAAGATCTAACCTTCGGTTGATCCCGTGCAGCC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la plantilla para PCR fue p85B.tub y se clonó en V1Jns.

7. La construcción de V1Jns-tPA-85B [C1] (contiene Ag85B con la secuencia señal tPA) se hizo usando los siguientes cebadores:

85C [C2] en sentido correcto [SEQ. ID. Nº.: 25]

GGA AGA TCT ACC ATG GGC TTC TCT AGG CCC GGT CTT C

85C antisentido [SEQ. ID. Nº.: 23]

GGAAGATCTTGCCGATGCTGGCTTGCTGGCTCAGGC.

Se siguió el mismo procedimiento que anteriormente en 1, excepto en que la plantilla para PCR fue p85B.tub y se clonó en V1Jns.

Después de los análisis de restricción todas las construcciones se secuencian parcialmente a través de las uniones de los vectores. La preparación de DNA a gran escala fue esencialmente como se describe (Montgomery, D.L. y col., supra).

Las construcciones de plásmidos se caracterizan mediante mapeo de restricción y análisis de secuencia de las uniones vector-inserto (véanse figuras 1-6). Los resultados fueron consistentes con los datos de la secuencia de M. tb publicada y mostraron que el codón de iniciación estuvo intacto para cada construcción (figura 7). También se muestran los diversos residuos de aminoácidos no relacionados con M. tb. Ag85 que se insertan como un resultado se la clonación.

Ejemplo 5 Expresión de proteínas de M. tb a partir de plásmidos V1Jns.tPA

Se sembraron células de rabdomiosarcoma (ATCC CCL136) un día antes de usar a una densidad de 1,2 x 10^{6} células por 9,5 cm^{2} de pocillo en celdillas de cultivo de tejidos de seis pocillos en DMEM con glucosa alta suplementado con suero fetal de ternero inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mM, HEPES 25 mM, penicilina a 50 U/ml y estreptomicina a 50 \mug/ml. (Todo a partir de BRL-Gibco). El DNA plasmídico purificado con cloruro de cesio extraído con fenol:cloroformo se precipitó con fosfato de calcio usando reactivos de Pharmacia CellPhect de acuerdo con el kit de instrucciones excepto en que se usan 5-15 \mug de células RD por cada pocillo de 9,5 cm^{2}. Los cultivos se sometieron a un choque con glicerol seis horas después de la adición de fosfato de calcio-precipitado de DNA; después de realimentación los cultivos se incubaron durante dos días previos a la recolección.

Los lisados de cultivos transfectados se prepararon en RIPA 1X (SDS al 0,5%, TRITÓN-X-100 al 1,0%, desoxicolato de sodio al 1%, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, TRIS-HCl 25 Mm A pH 7,4) suplementado con leupeptina 1 \muM, pepstatina 1 \muM, aprotinina 300 nM, y TLCK 10 1 \muM, y brevemente sonicado para reducir viscosidad. Los lisados se redisolvieron mediante electroforesis en geles de Tricina al 10% (Novex) y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los inmunoblots se procesaron con anticuerpos monoclonales 17/4 y 32/15 contra M. tb [Huygen y col., 1994, Infect. Immunity 62, 363] y se desarrollaron con el kit de detección ECL (Amersham).

La expresión de los genes del complejo 85 antigénico de M. tb se demostró mediante transfección transitoria de células RD. Lisados de células transfectadas o células falsamente transfectadas se fraccionaron mediante SDS PAGE y se analizaron mediante realización de inmunoblot. La figura 8 muestra que las células RB transfectadas con V1Jns.tPA-85A (C1), V1Jns.tPA-85A (C2), V1Jns.tPA-85A (C3), y V1Jns.tPA-85B (C1) expresan una proteína inmunorreactiva con un peso molecular aparente de aproximadamente 30-32 kDa.

Ejemplo 6 Inmunización con PNV y expresión de proteínas de antígeno 85 in vivo

Se anestesiaron Ratones BALB/c y C57BL/6 hembra de cinco a seis semanas de edad mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de 5 mg de HCl de ketamina (Aveco, Fort Dodge, IA) y 0,5 mg de xilazina (Mobley Corp, Shawnee, KS.) en medio salino. Las patas traseras se lavaron con etanol al 70%. A los animales les inyectaron tres veces con 100 \mul de DNA (2 mg/ml) suspendido en disolución salina: 50 \mul en cada pata. En los días 17-18 después de la inmunización, se recolectaron las muestras de suero y se analizaron para comprobar la presencia de anticuerpos anti-Ag85. La figura 9 muestra reactividad específica de inmunoblot de sueros de ratones inyectados con DNA de Ag85 (C1) pero no de ratones que recibieron un DNA control que no contenía un inserto génico (V1J). Se detectó reactividad a una disolución de suero de al menos 1:160 contra 300 ng de antígeno purificado 85A (figura 9b). Esto demuestra que la inyección de DNA de Ag85 resulta en expresión in vivo de Ag85 tal que estuvo disponible para la generación de respuestas de anticuerpos tanto en ratones BALB/c como en ratones C57BL/6 (B6).

Ejemplo 7 Respuestas de células T específicas contra el antígeno 85

Las células del bazo de ratones vacunados se analizaron en busca de secreción de citoquinas en respuesta a reestimulación específica con antígenos como se describen en Huygen y col., 1992 [Infect.Immunity 60, 2880]. Específicamente, las células del bazo se incubaron con proteínas de filtrado de cultivo (CF) de antígeno 85A purificado de BCG de M. bovis o un péptido 20-mer (p25) correspondiente a un epítopo celular de células T conocido por ratones C57BL/6 (aminoácidos 241.260). Los ratones se inmunizaron con V1Jns.tPA85A (C1) (100 \mug) tres veces con intervalos de tres semanas y se analizaron 17 días después de la inyección final. Las citoquinas se ensayaron usando bioensayos para IL-2, interferón-\gamma (IFN-\gamma) e IL-6, y por ELISA para IL-4 e IL-2. La producción sustancial de IL-2 e IFN-\gamma se observó en ratones BALB/c como en ratones C57BL/6 (B6) vacunados con V1Jns.tPA85A (C1) (figuras 10-13). Además, ratones C57BL/6 reaccionan también al epítopo de células T restringido H-2^{b} (figura 13). Los niveles de IL-4, IL-6 e IL-10 no se incrementaron en ratones vacunados con V1Jns.tPA85A (figuras 14-16). Estos resultados indican que una respuesta de células T ayudantes de tipo T_{h}1 se generó por la vacuna de DNA.

Ejemplo 8 Protección al desafío micobacteriano

Para probar la eficacia de una vacuna de DNA de M. tb, se probaron ratones con una inyección intravenosa de M. bovis BCG vivas (0,5 mg)y la multiplicación de BCG se analizó en los bazos y pulmones. Como controles, la multiplicación de BCG se midió en ratones probados no modificados (primera infección) y ratones probados que se vacunaron con BCG al tiempo de la inyección de DNA (infección secundaria). El número de unidades formadoras de colonia (CFU) en pulmones de ratones vacunados con (C1) V1Jns.tPA85A se redujo sustancialmente comparado con ratones con infección primaria o ratones vacunados con DNA VJ1 control. En ratones C57BL/6, se redujeron las CFU en un 83% en el día 8 después del desafío (figura 17) y en ratones BALB/c se redujeron las CFU en un 65% en el día 20 (figura 18). En el bazo, se redujo CPU en aproximadamente el 40% en el día 20 después del desafío en ratones BALB/c (figura 19) y en el día 8 en ratones C57BL/6 (figura 20). Por lo tanto, las respuestas inmunes observadas después de la inyección de una vacuna de DNA M. tb proporcionan protección en un modelo de desafío de M. bovis vivas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: CONTENT, JEAN

\hskip3,9cm

HUYGEN, KRIS

\hskip3,9cm

LIU, MARGARET A.

\hskip3,9cm

MONTGOMERY, DONNA

\hskip3,9cm

ULMER, JEFFREY

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UNA VACUNA POLINUCLEOTÍDICA CONTRA LA TUBERCULOSIS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS : 25

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: JACK L. TRIBBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 126 E. LINCOLN AVE., BUZÓN DE LA OFICINA DE CORREOS 2000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: RAHWAY

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NUEVA JERSEY

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAIS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 07065-0907

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/338.992

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVADO: 14-NOVIEMBRE-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: TRIBBLE, JACK L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.633

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE CERTIFICADO: 19342

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (908) 594-5321

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (908) 594-4720

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGCAAAGA TCTAAGGAAC GTGACTGCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCACCATG GATGCAATGA AGAGAGGGCT CTGCTGTGTG CTGCTGCTGT GTGGAGCAGT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCGTTTCG CCCAGCGA

\hfill

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTCGCTG GGCGAAACGA AGACTGCTCC ACACAGCAGC AGCACACAGC AGAGCCCTCT

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCATTGCA TCCATGGT

\hfill

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCTCATG AGCCACATAA TACCATG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACAAGAT CTACCATGGC TTGCAATTGT CAGTTGATGC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACATAGAT CTCCATGGGA ACTAAAGGAA GACGGTCTGT TC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACATGTCG ACCCGTAAAAA GGCCGGCGTTG CTGG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTT TTCCCGGCCG GGCTTGCCG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTT GTCTGTTCGG AGCTAGGC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA CCATGGGCTT TTCCCGGCCG GGCTTGC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA CCATGGCACA GCTTGTTGAC AGGGTT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTC CTTCTCCCGG CCGGGGCTGC CGGTCGAG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA ACCTTCGGTT GATCCCGTCA GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTC CTTCTCTAGG CCCGGTCTTC CA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTT GCCGATGCTG GCTTGCTGGC TCAGGC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA CCATGGGCTT CTCCCCGGCCG GGGCTGC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA NÚMERO 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: cadena simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID Nº.: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA CCATGGGCTT CTCTAGGCCC GGTCTTC

\hfill

37

Claims (19)

1. Una vacuna la cual, tras su administración en un mamífero es capaz de proteger a dicho mamífero al desafío subsiguiente de Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis, en la que dicha vacuna comprende, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, al menos una de una secuencia polinucleotídica de DNA que codifica una proteína 85A antígeno de Mycobacterium tuberculosis, una proteína 85B antígeno de Mycobacterium tuberculosis o una proteína 85C antígeno de Mycobacterium tuberculosis, unida operativamente a un promotor de transcripción, dicha secuencia de DNA está contenida dentro de un vector de expresión.

2. La vacuna de la reivindicación 1 que comprende al menos uno de los plásmidos V1Jns\cdot85A\cdotC2 como se define en la figura 3, V1Jns\cdottPA\cdot85B\cdotC1 como se define en la figura 5 y V1Jns\cdottPA\cdot85C\cdotC1 como se define en la figura 6.

3. La vacuna de la reivindicación 2 en la que dicho plásmido es dicistrónico, dicho fármaco comprende adicionalmente una secuencia adicional de nucleótido que codifica un gen inmunomodulador o inmunoestimulador.

4. La vacuna de la reivindicación 3 en la que dicha secuencia de nucleótidos adicional se selecciona del grupo que consta de secuencias de nucleótidos que codifican GM-CSF, IL-12, interferón, y un miembro de la familia B7 de proteínas coestimuladoras de células T.

5. La vacuna de la reivindicación 1 en la que dicho promotor de transcripción es el promotor de citomegalovirus, y cuyo vector de expresión comprende adicionalmente la secuencia del intrón A, y el terminador de la hormona de crecimiento bovina.

6. La vacuna de la reivindicación 1 en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente una secuencia señal unida operativamente a dicha proteína.

7. La vacuna de la reivindicación 6 que comprende el plásmido V1Jns\cdot85A\cdotC3 como se define en la figura 4.

8. La vacuna de la reivindicación 6 en la que dicha secuencia señal es una secuencia señal eucariota del gen que codifica el activador de plasminógeno específico de tejido de humanos.

9. La vacuna de la reivindicación 8 que comprende el plásmido V1Jns\cdottPA\cdot85A\cdotC1 como se define en la figura 2.

10. Un plásmido para usar en la preparación de una vacuna de DNA para la inmunización de un mamífero contra infección por Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis, dicho plásmido comprende al menos una de una secuencia polinucleotídica de DNA que codifica una proteína 85A antígeno de Mycobacterium tuberculosis, una proteína 85B antígeno de Mycobacterium tuberculosis o una proteína 85C antígeno de Mycobacterium tuberculosis, unida operativamente a un promotor de transcripción.

11. El plásmido de la reivindicación 10 en el que el plásmido es uno de los plásmidos V1Jns\cdot85A\cdotC2 como se define en la figura 3, V1Jns\cdottPA\cdot85B\cdotC1 como se define en la figura 5 y V1Jns\cdottPA\cdot85C\cdotC1 como se define en la figura 6.

12. El plásmido de la reivindicación 10 en el que dicho plásmido es dicistrónico, dicha plásmido comprende adicionalmente una secuencia nucleotídica adicional que codifica un gen inmunomodulador o inmunoestimulador.

13. El plásmido de la reivindicación 12 en el que dicha secuencia de nucleótidos adicional se selecciona del grupo que consta de secuencias de nucleótidos que codifican GM\cdotCSF, IL-12, interferón, y un miembro de la familia B7 de las proteínas coestimuladoras de células T.

14. El plásmido de la reivindicación 10 en el que dicho promotor de transcripción es el promotor de citomegalovirus, y cuyo plásmido comprende adicionalmente la secuencia del intrón A, y el terminador de la hormona del crecimiento bovina.

15. El plásmido de la reivindicación 10 en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica adicionalmente una secuencia señal unida operativamente a dicha proteína.

16. El plásmido de la reivindicación 15 en el que el plásmido es V1Jns\cdot85A\cdotC3 como se define en la figura 4.

17. El plásmido de la reivindicación 15 en el que dicha secuencia señal es una secuencia señal eucariota del gen que codifica el activador de plasminógeno específico de tejido de humanos.

18. El plásmido de la reivindicación 17 en el que el plásmido es V1Jns\cdottPA\cdot85A\cdotC1 como se define en la figura 2.

19. Un plásmido para usar en la preparación de una vacuna de DNA para la inmunización de un mamífero contra infección por Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en el que dicho mamífero es un animal doméstico o ganado.