EA038578B1 - Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата - Google Patents
Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата Download PDFInfo
- Publication number
- EA038578B1 EA038578B1 EA202000021A EA202000021A EA038578B1 EA 038578 B1 EA038578 B1 EA 038578B1 EA 202000021 A EA202000021 A EA 202000021A EA 202000021 A EA202000021 A EA 202000021A EA 038578 B1 EA038578 B1 EA 038578B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- triticain
- protein
- alpha
- cells
- wheat
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title abstract description 23
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title abstract description 23
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 title abstract description 12
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 title abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 101800000268 Leader protease Proteins 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 7
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical class [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 6
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 101000572796 Hepatitis E virus genotype 1 (isolate Human/China/HeBei/1987) RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- VNXXMHTZQGGDSG-CIUDSAMLSA-N Cys-His-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VNXXMHTZQGGDSG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 102100032965 Myomesin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101800002227 Papain-like protease nsp3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000006171 gluten free diet Nutrition 0.000 description 1
- 235000020884 gluten-free diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 235000020790 strict gluten-free diet Nutrition 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12Y304/22002—Papain (3.4.22.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, препаративной биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно к созданию рекомбинантных белков семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) в растворимой форме и препаратов белка тритикаина-альфа, состоящих из фрагмента тритикаина-альфа пшеницы, и способам их получения. Изобретение может быть использовано в исследовательских целях для изучения функционирования папаинподобных цистеиновых протеиназ, а также в медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов и представляет собой способ получения в растворимой форме рекомбинантных функционально активных вариантов цистеиновой протеазы пшеницы Triticum aestivum, включающий конструирование плазмидных ДНК для клонирования в экспрессионных системах E.coli и P.pastoris. Путем трансформации клеток E.coli штамма Rosetta garni B (DE3) и клеток P.pastoris штамма GS115 плазмидными ДНК pET15-6HIS-Triticain--GM, pET15-Triticain--GM-6HIS и pPIC9-Triticain--GM соответственно получены штаммы - продуценты усеченной формы тритикаина-альфа пшеницы, с последующим культивированием клеток-хозяев, выделением экспрессирующегося белка и очисткой хроматографическими методами. Изобретение обеспечивает возможность получения вариантов биологически активного фрагмента протеазы пшеницы в растворимой форме в бактериальной и дрожжевой экспрессионных системах, а также получение препарата тритикаина-альфа с высоким и стабильным выходом, уровнем очистки и функциональной активности.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии, препаративной биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно к созданию рекомбинантных белков семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) в растворимой форме и препаратов белка тритикаина-альфа, состоящих из фрагмента тритикаина-альфа пшеницы, и способам их получения. Изобретение может быть использовано в исследовательских целях для изучения функционирования папаинподобных цистеиновых протеиназ, а также в медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов и представляет собой способ получения в растворимой форме рекомбинантных функционально активных вариантов цистеиновой протеазы пшеницы Triticum aestivum, включающий конструирование плазмидных ДНК для клонирования в экспрессионных системах E.coli и P.pastoris. Путем трансформации клеток E.coli штамма Rosetta garni В (DE3) и клеток P.pastoris штамма GS115 плазмидными ДНК pETl 5-6HIS-Triticain-a-GM, pETl 5-Triticain-a-GM-6HIS и pPIC9-Triticain-a-GM соответственно получены штаммы - продуценты усеченной формы тритикаинаальфа пшеницы, с последующим культивированием клеток-хозяев, выделением экспрессирующегося белка и очисткой хроматографическими методами. Изобретение обеспечивает возможность получения вариантов биологически активного фрагмента протеазы пшеницы в растворимой форме в бактериальной и дрожжевой экспрессионных системах, а также получение препарата тритикаина-альфа с высоким и стабильным выходом, уровнем очистки и функциональной активности.
Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии, препаративной биохимии, биотехнологии, биофармакологии, а именно к созданию способов получения рекомбинантных белков семейства цистеиновых протеиназ пшеницы (Triticum aestivum) в растворимой форме и препараты белка тритикаинаальфа, состоящие из фрагмента тритикаина-альфа пшеницы. Изобретение может быть использовано в исследовательских целях для изучения функционирования папаинподобных цистеиновых протеиназ, а также в медицине для разработки ферментных терапевтических препаратов.
Уровень техники
Тритикаины (triticain-α, -β, -γ) - высококонсервативные папаин-подобные цистеиновые эндопротеазы пшеницы, состоящие из сигнального (лидерного) пептида, удаляющегося при активации пропептидного домена, гранулин-подобного домена [GenBank AB267407] и каталитического домена с каталитической триадой Cys-His-Asn [Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6]. Цистеиновые протеиназы распространены в растениях и экспрессируются в их различных органах [K. Muntz, M.A. Belozersky, Y.E. Dunaevsky et al. J Exp Bot, 2001, 52, 1741-52, J.Q. Ling, T. Kojima, M. Shiraiwa et al. Biochim Biophys Acta, 2003, 1627, 129-39]. Предполагается, что эти ферменты участвуют в стадиеспецифическом расщеплении и посттрансляционных модификациях запасающих белков [A. Capocchi, M. Cinollo, L. Galleschi, et al. JAgric Food Chem, 2000,48, 6271-79, T. Okamoto, T. Shimada, I. Hara-Nishimura, et al. Plant Physiol, 2003, 132, 1892-1900]. Среди папаинподобных цистеиновых протеиназ растений наиболее широко изучены ферменты риса и ячменя - оризаины (oryzain-α, -β, -γ) и эндопептидазы ЕРВ (barley cysteine proteinase B-1, -2) [A. Mikkonen, I Porali, M. Cercos, et al. Plant Mol Biol, 1996, 31(2), 239-54, H. Kondo, K. Abe, I. Nishimura, et al. J Biol Chem, 1990, 15, 265(26), 15832-37], однако протеазы пшеницы начали изучать относительно недавно [Т. Kiyosaki, Т. Asakura, I. Matsumoto et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6, T. Kiyosaki, I. Matsumoto, T. Asakura, et al. FEBS J, 2007, 274, 1908-17].
Основным преимуществом папаинподобных цистеиновых протеиназ из семян растений на данный момент является их эндопептидазная активность, в частности глютеназная активность - способность эффективно гидролизовать пептиды глютена (запасного белка пшеницы, состоящего из смеси мономерных глиадинов и полимерных глютенинов) или родственных запасных белков ржи и ячменя. Это свойство растительных ферментов позволяет считать их перспективными объектами при разработке лекарственных средств для борьбы с целиакией. Целиакия (глютеновая энтеропатия) представляет собой комплексное воспалительное заболевание человека, которое развивается при наличии соответствующей генетической предрасположенности в ответ на обогащенные остатками пролина и глутамина пептиды, являющиеся продуктами происходящего в пищеварительном тракте частичного протеолиза глютена [N. McGough, J.H. Cummings. Proc Nutr Soc, 2005, 64(4), 434-50, J.S. Leeds, A.D. Hopper, D.S. Sanders. Br Med Bull, 2008, 88(1), 157-70]. Распространенность глютеновой энтеропатии во взрослой популяции большинства стран мира оценена как 1:100 - 1:250 или 0.5-1% от общей популяции [WGO - OMGE: Practice guidelines. World Gastroenterology News, 10 (2, 2), 2005, 1-8]. Доказанной эффективной терапией целиакии является пожизненная строгая безглютеновая диета, позволяющая предотвратить развитие осложнений и исключить клинические симптомы заболевания [S. Rashtak, J.A. Murray. Aliment Pharmacol Ther, 2012, 35(7), 768-81]. Однако главным недостатком безглютеновой диеты является сложность ее соблюдения изза ее ограничительного характера, обусловленного как высокой стоимостью, так и сложностью подбора глютен-несодержащих продуктов питания.
В связи с этим исследование и разработка способов получения высокоспецифичных протеиназ, стабильных и активных в присутствии эндогенных ферментов желудочно-кишечного тракта человека (т.е. в месте предполагаемого действия лекарственного препарата на их основе) имеет большое значение в терапевтических целях [L.V. Savvateeva, A.A. Zamyatnin. Curr Pharm Des, 2016, 22(16), 2439-49].
Из литературы известен метод получения проэнзимной формы цистеиновой протеиназы ячменя ЕРВ2 (ргоЕР-В2) в E.coli. [H. Vora, J. Mclntire, P. Kumar, et al. Biotechnol Bioeng, 2007, 1, 98(1), 177-85, заявка WO 2008115428 A2, 25.09.2008].
В рамках данного изобретения была выбрана протеиназа пшеницы Triticum aestivum - тритикаинальфа, т.к. пшеница играет существенную роль как источник питания в России, а значит, наиболее подходящая для разработки отечественных терапевтических препаратов для лечения целиакии.
Молекула полноразмерного тритикаина-альфа состоит из 461 аминокислотного остатка с молекулярным весом 50,4 кДа. Впервые фермент был клонирован и экспрессирован в зародыше и алейроновом слое пшеницы для выяснения его роли в процессе созревания семян [Т. Kiyosaki, T. Asakura, I. Matsumoto et al. J Plant Physiol, 2009, 1, 166(1), 101-6]. Однако непосредственно белок тритикаин-альфа выделен не был.
Биосинтез рекомбинантного тритикаина-альфа для исследования его протеолитических функций был осуществлен нами ранее [L.V. Savvateeva, N.V. Gorokhovets, V.A. Makarov et al. Int J Biochem Cell Biol, 2015, 62, 115-24, Патент RU 2603054 C2, 20.11.2016]. В описанном способе рекомбинантный тритикаин-альфа (фрагмент полноразмерного белка) синтезировался в бактериальных клетках в нерастворимой форме, что требовало включения дополнительной, трудно валидируемой, стадии рефолдинга в про- 1 038578 цессе выделения целевого белка. Также полученные препараты обладали меньшей активностью, чем полученные препараты в настоящей заявке, а также обладали меньшим выходом при выделении и меньшей чистотой.
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой в рамках настоящей заявки, является расширение ассортимента ферментативных препаратов, с потенциалом использования в качестве лекарственного средства, а также разработка эффективного способа получения высокоочищенного и высокоактивного препарата белка с последующим потенциальным применением в промышленных условиях. Существует необходимость разработки усовершенствованных экономически целесообразных технологий получения таких белков с сохранением высокого качества (степень чистоты, выход и активность) препаратов для исследовательских и прикладных целей.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокоочищенного и высокоактивного препарата фрагмента протеазы пшеницы тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы (т.е. без лидерного пептида и гранулин-подобного домена), в растворимой форме с высоким выходом при выделении, для фундаментальных и прикладных исследований (в частности, для использования в составе ферментных терапевтических средств).
Поставленная задача решается биологически активным белковым препаратом, обладающим высокой специфической активностью папаин-подобных цистеиновых протеиназ, состоящим из фрагмента (SEQ ID NO:2-4) последовательности тритикаина-альфа (SEQ ID NO:1), экспрессирующегося в растворимой форме, чистота которого составляет не менее 85%. При этом препарат в котором фрагмент тритикаина-альфа содержит гексагистидиновую последовательность на N-конце, имеет последовательность SEQ ID NO:2, препарат, имеющий гексагистидиновую последовательность на С-конце, имеет последовательность SEQ ID NO:3, а препарат, не содержащий гексагистидиновую последовательность на С- и Nконцах, имеет последовательность SEQ ID NO:4.
Поставленная задача также решается способом получения биологически активного белкового препарата, обладающего специфической активностью папаинподобных цистеиновых протеиназ, рекомбинантной экспрессией в бактериальной системе, заключающимся в том, что проводят культивирование клеток E.coli штамма Rosetta gami В (DE3), трансформированных плазмидами pET15-6HIS-Triticain-aGM или pET15-Triticain-a-GM-6HIS, содержащими последовательности ДНК, кодирующие белки с SEQ ID NO:2-3 соответственно, в среде LB с добавлением ампициллина при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-в-О-галактозидом и растят еще 20 ч при 18°С с накоплением растворимой формы белка с SEQ ID NO:2-3; далее осажденные центрифугированием экспрессионные культуры ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученную после центрифугирования лизатов соответствующую надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А, затем белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола, далее раствор белка диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 и после определения концентрации и протеолитической активности белка с SEQ ID NO:2-3, в полученном препарате, аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. При этом используют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок с SEQ ID NO: 2- 3, а в качестве вектора экспрессии используют вектор на основе рЕТ15Ь.
Поставленная задача также решается способом получения биологически активного белкового препарата, обладающим высокой специфической активностью папаинподобных цистеиновых протеиназ, рекомбинантной экспрессией в дрожжевой системе, заключающийся в том, что проводят культивирование клеток P.pastoris штамма GS115 (His-, Mut+/MutS), трансформированных плазмидой pPIC9-Triticain-aGM, содержащей последовательность ДНК, кодирующей белок с SEQ ID NO:4 в среде YPD при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности А600 1.5, клеточные суспензии растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой и инкубируют при 30°С до появления колоний, затем одной колонией полученных трансформантов Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-aGM, содержащих одну или две копии фрагмента гена усеченного тритикаина-альфа, инокулируют питательную среду BMGY и наращивают клеточную массу при 30°С в шейкер-инкубаторе до оптической плотности 5 о.е. (Mut+) или 25 о.е. (MutS), осаждают центрифугированием и осадки ресуспендируют в среде BMMY с последующим инкубированием в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин, добавляя каждые 24 ч в качестве индуктора экспрессии метанол до конечной концентрации 0.7%, затем клетки осаждают, отбирают супернатанты; далее надосадочную культуральную жидкость Pichia pastoris GS115/pPIC9Triticain-a-GM фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, диализат концентрируют и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 130 мМ NaCl, далее собирают белковые
- 2 038578 фракции по 6 мл и анализируют на присутствие белка (SEQ ID NO:4) методами электрофоретического анализа и определют концентрацию и протеолитическую активность, далее биологически активный белковый препарат аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют. При этом для реализации способа используют нуклеиновую кислоту, кодирующую белок с последовательностью SEQ ID NO:4 для использования в способе получения биологически активного белкового препарата и вектор экспрессии на основе pPIC9.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведена электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3)/ pET15-6HIS-Triticain-a-GM до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3)/pET15-6HIS-Triticain-a-GM после индукции изопропилтио-β-D-галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain-α-GM, дорожка 5) после хроматографического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).
На фиг. 2 приведена электрофореграмма в 12% полиакриламидном геле в присутствии SDS: лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3)/Triticain-a-GM-6HIS до индукции (дорожка 1), лизатов клеток штамма-продуцента E.coli Rosetta gami B(DE3)/Triticain-a-GM-6HIS после индукции изопропилгио-в-Э-галактозидом (дорожка 2); растворимая клеточная фракция (дорожка 3), нерастворимая клеточная фракция (дорожка 4); рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:3, Triticain-aGM-6HIS, дорожка 5) после хроматографического выделения; М - белковые маркеры молекулярной массы (кДа).
На фиг. 3 рекомбинантный усеченный тритикаин-альфа (SEQ ID NO:4, γ-Triticain-a-GM, экспрессированный в клетках P.pastoris) после хроматографического выделения в 14% полиакриламидном геле в присутствии SDS (M - белковые маркеры молекулярной массы, кДа); (М-белковые маркеры молекулярной массы, кДа);
На фиг. 4 приведена гистограмма, демонстрирующая специфическую (протеолитическую) активность вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа и папаина (как контроля цистеиновых папаин-подобных протеиназ): 1 - папаин; 2 - рекомбинантный фрагмент тритикаин-альфа из нерастворимой фракции; 3 - усеченный тритикаин-альфа, экспрессированный в клетках P.pastoris (SEQ ID NO:4, γ-Triticain-α-GM); 4 -усеченный тритикаин-альфа с N-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:2, 6HIS-Triticain-α-GM); 5 - усеченный тритикаин-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью (SEQ ID NO:3, Triticain-a-GM-6HIS).
Осуществление изобретения
В перечне последовательностей в SEQ ID NO:1 указана аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного полноразмерного тритикаина-альфа, экспрессирующегося в E.coli (TRIT-α, курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-42а(+); курсивом и подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; подчеркиванием выделен лидерный пептид; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам; цветом выделен гранулин-подобный домен; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами); SEQ ID NO: 2 - аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с N-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (, 6HIS-Triticain-a-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15Ь; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам); SEQ ID NO: 3 - аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа с С-концевой полигистидиновой последовательностью, экспрессирующегося в E.coli в растворимой форме (, Triticain-a-GM-6HIS; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды рЕТ-15Ь; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами; курсивом и цветом выделена каталитическая триада Cys-His-Asn, определяющая принадлежность белка к цистеиновым протеазам); SEQ ID NO: 4 -аминокислотная и нуклеотидная последовательности рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа, экспрессирующегося в P.pastoris (, γ-Triticain-a-GM; курсивом выделена последовательность от экспрессионной плазмиды pPIC9; цветом выделен a-фактор; стрелкой выделен сигнал отщепления a-фактора; подчеркиванием выделены сайты узнавания рестриктазами);
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не ограничивают заявленный объем притязаний, при этом наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата.
Пример 1. Клонирование усеченных фрагментов гена тритикаина-альфа для бактериальной экспрессии белков в растворимой форме.
На основе известной последовательности мРНК пшеницы (Triticum aestivum), кодирующей полноразмерный ген тритикаина-альфа (GenBank AB267407), синтезируют комплементарную ДНК (кДНК) с
- 3 038578 использованием обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони и праймера на 3'нетранслируемую область мРНК 5'- gggggatccttacgcgctacttttcttgccg. Амплификацию кодирующей транслируемую область гена полноразмерного тритикаина-альфа ДНК, фланкированную сайтами рестрикции NdeI и BamHI (TRIT-α, SEQ ID NO:1), проводят с использованием следующих прямого и обратного праймеров: 5'-ccccatatgcatcatcatcatcatcatgccatgaggagctccatggccctc и 5'- gggggatccttacgcgctacttttcttgccg (сайты рестрикции NdeI и BamHI выделены подчеркиванием). Продукт амплификации и плазмидную ДНК рЕТ42а(+) обрабатывают рестриктазами NdeI и BamHI, соединяют при помощи лигазной реакции, после чего реакционную смесь трансфицируют в компетентные клетки E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую антибиотик (канамицин). Из отобранных методом ПЦР (с помощью универсальных праймеров для рЕТ-векторов) клонов выделяют целевую плазмидную ДНК (pET_TRIT-a). Нуклеотидную последовательность встроенного фрагмента подтверждают секвенированием по Сенгеру. Отобранные клоны наращивают для оценки продуктивности, устойчивости к антибиотикам и стабильности трансформации.
Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-a-GM, без лидерного пептида и гранулин-подобного домена, с N-концевой полигистидиновой последовательностью, SEQ ID NO:2) для экспрессии в бактериальной системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-a в качестве матрицы и праймеров: 5'tatacatatgtcgatcgtgtcgtacgg (сайт рестрикции NdeI выделен подчеркиванием) и 5'-ttctcgagttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции XhoI выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионную плазмиду pET-15b (Novagen, Germany) по сайтам рестрикции NdeI и XhoI, используя штамм E.coli Rosetta garni В (DE3). Скрининг колоний проводят методом рестрикционного анализа и последующего секвенирования.
Аналогичным образом осуществляют конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (Triticain-a-GM-6HIS), без лидерного пептида и гранулинподобного домена, с С-концевой полигистидиновой последовательностью, SEQ ID NO:3), используя следующую пару праймеров: 5'-ataccatggcgctgccggagaccgtcg и 5'-attctcgagtcagtggtggtggtggtggtggcccgtcttcgtcgggt и сайты рестрикции NcoI и XhoI соответственно (выделены подчеркиванием).
Пример 2. Клонирование фрагмента гена тритикаина-альфа для дрожжевой экспрессии белка в растворимой форме.
Конструирование новой последовательности ДНК, кодирующей усеченный фрагмент гена тритикаина-альфа (γ-Triticain-a-GM, SEQ ID NO:4) для экспрессии в дрожжевой системе, осуществляют на основе плазмидной ДНК pET_TRIT-a в качестве матрицы и праймеров: 5'-tgaattctccatcgtgtcgtacggg (сайт рестрикции EcoRI выделен подчеркиванием) и 5 '-attgcggccgcttagcccgtcttcgtcgg (сайт рестрикции NotI выделен подчеркиванием). Продукт амплификации клонируют в экспрессионный вектор Pichia pastoris pPIC9 по указанным сайтам, который позволяет получать целевой белок в секретируемом виде за счет сигнальной последовательности (α-фактора).
Пример 3. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в E.coli.
Штамм E.coli Rosetta gami В (DE3), трансформированный плазмидой рЕТ15-6HIS-Triticain-α-GM выращивают в среде LB (10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 5 г/л NaCl) при 37°С в аэробных условиях с добавлением ампициллина (до конечной концентрации 50 мг/мл) в течение 12-14 ч (посевной материал), инокулируют новую порцию питательной среды в соотношении 1:50, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, охлаждают во льду в течение 15 мин и индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ, после чего клетки продолжают инкубировать 20 ч при 18°С. При индукции ИПТГ происходит биосинтез рекомбинантного 6HIS-Triticainα-GM (SEQ ID NO:2), который накапливается в клетках как в растворимой форме, так и в тельцах включения (фиг. 1). Отбирают пробы клеточной суспензии до и после индукции в количестве, соответствующем 0.1 оптических единиц (о.е.), осаждают центрифугированием, суспендируют в лизирующем буфере (0.03 М Трис-HCl, рН 6.8, 10% глицерин, 1% додецилсульфат натрия, 3% меркаптоэтанол, 0.005% бромфеноловый синий), нагревают 5 мин при 95°С, и образцы объемом 20 мкл анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют для определения относительного количества белка в полосе целевого белка (фиг. 1). По данным сканирования содержание рекомбинантного 6HIS-Triticain-a-GM составляет 15-20% от всех клеточных белков.
Аналогичным образом осуществляют экспрессию фрагмента тритикаина-альфа Triticain-a-GM6HIS (SEQ ID NO:3), используя трансформированные плазмидой pET15-Triticain-a-GM-6HIS клетки штамма Rosetta gami В (DE3). Результат биосинтеза рекомбинантного белка анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (фиг. 2). По данным сканирования геля содержание рекомбинантного Triticain-a-GM-6HIS составляет 15-20% от всех клеточных белков, причем целевой белок синтезируется в бактериальных клетках исключительно в растворимой форме.
Пример 4. Получение высокоочищенного препарата рекомбинантного фрагмента тритикаина-альфа
- 4 038578 из E.coli.
Очистку целевых белков 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-a-GM-6HIS (SEQ ID NO:3) проводят методом аффинной (металл-хелатной) хроматографии. Получение рекомбинантного 6HISTriticain-a-GM и Triticain-a-GM-6HIS из клеток штаммов-продуцентов Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HISTriticain-a-GM и Rosetta gami B (DE3)/pET15-Triticain-a-GM-6HIS соответственно, включает несколько стадий. Осажденную центрифугированием клеточную биомассу экспрессионной культуры ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин (12x5 с) при 4°С. Полученную после центрифугирования лизата (10000xg, 4°C, 15 мин) надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А. Процесс хроматографии проводят на системе BioLogic (BioRad) с детекцией при 280 нм. Сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А. Связавшийся с сорбентом белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола. Раствор диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Концентрацию целевого белка определяют с помощью ВСА-реагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
Выход полученных таким способом рекомбинантных вариантов усеченного тритикаина-альфа в растворимой форме составляет не менее 15 мг (15-24 мг) с 1 л для бактериальной культуры Rosetta gami В (DE3)/pET15-6HIS-Triticain-a-GM и не менее 5 мг с 1 л - для Rosetta gami В (DE3)/pET15-Triticain-aGM-6HIS. Чистота полученных препаратов по данным электрофоретического анализа составляет не менее 85% (фиг. 1, 2; следует отметить, что целевые белки 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2) и Triticaina-GM-6HIS (SEQ ID NO:3), проявляющие протеолитическую активность, подвергаются автопротеолизу в процессе выделения).
Пример 5. Экспрессия фрагмента тритикаина-альфа пшеницы в растворимой форме в P. pastoris.
Для трансформации клеток Pichia pastoris дрожжевой экспрессионной плазмидой pPIC9-Triticain-aGM был использован ауксотрофный по гистидину штамм Pichia pastoris GS115 (His-, Mut+). Плазмиду pPIC9-Triticain-a-GM линеаризуют по сайту BglII. Трансформацию клеток Pichia pastoris проводят методом электропорации. Клетки штамма GS115 высевают на чашку с агаризованной средой YPD (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% глюкоза) и инкубируют при 30 °С 2 дня до появления отдельных колоний. Одной колонией инокулируют 5 мл среды YPD в колбе объемом 50 мл и наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин. Далее 200 мл свежей среды YPD засевают 0.2 мл ночной культуры и снова наращивают клетки в течение ночи при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности клеточной суспензии А600 1.5. Клетки осаждают центрифугированием (1500x g, 5 мин, 4°С), осадок дважды промывают 200 мл и 100 мл охлажденной во льду стерильной воды соответственно, после чего клетки снова осаждают и ресуспендируют в 8 мл холодного 1 М сорбита. Затем клетки снова осаждают и ресуспендируют в 0.6 мл ледяного 1 М сорбита. 40 мкл клеточной суспензии смешивают с 5 мкг линеаризованной плазмиды в 10 мкл буфера ТЕ (0.01 М Трис-HCl, 0.001 М ЭДТА, рН 8.0). Смесь помещают в охлажденную 2 мм кювету и охлаждают во льду 5 мин. Затем кювету помещают в отсек шоковой камеры электропоратора и генерируют единичный импульс. Кювету извлекают из камеры и быстро добавляют 1 мл ледяного 1 М сорбита. Содержимое кюветы переносят в стерильные микропробирки. По 100, 300 и 600 мкл клеточной суспензии, трансформированной линеаризованной плазмидой pPIC9-Triticain-a-GM, растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой. Для контроля выживаемости по 10 мкл клеточных суспензий после электропорации суспендируют в 100 мкл 1 М сорбита и по 10 мкл растирают на чашках Петри с агаризованной YPD средой. Чашки инкубируют при 30°С до появления колоний (2-4 дня).
В зависимости от способа рекомбинации и локуса встраивания линеаризованной плазмиды трансформированные клетки Pichia pastoris GS115 (Mut+) могут приобретать MutS фенотип. Для подтверждения Mut+ и MutS фенотипов трансформантов колонии высевают на чашки с минимальной агаризованной средой, содержащей метанол и глюкозу (ММ и MD соответственно), подразумевая, что дрожжевые клетки фенотипа MutS делятся в ММ среде медленнее, чем в MD среде (что визуально определяется сравнением размеров колоний на ММ и MD чашках через 2-3 суток инкубации при 30°С). Точную принадлежность дрожжевых трансформантов к Mut+ или MutS фенотипу подтверждают методом полимеразной цепной реакции. Для этого из выбранных клонов с ММ и MD чашек выделяют ДНК и анализируют методом ПЦР с использованием прямого 5'AOX1 (gactggttccaattgacaagc) и обратного 3'AOX1 (gcaaatggcattctgacatcc) праймеров при условиях амплификации: 95°С 3 мин, денатурация 95°С 30 с, 30 циклов, отжиг 54°С 30 с, элонгация 72°С 2 мин, затем 72°С 5 мин. Пробы анализируют методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. По размерам ампликонов ДНК клонов Mut+ и MutS фенотипа (2140 п.н. и 1476 п.н. соответственно) выявляют преобладающий фенотип (Mut+). Полученные трансформанты Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-a-GM содержат как минимум одну копию фрагмента гена тритикаина-альфа. По результатам анализа отбирают несколько клонов Mut+
- 5 038578 и MutS фенотипов для экспрессии целевого рекомбинантного белка.
Для получения двойных трансформантов линеализированную по сайту рестрикции SalI плазмиду pPIC9K-Triticain-a-GM трансформировали в полученные ранее клетки Pichia pastoris GS115/pPIC9Triticain-a-GM (Mut+ и MutS). Отбор двойных трансформантов проводили на генетицинсодержащей среде (0,15 мг/мл).
Для исследования способности трансформантов P.pastoris Mut+ и MutS фенотипов секретировать γTriticain-a-GM (SEQ ID NO:4) одной колонией каждого клона трансформанта и контрольных штаммов со свежих чашек инокулируют 4 мл среды BMGY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34% YNB, 4x10-5% биотин, 1% глицерин, 0.1 М фосфат калия, рН 6.0). Клеточную массу наращивают при 30°С в шейкер-инкубаторе при 300 об/мин до достижения А600 1 о.е. (для Mut+) и А600 5 о.е. (для MutS). Для АОХ-контролируемой индуции экспрессии клеточные суспензии в объеме, содержащем 5 о.е. (Mut+) или 25 о.е. (MutS), осаждают центрифугированием и осадки ресуспендируют в 5 мл среды BMMY (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 1.34% YNB, 4x10-5% биотин, 0.5% метанол, 0.1 M фосфат калия, рН 6.0). Клетки инкубируют в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин. Каждые 24 ч добавляют метанол до конечной концентрации 0.7%. После окончания инкубации клетки осаждают центрифугированием (4000xg, 5 мин, 4°С). Супернатанты отбирают, замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С до последующего анализа. Наличие рекомбинантного γ-Triticain-a-GM в супернатантах клеточной культуры P. pastoris определяют методом электрофореза в 14% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Пример 6. Получение высокоочищенного рекомбинантного γ-Triticain-a-GM из Pichia pastoris.
Надосадочную культуральную жидкость Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-a-GM фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, трижды производя замену буфера на свежий. Диализат концентрируют ультрафильтрацией на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore) и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащем 130 мМ NaCl. Процесс гель-фильтрации проводят со скоростью 0,5 мл/мин, фракции по 6 мл собирают и анализируют на присутствие целевого белка методами электрофоретического анализа и определения протеолитической активности. Очищенный белок концентрируют на ячейке Amicon с мембраной RC-10 (Millipore), определяют концентрацию с помощью ВСАреагента (бицинхониновой кислоты), аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
Выход полученного таким способом рекомбинантного γ-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:4) составляет 80-300 мг с 1 л дрожжевой культуры (с чистотой не менее 90% по данным электрофоретического анализа, фиг. 3; следует отметить, что целевой белок γ-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:4) в процессе секреции подвергается автопротеолизу).
Пример 7. Определение протеолитической активности вариантов рекомбинантных белков усеченного тритикаина-альфа (6HIS-Triticain-a-GM, Triticain-a-GM-6HIS и γ-Triticain-a-GM).
Ферментативную (протеолитическую) активность рекомбинантного усеченного тритикаина-альфа определяют по способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат PLVQ-AMK, конъюгированный с 7-амино-4-метилкумарином (АМК), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK. Последовательность и структура выбранного пептида PLVQ (пролин-лейцин-валин-глутамин), представляющего собой фрагмент глютена, являются оптимальными для связывания и гидролиза тритикаином-альфа [заявка WO 2008115428 А2, 25.09.2008].
Анализ проводят при 25°С в реакционной смеси, состоящей из 20 нМ целевого белка (рекомбинантного тритикаина-альфа) и 50 мкМ PLVQ-AMK в 200 мМ ацетатном буфере, рН 5.6, содержащем 100 мМ NaCl, 15 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.6 мМ ЭДТА, 0.5% ДМСО. Количество гидролизованного субстрата PLVQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного AMK с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм. Скорость реакции определяли по графику зависимости количества субстрата (моль) от времени гидролиза (с) с последующей обработкой полученных данных с применением метода линейной регрессиии. Для репрезентативности данные по специфической активности представлены в виде гистограммы (фиг. 4).
Сравнивали активность полученных препаратов усеченного тритикаина-альфа, полученного в растворимой форме, с препаратами усеченного тритикаина-альфа, полученного ранее в нашей лаборатории в нерастворимой форме и папаином.
Активность белковых препаратов усеченного тритикаина-альфа, полученного в растворимой форме 6HIS-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:2) и Triticain-a-GM-6HIS (SEQ ID NO:3) значительно превысила активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS-Triticain-a-GM, полученного в нерастворимой форме, а также папаина, что является существенным преимуществом препаратов, полученных нами в рамках данной заявки. Активность препарата усеченного тритикаина-альфа γ-Triticain-a-GM (SEQ ID NO:4), полученного в дрожжевой экспрессионной системе, оказалась ниже, чем активность препарата усеченного тритикаина-альфа 6HIS-Triticain-a-GM, полученного в нерастворимой форме, и папаина, однако при- 6 038578 нимая во внимание высокое содержание в препарате и высокий выход при экспрессии белка γ-Triticain-aGM, такой результат также является промышленно применимым и технически значимым.
Преимуществами заявленного технического решения являются, во-первых, получение протеолитически активного препарата тритикаина-альфа, состоящего из пропептидного (продомена) и каталитического доменов полноразмерного тритикаина-альфа пшеницы, который может быть использован для создания новых более эффективных лекарственных энзиматических средств, а также в исследовательстких целях, в частности для изучения функционирования папаинподобных цистеиновых протеиназ; вовторых, возможность получения вариантов протеолитически активного тритикаина-альфа в растворимой форме как в бактериальных, так и в дрожжевых клетках; в-третьих, упрощенная методика выделения вариантов рекомбинантного белка из E.coli за счет исключения стадии рефолдинга in vitro, т.е. времязатратной и сложно валидируемой процедуры, что впоследствии послужит основой для создания ферментных лекарственных средств в терапии некоторых заболеваний (в частности, целиакии).
Claims (9)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаинподобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что белок экспрессируется в растворимой форме и представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2-4.
- 2. Способ получения биологически активного белкового препарата по п.1, обладающего специфической активностью папаинподобных цистеиновых протеиназ, характеризующийся тем, что включает трансформацию клеток плазмидами, содержащими ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-4, культивирование и выделение биологически активного препарата.
- 3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидами, содержащими последовательности ДНК, кодирующие белки с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2-3, используют клетки E. coli штамма Rosetta gami В (DE3), в качестве среды культивирования используют среду LB с добавлением ампициллина и инкубируют при 37°С в аэробных условиях в течение 12-14 ч, посевным материалом инокулируют питательную среду, растят культуру до достижения оптической плотности А600 0.6-0.8, индуцируют 1 мМ изопропилтио-в-Э-галактозидом и растят еще 20 ч при 18°С с накоплением растворимой формы белка, а выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования экспрессионной культуры, после чего осадок ресуспендируют в 0.02 М фосфатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl и 0.01 М имидазол (буфер А), и гомогенизируют на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при 4°С, полученный лизат центрифугируют, надосадочную жидкость наносят на колонку с активированной ионами никеля иминодиацетат-сефарозой, уравновешенную буфером А, сорбент последовательно промывают уравновешивающим буфером А, затем белок элюируют буфером А с содержанием 0.3 М имидазола, далее раствор белка диализуют против 0.02 М фосфатного буфера, рН 8.0 и после определения концентрации и протеолитической активности белка в полученном препарате аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
- 4. Способ по п.2, характеризующийся тем, что для трансформации плазмидой, содержащей последовательность ДНК, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, используют клетки P. pastoris штамма GS115, в качестве среды культивирования используют среду YPD и инкубируют при 30°С в шейкер-инкубаторе до достижения оптической плотности А600 1.5, клеточные суспензии растирают на чашке Петри с минимальной безгистидиновой агаризованной средой и инкубируют при 30°С до появления колоний, затем одной колонией полученных трансформантов Pichia pastoris GS115/pPIC9-Triticain-a-GM, содержащих одну или две копии фрагмента гена усеченного тритикаинаальфа, инокулируют питательную среду BMGY и наращивают клеточную массу при 30°С в шейкеринкубаторе до оптической плотности 5 о.е. (Mut+) или 25 о.е. (MutS), выделение биологически активного препарата осуществляют осаждением путем центрифугирования, полученный осадок ресуспендируют в среде BMMY с последующим инкубированием в течение 96 ч при 30°С и 300 об/мин, добавляя каждые 24 ч в качестве индуктора экспрессии метанол до конечной концентрации 0.7%, затем клетки осаждают, отбирают супернатанты; далее надосадочную культуральную жидкость фильтруют (0.45 мкм) и диализуют против 0.02 М раствора фосфата натрия, рН 8.0 при 4°С в течение 24 ч, диализат концентрируют и наносят на колонку с сорбентом Sephacryl S-200HR, уравновешенную 0.02 М фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 130 мМ NaCl, далее собирают белковые фракции по 6 мл и анализируют на присутствие белка методами электрофоретического анализа и определяют концентрацию и протеолитическую активность, далее биологически активный белковый препарат аликвотируют по стеклянным флаконам, замораживают и лиофилизуют.
- 5. Нуклеиновая кислота, кодирующая биологически активный белковый препарат, обладающий специфической активностью папаинподобных цистеиновых протеиназ, по п.1, характеризующаяся тем, что предназначена для использования в способе по п.2.
- 6. Вектор экспрессии, характеризующийся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п.5 для ис-- 7 038578 пользования в способе по п.2.
- 7. Вектор экспрессии по п.6, характеризующийся тем, что представляет собой вектор на основе рЕТ15Ь или pPIC9.
- 8. Клетка-хозяин, характеризующаяся тем, что содержит нуклеиновую кислоту по п.5, кодирующую биологически активный белковый препарат по п.1, для использования в способе по п.2.
- 9. Клетка-хозяин по п.8, характеризующаяся тем, что представляет собой клетку E.coli штамма Rosetta gami В (DE3) или P.pastoris штамма GS115.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122806A RU2676322C1 (ru) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата |
| PCT/RU2018/050071 WO2019004878A1 (ru) | 2017-06-28 | 2018-06-28 | Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA202000021A1 EA202000021A1 (ru) | 2020-04-22 |
| EA038578B1 true EA038578B1 (ru) | 2021-09-17 |
Family
ID=64741789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA202000021A EA038578B1 (ru) | 2017-06-28 | 2018-06-28 | Препарат цистеиновой протеиназы пшеницы тритикаина-альфа, полученной в растворимой форме, и способ получения препарата |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11447780B2 (ru) |
| EA (1) | EA038578B1 (ru) |
| RU (1) | RU2676322C1 (ru) |
| WO (1) | WO2019004878A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110791534B (zh) * | 2019-11-27 | 2022-12-30 | 安徽师范大学 | 一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法 |
| RU2740319C1 (ru) * | 2020-03-19 | 2021-01-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Альфа-Тритикаин" | Способ повышения активности тритикаина-альфа |
| CN117143257B (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-09 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | Trim28-krab-znf10二元复合物、制备方法及用于前列腺癌筛查的试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2603054C2 (ru) * | 2015-02-17 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России) | Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008115428A2 (en) * | 2007-03-16 | 2008-09-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | A scaleable manufacturing process for cysteine endoprotease b, isoform 2 |
-
2017
- 2017-06-28 RU RU2017122806A patent/RU2676322C1/ru active
-
2018
- 2018-06-28 US US16/626,206 patent/US11447780B2/en active Active
- 2018-06-28 EA EA202000021A patent/EA038578B1/ru unknown
- 2018-06-28 WO PCT/RU2018/050071 patent/WO2019004878A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2603054C2 (ru) * | 2015-02-17 | 2016-11-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России) | Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SAVVATEEVA L.V. et al.: Glutenase and collagenase activities of wheat cysteine protease Triticain-: feasibility for enzymatic therapy assays, The international journal of biochemistry & cell biology, 2015, vol. 62, pp. 115-124, abstract, pp. 116, 117, Fig. 1 * |
| VORA H. et al.: A scaleable manufacturing process for pro-EP-B2, a cysteine protease from barley indicated for celiac sprue, Biotechnology and bioengineering, 2007, vol. 98, No. I, pp. 177-185, abstract * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA202000021A1 (ru) | 2020-04-22 |
| US11447780B2 (en) | 2022-09-20 |
| US20220162619A1 (en) | 2022-05-26 |
| WO2019004878A1 (ru) | 2019-01-03 |
| RU2676322C1 (ru) | 2018-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102699074B1 (ko) | 재조합 숙주 세포에서 탄소 공급원 조절된 단백질 생산 | |
| Kornelyuk et al. | Cytokine activity of the non-catalytic EMAP-2-like domain of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase | |
| Lin et al. | High-level expression and characterization of the thermostable leucine aminopeptidase Thelap from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in Aspergillus niger and its application in soy protein hydrolysis | |
| Zhang et al. | Gene expression and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) in Escherichia coli | |
| US11447780B2 (en) | Preparation of wheat cysteine protease triticain-alpha produced in soluble form and method of producing same | |
| Shu et al. | Expression, activation and characterization of porcine trypsin in Pichia pastoris GS115 | |
| CN117402860B (zh) | 一种链霉菌胰蛋白酶突变体及其应用 | |
| Nwankwo et al. | Extracellular proteases from halophiles: diversity and application challenges | |
| CN102994601A (zh) | 一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法 | |
| RU2603054C2 (ru) | Способ получения белков семейства цистеиновых протеаз пшеницы (triticum aestivum) и препарат белка тритикаин-альфа, полученный этим способом | |
| Yuan et al. | The role of thioredoxin and disulfide isomerase in the expression of the snake venom thrombin-like enzyme calobin in Escherichia coli BL21 (DE3) | |
| AU2004213586B2 (en) | Use of caspase enzymes for maturation of engineered recombinant polypeptide fusions | |
| CN109679941B (zh) | 一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用 | |
| CN103282490B (zh) | 在酵母中产生肠激酶的组合物和方法 | |
| KR101634078B1 (ko) | 봉입체 형성 단백질의 제조방법 | |
| CN113166231A (zh) | 胰凝乳蛋白酶抑制剂变体及其用途 | |
| MX2011007492A (es) | Proteinas de fusion, proceso de preparacion y uso de estas en sistemas de expresion de proteinas recombinantes. | |
| CN113736766B (zh) | 胶原蛋白水解酶及其编码基因、制备方法和用途 | |
| CN113755474B (zh) | 一种羧肽酶及其编码基因和应用 | |
| WO2004106524A1 (ja) | プロテアーゼ、このプロテアーゼをコードするｄｎａ、プロテアーゼの製造方法 | |
| CN104711200A (zh) | 一种中性蛋白酶生产菌株及其应用 | |
| Park et al. | Site-directed mutagenesis of conserved Trp39 in Rhizomucor pusillus pepsin: possible role of Trp39 in maintaining Tyr75 in the correct orientation for maximizing catalytic activity | |
| EP2976356B1 (en) | Aspartic proteases | |
| Guerrero‐Olazarán et al. | Recombinant shrimp (Litopenaeus vannamei) trypsinogen production in Pichia pastoris | |
| CN111466511B (zh) | 含有去环氧基蛋白酶的组合物及脱毒方法 |