EA034306B1 - Основанные на близости расположения способы выбора партнеров для связывания - Google Patents
Основанные на близости расположения способы выбора партнеров для связывания Download PDFInfo
- Publication number
- EA034306B1 EA034306B1 EA201790725A EA201790725A EA034306B1 EA 034306 B1 EA034306 B1 EA 034306B1 EA 201790725 A EA201790725 A EA 201790725A EA 201790725 A EA201790725 A EA 201790725A EA 034306 B1 EA034306 B1 EA 034306B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell
- receptor
- specified
- sequence
- transmembrane domain
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 126
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 93
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 51
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 157
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 95
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 90
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 90
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 81
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 53
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 49
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 39
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 35
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 35
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 29
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 29
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 claims description 18
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 9
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 9
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 9
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 8
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005763 Thrombopoietin Receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010070774 Thrombopoietin Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 claims 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 35
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 11
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 11
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 11
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 11
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 11
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 9
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102100032882 Glucagon-like peptide 1 receptor Human genes 0.000 description 3
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 3
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 3
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- 102100038896 Transmembrane protein domain Human genes 0.000 description 3
- 101710141239 Transmembrane protein domain Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- -1 fe nilalanine Chemical compound 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 3
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- SFKQVVDKFKYTNA-OGNLOKFRSA-N (2S)-N-[(2R)-6-amino-1-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]-1-oxohexan-2-yl]-1-[(4R,7S,10S,13S,16S,19R)-19-amino-7-(2-amino-2-oxoethyl)-10-(3-amino-3-oxopropyl)-13,16-dibenzyl-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carbonyl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound NCCCC[C@@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1)C(=O)NCC(N)=O SFKQVVDKFKYTNA-OGNLOKFRSA-N 0.000 description 2
- MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-(4-aminophenoxy)-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MIAKOEWBCMPCQR-YBXAARCKSA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010002724 Pheromone Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038344 Vomeronasal type-1 receptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 239000002427 pheromone receptor Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 239000010754 BS 2869 Class F Substances 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 1
- 102000003858 Chymases Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101001004391 Drosophila melanogaster Protein jim lovell Proteins 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000038630 GPCRs class A Human genes 0.000 description 1
- 108091007907 GPCRs class A Proteins 0.000 description 1
- 102000027582 GPCRs class B Human genes 0.000 description 1
- 108091008883 GPCRs class B Proteins 0.000 description 1
- 108091008885 GPCRs class E Proteins 0.000 description 1
- 108091008884 GPCRs class F Proteins 0.000 description 1
- 102000027587 GPCRs class F Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 241000270431 Heloderma suspectum Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001539176 Hime Species 0.000 description 1
- 108010072039 Histidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101100261153 Mus musculus Mpl gene Proteins 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016978 Orphan receptors Human genes 0.000 description 1
- 108070000031 Orphan receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000775914 Valdivia <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000003283 colorimetric indicator Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu].[Cu] LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007930 cytoplasmic receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 102000027412 enzyme-linked receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008592 enzyme-linked receptors Proteins 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- WLHQHAUOOXYABV-UHFFFAOYSA-N lornoxicam Chemical compound OC=1C=2SC(Cl)=CC=2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 WLHQHAUOOXYABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006239 metabotropic receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004083 metabotropic receptors Proteins 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
В изобретении предложены способы идентификации партнеров для связывания (например, пептидных лигандов), которые связываются с целевым белком (например, клеточным рецептором). Указанные способы предусматривают совместно локализованную экспрессию целевого белка и потенциальных партнеров для связывания и выбор партнеров для связывания на основании близости расположения в плазматической мембране.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Заявка на патент испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/066105 (поданной 20 октября 2014 г.). Указанная предварительная заявка включена в настоящий документ посредством ссылки полностью и для любых целей.
Уровень техники
Внутриклеточные комбинаторные библиотеки являются очень перспективными с точки зрения получения новых агонистов и других молекул, изменяющих физиологию клетки. При этом имеется потребность в универсальном механизме считывания, обеспечивающем количественную оценку в широком динамическом диапазоне. Так, существующие способы отбора для идентификации агонистов в растворе обычно зависят от их взаимодействия с рецепторами, которое изменяет их физическое состояние таким образом, что они активируют домен внутриклеточной передачи сигнала, который соединен с негативной репортерной системой. Соответственно, для каждой репортерной системы требуется отдельная конструкция, природа которой зависит от специфической информации о клеточной и молекулярной биологии рассматриваемой системы. Такая схема выбора не может обеспечить получения систем, способных регистрировать происходящее связывание, в частности, в тех случаях, когда неизвестен механизм передачи сигнала.
В данной области техники имеется потребность в более динамичных и универсальных основанных на происходящем связывании способах отбора лигандов. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение указанной и других имеющихся в данной области техники потребностей.
Краткое описание изобретения
Изобретение обеспечивает способы идентификации партнера для связывания, который связывается с целевым полипептидом в естественной клеточной среде. Согласно некоторым способам указанный целевой полипептид коэкспрессируют в клетке вместе с комбинаторной библиотекой потенциальных партнеров для связывания с применением лентивирусного вектора. Согласно некоторым способам указанные потенциальные партнеры для связывания содержат фермент, который расщепляет сигнальную молекулу, соединенную с целевым полипептидом, обеспечивая передачу сигнала в синтетическую репортерную систему в клетке.
Согласно некоторым вариантам реализации предложенные в настоящем изобретении способы предусматривают: (а) получение первой конструкции, экспрессирующей первую гибридную молекулу, содержащую целевой полипептид, содержащий первый трансмембранный домен (TM), и второй конструкции, экспрессирующей комбинаторную библиотеку вторых гибридных молекул, в каждой из которых содержится потенциальный партнер для связывания, присоединенный ко второму трансмембранному домену (TM), при этом одна из указанных гибридных молекул дополнительно содержит фермент, а другая гибридная молекула дополнительно содержит последовательность субстрата указанного фермента и активатор искусственного сигнального пути, (b) экспрессию указанной первой конструкции и указанной второй конструкции в клетке-хозяине для получения популяции клеток, при этом каждая клетка содержит первую гибридную молекулу и вторую гибридную молекулу, которые совместно локализованы (колокализованы) на плазматической мембране, (с) выбор клетки, в которой активирован искусственный сигнальный путь, из популяции клеток, и (d) идентификацию второй гибридной молекулы в выбранной клетке. Идентифицированная вторая гибридная молекула из выбранной клетки обеспечивает обнаружение партнера для связывания целевого полипептида.
Согласно некоторым из указанных способов указанный первый трансмембранный домен (TM) представляет собой природный домен целевого полипептида. Согласно некоторым способам указанный первый трансмембранный домен (TM) рекомбинантным способом присоединен к указанному целевому полипептиду. Согласно некоторым способам указанный фермент соединен через свой N-конец с вторым трансмембранным доменом, а указанная последовательность субстрата соединена с первым трансмембранным доменом через свой N-конец и с указанным активатором через свой С-конец. Согласно некоторым способам расщепление указанной последовательности субстрата ферментом приводит к отсоединению активатора от второй гибридной молекулы. Согласно некоторым способам указанный целевой полипептид представляет собой клеточный рецептор, а указанный партнер для связывания представляет собой лиганд указанного рецептора. Согласно некоторым из указанных способов указанный клеточный рецептор представляет собой рецептор клеточной поверхности, а указанный второй трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен рецептора тромбоцитарного фактора роста (рТФР, PDGFR, platelet-derived growth factor receptor). Некоторые из указанных способов направлены на сопряженные с G-белками рецепторы (GPCR). Некоторые из указанных способов направлены, в частности, на рецептор тромбопоэтина(рТПО, TpoR) или рецептор глюкагоноподобного пептида-1 (рГПП-1).
- 1 034306
Некоторые предложенные в изобретении способы предусматривают использование фермента, представляющего собой протеазу. Согласно некоторым из указанных способов последовательность субстрата содержит сайт расщепления протеазы. Согласно некоторым из указанных способов указанная используемая протеаза представляет собой TEV-протеазу. Согласно некоторым из указанных способов указанная используемая последовательность субстрата включает
ENLYFQS (SEQ ID N0:4) (TEV1), ENFYFQS (SEQ ID
N0:5) (TEV2), ENLYYQS (SEQ ID N0:6) (TEV3) или ENLFFQS (SEQ ID N0:7) (TEV 4)
Некоторые предложенные в настоящем изобретении способы предусматривают использование клетки-хозяина, которая представляет собой клетку HEK293 или HEK293l·. Согласно некоторым способам указанная клетка-хозяин стабильно экспрессирует указанную первую гибридную молекулу. Согласно некоторым из указанных способов указанную вторую гибридную молекулу экспрессируют в клеткехозяине с помощью лентивирусного вектора.
Согласно некоторым способам согласно настоящему изобретению используемый потенциальный партнер для связывания представляет собой пептид или антитело. Согласно некоторым способам указанный потенциальный партнер для связывания соединен с вторым трансмембранным доменом с помощью линкерной последовательности. Согласно некоторым из указанных способов указанная линкерная последовательность может содержать 3, 5, 6, 8, 10 или более тандемных повторов θθθθδ (SEQ ID NO: 1).
Согласно некоторым способам согласно настоящему изобретению указанный активатор представляет собой транскрипционный фактор, а указанный искусственный сигнальный путь представляет собой экспрессию репортерного гена под контролем последовательности регуляции транскрипции, распознаваемой указанным транскрипционным фактором. Согласно некоторым из указанных способов указанный репортерный ген вводят в клетку-хозяина с помощью лентивирусного вектора. Согласно некоторым способам указанный репортерный ген вводят в клетку-хозяина до экспрессии гибридных молекул. Согласно некоторым способам указанный транскрипционный фактор представляет собой GLA4-V16, а указанная последовательность регуляции транскрипции содержит GAL4 UAS и поздний аденовирусный промотор. Согласно некоторым способам указанный используемый репортерный ген представляет собой ген люциферазы luc2P или репортерный ген tdTomato.
Лучшее понимание природы настоящего изобретения и обеспечиваемых им преимуществ может быть достигнуто путем ознакомления с остальными разделами настоящего описания и прилагаемой формулой изобретения.
Описание чертежей
Фиг. 1 - схематическое представление способа мониторинга взаимодействия, основанного на близости расположения (proximity based) рецептора с лигандом. (А) Мембранный белок сопряжен со специфическим путем передачи сигнала таким образом, что после стимуляции указанного мембранного белка растворимым или мембраносвязанным агонистом активируется экспрессия репортерного гена. (В) Основанная на близости расположения система выбора состоит из двух мембраносвязанных белков. Первый из указанных белков представлен большой библиотекой мембраносвязанных потенциальных лигандов, присоединенных к протеазе TEV с внутриклеточной стороны. Далее, мембраносвязанный рецепторный белок содержит сайт расщепления TEV и искусственный транскрипционный фактор, присоединенный к нему с внутриклеточной стороны. В результате взаимодействия совместно локализованных рецепторного белка и лиганда, TEV и сайт распознавания TEV сближаются, что в значительной степени облегчает каталитическое высвобождение указанного транскрипционного фактора. Высвобождаемый транскрипционный фактор проникает в клеточное ядро, и активируется экспрессия репортерного гена;
фиг. 2 - основанная на близости расположения идентификация активации рецептора тромбопоэтина (рТПО). Получали стабильные линии клеток, несущих репортерный ген люциферазы под контролем UAS и сайт расщепления TEV рТПО/транскрипционный фактор. Клетки трансдуцировали лентивирусом, кодирующим связывающие тромбопоэтин (ТПО) или рТПО антитела 3D9 или 14F12. Гены, кодирующие разные линкеры, включающие 3, 5, 6, 8 или 10 копий (GGGGS) (SEQ ID NO: 1) или Fc IgG1 человека встраивали между лигандом и трансмембранным доменом рТФР. Активность люциферазы измеряли через 2 дня после инфицирования. Линию клеток, несущих сайт расщепления TEV рГПП-1/транскрипционный фактор, использовали в качестве клеток для отрицательного контроля. Реакцию контролировали на основании изменения люминесцентных сигналов относительно контрольного лентивируса, несущего нерелевантные антитела с линкером того же типа и длины;
фиг. 3А - основанная на близости расположения реакция на рецептор глюкагоноподобного пептида1 (рГПП-1). Полноразмерный рГПП-1 (1-463) и усеченный рГПП-1 (1-426) соединяли с сайтом расщепления TEV и транскрипционным фактором на С-конце. Получали стабильные линии клеток, несущих репортерный ген люциферазы под контролем UAS, и разные конструкции рГПП-1. Клетки трансдуцировали лентивирусом, кодирующим естественный лиганд рГПП-1, эксендин-4, в качестве положительного контроля, или нерелевантные антитела в качестве отрицательного контроля. Активность люциферазы измеряли через 1-3 дня после инфицирования. Люминесцентные сигналы от инфицированных клеток разделяли на сигналы от соответствующих неинфицированных клеток с получением отношения сигнал/шум (С/Ш);
- 2 034306 фиг. 3В - увеличение значения отношения сигнал/шум за счет изменения сайта расщепления TEV. Для конструкций с рГПП-1 (1-426) использовали четыре сайта расщепления TEV, расщепляемые с варьирующей эффективностью. Стабильные линии клеток, содержащие конструкции рГПП-1 с разными последовательностями субстрата TEV, трансдуцировали лентивирусом, кодирующим естественный лиганд рГПП-1, эксендин-4, в качестве потенциально обеспечивающей положительный результат конструкции, или Vc1.1 или нерелевантные антитела в качестве отрицательного контроля. Активность люциферазы измеряли через 1-3 дня после инфицирования. Люминесцентные сигналы от инфицированных клеток разделяли на сигналы от соответствующих неинфицированных клеток;
фиг. 4 - флуоресцентные белки в качестве репортерных генов для основанного на близости расположения способа. Исследовали стабильные линии клеток, содержащих репортерный ген tdTomato под контролем UAS и конструкции рПП1-1 с разными сайтами расщепления TEV. Указанные клетки трансдуцировали лентивирусом, содержащим эксендин-4 в качестве обеспечивающей положительный результат конструкции или нерелевантные антитела в качестве отрицательного контроля. Селективную экспрессию флуоресцентного белка наблюдали через 2 дня после инфицирования.
Подробное описание изобретения
I. Общая информация.
В изобретении предложены способы идентификации партнеров для связывания целевых белков или полипептидов. Целевой белок может представлять собой любой белок или полипептид, способный связываться с другой полипептидной или пептидной молекулой, например рецепторами клеточной поверхности, ядерными рецепторами и другими лигандсвязывающими белками. Указанные способы основаны на совместно локализованной (колокализованной) экспрессии целевого белка (например, клеточного рецептора) с потенциальными партнерами для связывания (например, потенциальными полипептидными лигандами), и осуществлении выбора в основанном на близости расположения формате. Настоящее изобретение частично основано на полученной авторами настоящего изобретения универсальной системе идентификации лигандов клеточных рецепторов. В указанной системе используется увеличение скорости химических процессов, вызванное эффектами близости - пространственным сближением лиганда и его рецептора. В указанной системе используется искусственный путь передачи сигнала; соответственно, она не зависит от конкретной химической природы системы рецептор/лиганд или соответствующего механизма передачи сигнала. Указанный способ обеспечивает возможность аутокринного выбора молекул из больших библиотек, взаимодействующих с рецепторами при нахождении в естественной среде. Согласно подробному описанию в настоящем документе, в настоящем изобретении предложен новый универсальный способ детекции активности связывания лигандов с рецепторами. В частности, это имеет большое значение в ситуациях, когда механизм дальнейшей передачи сигнала неизвестен.
Эффекты близости (proximity effects), выражающиеся в форме эффективной молярности, регулируют многие биологические процессы в клетке. Такие эффекты близости могут достигаться за счет компартментализации, прикрепления к поддерживающим молекулам или секвестрации в активных сайтах фермента. Эффективная молярность может составлять до 100-1010 М. В настоящем изобретении выбор подходящей системы фермент/субстрат, оптимальной затрудненности реакции и оптимизированной длины линкеров обеспечивает получение надежной универсальной системы, которая может применяться для конструирования репортерной системы для большинства мембранных рецепторов и других связывающих белков. В отличие от уже известных в данной области техники способов выбора, основанные на близости расположения репортерные системы согласно настоящему изобретению используют исключительно наличие или отсутствие взаимодействия между двумя молекул, и не зависят от дальнейших условий конкретных естественных путей. Вместо этого указанная система соединена с универсальной репортерной системой, на химические характеристики которой эффекты близости влияют положительным образом, по сравнению с конкурентными реакциями. Соответственно, в контексте сложной системы, такой как клетка, индуцированная эффективная молярность становится показателем специфичности, способствующей определенному взаимодействию.
Согласно подробно описанному в настоящем документе, способы согласно настоящему изобретению предусматривают использование внутриклеточных комбинаторных библиотек потенциальных партнеров для связывания, а также экспрессионной системы, в которой указанный потенциальный партнер для связывания и представляющий интерес белок (например, целевой рецептор) совместно локализованы в клеточных компартментах (например, плазматической мембране). Указанные внутриклеточные комбинаторные библиотеки могут экспрессировать до 1,0х108 разных антител или пептидов в клетках, также экспрессирующих представляющий интерес белок. Указанная экспрессионная система позволяет добиться секвестрации и более высоких показателей эффективной молярности взаимодействующих молекул относительно возможных при их взаимодействии в основном растворе. Кроме того, используют репортерную фермент-субстратную систему, которая может использовать преимущества указанного молекулярного взаимодействия в плазматической мембране и регистрировать его возникновение. Ферментсубстратную систему конструируют таким образом, что она применима к любым молекулярным взаимодействиям в клеточных компартментах.
- 3 034306
Лучшее понимание природы настоящего изобретения и обеспечиваемых им преимуществ может быть достигнуто путем ознакомления с остальными разделами настоящего описания и прилагаемой формулой изобретения.
II. Определения.
Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют значения, общеизвестные для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Специалист может ознакомиться с общими определениями многих терминов, используемых в настоящем описании, в следующих источниках: Academic Press Dictionary of Science and Technology, Morris (Ed.), Academic Press (1st ed., 1992); Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (Eds.), Oxford University Press (переизд., 2000); Encyclopaedic Dictionary of Chemistry, Kumar (Ed.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3rd ed., 2002); Dictionary of Chemistry, Hunt (Ed.), Routledge (1st ed., 1999); Dictionary of Pharmaceutical Medicine, Nahler (Ed.), Springer-Verlag Telos (1994); Dictionary of Organic Chemistry, Kumar and Anandand (Eds.), Anmol Publications Pvt. Ltd. (2002); и A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4th ed., 2000).
Кроме того, чтобы помочь читателю при практическом осуществлении настоящего изобретения, предложены приведенные ниже определения.
Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют значения, общеизвестные для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Специалист может ознакомиться с общими определениями многих терминов, используемых в настоящем описании, в следующих источниках: Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Smith et al. (eds.), Oxford University Press (переизд., 2000); Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Singleton et al. (Eds.), John Wiley & Sons (3PrdP ed., 2002); и A Dictionary of Biology (Oxford Paperback Reference), Martin and Hine (Eds.), Oxford University Press (4PthP ed., 2000). Кроме того, чтобы помочь читателю при практическом осуществлении настоящего изобретения, предложены приведенные ниже определения.
Приведенные в единственном числе термины, в том числе с дополнением указанный (ая, ое) включают соответствующие термины во множественном числе, если из контекста явным образом не следует иное. Аналогичным образом, предполагается, что термин или включает и, если из контекста явным образом не следует иное.
В настоящем документе термин аминокислота пептида относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют аналогичным встречающимся в природе аминокислотам образом. Встречающиеся в природе аминокислоты представлены аминокислотами, закодированными в генетическом коде, а также аминокислотами, которые были впоследствии модифицированы, например, гидроксипролином, γ-карбоксиглутаматом и О-фосфосерином. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, имеющим ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, т.е. содержащим атомы углерода, связанные с атомами водорода, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги содержат модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, однако сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота.
В настоящем документе термин содержащие или содержит применяют в отношении композиций, способов и соответствующего(их) им компонента(ов), существенных для настоящего изобретения, но, тем не менее, он не подразумевает исключения не указанных элементов, независимо от того, являются ли они существенными или нет.
В настоящем документе термин состоящий, по существу, из относится к элементам, необходимым для осуществления определенного варианта реализации. Указанный термин предусматривает возможность присутствия элементов, которые не оказывают существенного влияния на основную новую или функциональную характеристику (характеристики) указанного варианта реализации изобретения.
Термин состоящий из относится к композициям, способам и соответствующим им компонентам, описанным в настоящем документе, и исключает любые элементы, не представленные в указанном описании варианта реализации.
Термин приведение в контакт имеет обычное значение и относится к комбинированию двух или большего числа агентов (например, полипептидов или малых органических молекул), комбинированию агентов и клеток, или комбинированию двух популяций разных клеток. Контакт может происходить in vitro, например, при смешивании двух полипептидов или смешивании популяции антител с популяцией клеток в пробирке или в ростовой среде. Контакт может также происходить в клетке или in situ, например, при приведении в контакт двух полипептидов в клетке путем коэкспрессирования в указанной клетке рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих указанные два полипептида, или в клеточном лизате.
В случае последовательностей полипептидов консервативно модифицированные варианты относятся к варианту, содержащему консервативные замены аминокислот, замены остатков аминокислот на
- 4 034306 другой остаток аминокислоты, содержащий боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства остатков аминокислот с боковыми цепями, имеющими аналогичные заряды, были определены в данной области техники. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Термин сконструированная клетка, или рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клеткахозяин) относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной рассматриваемой клетки, но и всего потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации ввиду мутаций или воздействия окружающей среды, такое потомство фактически может не быть идентичным родительской клетке, однако при этом входит в объем термина клетка-хозяин в настоящем документе.
Эксендин-4 представляет собой агонист рецептора глюкагоноподобного пептида-1 (Г1П1-1) размером 39 аминокислот. Эксендин-4 присутствует в слюне ящерицы-ядозуба, Heloderma suspectum. Эксендин-4 отличается значимо более продолжительным периодом полувыведения относительно ГПП-1.
Гибридный белок или полипептид относится к полипептиду, состоящему по меньшей мере из двух полипептидов и связывающей последовательности, или функциональной связи между указанными двумя полипептидами, обеспечивающей образование одного непрерывного полипептида. Указанные два полипептида, объединенные в гибридный полипептид, как правило, происходят из двух независимых источников; соответственно, гибридный полипептид содержит два соединенных полипептида, которые обычно не объединяются в природе.
Гетерологичный в отношении двух полипептидов показывает, что указанные два полипептида не обнаруживаются в одной и той же клетке или в одном и том же микроорганизме в природе. Аллельные вариации или встречающиеся в природе мутационные явления не приводят к возникновению гетерологичной биомолекулы или последовательности согласно определению в настоящем документе. Гетерологичная область векторной конструкции представляет собой идентифицируемый сегмент полинуклеотида в составе большей полинуклеотидной молекулы, не обнаруживаемый в связанном с указанной большей молекулой состоянии в природе. Соответственно, в случаях, когда гетерологичная область кодирует ген млекопитающего, указанный ген обычно фланкирован полинуклеотидом, который не фланкирует указанный полинуклеотид генома млекопитающего в геноме исходного организма.
Термин выделенный означает, что полипептид или белок извлечен из естественного окружения. Однако некоторые из компонентов, обнаруживаемых совместно с указанным белком, могут по-прежнему быть обнаружены с выделенным белком. Соответственно, выделенный полипептид отличается от обнаруживаемого в природе, однако может представлять собой белок с чистотой, составляющей, по существу, менее 100%.
Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или большего числа нуклеиновых кислот или последовательностей полипептидов относятся к двум или большему числу одинаковых последовательностей или частей последовательностей. Две последовательности являются по существу, идентичными в том случае, если указанные две последовательности содержат определенный процент одинаковых остатков аминокислот или нуклеотидов (т.е. отличаются 60% идентичностью, необязательно 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% идентичностью на протяжении определенной области, или, если уточнение отсутствует, на протяжении всей последовательности) при сравнении и выравнивании с достижением максимального совпадения в пределах окна сравнения или в пределах заданной области, по оценке с применением одного из перечисленных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или неавтоматизированного выравнивания и визуального исследования. Необязательно, идентичность наблюдается на протяжении области, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 50 нуклеотидов (или 10 аминокислот), или, более предпочтительно, на протяжении области, длина которой составляет от 100 до 500 или 1000, или более нуклеотидов (или 20, 50, 200 или более аминокислот).
Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, с применением алгоритма локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970); с применением алгоритма гомологичного выравнивания Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970); с применением метода поиска подобия ПирсонаЛипмана (Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988); с применением компьютеризированных вариантов указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета программного обеспечения Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин); или с помощью неавтоматизированного выравнивания и визуального исследования (см., например, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)). Два примера алгоритмов, ко
- 5 034306 торые подходят для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, представлены алгоритмами BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в источниках: Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 и Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 :403-410, 1990 соответственно.
Помимо процента идентичности последовательностей, описанного выше, другим свидетельством того, что две последовательности нуклеиновых кислот или полипептидов, по существу, идентичны, является иммунологическая перекрестная реактивность полипептида, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, в отношении антител против полипептида, кодируемого второй нуклеиновой кислотой, согласно приведенному ниже описанию. Соответственно, полипептид, как правило, по существу, идентичен второму полипептиду, например, если указанные два пептида различаются только консервативными заменами. Другим свидетельством того, что две последовательности нуклеиновых кислот, по существу, идентичны, является то, что указанные две или комплементарные им молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, согласно приведенному ниже описанию. Еще одним свидетельством того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является возможность применения одинаковых праймеров для амплификации указанной последовательности.
Лиганд представляет собой молекулу, которую распознает конкретный антиген, рецептор или целевая молекула. Примеры лигандов, которые могут применяться при практической реализации настоящего изобретения, могут включать, не ограничиваясь перечисленными, агонисты и антагонисты клеточных мембранных рецепторов, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны, рецепторы гормонов, полипептиды, пептиды, ферменты, субстраты ферментов, кофакторы, лекарственные средства (например, опиаты, стероиды и т.п.), лектины, сахара, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, олигосахариды, белки и моноклональные антитела.
Связь относится к способам функционального связывания или функционального соединения двух биомолекул (например, полипептидов или полинуклеотидов, кодирующих два полипептида), включая, без ограничений, рекомбинантное слияние, ковалентное связывание, дисульфидные связи, ионные связи, водородные связи и электростатические связи. Гибридный или конденсированный относится к ковалентной связи. Линкер или спейсер относится к молекуле или группе молекул, соединяющих две биомолекулы, и служит для размещения указанных двух молекул в предпочтительной конфигурации с минимальными стерическими затруднениями.
Термин функционально связанный в отношении нуклеиновой кислоты относится к связи функционально взаимозависимых полинуклеотидных элементов. Нуклеиновая кислота функционально связана, если она находится в отношениях функциональной взаимозависимости с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию указанной кодирующей последовательностью. Функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК, как правило, непрерывны и, в тех случаях, когда необходимо объединить две кодирующие белки области, непрерывны и расположены внутри рамки считывания.
Если не указано иное, термины полипептид и пептид используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к полимерам из остатков аминокислот. Они включают как короткие олигопептиды (например, пептиды, длина которых составляет менее чем приблизительно 25 остатков), так и более длинные полипептидные молекулы (например, полимеры, длина которых составляет более чем приблизительно 25 или 30 остатков аминокислот). Как правило, длина потенциальных пептидных или полипептидных лигандов, используемых в настоящем изобретении, может составлять от приблизительно 4 остатков аминокислот до приблизительно 350 или более остатков аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации длина указанных пептидов или полипептидов составляет от приблизительно 6 остатков аминокислот до приблизительно 60 остатков аминокислот. Согласно некоторым другим вариантам реализации их длина может составлять от приблизительно 8 остатков аминокислот до приблизительно 40 остатков аминокислот. Указанные пептиды или полипептиды могут включать встречающиеся в природе полимеры аминокислот и не встречающийся в природе полимер аминокислот, а также полимеры аминокислот, в которых один или большее количество остатков аминокислот представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты. Если не указано иное, подразумевается, что конкретная последовательность полипептида также охватывает соответствующие консервативным образом модифицированные варианты.
В настоящем документе термин пептидный миметик или пептидомиметик относится к производному соединению референсного пептида, имитирующему биологические функции указанного пептида. Как правило, производное пептидомиметика по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 90% обеспечивает биологическую функцию референсного полипептида.
Термин функционально связанный относится к функциональной взаимосвязи двух или более полинуклеотидных сегментов (например, сегментов ДНК). Как правило, указанный термин относится к функциональной взаимосвязи последовательности регуляции транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промоторная или энхансерная последовательность функционально связана с кодирующей последовательностью, если она стимулирует или модулирует транскрипцию указанной кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой экспрессионной системе. Как
- 6 034306 правило, промоторные последовательности регуляции транскрипции, функционально связанные с транскрибируемой последовательностью, физически примыкают к указанной транскрибируемой последовательности, т.е. являются цис-действующими последовательностями. Однако некоторые последовательности регуляции транскрипции, такие как энхансеры, не обязательно должны физически примыкать к кодирующим последовательностям или быть расположены в непосредственной близости к кодирующим последовательностям, транскрипцию которых они повышают.
Если не указано иное, термин рецептор в широком смысле относится к молекуле, обладающей сродством к определенному лиганду. Рецепторы могут быть представлены встречающимися в природе или синтетическими молекулами. Они также могут применяться в неизмененном состоянии или в виде агрегатов с другими веществами. Рецепторы могут присоединяться, ковалентно или нековалентно, с элементом для связывания, либо непосредственно, либо при помощи специфического связывающего вещества. Типичным примером рецепторов, которые могут применяться при практической реализации настоящего изобретения, является сигнальный рецептор клеточной поверхности.
Выражение путь передачи сигнала или сигнальная активность (например, опосредованная рГИП-1 сигнализация) относится по меньшей мере к одной биохимической реакции, однако чаще к серии биохимических реакций, происходящих в результате взаимодействия клетки со стимулирующим соединением или агентом. Соответственно, при взаимодействии стимулирующего соединения с клеткой возникает сигнал, который передается по пути передачи сигнала, в конечном итоге приводя к клеточному ответу.
В настоящем документе термин вариант относится к молекуле (например, пептиду или полипептиду), которая содержит последовательность, по существу, идентичную последовательности референсной молекулы. Например, указанная референсная молекула может представлять собой полипептидный фермент согласно описанию в настоящем документе или его гибрид. Указанная референсная молекула может также представлять собой полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации указанный вариант может отличаться последовательностью, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или более идентичной последовательности референсной молекулы. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанный вариант отличается от референсной молекулы наличием одной или большего числа консервативных замен аминокислот. Согласно некоторым другим вариантам реализации вариант референсной молекулы представляет собой консервативно модифицированный вариант, например вариант с измененными последовательностями аминокислот (например, с одной или большим числом консервативных замен аминокислот), однако, по существу, сохраняет биологическую активность указанной референсной молекулы. Консервативные замены аминокислот хорошо известны специалисту в данной области техники.
Термин вектор предназначен для обозначения молекулы полинуклеотида, способной транспортировать другой полинуклеотид, к которому она была присоединена. Одним из типов векторов является плазмида, представляющая собой кольцевую петлю двуцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип векторов представлен вирусными векторами, отличающимися тем, что в вирусный геном могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть встроены в геном клетки-хозяина при введении в указанную клетку-хозяина; таким образом, они реплицируются вместе с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называются в настоящем документе рекомбинантными экспрессионными векторами (или просто экспрессионными векторами).
III. Экспрессионная система для основанного на близости расположения выбора.
В способах согласно настоящему изобретению задействована экспрессионная система которая позволяет закрепить и совместно локализовать экспрессируемый целевой белок (например, клеточный рецептор) и библиотеку потенциальных партнеров для связывания (например, потенциальных полипептидных лигандов) в клеточном компартменте, например в плазматической мембране. Указанные потенциальные партнеры для связывания экспрессируют с применением внутриклеточной комбинаторной библиотеки. Взаимодействие целевого белка и партнера для связывания активирует фермент-субстратную систему, регистрирующую возникновение молекулярного взаимодействия в указанном клеточном компартменте (например, плазматической мембране). Указанные целевой белок и партнер для связывания экспрессируют таким образом, что каждый из них соединен только с одним компонентом или несет только один компонент репортерной фермент-субстратной системы. Например, при использовании рецептора клеточной поверхности и пептидного лиганда указанная система функционирует только в том случае, если взаимодействие лиганда и рецептора обеспечивает сближение вступающих в реакцию молекул. Когда в результате указанного взаимодействия рецептор и его лиганд сближаются, протеолитическая реакция приводит к высвобождению активаторной или эффекторной молекулы, которая может обеспечивать детектируемый ответ в клетке-хозяине. Например, указанный активатор может представ
- 7 034306 лять собой пептидный или полипептидный транскрипционный фактор, который входит в ядро и связывается с промотором в ядре с активацией репортерного гена. Указанная экспрессионная система и итоговый формат выбора обеспечивают множество преимуществ. Например, указанная система позволяет проводить определение молекулярных взаимодействий обширного ряда потенциальных агонистов в физиологически релевантной среде интактной живой клетки. Кроме того, указанная система позволяет осуществлять поиск лигандов рецепторов в тех случаях, когда неизвестен механизм передачи сигнала или неизвестен собственно лиганд.
Для обеспечения совместно локализованной экспрессии потенциальных партнеров для связывания (например, полипептидных лигандов) и целевого белка (например, клеточного рецептора) на плазматической мембране партнер для связывания может быть соединен с трансмембранным белковым доменом и экспрессирован с первой экспрессионной конструкции. Целевой белок экспрессируют в форме гибрида с второй экспрессионной конструкции. Согласно некоторым вариантам реализации указанный целевой белок представляет собой рецептор клеточной поверхности, который содержит один или большее количество природных трансмембранных доменов (TM), например внеклеточный домен наряду с природным TM рецептора клеточной поверхности. Согласно некоторым другим вариантам реализации в соответствии с которыми целевой белок не содержит природного TM (например, представляет собой ядерный рецептор или другой лигандсвязывающий белок), он может быть экспрессирован в виде гибрида с гетерологичным трансмембранным белковым доменом. Согласно некоторым вариантам реализации в экспрессионных конструкциях используют линкерную последовательность, которая соединяет компоненты гибридного полипептида, например соединяет потенциальный лиганд (например, антитело или пептид) с трансмембранным белковым доменом. Например, большинство полученных к настоящему времени мембраносвязанных токсинов содержат участок из 20 чередующихся остатков глицина и аспарагина. Указанная линкерная последовательность может применяться в экспрессионных конструкциях согласно настоящему изобретению. Такой линкер, расположенный перед участком связывания с мембраной, может обеспечивать ротационную гибкость и расстояние, необходимые для связывания пептидного токсина с когнатным ионным каналом. Согласно различным вариантам реализации могут применяться линкеры различной длины, оптимизированные для экспрессии гибридных конструкций.
Согласно примеру схемы выбора с применением рецептора и пептидного лиганда указанные потенциальный лиганд и рецептор экспрессируют таким образом, что каждый из них соединен только с одним компонентом или несет только один компонент фермент-субстратной репортерной системы. Соответственно, согласно приведенным в настоящем документе примерам гибридная конструкция лиганд-ТМ может дополнительно экспрессировать фермент (или его субстрат), а указанная рецепторная конструкция может дополнительно экспрессировать последовательность субстрата (или фермента). Согласно различным вариантам реализации последовательность пептидного субстрата также связана с последовательностью эффектора или активатора (например, транскрипционным фактором). При связывании указанного лиганда с указанным рецептором ферментативное расщепление указанной последовательности субстрата приводит к высвобождению эффекторной молекулы. Высвобождаемая эффекторная молекула затем может активировать детектируемый сигнальный путь в клетке, обеспечивая подтверждение произошедшего связывания лиганда с рецептором.
Фермент-субстратные репортеры, подходящие для применения в настоящем изобретении, не ограничиваются какой-либо одной конкретной фермент-субстратной системой; при практической реализации настоящего изобретения могут применяться любые из ряда хорошо известных пар ферментов с полипептидными субстратами. Согласно приведенным в настоящем документе примерам один из примеров фермент-субстратной системы представлен TEV-протеазой и специфическим сайтом ферментативного расщепления пептида. TEV-протеаза представляет собой хорошо известную высокоспецифичную в отношении последовательности цистеинпротеазу вируса гравировки табака (TEV). Она является представителем РА-класса химотрипсин-подобных протеаз. Ввиду высокой специфичности в отношении последовательности ее часто используют для контролируемого расщепления гибридных белков in vitro и in vivo. При практической реализации настоящего изобретения может применяться TEV-протеаза дикого типа и любые варианты (например, консервативно модифицированные варианты) или ферментативные фрагменты фермента дикого типа. Последовательности и векторы, экспрессирующие TEV-протеазу и ее варианты, рутинно применяются в данной области техники, широко описаны в опубликованных источниках или доступны у коммерческих поставщиков, например Kapust et al., Prot. Expr. Purif, 19:312-8, 2000; Kapust et al., Prot. Eng., 14: 993-1000, 2001; Chen et al., Prot. Sci. 19:2379-88, 2010; и Addgene (Кембридж, Массачусетс). Соответствующий сайт расщепления последовательностей TEV-протеазы также подробно описан и используется в данной области техники. Примеры подходящих последовательностей субстрата TEVпротеазы включают, например,
ENLYFQS (SEQ ID N0:4) (TEV1), ENFYFQS (SEQ ID N0:5) (TEV 2), ENLYYQS (SEQ ID N0:6) (TEV 3) и ENLFFQS (SEQ ID N0:7).
Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность субстрата TEV-протеазы, используемая в конструкциях согласно изобретению, представлена последовательностью ENFYFQS (SEQ ID N0:5) (TEV 2).
- 8 034306
Аналогичным образом, при практической реализации настоящего изобретения может применяться любой репортерный ген, хорошо известный в данной области техники. Он может представлять собой любой ген или полинуклеотид, кодирующий белок, экспрессия которого клеткой может быть детектирована и/или количественно определена. Соответственно, измеренный уровень экспрессии указанного репортера отражает уровень активации промоторного элемента, управляющего экспрессией репортерного гена. Примеры генов, подходящих для применения в качестве репортерных генов, включают, например, гены, которые кодируют метаболический фермент, фактор устойчивости к антибиотику, люминесцентный белок или флуоресцентный белок. Такие репортерные гены хорошо известны в данной области техники; конкретные примеры описаны в источнике: Wood (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6(1): 50-58. В некоторых конструкциях согласно настоящему изобретению указанный репортерный ген кодирует люциферазу. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанный репортерный ген кодирует метаболический фермент, такой как β-галактозидаза. Согласно некоторым вариантам реализации указанный репортерный ген может представлять собой ген, дополняющий ауксотрофную мутацию в клетке-хозяине и позволяющий клеткам, которые экспрессируют указанный ген, расти на селективных средах.
Конструирование экспрессионных векторов и репортерных клеток для практической реализации способов согласно настоящему изобретению может быть легко реализовано в соответствии с общепринятыми методами молекулярной биологии. Примеры некоторых специфических протоколов для проведения требуемых этапов настоящего изобретения также приведены в настоящем документе. Например, согласно подробному описанию в настоящем документе, экспрессионные векторы, кодирующие гибрид лиганда/ТМ/фермента, могут быть получены путем присоединения потенциальных лигандов к N-концу трансмембранного домена рТФР (аминокислоты 514-561), тогда как фермент (например, TEV-протеазу) присоединяют к С-концу указанного трансмембранного домена. Для обеспечения ротационной гибкости между последовательностью лиганда и трансмембранного домена может быть встроена линкерная последовательность. Одна из линкерных последовательностей согласно примерам в настоящем документе содержит один или большее количество (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более) тандемных повторов GGGGS (SEQ IDNO: 1). Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер содержит 8, 10 или более тандемных повторов GGGGS (SEQ IDNO: 1). Гибрид лиганд/TM/фермент может быть клонирован в лентивирусный вектор (например, вектор pLV2 согласно примеру в настоящем документе) для получения вирусных частиц для трансфекции клетки-хозяина. В случае гибрида рецептора/субстрата/эффекторной молекулы, примером эффекторной молекулы может быть гибрид ДНК-связывающего домена Gal4 с С-концевым доменом активации VP16 вируса простого герпеса. Он обеспечивает получение искусственного транскрипционного фактора (GAL4-VP16), ортогонального в отношении любых клеток млекопитающих. Кодирующую область целевого рецептора (например, рТПО или рГПП-1) соединяют на С-конце с последовательностью субстрата или сайта расщепления фермента (например, сайта расщепления TEV-протеазой) и транскрипционным фактором GAL4-VP16. Указанная гибридная последовательность затем может быть клонирована в подходящий экспрессионный вектор (например, вектор pcDNA5).
При осуществлении настоящего изобретения могут применяться различные экспрессионные векторы. Например, лентивирусные векторы подходят для введения в клетку-хозяина и экспрессии в клеткехозяине комбинаторной библиотеки потенциальных партнеров для связывания. Лентивирусные векторы представляют собой ретровирусные векторы, способные трансдуцировать или инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, и, как правило, обеспечивают высокий титр вируса. Примеры векторов на основе лентивирусов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, например, лентивирусный вектор pLV2 согласно примеру в настоящем документе. Другие лентивирусные векторы, которые могут быть использованы и модифицированы для практической реализации настоящего изобретения, включают, например, pLVX-Puro, pLVX-IRES-Neo, pLVX-IRES-Hyg и pLVX-IRES-Puro. Различные лентивирусные векторы с клонированными последовательностями потенциальных лигандов могут быть введены в подходящую клетку-хозяина для экспрессии библиотеки потенциальных лигандов. Например, для применения в настоящем изобретении подходят линия клеток HEK293, линия клеток HEK293Т и линия клеток TF-1. Для экспрессии комбинаторной библиотеки в настоящем изобретении могут также применяться многие другие пакующие линии клеток, хорошо известные в данной области техники (например, линия клеток Lenti-X 293T). Наряду с векторами на основе лентивирусов и клеткамихозяевами, при практической реализации способов согласно настоящему изобретению могут также применяться другие векторы на основе ретровирусов и экспрессионные системы. Указанные векторы включают векторы на основе MMLV: pQCXIN, pQCXIQ и pQCXIH и совместимые с ними линии клетокпродуцентов, такие как пакующие линии клеток на основе HEK293: GP2-293, EcoPack 2-293 и AmphoPack 293, а также пакующая линия клеток на основе NIH/3T3 RetroPack PT67.
Для идентификации потенциальных лигандов, способных связываться с рецептором, клетка-хозяин может также содержать детектируемый репортерный ген, который может быть активирован эффекторной молекулой, что обеспечивает детекцию произошедшего связывания. Например, если выбранная эффекторная молекула представляет собой транскрипционный фактор GAL4-VP16, в клетку-хозяина может быть введен несущий UAS/репортерный ген вектор. Согласно приведенным в настоящем документе
- 9 034306 примерам несущий репортерный ген вектор содержит последовательность контроля транскрипции (например, несколько повторов GAL4 UAS и поздний аденовирусный промотор), которая распознается транскрипционным фактором GAL4-VP16 и активирует экспрессию функционально связанной последовательности. Указанная функционально связанная последовательность, как правило, кодирует легко детектируемый сигнал. Например, последовательность контроля транскрипции в несущем репортерный ген векторе может запускать транскрипцию репортерного гена люциферазы luc2P или tdTomato в ответ на связывание транскрипционного фактора GAL4-VP16. Согласно приведенным в настоящем документе примерам стабильные клетки-хозяева или линии клеток, несущие репортерный ген, могут быть легко получены путем трансфекции указанной клетки-хозяина (например, клеток HEK293) несущей репортерный ген конструкцией (например, несущим UAS/репортерный ген вектором).
Примером реализации настоящего изобретения является детектирование совместно локализованной экспрессии и связывания лигандов с рецепторами рТПО и Г1П1-1. Общую схему выбора, описанную в настоящем документе, можно широко применять при идентификации лигандов для любого клеточного рецептора. Указанные рецепторы включают любые рецепторы клеточной поверхности (например, рецепторы GPCR или связанные с ферментами рецепторы), которые, как правило, содержат собственные трансмембранные домены, как, например, рецепторы GPCR и связанный с ферментом рецептор. Помимо поверхностных рецепторов, содержащих трансмембранные домены, в системе выбора согласно настоящему изобретению могут быть исследованы другие клеточные рецепторы или лиганд-связывающие белки для идентификации их лигандов или партнеров для связывания, включая, например, цитоплазматические рецепторы или ядерные рецепторы. Рецепторы или лиганд-связывающие белки, не содержащие природных трансмембранных доменов, могут быть рекомбинантным способом соединены с гетерологичным трансмембранным доменом (например, TM рТФР) перед применением способов выбора согласно настоящему изобретению. Согласно различным вариантам реализации указанная система выбора может применяться для идентификации новых лигандов или модуляторов (агонистов или антагонистов) рецепторов, для которых не были идентифицированы лиганды (орфанные рецепторы). В случае рецепторов, у которых имеется известный лиганд, идентификация новых агонистов или антагонистов может требоваться, в частности, для имитации, усиления или ингибирования эффекта указанного лиганда.
Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к сопряженным с G-белками рецепторам (GPCR). GPCR составляют самое большое семейство белковых рецепторов клеточной поверхности. Существует три основных семейства GPCR, Gs-, Gi- и Gq-сопряженные рецепторы. При активации разные GPCR стимулируют ряд путей передачи сигнала. Например, сопряженный с Gs рецептор повышает, а сопряженный с Gi рецептор снижает уровень синтеза цАМФ. Соответственно, указанные два разных GPCR могут активировать или ингибировать элемент ответа на цАМФ. С другой стороны, сопряженный с Gq рецептор повышает внутриклеточную концентрацию кальция и активирует элемент множественного ответа. На основании гомологии последовательностей и функционального сходства GPCR могут быть разделены на рецепторы класса А (родопсиноподобные рецепторы), класса В (семейство рецепторов секретина), класса С (метаботропные глутаматные рецепторы/рецепторы феромонов), класса D (рецепторы феромонов спаривания грибов), класса Е (рецепторы циклического АМФ) и класса F (рецепторы Frizzled/Smoothened). Некоторые варианты реализации настоящего изобретения относятся к связанным с ферментами рецепторам. Связанные с ферментами рецепторы включают рецепторные тирозинкиназы; связанные с тирозинкиназами рецепторы; рецептороподобные тирозинфосфатазы; рецепторные серин/треониновые киназы; рецепторные гуанилатциклазы и связанные с гистидинкиназами рецепторы. Самая большая популяция из перечисленных связанных с ферментами рецепторов представлена рецепторными тирозинкиназами. Большинство указанных молекул представляют собой рецепторы факторов роста и гормонов, таких как эпидермальный фактор роста (ЭФР), тромбоцитарный фактор роста (ТФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста гепатоцитов (ФРГ), инсулин, фактор роста нервов (ФРН) и т.п.
Помимо обеспечения совместно локализации на плазматической мембране предложенные в настоящем изобретении способы могут также применяться для выбора лигандов, совместно локализованных с рецептором в других клеточных компартментах. Любая ситуация, в которой два белка избирательным образом сближаются, повышает эффективную молярность их взаимодействия. Соответственно, например, предложенные в настоящем изобретении способы могут также применяться для мониторинга взаимодействий между органеллами или в целом для отслеживания направленного транспорта белков путем перенаправления репортерной системы.
IV. Локализованные в плазматической мембране библиотеки лигандов.
В настоящем изобретении предложены комбинаторные библиотеки полипептидов или антител (например, одноцепочечных антител), которые могут быть локализованы на плазматической мембране при экспрессии в клетках. Каждая библиотека может содержать по меньшей мере 1х 104, 1х 105, 1х 106, 1х 107, 1х 108, 1х109, 1х1010 или более разных последовательностей полипептидов или антител. Как правило, каждый компонент библиотеки содержит специфическую или рандомизированную последовательность полипептида или антитела, которая функционально связана с трансмембранным доменом. Указанный
- 10 034306 трансмембранный домен, например трансмембранная область рТФР, согласно приведенным в настоящем документе примерам, обеспечивает прикрепление экспрессированных пептидов к клеточной мембране. Помимо доменов рТФР, при конструировании библиотек лигандов согласно настоящему изобретению могут также применяться многие другие трансмембранные домены, хорошо известные в данной области техники, а также варианты (например, консервативно модифицированные варианты) указанных известных трансмембранных белковых доменов. См., например, Remm et al., Genome Res. 10: 1679-1689, 2000; и Hubert et al., Cell Adh. Migr. 4:313-324, 2010.
Согласно некоторым вариантам реализации потенциальные лиганды представлены комбинаторной библиотекой полипептидных или пептидных последовательностей. Для конструирования комбинаторных библиотек согласно настоящему изобретению может быть использован любой полипептид или пептид (например, рандомизированный пептид). Их длина может составлять по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 300 или более остатков аминокислот. Как правило, для экспрессии библиотеки полипептидов используют стандартные техники генетического конструирования. Для получения библиотеки рекомбинантных полипептидов или пептидов согласно настоящему изобретению полинуклеотиды, кодирующие указанный пептид, встраивают в подходящую экспрессионную систему. При экспрессии гибридных пептидов могут использоваться подходящие экспрессионные векторы многочисленных типов, известные в данной области техники, в том числе, например, векторы, содержащие экспрессионные системы на основе бактерий, вирусов, дрожжей, грибов, насекомых или млекопитающих. Согласно приведенным в настоящем документе примерам предпочтительная экспрессионная система для получения пептидных или полипептидных библиотек согласно настоящему изобретению основана на лентивирусах. Способы получения и применения таких экспрессионных векторов хорошо известны. Для ознакомления с указанной и другими молекулярно-биологическими техниками, применяемыми для получения и экспрессирования комбинаторных библиотек согласно настоящему изобретению, см., например, источники: текущее издание руководства Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press, текущее издание ), Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, N.Y., текущее издание), Recombinant Gene Expression Protocols, в руководстве: Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N.J., текущее издание ), а также Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel et al., Eds.,) John Wiley & Sons, NY (текущее издание), и цитируемые в них источники. Согласно иллюстративному варианту реализации полинуклеотид может быть помещен под контроль подходящего промотора в экспрессионном векторе, например, промотора EFl-α в лентивирусном векторе, согласно приведенным в настоящем документе примерам.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используемая комбинаторная библиотека лигандов представляет собой библиотеку антител. При конструировании комбинаторных пептидных библиотек согласно настоящему изобретению могут применяться любые последовательности антител. Согласно некоторым вариантам реализации обычно используют библиотеку одноцепочечных антител. Библиотеки одноцепочечных антител могут содержать только тяжелую или легкую цепь антитела или ее вариабельный домен. Однако чаще компоненты библиотек одноцепочечных антител образованы соединенными вариабельными доменами тяжелых и легких цепей, разделенными пептидным спейсером, в составе непрерывной последовательности одного белка. См., например, Ladner et al., WO 88/06630; McCafferty et al., WO 92/01047. Разнообразие библиотек антител может обеспечиваться за счет получения кодирующих антитело последовательностей из естественных источников, таких как неклональная популяция иммунизированных или неиммунизированных В-клеток. Согласно альтернативному или дополнительному варианту разнообразие может быть достигнуто посредством искусственного мутагенеза, что хорошо известно в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации указанная библиотека антител экспрессирует одноцепочечные фрагменты вариабельных областей (scFv). Библиотека специфических scFv, подходящая для применения согласно настоящему изобретению, описана в данной области техники, например, в источнике: Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 12612-6, 2012. Такая библиотека антител может быть получена и экспрессирована с применением различных векторов, хорошо известных в данной области техники. Предпочтительно, библиотеку антител для применения в настоящем изобретении конструируют с применением лентивирусного вектора или вектора на основе ретровируса. Конструирование такой библиотеки антител для экспрессии в эукариотической клеткехозяине может выполняться в соответствии с техниками, примеры которых приведены в настоящем документе, и другими способами, хорошо известными в данной области техники.
Многие техники, хорошо известные в данной области техники, могут быть легко использованы для увеличения разнообразия компонентов библиотеки потенциальных лигандов. Указанные техники включают, например, комбинаторную перестановку цепей, гуманизацию последовательностей антител, введение мутаций, аффинное созревание, применение мутаторных клеток-хозяев и т.п. Все указанные способы могут быть использованы при практической реализации способов, описанных в настоящем документе, по усмотрению специалиста. См., например, Aujame et al., Hum. Antibod. 8: 155-168, 1997; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-82, 1991; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-13, 1994; Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 10701-10705, 2000; Crameri et al., Nat. Med. 2: 100-102, 1996; Fisch et al.,
- 11 034306
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7761-7766, 1996; Glaser et al., J. Immunol. 149: 3903-3913, 1992; Eving et al., Immunotechnology, 2: 127-143, 1996; Kanppik et al., J. Mol. Biol., 296: 57-86, 2000; Low et al., J. Mol. Biol. 260: 359-368, 1996; Riechmann and Winter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10068-10073, 2000; и Yang et al.,
J. Mol. Biol. 254: 392-403, 1995.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные библиотеки потенциальных лигандов включают варианты или мутанты, происходящие из одного потенциального полипептида или исходного каркасного полипептида (например, известного полипептидного лиганда клеточного рецептора). Например, молекула полинуклеотида, кодирующая указанный потенциальный полипептид, может быть изменена по одному или большему числу выбранных кодонов. Изменение определяется как замена, удаление или вставка одного или большего числа нуклеотидов в ген, кодирующий потенциальный полипептид, что приводит к изменению последовательности аминокислот указанного полипептида. Предпочтительно, указанные изменения обеспечивают путем замены по меньшей мере одной аминокислоты любой другой аминокислотой в одной или нескольких областях молекулы. Указанные изменения могут быть осуществлены путем применения различных способов, известных в данной области техники. Указанные способы включают, не ограничиваясь перечисленными, опосредованный олигонуклеотидами мутагенез (например, Zoller et al., Methods Enzymol. 154:329-50, 1987), кассетный мутагенез (например, Well et al., Gene 34:315, 1985), допускающую ошибки ПЦР (см., например, Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:62304, 1989; и Keohavong and Thilly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9253-7, 1989), и ДНК-шаффлинг (Stemmer, Nature 370:389-91, 1994; и Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:10747-51, 1994).
Согласно некоторым вариантам реализации указанные потенциальные лиганды могут быть дополнительно конъюгированы с партнером для получения гибрида (например, другим пептидом или другим фрагментом), который может применяться для улучшения очищения, повышения экспрессии указанного пептида в клетке-хозяине, способствовать детекции, стабилизации пептида и т.п. Примеры подходящих партнеров для получения гибридов для потенциальных пептидных лигандов согласно настоящему изобретению включают полиэтиленгликоль, ПЭГ или другие химические вещества. К подходящим пептидным или полипептидным партнерам для получения гибридов относятся, среди многих других, например, бета-галактозидаза, глутатион^-трансфераза, гистидиновая метка и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации указанные потенциальные пептиды или полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть снабжены детектируемой меткой.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные потенциальные лиганды могут содержать одно или большее число встречающихся в природе производных 20 стандартных аминокислот, например, 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, 3-метилгистидин, гомосерин, орнитин или карбоксиглутамат, и могут включать аминокислоты, не связанные полипептидными связями. Аналогичным образом, они могут также представлять собой циклические полипептиды и другие конформационно ограниченные структуры. Способы модификации полипептида для получения аналогов и производных хорошо известны в данной области техники, см., например, Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meinhofer, Vol. 5, p. 341, Academic Press, Inc., New York, N.Y. (1983); и Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Ed. Manfred E. Wolff, Ch. 1, pp. 619-620, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1995).
V. Выбор лигандов с применением основанных на близости расположения анализов.
В настоящем изобретении предложены способы идентификации одного или большего числа лигандов целевой молекулы (например, целевого рецептора) в большой внутриклеточной комбинаторной библиотеке потенциальных лигандов, которая может быть экспрессирована и локализована на плазматической мембране популяции клеток-хозяев. Согласно указанным способам разные потенциальные лиганды из библиотеки и целевая молекула (например, поверхностный рецептор) совместно локализованы на плазматической мембране клеток-хозяев. И целевая молекула (например, рецептор), и потенциальный лиганд соединены с одним из компонентов фермента и когнатного пептидного субстрата или последовательности распознавания указанного фермента. При связывании совместно локализованного лиганда с соседней целевой молекулой (например, рецептором), эффекторная молекула (например, транскрипционный фактор), соединенная с последовательностью субстрата, высвобождается в результате ферментативной реакции. Указанная эффекторная молекула может затем обеспечивать детектируемый ответ при активации искусственного клеточного ответа или сигнального пути, например, флуоресцентный ответ, люминесцентный ответ или другой сигнал.
Клетки-хозяева для практической реализации способов согласно настоящему изобретению могут представлять собой любые хорошо известные эукариотические клетки или линии клеток, которые могут содержать и экспрессировать целевую молекулу, потенциальные лиганды и репортерную конструкцию, описанные в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации в качестве клеток-хозяев при экспрессии гибридных молекул для основанного на близости расположения выбора лигандов используют клетки млекопитающих. Например, они могут быть представлены либо гибридомной линией клеток, либо линией клеток млекопитающих (например, клетками HEK293), несущей экзогенные экспрессионные векторы согласно приведенным выше примерам. Указанные клетки включают любые нормальные мортальные или аномальные иммортализованные клетки животных или человека. Помимо ли
- 12 034306 ний клеток, описанных в приведенных в настоящем документе примерах, в данной области техники также известен ряд других подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать целевую молекулу и конструкции с потенциальными лигандами согласно настоящему изобретению. Указанные линии клеток включают, например, линии клеток СНО, различные линии клеток COS, клетки HeLa, линии миеломных клеток, трансформированные В-клетки и другие линии гибридомных клеток. Общее описание применения культур клеток тканей млекопитающих для экспрессии полипептидов приведено, например, в источнике: Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Экспрессионные векторы для использования в клетках-хозяевах млекопитающих могут включать такие последовательности контроля экспрессии, как точка начала репликации, промотор и энхансер, и необходимые сайты обработки информации, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Указанные экспрессионные векторы обычно содержат промоторы, происходящие из генов млекопитающих или вирусов млекопитающих. Подходящие промоторы могут быть конститутивными, специфическими в отношении типа клеток, стадиеспецифическими, и/или модулируемыми или регулируемыми. Подходящие промоторы включают, не ограничиваясь перечисленными, промотор EFl-α и промотор UbC человека согласно примерам в настоящем документе, промотор металлотионеина, конститутивный аденовирусный основной поздний промотор, индуцируемый дексаметазоном промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вакуолизирующего вируса обезьян SV40, промотор pol III ассоциированного с лекарственной мультирезистентностью белка (MRP), конститутивный промотор MPSV, индуцируемый тетрациклином промотор цитомегаловируса (CMV) (такой как немедленно-ранний промотор CMV человека), конститутивный промотор CMV, и комбинации промоторов и энхансеров, известные в данной области техники.
Экспрессия конструкции с потенциальными лигандами и конструкции с целевой молекулой (например, рецептором) для мониторинга связывающей активности может осуществляться с применением общепринятых методов молекулярной биологии и способов согласно примерам в настоящем документе. Выбор лигандов целевого рецептора из библиотеки потенциальных лигандов может также осуществляться с применением стандартных процедур, хорошо известных в данной области техники или описанных в специфических примерах в настоящем документе. Независимо от используемых лигандов библиотека экспрессионных векторов (например, лентивирусных векторов), кодирующих комбинаторную библиотеку полипептидных лигандов или антител, может сначала быть введена в подходящие клеткихозяева (например, HEK293) для получения библиотеки лиганд-кодирующих вирусов. При котрансфекции указанными вирусами клеток-хозяев наряду с вирусом, экспрессирующим специфическую мембраносвязанную целевую молекулу (рецептор, такой как рТПО или рГПП-1), происходит экспрессия и совместная локализация библиотеки гибридных лигандов с рецептором на мембране. Согласно некоторым вариантам реализации сначала в клетку-хозяина могут быть введены экспрессирующий целевую молекулу вектор и конструкция с репортерным геном. Затем в указанную клетку-хозяина, которая стабильно экспрессирует целевую молекулу (например, поверхностный рецептор) может быть введена экспрессирующая лиганды библиотека.
В зависимости от используемой в описанных способах специфической эффекторной молекулы и репортерного гена для детекции связывания лигандов с целевой молекулой могут применяться различные анализы основанных на близости расположения реакций. Например, клетка-хозяин, несущая и UAS/репортерный ген, и гибрид целевого рецептора/сайта расщепления/транскрипционного фактора, может быть сначала инфицирована лентивирусами, несущими библиотеку гибридов потенциальных лигандов/ТМ/TEV-протеазы, с применением транскрипционного фактора GAL4-VP16 и транскрипционного элемента отклика GAL4 UAS. Затем клетки культивируют перед измерением активности репортерного гена.
В настоящем изобретении могут быть задействованы различные способы детекции и количественного определения экспрессии репортера, которые обычно основаны на измерении активности белка, кодируемого указанным репортером. В данной области техники известен широкий спектр подходящих детектируемых маркеров, в том числе флуоресцентных, радиоактивных, ферментативных или других лигандов, таких как авидин/биотин, которые способны обеспечивать детектируемый сигнал. Согласно некоторым вариантам реализации может быть использована флуоресцентная или ферментная метка, например, уреаза, щелочная фосфатаза или пероксидаза, вместо радиоактивных или других неблагоприятных для окружающей среды реагентов. Известны колориметрические индикаторные субстраты для ферментных меток, которые могут применяться для получения видимых глазом или спектрофотометрических сигналов. Согласно приведенным в настоящем документе примерам репортерный ген может представлять собой ген люциферазы, экспрессия которого может быть легко детектирована посредством люциферазного анализа, или по экспрессии гена tdTomato, которую можно наблюдать при помощи флуоресцентной микроскопии. Другие примеры репортерных генов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают гены бета-лактамазы и гены, кодирующие GFP или другие флуоресцентные белки, которые могут быть визуализированы при помощи флуоресцентной микроскопии или детектированы с применением сортировки клеток с активированной флуоресценцией.
- 13 034306
Если репортерный ген кодирует фермент, может быть использован субстрат для указанного фермента, который метаболизируется с образованием измеряемого продукта. Например, субстрат β-галактозидазы X-gal, который расщепляется указанным ферментом с образованием реакционного продукта синего цвета, часто используют для анализа репортерной экспрессии β-галактозидазы. (Miller J. ed. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia Coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Как вариант, используют субстрат β-галактозидазы о-нитрофенил-в-Э-галактопиранозид (ONPG), который метаболизируется β-галактозидазой с образованием соединения желтого цвета. Количество фермента определяют путем изменения оптической плотности окрашенного соединения с применением спектрофотометрии или считывающего устройства (ридера) для ИФА-ELISA. Поглощение регистрируют при 420 нм (Miller J.H. ed. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Другие широко используемые репортерные гены представлены генами фактора устойчивости к антибиотикам хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (ХАТ), люциферазы светлячков (согласно описанию в приведенных ниже примерах) и зеленого флуоресцентного белка медузы (Valdivia and Falkow (1997), Trends Microbiol. 5(9):360-363; Naylor (1999), Biochem. Pharmacol. 58(5)-49-757; Himes and Shannon (2000), Methods Mol. Biol. 130:165-174). Кроме того, различные альтернативные белки могут также применяться в качестве репортеров на основании возможности их детектирования и количественного определения. Анализы для измерения уровней экспрессии таких генов хорошо разработаны и широко применяются специалистами в данной области техники (Rosenthal (1987), Methods Enzymology, 152:704-720; Davey et al. (1995), Methods Mol. Biol. 49:143-148 и Bronstein et al. (1994), Anal. Biochem. 219(2):169-181).
Примеры
Представленные ниже примеры приведены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема. Для специалиста в данной области техники будут очевидны другие варианты настоящего изобретения, также охваченные прилагаемой формулой изобретения.
Пример 1. Материалы и способы.
Линии клеток. Клетки HEK293 (АТСС кат. № CRL-1573) или HEK293T (АТСС кат. № CRL-3216) поддерживали на среде DMEM, содержащей 10% (по объему) ФБС, пенициллина и стрептомицина, и трансфицировали с применением липофектамина 2000 (Life technologies). Антибиотики для клеток млекопитающих генетицин и гигромицин получали от Invivogen. Реагент для люциферазного анализа получали от Promega (El 500).
Конструирование плазмид. Лентивирусный вектор, кодирующий лиганд/TM/TEV-протеазу. Лиганд соединяли с N-концом трансмембранного домена рТФР (аминокислоты 514-561); с С-концом указанного трансмембранного домена соединяли TEV-протеазу. Между лигандом и трансмембранным доменом добавляли различное количество линкерных последовательностей GGGGS (SEQ ID NO: 1). Конструкцию лиганд/трансмембранный домен/TEV вводили в лентивирусный вектор под контролем промотора UBC (убиквитина С).
Вектор, несущий рецептор/сайт расщепления TEV/транскрипционный фактор.
GAL4-VP16. ДНК-связывающий домен Gal4 соединяли с С-концевым доменом активации VP16 вируса простого герпеса для получения искусственного транскрипционного фактора, ортогонального в клетках млекопитающих. За кодирующей областью рТПО или рГПП-1 размещали сайт расщепления TEV-протеазой и транскрипционный фактор GAL4-VP16 и клонировали в pcDNA5, экспрессию которой контролировал промотор CMV. Указанный вектор содержит гентамициновую селекционную кассету для получения стабильных линий клеток.
Вектор, несущий вышележащую активаторную последовательность (Upstream Activator Sequence, UAS) и репортерный ген. Несущий UAS/репортерный ген вектор содержит 9 повторов GAL4 UAS и поздний аденовирусный промотор. Указанная последовательность запускает транскрипцию репортерного гена люциферазы luc2P или tdTomato в ответ на связывание транскрипционного фактора GAL4-VP16. Указанный вектор содержит гигромициновую селекционную кассету для получения стабильных линий клеток.
Получение стабильной репортерной линии клеток. Стабильные линии клеток получали путем трансфекции клеток HEK293, вначале несущим UAS/репортерный ген вектором с применением липофектамина. Трансфицированные клетки отбирали с применением 200 мкг/мл гигромицина. Через две недели отобранные клетки собирали и трансфицировали вектором, несущим специфический рецептор/сайт расщепления TEV/транскрипционный фактор GAL4-VP16. Клетки отбирали с применением 800 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл гигромицина в течение двух недель.
Упаковка лентивируса. Вирус продуцировали в клетках HEK293T посредством котрансфекции лентивирусными векторами и вирусными пакующими векторами pCMVD8.9 и pVSVg в соотношении 1:1:1. Супернатанты, содержащие вирус, собирали через 48 ч после трансфекции и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм (Millipore). Титр лентивирусного состава определяли с применением набора Lenti-X p24 ELISA (Clontech).
- 14 034306
Анализ основанной на близости расположения реакции. Клетки стабильной линии, несущей и UAS/репортерный ген, и рецептор/сайт расщепления/транскрипционный фактор, высевали в 96-луночный планшет с плотностью 20000 клеток на лунку. Клетки инфицировали лентивирусом, несущим лиганд-ТМ-'ГВУ-протеазу при значении индекса множественности заражения (MOI), равном 1. Клетки культивировали в течение 24-72 ч перед измерением активности репортерного гена. Люциферазную активность оценивали с применением системы люциферазного анализа (Promega), а экспрессию tdTomato наблюдали при помощи флуоресцентной микроскопии.
Пример 2. Конструкции системы.
Авторы изобретения конструировали фермент-субстратную систему, в которой протекает малоэффективная и, таким образом, медленная при базовых концентрациях протеолитическая реакция. Авторы изобретения использовали TBV-протеазу и высокоспецифичный сайт расщепления. Протеазу прикрепляли к С-концу трансмембранного (TM) домена рТФР в содержащих лиганд конструкциях (фиг. 1). Сайт расщепления располагался между цитоплазматической частью рецептора и искусственным пептидным транскрипционным фактором. После расщепления указанный транскрипционный фактор высвобождается и активирует экспрессию репортерного гена (фиг. 1). Принципиальным является то, что, поскольку и потенциальный лиганд, и его рецептор заякорены в плазматической мембране, любое их взаимодействие приводит к сближению внутриклеточных реактантов, к которым они прикреплены, и способствует генерации сигнала.
В указанной системе показатель эффективной молярности оказывает действие на двух уровнях. Вопервых, поскольку реактанты располагаются в плазматической мембране и совместно локализованы, наблюдается выраженный эффект секвестрации, благоприятствующий взаимодействию. Во-вторых, взаимодействие указанных секвестрированных молекул обеспечивает сближение компонентов фермента и субстрата, таким образом значительно повышая эффективную молярность сигнальных компонентов системы. Важно отметить, что для указанной системы необходимо только молекулярное взаимодействие в мембране; указанная система в значительной степени независима от каких-либо специфических эффектов, например, конформационных изменений в результате взаимодействия.
Пример 3. Проверка концепции.
Для валидации указанного способа авторы изобретения исследовали как однократно проходящие через мембрану, так и несколько раз проходящие через мембрану белки. В случае однократно проходящих через мембрану рецепторов авторы изобретения исследовали естественный лиганд тромбопоэтин (ТПО) а также scFv-антитела к рецептору тромбопоэтина (рТПО), полученные авторами ранее (Zhang et al., Chemistry & Biology, 20:734-741, 2013). В случае несколько раз проходящих через мембрану рецепторов авторы изобретения исследовали распознавание пептидов GPCR-рецептором ГНН-1.
Гормон ТПО или связывающие рТПО антитела, 3D9 или 14F12, были экспонированы на поверхности клеток за счет соединения с N-концом трансмембранного домена рТФР. Сконструированное аналогичным образом нерелевантное антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Мембраносвязанный белок 3D9-scFv способен активировать рТПО-репортерную линию клеток SIB-bla и, соответственно, был использован в качестве положительного контроля. Указанные антитела или аутентичный ТПО при экспонировании на плазматической мембране усиливали опосредованный транскрипционным факторов сигнал по сравнению с контрольным нерелевантным антителом (фиг. 2). Авторы изобретения также провели ортогональный эксперимент для контроля неспецифических взаимодействий рецепторного компонента системы с пептидами или антителами. Для этого авторы изобретения исследовали линию клеток, несущих гибрид рГПП-1/транскрипционный фактор и нерелевантные активаторы, такие как активирующие ТПО антитела или ТПО, которые были активны только в клетках, экспрессирующих рТПО. Результаты показали, что экспонирование антител или ТПО не усиливало сигнал в клетках, несущих несоответствующий рецептор. Авторы изобретения также протестировали эффект длины линкера между лигандом и ТМ-доменом на реакции, основанные на близости расположения. Тромбопоэтин содержит 332 АК, a scFv содержит приблизительно 250 АК. При связывании ТПО с плазматической мембраной 3-9 тандемными повторами GGGGS (SBQ ID NO: 1) получали аналогичные сигналы; однако в случае scFv большее расстояние приводило к более высокой активности (фиг. 2). Соответственно, более длинный гибкий линкер может быть более универсальным.
Затем авторы изобретения исследовали возможность применения указанного способа для несколько раз проходящих через мембрану белков. В ходе предыдущего исследования авторы изобретения обнаружили, что мембраносвязанный эксендин-4 может активировать рецептор глюкагоноподобного пептида-1 (рГПП-1). Соответственно, авторы изобретения использовали рГПП-1 и эксендин-4 в качестве пары рецептор-лиганд для указанного исследования. рГПП-1 принадлежит к семейству β1 сопряженных с G-белками рецепторов с 7 трансмембранными доменами. Модель связывания рецептора класса В с пептидным лигандом предусматривает двухэтапный механизм, согласно которому С-концевая часть пептидного лиганда сначала взаимодействует с N-концевым эктодоменом рецептора. На втором этапе N-конец лиганда взаимодействует с трансмембранными спиралями и соединяющими петлями рецептора, что приводит к активации и передаче сигнала.
- 15 034306
Авторы изобретения соединяли полноразмерный рГПП-1 с транскрипционным фактором. Мембраносвязанный эксендин-4 соединяли с TEV-протеазой в С-концевом внутриклеточном домене. Взаимодействие коэкспрессируемых рецептора и эксендина-4 приводило к значимому повышению сигнальной активности, с 1 по 3 день включительно после инфицирования (фиг. 3А). Авторы изобретения также проверили, оказывает ли эффект на отношение сигнала к шуму (С/Ш) длина С-концевого фрагмента рГПП-1, к которому прикреплен транскрипционный фактор. Полноразмерный рецептор содержит внутриклеточный концевой фрагмент длиной 59 АК. Предыдущие исследования показали, что С-конец может быть усечен вплоть до С-концевого остатка Leu422 при отсутствии эффекта на активность ПШ-1 или экспрессию указанного рецептора. Внутриклеточный фрагмент усеченного рецептора содержит 22 аминокислоты. Авторы изобретения соединяли аминокислоты 1-426 рПШ-1 с высвобождаемым транскрипционным фактором, прикрепленным к усеченному рецептору. Конструкция с более коротким внутриклеточным концевым фрагментом рецептора обеспечивала более высокий показатель отношения С/Ш. Для дополнительного контроля авторы изобретения исследовали неспецифические пептидные лиганды аналогичной длины. Неспецифические пептиды, такие как Vc1.1, представляющий собой блокатор нАХР (никотинового ацетилхолинового рецептора)/ГАМК (метаботропного рецептора ГАМК) обеспечивали еще более низкие значения показателя С/Ш (фиг. 3В). И, наконец, при замене рПШ-1 на нерелевантный сопряженный с G-белком рецептор, CXCR4, отклика не наблюдалось (фиг. 3В).
Пример 4. Эффект разных сайтов расщепления TEV.
Для снижения шума при сохранении силы сигнала тестировали четыре последовательности субстрата TEV, которые TEV может расщеплять с разной эффективностью. TEV-протеаза распознает линейный эпитоп общей формы
E-X-X-Y-X-Q-G (SEQ ID N0:2) или E-X-X-Y-X-Q-S (SEQ ID NO:3); расщепление происходит между Q и G, или между Q и S.
Наиболее эффективным субстратом оказался
ENLYFQS (SEQ ID N0:4) (TEV1), который авторы изобретения использовали во всех описанных выше экспериментах.
Авторы изобретения выдвинули предположение, что последовательности субстрата, расщепляемые менее эффективно, будут генерировать меньший уровень шума при сохранении силы сигнала. Систематическое исследование показало, что множество различных аминокислот может быть размещено в различных положениях с обеспечением разной эффективности расщепления (Kcat/Km). Авторы изобретения сравнили отношение С/Ш для четырех разных последовательностей
ENLYFQS (SEQ ID N0:4) (TEV1), ENFYFQS (SEQ ID NO: 5) (TEV 2),
ENLYYQS (SEQ ID N0:6) (TEV 3) и ENLFFQS (SEQ ID N0:7) (TEV 4)
Соответствующие показатели Kcat/Km составляют 4,51±0,65; 0,024±0,001; 0,056±0,005; 0,35±0,041 мМ-1щ-1.
Авторы изобретения провели мониторинг эффекта использования указанных последовательностей на реакционную кинетику в основанной на близости расположения сигнальной системе. Относительно слабый субстрат TEV2 обеспечивал максимальное отношение сигнал/шум даже через 3 дня после инфицирования, тогда как использование лучших субстратов TEV1 и TEV4 приводило к появлению очень высокого уровня шума, начиная с 2 дня (фиг. 3В). Соответственно, TEV2 представляет собой на настоящий момент оптимальный сайт расщепления для контроля усиливаемой близостью расположения реакции.
Пример 5. Флуоресцентные белки могут применяться в качестве репортерных генов.
В основанных на близости расположения реакциях для общего применения при выборе функциональных антител или пептидов использование таких репортерных генов, как гены GFP или β-лактамазы, может быть идеальным в сочетании с таким способом выбора, как сортировка клеток с активированной флуоресценцией. Кроме того, флуоресцентные белки подходят для динамического клеточного анализа в живых клетках, позволяющего получать оценку сигнальной активности на протяжении периода времени в одном образце. Как показано на фиг. 4, авторы изобретения использовали tdTomato в качестве репортерного гена и наблюдали его экспрессию под микроскопом. Мембраносвязанный эксендин-4 индуцировал высокий процент клеток, экспрессирующих tdTomato, тогда как нерелевантный белок (антитело) не обеспечивал генерации поддающихся оценке уровней флуоресценции, что согласуется с результатами при использовании репортерного гена люциферазы. Примечательно, что ослабленные сайты расщепления TEV2 и TEV3 демонстрировали значительно меньший уровень фона.
Хотя вышеприведенное изобретение было достаточно подробно описано с приведением иллюстративного материала и примеров для ясности понимания, в свете представленных принципов изобретения специалисту в данной области техники будет ясно, что некоторые изменения и модификации могут быть введены в изобретение без отступления от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации, базы данных, последовательности из базы GenBank, патенты и патентные заявки, цитируемые в описании, включены в настоящий документ посредством ссылок в той же мере, как если бы они были конкретным и индивидуальным образом включены посредством ссылок.
Claims (10)
1. Способ идентификации партнера связывания с целевым полипептидом, включающий:
(a) получение первой конструкции, экспрессирующей гибридную молекулу, содержащую указанный целевой полипептид, содержащий первый трансмембранный домен (TM), и второй конструкции, экспрессирующей комбинаторную библиотеку гибридных молекул, которые содержат потенциальный партнер связывания, присоединенный ко второму трансмембранному домену (TM), причём одна из гибридных молекул дополнительно содержит фермент, а вторая гибридная молекула содержит последовательность субстрата указанного фермента и активатор искусственного сигнального пути;
(b) экспрессию указанных первой и второй конструкций в клетке-хозяине для получения популяции клеток, при этом каждая клетка содержит указанные первую и вторую гибридные молекулы, которые совместно локализованы на плазматической мембране;
(c) выбор клетки, в которой активирован искусственный сигнальный путь, из указанной популяции клеток и (d) идентификацию второй гибридной молекулы в указанной клетке, с идентификацией таким образом партнера связывания целевого полипептида.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый трансмембранный домен (TM) представляет собой природный домен указанного целевого полипептида.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный первый трансмембранный домен (TM) присоединен к указанному целевому полипептиду с помощью рекомбинации.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фермент соединен через N-концевую часть с указанным вторым трансмембранным доменом, а последовательность субстрата соединена с указанным первым трансмембранным доменом через N-концевую часть и с указанным активатором через Сконцевую часть.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что расщепление указанной последовательности субстрата указанным ферментом приводит к отсоединению активатора от указанной второй гибридной молекулы.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный целевой полипептид представляет собой клеточный рецептор, а указанный партнер для связывания представляет собой лиганд указанного рецептора, при этом необязательно указанный клеточный рецептор представляет собой рецептор клеточной поверхности, а указанный второй трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен рецептора тромбоцитарного фактора роста (рТФР), при этом необязательно указанный клеточный рецептор представляет собой сопряженный с G-белком рецептор (GPCR) и/или указанный клеточный рецептор представляет собой рецептор тромбопоэтина (рТПО) или рецептор глюкагоноподобного пептида-1 (рГПП-1).
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фермент представляет собой протеазу, а указанная последовательность субстрата содержит сайт расщепления указанной протеазой, при этом необязательно указанная протеаза представляет собой TEV-протеазу и/или указанная последовательность субстрата содержит ENLYFQS (SEQ ID NO: 4) (TEV 1), ENFYFQS (SEQ ID NO: 5) (TEV 2), ENLYYQS (SEQ ID NO: 6) (TEV 3) или ENLFFQS (SEQ ID NO: 7) (TEV 4).
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный потенциальный партнер для связывания представляет собой пептид или антитело, при этом необязательно указанный потенциальный партнер для связывания соединен с указанным вторым трансмембранным доменом посредством линкерной последовательности, при этом необязательно указанная линкерная последовательность содержит 3, 5, 6, 8, 10 или более тандемных повторов GGGGS (SEQ ID NO: 1).
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный активатор представляет собой транскрипционный фактор, а указанный искусственный сигнальный путь представляет собой экспрессию репортерного гена под контролем последовательности регуляции транскрипции, распознаваемой указанным транскрипционным фактором, при этом необязательно указанный репортерный ген вводят в указанную клетку-хозяин с помощью лентивирусного вектора, и/или указанный репортерный ген вводят в указанную клетку-хозяин до экспрессии указанных гибридных молекул, при этом необязательно указанный транскрипционный фактор представляет собой GLA4-V16, а указанная последовательность регуляции транскрипции содержит GAL4 UAS и поздний промотор аденовируса, и/или указанный репортерный ген представляет собой ген люциферазы luc2P или репортерный ген tdTomato.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку HEK293 или HEK293Т, при этом необязательно указанная клетка-хозяин стабильно экспрессирует указанную первую гибридную молекулу, при этом необязательно указанную вторую гибридную молекулу экспрессируют в указанной клетке-хозяине с помощью лентивирусного вектора.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462066105P | 2014-10-20 | 2014-10-20 | |
| PCT/US2015/055941 WO2016064673A1 (en) | 2014-10-20 | 2015-10-16 | Proximity based methods for selection of binding partners |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790725A1 EA201790725A1 (ru) | 2018-01-31 |
| EA034306B1 true EA034306B1 (ru) | 2020-01-27 |
Family
ID=55761351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790725A EA034306B1 (ru) | 2014-10-20 | 2015-10-16 | Основанные на близости расположения способы выбора партнеров для связывания |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10655124B2 (ru) |
| EP (1) | EP3209626A4 (ru) |
| JP (1) | JP2017530721A (ru) |
| CN (1) | CN107207371A (ru) |
| AU (1) | AU2015336308B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017008011A2 (ru) |
| CA (1) | CA2964895A1 (ru) |
| EA (1) | EA034306B1 (ru) |
| IL (1) | IL251771A0 (ru) |
| MX (1) | MX2017005310A (ru) |
| WO (1) | WO2016064673A1 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG10201910999TA (en) * | 2015-05-15 | 2020-01-30 | Agency Science Tech & Res | Native protein purification technology |
| WO2017214830A1 (zh) * | 2016-06-14 | 2017-12-21 | 石庆学 | 特异促进 pd-1 基因高表达的慢病毒载体及其应用 |
| WO2017214829A1 (zh) * | 2016-06-14 | 2017-12-21 | 石庆学 | 特异促进 pd-l1 基因高表达的慢病毒表达载体及其应用 |
| JP2020536115A (ja) | 2017-10-04 | 2020-12-10 | オプコ ファーマシューティカルズ、エルエルシー | 癌の個別化療法に関する物品および方法 |
| WO2025059015A1 (en) * | 2023-09-11 | 2025-03-20 | Octant, Inc. | Systems and methods for utilizing a plasma membrane anchored protease |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009009045A2 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | The Scripps Research Institute | Escape libraries of target polypeptides |
| US20130045871A1 (en) * | 2010-03-18 | 2013-02-21 | Cornell University | Engineering correctly folded antibodies using inner membrane display of twin-arginine translocation intermediates |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10109854A1 (de) * | 2001-03-01 | 2002-09-12 | Thomas Stanislawski | Polypeptide eines hdm2-Protein spezifischen murinen alpha/beta T-Zell Rezeptors, diese kodierende Nukleinsäuren und deren Verwendung |
| DE10109855A1 (de) * | 2001-03-01 | 2002-09-12 | Stanislawski Thomas | Polypeptide eines p53-Protein-spezifischen murinen alpha/beta T-Zell Rezeptors, diese kodierende Nukleinsäuren und deren Verwendung |
| US6867005B2 (en) * | 2001-10-24 | 2005-03-15 | Beckman Coulter, Inc. | Method and apparatus for increasing the dynamic range and accuracy of binding assays |
| DE10211063A1 (de) * | 2002-03-13 | 2003-10-09 | Axaron Bioscience Ag | Neue Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Interaktionen in vivo |
| EP3181575B1 (en) * | 2005-08-31 | 2021-03-17 | The Regents of The University of California | Cellular libraries of peptide sequences (clips) and methods of using the same |
| KR100794449B1 (ko) * | 2007-03-29 | 2008-01-16 | 고려대학교 산학협력단 | 핵산 전달용 양이온성 인지질 나노입자 조성물 |
| EP2158318A2 (en) * | 2007-05-14 | 2010-03-03 | Biogen Idec MA, Inc. | Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
| US20090081639A1 (en) * | 2007-05-31 | 2009-03-26 | Phil Hill | Assay for sensitivity to chemotherapeutic agents |
| US9732392B2 (en) * | 2011-08-05 | 2017-08-15 | Northwestern University | Modular sensor architecture for cell based biosensors |
| US20140308675A1 (en) * | 2011-10-11 | 2014-10-16 | Nissin Foods Holdings Co., Ltd. | Mutagenicity test method using mammalian cells |
| SG11201403445YA (en) * | 2011-12-22 | 2014-07-30 | Hoffmann La Roche | Full length antibody display system for eukaryotic cells and its use |
-
2015
- 2015-10-16 EA EA201790725A patent/EA034306B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-10-16 MX MX2017005310A patent/MX2017005310A/es unknown
- 2015-10-16 WO PCT/US2015/055941 patent/WO2016064673A1/en not_active Ceased
- 2015-10-16 JP JP2017521090A patent/JP2017530721A/ja not_active Ceased
- 2015-10-16 CA CA2964895A patent/CA2964895A1/en not_active Abandoned
- 2015-10-16 AU AU2015336308A patent/AU2015336308B2/en not_active Ceased
- 2015-10-16 US US15/520,544 patent/US10655124B2/en active Active
- 2015-10-16 CN CN201580061767.8A patent/CN107207371A/zh active Pending
- 2015-10-16 BR BR112017008011A patent/BR112017008011A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-10-16 EP EP15852120.3A patent/EP3209626A4/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-04-18 IL IL251771A patent/IL251771A0/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009009045A2 (en) * | 2007-07-10 | 2009-01-15 | The Scripps Research Institute | Escape libraries of target polypeptides |
| US20130045871A1 (en) * | 2010-03-18 | 2013-02-21 | Cornell University | Engineering correctly folded antibodies using inner membrane display of twin-arginine translocation intermediates |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BARNEA et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 28 December 2007 (28.12.2007), Vol. 105, Pgs. 64-9, entire document * |
| XIE et al. "Autocrine signaling based selection of combinatorial antibodies that transdifferentiate human stem cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14 May 2013 (14.05.2013), Vol. 110, Pgs. 8099-104, entire document * |
| ZHANG et al. "A proximity based general method for identification of ligand and receptor interactions in living cells", Biochem. Biophys. Res. Commun., 24 October 2014 (24.10.2014), Vol. 454, Pgs. 251-5, entire document * |
| ZHANG et al. "Selecting agonists from single cells infected with combinatorial antibody libraries", Chem. Biol., 23 May 2013 (23.05.2013), Vol. 20, Pgs. 734-41, entire document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2017005310A (es) | 2018-03-01 |
| JP2017530721A (ja) | 2017-10-19 |
| EA201790725A1 (ru) | 2018-01-31 |
| CA2964895A1 (en) | 2016-04-28 |
| BR112017008011A2 (pt) | 2017-12-19 |
| CN107207371A (zh) | 2017-09-26 |
| IL251771A0 (en) | 2017-06-29 |
| WO2016064673A1 (en) | 2016-04-28 |
| AU2015336308A1 (en) | 2017-05-11 |
| EP3209626A4 (en) | 2018-03-21 |
| AU2015336308B2 (en) | 2020-05-14 |
| US10655124B2 (en) | 2020-05-19 |
| US20180119133A1 (en) | 2018-05-03 |
| EP3209626A1 (en) | 2017-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Daringer et al. | Modular extracellular sensor architecture for engineering mammalian cell-based devices | |
| Cheloha et al. | Improved GPCR ligands from nanobody tethering | |
| EA034306B1 (ru) | Основанные на близости расположения способы выбора партнеров для связывания | |
| Wong et al. | EphrinB2 clustering by Nipah virus G is required to activate and trap F intermediates at supported lipid bilayer–cell interfaces | |
| US11053300B2 (en) | Membrane span-kinase fusion protein and the uses thereof | |
| US20200072820A1 (en) | Method of Selecting for Antibodies | |
| JP4956427B2 (ja) | レンチウイルスベクターおよびその使用 | |
| WO2004053499A1 (ja) | Ｆｒｅｔを利用した蛍光指示薬 | |
| CA3208573A1 (en) | Fusion proteins comprising two ring domains | |
| US7655439B2 (en) | Trimerizing polypeptides | |
| US8148110B2 (en) | Detection of molecular interactions by β-lactamase reporter fragment complementation | |
| Zhang et al. | A proximity based general method for identification of ligand and receptor interactions in living cells | |
| CN113544509A (zh) | 选择抗体的方法 | |
| JP2017060521A5 (ru) | ||
| Edelstein et al. | Conversion of natural cytokine receptors into orthogonal synthetic biosensors | |
| US9400249B2 (en) | Detection of biopolymer interactions, cancer cells, and pathogens using split-supercharged GFP | |
| US20120196760A1 (en) | Methods and compositions for identifying modulators of anti-tetherin activity to inhibit propagation of viruses | |
| EP4508095A1 (en) | Methods of identifying proximity effector polypeptides and methods of use thereof | |
| US20210096133A1 (en) | Red fluorescent protein-based biosensor for measuring activity of dopamine receptor d1 | |
| WO2003058197A2 (en) | Detection of molecular interactions by beta-lactamase reporter fragment complementation | |
| US20260036580A1 (en) | Use of stem cell-based biosensors for real-time, non-invasive monitoring of neuronal differentiation | |
| JP2005506053A (ja) | アポエクオリンをコードするコドン最適化核酸およびそれらの使用方法 | |
| McMahan | Post-translational Control Schemes in the Regulation of Synthetic Cellular Signaling via Engineered Notch Receptors | |
| US20230417736A1 (en) | Monitoring membrane protein trafficking for drug discovery and drug development | |
| WO2023220392A1 (en) | Synthetic modular extracellular sensors that employ natural receptor ligand-binding domains |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM RU |