EA032116B1 - Новое применение n,n-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида - Google Patents

Abstract

В соответствии с изобретением представлен N,N-бис-2-меркаптоэтил-изофталамид либо его фармацевтически приемлемые соли или производные для применения при системной регенерации аскорбата, а тем самым при терапевтическом лечении хронической обструктивной болезни легких.

Description

Настоящее изобретение касается нового применения известного соединения, хелатирующего тяжелые металлы.

Предшествующий уровень техники

Хроническая обструктивная болезнь легких (ΟΟΡΌ) является обструктивным заболеванием легких, которое характеризуется хронической затрудненностью дыхания, одышкой, кашлем и выделением мокроты.

Во всем мире СОРЭ, как полагают, затрагивает почти 600 млн лиц. Подавляющее большинство пациентов с СОРЭ являются курильщиками или бывшими курильщиками.

Существует много возможных причин СОРЭ, причем табакокурение является наиболее распространенной. Другие причины включают загрязнение воздуха, особенно от сжигания топлива (например, древесный дым). Также у заболевания может быть и генетический компонент.

Предполагается, что СОРЭ вызывается длительным воздействием этих раздражителей, что порождает воспалительные реакции в легких. Это приводит к сужению бронхов и разрушению легочной ткани (эмфиземе).

Хотя считается, что СОРЭ в большой степени является предотвращаемым заболеванием (например, путем уменьшения воздействия вызывающих его патогенов), оно по-прежнему является третьей самой распространенной в мире причиной смерти.

Лечение больных представляет серьезную проблему. В настоящее время первая линия лечения включает ингаляционные бронходилататоры и кортикостероиды. Однако ухудшение дыхания у страдающих СОРЭ обычно существенно не улучшается при применении существующих в настоящее время лекарств, а это значит, что зачастую применяются более радикальные меры, в том числе кислородная терапия и даже трансплантация легких. При обострении симптомов часто требуется госпитализация.

Из-за отсутствия эффективных способов лечения экономическое бремя СОРЭ огромно и оценивается в 2,1 трлн долларов в 2010 г. Социально-экономические издержки от СОРЭ могут возрасти, так как в развитых и развивающихся странах повышается долговечность. В ЕС прямые затраты на лечение 2 млн наиболее пострадавших пациентов составляет около 30 млрд евро в год (15 000 евро на 1 пациента в год). Прямые затраты на лечение других 20 млн больных составляют около 10 млрд евро (500 евро на 1 пациента в год). Таким образом, общие затраты составляют около 40 млрд евро, не считая дополнительных косвенных издержек из-за снижения производительности. При СОРЭ очень распространены сопутствующие заболевания, что еще больше раздувает стоимость лечения.

Таким образом, существует огромная, клинически неудовлетворенная потребность в новых и/или лучших средствах лечения СОРЭ. Также существует явная потребность в улучшенных способах лечения, способных воздействовать на ключевые патологические процессы, с потенциалом для изменения течения заболевания, уменьшения числа пациентов, прогрессирующих к более тяжелым стадиям заболевания.

Х,Х-бис-2-меркаптоэтил-изофталамид (ΝΒΜΙ) был впервые описан в патенте США за номером υδ 6,586,600 В2. Его применение в качестве пищевой добавки, а также для снятия окислительного стресса раскрыто в патентной заявке ϋδ 2010/0227812. ΝΒΜΙ известен как сильный хелатор тяжелых металлов, включая ртуть, кадмий и свинец. См. также Ра1с1 с1 а1., Тох1со1о§у Месйашктк апб Мс11юб8, 22, 383 (2012).

Аналоги ΝΒΜΙ были раскрыты среди прочего в ϋδ 8,426,368 В2 и международных патентных заявках \\'О 2011/038385 и \\'О 2012/121798.

Однако ни в одном из вышеуказанных документов не изложено потенциальное применение ΝΒΜΙ или родственных соединений при возможном лечении СОРЭ.

Общеизвестно, что у больных СОРЭ происходит усиление окислительного стресса в легких и системно, как в результате окислительной нагрузки от самого сигаретного дыма, так и от повышенного выделения активных форм кислорода (РО8) из активирующихся при этом воспалительных клеток.

Эукариотические клетки обладают внутриклеточными ферментными системами, которые регенерируют аскорбат из продукта его окисления, дегидроаскорбата (ΌΗΑ), тем самым предотвращая его необратимое окисление до дальнейших продуктов, не несущих антиоксидантной функции (например, см. Согб е1 а1., АгсН. ВюсНет. Вюрйуз., 500, 107 (2010)). Следовательно, этот механизм необходим для поддержания клеточных концентраций аскорбата и может происходить либо ферментативно под действием дегидроаскорбатредуктаз типа глутаредоксина (см. 8аагапеп е1 а1., Апбох1б. Кебох 81дпа1., 12, 15 (2010)) и протеин-дисульфидизомеразы (Лагба1 е1 а1., 1. Вю1. СНет., 276, 8825 (2001)), а также неферментативным путем через его восстановление под действием ΟδΗ (\Утк1ег е1 а1., Егее Кабк. Вю1. Μеб., 17, 333 (1994)).

Недавнее исследование показало, что вливание аскорбата повышает устойчивость к усталости скелетных мышц у пациентов с СОРЭ (например, см. Коззтаи е1 а1., Ат. 1. РНумок Ке§и1. 1п1е§г. Сотр. РЬу8ю1., 305 (2013)).

Мы обнаружили, что ΝΒΜΙ не только способен ингибировать высвобождение ключевых противовоспалительных маркеров типа интерлейкина-6 (Ш-6), интерлейкина-8 (Ш-8) и альфа-фактора некроза опухолей (ΤΝΕ-α), которые экспрессируются у больных СОРЭ (например, см. КиЫш е1 а1., Iπί1атт. А11егду Эгид Тагде18, 12, 315 (2013); ТНобейззоп е! а1., Кезр1г. Μеб., 103, 1548 (2009); Тапд, 1. ШегТегоп Су

- 1 032116

1окше Ке8., 34, 162 (2014) и Эабуапб с1 а1., Еиг. Ке§р1г. 1., (2014, ЕеЬ 20), но также, что весьма неожиданно, ΝΒΜΙ способен регенерировать аскорбат в жидкой фазе выстилки дыхательных путей. Кроме того, оказалось, что ΝΒΜΙ может выполнять это действие, функционируя в качестве донора электронов для рециркуляции аскорбата. Мы также обнаружили вне ожидания, что ΝΒΜΙ можно вводить пациентам для терапевтического лечения СОРЭ. ослабляя симптомы и модифицируя/устраняя прогрессирование заболевания и не вызывая значительных отрицательных побочных эффектов.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения предусмотрен ΝΒΜΙ либо его фармацевтически приемлемая соль или производное для применения в способе лечения СОРЭ. Такой способ включает введение фармацевтически эффективного количества ΝΒΜΙ нуждающимся в таком лечении пациентам.

Термин СОРО охватывает такие заболевания, которые в литературе именуются по-разному как хроническая обструктивная болезнь легких (СОЬО) или хроническая обструктивная болезнь дыхательных путей (СОЛО), которые характеризуются, к примеру, хронической затрудненностью дыхания, одышкой, кашлем и выделением мокроты.

Во избежание сомнений в контексте настоящего изобретения термины лечение, терапия и способ терапии включают терапевтическое или паллиативное лечение нуждающихся в этом больных СОРЭ или другими приведенными здесь родственными заболеваниями. Пациенты включают больных людей.

Фармацевтически приемлемые соли ΝΒΜΙ, которые можно упомянуть, включают соли щелочноземельных и особенно щелочных металлов, как то соли лития, натрия, калия, рубидия, цезия и франция.

Такие соли могут быть получены стандартными способами, например при реакции ΝΒΜΙ с одним или несколькими эквивалентами соответствующего основания, необязательно в растворителе или в среде, в которой соль нерастворима, с последующим удалением данного растворителя или данной среды стандартными методами (например, под вакуумом, лиофилизацией или фильтрованием). Соли также могут быть получены путем замены противоиона активного ингредиента в виде соли с другим противоионом, к примеру с помощью подходящей ионообменной смолы.

Фармацевтически приемлемые производные ΝΒΜΙ включают глутатион, цистеин, альфадигидролипоевую кислоту, цистамин, тиофосфат, 5'-тиоаденозин, Ь-гомоцистеин, кофермент А, 2меркаптоэтанол, дитиотреитол, производные йодацетата, бромацетата, фторацетата или хлорацетата. Такие производные могут быть получены, как описано, к примеру, в патентной заявке И8 2011/0237776.

ΝΒΜΙ, его фармацевтически приемлемые соли и фармацевтически приемлемые производные в дальнейшем совокупно именуются просто как ΝΒΜΙ.

В соответствии с другим аспектом изобретения предусмотрен способ лечения СОРЭ у пациентов путем введения ΝΒΜΙ в достаточной, фармацевтически эффективной дозе, способной регенерировать аскорбат (например, системно) у данного пациента.

Специалистам в данной области хорошо известно, что аскорбат также может по-разному именоваться в литературе как аскорбиновая кислота, Ь-аскорбиновая кислота и/или витамин С.

СОРЭ, как известно, связана с респираторной заболеваемостью и смертностью, риск которых в соответствии с изобретением может снижаться с помощью ΝΒΜΙ.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предусмотрен способ снижения риска (т.е. предотвращения) респираторной заболеваемости и смертности у пациентов, который включает введение ΝΒΜΙ таким пациентам, проявляющим симптомы СОРЭ.

Термин заболеваемость должен пониматься специалистами как включающий любые вызывающие, по крайней мере частично, нетрудоспособность болезни, заболевания, недомогания и/или вообще плохое состояние здоровья. Респираторная заболеваемость поэтому включает такие состояния, которые проявляются как последствия, например, СОРЭ.

Как оказалось, ΝΒΜΙ применим для облегчения симптомов СОРЭ, в том числе усталости (например, усталости скелетных мышц), одышки, кашля и выделения мокроты.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предусмотрен способ облегчения одного или нескольких симптомов СОРЭ у пациентов, страдающих СОРЭ, который включает введение ΝΒΜΙ таким пациентам.

Хотя они и не ограничиваются только этим, применение и способы лечения по изобретению, которые можно упомянуть, включают такие, при которых пациентами являются курильщики или бывшие курильщики.

В описанных здесь применениях и способах ΝΒΜΙ предпочтительно вводится местно или системно, к примеру, перорально, внутривенно или внутриартериально (в том числе при помощи внутрисосудистых или других периваскулярных устройств/дозовых форм (например, стентов)), внутримышечно, на кожу, подкожно, через слизистые оболочки (например, под язык или за щеку), ректально, трансдермально, интраназально, через легкие (например, путем ингаляции, трахеально или бронхиально), топически или любым другим парентеральным способом в виде фармацевтического препарата, содержащего соединение в фармацевтически приемлемой дозовой форме. Предпочтительные способы введения включают пероральное (в особенности), внутривенное, кожное или подкожное, интраназальное, внутримышечное или внутрибрюшинное введение.

- 2 032116

ΝΒΜΙ обычно вводится в виде одной или нескольких лекарственных форм в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем, которые можно выбирать с учетом предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. Такие фармацевтически приемлемые носители могут быть химически инертными по отношению к активным соединениям и не иметь вредных побочных эффектов или токсичности в условиях применения. Такие фармацевтически приемлемые носители также могут придавать немедленное или модифицированное высвобождение ΝΒΜΙ.

Подходящие лекарственные формы могут быть коммерчески доступными или же описаны в литературе, к примеру РстшЩоп. ТНе 8аеисе аиб Ртасбсе οί РНагтасу, 19(Н еб., Маск Ртшбид Сотрапу, Еайои, Реиикуката (1995); МаПтба1е, ТНе Сотр1е1е Эгид РеГегепсе (3 5^4Ь Ебйюи) и приведенные там документы, причем содержание всех этих документов включено сюда путем ссылки. С другой стороны, получение подходящих лекарственных форм может осуществляться специалистами и не по изобретению, а с помощью стандартных методов. Подходящие лекарственные формы для применения с ΝΒΜΙ также описаны в патентной заявке И8 2010/0227812.

Количество ΝΒΜΙ в лекарственной форме зависит от тяжести заболевания и от подлежащего лечению пациента, а также от того, какие соединения используются, но может быть определено и без изобретения специалистами.

В зависимости от подлежащего лечению пациента, а также от способа введения ΝΒΜΙ можно вводить в различных терапевтически эффективных дозах нуждающимся в этом пациентам.

Однако доза, вводимая человеку, в контексте настоящего изобретения должна быть достаточной для эффективной терапевтической реакции в течение разумного периода времени (как описано выше). Специалистам должно быть известно, что на выбор точной дозы и состава и наиболее подходящего режима доставки также будут влиять среди прочего фармакологические свойства лекарственной формы, природа и тяжесть подлежащего лечению заболевания и физическое и психическое состояние получателя, а также возраст, состояние, масса тела, пол и реакция подлежащего лечению пациента, стадия, тяжесть заболевания, а также генетические различия между пациентами.

Введение ΝΒΜΙ может быть непрерывным или прерывистым (например, болюсом). Дозировка также может определяться временем и частотой введения.

Поэтому подходящие дозы ΝΒΜΙ составляют от 0,5 до 100,0 мг, в том числе от 1 до 60 мг, к примеру между 1,5 и 40 мг соединения на кг общей массы тела пациента в день.

В любом случае практикующий врач или другой специалист сможет на практике определить такую дозировку, которая будет наиболее подходящей для конкретного пациента. Вышеприведенные дозировки являются типичными для обычных случаев. Конечно в отдельных случаях могут быть оправданы более высокие или более низкие интервалы доз, которые находятся в рамках объема настоящего изобретения.

В описанных здесь применениях и способах ΝΒΜΙ также можно комбинировать с одним или несколькими активными ингредиентами, которые потенциально применимы или показаны для применения при лечении СОРЭ. При этом такие пациенты могут и/или уже получают терапию на основе введения одного или нескольких из таких активных ингредиентов, причем под этим подразумевается получение предписанной дозы одного или нескольких из таких указанных здесь активных ингредиентов до, вместе с и/или после применения ΝΒΜΙ.

Такие активные ингредиенты включают бронходилататоры короткого действия (как то сальбутамол/альбутерол, левосальбутамол/левальбутерол, пирбутерол, эпинефрин, эфедрин и тербуталин), бронходилататоры длительного действия (как то сальметерол, кленбутерол, формотерол, бамбутерол и индакатерол), антихолинергические средства (как то тиотропий и ипратропий бромид), кортикостероиды (как то флунизолид, флутиказон пропионат, триамцинолон ацетонид, беклометазон дипропионат и будесонид) и другие препараты, используемые при лечении СОРЭ, в том числе долгосрочные антибиотики (например, такие макролиды как эритромицин), муколитики и кислород.

ΝΒΜΙ также можно вводить совместно с антиоксидантами или хелаторами, включая витамин Е, витамин Ό, цистеин, цистин, глутатион (С8Н), глутатион-липоевую кислоту (С8Н), дигидролипоевую кислоту (ПЬРЛ), липоевую кислоту (ЬРЛ), Ν-ацетилцистеин (ИЛС), димеркаптопропансульфонат (^ΜР8), димеркаптоянтарную кислоту (ΌΜ8Ά), этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и их смеси.

Фармацевтически приемлемые соли других активных ингредиентов, применимых при лечении СОРЭ, которые можно упомянуть, включают соли с кислотами и соли с основаниями. Такие соли могут быть получены стандартными способами.

Подходящие дозы других активных ингредиентов, включая те, что применимы при лечении СОРЭ, известны специалистам в данной области и включают дозы, приведенные для конкретных препаратов в медицинской литературе типа Μа^ί^ηба1е, ТНе Сотр1е1е Эгид РеГегепсе (35^4Ь Ебйюи) и приведенных там документах, причем содержание всех этих документов включено сюда путем ссылки.

Везде, где в описании используется слова примерно, к примеру, в контексте количества (например, дозы активных ингредиентов) следует иметь в виду, что такие переменные являются приблизительными и при этом могут отличаться на ± 10%, к примеру на ± 5%, предпочтительно ± 2% (например, ± 1%) от приведенных здесь чисел.

- 3 032116

Применения/способы, описанные здесь, могут иметь преимущество в том, что при лечении СОРЭ они могут быть более удобными для врача и/или пациента, более эффективными, менее токсичными, иметь более широкий спектр активности, быть более сильными, давать меньше побочных эффектов или же они могут иметь другие полезные фармакологические свойства, чем аналогичные способы лечения, известные на предшествующем уровне техники для применения в такой терапии.

Далее изобретение раскрывается на следующих фигурах и примерах, но никоим образом не ограничивается ими.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено на модели окисления аскорбата окисление аскорбата до ΌΗΆ под действием

9.10- фенантренхинона (9.10-РО) с последующей рециркуляцией ΌΗΆ под действием ΝΒΜΙ и дитиотреитола (ΌΤΤ).

На фиг. 2 представлено на модели окисления аскорбата окисление аскорбата до ΌΗΆ под действием СиЗО₄ с последующей рециркуляцией ΌΗΆ под действием ΝΒΜΙ и ΌΤΤ при добавлении их через 10, 20 и 30 мин, причем кинетика окисления аскорбата и рециркуляции представлена на левой панели, а соответствующий немедленный скачок и устойчивое повышение концентрации аскорбата после добавления ΝΒΜΙ и ΌΤΤ представлено на правой панели.

Примеры.

Пример 1. Ингибирование 1Ь-6 и 1Ь-8 при помощи ΝΒΜΙ.

Измеряли секрецию провоспалительных цитокинов - интерлейкина (1Ь)-6 и 1Ь-8 (а также ΟΜ-ί.'8Ρ и МСР-1) в клеточных средах в ответ на воздействие частиц на клетки А549 и ΒΕΆ8-2Β следующим образом.

Клетки легочного эпителия высеивали при 5х10⁴ в 24-луночные планшеты. После преинкубации в течение 3 ч с ΝΒΜΙ, антиокислительным соединением Ν-ацетил-Ь-цистеином (ИЛС), который использовался в качестве положительного контроля, или носителем среду удаляли.

Добавляли свежую среду, содержащую различные частицы (см. ниже) в разных концентрациях в общем объеме 0,5 мл еще на 24 ч. Затем отделяли супернатанты от клеток центрифугированием.

В бесклеточной жидкости измеряли ΙΕ-8, Ш-6, ΟΜ-ί’8Ρ и МСР-1 с помощью набора Эно8е1 ΕΕΙ8Ά Осус1ортсп1 кй (Β&Ό Зуйетк, ЛЫидбои, ИК) в соответствии с методикой производителя.

В качестве отрицательного контроля служило воздействие одной только среды. Каждый эксперимент проводили дважды в 4 повторах.

В общем, и диоксид титан типа Р25, и городская пыль (препарат 8ΒΜ 1649 Ь) вызывали выработку провоспалительных цитокинов в линиях клеток легочного эпителия А549 и ΒΕΆ8-2Β.

Эффект преинкубации при 50 мкМ ΝΒΜΙ на вызванную частицами выработку цитокинов испытывали при различных концентрациях соответствующих частиц.

Исследование показало, что ΝΒΜΙ может снижать вызванную частицами секрецию провоспалительных цитокинов в обеих линиях клеток, хотя лишь в некоторых случаях снижение доходило до фонового уровня.

Самые высокие концентрации Ш-8 и Ш-6 достигались в супернатантах клеток А549 при обработке их ΤίΟ₂ Р25 при 75 мкг/см². При этой дозе 50 мкМ ΝΒΜΙ снижал секрецию Ш-8 на 29% и Ш-6 на 38%.

При 100 мкг/см² препарата городской пыли преинкубация клеток А549 с 50 мкМ ΝΒΜΙ снижала секрецию Ш-8 на 30% и Ш-6 на 38%.

При 100 мкг/см² ΤίΟ₂ Р25 преинкубация клеток ΒΕΆ8-2Β с 50 мкМ ΝΒΜΙ снижала секрецию Ш-8 на 49% и Ш-6 на 37%.

При 100 мкг/см² препарата городской пыли преинкубация клеток ΒΕΆ8-2Β с 50 мкМ ΝΒΜΙ снижала секрецию Ш-6 на 47%.

Преинкубация с 5 мМ NΆС также эффективно снижала секрецию провоспалительных цитокинов. Пример 2. Регенерация аскорбата с помощью ΝΒΜΙ.

Исследовали, может ли ΝΒΜΙ функционировать в качестве донора электронов для рециркуляции аскорбата.

Кинетику окисления аскорбата, опосредованного и 1 мкМ 9,10-Рр, и 2 мкМ сульфата меди (Си8О₄), исследовали методом анализа истощения аскорбата (Ке11у е1 а1., Век. Вер. Иеа11й Είί. Ιηκΐ, 163, 3 (2011).

9.10- Рр использовали с тем, чтобы можно было изучать действие ΝΒΜΙ в отрыве от его хелатирующих свойств.

Все эксперименты проводили в трех повторах в 96-луночных планшетах ИУ с плоским дном (Стешет Βίο-опе) в конечном объеме 200 мкл. Воздействие запускали добавлением 20 мкл концентрированного раствора аскорбата (2 мМ) в каждую лунку, содержащую 160 мкл обработанной смолой Сйе1ех100 воды (содержащей 10% ΌΜ8Ο), плюс 10 мкл либо воды, маточного раствора Си8О₄ при 4 мМ или маточного раствора 9Э0-РС при 2 мМ и 10 мкл ΝΒΜΙ (4 мМ и 200 мкМ).

Все растворы готовили на обработанной смолой Сйе1ех-100 воде (содержащей 10% □[ИЗО). Это давало конечные концентрации в лунках 200 мкМ аскорбата, 2 мкМ СиЗО₄ или 1 мкМ 9,10-РС и от 10 до 200 мкМ ΝΒΜΙ.

Непосредственно перед добавлением аскорбата в каждую лунку при анализе планшет преинкубиро

- 4 032116 вали 10 мин при 37°С в считывающем устройстве (8рес!та Мах 190). Во время обработки планшет содержали при этой температуре. После добавления аскорбата его концентрацию, остающуюся в каждой лунке, отслеживали через каждые 2 мин на протяжении 2 ч путем измерения поглощения при 265 нм. Концентрацию аскорбата определяли по стандартной кривой, а скорость окисления аскорбата определяли методом линейной регрессии по начальной части графика концентрации от времени с помощью программы От1д1пЬаЬ фирмы М1сгоса1 8оП\таге Ытйеб (версия 5.0). Это делали для каждого из трех повторов, после чего скорость истощения аскорбата выражали в моль-сек^-1 х10^-9 в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Для экспериментов, в которых изучали влияние добавления ΝΒΜΙ к аскорбату, позже по ходу времени проводили анализ истощения Си8О₄ и 9.10-Рр. Планшеты инкубировали только со 190 мкл в течение первых 55-60 мин, после чего их вынимали из считывающего устройства и в каждую лунку добавляли 10 мкл либо ΝΒΜΙ, либо известного восстановителя - маточного раствора ΌΤΤ, либо воды. Затем планшет возвращали в считывающее устройство и отслеживали поглощение при 265 нм еще в течение 60 мин.

Определяли первоначальное повышение измеряемой концентрации аскорбата, которое именуется как скачок, в качестве меры исходной способности к рециркуляции. Также определяли устойчивое повышение в течение оставшихся 60 мин инкубации. Разница между этими двумя отражает способность добавленных соединений ингибировать последующую скорость опосредованного Си8О₄ или 9,10РО окисления аскорбата.

На фиг. 1 представлена кинетика окисления аскорбата, опосредованного инкубацией с 9,10-Рр, в течение первых 60 мин эксперимента. В это время добавляли ΝΒΜΙ (200 мкМ), и оказалось, что это приводит к немедленному повышению аскорбата скачком на 42,8 мкМ. После этого скорость окисления аскорбата снижалась по сравнению с первым 60-минутным периодом.

Это скачкообразное повышение аскорбата, которое указывает на рециркуляцию ΌΗΆ обратно в аскорбат, было неожиданным и оказалось значительно большим в сравнении с тем, что достигалось при использовании ΌΤΤ (200 мкМ), который давал меньшее первоначальное восстановление аскорбата в 5,1 мкМ, к тому же оно не было устойчивым.

На фиг. 2 представлена способность ΝΒΜΙ к рециркуляции ΌΗΆ на модели Си8О₄-аскорбат через 10, 20 и 30 мин инкубации. Опираясь на эти ранние моменты времени, скачкообразное повышение аскорбата после добавления ΝΒΜΙ было наиболее заметным при большей из двух тестируемых концентраций с последующим угасанием скорости окисления, возможно, из-за хелатирующих свойств соединения.

Эти эксперименты повторяли при добавлении ΝΒΜΙ и ΌΤΤ (оба при 200 мкМ) через 60 мин. При этом проявлялся немедленный скачок концентрации аскорбата на 7,93±6,58 мкМ с ΌΤΤ в сравнении с повышением на 24,98±5,54 мкМ с ΝΒΜΙ. За оставшиеся 60 мин инкубации устойчивое повышение аскорбата составляло 10,79±2,45 мкМ против 25,45±2,45 мкМ для ΌΤΤ и ΝΒΜΙ соответственно.

Эти результаты указывают на доселе неизвестное и неожиданное свойство ΝΒΜΙ, свидетельствуя о том, что он может рециркулировать ΌΗΆ обратно в аскорбат.

Пример 3. Лечение пациентки с СОРИ.

Пенсионерка, проживающая в США, которой несколько лет назад был поставлен диагноз СОРИ, регулярно испытывала приступы кашля 2-4 раза в сутки, начинавшиеся в любой час дня или ночи и продолжавшиеся от 40 до 75 мин.

Вследствие этих приступов кашля, дыхание у пациентки было неглубоким, ее горло раздраженным, а голос хриплым, уровень энергии у нее был очень низок, а качество жизни очень плохое.

Лечение три раза в день (во время еды) дозами по 100 мг ΝΒΜΙ в одной капсуле на протяжении 8 дней привело к значительному улучшению симптомов. На восьмой день лечения пациентка не испытывала никаких приступов кашля, и у нее значительно улучшилось дыхание.

Пример 4. Исследование ίη νΐνο Курящие мыши Ι.

Исследования показали, что сигаретный дым может вызвать воспалительную реакцию легких у мышей С57В1/6 и Иа1Ь/с при воздействии 5-6 сигарет в день 5 дней в неделю (например, см. И'1ш1к1 е1 а1., Еиг. Кекрп. 1., 26, 204 (2005) и 1ипд е1 а1., ΒΜС Сошр1ешеп1. АНегп. Μеά., 13, 219 (2013)).

Была разработана мышиная модель индуцированного сигаретным дымом (С8) заболевания дыхательных путей, в которой четыре группы мышей ΒΑΕΒ/с подвергали воздействию С8 (только в нос) с помощью курительной машины для сигарет, которая дает сочетание бокового и основного потока дыма из исследовательских сигарет с фильтром 7 дней в неделю на протяжении 2 недель.

В рамках 14-дневного исследования по определению дозы трем группам мышей вводили ΝΒΜΙ подкожно (5, 30 или 150 мг/кг) перед каждым воздействием С8. Проводили подсчет воспалительных клеток в бронхоальвеолярном смыве (ΒΑΕ), анализ методом проточной цитометрии (БАС8) и анализ цитокинов в БАБ.

Материалы и методы.

В данном исследовании использовали самок мышей ΒΑΕΒ/с (Наг1ет БаЬогаЮпек, Нидерланды). Их размещали в пластиковых клетках с впитывающей подстилкой и поддерживали 12-часовой цикл освещения. Пищу и воду давали аб НЬйит. Их содержание и экспериментальные протоколы были одобрены

- 5 032116

Региональным комитетом по этике при экспериментах на животных в Итеа. Мышам было 12 недель в самом начале протокола воздействия сигарет.

Протокол воздействия С8.

Животных подвергали вдыханию С8 (и бокового, и основного потока дыма). Воздействие С8 проводили в управляемой микропроцессором курительной машине для сигарет (ТЕ-10, Теадие Ейетргйек, СА, США), которая вырабатывает дым из исследовательских сигарет (1К5Е, Ишуегайу οί Кеи1иску, Ьехιημίοη. ΚΥ, США).

Сигареты автоматически подаются в карусель, прикуриваются, делаются затяжки и выбрасываются. Каждая сигарета курилась в течение 10 мин, а поток воздуха через машину был установлен на 12 л/мин. Сигареты хранились при -20°С до тех пор, пока не потребуются. Мышам подавали по 4 сигареты через каждые 10 минхЗ (т.е. 12 сигарет за 30 мин) раз в день, 7 дней в неделю на протяжении 2 недель. Дым поступал в дымовую башню (ЕММ8, ИК), обеспечивающую равное и одновременное воздействие С8.

Мышей помещали в пластиковые камеры и подвергали воздействию С8 только в нос. Контрольные мыши подвергались манипулированию каждый день и дышали комнатным воздухом, но их не вынимали из клеток.

Соответственно было 5 опытных групп, разделенных следующим образом:

1) ежедневное воздействие чистого воздуха (группа плацебо);

2) ежедневное воздействие С8 (группа плацебо с воздействием С8);

3) ежедневное воздействие С8, обработка ΝΒΜΙ в дозе 5 мг/кг (группа ΝΒΜΙ 5 мг/кг)

4) ежедневное воздействие С8, обработка ΝΒΜΙ в дозе 30 мг/кг (группа ΝΒΜΙ 30 мг/кг)

5) ежедневное воздействие С8, обработка ΝΒΜΙ в дозе 150 мг/кг (группа ΝΒΜΙ 150 мг/кг).

На 15-й день мышей обескровливали и подвергали бронхоальвеолярному лаважу (БАЕ). Легкие подвергали лаважу 4 раза через трахеальные трубки в общем объеме 1 мл+3х1 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса без Са²⁺^д²⁺ (ΗΒ88, 8|дта-А1йпс11, 81е1ийе1т, Германия).

Промывную жидкость после ΒΑΕ сразу же центрифугировали (10 мин, 4°С, 1750 об/мин). После удаления супернатанта до дальнейшего анализа клеточный осадок ресуспендировали и затем разбавляли 0,5 мл ΡΒ8. Лейкоциты подсчитывали вручную в гемоцитометре с тем, чтобы можно быть внести 20000 клеток и центрифугировать на центрифуге СуЮхрт® (цитоцентрифуга 8йапбои® СуЮхрт 3, система выделения клеток).

Препараты после цитоцентрифуги окрашивали с помощью реагента Μау-С^ииνа1ά-С^ет8а и проводили дифференциальный анализ легочных воспалительных клеток по стандартным морфологическим критериям, используя по 300 клеток от 1 препарата ί'νίοφίη.

Проводили анализ медиаторов воспаления в ΒΑΕ и сыворотке на наличие интерлейкина (ΙΕ)-1α, ГЬ1β, Ш-2, Ш-3, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-9, Ш-10, Ш-12р40, Ш-12р70, Ш-13, Ш17, эотаксина, С-С8Е, ΙΝΕγ, 0ΜС8Е, КС, МСР-1, ΜΙΡ-1α, ΜΙΡ-1β, ΚΑΝΤΕ8 и ΤΝΕα. Все анализы на цитокины проводили одновременно с помощью мультиплексного набора (23-плексная панель ΒίοΡΚχ™ Рго Μοιιχο Су1окте) в соответствии с инструкциями производителя (Βΐο-Каф и анализировали на установке Βίο-ΡΚχ™ (Ьиттех Βίο-ΡΚχ™ 200 8уйет, Βίο-Каф Негси1е8, Са).

Лейкоциты из ΒΑΕ анализировали методом проточной цитометрии на установке ΒΌ ΡΑί'8οΓ1™ (ΒοΛοη Οκΐιίηδοη, 8аи Охе, СА). Клетки из ΒΑΕ ресуспендировали в ΡΒ8, как описано выше. Окрашивание антителами проводили в 96-луночных планшетах при 2,0х 10⁵ клеток на образец.

Клетки преинкубировали с блокирующим РсР антителом (аи1-СО16/СО32; клон 2.4С2), чтобы уменьшить неспецифическое связывание. Для идентификации подтипов Т-клеток использовали следующие тАЬх: СП3-НТС (клон 17А2), ί.Ό4-ΡΕ (клон Н129.19) и С^8а-ΡΕ-Су5 (клон 53-6.7). В качестве отрицательного контроля использовали антитела соответствующего изотипа. Проточную цитометрию проводили на установке ΒΌ ΡΑί’8οΓΐ™ ^есШи ΌκΠηκοη, 8аи Ιο^ο, СА) по стандартной методике и анализировали данные с помощью программного обеспечения ΒΌ ЕАС8Б1уа. Все антитела получали из ΒΌ 8с1еисех Ρйа^т^идеи (8аи Ώιο^ο, СА). Т-клетки определяли как СБ3⁺.

Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (8.Ε.Μ). Статистическую значимость оценивали параметрическими методами, используя двусторонний дисперсионный анализ (ΑΝΟνΑ) для определения отличий между группами с последующим тестом ποδί 1юс Бонферрони. Когда это уместно, то использовали односторонний ΑΝΟνΑ или непарный 1-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считались результаты с р<0,05.

Статистический анализ проводили и строили графики с помощью Стар^ай Ρπδΐη (версия 6.0, Стар^ай 8οΠ\ν;·ιΐΌ Шс., 8аи Ώιο^ο, СА, США).

Результаты.

Всех животных взвешивали каждый день с 1-го по 15-й день через 24 ч после последнего воздействия дымом. Мыши не имели существенных отличий по весу в 1-й день. На 15-й день животные в группе ΝΒΜΙ 5 мг/кг имели меньший конечный вес (9,5±0,3 г), чем мыши, испытавшие воздействие С8 (20,3±0,3 г, р<0,05). Все мыши, испытавшие воздействие С8, независимо от дозы ΝΒΜΙ, значительно похудели за период с 1-го по 15-й день.

- 6 032116

Общее количество клеток в ВЛЬ у испытавших воздействие С8 животных (15-й день) не было существенно выше, чем в контрольных группах (296700±43650 при С8 и 284670±63200 клеток/мл без С8, р>0,05). Воздействие С8 вызывало значительное увеличение нейтрофилов в жидкости ВЛЬ (940±250 при С8 и 260±160 клеток/мл без С8, р<0,05). На 15-й день у животных в группе ΝΒΜΙ 150 мг/кг и группе ΝΒΜΙ 30 мг/кг было значительно меньшее число нейтрофилов, чем у мышей, просто испытавших воздействие С8.

За 2 недели воздействия С8 уровни медиаторов воспаления существенно не повышались, за исключением 6-С8Р в ВЛЬ. В группе ΝΒΜΙ 5 мг/кг понизился уровень ΜΙΡ-1 по сравнению с группой плацебо с воздействием С8 (р<0,05). Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.

За 2 недели воздействия С8 уровни медиаторов воспаления в сыворотке не повышались существенно. В группе ΝΒΜΙ 150 мг/кг понизились уровни 1Ь-1, 1Ь-3, 1Ь-6, эотаксина, ΜΙΡ-1 и ΚΆΝΤΕ8 по сравнению с группой плацебо с воздействием С8. В группе ΝΒΜΙ 30 мг/кг повысился уровень ЕС-10 в сыворотке. Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.

За 2 недели воздействия С8 не повысились существенно уровни клеток СЭ4 или клеток СЭ8 в жидкости ВЛЬ. Не отмечалось никаких существенных отличий между любыми группами.

У мышей в группе NΒΜI 150 мг/кг образовались ранки на загривке. В двух других группах NΒΜI не было никаких признаков изъязвления, равно как и в группах плацебо.

Пример 5. Исследование ίη νίνο Курящие мыши ΙΙ.

Из результатов исследования, описанного выше в примере 4, был сделан вывод, что двух недель курения сигарет, возможно, было недостаточно для того, чтобы вызвать воспалительную реакцию.

Поэтому за 14-дневным исследованием по определению дозы последовало 90-дневное исследование с использованием практически такой же установки и методики, описанных выше в примере 4.

При этом было 5 опытных групп, распределенных следующим образом:

1) ежедневное воздействие чистого воздуха (группа плацебо, гр. 1);

2) ежедневное воздействие С8 (группа плацебо с воздействием С8, гр. 2);

3) ежедневное воздействие С8, обработка ^ΜΙ в дозе 30 мг/кг (группа ^ΜΙ 30 мг/кг, гр. 3);

4) ежедневное воздействие С8, обработка ^ΜΙ в дозе 60 мг/кг (группа ^ΜΙ 60 мг/кг, гр. 4);

5) ежедневное воздействие С8, обработка ^ΜΙ в дозе 150 мг/кг (группа ^ΜΙ 150 мг/кг, гр. 5).

На 91-й день животных взвешивали и анестезировали пентобарбиталом натрия (90 мг/кг массы тела, в/б). Мышей подвергали трахеотомии с помощью канюли 18-го калибра и проводили механическую вентиляцию в квазисинусоидальном режиме с помощью дыхательного аппарата для небольших животных (Р1ех1Уеп1™, ЗСШЕО®) с частотой 3 Гц и дыхательным объемом (У_т) в 12 мл/кг массы тела. Применяли положительное давление в конце выдоха 3 см Н₂О.

Сердечный выброс у животных отслеживали посредством оценки механики дыхания. Мышей обездвиживали панкуронием (0,1 мг/кг массы тела, в/б (местные поставщики)), а затем проводили маневр из 4 вздохов при 3хУ_т в начале эксперимента, чтобы установить стабильную исходную механику дыхания и обеспечить одинаковость объема перед экспериментом.

Динамическую механику легких измеряли при синусоидальном стандартизованном дыхании и анализировали на однокомпартментной модели методом множественной линейной регрессии, получая сопротивление дыханию (Яка), эластичность (Е_кз) и податливость (Скз)· Измерение отражает и сужение проводящих дыхательных путей и изменения в легких. Измерения С_ка и Е_кз отражают только события на периферии легких, в особенности закрытие дыхательных путей, ведущее к уменьшению вовлеченности ацинусов. Напротив, избирательное изменение С_кз свидетельствует о более дистальном месте действия.

Более тщательные оценки механики легких проводили методом вынужденных колебаний (ΡΘΤ) в соответствии с 1опаккоп е! а1., Ке^ри. Кек., 9, 23 (2008) и Иекри. РйукюГ №игоЬю1., 165, 229 (2009). Параметры, которые получали при измерении ΡΟΤ в этом исследовании, это ньютоновское сопротивление (Κ_Ν), гасящее сопротивление (С), которое тесно связано с сопротивлением тканей и отражает диссипацию энергии в тканях легких, и эластичность тканей (Н), которая характеризует жесткость тканей и отражает запас энергии в тканях.

Динамические кривые давление-объем (РУ) определяли путем раздувания легких до максимального давления в 30 см Н₂О и допуская пассивный выдох с помощью управляемого компьютером дыхательного аппарата Р1ехщеп1 для измерения объема и давления. Собирали индивидуальные результаты от каждого животного. Все измерения РУ проводились в трех повторах. Квазистатические петли РУ получали при медленном ступенчатом раздувании и спадении легких. Петли РУ выполняли для уровня РЕЕР в 3 см Н₂О. Коэффициент формы (к) нисходящего колена петли РУ рассчитывали путем аппроксимации данных по уравнению 8а1а/аг-Кпоп1е8. Значение параметра к изменяется характерным образом при фиброзе и эмфиземе. Также получали квазистатическую податливость (С₈₄) и эластичность (Е_к!) и объем вдыхаемого воздуха, достаточный для достижения 20 см водного столба.

Бронхоальвеолярный лаваж (ВЛЬ) осуществляли в основном как описано выше в примере 4, равно как и анализ методом проточной цитометрии клеток из ВЛЬ и анализ медиаторов воспаления в ВЛЬ и

- 7 032116 сыворотке.

Замороженную ткань легких гомогенизировали вместе с 1 мл РВ8 в пробирке на 2 мл с помощью вибрационной мельницы (Ке1с11 ММ400) в течение 2 мин при 4°С. Сразу же после гомогенизации пробирку центрифугировали в течение 15 мин (1500 об/мин, 4°С). Надосадочную жидкость удаляли и сохраняли для определения концентрации белка на спектрофотометре ХапоОгор (Рго1еш8 А280). После определения содержания белка отбирали равные количества белка из каждого образца для анализа трансформирующего фактора роста-бета (ΤΟΡβ) 1-3. Анализ ΤΟΡβ 1-3 проводили одновременно с помощью мультиплексного набора (Вю-Р1ех Рго ΤΟΡ-β 3-Р1ех 1тшипоа88ау) в гомогенате легочной ткани в соответствии с инструкциями производителя (Вю-Каб), а анализ проводили на установке Вю-Р1ех™ (Ьиштех Вю-Р1ех™ 200 8уз!ет, Вю-Каб, Негси1ез, СА).

Животные, подвергавшиеся гистологическому анализу, не проходили тестирование дыхательной функции в целях сохранения целостности тканей. Извлекали правую долю легкого и фиксировали в 4% параформальдегиде до заливки в парафин. После заливки в парафин ткань нарезали на срезы толщиной 3 мкм и монтировали на положительно заряженные предметные стекла. Для оценки инфильтрации воспалительных клеток срезы депарафинировали, обезвоживали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистопатологическая оценка окрашенных срезов проводилась профессиональным патологоанатомом, специализирующимся на мелких животных, в Национальном ветеринарном институте (8УА) в Цррза1а, Швеция.

Статистический анализ проводили в основном как описано выше в примере 4.

Результаты.

В приведенной ниже табл. 1 представлено количество мышей, использовавшихся для различных анализов. У всех мышей брали пробы крови.

Таблица 1

	Физиология дыхательных путей, ВАВ и сыворотка крови	Гистология и сыворотка крови
Группа 1	9	3
Группа 2	7	3
Группа 3	9	3
Группа 4	8	3
Группа 5	7	3

За время 90-дневного воздействия погибло 5 мышей. В большинстве случаев они были подвергнуты эвтаназии из-за ухудшения состояния здоровья, как то большого снижения веса и летаргии, см. табл. 5. При анализе 6 мышей оказались явными выбросами, поэтому они были исключены из набора данных (табл. 2).

Таблица 2

	Исключены из-за ухудшения состояния здоровья при воздействии С§	Исключены из набора данных (статистический критерий)
Группа 1	-	2
Группа 2	2	1
Группа 3	-	3
Группа 4	1	-
Группа 5	2	-

Все испытавшие воздействие С8 мыши заметно пострадали от него. У них была взъерошенная шерсть и потеря мышечной силы. Животные, получавшие ХВМ1 (гр. 3 и гр. 4), выглядели в некоторой степени более здоровыми, чем в других группах, получавших плацебо (наблюдение зоотехника). Место инъекции для подкожного введения ХВМ1 меняли, чтобы избежать рубцов и изъязвлений. Несмотря на это, у мышей в гр. 5 образовались ранки и шишки на загривке. Две другие группы ХВМ1 не проявляли признаков изъязвления, равно как и группы плацебо. Контрольные животные получали ΏΜ8Θ в той же концентрации, что и ХВМ1 в гр. 5.

Испытавшие воздействие С8 животные проявляли значительные отличия по весу от контрольных животных на 90-й день. У контрольных мышей масса тела увеличилась на 15% (2,8±0,2 г), тогда как при воздействии С8 у мышей масса тела существенно не возрастала (-0,1±0,3 г). Все животные, получавшие ХВМ1, прибавили в весе по сравнению с исходным весом (гр. 3 1,0 ± 0,4 г, гр. 4 0,7 ± 0,2 г и гр. 5 0,6 ± 0,2 г). Общее количество клеток в ВАВ у подвергавшихся воздействию С8 животных на 90-й день было значительно выше, чем в контрольных группах (246700±21980 клеток на мл при С8 и 152000±20540 клеток/мл без С8, р<0,01). Воздействие С8 вызывало значительное увеличение макрофагов в жидкости ВАВ (229300±21400 клеток/мл при С8 и 134200±18600 клеток/мл без С8, р<0,01).

Воздействие С8 не вызывало увеличения числа инфильтрирующих нейтрофилов и лимфоцитов в жидкости ВАВ по сравнению с контрольной группой (гр. 1). У животных, получавших ХВМ1 (30, 60 и 150 мг/кг), не было существенного снижения числа макрофагов в ВАВ. Однако отмечалась тенденция к снижению числа нейтрофилов в гр. 4 и гр. 5 и снижение числа лимфоцитов в группах, получавших ИВМ1.

- 8 032116

После 90-дневного воздействия С8 не возрастали существенно уровни Т-хелперов (СО4+/СЭ3+) или Т-цитотоксических (СЭ8+/СЭ3+) лимфоцитов в жидкости ВАТ, как показал анализ РЛС8. Процентное содержание обоих типов лимфоцитов существенно не изменялось после обработки ΝΒΜΙ. Однако поскольку после обработки ΝΒΜΙ снижалось общее число лимфоцитов, наблюдалось значительное снижение Т-цитотоксических лимфоцитов (ί.Ό8+/ί.Ό3+) в жидкости ВЛЬ у получавших ΝΒΜΙ животных по сравнению с гр. 2.

90-дневное воздействие С8 вызывало структурные изменения в легких по сравнению с контрольными животными (гр. 2 против гр. 1), о чем свидетельствуют вызванные С8 изменения и в крупных, и в малых дыхательных путях за счет повышения Е_кз и Н вместе со снижением С_кз. Вызванное С8 снижение коэффициента гистерезисности η отражает уменьшение гетерогенности в легких.

Более высокие дозы ΝΒΜΙ (гр. 4 и гр. 5) вызывали значительное увеличение сопротивления малых и крупных дыхательных путей (В_кз и О).

У мышей, испытавших воздействие С8 (гр. 2), измеряли кривые РУ и сравнивали с мышами, получавшими комнатный воздух (гр. 1). При воздействии С8 легкие становились значительно жестче, и требовалось большее давление для их раздувания. Животные, получавшие ΝΒΜΙ (30, 60 и 150 мг/кг), не проявляли существенных изменений дыхательной функции по сравнению с группой плацебо (гр. 2). Воздействие дыма не влияло на С₈₁, Е₈₁ и к.

90-дневное воздействие С8 не вызывало существенного повышения уровней медиаторов воспаления в ВЛЬ и сыворотке. В группе ΝΒΜΙ 150 мг/кг (гр. 5) уровни ΜΙΡ-1β (р<0,05) и ΟΜ-Ρ8Ρ (р<0,01) в сыворотке снижались по сравнению с группой плацебо с воздействием С8 (гр. 2). Никаких других существенных отличий по анализируемым медиаторам воспаления не было.

Испытавшие воздействие С8 животные (гр. 2) не проявляли повышения уровня ΤΟΡβ в гомогенатах легких по сравнению с контрольной группой (гр. 1). У животных, получавших ΝΒΜΙ, содержание ΤΟΡβ 1-3 существенно не изменялось по сравнению с группой плацебо, получавшей С8 (гр. 2).

В просвете бронхов и альвеолах у всех легких проявлялось немного макрофагов. В получавших обработку группах макрофаги были несколько более многочисленны и проявляли цитоплазматические гранулы желтоватого пигмента или черного пигмента. Черным пигментом могла быть сажа от воздействия сигарет, а желтоватым пигментом - липофусцин.

У испытавших С8 животных наблюдалось небольшое число лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги) в некоторых альвеолярных перегородках, а также субплеврально в периферических участках легких. Небольшое повышение числа макрофагов в подвергшихся воздействию сигарет группах было слабовыраженным, и легкие оставались вполне ниже порога воспаления. Наблюдавшиеся изменения не были настолько интенсивными, чтобы вызвать клинические признаки.

Контрольные животные в данном исследовании проявляли значительно лучшую функцию дыхательных путей и больший прирост веса, чем испытавшие воздействие С8 мыши, но увеличение числа клеток в жидкости ВЛЬ не отличалось существенно от гр. 2. Контрольные мыши получали такую же обработку, что и гр. 2, кроме воздействия С8-дыма. Однако все животные находились в одном и том же помещении в лаборатории.

Заключение.

Испытавшие воздействие С8 мыши проявляли потерю веса (или отсутствие повышения веса), возрастание макрофагов и большую жесткость легких наряду со снижением податливости дыхания.

Обработка ΝΕΜΙ (гр. 3 и гр. 4) улучшала состояние здоровья у мышей, подвергавшихся ежедневному воздействию С8 в течение 90 дней. Положительный эффект обработки подтверждается увеличением веса и тенденцией к снижению числа лимфоцитов и снижением клеток СЭ8+ в жидкости ВЛЬ по сравнению с группой плацебо с воздействием С8 (гр. 2).

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение П,П-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли при лечении хронической обструктивной болезни легких.
2. 2. Применение по п.1, при котором вводимая доза П,П-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
3. 3. Применение по п.1 или 2, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.
4. 4. Применение П,П-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли в способе облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.
5. 5. Применение по п.4, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
6. 6. Применение по любому из пп.1-5, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.
7. 7. Применение по п.6, при котором пациент также получает терапию, которая включает введение

   - 9 032116 активного ингредиента, выбранного из бронходилататора, антихолинергического средства или кортикостероида.
8. 8. Применение НН-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для лечения хронической обструктивной болезни легких.
9. 9. Применение по п.8, при котором вводимая доза Н,Н-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
10. 10. Применение по п.8 или 9, при котором лечение снижает риск респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента.
11. 11. Применение НН-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления медикамента для способа облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента.
12. 12. Применение по п.11, при котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
13. 13. Применение по любому из пп.8-12, при котором способ лечения касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.
14. 14. Способ лечения хронической обструктивной болезни легких, который включает введение Ν,Νбис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в таком лечении пациенту.
15. 15. Способ по п.14, в котором вводимая доза НН-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его соли способна регенерировать аскорбат системно.
16. 16. Способ снижения риска респираторной заболеваемости и/или смертности у пациента, который включает введение НН-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту, проявляющему симптомы хронической обструктивной болезни легких.
17. 17. Способ облегчения одного или нескольких симптомов хронической обструктивной болезни легких у страдающего ею пациента, который включает введение НН-бис-2-меркаптоэтил-изофталамида или его фармацевтически приемлемой соли такому пациенту.
18. 18. Способ по п.17, в котором симптом представляет собой усталость скелетных мышц и/или кашель/выделение мокроты.
19. 19. Способ по любому из пп.14-18, который касается пациента, который является курильщиком или бывшим курильщиком.

    - 10 032116