EA039858B1

EA039858B1 - Антитела против c5 и их применение

Info

Publication number: EA039858B1
Application number: EA201990022A
Authority: EA
Inventors: Ин ХУ; Адрианна Латуцек; Кармело Романо; Уилльям Олсон
Original assignee: Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2022-03-21
Also published as: EA201990022A1

Abstract

Изобретение предусматривает моноклональные антитела, которые связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), и способы их использования. В различных вариантах осуществления изобретения антитела представляют собой антитела полностью человека, которые связываются с белком С5. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно использовать для ингибирования или нейтрализации активности С5, таким образом предоставляя средство лечения или предотвращения связанного с С5 заболевания или нарушения у человека. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к антителу против С5, которое имеет усовершенствованные фармакокинетические и фармакодинамические свойства, например время полужизни больше чем 10 суток.

Description

Заявка на данное изобретение, поданная 13 июня 2017 г. как международная патентная заявка РСТ, испрашивает преимущество приоритета предварительных заявок США № 62/349,705, поданной июня 2016 г.; 62/405,561, поданной 7 октября 2016 г.; и 62/422,10, поданной 15 ноября 2016 г., раскрытия каждой включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые специфически связываются с фактором комплемента С5, и к терапевтическим и диагностическим способам использования этих антител.

Предпосылки изобретения

Система комплемента представляет собой группу белков плазмы, которые при активации ведут к лизису клетки-мишени и содействуют фагоцитозу через опсонизацию. Комплемент активируют через серию протеолитических стадий по трем основным путям: классический путь, который обычно активируют иммунные комплексы, альтернативный путь, который могут индуцировать незащищенные клеточные поверхности, и путь маннозосвязывающего лектина. Все три пути каскада комплемента сходятся к протеолитическому расщеплению белка компонента 5 (С5) комплемента. Расщепление компонента 5 комплемента (С5) ведет к образованию фрагментов С5а и С5Ь, этот процесс критичен во время активации каскада комплемента. С5а может вызывать плейотропные физиологические ответы через связывание со своими рецепторами (Monk et al., 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448). C5a является сильным провоспалительным медиатором, который индуцирует хемотаксическую миграцию, усиливает клеточную адгезию, стимулирует окислительный взрыв и индуцирует высвобождение различных медиаторов воспаления, таких как гистамин или цитокины. С5Ь опосредует формирование мембраноатакующего комплекса (MAC или С5Ь-9), что ведет к лизису клеток в поздних фазах комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, в ядросодержащих клетках, которые устойчивы к цитолизу посредством С5Ь-9, сублитические количества С5Ь-9 могут вызывать активацию клеток, результатом чего является клеточная пролиферация, образование провоспалительных медиаторов и продуцирование внеклеточного матрикса.

Моноклональные антитела к С5 известны в данной области и описаны, например, в патентах США/публикациях № 9206251, 9107861, 9079949, 9051365, 8999340, 8883158, 8241628, 7999081, 7432356, 7361339, 7279158, 6534058, 6355245, 6074642, 20160299305, 20160051673, 20160031975, 20150158936, 20140056888, 20130022615, 20120308559 и в WO 2015/198243, WO 2015/134894, WO 2015/120130, ЕР 2563813В1, ЕР 2328616В1 и ЕР 2061810В1.

Антитела полностью человека, которые специфически связываются с белком С5 с высокой аффинностью и обладают усовершенствованными фармакокинетическими свойствами, могут быть важны при предотвращении и лечении различных С5-ассоциированных заболеваний (например, атипичного гемолитико-уремического синдрома).

Краткая сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связывают белок фактора 5 комплемента (С5). Антитела по настоящему изобретению можно использовать, inter alia, для ингибирования или нейтрализации активности белка С5. В определенных вариантах осуществления антитела можно использовать при предотвращении, лечении или улучшении по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения у субъекта. В определенных вариантах осуществления антитела можно вводить профилактически или терапевтически субъекту, который имеет риск наличия или имеет С5-ассоциированное заболевание или нарушение. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 представляют собой антитела полностью человека, которые связываются с С5 с высокой аффинностью и обладают усовершенствованными фармакокинетическими (PK) и фармакодинамическими (PD) свойствами. Такие высокоаффинные антитела с усовершенствованной PK/PD можно использовать для обеспечения превосходящего эффекта, наряду с менее частым дозированием у субъекта с С5-ассоциированным заболеванием или нарушением.

Антитела по изобретению могут быть полноразмерными (например, антитело IgG1 или IgG4) или могут содержать только антигенсвязывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv), и их можно модифицировать для того, чтобы влиять на функциональность, например, чтобы увеличивать персистенцию в организме-хозяине или устранять остаточные эффекторные функции (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). В определенных вариантах осуществления антитела могут быть биспецифическими.

В первом аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенные рекомбинантные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются специфически с белком С5. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой моноклональные антитела полностью человека.

Образцовые антитела против С5 по настоящему изобретению перечислены в табл. 1 и 2 в настоящем описании. В табл. 1 приведены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) образцовых антител против С5. В табл. 2 приве- 1 039858 дены идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты для HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2

HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3 образцовых антител против С5.

Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащую любые аминокислотные последовательности HCVR, перечисленные в табл. 1, в паре с любыми аминокислотными последовательностями LCVR, перечисленными в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащихся в любых образцовых антителах против С5, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 и 338/346. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбирают из одной из SEQ ID NO: 50/58 (например, Н4Н12161Р), 98/106 (например, Н4Н12166Р), 138/106 (например, Н4Н12166Р5) или 202/210 (например, Н4Н12170Р). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше пяти замен аминокислот, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше двух замен аминокислот. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую не больше пяти замен аминокислот, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую не больше двух замен аминокислот. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую по меньшей мере одну замену аминокислоты, и указанная LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую одну замену аминокислоты.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%,

- 2 039858 по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат CDR3 легкой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любых аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любые аминокислотные последовательности HCDR3, перечисленные в табл. 1, в паре с любыми аминокислотными последовательностями LCDR3, перечисленными в табл. 1. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в любых образцовых антителах против С5, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 56/64 (например, Н4Н12161Р), 104/112 (например, Н4Н12166Р), 144/112 (например, Н4Н12166Р5) и 208/216 (например, Н4Н12170Р).

Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела,или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная LCVR содержит LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту, и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности, перечисленной в табл. 1, на одну аминокислоту. Например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная HCVR содержит HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 100 на одну аминокислоту, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 102 на одну аминокислоту, и HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 104 на одну аминокислоту. В другом образцовом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR и LCVR, указанная LCVR содержит LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 108 на одну аминокислоту, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 110 на одну аминокислоту, и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112 или аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 112 на одну аминокислоту.

Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ней.

Настоящее изобретение также относится к антителам, или их антигенсвязывающим фрагментам, которые содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 354 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ней.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 8 0% или по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ней;

и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 354 или по существу схожую с ней последовательность, обладающую по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с ней.

Настоящее изобретение также относится к антителам, или их антигенсвязывающим фрагментам,

- 3 039858 которые содержат набор из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащийся в любом из образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.

В определенных вариантах осуществления набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52-54-56-60-62-64 (например, Н4Н12161Р), 100-102-104-108-110-112 (например, Н4Н12166Р), 140-142-144-108-110-112 (например, Н4Н12166Р5) и 204-206-208-212-214-216 (например, Н4Н12170Р).

В связанном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат набор из шести CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, как определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50/58 (например, Н4Н12161Р), 98/106 (например, Н4Н12166Р), 138/106 (например, Н4Н12166Р5) или 202/210 (например, Н4Н12170Р). Способы и приемы идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны в данной области, и их можно использовать для того, чтобы идентифицировать CDR в конкретных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрытых в настоящем описании. Образцовые конвенции, которые можно использовать для того, чтобы идентифицировать границы CDR, включают, например, определение Kabat, определение Chothia и определение AbM. Вообще говоря, определение Kabat основано на вариабельности последовательностей, определение Chothia основано на местоположении областей структурных петель, а определение AbM представляет собой компромисс между подходами Kabat и Chothia. См., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); и Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989). Публичные базы данных также доступны для идентификации последовательностей CDR в антителе.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с С5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (CDR) (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (LCVR), где HCVR содержит (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98;

(ii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 98;

(iii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 98;

или (iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, имеющую не больше 5 замен аминокислот;

и LCVR содержит (i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106;

(ii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью с SEQ ID NO: 106;

(iii) аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с SEQ ID NO: 106; или (iv) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, имеющую не больше 5 замен аминокислот.

Настоящее изобретение включает антитела против С5, имеющие модифицированный паттерн гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления можно использовать модификацию для того, чтобы удалять нежелательные участки гликозилирования, или антитело, не содержащее фрагмент фукозы, присутствующий на олигосахаридной цепи, например, для увеличения функции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002), JBC, 277:26733). В других применениях можно выполнять модификацию галактозилирования для того, чтобы модифицировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые ингибируют рН-зависимое связывание с С5. Например, настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают С5 с более высокой аффинностью при нейтральном рН, чем при кислом рН (т.е. сниженное связывание при кислом рН).

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые проявляют усовершенствованные фармакокинетические и фармакодинамические свойства, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые обладают увеличенным временем полужизни в сыворотке. В определенных вариантах осущест- 4 039858 вления антитела против С5 по настоящему изобретению имеют концентрацию в сыворотке больше чем мкг/мл до суток 40 у С5-гуманизированных мышей. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 по настоящему изобретению блокируют СР и АР гемолиз до суток 35 при введении С5гуманизированным мышам.

Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые конкурируют за специфическое связывание с С5 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1.

Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые перекрестно конкурируют за связывание с С5 с эталонным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1.

Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с тем же эпитопом, что и эталонное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR из HCVR и CDR из LCVR, где каждая HCVR и LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей HCVR и LCVR, перечисленных в табл. 1. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, что и эталонное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR из HCVR и CDR из LCVR, где пара аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR имеет SEQ ID NO: 98/106.

Настоящее изобретение также относится к антителам против С5 и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с одним или несколькими аминокислотными остатками, содержащимися в α цепь и/или β цепи С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с одной или несколькими аминокислотами в α цепи С5 и одной или несколькими аминокислотами в β цепи С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с одной или несколькими аминокислотами в α и β цепях С5, где антитела не связываются с доменом анафилатоксина С5а. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 человека (SEQ ID NO: 359). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 человека (SEQ ID NO: 359), где антитела не связываются с доменом анафилатоксина С5а из С5. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из (а) аминокислот с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359; (b) аминокислот с 593 до 599 из SEQ ID NO: 359; (с) аминокислот с 775 до 787 из SEQ ID NO: 359; (d) аминокислот с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359 и (е) аминокислот с 779 до 787 из SEQ ID NO: 359. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 359, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, по меньшей мере 10 аминокислотами или по меньшей мере 15 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 361. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 359, например, настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют по меньшей мере с 5 аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360 и 361. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 360 (соответствующей аминокислотам с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359) и с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 361 (соответствующей аминокислотам с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связываться специфически с С5 агонистическим образом, т.е. они могу усиливать или стимулировать связывание и/или активность С5; в других вариантах осуществления антитело может связываться специфически с С5 антагонистическим образом, т.е. оно может блокировать связывание и/или активность С5.

Настоящее изобретение также относится к выделенным антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют связывание С5 с С5-конвертазой. В некоторых вариантах осуществле- 5 039858 ния антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые блокируют связывание С5 с

С5-конвертазой, могут связываться с тем же эпитопом на С5, что и С5-конвертаза, или могут связываться с другим эпитопом на С5, нежели С5-конвертаза. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые блокируют связывание С5 с С5-конвертазой обезьяны.

В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению являются биспецифическими и имеют первую специфичность связывания с первым эпитопом белка С5 и вторую специфичность связывания со вторым эпитопом белка С5, где первый и второй эпитопы являются различными и не перекрывающимися.

В определенных вариантах осуществления антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связываются с С5а с IC₅₀ меньше чем 0,5 нМ. В определенных вариантах осуществления антитела содержат HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 290, 306, 322 и 338. В определенных вариантах осуществления антитела содержат LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 298, 314, 330 и 346.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые имеют одну или несколько следующих характеристик:

(а) представляет собой моноклональное антитело полностью человека;

(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(с) связывается с С5 человека с KD меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(d) связывается с С5 обезьяны с KD меньше чем 65 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(е) связывается с вариантом С5 человека R885H (SEQ ID NO: 356) с K_D меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(f) связывается с вариантом С5 человека R885C (SEQ ID NO: 357) с K_D меньше чем 0,5 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(g) блокирует опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиза больше чем на 95% и с IC₅₀ меньше чем 6 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;

(h) блокирует опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC₅₀ меньше чем 165 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;

(i) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки СР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 185 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;

(j) ингибирует опосредованный С5 африканской зеленой мартышки АР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 235 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза;

(k) ингибирует опосредованный С5 яванского макака СР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 145 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза;

(l) ингибирует опосредованный С5 яванского макака АР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 30 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное моноклональное антитело против С5 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые имеют одну или несколько следующих характеристик:

(а) содержит набор из шести CDR, содержащих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112;

(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (KD) меньше чем 0,2 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(d) связывается с вариантом С5 человека (R885H) с KD меньше чем 0,4 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(е) ингибирует опосредованный классическим путем (СР) гемолиз в сыворотке человека с IC₅₀меньше чем 3 нМ;

(f) ингибирует опосредованный альтернативным путем (АР) гемолиз в сыворотке человека с IC₅₀меньше чем 27 нМ;

(g) ингибирует СР-опосредованный гемолиз в сыворотке обезьяны с IC₅₀ меньше чем 21 нМ;

(g) ингибирует АР-опосредованный гемолиз в сыворотке обезьяны с IC50 меньше чем 10 нМ;

(h) имеет время полужизни в сыворотке (t_1/2) больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей;

(i) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;

- 6 039858 (j) блокирует СР-опосредованный гемолиз до суток 50 у С5-гуманизированных мышей;

(k) связывается с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в α цепи и/или β цепи SEQ ID NO: 359, где антитело не связывается с доменом анафилатоксина С5а из С5.

Во втором аспекте настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против С5 или их части. Например, настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые аминокислотные последовательности HCVR, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCVR, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR1, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR1, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR2, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR2, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности HCDR3, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCDR3, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR1, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR1, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR2, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR2, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим любые аминокислотные последовательности LCDR3, перечисленные в табл. 1; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCDR3, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим HCVR, где HCVR содержит набор из трех CDR (т.е. HCDR1-HCDR2-HCDR3), где набор аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3 представляет собой то, что определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим LCVR, где LCVR содержит набор из трех CDR (т.е. LCDR1-LCDR2-LCDR3), где набор аминокислотных последовательностей LCDR1-LCDR2-LCDR3 представляет собой то, что определено с помощью любых образцовых антител против С5, перечисленных в табл. 1.

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим как

- 7 039858

HCVR, так и LCVR, где HCVR содержит аминокислотную последовательность из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1, и где LCVR содержит аминокислотную последовательность из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1.

В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты HCVR, перечисленных в табл. 2, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними, и полинуклеотидную последовательность, выбранную из любых последовательностей нуклеиновой кислоты LCVR, перечисленных в табл. 1, или по существу схожей с ними последовательности, обладающей по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с ними. В определенных вариантах осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, где и HCVR и LCVR получены из одного и того же антитела против С5, перечисленного в табл. 1.

В связанном аспекте настоящее изобретение предусматривает рекомбинантные экспрессирующие векторы, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела против С5. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие любые молекулы нуклеиновой кислоты, указанные выше, т.е. молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любые последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, как изложено в табл. 2. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые введены такие векторы, а также способы получения антител или их частей посредством культивирования клеток-хозяев в условиях, допускающих получение антител или фрагментов антител и извлечение антител и фрагментов антител, полученных таким образом.

В третьем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного рекомбинантного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связывают С5, и фармацевтически приемлемый носитель. В связанном аспекте изобретение отличается композицией, которая представляет собой комбинацию антитела против С5 и второго терапевтического средства. В одном из вариантов осуществления второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, которое благоприятно объединяют с антителом против С5. Образцовые средства, которые могут быть полезно объединены с антителом против С5, включают, без ограничения, другие средства, которые связывают и/или ингибируют активность С5 (в том числе другие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты и т.д.), и/или средства, которые непосредственно не связывают С5, но, тем не менее, лечат или улучшают по меньшей мере один симптом или показание С5-ассоциированного заболевания или нарушения. Дополнительная комбинированная терапия и комбинированные составы с вовлечением антител против С5 по настоящему изобретению раскрыты в другом месте в настоящем описании.

В четвертом аспекте изобретение относится к терапевтическим способам для лечения заболевания или нарушения, связанного с С5, у субъекта с использованием антитела против С5 или антигенсвязывающей части антитела по изобретению, где терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом. Нарушение, которое лечат, представляет собой любое заболевание или состояние, которое усовершенствуют, улучшают, ингибируют или предотвращают посредством ингибирования активности С5. В определенных вариантах осуществления изобретение относится к способам предотвращения, лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела против С5 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы улучшения или снижения тяжести по меньшей мере одного симптома или показания пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH) у субъекта посредством введения антитела против С5 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить профилактически или терапевтически субъекту с наличием или риском наличия С5-ассоциированного заболевания или нарушения. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством субъекту, нуждающемуся в этом. Второе терапевтическое средство можно выбирать из группы, состоящей из противовоспалительного лекарственного средства (такого как кортикостероиды и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), другого антитела к белку С5, пищевой добавки, такой как антиоксиданты, и любого другого лекарственного средства или терапии, известных в данной области. В определенных вариантах осуществления второе терапевтическое средство может представлять собой средство, которое помогает противодействовать или снижать любой возможный побочный эффект(ы), связанный с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по изобретению, если такой побочный эффект(ы) должен проявиться. Антитело или его фрагмент можно вводить подкожно, внутривенно, внутрикожно, интраперитонеально, перорально или внутримышечно. Антитело или его фрагмент можно вводить в дозе приблизительно от 0,1 до приблизительно 100 мг/кг

- 8 039858 массы тела субъекта. В определенных вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению можно вводить в одной или нескольких дозах, составляющих между 50 и 600 мг.

Настоящее изобретение также относится к применению антитела против С5 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению при изготовлении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, для которого будет полезна блокада связывания и/или активности С5.

Другие варианты осуществления будут видны при просмотре следующего подробного описания.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено ингибирование уровней С5а антителом против С5 Н4Н12166Р в зависимости от дозы, как определяют посредством ELISA (описано в примере 9 в настоящем документе).

На фиг. 2 представлена общая концентрация в сыворотке в зависимости от времени после одной 15 мг/кг внутривенной инъекции Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2 самцам яванского макака (описано в примере 10 в настоящем документе). Профили концентрация-время наносили на график от первого после дозы до результата на пределе количественного определения (BLQ), если применимо, который рассчитывали как LLOQ/2. Каждая точка данных представляет среднее (±SD) (n=4 животных/группа); концентрации, которые, как предполагали, находились под влиянием ADA, исключали у одного животного в группе Н4Н12166Р и одного животного в группе Н4Н12161Р, начиная с суток 36 и суток 29 соответственно. LLOQ = нижний предел количественного определения.

На фиг. 3 представлен процент гемолиза в зависимости от времени ex vivo в красных клетках крови для анализов (А) классического пути и (В) альтернативного пути после одной внутривенной инъекции Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2 самцам яванского макака. % гемолиза, вычисляемый как соотношение экспериментального и максимального лизиса за вычетом % фонового лизиса из обоих значений, связан с количеством С5, ингибированного конкретным антителом против С5, присутствующим в сыворотке в данный момент времени. Каждая точка данных представляет среднее (±SD).

На фиг. 4 представлены профили общей концентрации в сыворотке в зависимости от времени для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5 (описано в примере 11 в настоящем документе). Гуманизированным С5 мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, объект сравнения 1 или объект сравнения 2. Каждая точка данных представляет среднее ± SEM (n=4-5 кажд.). Осуществляли мониторинг концентраций антител в сыворотках через 1, 10, 20, 30 и 40 суток после инъекции с использованием сэндвич ELISA.

На фиг. 5 представлен процент гемолиза в зависимости от времени ex vivo в анализе гемолиза по классическому пути комплемента для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5. Гуманизированным С5 мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 или объекта сравнения 2. Каждая точка данных представляет среднее ± SEM (n=4-5 кажд.). Осуществляли мониторинг процента гемолиза в сыворотке перед дозой, через 10, 20, 30, 40 и 50 суток после инъекции. % гемолиза, который вычисляли как соотношение экспериментального и максимального лизиса за вычетом % фонового лизиса из обоих значений, связан с количеством С5, ингибированного конкретным антителом против С5, присутствующим в сыворотке в данный момент времени.

На фиг. 6 представлены профили общей концентрации в сыворотке в зависимости от времени для выбранных антител против С5 у мышей, гуманизированных по С5 (описано в примере 11 в настоящем документе). Мышам вводили одну 15 мг/кг подкожную дозу Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 или изотипического контроля IgG4P. Каждая точка данных представляет среднее+SEM (n=5 кажд.). Осуществляли мониторинг уровней антител в сыворотках через 6 ч, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45 и 59 суток после инъекции с использованием сэндвич ELISA.

На фиг. 7 представлен график, показывающий оценки оптической когерентной томографии (ОСТ) у мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 M1M17628N по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 14 в настоящем документе). ****р<0,0001, двухфакторный дисперсионный анализ лечения антителом против С5 по 50 мг/кг в сравнении с отсутствием лечения или лечением изотипическим контролем.

На фиг. 8 представлено ингибирование гемолиза по классическому пути антителом против С5 M1M17628N в отсутствие С3 (А) и в присутствии 80 мкг/мл С3 человека (В) (описано в примере 14 в настоящем документе).

На фиг. 9 представлено число клеточных кластеров у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 человека Н4Н12170Р по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 15 в настоящем документе). n=8-12 глаз для каждой группы.

На фиг. 10 представлен график, показывающий оценки ОСТ у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем или антителом против С5 человека Н4Н12170Р по 10 или 50 мг/кг (описано в примере 15 в настоящем документе). n=8-12 глаз для каждой группы.

На фиг. 11 представлен график, показывающий оценки ОСТ у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем, антителом против С5 человека Н4Н12166Р по 3 или 10 мг/кг или объектом сравнения 2 по 10 мг/кг. n=6-12 глаз для каждой группы (описано в примере 15 в настоящем документе).

- 9 039858

На фиг. 12 представлено число клеточных кластеров у С5 гуманизированных мышей, которых лечили изотипическим контролем, антителом против С5 человека Н4Н12166Р по 3 или 10 мг/кг или объектом сравнения 2 по 10 мг/кг. n=6-12 глаз для каждой группы (описано в примере 15 в настоящем документе).

На фиг. 13 представлена кривая выживаемости мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем описании).

На фиг. 14 представлены уровни (А) альбумина в моче и (В) альбумина в моче, нормализованного по креатинину в моче, у мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем документе).

На фиг. 15 представлены уровни азота мочевины в крови у мышей NZBWF1, которых лечили изотипическим контролем или антителами против С5 M1M17628N или M1M17627N (описано в примере 17 в настоящем документе).

На фиг. 16 представлен график, показывающий ингибирование антитело-зависимой цитотоксичности для астроцитов посредством антител против С5 Н4Н12166Р, Н4Н12170Р, объекта сравнения 1 и объекта сравнения 2, как описано в примере 18.

Подробное описание

Перед описанием данных способов следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, по существу способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит только цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена в качестве ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.

Пока не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится это изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, можно использовать при практической реализации или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

Определения

Термин С5, также называемый компонентом 5 комплемента или фактор комплемента 5, относится к белку сыворотки из каскада комплемента. Белок С5 представляет собой белок из 1676 аминокислот, который содержит две цепи, α и β. Белок является точкой схождения трех путей активации комплемента: классического пути, альтернативного пути и пути маннозосвязывающего лектина. Аминокислотная последовательность полноразмерного белка С5 приведена в качестве примера в аминокислотной последовательности, предоставленной в GenBank под номером доступа NP_001726.2 (SEQ ID NO: 355). Термин С5 включает рекомбинантный белок С5 или его фрагмент. Термин также охватывает белок С5 или его фрагмент, сопряженный, например, с гистидиновой меткой, Fc мыши или человека или сигнальной последовательностью, такой как ROR1. Например, термин включает последовательности, примерами которых являются последовательности, представленные в SEQ ID NO: 356 или 357, которые содержат на С-конце гистидиновую метку, сопряженную с аминокислотными остатками 19-1676 полноразмерного белка С5. Термин также включает варианты белков, которые содержат гистидиновую метку на С-конце, сопряженную с аминокислотными остатками 19-1676 полноразмерного белка С5 с заменой R885H или заменой R885C.

Термин антитело, как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения молекул иммуноглобулинов, состоящих из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных дисульфидными связями (т.е. полные молекулы антител), а также их мультимеров (например, IgM) или их антигенсвязывающих фрагментов. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR или V_H) и константной области тяжелой цепи (состоит из доменов С_Н1, С_Н2 и С_Н3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (LCVR или V_L) и константной области легкой цепи (C_L). Области V_H и V_L дополнительно можно подразделять на области гипервариабельности, обозначаемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с областями, которые более консервативны и которые называют каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В определенных вариантах осуществления FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) могут быть идентичны последовательностям зародышевой линии человека или могут быть модифицированы естественным или искусственным путем.

Консенсусную аминокислотную последовательность можно определять на основе сравнительного анализа двух или больше CDR.

Также возможна замена одного или нескольких остатков CDR или пропуск одной или нескольких CDR. В научной литературе описаны антитела, в которых могут быть распределены одна или две CDR для связывания. Padlan et al. (1995, FASEB J. 9:133-139) анализировали области контакта между антите- 10 039858 лами и их антигенами на основе опубликованных кристаллических структур и заключали, что только приблизительно от одной пятой до одной третьей остатков CDR фактически контактируют с антигеном.

Padlan также обнаружил множество антител, в которых одна или две CDR не имеют аминокислот в контакте с антигеном (см. также Vajdos et al. 2002, J. Mol. Biol. 320:415-428).

Остатки CDR, не контактирующие с антигеном, можно идентифицировать на основе предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 в CDRH2 часто не требуются), в областях CDR по Kabat, лежащих вне CDR no Chothia, посредством молекулярного моделирования и/или эмпирически. Если CDR или ее остаток(остатки) пропускают, обычно ее заменяют на аминокислоту, занимающую соответствующее положение в другой последовательности антитела человека или консенсусе таких последовательностей. Положения для замены в CDR и аминокислоты для замен также можно выбирать эмпирически. Эмпирические замены могут представлять собой консервативные или неконсервативные замены.

Моноклональные антитела полностью человека против С5, раскрытые в настоящем описании, могут содержать одну или несколько замен, инсерций и/или делеций аминокислот каркасных и/или CDR областях вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии. Такие мутации легко определять посредством сравнения аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, в публичных базах данных о последовательностях антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые получают из любых аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании, в которых одну или несколько аминокислот в одной или нескольких каркасных и/или CDR областях мутируют в соответствующий остаток(остатки) последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело, или в соответствующий остаток(остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие замены в последовательности обозначают в настоящем описании в совокупности как генеративные мутации). Специалист в данной области, начиная с последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, раскрытых в настоящем описании, может легко получать множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат одну или несколько индивидуальных генеративных мутаций или их сочетания. В определенных вариантах осуществления все остатки каркаса и/или CDR в доменах V_H и/или V_Lмутируют обратно в остатки, встречающиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой антитело получено. В других вариантах осуществления только определенные остатки мутируют обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, встречающиеся в пределах первых 8 аминокислот в FR1 или в пределах последних 8 аминокислот в FR4, или только мутированные остатки, встречающиеся в пределах CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или несколько остатков каркаса и/или CDR мутируют в соответствующие остатки другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой антитело исходно получено). Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или больше генеративных мутаций в каркасных и/или CDR областях, например, где определенные индивидуальные остатки мутируют в соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, тогда как определенные другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохраняют или мутируют в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. Когда получены антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат одну или несколько генеративных мутаций, можно легко тестировать на одно или несколько желаемых свойств, таких как усовершенствованная специфичность связывания, увеличенная аффинность связывания, усовершенствованные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в зависимости от случая), сниженная иммуногенность и т.д.

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, получаемые таким общим путем, включены в настоящее изобретение.

Настоящее изобретение также относится к моноклональным антителам полностью человека против С5, содержащим варианты любых аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем описании, которые имеют одну или несколько консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR, например, с 10 или меньше, 8 или меньше, 6 или меньше, 4 или меньше и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем описании.

Термин антитело человека, как используют в настоящем описании, предназначен включать антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов человека эмбрионального типа. mAb человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человека эмбрионального типа (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или с помощью соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин антитело человека, как используют в настоящем описании, не предназначен включать mAb, в которых последователь- 11 039858 ности CDR, полученные из зародышевой линии млекопитающих других биологических видов (например, мыши), пересажены в последовательности FR человека. Термин включает антитела, рекомбинантно полученные у не относящегося к человеку млекопитающего или в клетках не относящегося к человеку млекопитающего. Термин не предназначен включать антитела, выделенные у человеческого субъекта или созданные в нем.

Термин рекомбинантный, как используют в настоящем описании, относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам по изобретению, которые создают, экспрессируют, выделяют или получают посредством технологий или известные в данной области способов, как технология рекомбинантных ДНК, которая включает, например, сплайсинг ДНК и трансгенную экспрессию. Термин относится к антителам, экспрессируемым у не относящегося к человеку млекопитающего (в том числе трансгенные не относящиеся к человеку млекопитающие, например трансгенные мыши) или в клеточной экспрессирующей системе (например, клетках СНО) или выделенным из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека.

Термин специфически связывает или специфически связывается с или тому подобное обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который относительно стабилен при физиологических условиях. Специфическое связывание можно охарактеризовать равновесной константой диссоциации по меньшей мере приблизительно 1х10^-8 М или меньше (например, более низкая K_D обозначает более прочное связывание). Способы определения того, специфически ли связываются две молекулы, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и т.п. Как раскрыто в настоящем описании, с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, идентифицированы антитела, которые связываются специфически с С5. Кроме того, полиспецифические антитела, которые связываются с одним доменом в С5 и одним или несколькими дополнительными антигенами, или биспецифические, которые связываются с двумя различными областями в С5, тем не менее, представляют собой рассматриваемые антитела, которые специфически связываются, как используют в настоящем описании.

Термин высокоаффинное антитело относится к тем mAb, которые обладают аффинностью связывания с С5, выражаемой в виде KD, по меньшей мере 10^-8 М; предпочтительно 10^-9 М; более предпочтительно 10^-10 М, даже более предпочтительно 10^-11 М, даже более предпочтительно 10^-12 М, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™ или ELISA аффинности в растворе.

Под термином низкая скорость диссоциации, K_off или kd понимают, что антитело диссоциирует с С5 с константой скорости 1х10^-3 с^-1 или меньше, предпочтительно 1х10’⁴ с^-1 или меньше, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.

Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п., как используют в настоящем описании, включают любые встречаемые в природе, получаемые ферментативно, синтетические или генетически сконструированные полипептиды или гликопротеины, которые специфически связывают антиген для того, чтобы формировать комплекс. Термины антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела, как используют в настоящем описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность связываться с белком С5.

В конкретных вариантах осуществления, антитело или фрагменты антител по изобретению можно конъюгировать с фрагментом, таким как лиганд или терапевтический фрагмент (иммуноконъюгат), второе антитело против С5 или любой другой терапевтический фрагмент, который можно использовать для лечения С5-ассоциированного заболевания или нарушения.

Выделенное антитело, как используют в настоящем описании, предназначено для обозначения антитела, которое по существу не содержит другие антитела (Ab), обладающие другими антигенными специфичностями (например, выделенное антитело, которое специфически связывает С5, или его фрагмент по существу не содержит Ab, которые специфически связывают антигены, отличные от С5.

Блокирующее антитело или нейтрализующее антитело, как используют в настоящем описании (или антитело, которое нейтрализует активность С5, или антагонистическое антитело), предназначено для обозначения антитела, у которого связывание с С5 ведет к ингибированию по меньшей мере одной биологической активности С5. Например, антитело по изобретению может предотвращать или блокировать комплемент-опосредованный гемолиз по классическому пути или альтернативному пути.

Термин поверхностный плазмонный резонанс, как используют в настоящем описании, относится к оптическому феномену, который делает возможным анализ биомолекулярных взаимодействий в реальном времени посредством обнаружения изменений в концентрациях белков на матрице биосенсора, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor АВ, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.).

Термин K_D, как используют в настоящем описании, предназначен для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с конкретным антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Один

- 12 039858 антиген может иметь больше чем один эпитоп. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными участками на антигене и могут иметь различные биологические эффекты. Термин эпитоп также относится к месту на антигене, на который отвечают В- и/или Т-клетки. Также он относится к области антигена, которую связывает антитело. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы в целом представляют собой подмножество структурных эпитопов и имеют те остатки, которые осуществляют непосредственный вклад в аффинность взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь конкретные характеристики трехмерной структурны и/или конкретные зарядовые характеристики.

Термин перекрестно конкурирует, как используют в настоящем описании, обозначает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном и ингибирует или блокирует связывание другого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Термин также включает конкуренцию между двумя антителами в обеих ориентациях, т.е. первое антитело, которое связывает и блокирует связывание второго антитела, и наоборот. В определенных вариантах осуществления первое антитело и второе антитело могут связываться с одним и тем же эпитопом. Альтернативно, первое и второе антитела могут связываться с различными, но перекрывающимися эпитопами так, что связывание одного ингибирует или блокирует связывание второго антитела, например, через стерическое затруднение. Перекрестную конкуренцию между антителами можно измерять известными в данной области способами, например посредством анализа интерферометрии биослоев без меток в реальном времени. Перекрестная конкуренция между двумя антителами может выражаться в связывании второго антитела, которое меньше, чем фоновый сигнал, из-за связывания с самим собой (где первое и второе антитела представляют собой одно и то же антитело). Перекрестную конкуренцию между двумя антителами можно выражать, например, в виде % связывания второго антитела, который меньше базового уровня фонового связывания с самим собой (где первое и второе антитела представляют собой одно и то же антитело).

Термин существенная идентичность или по существу идентичный в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента, указывает на то, что при оптимальном выравнивании с подходящими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной нитью) имеет место идентичность нуклеотидных последовательностей по меньшей мере приблизительно в 90% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, как измеряют с помощью любого общеизвестного алгоритма для идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, как рассмотрено далее. Молекула нуклеиновой кислоты, обладающая существенной идентичностью с эталонной молекулой нуклеиновой кислоты, может в определенных случаях кодировать полипептид, которые имеет такую же или по существу схожую аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый эталонной молекулой нуклеиновой кислоты.

В применении к полипептидам термин существенное сходство или по существу схожий обозначает, что две пептидные последовательности, когда выровнены оптимально, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием весов пропусков по умолчанию, обладают по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей, даже более предпочтительно по меньшей мере 95, 98 или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, различаются консервативными аминокислотными заменами.

Консервативная аминокислотная замена представляет собой ту, в которой аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток, имеющий боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена по существу не меняет функциональные свойства белка. В случаях, когда две или больше аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент или степень сходства можно корректировать в большую сторону для того, чтобы вносить поправки на консервативную природу замены. Средства внесения таких поправок хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-331, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают:

1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин;

2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин;

3) амид-содержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин;

4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан;

5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин;

6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат и

7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин.

Предпочтительные группы консервативных аминокислотных замен представляют собой валинлейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин- 13 039858 глутамин. Альтернативно, консервативная замена представляет собой любое изменение, которое имеет положительное значение в логарифмической вероятностной матрице РАМ250, раскрытой в Gonnet et al.

(1992), Science 256:1443 45, включенной в настоящее описание посредством ссылки. Умеренно консервативная замена представляет собой любую замену, которая имеет неотрицательное значение в логарифмической вероятностной матрице РАМ250.

Сходство последовательностей для полипептидов обычно измеряют с использованием программного обеспечения анализа последовательностей. Программное обеспечение анализа белков сопоставляет схожие последовательности с использованием мер сходства, присваиваемых различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как GAP и BESTFIT, которые можно использовать с параметрами по умолчанию для того, чтобы определять гомологию последовательностей или идентичность последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды, от различных видов организмов или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с использованием FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами; программа в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) предоставляет выравнивания и процент идентичности последовательностей областей с наилучшим перекрытием между запрашиваемыми и искомыми последовательностями (Pearson (2000), выше). Другой предпочтительный алгоритм для сравнения последовательности по изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей от различных организмов, реализован в компьютерной программе BLAST, в частности BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 и (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки.

Под фразой терапевтически эффективное количество понимают количество, которое вызывает желаемый эффект, ради которого его вводят. Точное количество зависит от цели лечения, и его определит специалист в данной области с использованием известных способов (см., например, Lloyd (1999), The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).

Как используют в настоящем описании, термин субъект относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно к человеку, нуждающемуся в улучшении, предотвращении и/или лечении С5-ассоциированного заболевания или нарушения, такого как атипичный гемолитикоуремический синдром (aHUS) или пароксизмальная ночная гемоглобинурия (PNH). Термин включает человеческие субъекты, которые обладают таким заболеванием или нарушением или имеют риск его наличия.

Как используют в настоящем описании, термины лечить, лечащий или лечение относятся к снижению или улучшению тяжести по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения благодаря введению терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению, нуждающемуся в этом субъекту. Термины включают ингибирование прогрессирования заболевания или ухудшения симптома/показания. Термины также включают положительный прогноз заболевания, т.е. субъекта можно освобождать от заболевания или он может иметь уменьшенное заболевание при введении терапевтического средства, такого как антитело по настоящему изобретению. Терапевтическое средство можно вводить субъекту в терапевтической дозе.

Термины предотвращать, предотвращающий или предотвращение относятся к ингибированию манифестации С5-ассоциированного заболевания или нарушения или любых симптомов или показаний такого заболевания или нарушения при введении антитела по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающие фрагменты антител.

Если конкретно не указано иное, термин антитело, как используют в настоящем описании, следует понимать как охватывающий молекулы антител, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулинов и две легкие цепи иммуноглобулинов (т.е. полные молекулы антител), а также их антигенсвязывающие фрагменты. Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п., как используют в настоящем описании, включают любой встречаемый в природе, получаемый ферментативно, синтетический или генетически сконструированный полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген, чтобы формировать комплекс. Термины антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела, как используют в настоящем описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с белком С5. Фрагмент антитела содержат фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fv, фрагмент dAb, фрагмент, содержащий CDR, или выделенную CDR. В определенных вариантах осуществления термин антигенсвязывающий фрагмент относится к полипептидному фрагменту полиспецифической антигенсвязывающей молекулы.

Антигенсвязывающие фрагменты антитела можно извлекать, например, из полных молекул антител с использованием любых подходящих стандартных способов, таких как протеолитическое расщепление или рекомбинантные способы генетической инженерии с использованием манипуляций и экспрессии ДНК, которая кодирует вариабельные и (необязательно) константные домены антитела. Такая ДНК из- 14 039858 вестна и/или легко доступна, например, в коммерческих источниках, библиотеках ДНК (включая, например, фаговые библиотеки антител) или ее можно синтезировать. ДНК можно секвенировать и манипулировать ею химически или с использованием способов молекулярной биологии, например, чтобы располагать один или несколько вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или вводить кодоны, создавать остатки цистеина, модифицировать, добавлять или удалять аминокислоты и т.д.

Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают:

(i) фрагменты Fab;

(ii) фрагменты F(ab')2;

(iii) фрагменты Fd;

(iv) фрагменты Fv;

(v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv);

(vi) фрагменты dAb и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), такую как пептид CDR3) или ограниченный пептид FR3-CDR3-FR4.

Другие сконструированные молекулы, такие как домен-специфические антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленными доменами, химерные антитела, антитела с пересаженными CDR, диатела, триатела, тетратела, мини-антитела, нанотела (например, одновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), небольшие модульные иммунофармацевтические средства (SMIP) и вариабельные домены акулы IgNAR, также охвачены выражением антигенсвязывающий фрагмент, как используют в настоящем описании.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может быть любого размера или аминокислотного состава и в целом содержит по меньшей мере одну CDR, которая находится смежно с или в рамке с одной или несколькими каркасными последовательностями. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен VH, связанный с доменом VL, домены VH и VL можно располагать друг относительно друга в любом подходящем расположении. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры V_H-V_H, V_H-V_L или V_L-V_L. Альтернативно, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.

В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный по меньшей мере с одним константным доменом. Неограничивающие образцовые конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно найти в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают:

(i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv)

V_H-C_H1-C_H2; (v) V_h-Ch1-C_h2-C_h3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii)

V_L-C_H1; (ix) V_l-C_h2; (x) V_l-C_h3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; и (xiv) V_L-C_L.

В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любых образцовых конфигурациях, перечисленных выше, вариабельные и константные домены можно или непосредственно связывать друг с другом, или связывать с помощью полной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или больше) аминокислот, что ведет к гибкой или полугибкой связи между смежными вариабельными и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела по настоящему изобретению может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) из любых конфигураций вариабельных и константных доменов, перечисленных выше, в нековалентной связи друг с другом и/или с одним или несколькими мономерными доменами V_H или V_L (например, с помощью дисульфидной связи(ей)).

Как и в случае полных молекул антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или полиспецифическими (например, биспецифическими).

Полиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела обычно содержит по меньшей мере два различных вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с отличающимся эпитопом на одном и том же антигене. Полиспецифическое антитело в любом формате, в том числе образцовые биспецифические форматы антител, раскрытые в настоящем описании, можно адаптировать для использования в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела по настоящему изобретению с использованием стандартных способов, доступных в данной области.

Получение антител человека.

Способы создания антител человека у трансгенных мышей известны в данной области. Любые такие известные способы можно использовать в контексте настоящего изобретения для того, чтобы полу

- 15 039858 чать антитела человека, которые специфически связываются с белком С5.

Иммуноген, содержащий любое одно из следующего, можно использовать для того, чтобы создавать антитела к белку С5. В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению получают от мышей, иммунизированных полноразмерным нативным белком С5 (см., например, номер доступа Genbank NP_001726.2) (SEQ ID NO: 355) или ДНК, кодирующей белок или его фрагмент. Альтернативно, белок или его фрагмент можно получать с использованием стандартных биохимических способов и модифицировать и использовать в качестве иммуногена. В определенных вариантах осуществления иммуноген представляет собой фрагмент белка С5, который находится в пределах аминокислотных остатков 19-1676 в SEQ ID NO: 355.

В некоторых вариантах осуществления иммуноген может представлять собой рекомбинантный белок С5 или его фрагмент, который экспрессируют в Е. coli или любых других эукариотических клетках или клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка (СНО).

Используя технологию VELOCIMMUNE® (см., например, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любой другой известный способ создания моноклональных антител, изначально выделяют высокоаффинные химерные антитела к С5, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Технология VELOCIMMUNE® включает создание трансгенной мыши, имеющей геном, который содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константных областей мыши так, что мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные области тяжелых и легких цепей человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способно экспрессировать антитело полностью человека.

В целом, мышь VELOCIMMUNE® стимулируют антигеном, представляющим интерес, и у мышей получают лимфатические клетки (такие как В-клетки), которые экспрессируют антитела. Лимфатические клетки можно сливать с линией миеломных клеток для того, чтобы получать бессмертные гибридомные клеточные линии, и осуществляют скрининг и отбор таких гибридомных клеточных линий для того, чтобы идентифицировать гибридомные клеточные линии, которые продуцируют антитела со специфичностью к антигену, представляющему интерес. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, можно выделять и связывать с желаемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой белок антитела можно получать в клетке, такой как клетка СНО. Альтернативно, ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела или вариабельные домены легких и тяжелых цепей, можно выделять непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов.

Изначально выделяют высокоаффинные химерные антитела, имеющие вариабельную область человека и константную область мыши. Как в экспериментальном разделе далее, определят характеристики антител и отбирают их по желательным характеристикам, в том числе аффинности, избирательности, эпитопу и т.д. Константные области мыши заменяют на желаемую константную область человека для того, чтобы создавать антитело полностью человека по изобретению, например, дикого типа или модифицированное IgG1 или IgG4. Хотя выбранная константная область может варьировать в соответствии с конкретным использованием, характеристики высокоаффинного связывания антигенов и специфичности к мишени присутствуют в вариабельной области.

Биоэквиваленты.

Антитела против С5 и фрагменты антител по настоящему изобретению охватывают белки, имеющие аминокислотные последовательности, которые варьируют относительно таковых у описанных антител, но сохраняют способность к связыванию белка С5. Такие вариантные антитела и фрагменты антител содержат одно или несколько добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с родительской последовательностью, чтобы проявлять биологическую активность, которая по существу эквивалента таковой у описанных антител. Аналогичным образом, последовательности ДНК, кодирующее антитела, по настоящему изобретению охватывают последовательности, которые содержат одно или несколько добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антитело или фрагмент антитела, которые по существу являются биоэквивалентами антитела или фрагмента антитела по изобретению.

Два антигенсвязывающих белка или антитела считают биоэквивалентами, если, например, они являются фармацевтическими эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, у которых скорость и степень абсорбции не демонстрируют значимых различий при схожих экспериментальных условиях при введении в одинаковой молярной дозе, или однократной дозе или нескольких дозах. Некоторые антитела следует считать эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и еще можно считать биоэквивалентом, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отражены на этикетке, не являются важными для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при хроническом применении и считаются медицински несущественными для конкретного исследуемого лекарственного продукта.

- 16 039858

В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентами, если нет клинически значимых различий в их безопасности, чистоте или активности.

В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентами, если пациента можно переключать один или несколько раз между эталонным продуктом и биологическим продуктом без ожидаемого увеличения риска нежелательных эффектов, в том числе клинически значимого изменения иммуногенности или сниженной эффективности, по сравнению с продолжением терапии без такого переключения.

В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка представляют собой биоэквиваленты, если оба они действуют по общему механизму или механизмам действия для условия или условий применения, до такой степени, в которой такие механизмы известны.

Биоэквивалентность можно демонстрировать способами in vivo и/или in vitro. Меры биоэквивалентности включают, например:

(а) тест in vivo у человека или других млекопитающих, в котором концентрацию антитела или его метаболитов измеряют в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости в качестве функции времени;

(b) тест in vitro, который обладает корреляцией с данными о биодоступности у человека in vivo и обоснованной предсказательной способностью в их отношении;

(с) тест in vivo у человека или других млекопитающих, в котором подходящий острый фармакологический эффект антитела (или его мишени) измеряют в качестве функции времени; и (d) строго контролируемое клиническое исследование, в котором устанавливают безопасность, эффект или биодоступность или биоэквивалентность антитела.

Биоэквивалентные варианты антител по изобретению можно конструировать, например создавая различные замены остатков или последовательностей или удаляя концевые или внутренние остатки или последовательности, не необходимые для биологической активности. Например, остатки цистеина, которые не важны для биологической активности, можно удалять или заменять на другие аминокислоты для того, чтобы предотвращать формирование не необходимых или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать варианты антител, которые содержат изменения аминокислот, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например мутации, которые элиминируют или устраняют гликозилирование.

Антитела против С5, содержащие варианты Fc.

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитела против С5, которые содержат домен Fc, содержащий одну или несколько мутаций, которые усиливают или уменьшают связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, содержащие мутацию в области С_Н2 или С_Н3 домена Fc, где мутация(и) увеличивает аффинность домена Fc к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН находится в диапазоне приблизительно от 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут вести к увеличению времени полужизни антитела в сыворотке при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например:

модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, А, W, H, F или Y [N434A, N434W, N434H, N434F или N434Y]); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434.

В одном из вариантов осуществления модификация содержит модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S);

модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F);

модификацию 433K (например, Н433К) и 434 (например, 434Y);

модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т, и 256Е);

модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L) и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).

В еще одном другом варианте осуществления модификация содержит модификацию 265А (например, D265A) и/или 297А (например, N297A).

Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, содержащие домен Fc, содержащий одну или несколько пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из:

250Q и 248L (например, T250Q и M248L);

252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е);

428L и 434S (например, M428L и N434S);

257I и 311I (например, P257I и Q311I);

2571 и 434Н (например, P257I и N434H);

376V и 434Н (например, D376V и N434H);

- 17 039858

307А, 380А и 434А (например, Т307А, Е380А и N434A) и

433K и 434F (например, Н433К и N434F).

Все возможные комбинации мутаций вышеуказанного домена Fc и других мутаций в вариабельных доменах антител, раскрытые в настоящем описании, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к антителам против С5, содержащим химерную константную область (С_н) тяжелой цепи, где химерная область С_н содержит сегменты, полученные из областей С_нбольше чем одного изотипа иммуноглобулинов. Например, антитела по изобретению могут содержать химерную область С_н, содержащую частичный или полный домен С_Н2, полученный из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с частичным или полным доменом С_Н3, полученным из молекулы IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенными вариантами осуществления антитела по изобретению содержат химерную область Сн, имеющую химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать аминокислотную последовательность верхнего шарнира (аминокислотные остатки из положений с 216 до 227 в соответствии с нумерацией EU), полученную из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека, в комбинации с последовательностью нижнего шарнира (аминокислотные остатки из положений с 228 до 236 в соответствии с нумерацией EU), полученной из шарнирной области IgG1 человека, IgG2 человека или IgG4 человека. В соответствии с определенными вариантами осуществления химерная шарнирная область содержит аминокислотные остатки, полученные из верхнего шарнира IgG1 человека или IgG4 человека, и аминокислотные остатки, полученные из нижнего шарнира IgG2 человека. Антитело, содержащее химерную область С_н, как раскрыто в настоящем описании, в определенных вариантах осуществления может проявлять модифицированные эффекторные функции Fc, не оказывая нежелательного влияния на терапевтические или фармакокинетические свойства антитела. (См., например, публикацию патентной заявки США 2014/0243504, раскрытие которой, таким образом, включено посредством ссылки в полном объеме).

Биологические характеристики антител.

В целом, антитела по настоящему изобретению функционируют посредством связывания с белком С5 и предотвращения его расщепления на С5а и С5Ь. Например, настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают белок С5 (например, при 25 или при 37°С) с KD меньше чем 9 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают С5 с K_Dприблизительно меньше чем 9 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 2 нМ, приблизительно меньше чем 1 нМ, приблизительно меньше чем 500 пМ, меньше чем 250 пМ или меньше чем 100 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают белок С5 человека с диссоциационным временем полужизни (t_1/2) больше чем приблизительно 2 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 25°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 4 в настоящем описании, или по существу схожего анализа. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связывают белок С5 с t_1/2 больше чем приблизительно 5 мин, больше чем приблизительно 10 мин, больше чем приблизительно 30 мин, больше чем приблизительно 50 мин, больше чем приблизительно 100 мин, больше чем приблизительно 150 мин, больше чем приблизительно 200 мин или больше чем приблизительно 250 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 25°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании (например, формат с захватом mAb или с захватом антигена), или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые связывают белок С5 человека с диссоциационным временем полужизни (t_1/2) больше чем приблизительно 1,5 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 37°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 4 в настоящем описании, или по существу схожего анализа. В определенных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению связывают белок С5 с t_1/2 больше чем приблизительно 2 мин, больше чем приблизительно 5 мин, больше чем приблизительно 10 мин, больше чем приблизительно 25 мин, больше чем приблизительно 50 мин, больше чем приблизительно 100 мин, больше чем приблизительно 150 мин или больше чем приблизительно 200 мин, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса при 37°С, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании (например, формат с захватом mAb или с захватом антигена), или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител,

- 18 039858 которые связывают белок С5 обезьяны (например, при 25°С или при 37°С) с K_D меньше чем 120 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают С5 обезьяны с K_D приблизительно меньше чем 120 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 25 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 1 нМ, приблизительно меньше чем 500 пМ или меньше чем 250 пМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связывают модифицированный белок С5 человека с заменой R885H (примером служит SEQ ID NO: 356) с K_D меньше чем 70 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. Варианты С5 показали слабый ответ на антитела против С5, ранее раскрытые в данной области (например, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают модифицированный С5 человека с K_D приблизительно меньше чем 65 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 3 нМ или меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые связывают модифицированный белок С5 человека с заменой R885C (примером служит SEQ ID NO: 357) с KD меньше чем 160 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании. Варианты С5 показали слабый ответ на антитела против С5, ранее раскрытые в данной области (например, Nishimura et al. 2014, New Engl. J. Med. 370:632-639). В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты связывают модифицированный С5 человека с K_D приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ или меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 3 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам антител, которые ингибируют комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) с IC₅₀ меньше чем 10 нМ, как измеряют посредством анализа люминесценции, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 6 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты ингибируют CDC с IC₅₀ приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 3,5 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа люминесценции В-клеток, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 6 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 человека классический путь (СР) гемолиз больше чем на 94% и с IC₅₀меньше чем 6 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC₅₀ приблизительно меньше чем 6 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ, приблизительно меньше чем 4 нМ, приблизительно меньше чем 3 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 человека альтернативный путь (АР) гемолиза больше чем на 70% и с IC₅₀меньше чем 165 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC₅₀ приблизительно меньше чем 160 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ или приблизительно меньше чем 20 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 африканской зеленой мартышки классический путь (СР) гемолиза больше чем на 40% и с IC₅₀ меньше чем 185 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с

- 19 039858 использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC₅₀приблизительно меньше чем 180 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 75 нМ или приблизительно меньше чем 50 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 африканской зеленой мартышки альтернативный путь (АР) гемолиза с IC₅₀ меньше чем 235 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC₅₀ приблизительно меньше чем 200 нМ, приблизительно меньше чем 150 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 50 нМ или приблизительно меньше чем 20 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют больше чем 90% опосредованного С5 яванского макака классического пути (СР) гемолиза с IC₅₀ меньше чем 145 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют СР гемолиз с IC₅₀ приблизительно меньше чем 140 нМ, приблизительно меньше чем 120 нМ, приблизительно меньше чем 100 нМ, приблизительно меньше чем 75 нМ или приблизительно меньше чем 50 нМ, как измеряют посредством анализа СР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые блокируют опосредованный С5 яванского макака альтернативный путь (АР) гемолиза с IC₅₀ меньше чем 30 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты блокируют АР гемолиз с IC₅₀ приблизительно меньше чем 25 нМ, приблизительно меньше чем 20 нМ, приблизительно меньше чем 10 нМ, приблизительно меньше чем 5 нМ или приблизительно меньше чем 2 нМ, как измеряют посредством анализа АР гемолиза, например, с использованием формата анализа, как определено в примере 8 в настоящем описании, или по существу схожего анализа.

Настоящее изобретение также относится к антителам и антигенсвязывающим фрагментам, которые демонстрируют усовершенствованные фармакокинетические (PK) и фармакодинамические (PD) свойства по сравнению с антителами против С5 в данной области. Антитела против С5 по настоящему изобретению демонстрируют меньшую подверженность опосредованному мишенью клиренсу при введении, как показано в примерах 9 и 10 в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые демонстрируют концентрации в сыворотке в течение продолжительных периодов, например больше чем 20 суток, больше чем 25 суток, больше чем 30 суток, больше чем 35 суток, больше чем 40 суток, больше чем 45 суток, больше чем 50 суток, больше чем 55 суток или больше чем 60 суток, как описано в примерах 9 и 10 в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления антитела против С5 по настоящему изобретению демонстрируют увеличенное время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток по сравнению с антителами против С5 в данной области.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают высокой аффинностью к С5 человека (например, KD меньше чем 0,3 нМ) и более низким клиренсом (например, увеличенное время полужизни в сыворотке, усовершенствованная фармакодинамическая активность в течение большего числа суток, чем ранее известные антитела против С5). Такие антитела по настоящему изобретению можно полезно применять при менее частом дозировании у субъекта с С5-ассоциированным заболеванием или нарушением.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком С5, где антитело или его фрагмент проявляют одну или несколько следующих характеристик:

(d) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 70 при введении яванскому

- 20 039858 макаку;

(е) блокирует СР и АР гемолиз до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;

(f) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у яванского макака;

(g) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;

(h) блокирует СР гемолиз до суток 30 при введении С5-гуманизированным мышам, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo; и (i) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выделенное рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком С5, где антитело или его фрагмент демонстрируют одну или несколько следующих характеристик:

(b) связывается с С5 человека с константой диссоциации (K_D) меньше чем 0,9 нМ при 25°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(с) связывается с С5 человека с K_D меньше чем 0,3 нМ при 37°С, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(d) связывается с С5 обезьяны с K_D меньше чем 65 нМ, как измеряют в анализе поверхностного плазмонного резонанса;

(k) ингибирует опосредованный С5 яванского макака СР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 145 нМ, как измеряют в анализе СР гемолиза; и (l) ингибирует опосредованный С5 яванского макака АР гемолиз с IC₅₀ меньше чем 30 нМ, как измеряют анализе АР гемолиза.

Антитела по настоящему изобретению могут обладать одной или несколькими из указанных выше биологических характеристик или любыми их сочетаниями. Другие биологические характеристики антител по настоящему изобретению будут видны специалисту в данной области при просмотре настоящего раскрытия, включая рабочие примеры в настоящем описании.

Картирование эпитопов и связанные технологии.

Настоящее изобретение включает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, встречающимися в одной или нескольких областях молекулы белка С5, включая а полипептид и β полипептид. Эпитоп, с которым связываются антитела, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или больше (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше) аминокислот, расположенных в любом из указанных выше доменов молекулы белка С5 (например, линейный эпитоп в домене). Альтернативно, эпитоп может состоять из множества не непрерывных аминокислот (или аминокислотных последовательностей), которые расположены в любом или обоих указанных выше доменах молекулы белка (например, конформационный эпитоп).

Различные способы, известные специалистам в данной области, можно использовать для того, чтобы определять, взаимодействует ли антитело с одной или несколькими аминокислотами в полипептиде или белке. Образцовые способы включают, например, стандартные перекрестные конкурентные анализы, такие как те, что описаны в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Другие способы включают анализ сканирующего аланином мутагенеза, анализ пептидного блоттинга (Reineke (2004), Methods Mol. Biol. 248:443-63), кристаллографические исследования при пептидном анализе расщепления и ЯМР анализ. Кроме того, можно использовать такие способы, как вырезание эпитопов, извлечение эпитопов и химическая модификация антигенов (Tomer (2000), Prot. Sci. 9:487496). Другой способ, который можно использовать для того, чтобы идентифицировать аминокислоты в полипептиде, с которыми антитело взаимодействует, представляет собой водород-дейтериевый обмен, обнаруживаемый посредством масс-спектрометрии. Вообще говоря, водород-дейтериевый обмен способ включает мечение белка, представляющего интерес, дейтерием, после чего следует связывание антитела

- 21 039858 с меченным дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, и подлежащие обмену протоны в аминокислотах, которые защищены антительным комплексом, подвергаются обратному обмену дейтерия на водород с более низкой скоростью, чем подлежащие обмену протоны в аминокислотах, которые не являются частью области контакта. Как результат, аминокислоты, которые образуют часть области контакта белка/антитела, могут сохранять дейтерий и, следовательно, демонстрировать относительно более высокую массу по сравнению с аминокислотами, не включенными в область контакта. После диссоциации антитела целевой белок подвергают протеазному расщеплению и массспектрометрическому анализу, тем самым выявляя меченные дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми антитело взаимодействует. См., например, Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267:252-259; Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.

Термин эпитоп относится к месту на антигене, на которое отвечают В- и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы можно формировать из непрерывных аминокислот или не непрерывных аминокислот, которые сближены за счет третичной укладки белка. Эпитопы, формируемые из непрерывных аминокислот, обычно сохраняются под воздействием денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образуемые посредством третичной укладки, обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3 и более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

Профилирование с помощью модификаций (MAP), также известное как профилирование антител на основе структуры антигена (ASAP), представляет собой способ классификации большого числа моноклональных антител (mAb), обнаруживаемых для одного и того же антигена, в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с поверхностями химически или ферментативно модифицированных антигенов (см. US 2004/0101920, в настоящем описании конкретно включенную посредством ссылки в полном объеме). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, который или отчетливо отличается от эпитопа, представляемого другой категорией, или частично перекрывается с ним. Эта технология делает возможной быструю фильтрацию генетически идентичных антител так, что определение характеристик можно сосредоточить на генетически различных антителах. Когда применят к скринингу гибридом, MAP может облегчать идентификацию редких клонов гибридом, которые продуцируют mAb, обладающие желаемыми характеристиками. MAP можно использовать для сортировки антител по изобретению по группам антител, связывающих различные эпитопы.

В определенных вариантах осуществления антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты связывают эпитоп в любой одной или нескольких из областей, примеры которых приведены в белке С5, или в естественной форме, как показано на примере в SEQ ID NO: 355, или рекомбинантно полученной, или с его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению связываются с областью, содержащей одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков 19-1676 белка С5 человека.

В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению, взаимодействуют с по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных остатков в диапазоне от приблизительно положения 19 приблизительно до положения 750; или аминокислотных остатков в диапазоне от приблизительно положения 751 приблизительно до положения 1676 в SEQ ID NO: 355.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение включает антитела против С5 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые взаимодействуют с одним или несколькими эпитопами, встречающимися в α и/или β цепи С5 (SEQ ID NO: 359). Эпитоп(ы) может состоять из одной или нескольких непрерывных последовательностей из 3 или больше (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше) аминокислот, расположенных в α цепи и/или β цепи С5. Альтернативно, эпитоп может состоять из множества не непрерывных аминокислот (или аминокислотных последовательностей), расположенных в С5. Как показано в примере 11 в настоящем описании, эпитоп С5, с которым взаимодействует образцовое антитело по изобретению Н4Н12166Р, определяют с помощью:

(i) аминокислотной последовательности NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), которая соответствует аминокислотам с 591 до 599, содержащимся в β цепи SEQ ID NO: 359; и (ii) аминокислотной последовательности WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), которая соответствует аминокислотам с 775 до 794, содержащимся в а цепи SEQ ID NO: 359.

Соответственно, настоящее изобретение включает антитела против С5, которые взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в области, состоящей из:

(i) аминокислотной последовательности NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), которая соответствует аминокислотам с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359; и (ii) аминокислотной последовательности WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), которая соответствует аминокислотам с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359.

Настоящее изобретение включает антитела против С5, которые связываются с тем же эпитопом, или частью эпитопа, что и любые из специфических образцовых антител, перечисленных в табл. 1. Аналогичным образом, настоящее изобретение также относится к антителам против С5, которые конкури- 22 039858 руют за связывание с белком С5 или его фрагментом с любым из специфических образцовых антител, перечисленных в табл. 1. Например, настоящее изобретение включает антитела против С5, которые перекрестно конкурируют за связывание с белком С5 с одним или несколькими антителами, перечисленными в табл. 1.

Можно легко определять, связывается ли антитело с тем же эпитопом или конкурирует за связывание с эталонным антителом против С5 с использованием стандартных известных в данной области способов. Например, для того чтобы определять, если тестовое антитело связывается с тем же эпитопом, что и эталонное антитело против С5 по изобретению, эталонному антителу позволяют связываться с белком или пептидом С5 при насыщающих условиях. Затем оценивают способность тестового антитела связываться с молекулой белка С5. Если тестовое антитело способно связываться с С5 после насыщающего связывания с эталонным антителом против С5, то можно заключить, что тестовое антитело связывается с другим эпитопом, нежели эталонное антитело против С5. С другой стороны, если тестовое антитело не способно связываться с белком С5 после насыщающего связывания с эталонным антителом против С5, то тестовое антитело может связываться с тем же эпитопом, что эпитоп, связываемый эталонным антителом против С5 по изобретению.

Для того чтобы определять, если антитело конкурирует за связывание с эталонным антителом против С5, описанный выше способ связывания осуществляют в двух ориентациях: в первой ориентации эталонному антителу позволяют связываться с белком С5 при насыщающих условиях, после чего следует оценка связывания тестового антитела с молекулой С5. Во второй ориентации тестовому антителу позволяют связываться с молекулой С5 при насыщающих условиях, после чего следует оценка связывания эталонного антитела с молекулой С5. Если в обеих ориентациях только первое (насыщающее) антитело способно связываться с молекулой С5, то заключают, что тестовое антитело и эталонное антитело конкурируют за связывание с С5. Специалист в данной области примет во внимание, что антитело, которое конкурирует за связывание с эталонным антителом, может необязательно связываться с идентичным эпитопом, как эталонное антитело, но может стерически блокировать связывание эталонного антитела посредством связывания перекрывающегося или смежного эпитопа.

Два антитела связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом, если каждое конкурентно ингибирует (блокирует) связывание другого с антигеном. То есть, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратных избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75, 90 или даже 99%, как измеряют в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990, 50:1495-1502). Альтернативно, два антитела имеют один и тот же эпитоп, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или устраняют связывание с одним антителом, снижают или устраняют связывание с другим. Два антитела имеют перекрывающиеся эпитопы, если некоторые аминокислотные мутации, которые снижают или устраняют связывание с одним антителом, снижают или устраняют связывание с другим.

Затем можно осуществлять дополнительные стандартные эксперименты (например, мутации в пептидах и анализы связывания) для того, чтобы подтверждать, обусловлено ли наблюдаемое отсутствие связывания тестового антитела фактически связыванием с тем же эпитопом, что и эталонное антитело, или если стерическое блокирование (или другой феномен) отвечает за отсутствие наблюдаемого связывания. Эксперименты этого типа можно осуществлять с использованием ELISA, RIA, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в данной области.

Иммуноконъюгаты.

Данное изобретение относится к моноклональному антителу человека против С5, конъюгированному с терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), чтобы лечить С5-ассоциированное заболевание или нарушение (например, атипичный гемолитико-уремический синдром). Как используют в настоящем описании, термин иммуноконъюгат относится к антителу, которое химически или биологически связывают с радиоактивным средством, цитокином, интерфероном, фрагментом мишени или репортера, ферментом, пептидом или белком или терапевтическим средством. Антитела можно связывать с радиоактивным средством, цитокином, интерфероном, фрагментом мишени или репортера, ферментом, пептидом или терапевтическим средством в любом местоположении вдоль молекулы при условии, что они способны связываться со своей мишенью. Примеры иммуноконъюгатов включают конъюгаты антител и лекарственных средств и слитые белки антитело-токсин. В одном из вариантов осуществления средство может представлять собой второе отличающееся антитело к белку С5. Тип терапевтического фрагмента, который можно конъюгировать с антителом против С5, должен учитывать состояние, подлежащее лечению, и желаемый терапевтический эффект, подлежащий достижению. Примеры подходящих средств для формирования иммуноконъюгатов известны в данной области; см., например, WO 05/103081.

Полиспецифические антитела.

Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими, биспецифическими или полиспецифическими. Полиспецифические антитела могут обладать специфичностью к различным эпитопам одного целевого полипептида или могут содержать антигенсвязывающие домены со специфичностью больше чем к одному целевому полипептиду. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69;

- 23 039858

Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.

Любые полиспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению или их варианты можно конструировать с использованием стандартных способов молекулярной биологии (например, технология рекомбинантной ДНК и экспрессии белка), как известно специалистам в данной области.

В некоторых вариантах осуществления С5-специфические антитела создают в биспецифическом формате (биспецифические), в котором вариабельные области, связывающиеся с различными доменами белка С5, связаны вместе, чтобы придавать двухдоменную специфичность одной связывающей молекуле. Надлежащим образом разработанные биспецифические средства могут усиливать общий ингибирующий белок С5 эффект через увеличение как специфичности, так и авидности связывания. Вариабельные области со специфичностью к индивидуальным доменам (например, сегменты N-концевого домена) или которые могут связываться с различными областями в одном домене, образуют пары на структурном остове, который позволяет каждой области связываться одновременно с отдельными эпитопами или с различными областями в одном домене. В одном из примеров для биспецифического средства вариабельные области тяжелой цепи (VH) из связывающего средства со специфичностью к одному домену рекомбинируют с вариабельными областями легкой цепи (V_L) из серии связывающих средств со специфичностью ко второму домену для того, чтобы идентифицировать не когнатных V_L партнеров, которые могут образовывать пары с исходной VH без нарушения исходной специфичности для этой V_H. Таким образом, один сегмент V_L (например, V_L1) можно комбинировать с двумя различными доменами VH (например, V_H1 и V_H2) для того, чтобы создавать биспецифическое средство, состоящее из двух связывающих плеч (VH1-VL1 и VH2-VL1). Использование одного сегмента V_L снижает сложность системы и, тем самым, упрощает и увеличивает эффективность в процессах клонирования, экспрессии и очистки, используемых для того, чтобы создавать биспецифическое средство (см., например, USSN13/022759 и US 2010/0331527).

Альтернативно, антитела, которые связывают больше чем один домен и вторую мишень, такую как, но не ограничиваясь этим, например, второе отличающееся антитело против С5, можно получать в биспецифическом формате с использованием способов, описанных в настоящем описании, или других способов, известных специалистам в данной области. Вариабельные области антител, которые связываются с отличающимися областями, можно связывать вместе с вариабельными областями, которые связываются с релевантными участками, например, на внеклеточном домене С5, чтобы придавать двойную антигенную специфичность одной связывающей молекуле. Надлежащим образом разработанные биспецифические средства с этими свойствами выполняют двойную функцию. Вариабельные области со специфичностью к внеклеточному домену комбинируют с вариабельной областью со специфичностью к наружному внеклеточному домену и образуют пары на структурном остове, который позволяет каждой вариабельной области связываться с отдельными антигенами.

Образцовый формат биспецифических антител, который можно использовать в контексте настоящего изобретения, включает использование домена С_Н3 первого иммуноглобулина (Ig) и второго домена С_Н3 Ig, где первый и второй домены С_Н3 Ig отличаются друг от друг по меньшей мере одной аминокислотой и где различие по меньшей мере в одну аминокислоту снижает связывание биспецифического антитела с белком А по сравнению с биспецифическим антителом, не имеющим аминокислотного отличия. В одном из вариантов осуществления первый домен С_Н3 Ig связывает белок А и второй домен С_Н3 Ig содержит мутацию, которая снижает или устраняет связывание белка А, такую как модификация H95R (по нумерации экзонов IMGT; H435R по нумерации EU). Второй С_Н3 дополнительно может содержать модификацию Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Дополнительные модификации, которые можно найти во втором СН3, включают

D16E, L18M, N44S, K52N, V57M и V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V422I по EU) в случае антител IgG1;

N44S, K52N и V82I (IMGT; N384S, K392N и V422I по EU) в случае антител IgG2; и

Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V422I по EU) в случае антител IgG4.

Вариации биспецифического формата антител, которые описаны выше, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.

Другие образцовые биспецифические форматы, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают, без ограничения, например, основанные на scFv или биспецифические форматы диател, слитые конструкции IgG-scFv, Ig с двойным вариабельным доменом (DVD), квадрому, выступы-во-впадины, обыкновенную легкую цепь (например, обыкновенную легкую цепь с выступамиво-впадины и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, лейциновую молнию, Duobody, IgG1/IgG2, IgG с двойного действия Fab (DAF) и биспецифические форматы Mab2 (обзор вышеуказанных форматов см., например, в Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 и цитируемых в них ссылках). Биспецифические антитела также можно конструировать с использованием конъюгации пептидов/нуклеиновых кислот, например, где неприродные аминокислоты с ортогональной химической реакционной способностью используют для того, чтобы создавать сайт-специфические конъюгаты антитело-олигонуклеотид, которые затем самособираются в мультимерные комплексы с определенными составом, валентностью и геометрией. (См.,

- 24 039858 например, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

Терапевтическое введение и составы.

Изобретение относится к терапевтическим композициям, содержащим антитела против С5 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Терапевтические композиции в соответствии с изобретением следует вводить с подходящими носителями, эксципиентами и другими средствами, которые включают в составы для обеспечения усовершенствованного переноса, доставки, переносимости и т. п. Множество подходящих составов можно найти в справочнике, известном всем фармацевтическим химикам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, жиры, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™), ДНК конъюгаты, безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло в воде и вода в масле, эмульсии Carbowax (полиэтиленгликоли различных молекулярных масс), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие Carbowax. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations, PDA (1998), J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.

Дозу антитела можно варьировать в зависимости от возраста и размеров субъекта, подлежащего введению, целевого заболевания, условий, пути введения и т.п. Когда антитело по настоящему изобретению применяют для лечения заболевания или нарушения у взрослого пациента или для предотвращения такого заболевания, благоприятно вводить антитело по настоящему изобретению, обычно в однократной дозе приблизительно от 0,1 приблизительно до 100 мг/кг массы тела, более предпочтительно приблизительно от 5 приблизительно до 80, приблизительно от 10 приблизительно до 70 или приблизительно от 20 приблизительно до 50 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния, частоту и длительность лечения можно корректировать. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в виде начальной дозы по меньшей мере приблизительно от 0,1 приблизительно до 800 мг, приблизительно от 1 приблизительно до 600 мг, приблизительно от 5 приблизительно до 500 мг или приблизительно от 10 приблизительно до 400 мг. В определенных вариантах осуществления за начальной дозой может следовать введение второй или множества последующих доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в количестве, которое может приблизительно таким же или меньше такового в начальной дозе, где последующие дозы разделяют по меньшей мере 1-3 сутками; по меньшей мере одной неделей, по меньшей мере 2 неделями; по меньшей мере 3 неделями; по меньшей мере 4 неделями; по меньшей мере 5 неделями; по меньшей мере 6 неделями; по меньшей мере 7 неделями; по меньшей мере 8 неделями; по меньшей мере 9 неделями; по меньшей мере 10 неделями; по меньшей мере 12 неделями или по меньшей мере 14 неделями.

Различные системы доставки известны, и их можно применять для того, чтобы вводить фармацевтическую композицию по изобретению, например инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, рецепторопосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают, но не ограничиваясь этим, внутрикожный, трансдермальный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный пути. Композицию можно вводить с помощью любого удобного пути, например посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистая оболочка рта, ректальная и кишечная слизистая и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным. Фармацевтическую композицию также можно доставлять в везикуле, в частности липосоме (см., например, Langer (1990), Science, 249:1527-1533).

Использование наночастиц для того, чтобы доставлять антитела по настоящему изобретению, также предусмотрено в настоящем описании. Конъюгированные с антителами наночастицы можно использовать как для терапевтических, так и для диагностических применений. Конъюгированные с антителами наночастицы и способы получения и использования описаны подробно в Arruebo, M., et al. 2009 (Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications в J. Nanomat., том 2009, ID статьи 439389, 24 страницы, doi: 10,1155/2009/439389), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Наночастицы можно разрабатывать и конъюгировать с антителами, содержащимися в фармацевтических композициях для направленного воздействия на клетки. Наночастицы для доставки лекарственных средств также описаны, например, в US 8257740 или US 8246995, каждый включен в настоящее описание в полном объеме.

В определенных ситуациях фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления можно использовать насос. В другом варианте осуществления можно использовать полимерные материалы. В еще одном другом варианте осуществления систему с контролируемым высвобождением можно помещать вблизи от мишени композиции, что, таким образом, требует только доли от системной дозы.

Инъецируемые препараты могут включать дозированные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных, внутричерепных, интраперитонеальных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий и т.д. Эти инъецируемые препараты можно получать с помощью общеизвестных способов. Например, инъецируемые препараты можно получать, например, посредством растворения, суспендирования

- 25 039858 или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, стандартно используемой для инъекций. В качестве водной среды для инъекций имеют место, например, физиологический солевой раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные средства, и т.д., которые можно использовать в комбинации с подходящим солюбилизирующим средством, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионное поверхностно-активное средство [например, полисорбат 80, НСО-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) продукт присоединения гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используют, например, сезамовое масло, соевое масло и т.д., которые можно использовать в комбинации с солюбилизирующим средством, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Инъекцией, полученной таким образом, предпочтительно заполняют подходящую ампулу.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно доставлять подкожно или внутривенно с использованием стандартных иглы и шприца. Кроме того, в отношении подкожной доставки, устройство доставки по типу ручки без труда находит применения для доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Такое устройство доставки по типу ручки может быть повторно используемым или одноразовым. Повторно используемое устройство доставки по типу ручки в целом использует заменяемый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Когда вся фармацевтическая композиция в картридже введена и картридж пуст, пустой картридж можно легко выбрасывать и заменять на новый картридж, который содержит фармацевтическую композицию. Устройство доставки по типу ручки затем можно повторно использовать. В одноразовом устройстве доставки по типу ручки заменяемый картридж отсутствует. Скорее, одноразовое устройство доставки по типу ручки поступает предварительно заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре в устройстве. Когда фармацевтическая композиция в резервуаре закончилась, выбрасывают устройство целиком.

Многие повторно используемые устройства доставки по типу ручки и автоинъектора находят применения для подкожной доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры включают, но определенно без ограничения этим, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), ручку HUMALOG MIX 75/25™, ручку HUMALOG™, ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), среди прочих. Примеры одноразовых устройств доставки по типу ручки, имеющие применения для подкожной доставки фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают, но определенно без ограничения этим, ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоинъектор SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) и ручку HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), среди прочих.

Благоприятно, описанные выше фармацевтические композиции для орального или парентерального использования получают в дозированных формах в стандартной дозе, подобранной так, чтобы соответствовать дозе активных ингредиентов. Такие дозированные формы в стандартной дозе включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.д. Количество содержащегося антитела в целом составляет приблизительно от 5 приблизительно до 500 мг на дозированную форму в стандартной дозе; в частности в форме инъекции предпочтительно антитело составляло приблизительно от 5 приблизительно до 300 мг и приблизительно от 10 приблизительно до 300 мг для других дозированных форм.

Терапевтическое использование антител.

Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения заболевания, или нарушения, или состояния, связанного с С5, и/или для улучшения по меньшей мере одного симптома, связанного с таким заболеванием, нарушением или состоянием. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить в терапевтической дозе пациенту с заболеванием или нарушением или состоянием, связанным с С5.

В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать при лечении или предотвращении симптома или показания атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS). Симптомы и показания при aHUS включают, но не ограничиваясь этим, активацию тромбоцитов, гемолиз, системную тромботическую микроангиопатию (формирование свертков крови в небольших кровеносных сосудах по всему организму), ведущую к инсульту, сердечному приступу, почечной недостаточности и/или гибели, терминальной стадии почечной недостаточности, постоянному повреждению почек, боли в животе, спутанности, отеку, утомлению, тошноте/рвоте, диарее и микроангиопатической анемии.

В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать при лечении или предотвращении симптома или показания при пароксизмальной ночной гемогло- 26 039858 бинурии (PNH). Симптомы и показания при PNH включают, но не ограничиваясь этим, разрушение красных клеток крови, тромбоз (в том числе тромбоз глубоких вен, легочную эмболию), внутрисосудистую гемолитическую анемию, красную окраску мочи, симптомы анемии, такие как усталость, одышка и сердцебиения, боль в животе и затрудненное глотание.

В определенных вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из неврологических нарушений, почечных нарушений, рассеянного склероза, инсульта, синдрома Гийена-Барре, травматического повреждения головного мозга, болезни Паркинсона, нарушений ненадлежащей или нежелательной активации комплемента, осложнений гемодиализа, сверхострого отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата, индуцированной интерлейкином-2 токсичность во время терапии IL-2, воспалительных нарушений, воспаления при аутоиммунных заболеваниях, болезни Крона, респираторного дистресс-синдрома взрослых, термического повреждения, включая ожоги или обморожения, постишемических реперфузионных состояний, инфаркта миокарда, синдрома повышенной проницаемости капилляров, ожирения, диабета, болезни Альцгеймера, шизофрении, инсульта, эпилепсии, атеросклероза, васкулита, буллезного пемфигоида, С3-гломерулопатии, мембранопролиферативного гломерулонефрита, баллонной ангиопластики, постгемодиализного синдрома при сердечно-легочном шунтировании или почечном шунтировании, гемодиализа, почечной ишемии, реперфузии брыжеечной артерии после реконструкции аорты, инфекционного заболевания или сепсиса, нарушений иммунных комплексов и аутоиммунных заболеваний, диабетической нефропатии, синдрома Альпорта, прогрессирующей почечной недостаточности, протеинурических заболеваний почек, реперфузионного повреждения при почечной ишемии, волчаночного нефрита, гломерулопатии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), SLE нефрита, мембранопролиферативного нефрита, гемолитической анемии, оптикомиелита, трансплантата почки, наследственной недостаточности CD59, псориаза и миастении гравис. В определенных других вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или предотвращения по меньшей мере одного симптома или показания С5-ассоциированного заболевания или нарушения, выбранных из группы, состоящей из заболеваний и нарушений легких, таких как диспноэ, гемоптизис, ARDS, астма, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), эмфизема, легочная эмболия и инфаркт, пневмония, фиброгенные пневмокониозы, повреждения, обусловленные инертной пылью и минералами (например, кремний, угольная пыль, бериллий и асбест), фиброз легких, органические пневмокониозы, химическое повреждение (из-за раздражающих газов и химических соединений, например, хлора, фосгена, диоксида серы, сероводорода, диоксида азота, аммиака и соляной кислоты), повреждение дымом, термическое повреждение (например, ожог, обморожение), астма, аллергия, бронхоконстрикция, пневмонит гиперчувствительности, паразитарные заболевания, синдром Гудпасчера, васкулит легких, наследственный отек Квинке и ассоциированное с иммунными комплексами воспаление.

В определенных вариантах осуществления антитела по изобретению можно использовать для лечения субъектов, страдающих глазным заболеванием, таким как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), диабетический отек желтого пятна (DME), диабетическая ретинопатия, глазной ангиогенез (глазная неоваскуляризация, поражающая ткань хориоида, роговицы или сетчатки), географическая атрофия (GA), увеит и оптикомиелит. Антитела по настоящему изобретению можно использовать для лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома или показания сухой AMD или влажной AMD. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно использовать для предотвращения или снижения скорости потери зрения. В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для уменьшения друз в глазу субъекта с AMD. В одном из вариантов осуществления антитела по настоящему изобретению можно использовать для предотвращения или уменьшения/замедления потери зрения у субъекта с AMD.

Одно или несколько антител по настоящему изобретению можно вводить для облегчения или предотвращения или снижения тяжести одного или нескольких симптомов или состояний/показаний глазного заболевания или нарушения. Антитела можно использовать для того, чтобы улучшать или снижать тяжесть по меньшей мере одного симптома, включая в качестве неограничивающих примеров потерю зрения, визуальное искажение, сложность адаптации с низким уровням осведения, искривленное центральное зрение, увеличение затемнения центрального/общего зрения, присутствие друз (мелкие скопления внеклеточного материала, которые образуются на сетчатке), пигментные изменения, искаженное зрение в форме метаморфопсии, при которой сетка из прямых линий выглядит волнистой и части сетки могут выглядеть пустыми, экссудативные изменения (геморрагии в глаз, обильный экссудат, субретинальное/под пигментным эпителием сетчатки/интраретинальное текучее вещество), медленное восстановление зрительной функции после воздействия яркого света (фотострессовый тест), начальную и географическую атрофию, существенное снижение остроты зрения (на два уровня или больше), например, с 20/20 до 20/80, преимущественные периметрические изменения повышенной остроты зрения (для влажной AMD), расфокусированное зрение, постепенную потерю центрального зрения (у тех, кто имеет не экссудативную дегенерацию желтого пятна, быстрое начало потери зрения (часто обусловленное подте- 27 039858 канием и кровотечением в аномальных кровеносных сосудах у субъекта с экссудативной дегенерацией желтого пятна, центральные скотомы (тени или выпадение полей зрения), трудности при различении цветов, в частности между темными и темными и между светлыми и светлыми, потерю контрастной чувствительности, прямые линии выглядят изогнутыми на сетке Амслера.

Также в настоящем описании предусмотрено использование одного или нескольких антител по настоящему изобретению профилактически у субъектов с риском развития дегенерации желтого пятна, таких как субъекты в возрасте старше 50, субъекты с семейным анамнезом дегенерации желтого пятна, курильщики и субъекты с ожирением, высоким холестерином, сердечно-сосудистыми заболеваниями или нездоровой диетой.

В дополнительном варианте осуществления изобретения данные антитела используют для получения фармацевтической композиции или лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих заболеванием или нарушением, связанным с С5. В другом варианте осуществления изобретения данные антитела используют в качестве вспомогательной терапии с любым другим средством или любой другой терапией, известными специалистам в данной области, которые можно использовать для лечения или улучшения заболевания или нарушения, связанного с С5.

Комбинированная терапия.

Комбинированная терапия может включать антитело против С5 по изобретению и любое дополнительное терапевтическое средство, которое может быть полезно в комбинации с антителом по изобретению или с биологически активным фрагментом антитела по изобретению. Антитела по настоящему изобретению можно комбинировать синергически с одним или несколькими лекарственными средствами или терапией, которые используют для лечения заболевания или нарушения, связанного с С5. В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению можно комбинировать со вторым терапевтическим средством, чтобы улучшать один или несколько симптомов указанного заболевания.

В зависимости от С5-ассоциированного заболевания или нарушения, антитела по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, включая в качестве неограничивающих примеров антикоагулянт (например, варфарин, аспирин, гепарин, фениндион, фондапаринукс, идрапаринукс и ингибиторы тромбина, такие как аргатробан, лепирудин, бивалирудин или дабигатран), противовоспалительное лекарственное средство (например, кортикостероиды и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), антигипертензивное средство (например, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента), иммуносупрессорное средство (например, винкристин, циклоспорин А или метотрексат), фибринолитическое средство (например, анкрод, s-аминокапроновая кислота, антиплазмин-al, простациклин и дефибртид), понижающее липиды средство, такое как ингибитор гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазы, средство против CD20, такое как ритуксимаб, средство против TNF, такое как инфликсимаб, противосудорожное средство (например, сульфат магния), ингибитор С3 или антитромботическое средство.

В определенных вариантах осуществления второе терапевтическое средство представляет собой другое антитело к белку С5. В настоящем описании предусмотрено использование комбинации (коктейля) антител с широкой нейтрализующей или ингибирующей активностью против С5. В некоторых вариантах осуществления не конкурирующие антитела можно комбинировать и вводить нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления антитела, содержащиеся в комбинации, связываются с отдельными не перекрывающимися эпитопами на белке. Антитела, содержащиеся в комбинации, могут блокировать связывание С5 с С5-конвертазой и/или могут предотвращать/ингибировать расщепление С5 до С5а и С5Ь. В определенных вариантах осуществления второе антитело может обладать более длительным временем полужизни в сыворотке человека.

Как используют в настоящем описании, термин в комбинации с обозначает, что дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить до, одновременно с или после введения антитела против С5 по настоящему изобретению. Термин в комбинации с также включает последовательное или сопутствующее введение антитела против С5 и второго терапевтического средства.

Дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту перед введением антитела против С5 по настоящему изобретению. Например, первый компонент можно считать подлежащим введению перед вторым компонентом, если первый компонент вводят за 1 неделю перед, 72 ч перед, 60 ч перед, 48 ч перед, 36 ч перед, 24 ч перед, 12 ч перед, 6 ч перед, 5 ч перед, 4 ч перед, 3 ч перед, 2 ч перед, 1 ч перед, 30 мин перед, 15 мин перед, 10 мин перед, 5 мин перед или меньше чем 1 мин перед введением второго компонента. В других вариантах осуществления дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту после введения антитела против С5 по настоящему изобретению. Например, первый компонент можно считать подлежащим введению после второго компонента, если первый компонент вводят через 1 мин после, 5 мин после, 10 мин после, 15 мин после, 30 мин после, 1 час после, 2 ч после, 3 ч после, 4 ч после, 5 ч после, 6 ч после, 12 ч после, 24 ч после, 36 ч после, 48 ч после, 60 ч после, 72 ч после введения второго компонента. В других вариантах осуществления дополнительный терапевтически активный компонент(ы) можно вводить субъекту одновременно со введением антитела против С5 по настоящему изобретению. Одновременное введение, для целей настоящего изобретения, включает, например, введение антитела против С5 и дополнительного

- 28 039858 терапевтически активного компонента субъекту в одной дозированной форме или в отдельных дозированных формах, вводимых субъекту в пределах приблизительно 30 мин или меньше друг от друга. При введении в отдельных дозированных формах каждую дозированную форму можно вводить через один и тот же путь (например, оба антитела против С5 и дополнительный терапевтически активный компонент можно вводить внутривенно и т.д.); альтернативно, каждую дозированную форму можно вводить через отличающийся путь (например, антитело против С5 можно вводить внутривенно и дополнительный терапевтически активный компонент можно вводить перорально). В любом случае введение компонентов в одной дозированной форме, в отдельных дозированных формах через один и тот же путь или в отдельных дозированных формах через различные пути - все считают одновременным введением для целей настоящего раскрытия. Для целей настоящего раскрытия введение антитела против С5 до, одновременно с или после (как эти термины определяют выше в настоящем описании) введения дополнительного терапевтически активного компонента считают введением антитела против С5 в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом.

Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антитело против С5 по настоящему изобретению совместно формулируют с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в другом месте в настоящем документе.

Схемы введения.

В соответствии с определенными вариантами осуществления однократную дозу антитела против С5 по изобретению (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела против С5 и любого из дополнительных терапевтически активных средств, указанных в настоящем описании) можно вводить нуждающемуся в этом субъекту. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего изобретения множество доз антитела против С5 (или фармацевтической композиции, содержащей комбинацию антитела против С5 и любого из дополнительных терапевтически активных средств, указанных в настоящем описании) можно вводить субъекту в течение определенного периода времени. Способы в соответствии с этим аспектом изобретения включают последовательное введение субъекту нескольких доз антитела против С5 по изобретению. Как используют в настоящем описании, последовательное введение обозначает, что каждую дозу антитела против С5 вводят субъекту в отличающийся момент времени, например в отличающиеся сутки, отделенные предварительно определяемым интервалом (например, часы, сутки, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы, которые включают последовательное введение пациенту одной начальной дозы антитела против С5, после чего следуют одна или несколько вторичных доз антитела против С5 и, необязательно, после чего следуют одна или несколько третичных доз антитела против С5.

Термины начальная доза, вторичные дозы и третичные дозы относятся к хронологической последовательности введения антитела против С5 по изобретению. Таким образом, начальная доза представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (также обозначают как доза базового уровня); вторичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; и третичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Все начальные, вторичные и третичные дозы могут содержать одно и то же количество антитела против С5, но в целом могут отличаться друг от друга в отношении частоты введения. Однако в определенных вариантах осуществления количество антитела против С5, содержащегося в начальных, вторичных и/или третичных дозах, варьирует от одной к другой (например, корректируют вверх или вниз в зависимости от ситуации) во время курса лечения. В определенных вариантах осуществления две или больше (например, 2, 3, 4 или 5) дозы вводят в начале схемы лечения в качестве загрузочных доз, после чего следуют последующие дозы, которые вводят на менее частой основе (например, поддерживающие дозы).

В определенных образцовых вариантах осуществления настоящего изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-48 ч (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5 или больше) после непосредственно предшествующей дозы. Фраза непосредственно предшествующая доза, как используют в настоящем описании, обозначает, в последовательности из нескольких введений, дозу антитела против С5, которую вводят пациенту перед введением ближайшей следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.

Способы в соответствии с этим аспектом изобретения могут включать введение пациенту любого числа вторичных и/или третичных доз антитела против С5. Например, в определенных вариантах осуществления пациенту вводят только одну вторичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) вторичных доз. Аналогичным образом, в определенных вариантах осуществления пациенту вводят только одну третичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или больше (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше) третичные дозы.

В определенных вариантах осуществления частота, с которой вторичные и/или третичные дозы вводят пациенту, может варьировать в ходе схемы лечения. Частоту введения также может корректировать во время хода лечения посредством врача в зависимости от потребностей конкретного пациента, после клинического обследования.

- 29 039858

Диагностическое использование антител.

Антитела против С5 по настоящему изобретению можно использовать для того, чтобы обнаруживать и/или измерять С5 в образце, например, для диагностических целей. Некоторые варианты осуществления предусматривают использование одного или нескольких антител по настоящему изобретению в анализах для того, чтобы обнаруживать С5-ассоциированное заболевание или нарушение. Образцовые диагностические анализы для С5 могут включать, например, приведение образца, полученного у пациента, в контакт с антителом против С5 по изобретению, где антитело против С5 метят поддающейся обнаружению меткой или репортерной молекулой или используют в качестве захватываемого лиганда для того, чтобы избирательно выделать С5 из образцов пациентов.

Альтернативно, не меченное антитело против С5 можно использовать в диагностических применениях в комбинации со вторичным антителом, которое само метят с возможностью обнаружения. Поддающаяся обнаружению метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵S или ¹²⁵I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеинизотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные образцовые анализы, которые можно использовать для того, чтобы обнаруживать или измерять С5 в образце, включают твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) и активируемую флуоресценцией сортировку клеток (FACS).

Образцы, которые можно использовать в С5 диагностических анализах в соответствии с настоящим изобретением, включают любой образец ткани или текучего вещества, получаемый от пациента, который содержит поддающиеся обнаружению количества или белка С5 или его фрагментов, при нормальных или патологических состояниях. В целом, уровни белка С5 в конкретном образце, получаемом от здорового пациента (например, пациента, не пораженного заболеванием, связанным с С5), измеряют для того, чтобы изначально установить базовый или стандартный уровень С5. Этот базовый уровень С5 затем можно сравнивать с уровнями С5, измеренными в образцах, полученных у индивидуумов с подозрением на наличие С5-ассоциированного состояния или симптомами, связанными с таким состоянием.

Антитела со специфичностью к белку С5 могут не содержать дополнительные метки или фрагменты или они могут содержать N-концевую или С-концевую метку или фрагмент. В одном из вариантов осуществления меткой или фрагментом является биотин. В анализе связывания местоположение метки (если уместно) может определять ориентацию пептида относительно поверхности, с которой связывают пептид. Например, если поверхность покрывают авидином, пептид, содержащий N-концевой биотин, будет ориентирован так, что С-концевая часть пептида будет дистальной относительно поверхности.

Избранные варианты осуществления.

Избранные варианты осуществления по настоящему раскрытию включают следующее.

В варианте осуществления 1 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в С5 (SEQ ID NO: 359), как определяют по водород-дейтериевому обмену.

В варианте осуществления 2 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в α цепи и/или β цепи С5, как определяют по водород-дейтериевому обмену.

В варианте осуществления 3 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по вариантам осуществления 1 или 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не взаимодействуют с аминокислотой из областью анафилатоксина С5а из С5, как определяют по водород-дейтериевому обмену.

В варианте осуществления 4 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с одной или несколькими аминокислотами, содержащимися в SEQ ID NO: 360 и/или SEQ ID NO: 361, как определяют по водород-дейтериевому обмену.

В варианте осуществления 5 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из:

(а) аминокислот с 591 до 599 из SEQ ID NO: 359;

(b) аминокислот с 593 до 599 из SEQ ID NO: 359;

(с) аминокислот с 775 до 787 из SEQ ID NO: 359;

(d) аминокислот с 775 до 794 из SEQ ID NO: 359 и (е) аминокислот с 779 до 787 из SEQ ID NO: 359.

В варианте осуществления 6 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 5, где антитело или его анти- 30 039858 генсвязывающий фрагмент взаимодействуют по меньшей мере с пятью аминокислотами, содержащимися в аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 360 и 361.

В варианте осуществления 7 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 360 и 361.

В варианте осуществления 8 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент взаимодействуют по меньшей мере с одним из следующих аминокислотных остатков: N591, М592, А593, Т594, G595, М596, D597, S598, W599, W775, Е776, V777, Н778, L779, V780, Р781, R782, R783, К784, Q785, L786, Q787, F788, А789, L790, Р791, D792, S793 или L794 из SEQ ID NO: 359.

В варианте осуществления 9 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 8, где антитело обладает одной или несколькими из следующих характеристик:

(а) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 70 при введении яванскому макаку;

(b) блокирует классический путь (СР) гемолиза до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;

(с) блокирует альтернативный путь (АР) гемолиза до суток 35 при введении яванскому макаку, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo;

(d) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у яванского макака;

(е) имеет концентрацию в сыворотке больше чем 10 мкг/мл до суток 40 при введении С5-гуманизированным мышам;

(f) блокирует СР гемолиз до суток 30 при введении С5-гуманизированным мышам, как измеряют в анализе гемолиза ex vivo; и (g) имеет время полужизни в сыворотке больше чем 10 суток у С5-гуманизированных мышей.

В варианте осуществления 10 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 9, где антитело обладает дополнительной характеристикой, выбранной из группы, состоящей из:

В варианте осуществления 11 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 10, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), содержащиеся в любой одной из последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), перечисленных в табл. 1; и три CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в любой одной из последовательностей вариабельной области легкой цепи (LCVR), перечисленных в табл. 1.

В варианте осуществления 12 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его анти- 31 039858 генсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 11, которые содержат:

(а) домен HCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 124, 140, 148, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 276, 292,

308, 324 и 340;

(b) домен HCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 126, 142, 150, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 278, 294, 310, 326 и 342;

(с) домен HCDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 128, 144, 152, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 296, 312, 328 и 344;

(d) домен LCDR1, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 116, 132, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 284, 300, 316, 332 и 348;

(е) домен LCDR2, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 118, 134, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 286, 302, 318, 334 и 350; и (f) домен LCDR3, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 120, 136, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 288, 304, 320, 336 и 352.

В варианте осуществления 13 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 1 до 12, содержащее HCVR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей HCVR, перечисленных в табл. 1.

В варианте осуществления 14 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 13, содержащие LCVR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей LCVR, перечисленных в табл. 1.

В варианте осуществления 15 настоящее изобретение включает выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 11 до 14, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 и 338/346.

В варианте осуществления 16 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления с 11 до 15, содержащие три CDR, содержащиеся в HCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, 98, 138 и 202; и три CDR, содержащиеся в LCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, 106 и 210.

В варианте осуществления 17, настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 16, содержащие CDR, выбранные из группы, состоящей из:

(a) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 и 64;

(b) SEQ ID NO: 1000, 102, 104, 108, 110 и 112;

(с) SEQ ID NO: 140, 142, 144, 108, 110 и 112 и (d) SEQ ID NO: 204, 206, 208, 212, 214 и 216.

В варианте осуществления 18 настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 17, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCvR/LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50/58, 98/106, 138/106 и 202/210.

В варианте осуществления 19 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют за связывание с С5 с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 17.

В варианте осуществления 20 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 17.

В варианте осуществления 21 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 9 или 10, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше 5 замен аминокислот.

В варианте осуществления 22 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 21, которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, перечисленную в табл. 1, имеющую не больше 5 замен аминокислот.

- 32 039858

В варианте осуществления 23 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 9 или 10, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 98.

В варианте осуществления 24 настоящее изобретение включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 23, содержащие вариабельную область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей с SEQ ID NO: 106.

В варианте осуществления 25 настоящее изобретение включает выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, блокирующие расщепление С5 на С5а и С5Ь, которые содержат три CDR из HCVR, где HCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 122, 138, 146, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 274, 290, 306, 322 и 33 8; и три CDR из LCVR, где LCVR имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 114, 130, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 282, 298, 314, 330 и 346.

В варианте осуществления 26 настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с С5 в соответствии с любым одним из вариантов осуществления с 1 до 25, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В варианте осуществления 27 настоящее изобретение включает выделенную молекулу полинуклеотида, содержащего полинуклеотидную последовательность, которая кодирует HCVR антитела, как изложено в любом одном из вариантов осуществления с 1 до 25.

В варианте осуществления 28 настоящее изобретение включает выделенную молекулу полинуклеотида, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует LCVR антитела, как изложено в любом одном из вариантов осуществления с 1 до 25.

В варианте осуществления 29 настоящее изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по варианту осуществления 27 или 28.

В варианте осуществления 30 настоящее изобретение включает клетку, экспрессирующую вектор по варианту осуществления 29.

В варианте осуществления 31 настоящее изобретение включает способ предотвращения, лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома или показания заболевания или нарушения, связанного с С5, способ включает введения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления с 1 до 25 нуждающемуся в этом субъекту.

В варианте осуществления 32 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из атипичного гемолитикоуремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH), возрастной дегенерации желтого пятна, географической атрофии, увеита, оптикомиелита, рассеянного склероза, инсульта, синдрома Гийена-Барре, травматического повреждения головного мозга, болезни Паркинсона, нарушений ненадлежащей или нежелательной активации комплемента, осложнений гемодиализа, сверхострого отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата, индуцированной интерлейкином-2 токсичности во время терапии IL-2, воспалительных нарушений, воспаления при аутоиммунных заболеваниях, болезни Крона, респираторного дистресс-синдрома взрослых, термического повреждения, включая ожоги или обморожения, постишемических реперфузионных состояний, инфаркта миокарда, синдрома повышенной проницаемости капилляров, ожирения, диабета, болезни Альцгеймера, шизофрении, инсульта, эпилепсии, атеросклероза, васкулита, буллезного пемфигоида, С3-гломерулопатии, мембранопролиферативного гломерулонефрита, диабетической нефропатии, синдрома Альпорта, прогрессирующей почечной недостаточности, протеинурических заболеваний почек, реперфузионного повреждения при почечной ишемии, волчаночного нефрита, баллонной ангиопластики, постгемодиализного синдрома при сердечно-легочном шунтировании или почечном шунтировании, гемодиализа, почечной ишемии, реперфузии брыжеечной артерии после реконструкции аорты, инфекционного заболевания или сепсиса, нарушений иммунных комплексов и аутоиммунных заболеваний, почечных нарушений, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), SLE нефрита, пролиферативного нефрита, гемолитической анемии, астмы, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), эмфиземы, легочных эмболии и инфарктов, пневмонии и миастении гравис.

В варианте осуществления 33 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение представляет собой aHUS.

В варианте осуществления 34 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 31, в котором заболевание или нарушение представляет собой PNH.

В варианте осуществления 35 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления 31-34, в котором фармацевтическую композицию вводят профилактически или терапевтически субъекту, нуждающемуся в этом.

В варианте осуществления 36 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления с 31 до 35, в котором фармацевтическую композицию вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством.

- 33 039858

В варианте осуществления 37 настоящее изобретение включает способ по варианту осуществления 36, в котором второе терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из антикоагулянта, противовоспалительного лекарственного средства, антигипертензивного средства, иммуносупрессорного средства, понижающего липиды средства, средства против CD20, такого как ритуксимаб, средства против TNF, такого как инфликсимаб, противосудорожного средства, ингибитора С3, второго антитела против С5 и антитромботического средства.

В варианте осуществления 38 настоящее изобретение включает способ по любому из вариантов осуществления с 31 до 37, в котором фармацевтическую композицию вводят подкожно, внутривенно, внутрикожно, интраперитонеально, перорально, внутримышечно или внутрь черепа.

Примеры

Следующие примеры приведены с тем, чтобы предоставить средним специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как получать и использовать способы и композиции по изобретению, и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем того, что авторы изобретения считают своим изобретением. Предприняты усилия к тому, чтобы обеспечить точность в отношении используемых чисел (например, количество, температура и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения следует принимать во внимание. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой усредненную молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, комнатная температура составляет приблизительно 25°С и давление равно атмосферному или близко к нему.

Пример 1. Создание антител человека к белку фактора 5 комплемента (С5).

Антитела человека к белку С5 создавали у мыши VELOCIMMUNE®, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей к цепи иммуноглобулина человека. Мышей иммунизировали очищенным сывороточным белком С5 человека (Calbiochem № по каталогу 20-4888).

Мониторинг антительного иммунного ответа осуществляли посредством С5-специфического иммунологического анализа. Когда достигали желаемого иммунного ответа, спленоциты собирали и сливали с миеломными клетками мыши, чтобы сохранять их жизнеспособность и формировать гибридомные клеточные линии. Осуществляли скрининг и отбор гибридомных клеточных линий для того, чтобы идентифицировать клеточные линии, которые продуцируют С5-специфические антитела. Клеточные линии использовали для получения нескольких химерных антител против С5 (т.е. антител, содержащих вариабельные домены человека и константные домены мыши); образцовые антитела, созданные таким образом, обозначали как H2M11683N и H2M11686N.

Антитела против С5 также выделяли непосредственно из антиген-положительных В-клеток мышей без слияния с миеломными клетками, как описано в патенте США 7582298, включенном в настоящее описание конкретно по ссылке в полном объеме. Используя этот способ, получали несколько антител полностью человека против С5 (т.е. антител, содержащих вариабельные домены человека и константные домены человека); образцовые антитела, созданные таким образом, обозначали как Н4Н12159Р, Н4Н12161Р, Н4Н12163Р, Н4Н12164Р, Н4Н12166Р, Н4Н12167Р, Н4Н12168Р, Н4Н12169Р, Н4Н12170Р, Н4Н12171Р, Н4Н12175Р, Н4Н12176Р2, Н4Н12177Р2 и Н4Н12183Р2.

Биологические свойства образцовых антител, созданных в соответствии со способами из этого примера, описаны подробно в примерах, приведенных далее.

Пример 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей.

В табл. 1 приведены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR выбранных антител против С5 по изобретению.

- 34 039858

Таблица 1

Идентификаторы аминокислотных последовательностей________

	SEQ ID NO:
Обозначени е антитела	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H2M11683N	2	4	6	8	10	12	14	16
H2M11686N	18	20	22	24	26	28	30	32
Н4Н12159Р	34	36	38	40	42	44	46	48
Н4Н12161Р	50	52	54	56	58	60	62	64
Н4Н12163Р	66	68	70	72	74	76	78	80
Н4Н12164Р	82	84	86	88	90	92	94	96
Н4Н12166Р	98	100	102	104	106	108	110	112
Н4Н12166Р2	98	100	102	104	114	116	118	120
Н4Н12166РЗ	122	124	126	128	106	108	110	112
Н4Н12166Р4	98	100	102	104	130	132	134	136
Н4Н12166Р5	138	140	142	144	106	108	110	112
Н4Н12166Р6	146	148	150	152	106	108	110	112
Н4Н12166Р7	122	124	126	128	130	132	134	136
Н4Н12166Р8	146	148	150	152	114	116	118	120
Н4Н12166Р9	146	148	150	152	130	132	134	136
Н4Н12166Р1 0	138	140	142	144	130	132	134	136
Н4Н12167Р	154	156	158	160	162	164	166	168
Н4Н12168Р	170	172	174	176	178	180	182	184
Н4Н12169Р	186	188	190	192	194	196	198	200
Н4Н12170Р	202	204	206	208	210	212	214	216
Н4Н12171Р	218	220	222	224	226	228	230	232
Н4Н12175Р	234	236	238	240	242	244	246	248
Н4Н12176Р2	250	252	254	256	258	260	262	264
Н4Н12177Р2	266	268	270	272	258	260	262	264
Н4Н12183Р2	274	276	278	280	282	284	286	288
H2M11682N	290	292	294	296	298	300	302	304
H2M11684N	306	308	310	312	314	316	318	320
H2M11694N	322	324	326	328	330	332	334	336
H2M11695N	338	340	342	344	346	348	350	352

Соответствующие идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты приведены в табл. 2.

- 35 039858

Таблица 2

Идентификаторы последовательностей нуклеиновой кислоты

	SEQ ID NO:
Обозначени е антитела	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H2M11683N	1	3	5	7	9	11	13	15
H2M11686N Н4Н12159Р Н4Н12161Р Н4Н12163Р Н4Н12164Р Н4Н12166Р Н4Н12166Р2 Н4Н12166РЗ Н4Н12166Р4 Н4Н12166Р5 Н4Н12166Р6 Н4Н12166Р7 Н4Н12166Р8 Н4Н12166Р9 Н4Н12166Р1 0 Н4Н12167Р Н4Н12168Р Н4Н12169Р Н4Н12170Р Н4Н12171Р	17 33 49 65 81 97 97 121 97 137 145 121 145 145 137 153 169 185 201 217	19 35 51 67 83 99 99 123 99 139 147 123 147 147 139 155 171 187 203 219	21 37 53 69 85 101 101 125 101 141 149 125 149 149 141 157 173 189 205 221	23 39 55 71 87 103 103 127 103 143 151 127 151 151 143 159 175 191 207 223	25 41 57 73 89 105 113 105 129 105 105 129 113 129 129 161 177 193 209 225	27 43 59 75 91 107 115 107 131 107 107 131 115 131 131 163 179 195 211 227	29 45 61 77 93 109 117 109 133 109 109 133 117 133 133 165 181 197 213 229	31 47 63 79 95 111 119 111 135 111 111 135 119 135 135 167 183 199 215 231
Н4Н12175Р	233	235	237	239	241	243	245	247
Н4Н12176Р2	249	251	253	255	257	259	261	263
Н4Н12177Р2	265	267	269	271	257	259	261	263
Н4Н12183Р2	273	275	277	279	281	283	285	287
H2M11682N	289	291	293	295	297	299	301	303
H2M11684N	305	307	309	311	313	315	317	319
H2M11694N	321	323	325	327	329	331	333	335
H2M11695N	337	339	341	343	345	347	349	351

Антитела обычно обозначают в настоящем описании в соответствии со следующей номенклатурой:

префикс Fc (например Н4Н, Н2М и т.д.), за которым следует цифровой идентификатор (например 11686, 12166, 12183 и т.д., как показано в табл. 2), за которым следует суффикс Р, Р2 или N. Таким образом, в соответствии с этой номенклатурой антитело можно обозначать в настоящем описании, например, как H2M1168 6N, Н4Н12183Р2, Н4Н12168Р и т.д. Префиксы Н4Н и Н2М в обозначениях антител, используемых в настоящем описании, указывают на конкретный изотип Fc-области антитела. Например, Н4Н антитело имеет Fc IgG4 человека, содержащую мутацию серина в пролин в шарнирной области (S108P), чтобы содействовать стабилизации димера, а Н2М антитело имеет Fc IgG2 мыши (изотип а или b) (все вариабельные области являются полностью человеческими, как обозначено с помощью первой Н в обозначении антитела). Специалист в данной области примет во внимание, что антитело, содержащее Fc конкретного изотипа, можно превращать в антитело с Fc другого изотипа (например, антитело с Fc IgG1 мыши можно превращать в антитело с IgG4 человека и т.д.), но в любом случае вариабельные домены (в том числе CDR), которые обозначены с помощью цифровых идентификаторов, которые представлены в табл. 2, будут оставаться теми же, и ожидают, что свойства связывания с антигеном будут идентичными или по существу схожими, независимо от природы домена Fc.

В определенных вариантах осуществления выбранные антитела с Fc IgG1 мыши превращали в ан- 36 039858 титела с Fc IgG4 человека. В одном из вариантов осуществления домен Fc IgG4 содержит две или больше аминокислотные замены, как раскрыто в US 20100331527.

Для того чтобы создавать мутированные антитела, различные остатки в определяющих комплементарность областях (CDR) из Н4Н12166Р мутировали в гистидин для того, чтобы создавать 9 мутированных антител, идентифицированных как от Н4Н12166Р2 до Н4Н12166Р10. Показано, что гистидиновые мутации в CDR придают зависимость от рН связыванию с целевым антигеном, что ведет к усовершенствованной фармакокинетике (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).

Контрольные конструкции, используемые в следующих примерах.

Следующие контрольные конструкции (антитела против С5) включали в эксперименты, раскрытые в настоящем описании, в целях сравнения: объект сравнения 1, моноклональное антитело против С5 человека, имеющее последовательности VH/VL из антитела h5G1.1 в соответствии с патентом США № 6355245 (Alexion Pharmaceuticals, Inc.); и объект сравнения 2, моноклональное антитело человека против С5 человека, имеющее последовательности VH/VL из антитела 8109 в соответствии с публикацией патентной заявки США № 2013/0022615 (Novartis).

Пример 3. Связывание антитела с С5, как определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса.

Равновесные константы диссоциации (значения KD) для связывания С5 с очищенными антителами против С5 определяли с использованием биосенсорного анализа поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени на приборе Biacore T200. Поверхность датчика Biacore дериватизировали посредством аминного связывания с моноклональным антителом мыши против Fc человека (GE Healthcare, № BR-1008-39), чтобы захватывать антитела против С5, экспрессируемые с константными областями Fc человека. Исследования связывания Biacore проводили в подвижном буфере HBST (0,01 M HEPES рН 7,4, 0,15М NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% об./об. поверхностно-активного средства Р20). С5 человека получали из коммерческого источника (EMD). Другие реактивы С5 экспрессировали с С-концевой myc-myc-гексагистидиновой меткой (впоследствии обозначаемой как C5-mmh). Также экспрессировали реактивы C5-mmh человека, содержащие гистидиновые и цистеиновые точечные мутации по аргинину 885 (впоследствии обозначаемые как С5 R885H-mmh и С5 R885C-mmh соответственно). Различные концентрации С5 человека, С5 человека R885H-mmh (SEQ ID NO: 356), С5 человека R885C-mmh (SEQ ID NO: 357) и C5 обезьяны-mmh (SEQ ID NO: 358) (в диапазоне от 100 до 1,23 нМ, 3-кратные разведения), полученные в подвижном буфере HBST, впрыскивали на поверхность с захваченным антителом против С5 при скорости потока 30 мкл/мин. Осуществляли мониторинг ассоциации всех С5 реактивов с каждым из захваченных моноклональных антител в течение 3 мин и осуществляли мониторинг их диссоциации в подвижном буфере HBST в течение 8 мин. Все эксперименты по кинетике связывания осуществляли при 25 или 37°С. Кинетические константы скорости ассоциации (k_a) и диссоциации (kd) определяли посредством аппроксимации сенсограмм реального времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения аппроксимации кривых Scrubber 2.0с. Равновесные константы диссоциации связывания (KD) и диссоциационное время полужизни (t_1/2) вычисляли по кинетическим константам скорости: K_D(M) = kd/k_a и t_1/2 (мин) = ln₂/ ( 60xkd).

Кинетические параметры связывания для связывания С5 человека с антителами против С5 при 25 и 37°С представлены в табл. 3 и 4.

Таблица 3

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека при 25 °С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	t_1/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	231	439	4,17Е+05	5,14Е-05	1,23Е-10	225
Н4Н12171Р	51	64	1,49Е+05	8,16Е-05	5,49Е-10	142
Н4Н12161Р	38	64	2,58Е+05	4,37Е-05	1,70Е-10	264
Н4Н12176Р2	50	96	3,36Е+05	6,75Е-05	2,01Е-10	171
Н4Н12163Р	51	108	6,43Е+05	2,08Е-04	3,24Е-10	55
Н4Н12167Р	52	116	1,09Е+06	1,31Е-04	1,21Е-10	88

- 37 039858

Н4Н12175Р	51	100	2,16Е+05	1,96Е-04	9,10Е-10	59
Н4Н12159Р	53	118	9,75Е+05	7,13Е-05	7,31Е-11	162
Н4Н12164Р	52	103	2,92Е+05	8,84Е-05	3,02Е-10	131
Н4Н12168Р	50	113	4,23Е+05	4,75Е-05	1,12Е-10	243
Н4Н12169Р	51	18	2,24Е+05	4,40Е-04	1,96Е-09	26
H4H11686N	200	341	2,20Е+05	3,31Е-05	1,50Е-10	349
Н4Н12170Р	51	119	5,25Е+05	6,79Е-05	1,29Е-10	170
Н4Н12177Р2	47	60	6,56Е+04	6,29Е-05	9,59Е-10	184
Н4Н12183Р2	46	50	1,66Е+05	2,70Е-05	1,63Е-10	427
Н4Н12166Р	53	105	6,42Е+05	1,10Е-04	1,71Е-10	105
Н4Н12166Р2	53	95	8,26Е+05	3,61Е-04	4,38Е-10	32
Н4Н12166РЗ	59	124	4,03Е+05	4,65Е-04	1,15Е-09	25
Н4Н12166Р4	49	92	4,46Е+05	1,76Е-04	3,95Е-10	66
Н4Н12166Р5	59	110	2,85Е+05	3,28Е-04	1,15Е-09	35
Н4Н12166Р6	64	131	4,89Е+05	1,84Е-04	3,75Е-10	63
Н4Н12166Р7	50	92	2,74Е+05	1,01Е-03	3,67Е-09	11
Н4Н12166Р8	50	91	4,84Е+05	6,86Е-04	1,42Е-09	17
Н4Н12166Р9	52	100	3,32Е+05	2,64Е-04	7,94Е-10	44
Н4Н12166Р1 0	49	69	1,57Е+05	1,32Е-03	8,38Е-09	9
объект сравнения 1	232	250	9,69Е+04	1,46Е-04	1,51Е-09	79
объект сравнения 2	117	170	2,62Е+05	2,39Е-04	9,12Е-10	48

Таблица 4

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека при 37°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	tl/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	257	492	4,54Е+05	2,41Е-04	5,32Е-10	48
Н4Н12171Р	59	58	1,22Е+05	7,62Е-04	6,27Е-09	15
Н4Н12161Р	40	66	1,16Е+05	1,15Е-04	9,90Е-10	101
Н4Н12176Р2	38	71	1,47Е+05	2,34Е-04	1,59Е-09	49
Н4Н12163Р	65	139	9,11Е+05	6,65Е-04	7,29Е-10	17
Н4Н12167Р	75	153	1,29Е+06	3,81Е-04	2,95Е-10	30
Н4Н12175Р	74	132	2,96Е+05	6,37Е-04	2,15Е-09	18
Н4Н12159Р	70	145	1,04Е+06	1,07Е-04	1,03Е-10	108

- 38 039858

Н4Н12164Р	66	140	3,96Е+05	1,28Е-04	3,23Е-10	90
Н4Н12168Р	34	12	2,50Е+04	4,64Е-04	1,85Е-08	25
Н4Н12169Р	59	65	1,15Е+05	3,52Е-04	3,06Е-09	33
H4H11686N	206	406	3,ЗЗЕ+05	1,56Е-04	4,69Е-10	74
Н4Н12170Р	34	55	2,97Е+05	4,15Е-04	1,40Е-09	28
Н4Н12177Р2	41	37	4,42Е+04	5,78Е-04	1,31Е-08	20
Н4Н12183Р2	29	30	4,30Е+04	2,50Е-04	5,81Е-09	46
Н4Н12166Р	69	127	8,80Е+05	2,ЗОЕ-04	2,62Е-10	50
Н4Н12166Р2	68	110	9,50Е+05	1,23Е-03	1,29Е-09	9
Н4Н12166РЗ	86	147	6,12Е+05	1,27Е-03	2,07Е-09	9
Н4Н12166Р4	63	108	5,05Е+05	4,69Е-04	9,30Е-10	25
Н4Н12166Р5	76	129	4,40Е+05	1,22Е-03	2,77Е-09	9
Н4Н12166Р6	90	157	5,42Е+05	4,74Е-04	8,75Е-10	24
Н4Н12166Р7	64	105	3,49Е+05	2,58Е-03	7,39Е-09	4
Н4Н12166Р8	65	98	6,75Е+05	2,09Е-03	3,10Е-09	6
Н4Н12166Р9	76	122	3,75Е+05	6,39Е-04	1,70Е-09	18
Н4Н12166Р1 0	64	82	2,27Е+05	3,14Е-03	1,38Е-08	4
объект сравнения 1	185	246	1,47Е+05	5,ЗОЕ-04	3,61Е-09	22
объект сравнения 2	119	205	2,85Е+05	б,57Е-04	2,30Е-10	18

Связывание С5 обезьяны-mmh с антителами против С5 при 25 и 37°С представлено в табл. 5 и 6.

Таблица 5

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 обезьяны-mmh при 25°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 обезьяныmmh связанн. (RU)	к_а (1/Мс)	k_d (1/с)	K_D (М)	tl/2 (мин)
H4H11683N	228	403	3,86Е+05	2,47Е-04	6,40Е-10	47
Н4Н12171Р	51	17	4,60Е+04	2,26Е-04	4,92Е-09	51
Н4Н12161Р	38	45	6,ЗЗЕ+04	2,48Е-05	3,92Е-10	465
Н4Н12176Р2	50	69	1,82Е+05	5,88Е-05	3,22Е-10	196
Н4Н12163Р	50	98	3,11Е+05	7,75Е-04	2,49Е-09	15

- 39 039858

Н4Н12167Р	52	111	4,19Е+05	1,32Е-04	3,15Е-10	88
Н4Н12175Р	51	59	6,42Е+04	1,65Е-03	2,57Е-08	7
Н4Н12159Р	53	116	3,54Е+05	4,69Е-05	1,ЗЗЕ-10	246
Н4Н12164Р	51	66	1,27Е+05	1,53Е-03	1,20Е-08	8
Н4Н12168Р	50	86	1,73Е+05	1,14Е-04	6,60Е-10	101
Н4Н12169Р	51	22	1,64Е+05	4,55Е-03	2,78Е-08	3
H4H11686N	196	247	1,57Е+05	4,89Е-04	3,11Е-09	24
Н4Н12170Р	51	92	2,62Е+05	5,21Е-05	1,99Е-10	222
Н4Н12177Р2	47	32	4,62Е+04	9,92Е-04	2,15Е-08	12
Н4Н12183Р2	47	23	4,88Е+04	4,94Е-04	1,01Е-08	23
Н4Н12166Р	52	90	2,05Е+05	1,06Е-03	5,15Е-09	11
Н4Н12166Р2	53	71	3,00Е+05	3,16Е-03	1,05Е-08	4
Н4Н12166РЗ	59	72	1,68Е+05	4,47Е-03	2,66Е-08	3
Н4Н12166Р4	49	69	2,10Е+05	1,78Е-03	8,50Е-09	6
Н4Н12166Р5	59	56	1,44Е+05	3,46Е-03	2,40Е-08	3
Н4Н12166Р6	64	94	2,39Е+05	2,66Е-03	1,11Е-08	4
Н4Н12166Р7	50	36	1,36Е+05	6,ЗЗЕ-ОЗ	4,65Е-08	2
Н4Н12166Р8	50	47	2,31Е+05	4,99Е-03	2,16Е-08	2
Н4Н12166Р9	52	55	1,70Е+05	3,18Е-03	1,87Е-08	4
Н4Н12166Р1 0	49	15	9,56Е+04	6,16Е-03	6,44Е-08	2
объект сравнения 1*	228	11	N/A	N/A	3,11Е-07	N/A

N/A - не доступно;

*SS - анализ устойчивого состояния.

Таблица 6

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 обезьяны-mmh при 37°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 обезьяныmmh связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	t_1/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	192	303	5,35Е+05	1,15Е-03	2,16Е-09	10
Н4Н12171Р	59	78	5,56Е+05	1,03Е-03	1,85Е-09	11
Н4Н12161Р	41	53	1,34Е+05	7,45Е-04	5,56Е-09	16
Н4Н12176Р2	36	47	1,35Е+05	1,29Е-03	9,60Е-09	9
Н4Н12163Р	64	129	3,90Е+05	1,25Е-03	3,20Е-09	9
Н4Н12167Р	74	146	5,37Е+05	2,89Е-04	5,39Е-10	40
Н4Н12175Р	74	74	1,77Е+05	2,76Е-03	1,56Е-08	4
Н4Н12159Р	70	137	4,12Е+05	5,50Е-05	1,ЗЗЕ-10	210
Н4Н12164Р	65	99	1,86Е+05	1,17Е-03	6,ЗОЕ-09	10

- 40 039858

Н4Н12168Р	34	29	5,ЗЗЕ+04	6,76Е-04	1,27Е-08	17
Н4Н12169Р	59	64	2,51Е+05	3,61Е-03	1,43Е-08	3
H4H11686N	145	195	2,ЗЗЕ+05	2,07Е-03	8,88Е-09	6
Н4Н12170Р	34	60	5,21Е+05	8,71Е-04	1,67Е-09	13
Н4Н12177Р2	41	27	1,50Е+05	7,17Е-03	4,77Е-08	2
Н4Н12183Р2	28	13	5,40Е+04	6,37Е-03	1,18Е-07	2
Н4Н12166Р	68	110	2,19Е+05	1,87Е-03	8,55Е-09	6
Н4Н12166Р2	68	83	3,93Е+05	2,97Е-03	7,56Е-09	4
Н4Н12166РЗ	85	92	2,23Е+05	2,92Е-03	1,31Е-08	4
Н4Н12166Р4	62	80	2,23Е+05	1,83Е-03	8,20Е-09	6
Н4Н12166Р5	75	70	1,50Е+05	3,13Е-03	2,09Е-08	4
Н4Н12166Р6	90	112	2,53Е+05	2,32Е-03	9,18Е-09	5
Н4Н12166Р7	63	48	1,25Е+05	2,41Е-03	1,93Е-08	5
Н4Н12166Р8	64	53	2,03Е+05	2,69Е-03	1,ЗЗЕ-08	4
Н4Н12166Р9	75	69	1,81Е+05	2,61Е-03	1,44Е-08	4
Н4Н12166Р1 0	63	24	6,60Е+04	2,79Е-03	4,22Е-08	4
объект сравнения 1	132	4	NB	NB	NB	NB

Связывание С5 человека R885H-mmh и С5 человека R885C-mmh с антителами против С5 при 25°С представлено в табл. 7 и 8 соответственно.

Таблица 7

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885H-mmh при 25°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека R885H-mmh связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	%/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	183	118	5,26Е+05	2,46Е-04	4,68Е-10	47
Н4Н12171Р	119	51	6,59Е+05	1,42Е-04	2,16Е-10	81
Н4Н12161Р	105	199	8,36Е+04	8,32Е-05	9,96Е-10	139
Н4Н12176Р 2	170	65	1,78Е+05	2,17Е-04	1,22Е-09	53
Н4Н12163Р	111	214	6,72Е+05	4,34Е-04	6,46Е-10	27
Н4Н12167Р	93	187	6,89Е+05	2,98Е-04	4,ЗЗЕ-10	39
Н4Н12175Р	104	207	1,81Е+05	1,98Е-03	1,09Е-08	6
Н4Н12159Р	101	177	7,06Е+05	1,76Е-04	2,50Е-10	66
Н4Н12164Р	143	295	1,58Е+05	1,87Е-04	1,19Е-09	62
Н4Н12168Р	138	197	5,29Е+04	2,14Е-04	4,05Е-09	54
Н4Н12169Р	116	173	4,84Е+05	7,09Е-05	1,47Е-10	163
H4H11686N	145	259	2,16Е+05	1,06Е-04	4,91Е-10	109
Н4Н12170Р	244	442	4,09Е+05	1,61Е-04	3,94Е-10	72
Н4Н12177Р	137	232	1,48Е+05	5,92Е-04	4,01Е-09	20
Н4Н12183Р	158	99	3,77Е+04	4,37Е-05	1,16Е-09	264
Н4Н12166Р	188	366	5,28Е+05	2,12Е-04	4,02Е-10	54
объект сравнения 1	87	11	NB	NB	NB	NB
объект сравнения 2	118	249	1,08Е+06	6,53Е-04	6,06Е-10	18

Таблица 8

- 41 039858

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885C-mmh при 25°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека R885C-mmh связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	t_1/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	174	116	4,99Е+05	2,39Е-04	4,79Е-10	48
Н4Н12171Р	109	51	3,79Е+05	1,39Е-04	3,66Е-10	83
Н4Н12161Р	103	147	1,30Е+05	8,71Е-05	6,72Е-10	133
Н4Н12176Р 2	164	63	1,07Е+05	2,18Е-04	2,03Е-09	53
Н4Н12163Р	110	211	5,04Е+05	4,32Е-04	8,58Е-10	27
Н4Н12167Р	85	163	7,11Е+05	2,94Е-04	4,13Е-10	39
Н4Н12175Р	99	128	8,18Е+04	1,55Е-02	1,90Е-07	1
Н4Н12159Р	93	168	5,86Е+05	1,69Е-04	2,89Е-10	68
Н4Н12164Р	139	249	1,53Е+05	1,82Е-04	1,19Е-09	63
Н4Н12168Р	128	144	6,09Е+04	1,99Е-04	3,27Е-09	58
Н4Н12169Р	108	168	2,78Е+05	6,99Е-05	2,51Е-10	165
H4H11686N	143	253	1,78Е+05	9,49Е-05	5,34Е-10	122
Н4Н12170Р	244	427	3,57Е+05	1,60Е-04	4,47Е-10	72
Н4Н12177Р 2	138	177	1,00Е+05	1,32Е-03	1,32Е-08	9
Н4Н12183Р 2	158	80	2,99Е+04	2,20Е-05	7,37Е-10	525
Н4Н12166Р	188	356	4,26Е+05	2,07Е-04	4,87Е-10	56
объект сравнения 1	87	9	NB	NB	NB	NB
объект сравнения 2	117	241	1,17Е+06	6,19Е-04	5,ЗОЕ-10	19

Связывание С5 человека R885H-mmh и С5 человека R885C-mmh с антителами против С5 при 37°С представлено в табл. 9 и 10 соответственно.

- 42 039858

Таблица 9

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885H-mmh при 37°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека R885H-mmh	к_а	k_d	K_D	tl/2
Связанн. (RU)	(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	49	81	5,48Е+05	1,47Е-03	2,69Е-09	8
Н4Н12171Р	59	80	5,92Е+05	9,63Е-04	1,63Е-09	12
Н4Н12161Р	41	54	1,18Е+05	9,25Е-04	7,84Е-09	12
Н4Н12176Р 2	45	69	2,57Е+05	9,58Е-04	3,73Е-09	12
Н4Н12163Р	60	85	7,24Е+05	2,90Е-03	4,00Е-09	4
Н4Н12167Р	38	65	8,81Е+05	2,57Е-03	2,91Е-09	5
Н4Н12175Р	25	30	1,37Е+05	9,50Е-03	6,94Е-08	1
Н4Н12159Р	51	82	6,38Е+05	9,48Е-04	1,49Е-09	12
Н4Н12164Р	59	68	1,95Е+05	1,06Е-03	5,46Е-09	11
Н4Н12168Р	34	29	2,43Е+04	1,23Е-03	5,04Е-08	9
Н4Н12169Р	61	79	4,29Е+05	7,39Е-04	1,72Е-09	16
H4H11686N	40	74	4,19Е+05	8,00Е-04	1,91Е-09	14
Н4Н12170Р	36	64	5,59Е+05	8,39Е-04	1,50Е-09	14
Н4Н12177Р 2	45	51	2,76Е+05	2,76Е-03	1,00Е-08	4
Н4Н12183Р 2	33	36	9,58Е+04	7,12Е-04	7,43Е-09	16
Н4Н12166Р	71	58	6,24Е+05	1,31Е-03	2,09Е-09	9
объект сравнения 1	41	5	NB	NB	NB	NB
объект сравнения	23	47	8,39Е+05	1,05Е-03	1,25Е-09	11
2

- 43 039858

Таблица 10

Кинетические параметры связывания для связывания моноклональных антител против С5 с С5 человека R885C-mmh при 37°С

Антитело	Количество захваченног о антитела (RU)	100 нМ С5 человека R8 8 5C-mmh связанн. (RU)	к_а	k_d	K_D	tl/2
(1/Мс)	(1/с)	(М)	(мин)
H4H11683N	48	78	4,38Е+05	1,43Е-03	3,25Е-09	8
Н4Н12171Р	59	78	4,77Е+05	9,57Е-04	2,01Е-09	12
Н4Н12161Р	41	49	1,10Е+05	9,01Е-04	8,17Е-09	13
Н4Н12176Р 2	44	55	1,41Е+05	1,03Е-03	7,32Е-09	11
Н4Н12163Р	59	83	5,66Е+05	2,81Е-03	4,97Е-09	4
Н4Н12167Р	38	64	6,84Е+05	2,49Е-03	3,64Е-09	5
Н4Н12175Р	25	4	1,12Е+05	1,79Е-02	1,59Е-07	1
Н4Н12159Р	51	68	5,61Е+05	9,75Е-04	1,74Е-09	12
Н4Н12164Р	59	64	1,77Е+05	1,04Е-03	5,85Е-09	11
Н4Н12168Р	34	21	6,38Е+04	5,69Е-04	8,90Е-09	20
Н4Н12169Р	61	75	3,29Е+05	7,37Е-04	2,24Е-09	16
H4H11686N	39	69	2,84Е+05	7,91Е-04	2,78Е-09	15
Н4Н12170Р	36	61	4,24Е+05	8,70Е-04	2,05Е-09	13
Н4Н12177Р 2	43	31	1,07Е+05	5,07Е-03	4,76Е-08	2
Н4Н12183Р 2	31	25	5,12Е+04	9,97Е-04	1,95Е-08	12
Н4Н12166Р	72	54	4,91Е+05	1,26Е-03	2,56Е-09	9
объект сравнения 1	41	2	NB	NB	NB	NB
объект сравнения 2	23	42	7,34Е+05	1,07Е-03	1,45Е-09	11

При 25°С все 25 антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека со значениями KD в диапазоне от 73 пМ до 8,4 нМ, как показано в табл. 3. При 37°С антитела против С5 по изобретению связывались с С5 человека со значениями K_D в диапазоне от 103 пМ до 18,5 нМ, как показано в табл. 4. При 25°С 25 из 25 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 обезьяны-mmh со значениями KD в диапазоне от 133 пМ до 64 нМ, как показано в табл.5. При 37°С 25 из 25 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 обезьяны-mmh со значениями KD в диапазоне от 133 пМ до 118 нМ, как показано в табл.6. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885H-mmh со значениями KD в диапазоне от 147 пМ до 10,9 нМ, как показано в табл. 7. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885C-mmh со значениями KD в диапазоне от 251 пМ до 190 нМ, как показано в табл. 8. При 37°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885Hmmh со значениями KD в диапазоне от 1,49 до 69,4 нМ, как показано в табл. 9. При 25°С 16 из 16 тестированных антител против С5 по изобретению связывались с С5 человека R885C-mmh со значениями KD в диапазоне от 1,74 до 159 нМ, как показано в табл. 10.

Пример 4. Связывание антител с С5 при различных рН.

Эффект рН, оказываемый на скорость диссоциации рекомбинантного С5 человека, связанного с очищенными моноклональными антителами против С5, определяли с использованием биосенсора поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени на приборе Biacore T200. Поверхность датчика Biacore сначала дериватизировали посредством аминного связывания с моноклональным антителом мыши против Fc человека (GE, № BR-1008-39) для того, чтобы захватывать моноклональные антитела против С5, экспрессируемые с Fc IgG4 человека. Все исследования связывания Biacore осуществляли с использованием двух подвижных буферов PBS-T рН 7,4 (0,01 М Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. Tween-20, рН корректировали до 7,4) и PBS-T рН 6,0 (0,01 М Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. Tween-20, рН корректировали до 6,0). Различные концентрации С5 человека (EMD, № по каталогу 204888) или С5 обезьяны.mmh (полученного в PBS-T рН 7,4 подвижном буфере) в диапа

- 44 039858 зоне от 100 до 11,11 нМ, 3-кратные разведения впрыскивали на поверхность с захваченным моноклональным антителом против С5 в течение 3 мин при скорости потока 50 мкл/мин и осуществляли мониторинг их диссоциации в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 в течение 6 мин. Все эксперименты по кинетике связывания осуществляли при 25 и 37°С. Кинетическую константу диссоциации (kd) определяли посредством аппроксимации сенсограмм реального времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения аппроксимации кривых Scrubber 2.0с. Диссоциационное время полужизни (t_1/2) при связывании вычисляли по kd как:

t1/2(MHH) = ln(2)/60xkd.

Соотношения времени полужизни для связывания С5 человека с различными моноклональными антителами против С5 при 25 и 37°С в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 представлены в табл. 11 и 12.

Таблица 11

Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 человека при 25°С

Захваченное	Соотношение ti_/2
mAb	pH 7,4/рН 6,0
Н4Н12169Р	IC
Н4Н12176Р2	IC
Н4Н12161Р	IC
Н4Н12159Р	< 0,3
Н4Н12170Р	< 0,5
Н4Н12166Р	4,5
Н4Н12183Р2	IC
Н4Н12167Р	0, 6
Н4Н12164Р	0,3
Н4Н12163Р	1,2
Н4Н12175Р	0, 9
Н4Н12177Р2	< 0,5
Н4Н12171Р	0, 6
Н4Н12168Р	1,5
Н4Н12166Р2	9, 3
Н4Н12166РЗ	7,9
Н4Н12166Р4	7,8
Н4Н12166Р5	8,3
Н4Н12166Р6	7, 8
Н4Н12166Р7	35
Н4Н12166Р8	47
Н4Н12166Р9	31
Н4Н12166Р10	33
H4H11683N	2
H4H11686N	2

IC - неубедительно.

- 45 039858

Таблица 12 Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 человека при 37 °С

Захваченное mAb	Соотношение ti_/2
pH 7,4/рН 6,0
Н4Н12169Р	IC
Н4Н12176Р2	< 0,4
Н4Н12161Р	< 0,7
Н4Н12159Р	< 0,2
Н4Н12170Р	< 0,2
Н4Н12166Р	3, 8
Н4Н12183Р2	IC
Н4Н12167Р	0,2
Н4Н12164Р	<0,1
Н4Н12163Р	0, 8
Н4Н12175Р	0, 9
Н4Н12177Р2	1,3
Н4Н12171Р	3,7
Н4Н12168Р	1
Н4Н12166Р2	7,3
Н4Н12166РЗ	6, 6
Н4Н12166Р4	7, 6
Н4Н12166Р5	7, 6
Н4Н12166Р6	8,2
Н4Н12166Р7	21
Н4Н12166Р8	36
Н4Н12166Р9	28
Н4Н12166Р10	19
H4H11683N	1,4
H4H11686N	0, 8

IC - неубедительно.

Соотношения времени полужизни для связывания С5 обезьяны с различными моноклональными антителами против С5 при 25 и 37°С в двух подвижных буферах PBS-T рН 7,4 и PBS-T рН 6,0 представлены в табл. 13 и 14.

- 46 039858

Таблица 13

Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 обезьяны при 25°С______

Захваченное mAb	Соотношение ti/₂
pH 7,4/рН 6,0
Н4Н12169Р	3,4
Н4Н12176Р2	> 9, 1
Н4Н12161Р	IC
Н4Н12159Р	1,2
Н4Н12170Р	> 1,7
Н4Н12166Р	18,5
Н4Н12183Р2	5, 8
Н4Н12167Р	9, 2
Н4Н12164Р	2,9
Н4Н12163Р	9, 7
Н4Н12175Р	3, 6
Н4Н12177Р2	3,7
Н4Н12171Р	2,1
Н4Н12168Р	3, 8
H4H11683N	0,34
H4H11686N	0,37

IC - неубедительно.

Таблица 14

Соотношения времени полужизни выбранных антител против С5 для С5 обезьяны при 37°С

Захваченное	Соотношение ti/₂
mAb	pH 7,4/рН 6, 0
Н4Н12169Р	2
Н4Н12176Р2	2,8
Н4Н12161Р	10, 7
Н4Н12159Р	6, 3
Н4Н12170Р	4,7
Н4Н12166Р	7,1
Н4Н12183Р2	2,4
Н4Н12167Р	4,4
Н4Н12164Р	1,1
Н4Н12163Р	3,3
Н4Н12175Р	0,4
Н4Н12177Р2	1,5
Н4Н12171Р	4,7
Н4Н12168Р	4
H4H11683N	0,7
H4H11686N	0,5

IC - неубедительно.

Как показано в табл. 11-14, выбранные антитела против С5 демонстрировали рН-зависимое связывание, как видно по соотношениям t_1/2.

- 47 039858

Пример 5. Перекрестная конкуренция Octet между антителами против С5.

Конкуренцию связывания между моноклональными антителами против С5 (mAb) определяли с использованием анализа интерферометрии биослоев без метки в реальном времени на биосенсоре Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Весь эксперимент осуществляли при 25°С в 0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,05% об./об. поверхностно-активного средства Tween-20, 0,1 мг/мл BSA (буфер Octet HBS-P) при встряхивании пластины на скорости 1000 об./мин. Для того чтобы оценивать, способны ли два антитела конкурировать друг с другом за связывание с соответствующими им эпитопами на С5 человека (hC5, очищенный от плазмы, EMD), приблизительно 1,5 нм mAb против С5 человека сначала захватывали на кончиках биосенсора Octet, покрытых антителом против hFc (Pall ForteBio Corp., № 18-5060), посредством погружения кончиков на 3 мин в лунки, содержащие раствор mAb против С5 человека 50 мкг/мл (далее обозначают как mAb1). Затем кончики биосенсора с захваченными антителами насыщали блокирующим Н4Н изотипическим контрольным mAb (далее обозначают как блокирующее mAb) посредством погружения в лунки, содержащие раствор блокирующего mAb 200 мкг/мл на 4 мин. Затем кончики биосенсора погружали в лунки, содержащие со-комплексный раствор 50 нМ hC5 и 1 мкМ второго mAb против С5 человека (далее обозначают как mAb2), который предварительно инкубировали в течение 2 ч, на 4 мин. Кончики биосенсора промывали в буфере Octet HBS-P между всеми стадиями эксперимента. Мониторинг ответа связывания в реальном времени осуществляли во время хода эксперимента и регистрировали ответ связывания в конце каждой стадии. Ответ связывания С5 человека, предварительно образовавшего комплекс с mAb2, на mAb1 корректировали по фоновому связыванию, сравнивали и определяли конкурентное/неконкурентное поведение различных моноклональных антител против С5.

В табл. 15 в явной форме определены зависимости для антител, конкурирующих в обоих направлениях, независимо от порядка связывания.

Таблица 15

Перекрестная конкуренция между парами выбранных антител против С5

Первое mAb (mAbl), с использованием АНС Octet	захваченное биосенсоров	Антитела тАЬ2, для которых показана конкуренция с mAbl
Н4Н12183Р2	Н4Н12167Р; Н4Н12163Р	Н4Н12166Р;
Н4Н12167Р	Н4Н12183Р2; Н4Н12163Р	Н4Н12166Р;
Н4Н12166Р	Н4Н12183Р2; Н4Н12163Р	Н4Н12167Р;
Н4Н12163Р	Н4Н12183Р2; Н4Н12166Р	Н4Н12167Р;
Н4Н12159Р	Н4Н12169Р;	H4H11683N;
	Н4Н12170Р
Н4Н12169Р	Н4Н12159Р; Н4Н12170Р	H4H11683N;
H4H11683N	Н4Н12159Р; Н4Н12170Р	Н4Н12169Р;
Н4Н12170Р	Н4Н12159Р; H4H11683N	Н4Н12169Р;
Н4Н12175Р	Н4Н12177Р2
Н4Н12177Р2	Н4Н12175Р
Н4Н12176Р2	Н4Н12164Р
Н4Н12164Р	Н4Н12176Р2
Н4Н12168Р	нет
Н4Н12161Р	нет
H4H11686N	нет

Пример 6. Ингибирование С5-опосредованной комплемент-зависимой цитотоксичности в биоанализе В-клеток.

В этом примере описан биоанализ для того, чтобы тестировать роль С5 с использованием антитела против CD20 в классическом пути комплемента. Показано, что терапевтические антитела против CD20 к

- 48 039858 специфическому антигену CD20 клеточной поверхности В-клеток ведут к CDC в В-клетках (Glennie et al. 2007, Mol. Immunol. 44:3823-3837), и ранее описан CDC анализ с использованием клеточных линий, экспрессирующих CD20 (Flieger et al. 2000, Cell. Immunol. 204:55-63). Клетки Daudi, В-клеточную линию человека, экспрессирующую CD20, сыворотку с сохраненным комплементом или истощенную по С5 сыворотку с экзогенными вариантами С5 и антитело против CD20 (антитело, содержащее VH/VL из 2F2 из патента США № 8529902) использовали для того, чтобы оценивать роль активности С5 в CDC.

В биоанализе CDC для С5 клетки Daudi высевали в 96-луночные аналитические планшеты по 10000 клеток/лунка или в RPMI, содержащей 10% FBS, пенициллин/стрептомицин, L-глутамин, пируват натрия и заменимые аминокислоты (полная среда RPMI), или в RPMI, содержащей 1% BSA, пенициллин/стрептомицин и L-глутамин (RPMI/BSA). Все анализы с тестированием мутированных антител против hC5, наряду с тестированием не мутированных антител с С5-содержащей сывороткой человека, проводили в полной среде RPMI, тогда как анализы с тестированием не мутированных антител с сывороткой африканской зеленой мартышки и вариантами С5 человека проводили в среде RPMI/BSA. Для того чтобы измерять CDC с использованием сыворотки человека или обезьяны, антитело против CD20 разводили 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело) и инкубировали с клетками в течение 10 мин при 25°С, после чего следовало добавление 1,66% сыворотки или 1,66% истощенной по С5 сыворотки и 6,6 нМ вариантов С5 белка. Количество белка С5, добавляемое в истощенную по С5 сыворотку, основано на приводимом значении концентрации С5 в сыворотке человека 0,37 мкМ (Rawal et al. 2008, J. Biol. Chem. 283:7853-7863). Для того чтобы тестировать ингибирование CDC антителом к С5, антитела к С5 разводили 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело) и инкубировали с 1,66% сывороткой или 1,66% истощенной по С5 сывороткой и 6,6 нМ вариантов С5 белка в течение 30 мин. За 10 мин перед добавлением антител с сывороткой к клеткам антитело против CD20 добавляли к клеткам по 1, 2, 3, 3,5, 7, 10 или 30 нМ. По окончании инкубации с антителом против CD20 смесь антитело/сыворотка добавляли к клеткам. Цитотоксичность измеряли после 3,5 ч инкубации при 37°С и в 5% СО₂, после чего следовало 15 мин инкубации при 25°С и добавление реактива CytoTox-Glo™ (Promega, № G9292). CytoTox-Glo™ представляет собой люминесцентный реактив, который измеряет гибель клеток так, что увеличенную люминесценцию наблюдают при увеличенной цитотоксичности (измеряют в относительных световых единицах, RLU). Клетки без обработки в контрольных лунках лизировали посредством обработки дигитонином непосредственно после добавления реактива CytoTox-Glo™ для того, чтобы определять максимальную гибель клеток. Люминесценцию в планшетах считывали с помощью прибора Victor X (Perkin Elmer) через 15 мин после добавления CytoTox-Glo™. Процентную долю цитотоксичности вычисляли с использованием значений RLU, используя следующее уравнение:

% цитотоксичности=100 х (экспериментальный лизис клеток фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)

В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой люминесценцию клеток, которые обрабатывали только средами и сывороткой без какого-либо антитела против CD20, а максимальный лизис клеток представляет собой люминесценцию клеток, которые обрабатывали дигитонином. Результаты, выраженные в виде % цитотоксичности или RLU, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad), чтобы получать значения ЕС₅₀ и IC₅₀. Ингибирование для антител вычисляли так, что ингибирование от 0 до 100% представляет собой диапазон ингибирования от концентрации антитела против CD20, используемого в анализе, без ингибитора до 0 нМ антитела против CD20.

Результаты.

Всего 25 антител против С5 человека, 16 не мутированных и 9 мутированных тестировали на их способность ингибировать С5 в CDC анализе с использованием клеток Daudi с антителом против CD20 и сывороток человека (с нормальным hC5 или вариантами С5) или сывороток африканской зеленой мартышки. Различные остатки в определяющих комплементарность областях (CDR) из Н4Н12166Р мутировали в гистидины для того, чтобы создавать 9 мутированных антител, Н4Н12166Р2-Н4Н12166Р10. Показано, что гистидиновые мутации в CDR придают зависимость от рН связыванию с целевым антигеном, что ведет к усовершенствованной фармакокинетике (Igawa et al. 2010, Nat. Biotechnol. 28:1203-1207).

- 49 039858

Таблица 16

Ингибирование CDC не мутированным антителом против hC5 с использованием 1,66% сыворотки и антитела против CD20 в клетках Daudi

Сыворотка	Человек	Человек	Африканская зеленая мартышка	Истощенная по С5 человека и	Истощенная по С5 яеловека и
ЕС₅₀ [М] антитела против CD20 (с 1,66% сывороткой ) Постоянное антитело против CD20 (с 1,66% сывороткой ) Антитело H4H11683N H4H11686N Н4Н12159Р Н4Н12161Р Н4Н12163Р Н4Н12164Р Н4Н12166Р Н4Н12167Р	1,0Е-09 1 нМ 1С₅₀ [М] Не тестировали Не тестировали 3,2Е-09 2,4Е-09 3,4Е-09 2,4Е-09 2,6Е-09 2,5Е-09	1,4Е-09 1,2Е-09 1,5Е-09 Не тестировали Не тестировали Не тестировали Не тестировали Не тестировали Не тестировали	2,4Е-09 3 нМ 1С₅₀ [М] (макс. % ингибирован ия) * 4,0Е-09 4,4Е-09 3,4Е-09 2,6Е-09 3,7Е-09 5,8Е-09 4,5Е-09 3,5Е-09	6, 6 нМ варианта С5 R885H 1,9Е-09 3,5 нМ 1С₅₀ [М] 1,ЗЕ-09 1,1Е-09 1,4Е-09 1,8Е-09 2,1Е-09 1,8Е-09 1,ЗЕ-09 1,9Е-09	6, 6 нМ варианта С5 R885C 2,7Е-09 3 0 нМ 1С₅₀ [М] (макс. % ингибирован ия) * 9,0Е-10 4,5Е-10 1,0Е-09 1,0Е-09 1,1Е-09 8,2Е-10 4,6Е-10 1,0Е-09
Н4Н12168Р	1,5Е-09	Не тестировали	2,0Е-09	2,ЗЕ-09	8,6Е-10
Н4Н12169Р	1,7Е-09	Не тестировали	2,9Е-09	1,ЗЕ-09	6,7Е-10
Н4Н12170Р	2,0Е-09	Не	3,7Е-09	4,8Е-10	4,ЗЕ-10

- 50 039858

		тестировали
Н4Н12171Р	1,9Е-09	Не тестировали	3,ЗЕ-09	1,6Е-09	6,5Е-10
Н4Н12175Р	2,2Е-09	Не тестировали	5,2Е-09	4,2Е-09	>2,0Е-08 (67%)
Н4Н12176Р2	2,7Е-09	Не тестировали	3,5Е-09	2,1Е-09	1,ЗЕ-09
Н4Н12177Р2	2,2Е-09	Не тестировали	6,1Е-09	2,4Е-09	1,6Е-09
Н4Н12183Р2	1,7Е-09	Не тестировали	1,4Е-08	1,2Е-09	4,5Е-10
объект сравнения 1	2,ЗЕ-09	1,8Е-09	>9,0Е-08 (49%)	Без ингибирован ия	Без ингибирован ия
Контрольно е mAb 1	Без ингибирован ИЯ	Без ингибирован ИЯ	Не тестировали	Не тестировали	Не тестировали
Контрольно е mAb 2	Не тестировали	Не тестировали	Без ингибирован ИЯ	Без ингибирован ия	Без ингибирован ия

*Если не указано иное, везде ингибирование составляет ~100%.

Как показано в табл. 16 и 17, все 25 антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5, присутствующим в 1,66% сыворотке человека. IC₅₀ для не мутированных антител находились в диапазоне от 1,2 до 3,4 нМ. IC₅₀ мутированных антител находились в диапазоне от 3,0 до 12 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC₅₀2,6 и 2,9 нМ.

Таблица 17

Ингибирование CDC мутированным антителом против hC5 с использованием 1,66% сыворотки и антитела против CD20 в клетках Daudi

Сыворотка	Человек	Африканская зеленая мартышка	Истощенная по С5 человека и 6, 6 нМ варианта С5 R885H	Истощенная по С5 человека и 6, 6 нМ варианта С5 R885C
ЕС₅₀ [М] антитела против CD20 (с 1,66%	1,9Е-09	2,6Е-09	6,ЗЕ-09	9,5Е-09

- 51 039858

сывороткой)
Постоянное антитело против CD20 (с 1,66% сывороткой)	2 нМ	10 нМ	7 нМ	30 нМ
Антитело	1С₅₀ [М]	1С₅₀ [М] (макс. % ингибирования ) *	1С₅₀ [М]	1С₅₀ [М]
Н4Н12166Р	2,9Е-09	5,6Е-09	1,ЗЕ-09	7,6Е-10
Н4Н12166Р2	3,7Е-09	9,7Е-09	1,7Е-09	1,2Е-09
Н4Н12166РЗ	7,8Е-09	>3,0Е-08 (64%)	2,9Е-09	1,7Е-09
Н4Н12166Р4	3,5Е-09	7,9Е-09	1,5Е-09	9,6Е-10
Н4Н12166Р5	4,9Е-09	>3,0Е-08 (75%)	2,1Е-09	1,4Е-09
Н4Н12166Р6	3,0Е-09	9,9Е-09	1,ЗЕ-09	7,9Е-10
Н4Н12166Р7	7,ЗЕ-09	>6,0Е-08 (61%)	4,2Е-09	2,ЗЕ-09
Н4Н12166Р8	4,1Е-09	>2,0Е-08 (79%)	2,1Е-09	1,2Е-09
Н4Н12166Р9	3,9Е-09	>1,0Е-08 (85%)	1,7Е-09	7,7Е-10
Н4Н12166Р10	1,2Е-08	>1,0Е-07 (34%)	7,0Е-09	3,5Е-09
объект сравнения 1	2,7Е-09	>1,0Е-07 (35%)	Без ингибирования	Без ингибирования
Контрольное mAb 2	Без ингибирования	Без ингибирования	Без ингибирования	Без ингибирования

не мутированных антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5 африканской зеленой мартышки, с IC₅₀ в диапазоне от 2,0 до 14 нМ.

из 9 мутированных антител демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной С5 африканской зеленой мартышки, с IC₅₀ в диапазоне от 7,1 до 9,9 нМ. Остальные 6 мутированных антител являются блокаторами с IC₅₀ больше 10 нМ и максимальным ингибированием (при 100 нМ антитела) в диапазоне от 34 до 85%. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC₅₀ 4,5 и 5,6 нМ.

Для того чтобы тестировать, ингибируют ли антитела против hC5, варианты С5 человека, R885H и R885C, истощенную по С5 сыворотку человека тестировали с 6,6 нМ каждого варианта С5. Все 25 антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованное вариантом С5 R885H, с IC₅₀ для не мутированных антител в диапазоне от 0,48 до 4,2 нМ, тогда как IC₅₀ для мутированных антител находились в диапазоне от 1,3 до 7,0 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC₅₀ 1/3 и 1,3 нМ.

из 16 не мутированных антител против hC5 демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной вариантом С5 R885C, с IC₅₀ в диапазоне от 0,43 до 1,6 нМ. Одно не мутированное антитело демонстрировало слабое ингибирование CDC с максимальным ингибированием 67% (при 100 нМ антитела) и IC₅₀>20 нМ. Все 9 мутированных антител демонстрировали полное ингибирование CDC, опосредованной вариантом С5 R885C, с IC₅₀ в диапазоне от 0,77 до 3,5 нМ. Родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р давало полное ингибирование с IC₅₀ 0,46 и 0,76 нМ.

Антитело против CD20 демонстрировало CDC клеток Daudi с 1,66% сывороткой с ЕС₅₀ 1,0, 1,4 и 1,9 нМ для сыворотки человека, 2,4 и 2,6 нМ для сыворотки африканской зеленой мартышки, 1,9 и 6,3 нМ для истощенной по hC5 сыворотки с вариантом hC5 R885H и 2,7 и 9,5 нМ для истощенной по hC5 сыворотки с вариантом hC5 R885C. Ни одно из нерелевантных контрольных антител IgG, контрольного mAb1 и контрольного mAb2, не демонстрировало какое-либо ингибирование CDC.

Пример 7. Ингибирование активности С5а, как определяют посредством люциферазного анализа.

В этом примере описан анализ для тестирования активации С5а через один из его рецепторов, C5aR1. C5aR1 представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR) и может инициировать различные сопряженные с GPCR пути передачи сигнала (Monk et al. 2007, Br. J. Pharmacol. 152:429-448).

- 52 039858

Создан биоанализ с использованием клеток HEK293, стабильно трансфицированных C5aR1 человека (№ доступа NP 001727.1) и G16 человека (№ доступа NP_002059.3) наряду с люциферазным репортером [отвечающий элемент NFAT (4X)-люцифераза]. Ga 16 представляет собой относительно неразборчивый G белок, который может связываться с GPCR различных типов, что ведет к активации PLC-β и последующему повышению Са⁺⁺, который, в свою очередь, активирует транслокацию NFAT и транскрипцию репортерного гена (Kostenis et al. 2005, Trends Pharmacol. Sci. 26:595-602). Результирующая клеточная линия HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc выделена и поддерживается в 10% DMEM, содержащей 10% FBS, NEAA, пенициллин/стрептомицин, 500 мкг/мл G418, 100 мкг/мл гигромицина В и 7 мкг/мл бластицидина.

Для люциферазного биоанализа С5а клетки HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc высевали в 96-луночные аналитические планшеты по 20000 клеток/лунка в OPTIMEM (Invitrogen, № 31985-070) с добавлением 0,5% BSA, пенициллина/стрептомицина и L-глутамина и затем инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение ночи. BSA использовали вместо FBS, поскольку показано, что сыворотка расщепляет и инактивирует hC5a (Klos et al., 2013, Pharmacol. Rev. 65:500-543). На следующее утро hC5a титровали от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий hC5a) и добавляли в клетки для того, чтобы определять дозозависимую кривую титрования для клеточной линии. Для того чтобы тестировать ингибирование hC5a антителом к hC5a, 500 пМ hC5a добавляли к клеткам. Непосредственно после этого антитела, разведенные 1:3 от 100 нМ до 2 пМ (включая контрольный образец, не содержащий антитело), добавляли к клеткам. Клетки инкубировали в течение 5,5 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Люциферазную активность обнаруживали после инкубации с реактивом OneGlo™ (Promega, № E6051). OneGlo™ представляет собой люминесцентный реактив, которым измеряют количество люциферазы, присутствующей в клетках. В этом анализе увеличенная активация hC5a ведет к увеличенному образованию люциферазы и люминесценции (измеряют в относительных световых единицах, RLU). Измерение люминесценции осуществляли с использованием прибора Victor X (Perkin Elmer). Результаты анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad), чтобы получать значения ЕС₅₀ и IC₅₀. Ингибирование антител вычисляли так, что ингибирование от 0 до 100% представляет собой диапазон ингибирования от 500 пМ hC5a без ингибитора до 0 нМ hC5a.

Четыре антитела против hC5 тестировали на их способность ингибировать hC5a активацию его рецептора, hC5aR1, посредством измерения степени ингибирования для 500 пМ hC5a активации клеток HEK293/hGal6/hC5aR1/NFAT-luc.

Таблица 18

Ингибирование антителом против hC5 для 500 пМ hC5a в клетках HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc

ЕС₅₀[М] hC5a	3,9E-10
mAb PID или REGN №	Ингибирование для 500 пМ hC5a
IC₅₀ [M]
H2aM11682N	4,6E-10
H2aM11684N	3,5E-11
H2aM11694N	1,4E-10
H2aM11695N	4,2E-11
Контрольное mAb	Без ингибирования

Как показано в табл. 18, все 4 антитела по изобретению демонстрировали полное ингибирование для 500 пМ hC5a с IC₅₀ в диапазоне от 0,035 до 0,46 нМ. Нерелевантное контрольное антитело IgG, контрольное mAb3, не демонстрировало какое-либо ингибирование hC5a. hC5a активировал клетки HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc с ЕС₅₀ 0,39 нМ.

Пример 8. Биоанализ гемолиза.

Анализ классического пути гемолиза (СН) и анализ альтернативного пути гемолиза (АН) разрабатывали для того, чтобы тестировать активность антител.

СН представляет собой скрининговый анализ активации классического пути комплемента, который чувствителен к снижению, отсутствию и/или неактивности любого компонента пути. В СН тестируют функциональную способность сывороточных компонентов классического пути комплемента лизировать красные клетки крови овцы (SRBC), предварительно покрытые антителом кролика против красных клеток крови овцы (гемолизин). Когда покрытые антителом SRBC инкубируют с тестовой сывороткой, активируют классический путь комплемента и результатом является гемолиз. Если компонент комплемента отсутствует, СН уровень будет нулевым; если один или несколько компонентов классического пути снижены, СН будет снижен. (Nilsson et al. 1984, J. Immunol. Meth. 72:49-59). Этот анализ используют для определения характеристик и скрининга высокоаффинных антител против С5 человека.

- 53 039858

Способы.

(А) Анализ гемолиза по классическому пути комплемента.

Желаемое число красных клеток крови овцы (SRBC) промывали в буфере GVB++ и ресуспендировали по 1х10⁹ клеток/мл. Для сенсибилизации SRBC смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизина кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин. Сенсибилизированные клетки SRBC разводили до 2±10⁸ клеток/мл в GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Нормальную сыворотку человека или сыворотку яванского макака разводили до 2 или 10% в буфере GVB++. Для того чтобы тестировать ингибирование опосредованной С5 гемолитической активности, тестовые антитела предварительно инкубировали в течение 20 мин при 4°С в концентрациях в диапазоне от 0,6 до 800 нМ в 2-10% нормальной сыворотке человека или 10% сыворотке яванского макака или сыворотке африканской зеленой мартышки. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл сенсибилизированных RBC овцы (2х10⁸ клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет, после чего следовало добавление 100 мкл соответствующих образцов сыворотки, которые предварительно инкубировали с тестовыми антителами. Клетки аккуратно смешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1250xg и 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации в сыворотке 1-5% для обработок.

Процент гемолиза вычисляли следующим образом:

% гемолиза = 100 х (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).

В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, инкубированных в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad) для получения значений IC₅₀- Данные представляли в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.

(В) Анализ альтернативного комплемента.

Желаемое число красных клеток крови кролика (RbRBC) промывали в буфере GVB-Mg²⁺/EGTA и ресуспендировали по 2х10⁸ клеток/мл. Нормальную сыворотку человека или сыворотку яванского макака разводили до 10% в буфере GVB-Mg²⁺/EGTA. Для того чтобы тестировать ингибирование опосредованной С5 гемолитической активности, антитела в концентрациях в диапазоне от 3 до 800 нМ предварительно инкубировали в течение 20 мин при 4°С в 5-10% нормальной сыворотке человека или сыворотке яванского макака. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл RbRBC (2х10⁸ клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет, после чего следовало добавление 100 мкл 10% нормальной сыворотки человека или сыворотки яванского макака или сыворотки африканской зеленой мартышки, которую предварительно инкубировали с антителами против С5. Клетки мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации клетки осаждали центрифугированием на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96 плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации сыворотки 5% сыворотки.

В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые инкубировали в буфере GVB-Mg/EGTA, не содержащем только сыворотку, или без какого-либо антитела против С5. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от клеток, которые обрабатывали водой. Ингибирование посредством антител против С5 значения IC₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 6 (GraphPad).

Результаты.

(А) Ингибирование гемолиза, опосредованного С5 человека.

Всего 25 антител против С5 человека (hC5), 16 не мутированных и 9 мутированных, тестировали на их способность ингибировать С5 из нормальной сыворотки человека (NHS) в анализе СН50 с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и анализе АН50 с использованием красных клеток крови кролика (RRBC).

- 54 039858

Таблица 19

Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 1 или 5% нормальной сыворотке человека (NHS)

mAb PID	СР человека	АР человека	СР человека	АР человека
1С₅₀ [М]	1С₅₀ [М]	% макс. ингибирования	% макс. ингибирования
Н4Н12183Р2	5,88Е-09	1,60Е-07	99,9%	78,9%
Н4Н12176Р2	4,58Е-09	1,65Е-08	94,1%	69,9%
Н4Н12168Р	3,ЗЗЕ-09	2,85Е-08	97,5%	66,2%
H4H11686N	3,09Е-09	1,ЗОЕ-08	97,4%	76,2%
Н4Н12167Р	3,68Е-09	1,55Е-08	99,9%	64,8%
Н4Н12161Р	2,56Е-09	2,55Е-08	93,7%	56, 1%
Н4Н12163Р	2,72Е-09	2,05Е-08	96, 1%	66, 0%
Н4Н12166Р	2,80Е-09	2,60Е-08	95,0%	70,9%
H4H11683N	2,54Е-09	3,40Е-08	98,1%	73,2%
Н4Н12159Р	2,50Е-09	1,75Е-08	97,9%	73,4%
Н4Н12177Р2	2,34Е-09	1,70Е-08	97,5%	71,0%
Н4Н12170Р	2,39Е-09	1,80Е-08	98,2%	81,1%
Н4Н12175Р	2,36Е-09	2,00Е-08	98,0%	80,2%
Н4Н12171Р	2,ЗЗЕ-09	1,55Е-08	94,9%	42,0%
Н4Н12164Р	2,10Е-09	1,45Е-08	95,9%	69,7%
Н4Н12169Р	2,36Е-09	2,00Е-08	98,3%	44,5%
Изотипический	Нет	Нет	Нет	Нет
контроль	активности	активности	активности	активности

Как показано в табл. 19, 16 антител против hC5 по данному изобретению демонстрировали больше чем 94% ингибирование гемолиза по классическому пути (СР), опосредованному с помощью С5, присутствующего в 1% сыворотке человека. IC₅₀ для антител находились в диапазоне от 2,1 до 5,9 нМ, и процент ингибирования находился в диапазоне 95-99%. Все 16 антител против С5 демонстрировали больше чем 60% ингибирование (за исключением Н4Н12169Р) в анализе гемолиза по альтернативному пути (АР), который опосредован с помощью С5, присутствующего в 5% NHS. IC₅₀ для антител находились в диапазоне от 13 до 160 нМ, и процент ингибирующей активности находился в диапазоне от 44 до 81%.

Таблица 20

Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальной сыворотке человека (NHS)

гпАЬ PID	СР человека	АР человека	СР человека	АР человека
1С₅₀ [М]	1С₅₀ [М]	% макс. ингибирования	% макс. ингибирования
Н4Н12166Р	1,09Е-08	2,09Е-08	99,4%	86, 9%
Н4Н12166Р2	1,59Е-08	4,78Е-08	98,2%	81,3%
Н4Н12166РЗ	1,34Е-08	6,00Е-08	95,9%	78,3%
Н4Н12166Р4	1,32Е-08	3,17Е-08	98,6%	77,0%
Н4Н12166Р5	1,49Е-08	6,55Е-08	97,1%	77,7%
Н4Н12166Р6	1,03Е-08	2,84Е-08	98,1%	82,4%
Н4Н12166Р7	2,43Е-08	1,56Е-07	93,7%	83,2%
Н4Н12166Р8	1,41Е-08	7,ЗОЕ-08	95,7%	73,3%
Н4Н12166Р9	1,16Е-08	5,35Е-08	93,7%	72,2%
Н4Н12166Р10	4,44Е-08	Нет активности	74,0%	Нет активности
Изотипический контроль	Нет активности	Нет активности	Нет активности	Нет активности

Как показано в табл. 20, все 9 мутированных антител против hC5 демонстрировали ингибирование СР и АР гемолитической активности, опосредованной с помощью С5, присутствующего в 5% сыворотке человека. В анализе СР гемолиза родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р демонстрировало больше чем 98% ингибирование с IC₅₀ 10,9 нМ. 8 мутированных антител против hC5 демонстрировали больше чем 90% ингибирование с IC₅₀ в диапазоне от 10,3 до 24,3 нМ. Мутированное антитело против С5 12166Р10 демонстрировало частичное ингибирование 74%. В анализе АР гемолиза родительское не мутированное антитело Н4Н12166Р демонстрировало больше чем 85% ингибирование с IC₅₀ 20,9 нМ.

- 55 039858

Мутированные антитела против hC5 демонстрировали ингибирование в диапазоне 72-83%, и IC₅₀ антител находились в диапазоне от 28 нМ до 0,15 мкМ.

(В) Ингибирование гемолиза, опосредованного С5 обезьяны.

Всего 25 антител против С5 человека (hC5), 16 не мутированных и 9 мутированных, тестировали на их способность ингибировать С5 яванского макака и африканской зеленой мартышки в СН50 анализе с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и АН50 анализе с использованием красных клеток крови кролика (RRBC).

Таблица 21

Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальных сыворотках африканской зеленой мартышки (AGM)

	СР с AGM сывороткой	АР с AGM сывороткой	AGM СР	AGM АР
гпАЬ PID	1С_5О [М]	1С_5О [М]	% макс. ингибирования	% макс. ингибирования
Н4Н12183Р2	Нет активности	Нет активности	Нет активности	Нет активности
Н4Н12176Р2	3,04Е-08	4,77Е-08	91,0%	83,2%
Н4Н12168Р	2,80Е-08	2,25Е-08	90,8%	88,2%
H4H11686N	4,82Е-08	1,63Е-07	49,3%	50,4%
Н4Н12167Р	6,95Е-08	6,95Е-08	90,5%	53,4%
Н4Н12161Р	3,19Е-08	4,75Е-08	78,9%	35,7%
Н4Н12163Р	6,90Е-08	2,16Е-07	83,2%	58,5%
Н4Н12166Р	1,ЗОЕ-07	2,ЗЗЕ-07	81,0%	44,2%
H4H11683N	2,92Е-08	4,08Е-08	81,1%	88,1%
Н4Н12159Р	2,58Е-08	2,70Е-08	93,4%	93,5%
Н4Н12177Р2	1,80Е-07	1,01Е-07	80,6%	8,80%
Н4Н12170Р	2,54Е-08	2,69Е-08	94,9%	90,9%
Н4Н12175Р	1,18Е-07	9,85Е-08	84,5%	17,4%
Н4Н12171Р	Нет активности	2,ЗЗЕ-08	17,8%	69,70%
Н4Н12164Р	2,47Е-07	1,78Е-07	85,8%	15,60%
Н4Н12169Р	3,44Е-08	9,15Е-08	43,3%	45,70%

Как показано в табл. 21, антитела против hC5 демонстрировали различные уровни ингибирования СР или АР гемолитической активности в 5% сыворотках африканской зеленой мартышки. В СР анализе 2 из 16 антител против hC5 не демонстрировали ингибирование гемолитической активности. 14 антител демонстрировали ингибирование в диапазоне 43-94% с IC₅₀ в диапазоне от 25 до 180 нМ. В анализе АР гемолиза 13 из 17 антител демонстрировали ингибирование активность в диапазоне 17-93% с IC₅₀ в диапазоне от 22,5 до 233 нМ.

- 56 039858

Таблица 22

Ингибирование СР и АР активности антителом против hC5 в 5% нормальных сыворотках обезьян Cynomolgus (Cyno)

	СР с сывороткой Супо	АР с сывороткой Супо	Супо СР	Супо АР
mAb PID Н4Н12183Р2 Н4Н12171Р Н4Н12170Р Н4Н12159Р Н4Н12168Р H4H11683N Н4Н12176Р2 Н4Н12161Р Н4Н12169Р H4H11686N Н4Н12163Р Н4Н12167Р Н4Н12175Р Н4Н12166Р Н4Н12177Р2 Н4Н12164Р	1С₅₀ [М] 1,42Е-07 8,70Е-09 8,20Е-09 7,75Е-09 1,03Е-08 9,00Е-09 1,47Е-08 2,79Е-08 1,99Е-08 1,41Е-08 1,65Е-08 2,13Е-08 1,09Е-08 2,01Е-08 1,71Е-08 1,96Е-08	1С₅₀ [М] 2,96Е-08 7,20Е-09 7,00Е-09 7,05Е-09 5,45Е-09 7,15Е-09 7,70Е-09 7,80Е-09 7,95Е-09 9,00Е-09 1,02Е-08 7,60Е-09 8,05Е-09 8,85Е-09 8,80Е-09 9,10Е-09	% макс, ингибирования 64,6% 92,9% 99,0% 99,3% 99,0% 98,8% 97,5% 100,0% 92,8% 94,5% 96, 4% 100,0% 96, 7% 94,2% 94,90% 94,7%	% макс. ингибировани я 100,0% 98,8% 99,2% 99,6% 99,7% 98,9% 99,3% 98,4% 96,30% 98,7% 98,5% 98,30% 98,10% 98,60% 98,10% 98,70%
Изотипически й контроль	Нет активности	Нет активности	Нет активности	Нет активности

Как показано в табл. 22, антитела против hC5 (за исключением Н4Н12183Р2, которое демонстрировало 64% ингибирование СР) демонстрировали больше чем 90% ингибирование в анализе СР или АР гемолиза в 5% сыворотке яванского макака. В анализе СР гемолиза IC₅₀ антител находились в диапазоне от 7,15 до 142 нМ. В анализе АР гемолиза IC₅₀ антител находились в диапазоне от 5,4 до 29,6 нМ.

(C) Ингибирование гемолиза, опосредованного вариантом С5 человека.

Выбранные антитела против С5 тестировали на их способность ингибировать вариант С5 человека (см. пример 3 в настоящем описании) из истощенной по С5 сыворотки человека в СН50 анализе. В истощенной по С5 сыворотке человека с добавлением экзогенного варианта С5 R885H, Н4Н12166Р и объект сравнения 2 блокировали СР гемолиз со значениями IC₅₀ 6,0 и 4,4 нМ соответственно и значениями IC₈₀7,6 и 5,5 нМ соответственно. Для варианта R885C, Н4Н12166Р и объект сравнения 2 блокировали СР гемолиз в истощенной по С5 сыворотке человека с экзогенными вариантами С5 с IC₅₀ 9,3 и 6,8 нМ соответственно и значениями IC₈₀ 11 и 8,2 нМ соответственно. Как ожидали, объект сравнения 1 не блокировал гемолитическую активность вариантов С5 человека.

(D) Ингибирование комплекса С5Ь-6 человека.

Выбранные антитела против С5 тестировали на их способность ингибировать комплекс С5Ь-6 человека из истощенной по С5 сыворотки человека в СН50 анализе. Н4Н12166Р сильно блокировало СР гемолиз в истощенной по С5 сыворотке человека с добавлением экзогенного комплекса huC5b-6 с IC₅₀3,8 нМ и значением IC₈₀ 5,8 нМ. В отличие от этого, объект сравнения 1 блокировал опосредованный комплексом С5Ь-6 гемолиз с меньшей силой, со значениями IC₅₀ 5,0 нМ и значением IC₈₀ 46 нМ соответственно. Объект сравнения 1 ингибировал только 70% общего гемолиза при наивысших тестируемых концентрациях. Объект сравнения 2 не блокировал гемолитическую активность комплекса С5Ь-6 человека.

Пример 9. Антитела против С5 блокируют образование С5а в анализе СР гемолиза.

Для того чтобы оценивать, ингибируют ли антитела против С5 образование С5а, супернатанты из анализа классического пути (СР) гемолиза анализировали на уровни С5а с помощью ELISA.

С5а, образуемый в результате расщепления С5, представляет собой белковый фрагмент из 74 аминокислот. С5а быстро метаболизируется карбоксипептидазами сыворотки до более стабильной менее активной формы из 73 аминокислот С5а des-Arg посредством удаления С-концевого аргинина. Количественное определение С5а des-Arg, следовательно, обеспечивает надежное измерение для мониторинга образования С5а in vivo и in vitro. В соответствии с информацией, предоставляемой производителем, используемый здесь набор MicroVue C5a ELISA позволяет обнаруживать С5а des-Arg. Предварительные эксперименты (данные не приведены) показывают, что также обнаруживают первичную форму С5а из 74

- 57 039858 аминокислот. В целях этого примера обе формы в совокупности обозначают как С5а.

Уровни белка С5а определяли в супернатантах из анализа СР гемолиза с использованием нормальной сыворотки человека (NHS) с сохраненным комплементом, которую предварительно инкубировали с Н4Н12166Р или изотипическим контрольным антителом, как описано в примере 8. Уровни белка С5а измеряли с использованием набора MicroVue C5a ELISA по инструкциям производителя. В кратком изложении, образцы разводили и инкубировали в планшетах, предварительно покрытых захватывающим антителом (мышиным против С5а со специфичностью к неоэпитопу на С5 человека). Белок С5а человека, предоставленный производителем, использовали в качестве стандарта для калибровки. С5а в супернатантах обнаруживали посредством HRP-конъюгированного идентифицирующего антитела (моноклональное антитело мыши к области С5а из С5). Хромогенный субстрат HRP 3-, 3'-, 5-, 5'-тетраметилбензидин (ТМВ) добавляли для того, чтобы обнаруживать активность HRP. Использовали раствор 1н. соляной кислоты для того, чтобы останавливать реакцию, и измеряли оптическую плотность при 450 нм (OD₄₅₀) на считывателе планшетов SpectraMax. Данные анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) в GraphPad Prism. Концентрацию С5а выражали в нг/мл супернатанта.

В анализе с использованием 5% NHS, H4H12166P сильно блокировал увеличение уровней белка С5а в зависимости от дозы с IC₅₀ 8,5 нМ, тогда как изотипическое контрольное антитело не оказывало эффекта на уровни С5а (фиг. 1). Максимальное блокирование при наивысшей тестированной концентрации Н4Н12166Р (267 нМ) вело к ~10-кратному снижению уровней С5а до 3,8 нг/мл (0,3 нМ) по сравнению с 34 нг/мл (2,8 нМ), которые наблюдали при наименьшей тестированной концентрации Н4Н12166Р (1 нМ) в 5% сыворотке. Концентрация С5а, которую наблюдали для максимального блокирования, близка к базовому уровню С5а 2,3 нг/мл (0,2 нМ) в необработанной 5% NHS.

Пример 10. Определение характеристик фармакокинетики и фармакодинамики антител против С5 у яванского макака.

В этом примере описано определение характеристик фармакокинетики (PK) и фармакодинамики (PD) выбранных антител против С5, которое проводили у самцов яванского макака. Эндогенные уровни С5 определяли перед дозированием антитела против С5 и использовали для стратификации групп животных по дозе.

Общие циркулирующие уровни С5 у яванского макака определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abeam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации белка С5 у обезьян составляют 90,85±19,17 мкг/мл.

Для каждого антитела против С5 каждому из 4 яванских макаков вводили одну внутривенную (IV) инъекцию в дозе 15 мг/кг. Образцы крови брали у каждого животного перед дозой и до 1680 ч (70 суток), получали сыворотку и замораживали при -80°С до анализа на PK и PD.

Анализ общего уровня антител IgG с помощью иммунологического анализа ELISA.

Общие концентрации антител в образцах сыворотки обезьяны измеряли с использованием не валидированного прямого ELISA. В процедуре ELISA использовали микротитровальный планшет, покрытый моноклональным антителом мыши против Fc IgG1/IgG4 человека. В планшет различные антитела против С5 добавляли и антитела против С5, захваченные на планшете, обнаруживали с использованием биотинилированного моноклонального антитела мыши против Fc IgG4 человека, после чего следовал нейтравидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (нейтравидин-HRP). Затем добавляли субстрат на основе люминола со специфичностью к пероксидазе, чтобы получать интенсивность сигнала, которая пропорциональна концентрации общего захваченного антитела против С5. Измерения калибровочных стандартов в относительных световых единицах (RLU) и соответствующие им номинальные концентрации аппроксимировали с использованием взвешенного 4-параметрического логистического уравнения для того, чтобы создавать калибровочное уравнение, которое описывает зависимость концентрации антител против С5 и ответа в анализе. Нижний предел количественного определения (LLOQ) составлял 1,56 нг/мл в анализе (2% сыворотка обезьяны) и 78 нг/мл в чистой сыворотке обезьяны.

Определение PK параметров.

PK параметры определяли посредством некомпартментного анализа (NCA) с использованием программного обеспечения Phoenix®WinNonlin® (версия 6.4, Certara, L.P.) и модели IV болюсного дозирования.

Все PK параметры получали из соответствующих средних значений концентраций, в том числе наблюдаемой максимальной концентрации в сыворотке (C_max), времени наблюдаемой пиковой концентрации (t_max) и наблюдаемого оценочного времени полужизни (T_1/2). Для каждого антитела площадь под кривой зависимости концентрации от времени вплоть до последней измеряемой концентрации (AUC_last) и экстраполированную от нулевого момента времени до бесконечности (AUC_inf) определяли с использованием правила линейных трапеций с линейной интерполяцией и равномерными весами.

PD анализ посредством анализа гемолиза ex vivo.

Фармакодинамику выбранных антител против С5 анализировали с использованием анализов клас- 58 039858 сического пути и альтернативного пути гемолиза ex vivo.

Анализ классического пути гемолиза: красные клетки крови овцы (SRBC) промывали в буфере

GVB++ (желатин-вероналовый буфер с CaCl2 и MgCl2) (Boston BioProducts) и ресуспендировали по

1х10⁹ клеток/мл. Чтобы сенсибилизировать SRBC, всего 1х10⁹ SRBC/мл смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизин кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин.

Сенсибилизированные SRBC разводили до 2х10⁸ клеток/мл в буфере GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Кровь у яванских макаков брали перед дозированием и через 5 мин, 4 и 8 ч и 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 и 70 суток после дозы для PD анализа. Сыворотку получали и замораживали до дальнейшего использования. В сутки анализа сыворотку Cynomolgus из соответствующих моментов времени разводили до 10% в буфере GVB++. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл сенсибилизированных SRBC (2х10⁸ клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 10% сыворотки яванского макака из соответствующих моментов времени. SRBC мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 10 мин. По истечении времени инкубации клетки центрифугировали на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96 плоскодонный планшет и считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли при конечной концентрации сыворотки 5%. Процент гемолиза вычисляли с использованием значений поглощения и следующего уравнения:

В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм для SRBC, которые инкубировали в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм для SRBC, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрической логистической) и программного обеспечения Prism 5 (GraphPad) для получения значений IC₅₀. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.

Анализ альтернативного пути гемолиза: желаемое число красных клеток крови кролика (RbRBC) промывали в буфере GVB-Mg²⁺/EGTA и ресуспендировали по 2х10⁸ клеток/мл. Кровь у яванских макаков брали перед дозированием и через 5 мин, 4 и 8 ч и 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42 и 49 суток после дозы для PD анализа. Сыворотку получали и замораживали до дальнейшего использования. Круглодонные 96-луночные планшеты использовали для того, чтобы измерять гемолитическую активность. Всего 100 мкл RbRBC (2х10⁸ клеток/мл) высевали в 96-луночный планшет при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 10% сыворотки яванского макака из соответствующих моментов времени, перечисленных выше. RbRBC мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. По истечении времени инкубации, клетки центрифугировали на 1250χg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет, который считывали при 412 нм на считывателе микропланшетов Spectramax. Гемолитическую активность вычисляли для конечной концентрации в сыворотке 5% и выражали в виде процентной доли от общего гемолиза RBC с использованием воды. Процент гемолиза вычисляли, как описано выше.

Результаты.

Выбранные антитела против С5 (перечислено в табл. 1) тестировали в начальных экспериментах на пролонгированные фармакокинетические профили у яванского макака и С5-гуманизированных мышей (описано в примере 10). Н4Н12166Р и Н4Н12161Р отбирали в качестве обладающих высокой аффинностью в сочетании с пролонгированной PK и использовали в последующих экспериментах в настоящем описании с объектом сравнения 1 и объектом сравнения 2.

Яванским макакам вводили одну 15 мг/кг IV болюсную дозу Н4Н12166Р, Н4Н12161Р или объекта сравнения 2. Концентрации всех антител в сыворотке и процент активности классического пути (СР) гемолиза определяли в 19 моментов времени в течение 70-суточного прижизненного периода. Альтернативный путь (АР) гемолиза определяли в 17 моментов времени в течение 50-суточного прижизненного периода. В табл. 23 сведены средние концентрации антител для всех трех антител. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 2. Средние параметры PK описаны в табл. 24.

- 59 039858

Таблица 23

Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной 15 мг/кг внутривенной инъекции выбранных антител против С5 самцам яванского макака

Время дозы)	(часы	после	№	Концентрация среднее ± SD	АЬ в сыворотке (мкг/мл)
Н4Н12166Р	Н4Н12161Р	объект сравнения 2
0 0, 083			4 4	BLQ 445 ± 30	BLQ 456 + 26,2	BLQ 459 + 55,2
4			4	328 ± 27	360 + 28,2	363 + 43,8
8			4	353 ± 29,9	316 + 21,5	357 + 16,1
24			4	282 ± 43,6	276 + 32,4	248 + 19,6
48			4	225 ± 15,2	221 ±21,5	212 ± 19,3
72			4	180 ± 15,0	181 + 17,2	196 + 36,2
120			4	194 ± 20,9	162 + 10,7	179 + 23,3
168			4	171 ± 29,9	132 + 17,0	157 + 18,4
240			4	157 ± 12,7	96, 1 + 17,3	114 + 13,0
336			4	120 + 10,2	49,3 + 18,7	67, 9 + 25,8
432			4	105 ± 13,9	24,6 ± 11, 8	42,6 ± 15,9
504			4	92,2 ± 10,6	13,8 + 9,95	28,6+13,1
672			4	75, 1+15,8	6,16 + 2,40	10, 9 + 6,25
840	3	59,6+4,79	2,44 + 0,85	4,45 + 2,63
1008	3	43,3 + 2,89	1,16 + 0,52	2,17 + 1,58
1176	3	30,6 + 1,42	0, 57 + 0,25	1,29 + 1,16
1344	3	25,9 + 3,74	0,315 + 0, 16	0,492 + 0,49
1512	3	18,2 + 2,41	0,17 + 0,08	0,270 + 0,27
1680	3	11,5 + 1,51	0,079 + 0, 07	0,123 + 0,15
Время -	время в часах после инъекции одной дозы;

SD - стандартное отклонение;

BLQ - ниже предела количественного определения.

После IV введения болюса определяли характеристики профилей зависимости концентрации общих IgG от времени для Н4Н12166Р, Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 с помощью начальной короткой фазы распределения, после которой следует одна фаза элиминации на всем протяжении прижизненного периода. Пиковые концентрации Н4Н12166Р, Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 хорошо поддавались сравнению, поскольку соответствующие значения Cmax/дозы среди всех антител находились в пределах 1,1 раза (29,7, 30,4 и 30,6 [(мкг/мл)/(мг/кг)] соответственно) (табл. 24).

- 60 039858

Таблица 24

Средние фармакокинетические параметры для концентраций общих IgG в сыворотке после одной внутривенной инъекции выбранных антител против С5 15 мг/кг самцам яванского макака

Параметр	Н4Н12166Р	Н4Н12161Р	Объект сравнения 2
		15 мг/кг IV (п=4)
	Средне е	SD	Средне е	SD	Средне е	SD
С_тах (мкг/мл)	445	30, 0	456	26,2	459	55,2
Стах/доза (мкг/мл)/(мг/кг)	29,7	2,00	30,4	1,75	30,6	3,68
С_о (мкг/мл)	448	30,5	458	26, 6	461	55,6
t_max (часы)	0,083	0	0,083	0	0,083	0
AUC_last сутких (мкг/мл)	5080	1040	2350	357	2810	470
AUC_last/_Ho₃a (мкг/мл)/(мг/кг)	сутких	339	69,3	157	23,8	187	31,3
AUC_inf сутких (мкг/мл)	5550	671	2350	356	2810	470
AUC_inf/flosa (мкг/мл)/(мг/кг)	сутких	370	44,7	157	23,7	188	31,4
CL (мл/ч/кг)	0,114	0,0143	0,270	0,0411	0,228	0,0425
V_ss (мл/кг)	60,4	4,85	44,0	4,34	45,3	3,06
t_1/2 (сутки)	15,6	1,43	5,50	2,45	5,91	1,13

IV - внутривенно;

n - число животных;

C_max - пиковая концентрация;

Со - начальная концентрация, определяемая посредством экстраполяции;

tmax ^- время ^до Cmax;

AUC - площадь под кривой концентрации-времени;

AUC_last - AUC, вычисленная от нулевого момента времени до времени последней положительной концентрации;

AUCinf - AUC от нулевого момента времени и экстраполированная до бесконечности;

CL - общий клиренс организма;

V_ss - объем распределения в устойчивом состоянии;

t_1/2 - время полужизни;

SD - стандартное отклонение.

Note - t_max выражают в номинальных часах.

Оценка профилей концентрация-время показывала, что Н4Н12166Р демонстрировало самую медленную элиминацию с конечными концентрациями антител >10 мкг/мл до суток 71 исследования. Кинетика у Н4Н12161Р и объекта сравнения 2 была схожей; оба демонстрировали более быструю элиминацию, чем Н4Н12166Р, с концентрациями mAb >10 мкг/мл к суткам 22 и 29 соответственно.

Следовательно, нормализованные по дозе экспозиции (AUQast/доза) показывали, что Н4Н12166Р имело самую высокую экспозицию 339 сутокх(мкг/мл)/(мг/кг), тогда как Н4Н12161Р и объект сравнения 2 имели приблизительно в 2 раза меньшую экспозицию, 157 и 187 сутокх(мкг/мл)/(мг/кг) соответственно, чем Н4Н12166Р.

Время полужизни антитела (t_1/2), вычисленное во время фазы элиминации, находилось в диапазоне от 5,5 до 15,6 суток среди групп доз и также коррелировало с экспозицией, где Н4Н12166Р имело соответственно самое высокое t_1/2 15,6 суток, тогда как Н4Н12161Р и объект сравнения 2 имели значения t_1/25,5 и 5,9 суток соответственно.

Фармакологические эффекты антител против С5 из образцов сыворотки яванского макака определяли ex vivo посредством гемолиза по классическому пути комплемента (СР) с использованием сенсибилизированных красных клеток крови овцы (SRBC) и альтернативного пути (АР) гемолиза красных клеток крови кролика (RbRBC). Ингибирование гемолитической активности вычисляли для конечной концентрации в сыворотке 5% и выражали в виде процентной доли общего гемолиза RBC с использованием воды. В табл. 25 сведена активность 3 антител ex vivo, как определяют по среднему проценту гемолиза.

- 61 039858

Таблица 25

Процент активности гемолиза по классическому и альтернативному пути ex vivo для выбранных антител против С5

Время (часы после дозы)	№	% классического пути гемолиза в сыворотке Cynomolgus, 10 мин, среднее ± SEM	% альтернативного пути гемолиза в сыворотке Cynomolgus, 60 мин, среднее ± SEM
Н4Н1216 6Р	Н4Н12161Р	объект сравнен ия 2	Н4Н12166Р	Н4Н12161Р	объект сравнения 2
0	4	91,34 ± 7,6	Не тестировал и	84,36 ± 20,28	73,44 ± 17,26	64,90 ± 19,51	55,77 ± 10,82
0,083	4	3,5 ± 1,4	Не тестировал и	6, 6 ± 6, 5	5,53 ± 1,98	5,90 ± 3,92	3,83 ± 3,93
4	4	2,35 ± 1,06	Не тестировал и	3,16 ± 2,2	7,43 ± 2,54	6,53 ± 2,7	5,30 ± 2,80
8	4	1,55 ± 0,21	Не тестировал и	1,25 ± 0,21	3,53 ± 0,91	4,70 ± 2,77	1,98 ± 0,83
24	4	7,7 ± 6, 08	Не тестировал и	4,55 ± 2,05	13,40 ± 2,77	4,68 ± 1,89	4,65 ± 2,35
48	4	2,85 ± 2,19	Не тестировал и	2,6 ± 0,7	5,53 ± 2,40	7,68 ± 5,22	2,28 ± 0,67
72	4	0,9 ± 0,42	Не тестировал и	1,3 ± 0,28	7,95 ± 3,36	5,95 ± 2,23	1,45 ± 0,33

- 62 039858

120	4	1,75 0,07	±	Не тестировал и	1,3 0,14	±	16, 38 6, 91	±	7,60 1,94	±	1,68 0,22	±
168	4	1,6 1,13	±	Не тестировал и	1,4 0,56	+	21,28 8,24	+	10,75 2,27	+	2,15 0,19	+
240	4	1 0,14	±	Не тестировал и	3,7 2,83	±	19,18 10,20	±	13,53 7,17	±	14,20 16,73	±
336	4	2,55 2,05	±	Не тестировал и	37,85 5,3	+	21,10 7,55	+	50,58 12,91	+	65,60 26, 04	+
432	4	1,35 0,91	±	Не тестировал и	105,25 ± 3,3	15,20 10,86	+	59,75 12,65	+	54,55 19,11	+
504	4	3,55 2,05	±	Не тестировал и	107,1 4,38	±	33,15 8,80	±	88,55 24,63	±	85,63 27,48	±
672	4	2,2 0,56	±	Не тестировал и	88,9 23,05	±	75,25 18,30	±	88,55 8,53	±	91,58 18,55	±
840	3	3,075 2,70	±	Не тестировал и	105,37 ± 53,4	46, 65 5,30	+	92,33 5,16	+	91,85 2,33	+
1008	3	15,5 26, 6	±	Не тестировал и	108,85 ± 2,35	58,60 9,48	+	92,45 6,27	+	92,30 2,69	+
1176	3	58,33 39,55	±	Не тестировал и	113,85 ± 2,62	72,95 5,87	+	104,90 3,5	+	101,90 0,42	+
1344	3	71,55 43,02	±	Не тестировал и	110,3 1,98	+	Не тестировал и	Не тестировал и	Не тестировал и
1512	3	91,375 ± 29,7	Не тестировал и	110,6 0,85	±	Не тестировал и	Не тестировал и	Не тестировал и
1680	3	112,22 ±4,06	Не тестировал и	112,15 ± 0,5	Не тестировал и	Не тестировал и	Не тестировал и

Время - время в часах после инъекции одной дозы;

SEM стандартная ошибка среднего;

BLQ - ниже предела количественного определения;

NC - не вычисляли.

Как показано в табл. 25 и на фиг. 2, PD эффекты измеряли с помощью СР комплемента (инкубация 10 мин) к суткам 70. Н4Н12166Р блокировало больше чем 95% СР гемолитической активности до суток 35. Активность возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 70. Объект сравнения 2 блокировал приблизительно 95% СР гемолитической активности до суток 10, и активность быстро возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 18.

PD эффекты также измеряли посредством анализа гемолиза по АР пути комплемента (инкубация 60 мин) до суток 49. Как показано в табл. 25 и на фиг. 3, Н4Н12166Р блокировало 80% общей АР гемолитической активности до суток 18, и активность возвращалась к максимальному уровню гемолиза до исследования к суткам 50. Н4Н1216Р и объект сравнения 2 блокировали 90% АР гемолитической активности до суток 7, и активность возвращалась к максимальным уровням гемолиза до исследования к суткам 21.

Пример 11. Определение характеристик PK/PD для антител против С5 у С5-гуманизированных мышей.

В этой группе экспериментов фармакокинетику и фармакодинамику выбранных антител против С5

- 63 039858 оценивали у мышей, гуманизированных для того, чтобы экспрессировать белок С5 человека с использованием технологии Velocigene® (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Создавали гуманизированных мышей с заменой экзонов 2-41 гена С5 мыши на экзоны 2-42 гена С5 человека (раскрыто в публикации патентной заявки США 2015/0313194, включенной в настоящее описание в полном объеме).

Общие уровни циркулирующего С5 человека определяли с использованием Human Complement С5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя.

Определение общего уровня лекарственного средства в сыворотке с помощью ELISA.

Концентрации циркулирующих антител против С5, как связанных с С5, так и не связанных, определяли по анализ общих антител человека с использованием ELISA. В кратком изложении поликлональное антитело козы против IgG человека 1 мкг/мл в PBS иммобилизовали на 96-луночных планшетах в течение ночи; планшеты промывали для того, чтобы удалять не связанный IgG, и затем блокировали с использованием 5% BSA. Серийные разведения образцов сыворотки, содержащей антитела против С5 (6 точек) и эталонные стандарты (12 точек) для соответствующих антител, переносили в планшеты, покрытые против IgG человека, и инкубировали в течение 1 ч. Затем связанные с планшетом антитела против С5 обнаруживали с использованием поликлонального антитела козы против IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшеты проявляли с использованием субстрата ТМВ в соответствии с рекомендованным протоколом производителя, и сигналы оптической плотности (OD) при 450 нм регистрировали с использованием считывателя планшетов Perkin Elmer Victor Х4 Multimode. Концентрации антител против С5 в сыворотке вычисляли на основе калибровочной кривой эталонных стандартов, созданной с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Определение PK параметров.

PK параметры определяли с использованием некомпартментного анализа (NCA) и программного обеспечения Phoenix®WinNonlin® (версии 6.3, Certara, L.P.) и модель внесосудистого дозирования. Используя соответствующие средние значения концентраций для каждого антитела, все PK параметры, в том числе наблюдаемое оценочное время полужизни (t_1/2) и площадь под кривой зависимости концентрации от времени вплоть до последней измеряемой концентрации (AUC_last), определяли с использованием правила линейных трапеций с линейной интерполяцией и равномерными весами.

PD анализ посредством анализа гемолиза.

Фармакодинамику для выбранных антител против С5 определяли с использованием анализа гемолиза по классическому пути комплемента. Красные клетки крови овцы (SRBC) (кровь овцы в растворе Олсвера) промывали в буфере GVB++ (желатин-вероналовый буфер с CaCl₂ и MgCl₂) (Boston BioProducts) и ресуспендировали по 1x109 клеток/мл. Для сенсибилизации 1x109 SRBC/мл смешивали с равным объемом разведенного 1:50 гемолизина кролика против овцы (1,5 мг/мл) при 37°С в течение 20 мин. Сенсибилизированные SRBC разводили до 2x10⁸ клеток/мл в GVB++ перед использованием в анализе гемолиза. Образцы сывороток от получавших предварительные дозы животных или гуманизированных С5 мышей, которым дозировали антитела против С5, которые брали в сутки 10, 20, 30, 40 и 50 после дозы, разводили до 20% в буфере GVB++. Всего 100 мкл сенсибилизированных SRBC (2x10⁸ клеток/мл) высевали в 96-луночные круглодонные планшеты при 37°С, после чего следовало добавление 100 мкл 20% сыворотки, в которую добавляли 160-180 мкг/мл белка 3 комплемента человека (huC3). Клетки мягко перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. После инкубации клетки центрифугировали на 1250xg при 4°С. Всего 100 мкл супернатанта переносили в свежий 96-плоскодонный планшет и считывали на А412 нм в считывателе микропланшетов Spectramax. Процент гемолиза вычисляли с использованием значений поглощения и следующего уравнения:

% гемолиза = 100 x (экспериментальный лизис клеток - фоновый лизис клеток)/(максимальный лизис клеток - фоновый лизис клеток).

В этом уравнении фоновый лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от SRBC, которые инкубировали в буфере GVB++, только не содержащем сыворотку. Максимальный лизис клеток представляет собой OD при А412 нм от SRBC, которые обрабатывали водой. Результаты, выраженные в виде % гемолиза, анализировали с использованием нелинейной регрессии (4-параметрическая логистическая) в программном обеспечении Prism 6 (GraphPad) для получения значений IC₅₀. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.

Эксперимент 1.

В этом эксперименте фармакокинетику и фармакодинамику образцового антитела Н4Н12166Р оценивали в сравнении с объектом сравнения 1 и объектом сравнения 2 у гуманизированных С5 мышей. Общие уровни циркулирующего С5 человека определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации С5 человека у мышей составляют 39,73±17,82 мкг/мл. Имело место различие между самцами (55,4±1,7 мкг/мл, n=47) и самками (24,7±0,6 мкг/мл, n=49) мышей.

Перед дозированием антител самцов и самок гуманизированных С5 мышей стратифицировали в со- 64 039858 ответствии с уровнями С5 человека, которые усредненно составляли 40 мкг/мл. Для каждого антитела против С5, когорты из 22 мышей получали одну дозу Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 или объекта сравнения 2 15 мг/кг посредством подкожной (s.c.) инъекции. У всех мышей брали кровь перед дозой и в сутки 1 после инъекции для PK анализа. Кроме того, через 10, 20, 30, 40 и 50 суток после инъекции группы из 4 или 5 мышей из каждой когорты умерщвляли и собирали терминальный образцы крови для PK и PD анализа. Образцы сыворотки в сутки 1 представляли собой среднее для всей когорты из 22 мышей. Из крови получали сыворотку и замораживали ее при -80°С до анализа.

Общие концентрации антител определяли в 7 моментов времени и процент активности гемолиза определяли в 6 моментов времени за 50-суточный прижизненный период. Все концентрации антител против С5 сведены в табл. 26. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 4. Средние PK параметры описаны в табл. 27.

Таблица 26

Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной подкожной инъекции антител против С5 15 мг/кг гуманизированным С5 мышам

Время (сутки)	№	Концентрация АЬ в сыворотке (мкг/мл) среднее + SD
Н4Н12166Р	Объект сравнения 1	Объект сравнения 2
1	22	178 ± 22,7	229 + 40,7	164 + 24,1
10	4	83,7 + 22,2	102 ± 22,9	44 ± 24,1
20	5	57,1 ± 26,8	29 ± 31,3	11,4 ± 10,3
30	5	38,1 ±7,6	30,1 + 34,2	3,6 ± 3,2
40	4	11,9 + 5,0	0,4 + 0,4	0,5 + 0,4
50	4*	9,3 ± 12,2	0,3 ± 0,3	0,3 ± 0,2

сутки -сутки исследования;

SD - стандартное отклонение;

SEM стандартная ошибка среднего;

ND - не обнаруживали;

NS - нет образцов.

*Для объекта сравнения 2 в сутки 50 n=3 из-за невозможности анализа одного образца в силу технических проблем.

Таблица 27

PK параметры

Параметр	Единицы	Н4Н12166Р	Объект сравнения 1	Объект сравнения 2
Концентраци я mAb в сутки 1	мкг/мл	178	229	164
AUClast	суткихмкг/мл	2801	2708	1418
tl/2	d	11,3	4,7	7, 6

C_max - пиковая концентрация;

AUC_last - AUC, вычисленная от нулевого момента времени и до времени последней положительной концентрации;

ti/2 - наблюдаемое оценочное время полужизни.

Профили средней концентрации в зависимости от времени в сутки 1 показывают, что три антитела Н4Н12166Р, объект сравнения 1 и объект сравнения 2 имели сравнимые концентрации в сыворотке 178, 229 и 164 мкг/мл соответственно. Объект сравнения 1 имел профиль элиминации, схожий с Н4Н12166Р, вплоть до суток 30, но в сутки 40 и 50 демонстрировал быстрое увеличение клиренса по сравнению с Н4Н12166Р. В сутки 50 Н4Н12166Р имел усредненную концентрацию антитела в сыворотке приблизительно 9 мкг/мл, тогда и как объект сравнения 1 и объект сравнения 2 имели в 30 раз сниженную усредненную концентрацию антитела в сыворотке 0,3 мкг/мл. Объект сравнения 2 демонстрировал наименьшую экспозицию из трех тестированных антител, приблизительно с 2-кратно более низкой AUC_last(1408 суткихмкг/мл) по сравнению с Н4Н12166Р (2801 суткихмкг/мл) и объектом сравнения 1

- 65 039858 (2708 суткихмкг/мл).

Фармакологические эффекты антител против С5 Н4Н12166Р, объекта сравнения 1 и объекта сравнения 2 из образцов сыворотки гуманизированных С5 мышей с добавлением С3 человека измеряли до суток 50 и определяли ex vivo по гемолизу сенсибилизированных SRBC по классическому пути комплемента (СР). Средний процент гемолиза для каждого антитела против С5 приведен в табл. 28 и профиль среднего процента гемолиза в зависимости от времени представлен на фиг. 5.

Таблица 28

Процент активности гемолиза по классическому пути для антител против С5 человека ex vivo

Время (сутки)	№	% гемолиза по классическому пути в 10% сыворотке мыши, 60 мин, среднее ± SEM
Н4Н12166Р	объект сравнения 1	объект сравнения 2
1	22	NS	NS	NS
10	4	12,6 ± 7,79	10,39 ±2,88	12,06 ± 9, 12
20	5	18,8 ±8,1	21,59 ± 17,53	65,08 ± 52,87
30	5	13,76 ± 10,9	78,98 ± 40,3	91,67 ± 16,74
40	4	41,71 ± 40,7	101,09 ± 4,01	68,99 ± 42,47
50	4*	62,2 ± 56, 6	88,99 ± 17,51	105,14 ± 4,07

сутки - сутки исследования;

SEM - стандартная ошибка среднего;

ND - не обнаруживали;

NS - нет образцов.

Н4Н12166Р, объект сравнения 1 и объект сравнения 2 ингибировали терминальную гемолитическую активность комплемента, по-видимому, коррелирующую с экспозициями антител. Н4Н12166Р блокировало больше чем 85% гемолитической активности до суток 30 с возвращением активности к базовым уровням перед дозой к суткам 50. Объект сравнения 1 и объект сравнения 2 блокировали приблизительно 80% гемолитической активности до суток 20 и суток 10 соответственно с возвращением активности к базовым уровням к суткам 30 для обоих.

Эксперимент 2.

В этом эксперименте фармакокинетику и фармакодинамику антител против С5 Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 и изотипического контроля оценивали у гуманизированных С5 мышей (мышей, гомозиготных по экспрессии С5 человека). Общие уровни циркулирующего С5 определяли с использованием Human Complement C5 ELISA (Abcam, № по каталогу ab125963), который осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Определяли, что усредненные концентрации С5 человека у мышей составляют 48,98 ±15,1 мкг/мл.

Перед дозированием антител самцов и самок гуманизированных С5 мышей стратифицировали в соответствии с уровнями С5 человека, которые усредненно составляли 50 мкг/мл. Для каждого mAb против С5, когорты из 5 мышей получали одну подкожную (s.c.) инъекцию 15 мг/кг Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объекта сравнения 1 или изотипического контроля. У всех мышей брали кровь перед дозой, через 6 ч, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 13, 21, 30 и 45 суток после инъекции для PK анализа. Кроме того, в сутки 59 всех мышей из каждой когорты умерщвляли и брали терминальные образцы крови для PK и PD анализа. Из крови получали сыворотку, которую замораживали при -80°С до анализа.

Общие концентрации антител определяли в 12 моментов времени и процент активности гемолиза определяли в 1 момент времени в течение 59-суточного прижизненного периода. Общие сывороточные концентрации антител для каждого антитела против С5 сведены в табл. 29. Профили средних общих концентраций антител в зависимости от времени приведены на фиг. 6. Средние PK параметры описаны в табл. 30.

- 66 039858

Таблица 29

Средние концентрации общего IgG в сыворотке после одной подкожной инъекции выбранных антител против С5 15 мг/кг гуманизированным С5 мышам

Время (сутки)	Концентрация АЬ в сыворотке (мкг/мл) среднее ± SD
Н4Н12166Р	Н4Н12161Р	Объект	Изотипический
0 0,25 1 2 3 7	ND 31,2 ± 4,2 149,9 ± 16,1 160,8 ± 20 166,2 ± 12,4 158,6 ±8,5	ND 43,5 ± 16,3 193,8 ± 24,1 221 ± 26,5 210 ± 31,2 162,5 ± 34,8	сравнения 1 ND 59,2 ± 24,1 179,0 ± 9,8 166,6 ± 22,3 159,2 ± 33,2 136,1 ± 38,1	контроль ND 61,5 ± 29,4 218,1 ± 17 188,8 ± 25,8 177,9 ± 26,2 184,9 ± 33,9
10	123,5 ± 28,7	133,2 ± 20,2	107,2 ± 45,7	159,5 ± 28,8
13	93,7 ± 23,6	97,2 ± 24,6	70,6 ± 38	117,2 ± 24,1
21	60,4 ± 14,9	42,4 ± 30,3	29,5 ± 20,6	80,0 ± 17,5
30	37,8 ± 10,8	15,3 ± 19,7	4,2 ± 3,5	42,1 ± 6,7
45	20,7 ± 5,2	3,5 ± 5,2	0,4 ± 0,3	16,5 ± 13,9
59	4,1 ± 1,9	0,6 ± 1,0	0,08 ± 0,04	4,6 ± 4,5

сутки - сутки исследования;

SD - стандартное отклонение;

SEM стандартная ошибка среднего;

ND - не обнаруживали;

NS - нет образцов.

Таблица 30

PK параметры

Параметр	Единицы	Тестовое антитело (среднее ± SD)
Н4Н12166Р	Н4Н12161Р	Объект сравнения 1	Изотипический контроль
Стах	мкг/мл	178 ± 10	225 ± 22	183 ± 18	221 ± 19
AUC_last	суткихмкг/мл	3490 ± 590	3040 ± 900	2240 ± 780	4080 ± 480
tl/2	D	11 ± 1	5, 8 ± 2	4,2 ± 1	9,9 ± 4

C_max - пиковая концентрация;

AUClast - AUC, вычисленная от нулевого момента времени и до времени последней положительной концентрации;

Т_1/2 - наблюдаемое оценочное время полужизни.

Профили средних концентраций в зависимости от времени показывают, что Н4Н12166Р, Н4Н12161Р, объект сравнения 1 и изотипический контроль достигали максимальной концентрации в сыворотке (C_max) между сутками 1 и 3, при сравнимых значениях C_max в пределах 1,3 крат (178, 225, 183 и 221) мкг/мл соответственно. Н4Н12166Р и изотипический контроль имели схожие профили элиминации, при уровнях остающихся лекарственных средств приблизительно 4 мкг/мл в сутки 59. Н4Н12161Р демонстрировало более быстрый клиренс, чем Н4Н12166Р и изотипический контроль, но выводилось более медленно, чем объект сравнения 1. В сутки 59 Н4Н12161Р имело средний сывороточный уровень лекарственного средства 0,6 мкг/мл, тогда как объект сравнения 1 имел почти неподдающийся обнаружению уровень лекарственного средства 0,08 мкг/мл.

Изотипический контроль, Н4Н12166Р и Н4Н12161Р демонстрировали сравнимые значения экспозиции (AUC_last) в пределах 1,3 крат (4080, 3490 и 3040 суткихмкг/мл соответственно), тогда как объект сравнения 1 проявлял в 1,6 раза более низкую экспозицию (2240 суткихмкг/мл) по сравнению с Н4Н12166Р.

Пример 12. Анализ на основе LC-MRM-MS для определения концентрации общего С5 человека.

В этом примере концентрации общего С5 человека в сыворотке определяли с использованием жидкостной хроматографии в сочетании со способом масс-спектрометрического мониторинга множества реакций (LC-MRM-MS) в исследовании фармакокинетики/фармакодинамики антитела против С5 Н4Н12166Р.

Концентрации общего С5 человека в сыворотке определяли посредством измерения концентрации

- 67 039858

10-аминокислотного пептида LQGTLPVEAR (а. о. 1129-1138 в SEQ ID NO: 359), содержащегося в последовательности С5, в качестве посредника для С5. Теоретически этот способ также позволяет обнаруживать С5Ь - продукт расщепления С5. Однако из-за нестабильности свободного С5Ь концентрации С5Ь в сыворотке в целом низки, а большинство С5Ь связано с клеточными поверхностями в форме комплексов MAC (Cooper & Muller-Eberhard, 1970, J. Exp. Med. 132:775-93; Hadders et al. 2012, Cell Rep. 1:200-7). Следовательно, обработанные образцы сыворотки, которые анализировали здесь, вероятно содержат только несущественные количества продукта С5Ь, если вообще содержат.

Способы.

Для PK/PD исследования мыши получали одну дозу Н4Н12166Р 15 мг/кг посредством подкожной (s.c.) инъекции. У всех мышей брали кровь перед дозой и в сутки 1 после инъекции для PK анализа. Кроме того, через 10, 20, 30, 40, 50 и 60 суток после инъекции мышей умерщвляли и брали терминальные образцы крови для PK и PD анализа.

С5 человека использовали в качестве эталонного стандарта для калибровки и пептид С5 человека, полученный с использованием С-концевого остатка аргинина, меченного стабильным изотопом, использовали в качестве внутреннего стандарта (LQGTLPVEAR-13C615N4). Эталонный стандарт использовали в концентрациях в диапазоне от 3,9 до 250 мкг/мл (серийные разведения 1:2) в сыворотке от самостоятельно созданных мышей с нокаутом С5, у которых удаляли ген С5 мыши (С5^-/-). Сыворотку от С5^-/- мышей также использовали в качестве отрицательного контроля (пустая проба). Калибровочные стандарты, пустые пробы и исследуемые образцы сыворотки (10 мкл кажд.) сушили и затем денатурировали в 100 мкл буфера из 8 М мочевины/20 мМ трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 37°С в течение 1 ч. Затем 10 мкл 25 нМ внутреннего стандарта добавляли во все образцы. Образцы алкилировали с использованием 10 мМ 2-йодацетамида при комнатной температуре в течение 30 мин и разводили с использованием 50 мМ бикарбоната аммония до конечного объема 500 мкл. Затем образцы расщепляли трипсином (1:20 мас./мас.) в течение ночи при 37°С. Триптический пептид LQGTLPVEAR, происходящий из С5, обнаруживали и определяли количественно с помощью LC-MRM-MS, используя Waters Xevo TQ-S с системой ACQUITY UPLC. Каждый обработанный образец (10 мкл) инъецировали в предварительно уравновешенную колонку ACQUITY UPLC ВЕН С18. Скорость потока составляла 0,6 мл/мин (подвижная фаза А: вода:муравьиная кислота/100:0,1 [об./об.] и подвижная фаза В: ацетонитрил:муравьиная кислота/100:0,1 [об./об.]). Время удержания и площадь пика определяли с использованием программного обеспечения Masslynx Analyst Data (Waters). Концентрации анализируемого вещества С5 вычисляли по калибровочной кривой, которую создавали посредством построения графика соотношения площадей пиков для эталонного стандарта С5 (не меченный пептид С5 LQGTLPVEAR-¹²C6¹⁴N4, созданный триптическим расщеплением hC5) и внутреннего стандарта (пептид С5, меченный стабильным изотопом) в зависимости от номинальной концентрации эталонного стандарта С5. Концентрации вычисляли с использованием линейной регрессии. Наименьшая концентрация эталонного стандарта С5 (3,9 мкг/мл) находилась в динамическом диапазоне анализа, и ее определяли в качестве LLOQ анализа.

Результаты.

Концентрации общего С5 человека в сыворотке оценивали для взятых образцов и через взятие крови из хвоста перед дозированием (перед дозой) и через терминальное взятие крови в сутки 10, 30 и 35 у соответствующих животных. Общие концентрации hC5 после дозирования Н4Н12166Р были схожими (в пределах от ~1 до 0,9 крат) с уровнями перед дозой в сутки 10, 30 и 35 после дозирования. Наблюдаемые небольшие различия не были статистически значимыми, как оценивали с помощью критерия МаннаУитни, используя программное обеспечение GraphPad Prism. Анализ молярного соотношения С5/Н4Н12166Р демонстрировал, что Н4Н12166Р оставался в молярном избытке относительно С5 до суток 35 после дозирования (табл. 31).

Таблица 31

Сводка PD характеристик для Н4Н12166Р

Сутки после дозы	% СР гемоли за средне е ± SD	% ингибиров ания	С5 (мкг/мл)	Н4Н1216 6Р (мкг/мл ) среднее ± SD	Молярное соотношени е терминальн ых С5: Н4Н12166Р
Пере Д дозо й	Терминальн ый	Кратное ть изменен ИЯ
0	77,2	0	n/d	п/а	п/а
10	5,2	93	34,2	30,0	1,о	78,8	0,3
30	7,4	90	31,9	28,4	0,9	30,4	0,8
35	6, 0	92	36, 1	32,7	1,0	29,6	0,9
40	37,1	52	n/d	20,9	n/d
50	Все животные в группе исключены из-за	титров МАНА > 1000
60	73,57	⁵	n/d			Г’	\| n/d

- 68 039858 ^a Процентную долю ингибирования СР гемолитической активности вычисляли по средним значениям % СР гемолиза в указанные сутки после дозирования относительно среднего значения % СР гемолиза в сутки 0.

^b Кратность изменения - терминальный (указанные сутки после дозирования) С5:С5 перед дозой.

SD - стандартное отклонение.

МАНА - антитело мыши против человека. n/d - не определяли.

Животных с данными, на которые влияли МАНА, полностью исключали из вычислений (2х сутки 30, 1х сутки 35, 2х сутки 40 и все 4 мыши в сутки 50).

Пример 13. Картирование эпитопов для связывания Н4Н12166Р с С5 по водород-дейтериевому обмену.

Картирование эпитопов по H/D обмену с масс-спектрометрией осуществляли для того, чтобы определять аминокислотные остатки hC5 (аминокислоты М1-С1676 из SEQ ID NO: 359), с которыми взаимодействует Н4Н12166Р. Общее описание способа H/D обмена приведено, например, в Ehring (1999), Analytical Biochemistry, 267(2):252-259; and Engen and Smith (2001), Anal. Chem. 73:256A-265A.

HDX-MS эксперименты осуществляли на интегрированной платформе Waters HDX/MS, состоящей из системы Leaptec HDX PAL для мечения дейтерием, Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager) для расщепления образцов и загрузки, Waters Acquity M-Class (p,Binary solvent manager) для градиента аналитической колонки и масс-спектрометр Synapt G2-Si для измерения масс пептических пептидов.

Раствор для мечения получали в 10 мМ буфере PBS в D2O при pD 7,0 (эквивалент рН 6,6). Для мечения дейтерием 3,8 мкл С5 (6 пмоль/мкл) или С5, предварительно смешанный с антителом в молярном соотношении 1:1, инкубировали с 56,2 мкл D2O раствора для мечения для различных моментов времени (например, не дейтерированный контроль = 0 с, метили в течение 1 и 20 мин). Дейтерирование гасили посредством переноса 50 мкл образца в 50 мкл предварительно охлажденного гасящего буфера (0,2 М ТСЕР, 6 М хлорид гуанидина в 100 мМ фосфатном буфере, рН 2,5) и смешанный образец инкубировали при 1,0°С в течение 2 мин. Затем погашенный образец впрыскивали в Waters HDX Manager для встроенного расщепления пепсином/протеазой XIII. Расщепленные пептиды улавливали на предколонке ACQUITY UPLC ВЕН С18 VanGuard 1,7-мкм, 2,1 х5 мм при 0°С и элюировали в аналитическую колонку

ACQUITY UPLC ВЕН С18 1,7-мкм, 1,0х50 мм в течение 9-минутного градиентного разделения 5-40% В (подвижная фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле). Масс-спектрометр настраивали на напряжение на конусе 37 В, время сканирования 0,5 с и диапазон масса/заряд 50-1700 единиц Томсона (Th).

Для идентификации пептидов из С5 человека данные LC-MSE от недейтерированного образца обрабатывали и проводили поиск в базе данных, содержащей С5 человека, пепсин и их рандомизированные последовательности через программное обеспечение Waters ProteinLynx Global Server (PLGS).

Идентифицированные пептиды импортировали в программное обеспечение DynamX и осуществляли фильтрацию по двум критериям: (1) минимум продуктов на аминокислоту = 0,3 и (2) порог файлов репликации = 3. Затем программное обеспечение DynamX автоматически определяло захват дейтерия для каждого пептида на основе времени удержания и высокой точности массы (<10 ч./млн) для множества моментов времени с тремя повторениями для каждого времени.

Используя встроенную колонку с пепсином/протеазой XIII, сопряженную с регистрацией данных MSE, всего 189 пептидов из С5 человека идентифицировали в отсутствии или присутствии антитела, что представляет покрытие последовательности 62%. В табл. 32 проиллюстрированы пять пептидов, которые имели значительно сниженный захват при дейтерировании (центроидные дельта-значения >0,9 Да с р-значениями <0,05), когда связаны с Н4Н12166Р.

Таблица 32

Дейтерирование пептидов С5 человека при связывании с Н4Н12166Р

Оста тки	Дейтерирование 1 мин	Дейтерирование 20 мин
	С5 центроид Н+	С5+Н4Н12166Р центроид МН+	Δ	С5 центроид МН+	С5+Н4Н12166Р центроид МН+	Δ
591- 599	1015,38 ± 0,09	1014,44 ± 0,16	-0,93	1015,64 ± 0,04	1014,60 ± 0,08	-1,04
593- 599	769,41 ± 0,11	768,33 ± 0,05	-1,08	769,65 ± 0,01	768,30 ± 0,004	-1,35

- 69 039858

775- 787	1693,81 0,11	±	1692,85 0,07	±	-0,96	1694,06 0,04	±	1692,96 0,02	±	-1,10
775- 794	2439,62 0,29	±	2438,42 0,20	±	-1,20	2440,16 0,06	±	2439,17 0,21	±	-0,99
779- 787	1141,14 0,04	±	1140,21 0,05	±	-0,93	1141,23 0,03	±	1140,21 0,02	±	-1,02

Зарегистрированная масса пептида соответствует усредненному значению центроидной МН+ массы из трех повторений. Эти пептиды, соответствующие аминокислотам 591-599 и 775-794, имели более низкую скорость дейтерирования при связывании с Н4Н12166Р. Эти идентифицированные остатки также соответствуют остаткам 591-599 и 775-794 в С5 человека, как определено с помощью записи Uniprot P01031 (CO5_HUMAN; SEQ ID NO: 359).

Пример 14. Эффект антител против С5, оказываемый на воспаление глаза в экспериментальном аутоиммунном увеите у мышей.

Данное исследование проводили для того, чтобы оценивать роль С5 в экспериментальном аутоиммунном увеите (EAU). Использовали как генетический [нокаут С5 (KO), мыши с двойным С3/С5 KO], так и фармакологический (антитело против С5) экспериментальные подходы.

Способы.

Использовали взрослых мышей C57BL/6J (n=25, Jackson labs), мышей с С5 KO (n=13) и С3/С5 KO (n=8) (Regeneron Pharmaceuticals Inc.). EAU индуцировали посредством подкожной инъекции пептида межфоторецепторного ретиноид-связывающего белка человека (IRBP, New England Peptide) в полном адъюванте Фрейнда и интраперитонеальной инъекции токсина коклюша. mAb против С5 мыши или mAb изотипического контроля вводили через подкожные инъекции каждые 3 суток от суток 5 до суток 28. Антитело против С5 мыши, использованное в этом исследовании (M1M17628N), содержало HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363. SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Inc.) использовали для того, чтобы оценивать уровни воспаления в сутки -1, 7, 14, 21 и 28. Всех животных умерщвляли в сутки 28 для взятия глаз и крови. Анализ гемолиза с/без С3 человека осуществляли для валидации ингибирования комплемента. Данные анализировали посредством ANOVA.

Результаты.

По сравнению с мышами дикого типа возникновение воспаления (30-50%) и число клеточных кластеров стекловидного тела были значительно снижены у С5 KO мышей (р<0,01). Оценки оптической когерентной томографии (ОСТ) у С5 KO мышей также значительно снижены 50% на неделе 3 (р<0,0001). Интересно, что у мышей с двойным С3/С5 KO значительно больше клеточных кластеров стекловидного тела и выше оценки заболевания к суткам 28 по сравнению с мышами дикого типа (р<0,05). У животных, которые получали Ab против mC5 (50 мг/кг), заболеваемость воспалением и клеточные кластеры стекловидного тела значительно снижены по сравнению с отсутствием лечения или изотипической контрольной группой к суткам 21 (р<0,01). В недели 3 и 4 оценки ОСТ в группе лечения антителом против С5 значительно ниже по сравнению с отсутствием лечения или изотипическим контролем (р<0,0001), (фиг. 7) Анализ гемолиза с/без С3 человека подтверждал эффект ингибирования антителом против С5 в неделю 4 (фиг. 8).

Заключение.

Воспаление глаз из-за EAU смягчали посредством ингибирования активности С5, через генетическую делецию или фармакологическое ингибирование с использованием специфического антитела против С5. Истощение С5 задерживало возникновение EAU и снижало ОСТ оценку заболевания. Эти результаты показывают, что С5 является потенциальной терапевтической мишенью при аутоиммунном увеите. Антитело против С5 оказывает защитный эффект при заболевании EAU у мышей дикого типа. Находки авторов изобретения также подсказывают, что С3 может быть полезен для заболевания EAU у мышей.

Пример 15. Эффект антител против С5 человека, оказываемый на экспериментальный аутоиммунный увеит.

В этом примере описаны эффекты антител к С5 против С5 человека в модели экспериментального аутоиммунного увеита (EAU) на мышах. Мышей, которых использовали в этом исследовании, гуманизировали для того, чтобы экспрессировать белок С5 человека, используя технологию Velocigene® (Valenzuela et al. 2003, Nat. Biotechnol. 21:652-659). Создавали гуманизированных мышей с заменой экзонов 2-41 гена С5 мыши на экзоны 2-42 гена С5 человека (раскрыто в публикации патентной заявки США 2015/0313194, включенной в настоящее описание в полном объеме).

Способы.

Взрослых самцов мышей иммунизировали подкожно в каждое бедро с использованием 150 мкг пептида 1-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (SEQ ID NO: 364) межфоторецепторного ретиноидсвязывающего белка (IRBP) человека (Avichezer et al. 2000, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:127-131) в 0,2 мл эмульсии CFA, с добавлением штамма Mycobacterium tuberculosis H37RA до 2,5 мг/мл. Затем мы- 70 039858 шам интраперитонеально инокулировали 1,0 мкг токсина коклюша (РТХ) для того, чтобы содействовать индукции клеточно-опосредованного аутоиммунитета, содействуя Thi-поляризации иммунного ответа (Thurau et al. 1997, Clin. Exp. Immunol. 109:370-376; Silver et al. 1999, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40:28982905). Мониторинг массы тела животных осуществляли два раза в неделю.

Офтальмологические осмотры осуществляли в сутки -1, перед индукцией EAU и в сутки 7, 14, 21 и 28. Мышей анестезировали кетамином (120 мг/кг, IP) и ксилазином (5 мг/кг, IP). Зрачки расширяли с использованием 0,5% офтальмологического раствора тропикамида и исследовали дно глаза с использованием контактной линзы с фундус-камерой в системе платформы ангиографии сетчатки (HRA) Spectralis Heidelberg+OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA).

Серию из 61 латерального оптического разреза получали для каждого глаза с использованием ОСТ функции в системе Spectralis HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, USA). Область ОСТ визуализации центровали на оптическом диске, делая возможной равную визуализацию над и под головкой зрительного нерва. Толщину сетчатки измеряли как расстояние между нижней частью слоя RPE и внутренней пограничной мембраной глаза. Измерения выполняли в 1500 мкм от диска зрительного нерва и значения из четырех различных квадратов сетчатки (например, верхнего, нижнего, височного и носового) усредняли для получения средней толщины сетчатки глаза.

Также на ОСТ изображениях тяжесть инфильтрации стекловидного тела воспалительными клетками ранжировали посредством оценки усредненного числа воспалительных клеточных кластеров в стекловидном теле, в четырех латеральных ОСТ сканированиях, которые пересекали зрительный нерв, на каждый глаз.

Разрабатывали шкалу из 4 степеней для оценки тяжести заболевания на ОСТ изображениях (ОСТ оценки) (табл. 33).

Таблица 33

Оценка EAU in vivo с использованием оптической когерентной томографии (ОСТ)

Степень	Критерии
0	Без изменений
0,5 (след)	Небольшая инфильтрация воспалительными клетками в стекловидном теле, в первую очередь около головки зрительного нерва (<15 кластеров)
1	Небольшая инфильтрация воспалительными клетками в стекловидном теле, в первую очередь около головки зрительного нерва (<25 кластеров); небольшие очаговые субретинальные повреждения (серые пятна) на периферии; небольшие складки сетчатки на периферии; расширение сосудов сетчатки; периваскулит и васкулит
2	Умеренная инфильтрация воспалительными клетками в стекловидном теле более диффузная, но не на дальней периферии (<50 кластеров); разрушение слоя сетчатки; формирование гранулем небольшого или среднего размера со складками сетчатки в первую очередь на периферии; расширение сосудов; небольшая очаговая хориоидальная неоваскуляризация; периваскулит и васкулит; небольшой отек сетчатки (<10 мкм)
3	Умеренная или тяжелая диффузная инфильтрация

- 71 039858

воспалительными клетками в стекловидном теле (>50 кластеров); диффузное разрушения слоя сетчатки и расширенные сосуды во внутреннем ядерном слое; формирование средних или больших гранулем со складками сетчатки на всем протяжении сетчатки; серьезное расширение сосудов сетчатки; периваскулит и васкулит; умеренная диффузная хориоидальная неоваскуляризация; умеренный или тяжелый отек сетчатки (10-40 мкм); небольшие отслоения сетчатки

4

Тяжелая диффузная инфильтрация воспалительными клетками в стекловидном теле (>70 кластеров); диффузное разрушение слоев и расширенные сосуды во внутреннем ядерном слое; диффузное формирование тяжелых гранулем со складками сетчатки; тяжелая диффузная хориоидальная неоваскуляризация; периваскулит и васкулит; дегенерация сетчатки или тяжелый отек сетчатки (уменьшение >2 0 мкм или увеличение >4 0 мкм, соответственно); обширное отслоение сетчатки

Статистический анализ.

Статистический анализ параметрических данных (масса тела, воспалительные клеточные кластеры в стекловидном теле и толщина сетчатки) осуществляли посредством однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Тьюки. Для непараметрических данных (оценки ОСТ и гистологические оценки) анализ осуществляли посредством критерий Краскела-Уоллиса и критерия Данна с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 5.0d в отношении изотипического контроля или групп без лечения. Данные представляют средние значения ± SEM. р-значения меньше 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты.

В первом исследовании (исследование А) мышей лечили подкожно каждые 3 суток от суток 5 изотипическим контрольным антителом (50 мг/кг) или 10 мг/кг, или 50 мг/кг Н4Н12170Р. Лечение с использованием 10 мг/кг Н4Н12170Р вело к снижению воспаления и повреждения сетчатки (фиг. 9). Мыши, которых лечили с использованием 10 мг/кг Н4Н12170Р, также демонстрировали статистически значимое снижение оценок ОСТ к суткам 21 и суткам 28 (фиг. 10).

Во втором исследовании (исследование В) мышей лечили подкожно каждые 3 суток от суток 6 с использованием изотипического контроля (10 мг/кг), 3 мг/кг или 10 мг/кг Н4Н12166Р или с использованием объекта сравнения 2 (см. пример 2 в настоящем описании; контрольные конструкции, используемые в следующих примерах). Лечение с использованием Н4Н12166Р или по 3 мг/кг, или по 10 мг/кг вызывало дозозависимое снижение оценок ОСТ, которое было статистически значимым в сутки 14-28 (фиг. 11). Лечение с использованием 10 мг/кг Н4Н12166Р у С5 гуманизированных мышей начиная с 6 суток после индукции EAU вело к дозозависимому снижению воспаления и повреждения сетчатки, как определяют посредством ОСТ, проведенной в сутки 14-28 (фиг. 12).

Для обоих исследований неинвазивная прижизненная оценка с помощью ОСТ демонстрировала прогрессирующее развитие воспаления, увеличение толщины сетчатки и морфологические аномалии у контрольных животных после иммунизации с использованием IRBP.

Заключение.

Эти эксперименты предоставляют дополнительное фармакологическое свидетельство того, что С5 играет роль в патогенезе аутоиммунного увеита. Фармакологическое истощение С5 человека с помощью антитела полностью человека против С5 человека отсрочивало заболеваемость EAU и снижало тяжесть заболевания, подтверждая эффект этих антител при аутоиммунном увеите.

Пример 16. Эффект антител против С5, оказываемый на реперфузионное повреждение при почечной ишемии.

Данное исследование осуществляли для того, чтобы оценивать роль С5 при реперфузионном повреждении при почечной ишемии. Использовали как генетический (с использованием мышей с нокаутом С3 и нокаутом С5), так и фармакологический подходы (с использованием антител против С5). Модель реперфузии при ишемии создавали посредством билатерального пережатия ножек сосудов почек на

- 72 039858 мин, после чего следовало 48 ч реперфузии. Имитация лапаротомии служила в качестве контроля. Антитело против С5 вводили по 50 мг/кг внутривенно в однократной дозе непосредственно после ишемии (лечебная) или подкожно в виде двух доз, в сутки -1 и сутки 1 хирургического вмешательства (профилактически). В этом исследовании использовали антитело против С5 M1M17628N, содержащее HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363. Маркеры азот мочевины в крови (BUN) и креатинин сыворотки использовали для того, чтобы оценивать у мышей уровни заболевания и зашиты.

Таблица 34

Процент изменения уровней азота мочевины в крови мышей, которых лечили антителом против С5 (M1M17628N) в профилактическом и терапевтическом режимах

BUN,% изменения ср.	RIRI+носитель	RIRI+изотипический контроль
Сутки 2	Сутки 2
RIRI+M1M17628N (проф.)	-37,19	-34,68
RIRI+M1M17628N (леч.)	- 53,70	-51,85

Таблица 35

Процент изменения уровней креатинина сыворотки у мышей, которых лечили антителом против С5 (M1M17628N) в профилактическом и терапевтическом режимах

SCr,% изменение ср.	RIRI+носитель	RIRI+изотипический контроль
Сутки 2	Сутки 2
RIRI+M1M17628N (проф.)	-53,09	-49,34
RIRI+M1M17628N (леч.)	-59,40	-56,16

По сравнению с мышами дикого типа мыши с нокаутом С3 и С5 демонстрировали значительную функциональную защиту в RIRI модели острого повреждения почек, о чем свидетельствовало снижение уровней азота мочевины в крови и креатинина сыворотки. Антитело против С5 демонстрировало функциональную защиту в RIRI модели как в профилактическом, так и в терапевтическом режимах (табл. 34, 35).

Пример 17. Эффект антител против С5, оказываемый на волчаночный нефрит.

В этом примере описан эффект антител против С5 при лечении волчаночного нефрита в модели на мышах.

Системная красная волчанка (SLE) представляет собой аутоиммунное нарушение, обусловленное утратой толерантность к собственным антигенам, образованием аутоантител и отложением иммунных комплексов (IC), фиксирующих комплемент, в пораженных тканях. SLE отличается широким диапазоном клинических манифестаций и целевых органов, причем волчаночный нефрит является одним из наиболее серьезных осложнений. Активация комплемента в почках пациентов с волчаночным нефритом вносит вклад в воспаление и повреждение ткани. Эффект антител против С5 при лечении волчаночного нефрита изучали у мышей NZBWF1, спонтанной мышиной модели волчаночного нефрита (Yang et al. 1996, PNAS). У мышей возникает аутоиммунное заболевание наподобие SLE человека, аутоантитела к ядерным антигенам и белкам клеточной мембраны, гипергаммаглобулинемия, альбуминурия, протеинурия, начинается гломерулонефрит иммунных комплексов и гибель от почечной недостаточности и терминальная стадия почечной недостаточности в возрасте от 35 до 50 недель.

Для этого исследования мышей NZBWF1 в возрасте 25 недель подкожно лечили с использованием 30 мг/кг изотипического контроля или антител против С5 два раза в неделю в течение 8 недель, затем три раза в неделю в течение 10 недель. Для этого исследования использовали антитела против С5 мыши M1M17628N и M1M17627N, которые содержат HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 362/363 и 365/366 соответственно.

Лечение антителами против С5 значительно усовершенствовало коэффициент выживаемости у мышей (фиг. 13). Оба антитела усовершенствовали альбуминурию на 8-14 неделях лечения (фиг. 14) и уровни азота мочевины в крови на 12-16 неделях лечения (фиг. 15).

Пример 18. Эффект антител против С5, оказываемый на гибель клеток астроцитов.

Оптикомиелит (NMO) представляет собой аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (CNS), которое преимущественно поражает зрительный нерв и спинной мозг. При NMO аутоантитела против аквапорина-4 (AQP4-Ab) вызывают повреждение астроцитов посредством активации комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Цели этого исследования состояли в том, чтобы оценивать роль системы комплемента в прогрессировании NMO и использовании антитела против белка комплемента в качестве потенциального терапевтического лечения для NMO.

- 73 039858

Первичные корковые астроциты крысы получали из коры больших полушарий головного мозга постнатальных детенышей крыс и культивировали с AQP4-Ab (антитело rAb-53 из публикации патентной заявки США 2014/0170140; Bennett et al 2009, Ann. Neurol. 66: 617-629) и белками комплемента для того, чтобы демонстрировать клеточно-опосредованную цитотоксичность. Затем эксперименты повторяли с добавлением антитела против С5 для того, чтобы демонстрировать блокирование разрушения клеток астроцитов.

Для того чтобы количественно определять гибель клеток, осуществляли люминесцентный цитотоксический анализ CytoTox-Glo™. В анализе использовали различные концентрации антитела против С5 (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 или 1000 мкг/мл) или изотипическое контрольное антитело.

Для того чтобы определять, может ли антитело против С5 блокировать CDC, индуцированную AQP4-Ab, высевали астроциты и повторяли цитотоксический анализ CytoTox-Glo™, чтобы находить оптимальную дозу AQP4-Ab для этого посева. Обнаруживали, что оптимальная концентрация AQP4-Ab составляет 50 мкг/мл, и в следующем эксперименте использовали постоянную дозу AQP4-Ab (50 мкг/мл), тогда как дозу антитела против С5 варьировали. Как показано на фиг. 16, наблюдали снижение в RLU (от усредненно 300 тыс. до усредненно 100 тыс.) с увеличением количества антитела против С5, что демонстрирует, что антитело против С5 блокировало гибель клеток астроцитов. Для обоих экспериментов RLU не изменялись в зависимости от изотипического контрольного антитела. Как показано на фиг. 16, антитела против С5 ингибировали индуцированную AQP4-Ab цитотоксичность на первичных корковых астроцитах с IC₅₀ 15-17 нМ.

В будущем исследовании антитело против AQP4 и антитело против С5 следует инъецировать в головной мозг крысы для того, чтобы оценивать терапевтический эффект, оказываемый на комплементопосредованную цитотоксичность в отношении астроцитов в CNS.

Пример 19. Анализ эндотелия.

В этом примере описан анализ эндотелия клубочков in vitro для исследования блокирования отложения С5Ь-9 и С3 антителом против С5.

Воспроизводимые способы оценки ингибирующих эффектов кандидатов в лекарственных средствах, оказываемых на активацию комплемента, важны для доклинических испытаний. Из-за сложности путей активации комплемента в анализе следует использовать релевантные клетки и конечные точки для заданного терапевтического показания. Здесь, используя иммортализованную линию клеток эндотелия клубочков человека (HGEC), валидировали модель отложения С3 и С5 комплемента для использования в оценке блокирующей активности mAb против С3 или С5.

Способы.

Первичные клетки эндотелия клубочков почки человека (HGEC; Cell Biologies) высевали на ночь в полную среду в покрытые коллагеном I черные 96-луночные планшеты с чистым дном. Клетки обрабатывали или с использованием PBS (контроль) или активировали в течение 10 мин с использованием 10 мкМ ADP. После промывания в PBS 50% сыворотку человека (с сохраненным комплементом, истощенную по С3 или истощенную по С5) добавляли на 4 ч. Антитела против С5 добавляли по 1 мг/мл в сыворотку перед лечением. Клетки промывали, фиксировали и исследовали антителами против СЗЬ (Thermofisher) и/или антителами против C5b-9 (Abcam), вторичными антителами и докрашивали с использованием DAPI. Захватывали изображения на ImagExpress и использовали многопараметрический анализ изображения для того, чтобы количественно определять флуоресцентное окрашивание для каждого изображения и усредненно для каждого условия.

Результаты.

Отложение С3 и С5Ь-9 наблюдали у ADP-активированных HGEC, на которые воздействовали нормальной сывороткой человека, но не у не активированных HGEC (С3: 1,5χ10⁷±1,0χ10⁷; C5: 7,9χ10⁶±6,6χ10⁶, Р<0,05 против не ADP-активированных HGEC). Отложения С3 и С5Ь-9 значительно снижали у ADP-активированных HGEC, на которые воздействовали истощенной по С3 или С5 сывороткой (С3: 3,3χ105±4,8χ10⁴; C5: 1,5χ10⁶±6,0χ10⁵, Р<0,05). Добавление блокирующего mAb против С5 значительно снижало отложение С5Ь-9 из нормальной сыворотки человека на ADP-активированных HGEC, отложение сравнимо с истощенными по С5 сыворотками (С5 mAb: 1,02χ10⁶±6,0χ10⁵, контрольное mAb 3,7χ10⁶±1,6χ10⁶, Р<0,05 против контрольного mAb).

Заключение.

Эти данные демонстрируют полезность анализа эндотелия клубочков человека in vitro для моделирования отложения С3 и С5 комплемента. В дополнение к скринингу in vitro, этот анализ обладает потенциалом в качестве трансляционной модели для того, чтобы оценивать стратегии против комплемента при заболевании почек, используя образцы сывороток, полученные у пациентов.

Объем настоящего изобретения не подлежит ограничению конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании. В действительности, различные модификации изобретения в дополнение к тем, что описаны в настоящем документе, будут видны специалистам в данной области из приведенного выше описания и сопроводительных фигур. Предусмотрено, что такие модификации входят в объем приложенной формулы изобретения.

- 74 039858

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком фактора 5 комплемента (С5), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

HCDR1, которая SEQ ID NO: 100; содержит аминокислотную последовательность, представленную в

HCDR2, которая SEQ ID NO: 102; содержит аминокислотную последовательность, представленную в

HCDR3, которая SEQ ID NO: 104; содержит аминокислотную последовательность, представленную в

LCDR1, которая SEQ ID NO: 108; содержит аминокислотную последовательность, представленную в

LCDR2, которая SEQ ID NO: 110; и содержит аминокислотную последовательность, представленную в

LCDR3, которая SEQ ID NO: 112. содержит аминокислотную последовательность, представленную в
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 98, и/или вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 106.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR из SEQ ID NO: 98/106.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 354.
6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, содержащие пару аминокислотных последовательностей тяжелой цепи/легкой цепи из SEQ ID NO: 353/354.
7. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, которые представляют собой полную молекулу антитела.
8. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с С5, по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
9. Устройство доставки по типу ручки, содержащее фармацевтическую композицию по п.8.
10. Автоинъекционное устройство, содержащее фармацевтическую композицию по п.8.
11. Выделенная молекула полинуклеотида, содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7.
12. Выделенная молекула полинуклеотида, содержащая полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вариабельную область легкой цепи (LCVR) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7.
13. Экспрессирующий вектор, который содержит молекулу полинуклеотида по пп. 11 и 12.
14. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-7, экспрессирующая вектор по п.13.
15. Способ предотвращения или лечения по меньшей мере одного симптома или показания заболевания или нарушения, связанного с С5, при этом способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1 -7, нуждающемуся в этом субъекту.
16. Способ по п.15, в котором заболевание или нарушение выбирают из группы, состоящей из атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), пароксизмальной ночной гемоглобинурии (PNH), возрастной дегенерации желтого пятна, географической атрофии, увеита, оптикомиелита, рассеянного склероза, инсульта, синдрома Гийена-Барре, травматического повреждения головного мозга, болезни Паркинсона, нарушений ненадлежащей или нежелательной активации комплемента, осложнений гемодиализа, сверхострого отторжения аллотрансплантата, отторжения ксенотрансплантата, индуцированной интерлейкином-2 токсичности во время терапии IL-2, воспалительных нарушений, воспаления при аутоиммунных заболеваниях, болезни Крона, респираторного дистресс-синдрома взрослых, термического повреждения, включая ожоги или обморожения, постишемических реперфузионных состояний, инфаркта миокарда, синдрома повышенной проницаемости капилляров, ожирения, диабета, болезни Альцгеймера, шизофрении, инсульта, эпилепсии, атеросклероза, васкулита, буллезного пемфигоида, С3-гломерулопатии, мембранопролиферативного гломерулонефрита, диабетической нефропатии, синдрома Альпорта, прогрессирующей почечной недостаточности, протеинурических заболеваний почек,

- 75 039858 реперфузионного повреждения при почечной ишемии, волчаночного нефрита, баллонной ангиопластики, постгемодиализного синдрома при сердечно-легочном шунтировании или почечном шунтировании, гемодиализа, почечной ишемии, реперфузии брыжеечной артерии после реконструкции аорты, инфекционного заболевания, сепсиса, нарушения иммунных комплексов, аутоиммунного заболевания, почечного нарушения, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), SLE нефрита, пролиферативного нефрита, гемолитической анемии, астмы, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), эмфиземы, легочной эмболии, инфаркта легкого, пневмонии и миастении гравис.
17. Способ по п.15, в котором заболевание или нарушение представляет собой атипичный гемолитико-уремический синдром.
18. Способ по п.15, в котором заболевание или нарушение представляет собой пароксизмальную ночную гемоглобинурию.
19. Способ по любому из пп.15-18, в котором фармацевтическую композицию вводят профилактически субъекту, нуждающемуся в этом.
20. Способ по любому из пп.15-19, в котором фармацевтическую композицию вводят в комбинации со вторым терапевтическим средством.
21. Способ по п.20, в котором второе терапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из антикоагулянта, противовоспалительного лекарственного средства, антигипертензивного средства, иммуносупрессорного средства, понижающего липиды средства, средства против CD20, такого как ритуксимаб, средства против TNF, такого как инфликсимаб, противосудорожного средства, ингибитора С3, второго антитела против С5 и антитромботического средства.
22. Способ по любому из пп.15-21, в котором фармацевтическую композицию вводят подкожно, внутривенно, внутрикожно, интраперитонеально, перорально, внутримышечно или внутрь черепа.