ES1304764U - ICSI plate system (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Sistema de placa de ICSIICSI plate system
Sector técn icoTechnical sector
La presente invención se refiere a una placa de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) que lleva integrado, en la propia placa, un sistema de selección espermática basada en micro fluidos con flujos de corriente, sin necesidad de un sistema externo para crear estos flujos.The present invention refers to an intracytoplasmic sperm injection (ICSI) plate that has integrated, in the plate itself, a sperm selection system based on microfluids with current flows, without the need for an external system to create these flows.
Estado de la técnicaState of the art
La preparación del semen y la selección espermática son pasos primordiales durante los tratamientos de reproducción asistida (TRA), ya que cualquier manipulación puede tener un impacto sobre la viabilidad de los espermatozoides, especialmente sobre la integridad de su información genética, y esto puede influir en el éxito reproductivo y la salud del recién nacido.Semen preparation and sperm selection are essential steps during assisted reproduction treatments (ART), since any manipulation can have an impact on the viability of the sperm, especially on the integrity of their genetic information, and this can influence reproductive success and newborn health.
Los métodos de selección espermática se desarrollaron con dos objetivos que son fundamentales: la eliminación del plasma seminal y la selección de los mejores espermatozoides, pasos esenciales para preservar su capacidad de fecundación y evitar la reacción acrosómica espontánea.Sperm selection methods were developed with two fundamental objectives: the elimination of seminal plasma and the selection of the best sperm, essential steps to preserve their fertilization capacity and avoid spontaneous acrosome reaction.
Los métodos de selección espermática más utilizados actualmente son el Wash and Swim-Up (WSU) y la Centrifugación en Gradientes de Densidad (CGD). En el WSU se realiza una centrifugación inicial de la muestra de semen, diluida en medio de cultivo, para concentrar la fracción celular en un sedimento, o pellet, y separarla del plasma seminal. Posteriormente, se añade cuidadosamente sobre el pellet medio de cultivo y se incuba durante un tiempo determinado para permitir que los espermatozoides móviles migren a la fracción superior. Tras un lavado final de esa fracción se obtiene la muestra definitiva, que se utilizará para la fecundación in vitro. La duración total del procedimiento es de 60 a 70 minutos. En la CGD, la muestra completa de semen se deposita en la parte superior de dos capas de gradientes de densidad de un medio coloidal preparado a diferentes concentraciones y se procede a su centrifugación. Como resultado se obtiene un pellet que contiene los espermatozoides con mejor movilidad. Tras un lavado adicional de ese pellet por centrifugación, se consigue la muestra definitiva de espermatozoides móviles en un tiempo aproximado de 40 minutos. Ambos métodos han demostrado ampliamente su eficacia para eliminar el plasma seminal y seleccionar espermatozoides móviles, pero presentan una serie de limitaciones. Por una parte, la centrifugación (WSU y CGD) y la temperatura de incubación (WSU) generan radicales libres de oxígeno que inducen fragmentación del ADN espermático (FADN). Este hecho es de relevancia por la relación entre FADN con fracaso reproductivo, en particular a nivel de fecundación y desarrollo embrionario, especialmente en parejas con baja calidad de sus gametos. Por otra parte, ambos métodos requieren que la muestra de semen sea manipulada y cambiada de recipiente (tubos o placas de cultivo) en varias ocasiones, cada una de las cuales representa un posible riesgo de confusión o pérdida de espermatozoides. Y, en tercer lugar, requieren un tiempo largo de preparación, así como de material costoso para llevar a cabo todo el proceso.The most commonly used sperm selection methods currently are Wash and Swim-Up (WSU) and Density Gradient Centrifugation (CGD). At the WSU, an initial centrifugation of the semen sample, diluted in culture medium, is performed to concentrate the cellular fraction into a pellet, or pellet, and separate it from the seminal plasma. Subsequently, culture medium is carefully added to the pellet and incubated for a certain time to allow the motile sperm to migrate to the upper fraction. After a final wash of this fraction, the final sample is obtained, which will be used for in vitro fertilization. The total duration of the procedure is 60 to 70 minutes. In CGD, the entire semen sample is deposited on top of two layers of density gradients of a colloidal medium prepared at different concentrations and centrifuged. As a result, a pellet is obtained that contains sperm with better mobility. After additional washing of this pellet by centrifugation, the final sample of motile sperm is obtained in approximately 40 minutes. Both methods have widely demonstrated their effectiveness in eliminating seminal plasma and selecting motile sperm, but they present a series of limitations. On the one hand, centrifugation (WSU and CGD) and incubation temperature (WSU) generate oxygen free radicals that induce fragmentation of sperm DNA (FADN). This fact is relevant due to the relationship between FADN with reproductive failure, particularly at the level of fertilization and embryonic development, especially in couples with low quality of their gametes. On the other hand, both methods require that the semen sample be manipulated and changed containers (tubes or culture plates) on several occasions, each of which represents a possible risk of confusion or loss of sperm. And, thirdly, they require a long preparation time, as well as expensive materials to carry out the entire process.
Por todo ello, una de las líneas de investigación de mayor relevancia en la actualidad se centra en la búsqueda de nuevas metodologías que permitan una selección espermática más segura, que permita reducir el impacto iatrogénico sobre el espermatozoide relacionado tanto con la generación de ROS como con el número de pasos necesarios para la preparación de la muestra. Además, es importante conseguir una mayor eficiencia del procedimiento a través de la reducción de tiempos y costesFor all these reasons, one of the most relevant lines of research today focuses on the search for new methodologies that allow safer sperm selection, which allows reducing the iatrogenic impact on the sperm related to both the generation of ROS and the number of steps necessary for sample preparation. Furthermore, it is important to achieve greater efficiency of the procedure through reduction of time and costs.
El uso de microfluidos se ha convertido en una tendencia prometedora que cumple con estas premisas. En la actualidad ya existen varios dispositivos comerciales diseñados para seleccionar espermatozoides móviles. Todos ellos son plataformas externas, en forma de portaobjetos, la mayoría de ellos, con circuitos predefinidos excavados en la misma superficie y utilizando, en muchos casos, polidimetilsiloxano (PDMS). Varios autores han descrito la utilidad de los sistemas de microfluidos para seleccionar espermatozoides móviles, que además presentan su ADN íntegro. La principal diferencia entre los microfluidos y los métodos tradicionales de selección espermática, como el WSU o la CGG, es que no se requiere centrifugación de la muestra para su procesamiento. Además, permiten obtener la fracción definitiva de espermatozoides móviles en un tiempo aproximado de 20 minutos. The use of microfluidics has become a promising trend that meets these premises. Currently, there are several commercial devices designed to select motile sperm. All of them are external platforms, in the form of slides, most of them, with predefined circuits excavated in the same surface and using, in many cases, polydimethylsiloxane (PDMS). Several authors have described the usefulness of microfluidic systems to select motile sperm, which also present their entire DNA. The main difference between microfluidics and traditional sperm selection methods, such as WSU or CGG, is that centrifugation of the sample is not required for processing. In addition, they allow obtaining the definitive fraction of motile sperm in approximately 20 minutes.
No obstante, la aplicación de microfluidos en los TRA, tal y como se conoce en la actualidad, requiere el uso de dispositivos externos a los utilizados de forma rutinaria en el laboratorio de reproducción asistida. Este es un factor que confiere complejidad y un coste añadido al procedimiento y no acaba de eliminar el riesgo asociado a la manipulación de la muestra, puesto que todavía se precisa la transferencia de los espermatozoides desde el dispositivo de microfluidos a la placa de ICSI. Además, se dan casos, especialmente aquellos con dispermia muy severa (muy bajo recuento espermático, muy baja movilidad o muy pocos espermatozoides con morfología normal), en los que cabe la posibilidad de que ningún espermatozoide alcance el extremo final del canal microfluídico, de manera que existe el riesgo de quedarse sin muestra alguna para poder llevar a cabo la ICSI, cuando los espermatozoides quedan atrapados en esos túneles de paredes y techo sólidos de los actuales chips de microfluidos.However, the application of microfluidics in ART, as currently known, requires the use of devices other than those routinely used in the assisted reproduction laboratory. This is a factor that confers complexity and added cost to the procedure and does not completely eliminate the risk associated with sample manipulation, since the transfer of sperm from the microfluidic device to the ICSI plate is still required. Furthermore, there are cases, especially those with very severe dyspermia (very low sperm count, very low mobility or very few sperm with normal morphology), in which it is possible that no sperm reach the end of the microfluidic channel, so that there is a risk of running out of any sample to carry out ICSI, when the sperm become trapped in those solid-walled and roofed tunnels of current microfluidic chips.
Por otra parte, hay que tener en cuenta que no todos los sistemas de microfluidos aprovechan la reotaxis espermática, ya que no presentan un flujo de corriente. El líquido permanece estático y son los espermatozoides los que se desplazan, pero no contracorriente.On the other hand, it must be taken into account that not all microfluidic systems take advantage of sperm rheotaxis, since they do not present a current flow. The liquid remains static and it is the sperm that move, but not against the current.
En busca de una mejora en el proceso de selección espermática, varios grupos han propuesto sistemas de microfluidos hechos a mano en la propia placa de ICSI, a partir de la unión de gotas de medio de cultivo, de manera que en un punto del sistema se cola una gota de la muestra de semen y en otro se seleccionan, posteriormente, los espermatozoides.In search of an improvement in the sperm selection process, several groups have proposed microfluidic systems made by hand on the ICSI plate itself, from the union of drops of culture medium, so that at one point in the system A drop of the semen sample is poured and the sperm are subsequently selected in another.
Estos sistemas tienen la ventaja de su simplicidad y su eficiencia, pero también varias desventajas, como el hecho del factor manual a la hora de crear el sistema, dependiendo de la habilidad personal del usuario e impidiendo la reproducibilidad absoluta del sistema, y el no aprovechamiento de todas las herramientas de selección espermática, incluidas la reotaxis y la termotaxis.These systems have the advantage of their simplicity and efficiency, but also several disadvantages, such as the fact of the manual factor when creating the system, depending on the personal skill of the user and preventing absolute reproducibility of the system, and the lack of exploitation. of all sperm selection tools, including rheotaxis and thermotaxis.
Existe en el mercado una placa de ICSI con un sistema de microfluidos incorporado (Fertdish, publicado en Lab on a Chip 21 (775) 2021). Este sistema presenta una serie de diferencias claras con el sistema objeto de la presente invención. En primer lugar, no existe un flujo de corriente en el recorrido, por lo que los espermatozoides nadan a través del sistema, pero no contracorriente, por lo que no se aprovecha el fenómeno de reotaxis para seleccionar los mejores espermatozoides. Tampoco existe una diferencia de temperatura, por lo que desaprovecha también el fenómeno de termotaxis para seleccionar los espermatozoides. En tercer lugar, el recorrido a seguir por los espermatozoides es recto, por lo que no se aprovecha la posibilidad de seleccionar aquellos con progresión curvilínea y que pueden presentar un ADN más íntegro que los de progresión rectilínea. Este recorrido recto puede hacer también que, en caso de poner una gota de semen completo, parte del plasma seminal alcance el final del recorrido, lo que podría reducir la capacidad fecundante de los espermatozoides. En último lugar el recorrido está cubierto por un material sólido, por lo que, a diferencia del sistema propuesto, es imposible recuperar espermatozoides en el caso de que ninguno de ellos alcance el punto final, porque quedan atrapados dentro del sistema.There is an ICSI plate on the market with a built-in microfluidic system (Fertdish, published in Lab on a Chip 21 (775) 2021). This system presents a series of clear differences with the system object of the present invention. Firstly, there is no current flow in the path, so the sperm swim through the system, but not against the current, so the rheotaxis phenomenon is not taken advantage of to select the best sperm. There is also no temperature difference, so the thermotaxis phenomenon is also wasted to select sperm. Thirdly, the path followed by the sperm is straight, so the possibility of selecting those with curvilinear progression and which may have more complete DNA than those with rectilinear progression is not taken advantage of. This straight path can also mean that, if a drop of complete semen is placed, part of the seminal plasma reaches the end of the path, which could reduce the fertilizing capacity of the sperm. Lastly, the route is covered by a solid material, so, unlike the proposed system, it is impossible to recover sperm in the event that none of them reach the end point, because they are trapped inside the system.
Por todo lo mencionado anteriormente, la presente invención proporciona una placa de ICSI cuyos objetivos: mejorar la efectividad de la selección espermática para ICSI, simplificarla, hacerla más segura y eficiente.For all of the above, the present invention provides an ICSI plate whose objectives: improve the effectiveness of sperm selection for ICSI, simplify it, make it safer and more efficient.
Para conseguirlo, el sistema permite lo siguiente:To achieve this, the system allows the following:
1- Hacer en la propia placa de ICSI la selección de los espermatozoides a microinyectar, evitando así sucesivos traslados de la muestra y reduciendo, por ello, el riesgo de confusión al identificar la misma.1- Select the sperm to be microinjected on the ICSI plate itself, thus avoiding successive transfers of the sample and, therefore, reducing the risk of confusion when identifying it.
2- Hacer esta selección de la muestra a partir de semen completo, es decir, sin un procesamiento previo de la muestra, reduciendo el riesgo de daño iatrogénico sobre los espermatozoides producido, especialmente pero no exclusivamente, por la centrifugación y mejorando así la efectividad del tratamiento.2- Make this selection of the sample from whole semen, that is, without prior processing of the sample, reducing the risk of iatrogenic damage to the sperm produced, especially but not exclusively, by centrifugation and thus improving the effectiveness of the treatment.
3- Seleccionar los mejores espermatozoides aprovechando las características específicas de estos de nadar hacia los bordes, nadar contracorriente (reotaxis) y nadar hacia zonas más cálidas (termotaxis), mejorándose así la efectividad del tratamiento.3- Select the best sperm taking advantage of their specific characteristics of swimming towards the edges, swimming against the current (rheotaxis) and swimming towards warmer areas (thermotaxis), thus improving the effectiveness of the treatment.
4- Simplificar la técnica de selección espermática para ICSI, reduciendo el tiempo necesario para disponer de los espermatozoides a microinyectar y del gasto en material inventariable y fungible, lo que hace que en conjunto se mejore la eficiencia respecto a las técnicas convencionales de selección espermática para ICSI. 4- Simplify the sperm selection technique for ICSI, reducing the time necessary to have the sperm to be microinjected and the expense in inventory and consumable material, which overall improves efficiency compared to conventional sperm selection techniques for ICSI. ICSI.
Explicación de la invenciónExplanation of the invention
El sistema inventado agrupa el aprovechamiento de fundamentos físicos, químicos y biológicos que permiten seleccionar los mejores espermatozoides, como son:The invented system brings together the use of physical, chemical and biological foundations that allow the best sperm to be selected, such as:
1- Tendencia de los espermatozoides a nadar contracorriente (reotaxis).1- Tendency of sperm to swim against the current (rheotaxis).
2- Tendencia de los espermatozoides a nadar hacia los bordes.2- Tendency of sperm to swim towards the edges.
3- Tendencia de los espermatozoides a nadar hacia zonas más cálidas (termotaxis).3- Tendency of sperm to swim towards warmer areas (thermotaxis).
4- Ley de Laplace.4- Laplace's Law.
5- Leyes de la Hidrostática.5- Laws of Hydrostatics.
Para mejorar el pronóstico del tratamiento de reproducción asistida ICSI, es fundamental seleccionar los mejores espermatozoides, definiéndose estos como los que tienen mejor potencial para fecundar el óvulo y desarrollar un embrión sano y evolutivo hasta el momento del parto. Se sabe que los espermatozoides con peor morfología y especialmente, los que presentan fallos en la integridad de su ADN, se relacionan con menor tasa de fecundación por ICSI, mayor incidencia de detención en el desarrollo embrionario, peor tasa de implantación embrionaria, mayor tasa de aborto y peor tasa de nacido vivo por transferencia embrionaria. La morfología o movilidad de un espermatozoide no indica si su ADN está o no íntegro.To improve the prognosis of ICSI assisted reproduction treatment, it is essential to select the best sperm, defining these as those with the best potential to fertilize the egg and develop a healthy and evolving embryo until the moment of delivery. It is known that sperm with worse morphology, and especially those with defects in the integrity of their DNA, are related to a lower rate of fertilization by ICSI, a higher incidence of arrest in embryonic development, a worse rate of embryonic implantation, a higher rate of abortion and worse live birth rate per embryo transfer. The morphology or mobility of a sperm does not indicate whether its DNA is intact or not.
Se ha demostrado que los mejores espermatozoides, aquellos con mayor integridad de su ADN, tienen a nadar contracorriente. A este fenómeno se le conoce como reotaxis. Por el contrario, los espermatozoides con fallos en su ADN tienen mermada esa capacidad, avanzando menos o siendo arrastrados por la corriente. Se ha demostrado que aplicando un flujo de corriente en un sistema de microfluidos (sistemas con muy pequeñas cantidades de fluido en dimensiones infracentimétricas) se seleccionan espermatozoides con mayor probabilidad de presentar un ADN íntegro.It has been shown that the best sperm, those with the greatest integrity of their DNA, tend to swim against the current. This phenomenon is known as rheotaxis. On the contrary, sperm with flaws in their DNA have this capacity reduced, advancing less or being dragged by the current. It has been shown that applying a current flow in a microfluidic system (systems with very small amounts of fluid in infracentimeter dimensions) sperm are selected with a greater probability of having intact DNA.
También se ha demostrado que los mejores espermatozoides tienen a nadar hacia los bordes, no de forma rectilínea, sino desplazándose progresivamente hacia uno u otro lado. Se ha demostrado que al hacer nadar a los espermatozoides a través de un canal microfluídico con desvíos a derecha e izquierda en su trazado, aquellos que siguieron nadando de forma rectilínea hasta el final del canal, sin desviarse por los desvíos, tenían una mayor incidencia de fragmentación en su ADN que aquellos que iban nadando pegados a la pared del canal y por ello salieron por el desvío. Esta mejora en la tasa de integridad del ADN es independiente de la movilidad o morfología de los espermatozoides, ya que todos ellos presentaban una buena movilidad que les permitió desplazarse de forma progresiva. También se ha observado que se recuperan más espermatozoides con ADN íntegro en los desvíos cuando estos tienen un ángulo de 45° que cuando este ángulo es de 90°.It has also been shown that the best sperm tend to swim towards the edges, not in a straight line, but moving progressively to one side or the other. It has been shown that by making sperm swim through a channel microfluidic with detours to the right and left in its layout, those who continued swimming in a straight line until the end of the channel, without deviating through the detours, had a higher incidence of fragmentation in their DNA than those who swam close to the wall of the channel and that's why they took the detour. This improvement in the rate of DNA integrity is independent of the mobility or morphology of the sperm, since all of them had good mobility that allowed them to move progressively. It has also been observed that more sperm with intact DNA are recovered in the diversions when they have an angle of 45° than when this angle is 90°.
Se ha demostrado que los mejores espermatozoides tienen tendencia a nadar de zonas más frías a zonas más cálidas. A este fenómeno se le conoce como termotaxis. La placa permite aprovechar este fenómeno haciendo conducir la temperatura desde una placa calefactada a las gotas de la placa, interponiendo una plancha de aluminio de 2 mm de grosor debajo de las gotas de la placa de ICSI que se quiere estén más calientes. Esto crea un gradiente de temperatura entre las gotas y reduce el tiempo de recuperación de los espermatozoides, además de seleccionar aquellos con mayor integridad en su ADN. It has been shown that the best sperm have a tendency to swim from colder areas to warmer areas. This phenomenon is known as thermotaxis. The plate makes it possible to take advantage of this phenomenon by conducting the temperature from a heated plate to the drops on the plate, placing a 2 mm thick aluminum plate under the drops of the ICSI plate that are to be hotter. This creates a temperature gradient between the drops and reduces sperm recovery time, in addition to selecting those with greater integrity in their DNA.
Se ha demostrado (Ley de Laplace) que gotas del mismo líquido, pero con diferente radio presentan diferente presión, siendo mayor en aquella con menor radio. Esto hace que, al conectar dos gotas de diferente radio, se cree un flujo o corriente que va de gota de menor radio a la de mayor radio. Este fundamento permite crear un sistema de microfluidos con un flujo de corriente sin necesidad de utilizar un sistema externo, como una bomba de presión, para crear estos flujos.It has been shown (Laplace's Law) that drops of the same liquid, but with a different radius, have different pressures, being greater in those with a smaller radius. This means that, when connecting two drops of different radii, a flow or current is created that goes from the drop with the smallest radius to the drop with the largest radius. This foundation allows creating a microfluidic system with a flow of current without the need to use an external system, such as a pressure pump, to create these flows.
Se ha demostrado también (leyes de la hidrostática) que la presión sobre un punto determinado dentro de un fluido es proporcional a la distancia de ese punto a la superficie. Por ello, cuando en una placa de Petri se colocan una gota con un volumen determinado y otra con un volumen mayor, y se cubren ambas con aceite, la presión del aceite sobre la superficie de cada gota será diferente, siendo mayor en la gota de menor volumen, por haber más distancia entre su superficie y la superficie del aceite, que en la gota de mayor volumen, cuya superficie quedará más cercana a la superficie del aceite. Este concepto puede ser también aprovechado para crear una diferencia de presión entre dos gotas de un sistema microfluídico y con ello, un flujo de corriente sin necesidad de un sistema externo. It has also been shown (laws of hydrostatics) that the pressure on a given point within a fluid is proportional to the distance of that point from the surface. Therefore, when a drop with a given volume and another with a larger volume are placed in a Petri dish, and both are covered with oil, the pressure of the oil on the surface of each drop will be different, being greater in the drop of smaller volume, because there is more distance between its surface and the surface of the oil, than in the drop of greater volume, whose surface will be closer to the surface of the oil. This concept can also be used to create a pressure difference between two drops of a microfluidic system and with it, a current flow without the need for an external system.
La placa de ICSI objeto de la presente invención lleva un sistema microfluídico incorporado en el cual se crea un flujo contracorriente, sin necesidad de sistema externo alguno, al unir gotas con diferente presión, en un trazado con unos desvíos determinados que permiten seleccionar los mejores espermatozoides. Se añade además un gradiente de temperatura determinado para agilizar esta selección espermática y hacer una selección aún mejor. The ICSI plate object of the present invention has a built-in microfluidic system in which a countercurrent flow is created, without the need for any external system, by joining drops with different pressure, in a path with certain deviations that allow the best sperm to be selected. . A certain temperature gradient is also added to speed up this sperm selection and make an even better selection.
La base de la placa de ICSI objeto de la presente invención es una placa de ICSI de poliestireno de uso convencional en la que ha excavado el circuito microfluídico.The base of the ICSI plate object of the present invention is a conventionally used polystyrene ICSI plate in which the microfluidic circuit has been excavated.
Aunque muchos sistemas de microfluidos están construidos con polidimetilsiloxano (PDMS), este lo está con poliestireno o material similar, por ser el material utilizado de forma habitual en este tipo de placas de ICSI y por ser un material preferido, en general, para el cultivo celular.Although many microfluidic systems are built with polydimethylsiloxane (PDMS), this one is made with polystyrene or similar material, as it is the material commonly used in this type of ICSI plates and because it is a preferred material, in general, for culture. cell phone.
El sistema de selección espermática se sitúa en un lateral de la placa, de manera que el resto de ella sirve para hacer el ICSI de forma convencional.The sperm selection system is located on one side of the plate, so that the rest of it is used to perform the ICSI in a conventional way.
Una misma placa puede incluir varios circuitos de manera que se pueda hacer la selección espermática es más de uno de ellos con el fin de recuperar más espermatozoides a partir de un mayor volumen de muestra inicial (por ejemplo, 4 gotas de semen en lugar de una sola gota).The same plate can include several circuits so that sperm selection can be done in more than one of them in order to recover more sperm from a larger volume of initial sample (for example, 4 drops of semen instead of one. single drop).
El sistema consta de dos sectores. Un primer sector de dispersión de la muestra y selección espermática por termotaxis y un segundo sector de selección espermática por reotaxis. The system consists of two sectors. A first sector of sample dispersion and sperm selection by thermotaxis and a second sector of sperm selection by rheotaxis.
El aspecto final del recorrido completo, visto desde la parte superior, es el de una ele mayúscula (L), con un brazo más largo y un brazo más corto, en la cual hay una gota en cada extremo y una gota en la intersección de ambos lados.The final appearance of the complete path, seen from the top, is that of a capital letter L (L), with a longer arm and a shorter arm, in which there is a drop at each end and a drop at the intersection of both sides.
El brazo largo de la L correspondería al sector de dispersión y termotaxis y el brazo corto al sector de selección espermática por reotaxis.The long arm of the L would correspond to the dispersion and thermotaxis sector and the short arm to the sperm selection sector by rheotaxis.
El sistema está excavado en el fondo de la placa, y desde la parte superior se ve, efectivamente, como una L formada por dos canales perpendiculares y tres alveolos. Los dos alveolos de los extremos tienen preferentemente la misma medida, mientras que el alveolo en la intersección es de mayor tamaño, preferentemente el doble. El primer canal tiene también una mayor longitud que el segundo (preferentemente el doble), aunque ambos canales, y los tres alveolos, son preferentemente igual de profundos.The system is excavated at the bottom of the plate, and from the top it is effectively seen as an L formed by two perpendicular channels and three alveoli. The two alveoli at the ends preferably have the same size, while the alveolus at the intersection is larger, preferably double. The first channel It is also longer than the second (preferably double), although both canals, and the three alveoli, are preferably equally deep.
El alveolo del final del recorrido tiene unos pequeños salientes, progresivamente menos profundos, que hacen que los espermatozoides entren y se queden ahí atrapados, listos para ser aspirados y utilizados para el ICSI, para evitar que sigan nadando, volviendo hacia atrás, y se queden atrapados dicho alveolo.The alveolus at the end of the path has small projections, progressively shallower, that cause the sperm to enter and remain trapped there, ready to be aspirated and used for ICSI, to prevent them from continuing to swim, returning back, and remaining trapped said alveolus.
El sistema de microfluidos se prepara poniendo una gota del mismo volumen de medio de cultivo en cada alveolo y seguidamente, una cuarta gota del mismo volumen sobre la gota del alveolo intermedio, de manera que esta tendrá el doble de volumen que las otras. The microfluidic system is prepared by placing a drop of the same volume of culture medium in each alveolus and then, a fourth drop of the same volume on the drop in the intermediate alveolus, so that this will have twice the volume of the others.
Dependiendo del acabado del plástico de la placa (hidrofóbico o hidrofílico), es posible que las gotas se conecten entre ellas automáticamente, al rellenarse los canales por capilaridad, o que haya que pasar una punta de pipeta estéril sobre los canales, de una gota a otra, para que estas queden conectadas. En cualquier caso, en cuanto se conecten las tres gotas se creará automáticamente una diferencia de presión entre ellas.Depending on the finish of the plate plastic (hydrophobic or hydrophilic), the drops may connect to each other automatically, as the channels are filled by capillarity, or a sterile pipette tip may have to be passed over the channels, from one drop to the next. another, so that they remain connected. In any case, as soon as the three drops are connected, a pressure difference will automatically be created between them.
Una vez cebado el circuito el circuito microfluídico con el medio de cultivo, se configura el resto de la placa de ICSI disponiendo las gotas que contendrán los espermatozoides seleccionados y los ovocitos (óvulos) y se cubre todo con aceite mineral.Once the microfluidic circuit has been primed with the culture medium, the rest of the ICSI plate is configured by arranging the drops that will contain the selected sperm and oocytes (eggs) and covering everything with mineral oil.
Una vez hecho esto, se añade una gota de semen, de la mitad de volumen que las anteriores, en la gota inicial del sistema, que es la que se encuentra en el extremo del canal más largo.Once this is done, a drop of semen, half the volume of the previous ones, is added to the initial drop of the system, which is the one at the end of the longest channel.
A continuación, se pone la placa de ICSI sobre una plancha de aluminio de 2 mm que tiene unos recortes para estar en contacto con toda la placa de ICSI excepto con la gota en la que encuentra la muestra de semen.Next, the ICSI plate is placed on a 2 mm aluminum plate that has cutouts to be in contact with the entire ICSI plate except for the drop in which the semen sample is found.
Y, por último, el conjunto placa de ICSI - plancha de aluminio, se pone sobre una superficie plana calefactada a 37°C. El aluminio transmitirá la temperatura a toda la placa de ICSI excepto a la gota en la que se ha puesto la muestra de semen. esto crea un gradiente de temperatura entre la primera y la segunda gota y se inicia el proceso de la termotaxis. And finally, the ICSI plate - aluminum plate assembly is placed on a flat surface heated to 37°C. The aluminum will transmit the temperature to the entire ICSI plate except the drop in which the semen sample has been placed. This creates a temperature gradient between the first and second drop and begins the thermotaxis process.
De acuerdo con los resultados, en la mayoría de las muestras de semen con al menos un millón de espermatozoides con buena progresión rectilínea por mililitro, en menos de quince minutos habrá espermatozoides suficientes para microinyectar al menos 20 ovocitos en la gota final del circuito y en casos de normozoospermia (muestras de semen con todos los parámetros dentro de los límites de referencia de normalidad de la OMS), en menos de diez minutos.According to the results, in the majority of semen samples with at least one million sperm with good rectilinear progression per milliliter, in less than In fifteen minutes there will be enough sperm to microinject at least 20 oocytes in the final drop of the circuit and in cases of normozoospermia (semen samples with all parameters within the WHO normal reference limits), in less than ten minutes.
Las gotas son de diferente diámetro y volumen, de manera que, de acuerdo con la Ley de Laplace, la presión de cada gota es inversamente proporcional a su diámetro. Así, una gota de un diámetro determinado tendrá más presión que una gota del mismo medio de cultivo con un diámetro mayor y al unir ambas gotas, se creará un flujo, es decir, un desplazamiento del medio, de la gota con más presión a la gota con menos presión.The drops are of different diameter and volume, so that, according to Laplace's Law, the pressure of each drop is inversely proportional to its diameter. Thus, a drop of a given diameter will have more pressure than a drop of the same culture medium with a larger diameter and by joining both drops, a flow will be created, that is, a displacement of the medium, from the drop with more pressure to the drop. drop with less pressure.
Además, tal y como se hace habitualmente en la técnica del ICSI, las gotas van cubiertas por aceite mineral para que no se produzcan cambios en el pH y osmolaridad en el medio de cultivo por la evaporación. Este aceite que cubre las gotas, de acuerdo con las leyes de la hidrostática, ejerce también una presión distinta sobre las gotas de menor volumen que sobre las gotas de mayor volumen, de manera que esta presión es también inversamente proporcional al volumen de la gota.Furthermore, as is usually done in the ICSI technique, the drops are covered by mineral oil so that changes in the pH and osmolarity of the culture medium do not occur due to evaporation. This oil that covers the drops, in accordance with the laws of hydrostatics, also exerts a different pressure on the drops of smaller volume than on the drops of larger volume, so that this pressure is also inversely proportional to the volume of the drop.
En conjunto, esto hace que, al unir dos gotas de diferente tamaño por un canal del mismo medio de cultivo, este medio se irá desplazando, progresivamente, de la gota más pequeña a la gota más grande. Y cuanto menor sea la gota pequeña y mayor se vaya haciendo la gota grande, la diferencia de presión entre ellas irá aumentando, de manera que este flujo de corriente permanecerá durante tiempo.Altogether, this means that, when two drops of different sizes are joined through a channel of the same culture medium, this medium will progressively move from the smallest drop to the largest drop. And the smaller the small drop is and the larger the large drop becomes, the pressure difference between them will increase, so that this flow of current will remain for a long time.
Este tiempo y la velocidad del flujo, pueden regularse modificando el volumen y diámetro de las gotas, la distancia de ellas y las dimensiones del canal que las comunica.This time and the flow speed can be regulated by modifying the volume and diameter of the droplets, their distance and the dimensions of the channel that communicates them.
De este modo el sistema objeto de la presente invención queda caracterizado, esencialmente, porque está formado por:In this way, the system object of the present invention is characterized, essentially, because it is formed by:
- Una placa de ICSI con al menos un circuito de microfluido excavado.- An ICSI board with at least one microfluidic circuit carved into it.
- La placa de ICSI es preferentemente una placa de ICSI de poliestireno de uso convencional o un material similar.- The ICSI plate is preferably an ICSI plate made of conventional polystyrene or a similar material.
- La placa de ICSI puede comprender más de un circuito de microfluido excavado. - The ICSI board may comprise more than one excavated microfluidic circuit.
- Cada circuito de microfluido está formado por dos canales perpendiculares, formando ambos canales una forma de ele mayúscula (L), existiendo tres alveolos (un primer alveolo en un extremo del primer canal, un segundo alveolo en la intersección de los dos canales, y un tercer alveolo en el extremo del segundo canal); donde la longitud del primer canal es mayor que la longitud del segundo canal (preferentemente el doble); donde el canal largo corresponde a un sector de dispersión y termotaxis y el canal corto al sector de la selección espermática por reotaxis; donde los alveolos de los extremos del circuito son preferentemente del mismo tamaño; donde el alveolo de la intersección entre los dos canales tiene una mayor superficie que los alveolos de los extremos (preferentemente el doble) ; y donde los dos canales y los tres alveolos tienen la misma profundidad.- Each microfluidic circuit is formed by two perpendicular channels, both channels forming a capital L shape (L), with three alveoli (a first alveolus at one end of the first channel, a second alveolus at the intersection of the two channels, and a third alveolus at the end of the second canal); where the length of the first channel is greater than the length of the second channel (preferably double); where the long channel corresponds to a sector of dispersion and thermotaxis and the short channel to the sector of sperm selection by rheotaxis; where the cells at the ends of the circuit are preferably of the same size; where the alveolus at the intersection between the two channels has a greater surface area than the alveoli at the ends (preferably twice as much); and where the two canals and the three alveoli have the same depth.
- El tercer alveolo (3) tiene unos pequeños salientes, progresivamente menos profundos, que hacen que los espermatozoides entren y se queden ahí atrapados, listos para ser aspirados y utilizados para el ICSI, para evitar que sigan nadando, volviendo hacia atrás, y se queden atrapados dicho alveolo.- The third alveolus (3) has small projections, progressively shallower, that cause the sperm to enter and remain trapped there, ready to be aspirated and used for ICSI, to prevent them from continuing to swim, returning back, and being said alveolus is trapped.
- Una plancha de aluminio que tiene unos recortes para estar en contacto con toda la placa de ICSI excepto con la gota en la que encuentra la muestra de semen. - An aluminum plate that has cutouts to be in contact with the entire ICSI plate except for the drop in which the semen sample is found.
El sistema objeto de la presente invención queda además caracterizado porque comprende el siguiente método de funcionamiento:The system object of the present invention is further characterized because it comprises the following method of operation:
- Disposición de una gota del mismo volumen de medio de cultivo en cada alveolo y seguidamente, una cuarta gota del mismo volumen sobre la gota del alveolo intermedio, de manera que esta tendrá el doble de volumen que las otras.- Place a drop of the same volume of culture medium in each alveolus and then, a fourth drop of the same volume on the drop in the intermediate alveolus, so that it will have twice the volume of the others.
- Si el acabado de la superficie de la placa es hidrofílico, paso de una punta de pipeta estéril sobre los canales, de una gota a otra, para que estas queden conectadas. - If the surface finish of the plate is hydrophilic, pass a sterile pipette tip over the channels, from one drop to another, so that they are connected.
- Configuración del resto de la placa de ICSI disponiendo las gotas que contendrán los espermatozoides seleccionados y los ovocitos (óvulos)- Configuration of the rest of the ICSI plate by arranging the drops that will contain the selected sperm and oocytes (eggs)
- Cubrición de toda la placa con aceite mineral.- Covering the entire plate with mineral oil.
- Adición de una gota de semen, de la mitad de volumen que las anteriores, en el primer alveolo, que es la que se encuentra en el extremo del canal más largo. - Adding a drop of semen, half the volume of the previous ones, in the first alveolus, which is the one found at the end of the longest canal.
- Disposición de la placa de ICSI sobre la plancha de aluminio.- Arrangement of the ICSI plate on the aluminum plate.
- Disposición del conjunto placa de ICSI - plancha de aluminio sobre una superficie plana calefactada a 37°C. El aluminio transmitirá la temperatura a toda la placa de ICSI excepto a la gota en la que se ha puesto la muestra de semen. creando de temperatura entre la primera y la segunda gota, iniciando el proceso de la termotaxis.- Arrangement of the ICSI plate - aluminum plate assembly on a flat surface heated to 37°C. The aluminum will transmit the temperature to the entire ICSI plate except the drop in which the semen sample has been placed. creating temperature between the first and second drop, starting the thermotaxis process.
Breve descripción de los d ibu josBrief description of the drawings
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de figuras en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:To complement the description that is being made and in order to help a better understanding of the characteristics of the invention, in accordance with a preferred example of its practical implementation, a set of figures is attached as an integral part of said description. where, for illustrative and non-limiting purposes, the following has been represented:
La figura 1 muestra una vista esquemática del circuito de microfluidos excavado en la placa de ICSI, según una opción de realización de la presente invención.Figure 1 shows a schematic view of the microfluidic circuit excavated in the ICSI plate, according to an embodiment option of the present invention.
La figura 2 muestra una vista superior de una placa de ICSI con dos sistemas de selección espermática por microfluidos y reotaxis, según una opción de la presente invención. Figure 2 shows a top view of an ICSI plate with two sperm selection systems using microfluidics and rheotaxis, according to one option of the present invention.
La figura 3 muestra una vista superior de una placa de ICSI con cuatro sistemas de selección espermática por microfluidos y reotaxis, según una opción de la presente invención.Figure 3 shows a top view of an ICSI plate with four microfluidic sperm selection and rheotaxis systems, according to one option of the present invention.
Descripción de los modos de realización preferente de la invenciónDescription of the preferred embodiments of the invention
A la vista de las mencionadas figuras, y de acuerdo con la numeración adoptada, se puede observar en ellas un ejemplo de realización preferente de la invención, la cual comprende las partes y elementos que se indican y describen en detalle a continuación.In view of the aforementioned figures, and in accordance with the numbering adopted, an example of a preferred embodiment of the invention can be observed, which includes the parts and elements indicated and described in detail below.
Así, el sistema objeto de la presente invención comprende una palca de ICSI (7) que tiene excavado al menos un circuito (6) de microfluido. Thus, the system object of the present invention comprises an ICSI panel (7) that has at least one microfluidic circuit (6) excavated.
Tal y como se muestra en la figura 1, el circuito (6) de microfluido está formado por tres alveolos (1,2,3) y dos canales (4,5), donde los dos canales forman una ele mayúscula (L), siendo la longitud del primer canal (4) el doble que la longitud del segundo canal (5). El primer alveolo (1) es el alveolo en el que se deposita la muestra de semen y está dispuesto en el extremo libre del primer canal (4). El tercer alveolo (3) es el alveolo del que se extraen los espermatozoides seleccionados, y está dispuesto en el extremo libre del segundo canal (5), y tiene un diámetro igual que el primera alveolo. El segundo alveolo (2) está dispuesto en la intersección entre el primera canal (4) y el segundo canal (5), y tiene el doble de diámetro que el primer alveolo (1) y el tercer alveolo (3), correspondiendo el primer canal (4) a un sector de dispersión y termotaxis y el segundo canal (5) a un sector de la selección espermática por reotaxis. La profundidad de los tres alveolos (1,2,3) y los dos canales (4,5) es la misma.As shown in Figure 1, the microfluidic circuit (6) is formed by three alveoli (1,2,3) and two channels (4,5), where the two channels form a capital letter L (L), the length of the first channel (4) being twice the length of the second channel (5). The first alveolus (1) is the alveolus in which the semen sample is deposited and is arranged at the free end of the first channel (4). The third alveolus (3) is the alveolus from which the selected sperm are extracted, and is arranged at the free end of the second channel (5), and has a diameter equal to that of the first alveolus. The second alveolus (2) is arranged at the intersection between the first channel (4) and the second channel (5), and has twice the diameter of the first alveolus (1) and the third alveolus (3), corresponding to the first channel (4) to a sector of dispersion and thermotaxis and the second channel (5) to a sector of sperm selection by rheotaxis. The depth of the three alveoli (1,2,3) and the two canals (4,5) is the same.
De este modo, el sistema se conforma uniendo tres alveolos de diferente volumen, de manera que el segundo alveolo (2) tiene el doble de volumen que el primer y segundo alveolos (1 y 3) de manera que, de acuerdo con la Ley de Laplace y de Hidrostática, los alveolos primero y tercero tienen más presión que el segundo alveolo cuando contienen fluido en su interior. Al unir los alveolos con los canales (4 y 5) se crea un flujo de corriente desde los primer y tercero alveolos de los extremos (1,3), que tienen más presión, hacia el segundo alveolo central (2).In this way, the system is formed by joining three alveoli of different volumes, so that the second alveolus (2) has twice the volume of the first and second alveoli (1 and 3) so that, according to the Law of Laplace and Hydrostatics, the first and third alveoli have more pressure than the second alveolus when they contain fluid inside. By joining the alveoli with the channels (4 and 5), a flow of current is created from the first and third alveoli at the ends (1,3), which have more pressure, towards the second central alveolus (2).
Al poner una muestra de semen (6) en el primer alveolo (1), al haber una presión hacia el segundo alveolo (2), el plasma seminal se va dispersando a través del primer canal (4) y los espermatozoides con mejor movilidad curvilínea van desplazándose hacia los bordes de los canales y avanzando a favor de la corriente. Cuando llegan al segundo alveolo (2) se encuentran con un flujo de corriente que llega desde el tercer alveolo (3). Los mejores espermatozoides seguirán nadando por los bordes y conseguirán vencer la corriente en contra y llegar al tercer alveolo (3). Para que no sigan nadando, volviendo hacia atrás, y se queden atrapados en el tercer alveolo (3), este tiene unos pequeños salientes, progresivamente menos profundos, que hacen que los espermatozoides entren y se queden ahí atrapados, listos para ser aspirados y utilizados para el ICSI.By placing a semen sample (6) in the first alveolus (1), as there is pressure towards the second alveolus (2), the seminal plasma is dispersed through the first channel (4) and the sperm with better curvilinear mobility They move towards the edges of the channels and advance with the current. When they reach the second alveolus (2) they encounter a current flow that comes from the third alveolus (3). The best sperm will continue to swim along the edges and will be able to overcome the countercurrent and reach the third alveolus (3). So that they do not continue swimming, going back, and get trapped in the third alveolus (3), it has small protrusions, progressively shallower, that cause the sperm to enter and remain trapped there, ready to be aspirated and used. for ICSI.
El ángulo recto entre los caminos y la corriente en contra evita que el plasma seminal llegue al tercer alveolo, algo que podría reducir la capacidad fecundante de los espermatozoides. The right angle between the paths and the countercurrent prevents the seminal plasma from reaching the third alveolus, something that could reduce the fertilizing capacity of the sperm.
Sin embargo, los mejores espermatozoides sí son capaces de nadar contra corriente y alcanzar la gota final.However, the best sperm are capable of swimming against the current and reaching the final drop.
En las figuras 2 y 3 se pueden observar dos ejemplos de placas de CSI (7) con dos y cuatro sistemas de selección espermática por microfluidos y reotaxis respectivamente, con alveolos (8) con PVP para depositar los espermatozoides seleccionados, alveolos (9) para depositar los ovocitos para ICSI y alveolos extra (10) de medio de cultivo. In Figures 2 and 3 you can see two examples of CSI plates (7) with two and four sperm selection systems by microfluidics and rheotaxis respectively, with alveoli (8) with PVP to deposit the selected sperm, alveoli (9) for deposit the oocytes for ICSI and extra alveoli (10) of culture medium.
Claims (8)
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