[go: up one dir, main page]

EA021512B1 - Антагонисты толл-подобного рецептора 3 - Google Patents

Антагонисты толл-подобного рецептора 3 Download PDF

Info

Publication number
EA021512B1
EA021512B1 EA201171307A EA201171307A EA021512B1 EA 021512 B1 EA021512 B1 EA 021512B1 EA 201171307 A EA201171307 A EA 201171307A EA 201171307 A EA201171307 A EA 201171307A EA 021512 B1 EA021512 B1 EA 021512B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibodies
antibody
amino acid
tab
cells
Prior art date
Application number
EA201171307A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201171307A1 (ru
Inventor
Марк Каннингхэм
Ицин Фэн
Катарина Хиринга
Цзиньцюань Ло
Роберт Раухенбергер
Марк Рутц
Лани Сан Матео
Роберт Т. Сариски
Рэймонд Свит
Фан Тэн
Алексей Тепляков
Шэн-Дзюн Ву
Original Assignee
Янссен Байотек Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/609,675 external-priority patent/US8409567B2/en
Application filed by Янссен Байотек Инк. filed Critical Янссен Байотек Инк.
Publication of EA201171307A1 publication Critical patent/EA201171307A1/ru
Publication of EA021512B1 publication Critical patent/EA021512B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

Описываются антитела-антагонисты толл-подобного рецептора 3 (TLR3), полинуклеотиды, кодирующие антитела-антагонисты TLR3 или их фрагменты, и способы изготовления и применения вышеуказанных веществ.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, являющимся антителами-антагонистами толлподобного рецептора 3 (ТЬК3), полинуклеотидам, кодирующим антитела-антагонисты ТЬК3 или их фрагменты, а также к способам получения и использования названных продуктов.
Предпосылки создания изобретения
Толл-подобный рецептор (ТЕК.) регулирует активацию врожденного иммунного ответа, а также развитие адаптивного (специфического) иммунитета, активируя каскады внутриклеточной передачи сигнала в ответ на связывание бактериальных, вирусных, паразитических, а в некоторых случаях и эндогенных лигандов (Ьаисаз!ег е! а1., 1. ΡΠνκίοΙ. 563:945-955, 2005). Расположенные на плазматической мембране ТЬК, ТЬК1, ТЬК2, ТЬК4 и ЬК6 распознают лиганды, включая белковые или липидные компоненты бактерий и грибков. Толл-подобные рецепторы, ТЬК3, ТЬК7 и ТЬК9, преимущественно внутриклеточные, активируются двухцепочечными РНК, одноцепочечными РНК и неметилированными СрО ДНК соответственно. Считается, что дисрегуляция сигнального пути ТЬК является причиной множества проблем, и терапевтические стратегии развиваются в этом направлении (Нойтаи е! а1., Ναι. Кеу. Эгид Э|зсоу. 4:879-880, 2005; Ке/аек 1и!. 1ттииорЬагтасо1. 6:863-869, 2006; \У1ске1дгеп. §с1епсе 312:184-187, 2006). Например, антагонисты ТЬК4, а также ТЬК7 и ТЬК9, проходят клинические испытания воможности их применения для лечения тяжелого сепсиса и системной красной волчанки соответственно (Кап/1ег е! а1., №!. Мей. 13:552-559, 2007).
Сигнальный путь ТЬК3 активируется двухцепочечной РНК, матричной РНК или РНК, высвобождаемой некротическими клетками при воспалении или вирусной инфекции. Активация ТЬК3 индуцирует секрецию интерферонов и провоспалительных цитокинов, а также приводит к активации и увеличению числа иммунных клеток, защищая таким образом от некоторых микробных инфекций. Например, обнаружена связь доминантно-негативного аллеля ТЬК3 с повышенной восприимчивостью к энцефалиту, вызванному вирусом простого герпеса, после первичного инфицирования вирусом Н8У-1 в детском возрасте (Акепд е! а1., 8с1епсе 317:1522-1527, 2007). У мышей недостаток ТЬК3 связан с пониженной выживаемостью при экспериментальном заражении вирусом Коксаки (КюЬет е! а1., РЬо8 Оие 4:е4127, 2009). Тем не менее, показано, что нарушенная регуляция сигнального пути ТЬК3 имеет отношение к заболеваемости и смертности при определенных вирусных инфекциях, в том числе вызванных вирусом западнонильской лихорадки, флебовирусом, вирусом коровьей оспы и вирусом гриппа типа А (\Уапд е! а1., №й. Мей. 10:1366-1373, 2004; Оотееи е! а1., 1. 1ттиио1. 177:6301-6307, 2006; Ни!скеп8 е! а1., 1. 1ттиио1. 180:483-491, 2008; Ье ОоГйс е! а1., Р1о8 РаШод. 2:Е53, 2006).
Кристаллическая структура внеклеточных доменов человеческого и мышиного ТЬК3 известна (Ве11 е! а1., Ргос. №И. Асай. δοΐ. (υδΑ), 102:10976-80, 2005; СЬое е! а1., 8аеисе 309:581-585, 2005; Ьщ е! а1., 8с1еисе, 320:379-381, 2008). ТЬК3 имеет подковообразную форму соленоида, несет на своей поверхности гликаны и включает 23 домена, состоящих из лейцитовых повторов (ЬКК). Были картированы участки связывания двухцепочечной РНК в двух разных областях (Ьщ е! а1., δс^еηсе. 320:379-81, 2008). Предполагается, что сигнальная единица состоит из одной двухцепочечной РНК и двух внеклеточных доменов ТЬК3 (Ьеоиатй е! а1., Ргос. N311. Асай. N311. Асай. δοΐ. (υδΑ) 105:258-263, 2008).
Показано, что ТЬК3 запускает патогенные механизмы при целом ряде воспалительных, иммуноопосредованных и аутоиммунных заболеваний, включающих, например, септический шок (Сауаззаш е! а1., 1. Ехр. Мей. 205:2609-2621, 2008), острое поражение легких (Миггау е! а1., Ат. 1. Кезрй. Сп!. Саге Мей. 178:1227-1237, 2008), ревматоидный артрит (К1т е! а1., 1ттиио1. Ье!!. 124:9-17, 2009; Вгейаио е! а1., Айй. Кйеит. 52:2656-2665, 2005), астму ^идшта е! а1., Ат. 1. Кезр. Се11 Мо1. Вю1. 40:654-662, 2009; Мог18Ыта е! а1., 1и!. АгсЬ. А11егду 1ттиио1. 145:163-174, 2008; δΦΜ^Π е! а1., Кезрй. Кез. 10:43, 2009), воспалительные заболевания ЖКТ, например, болезнь Крона и язвенный колит (2Ьои е! а1., 1. 1ттиио1. 178:4548-4556, 2007; 2Ьои е! а1., Ргос. №й1. Асай. δ^. (^А) 104:7512-7515, 2007), аутоиммунные заболевания печени (Ьаид е! а1., 1. С1ш. 1иуез!. 116:2456-2463, 2006) и сахарный диабет I типа (Оодизаи е! а1. 0|аЬе1ез 57:1236-1245, 2008; Ыеи аий 21рйз, Сигг. Мо1. Мей. 9:52-68, 2009). Кроме того, показано, что органоспецифическая экспрессия ТЬК3 коррелирует с рядом патологических состояний, вызываемых нарушением регуляции местных воспалительных реакций, например, в тканях печени при первичном биллиарном циррозе (Таки е! а1., ЬаЬ 1иуез!. 85:908-920, 2005), в суставах при ревматоидном артрите (Озре1! е! а1., АйЬййз КЬеит. 58:3684-3692, 2008) и слизистой оболочке носа при аллергическом рините (Ртаиззои е! а1., Кезрй. Кез. 6:100, 2005).
При некрозе высвобождение клеточного содержимого, в том числе эндогенных матричных РНК, индуцирует секрецию цитокинов, хемокинов и других факторов, которые инициируют процесс местного воспаления, облегчают уничтожение клеточных остатков и восстановительный процесс. Некроз часто приводит к непрекращающемуся воспалительному процессу, способствуя его переходу в хроническую форму или усилению (ВегдзЬакеи е! а1., №Ш.1ге Ке\ае\уз 7:99-109, 2009). Активация ТЬК3 в месте некроза может способствовать развитию ненормального воспалительного процесса и привести к возникновению провоспалительной положительной обратной связи за счет высвобождения лигандов ТЬК3. Таким образом, антагонисты ТЬК3 могут играть положительную роль при многих заболеваниях, сопровождающихся хроническим или острым воспалением и/или некрозом.
- 1 021512
Снижение активации ТЬК3 может рассматриваться как новая стратегия в лечении онкологических заболеваний, таких как почечноклеточный рак и плоскоклеточный (эпидермальный) рак области головы и шеи (Мопка\уа е( а1., С1ш. Сапсег Ке8. 13:5703-5709, 2007; Рпек е( а1., Ιηΐ. 1. Мо1. Мей. 21:209-215, 2008). Кроме того, аллель ТЬК3Ъ423Р, кодирующий белок с меньшей активностью, связан с функцией защиты против продвинутой сухой макулярной дегенерации вследствие возрастных изменений (Уап§ е( а1., N. Епд1. 1. Мей. 359:1456-1463, 2008), что указывает на возможную положительную роль антагонистов ТЬК3 при этом заболевании.
Заболевания, связанные с воспалением, также как и заболевания, вызываемые инфекциями, имеют значительное влияние на здоровье и, следовательно, большое экономическое значение. Тем не менее, несмотря на прогресс во многих областях медицины, существует относительно мало возможностей для лечения большинства названных заболеваний.
Таким образом, существует необходимость в подавлении активности ТЬК3 для лечения связанных с функцией этого рецептора заболеваний.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показан эффект моноклональных антител (тАЬ) против человеческого ТЬК3 (НиТЬЮ) в эксперименте с использованием гена-репортера ΝΡ-кВ.
На фиг. 2А и 2В показан эффект (% ингибирования) или эффект моноклональных антител против человеческого ТЬК3 в эксперименте с использованием гена ВЕА8-2В.
На фиг. 3А и 3В показан эффект моноклональных антител против человеческого ТЬК3 в эксперименте с использованием гена ΝΗΒΕ.
На фиг. 4 показан эффект моноклональных антител против человеческого ТЬК3 в эксперименте с использованием гена РВМС.
На фиг. 5А и 5В показан эффект моноклонального антитела против человеческого ТЬК3 в эксперименте с использованием гена НА8М.
На фиг. 6А, 6В и 6С показано связывание моноклонального антитела против человеческого ТЬК3 с мутантами ТЬК3.
На фиг. 7А показаны эпитопы, распознаваемые тАЬ 15ЕУО (черным цветом) и С1068 (серым цветом) (верхняя часть фигуры), и эпитопы, распознаваемые тАЬ 12ОУО/О8У (черным цветом, нижняя часть фигуры), наложенные на изображение структуры внеклеточного домена человеческого ТЬК3. На фиг. 7В показана карта возмущений при избирательном замещении водорода дейтерием в случае, когда внеклеточный домен ТЬК3 образует комплекс с тАЬ 15ЕУЦ.
На фиг. 8А и 8В показан эффект суррогатных крысиных/мышиных тАЬ (тАЬ против мышиного ТЬК3, тАЬ 5429) в экспериментах с использованием А) гена-репортера ΝΡ-кВ и В) гена-репортера 18КЕ.
На фиг. 9 показан эффект суррогатных тАЬ (тАЬ 5429, тАЬ с1811) в эксперименте с МЕР СХСБ10/1Р-10.
На фиг. 10 показана специфичность связывания суррогатных тАЬ с ТЬК3. Верхняя панель: контроль изотипа; нижняя панель: тАЬ с1811.
На фиг. 11 показано влияние суррогатных тАЬ на уровень репН в при экспериментально индуцированной гиперчувствительности дыхательных путей (ГДП).
На фиг. 12 показан эффект суррогатных тАЬ на общее число нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) при гиперчувствительности дыхательных путей (ГДП).
На фиг. 13 показан эффект влияния суррогатных тАЬ на уровень продукции СХСЫ0/1Р-10 в жидкости после лаважа при ГДП.
На фиг. 14 показан эффект суррогатных тАЬ на гистопатологические показатели при использовании декстран сульфата натрия (ДСН).
На фиг. 15 показан эффект суррогатных тАЬ на А) гистопатологические показатели и В) приток нейтрофилов при переносе Т-клеток.
На фиг. 16 показано влияние суррогатных тАЬ на клинические показатели при коллагениндуцированном артрите (КИА).
На фиг. 17 показан эффект суррогатных тАЬ на площадь под кривой, описывающей динамику клинических показателей, при КИА.
На фиг. 18 показано влияние суррогатных тАЬ на выживаемость мышей С57ВБ/6 после интраназального введения вируса гриппа А/РК/8/34. Введение тАЬ началось в день -1.
На фиг. 19 показано влияние суррогатных тАЬ на клинические показатели после заражения вирусом гриппа типа А/РК/8/34. Введение тАЬ началось в день -1.
На фиг. 20 показано влияние суррогатных тАЬ на массу тела в течение 14 дней после введения вируса гриппа А/РК/8/34. Введение тАЬ началось в день -1.
На фиг. 21 показано влияние суррогатных тАЬ на концентрацию глюкозы в крови у животных (А) \УТ ΌΙΘ и (В) ТЬК3КО ΌΙΘ после пробного введения глюкозы.
На фиг. 22 показано влияние суррогатных тАЬ на концентрацию инсулина у животных \УТ ΌΙΘ.
На фиг. 23 показано влияние тАЬ 15ЕУЦ на (А) ЭТН1 и (В) продукцию СХСБ10/1Р-10 и ССЬ5/КАОТЕ§ в клетках NΗΒΕ, индуцированную риновирусом.
- 2 021512
На фиг. 24 показано влияние тЛЪ 15ЕУО на (А) содержание 81САМ-1 и (В) жизнеспособность клеток НИУЕС.
На фиг. 25 показана выживаемость животных после введения суррогатных тАЪ через 3 дня после инфекции вирусом гриппа А.
На фиг. 26 показаны оценки клинического состояния после введения суррогатных тАЪ через 3 дня после заражения вирусом гриппа А.
На фиг. 27 показано изменение массы тела животных после введения суррогатных тАЪ через 3 дня после инфекции вирусом гриппа А.
На фиг. 28 показана молекулярная структура четвертичного комплекса внеклеточного домена ТЬК3 с РаЪ 12ОУО/О8У. РаЪ 15ЕУО и РаЪ с1068 в А с представлением цепей в форме лент и общей структурой поверхности. Внеклеточный домен ТЬК3 показан светло-серым цветом, Ν-конец отмечен буквой Ν; все РаЪ-фрагменты на схеме расположения цепей показаны темно-серым цветом. В. Эпитопы показаны светло-серым цветом и помечены на схеме внеклеточного домена ТЬК3 так же, как РаЪ в А. На фиг. 28, 29 и 30 РаЪ 12ОУО/О§У, РаЪ с1068 и РаЪ 15ЕУО сокращенно указаны как РаЪ12, РаЪ1068 и РаЪ15, соответственно, для ясности.
Фиг. 29 показывает механизм нейтрализации РаЪ 15ЕУО. А. Сигнальная единица (СЕ) двухцепочечная РНК:ТЬК3 с эпитопом РаЪ 15ЕУС. отмеченным светло-серым цветом, в одном из двух внеклеточных доменов ТЬК3 (светло- и темно-серый цвет, и помечен ТЬК3). Лиганд двухцепочечной РНК показан в виде двойной спирали серого цвета. В. Иллюстрация связывания РаЪ 15ЕУО, создающего стерические препятствия для связывания с двухцепочечной РНК и, таким образом, образования СЕ. Связывание РаЪ 15ЕУОс высоким сродством будет препятствовать формированию СЕ или вызовет распад уже образовавшейся СЕ.
На фиг. 30 показан механизм РаЪ 12ОУО/О§У и РаЪ с1068 и соединения единиц в сигнальную единицу (СЕ) ТЬК3. А. РаЪ 12ОУО/О§У и РаЪ с1068 могут связываться (в том числе совместно) с одной СЕ. В. Модель тесного объединения двух СЕ на двухцепочечной РНК длиной примерно 76 пар оснований. Для наглядности три эпитопа выделены цветом. С. Связывание РаЪ 12ОУО/О§У и РаЪ с1068 препятствует объединению СЕ из-за стерических столкновений между антителами и соседними СЕ. Две стрелки, направленные влево, обозначают разные количественные степени разделения СЕ под влиянием антител (нижняя стрелка относится к РаЪ 12ОУО/О§У, а верхняя - к РаЪ с1068).
На фиг. 31 показано соответствие между последовательной нумерацией и системой нумерации Кабата и Чотиа на примерах антител. Области, определяющие комплементарность, и гипервариабельные участки показаны серым цветом.
На фиг. 32 показано совмещение региона УЪ тАЪ 15ЕУО с каркасным сегментом человеческого антитела Ук1. Гипервариабельные петли Чотиа подчеркнуты, паратопы подчеркнуты двойной чертой, а различия каркасного сегмента показаны серым цветом. Гены Ук1 представляют собой аллели *01, если не указано иное. Нумерация остатков последовательная.
На фиг. 33 показано совмещение региона УН тАЪ 15ЕУО с каркасным сегментом человеческого антитела УТ5. Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32.
На фиг. 34 показано совмещение региона УЪ тАЪ 12ОУО/О§У с каркасным сегментом человеческого антитела Ук3. Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32.
На фиг. 35 показано совмещение областей УЪ и УН тАЪ 15ЕУО или тАЪ 12ОУО/О§У с каркасными сегментами человеческого антитела 1к, 1λ или Лт Особенности последовательности показаны, как на фиг. 32.
Изложение сущности изобретения
Один из аспектов изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками К416, К418, Ь440, N441, Е442, Υ465, N466, К467, Υ468, К488, К489, А491, К493, N515, N516, N517, Н539, N541, §571, Ь595 и К619 §ЕО ГО N0: 2 толлподобного рецептора 3 (ТЬК3).
Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками §115, Ό116, К117, А120, К139, N140, N141, У144, К145, Т166, р167, У168, §188, Е189, Ό192, А195 и А219, §ЕО ГО N0: 2 толл-подобного рецептора 3 (ТЬК3).
Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с ТЬК3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в §Е0 ГО N0: 2, через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа ν33, Р50, Ό52, Ό54, Υ56, N58, Р61, Е95, Υ97, Υ100 и И100Ъ и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа 027, Υ32, N92, Т93, Ь94 и §95.
Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с ТЬК3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в §Е0 ГО N0: 2
- 3 021512 через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа Ν31α, 052. К52Ь, 853, К54, Υ56, Υ97, Р98, Р99 и Υ100, и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа 029, 830, Υ31, Υ32, Е50, Ό51, Υ91, Ό92 и Ό93.
Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с ТЬК3, причем антитела имеют по меньшей мере одно из следующих свойств:
a) связываются с человеческим ТЬК.3 с Кй<10 нМ;
b) уменьшают биологическую активность ТЬК3 в анализе ίη νίίτο с использованием гена-репортера ΝΕ-кВ и поли(1:С) на >50%, при концентрации 1 мкг/мл;
c) на >60% ингибируют продукцию 1Ь-6 или СХСЬ10/1Р-10 в клетках ВЕА8-2В, стимулированных воздействием <100 нг/мл поли(1:С), при концентрации 10 мкг/мл;
й) на >50% ингибируют продукцию 1Ь-6 или СХСЬ10/1Р-10 в клетках ВЕА8-2В, стимулированных воздействием <100 нг/мл поли(1:С), при концентрации 0,4 мкг/мл;
е) на >50% ингибируют продукцию 1Ь-6 в клетках ΝΗΒΕ, стимулированных воздействием 62,5 нг/мл поли(1:С), при концентрации 5 мкг/мл;
ί) на >50% ингибируют продукцию 1Ь-6 в клетках ΝΗΒΕ, стимулированных воздействием 62,5 нг/мл поли(1:С), при концентрации 1 мкг/мл;
д) на >20% ингибируют поли(1:С)-индуцированную продукцию ΙΡΝ-γ, 1Ь-6 или 1Ь-12 в клетках РВМС, при концентрации 1 мкг/мл;
1ι) ингибируют биологическую активность ТЬК3 яванского макака в анализе ίη νίίτο с использованием гена-репортера ΝΡ-кВ при 1С50 <10 мкг/мл; или
ί) ингибируют биологическую активность ТЬК3 яванского макака в анализе ίη νίίτο с использованием гена-репортера Ι8ΚΕ при 1С50 <5 мкг/мл.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных взаимодействовать с ТЬК3, конкурирующих за связывание ТЬК3 с моноклональными антителами, причем эти моноклональные антитела состоят из аминокислотных последовательностей участков 1, 2 и 3, определяющих комплементарность (сотр1етеп1агПу йеЮгтиипд гедюпк - СЭР) определенных тяжелых цепей, аминокислотных последовательностей СГОР 1, 2 и 3 определенных легких цепей, а также из аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных тяжелых цепей (УН) или аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных легких цепей (УЬ).
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с ТЬК3, содержащих как вариабельный участок тяжелой, так и вариабельный участок легкой цепи, причем эти антитела также содержат определяющие комплементарность участки 1, 2 и 3 (СЭР) определенных тяжелых цепей и аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 участков СИР определенных легких цепей.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с ТЬК3, содержащих вариабельные участки как тяжелой, так и легкой цепи, причем эти антитела также содержат аминокислотные последовательности вариабельных участков определенных тяжелых цепей (УН) и аминокислотные последовательности вариабельных участков определенных легких цепей (УЬ).
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных антителах, способных реагировать с ТЬК3, содержащих вариабельные участки как тяжелой, так и легкой цепей, причем эти антитела также содержат аминокислотные последовательности определенных тяжелых цепей и аминокислотные последовательности определенных легких цепей.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 или 216.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,
21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 или 225.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной тяжелой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированной легкой цепи антитела, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 или 227.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО ΝΟ: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 или 216.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирую- 4 021512 щем легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 или 225.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированном полинуклеотиде, кодирующем легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО N0: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165, 167 или 227.
Следующий аспект данного изобретения заключается в фармацевтической композиции, состоящей из изолированных антител настоящего изобретения и фармацевтически приемлемых носителей.
Следующий аспект данного изобретения заключается в векторе, включающем по меньшей мере один полинуклеотид, представленный в данном изобретении.
Следующий аспект данного изобретения заключается в клетках-хозяевах, содержащих вектор, представленный в данном изобретении.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе получения антител, способных реагировать с ТЬК.3, заключающемся в культивировании клеток-хозяев, представленных в данном изобретении, и отборе антител, производимых клетками-хозяевами.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики воспалительных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения или предупреждения воспалительного заболевания.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики системных воспалительных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения или предупреждения системного воспалительного заболевания.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения диабета 2 типа, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения диабета 2 типа.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения гипергликемии, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения гипергликемии.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения гиперинсулинемии, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения резистентности к инсулину.
Следующий аспект данного изобретения заключается в способе лечения или профилактики вирусных инфекций, который включает введение терапевтически эффективных доз изолированных антител, представленных в данном изобретении, нуждающимся в лечении пациентам в течение периода, достаточного для лечения или профилактики вирусных инфекций.
Подробное описание изобретения
Все публикации, упоминаемые в данном описании, в том числе, помимо прочего, патенты и патентные заявки, включенные в настоящее описание путем ссылки, являются частью настоящего документа, как если бы они были изложены непосредственно в настоящем документе.
Используемый в данном изобретении термин антагонист означает молекулу, которая любым способом, частично или полностью, ингибирует эффект другой молекулы, такой как рецептор или внутриклеточный медиатор.
Используемый в данном изобретении термин антитела-антагонисты ТКЕ3 или антитела, способные реагировать с ТЕК.3, относится к антителам, способным прямо или косвенно физически взаимодействовать, уменьшать или ингибировать биологическую активность ТЬК3 или активацию рецептора ТЬК.3. Например, антитело, способное реагировать с ТЬК3, может связываться непосредственно с ТЬК3 и нейтрализовать активность ТЬК.3, т.е. блокировать сигнальный путь ТЬК.3, приводя к уменьшению продукции цитокинов и хемокинов, либо к активации ΝΡ-κΒ.
Используемый в данном изобретении термин антитела имеет широкое значение и относится к иммуноглобулинам или молекулам антител, включая поликлональные антитела, моноклональные антитела, включая мышиные/крысиные, человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и химерные моноклональные антитела и фрагменты антител.
В общем смысле антитела являются белками или пептидными цепочками, которые специфически связываются со специфическим антигеном. Интактные антитела являются гетеротетрамерными гликопротеинами, состоящими из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей. Обычно,
- 5 021512 каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одного ковалентного дисульфидного мостика, тогда как число дисульфидных связей между тяжелыми цепями различных иммуноглобулиновых изотипов может варьироваться. Каждая тяжелая и каждая легкая цепь также обладает регулярно расположенными внутренними дисульфидными мостиками. На одном конце каждой тяжелой цепи расположен вариабельный домен (вариабельная область, УН), за которой следует ряд постоянных доменов (постоянные области). Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (УЪ), а на другом конце постоянный домен. Постоянный домен легкой цепи находится напротив первого постоянного домена тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи находится напротив вариабельного домена тяжелой цепи. Исходя из аминокислотной последовательности постоянных доменов легкая цепь антитела любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различающихся типов, а именно каппа (к) и лямбда (λ).
Иммуноглобулины делятся на пять больших классов, а именно 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1§О и 1дМ, в зависимости от аминокислотного состава постоянного домена тяжелой цепи. 1§А и 1§О, в свою очередь, подразделяются на изотипы 1дАь 1дА2, 1дОь 1дО2, 1дО3 и 1§О4.
Термин фрагмент антитела относится к части интактного антитела, обычно это антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Например, к фрагментам антитела относятся фрагменты РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2 и Ρν, диатела, одноцепочечные фрагменты антитела и мультиспецифичные антитела, сформированные из по меньшей мере двух интактных антител.
Вариабельные участки легкой или тяжелой цепи состоят из каркасного участка, прерванного тремя антигенсвязывающими участками. Антигенсвязывающие участки могут называться по-разному, например, (ί) термин определяющие комплементарность участки (ί'ΌΒ) отражает вариабельность последовательности (\Уи апб ВаЬа1. 1. Ехр. Меб. 132:211-250, 1970). Как правило, антигенсвязывающий участок имеет шесть СОК; три из которых расположены на УН (НСОВ1, НСОВ2, НСОК3), а другие три на УЬ (ЬСОВЙ ЬСПК2, БСОВ3) (КаЬа! е1 а1., Зециепсек οί Рто1еш8 οί 1ттипо1ощса1 1п1еге81, 51П Еб. РиЬНс НеаЙЬ 8егасе, Ыабопа1 1п81йи1е8 οί НеаИЬ, ВеШекба, Мб., 1991). (ίί) Согласно определению Чотии и Леска термин гипервариабельный участок, НУВ, или НУ относится к вариабельному домену антитела, который имеет гипервариабельную структуру (СЬоННа апб Ьекк, Мо1. Вю1. 196:901-917, 1987). Как правило, антигенсвязывающий участок содержит шесть гипервариабельных областей, три из которых находятся в УН (Н1, Н2, Н3) и три - в УЪ (Ь1, Ь2, Ь3). Чотиа и Леск называют структурно консервативные НУ каноническими структурами. (ίίί) 1МСТ-СЭВ Согласно Лефранку (ЬеГгапс е1 а1., Оеу. Сотрата! 1ттипо1. 27:55-77, 2003), термин 1МСТ-СЭВ основывается на сравнении пяти доменов иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток. В международной базе данных 1тМипоОепеТю8 (1МСТ; 1Шр://\у\у\\_Нпд1_огд) приводится стандартизованное обозначение и определение этих участков. Соответствие между СОВ, НУ и 1МСТ подробно описано у ЬеГгапс е1 а1. (^еν. Сотрата! 1ттипо1. 27:55-77, 2003). (ίν) Антигенсвязывающий участок также может быть определен на основании использования остатков, определяющих специфичность (δΌΒυ) (А1тадго, Мо1. Весодпй. 17:132-143, 2004), где термин определяющие специфичность аминокислотные остатки (кресШсйу беЮгтнйпд ге81бие8, δΌΒ) используется для обозначения аминокислотных остатков иммуноглобулинов, непосредственно вовлеченных в контакт с антигеном. δΌΒυ - точная мера количества и распределения 8ΌΒ для разных типов антигенов, согласно результатам анализа кристаллической структуры комплексов антиген-антитело. (ν) Антигенсвязывающий участок также можно определить как остатки паратопа антитела, определенные в кристаллической структуре комплекса антиген-антитело.
Используемый в данном изобретении термин композитные последовательности означает антигенсвязывающий участок, включающий все аминокислотные остатки, индивидуально упомянутые у Кабата, Чотии или в 1МСТ, или любые другие участки, определенные как антигенсвязывающие.
Остатки Чотиа в настоящем документе относятся к УЪ и УН областям антитела и нумеруются согласно А1-Ра/1каш (А1-ка/|кап1 е1 а1., ί. Мо1. Вю1. 273:927-48, 1997). Соответствие между двумя самыми употребительными системами нумерации, Кабата (КаЬа! е1 а1., δе^иеηсе8 οί 1ттипо1ощса1 1п1еге81, 5* Еб. РиЬНс НеаНЬ δе^ν^се. ΝΙΗ ВеШекба, МО, 1991) и Чотиа (СЬоННа апб Ьекк, Мо1. Вю1. 196:901-17, 1987) по отношению к последовательной нумерации полипептидов показано на фиг. 31 на примере антител, относящихся к настоящему изобретению.
Название каркасный участок или каркасные последовательности относится к последовательностям вариабельных участков, которые не были определены как антигенсвязывающие. Каркасный участок обычно разделяют на четыре области, ΡΒ1, ΡΒ2, ΡΒ3 и ΡΒ3, образующие каркасную структуру для трех антигенсвязывающих участков в каждой вариабельной области. Поскольку для определения антигенсвязывающего участка могут использоваться разные термины, как указано выше, определение точной последовательности аминокислот каркасного участка зависит от определения антигенсвязывающего участка.
Каркасный участок вариабельной области легкой цепи каппа 1 (Ук1) или Ук1 в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов Ук1 или их аллелей. Например, это следующие функциональные
- 6 021512 человеческие гены Ук1: ЮКУ1-5*01, ЮКУ1-6*01, ЮКУ1-8*01, ЮКУ1-9*01, ЮКУ1-12*01, ЮКУ113*02, ЮКУ1-16*01, ЮКУ1-17*01, ЮКУ1-27*01, ЮКУ1-33*01, ЮКУ1-37*01, ЮКУ1-39*01, ЮКУГО8*01, ЮКУГО-12*01, ЮКУГО-13*01, ЮКУГО-16*01, ЮКУГО-17*01, ЮКУГО-33*01, ЮКУГО-37*01, ЮКУГО-39*01, 1СКУ1Э-42*01 или 1СКУЮ-43*01. Номенклатура генов иммуноглобулина хорошо известна.
Каркасный участок вариабельной области легкой цепи лямбда 3 (УХ3) или νλ3 в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов Уλ3 или их аллелей. Например, это следующие функциональные человеческие гены Уλ3: ЮЬУ3-1*01, ЮЬУ3-9*01, ЮЬУ3-10*01, ЮЬУ3-12*01, ЮЬУ3-16*01, ЮЬУ319*01, ЮЬУ3-21*01, ЮЬУ3-22*01, ЮЬУ3-25*01, ЮЬУ3-27*01 и ЮЬУ3-32*01.
Каркасный участок вариабельной области легкой цепи УЪ5 или УЪ5 в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов УЪ5 или их аллелей. Например, это следующие функциональные гены УЪ5: ЮНУ5-51*01 и ЮНУ5-1*01.
Каркасный участок вариабельной области легкой цепи УЪ6 или УЪ6 в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов УЪ6 или их аллелей. Например, это функциональный ген УЪ6 ЮНУ6-1*01.
Каркасный участок легкой цепи 1-каппа (или 1к) в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов 1к или их аллелей. Например, это функциональные человеческие гены Ук ЮК11, ЮК12, ЮК13, ЮК14 и ЮК15.
Каркасный участок 1-лямбда легкой цепи (или 1λ) в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов 1λ или их аллелей. Например, это функциональные человеческие гены 1λ ЮЫ1, ЮЫ2, ЮЫ3, ЮЫ4, ЮЫ5, ЮЫ6 и ЮЫ7.
Каркасный участок 1-области тяжелой цепи или 11ι в настоящем документе означает каркасный участок с аминокислотной последовательностью, кодируемой любым из человеческих функциональных генов 11ι или их аллелей. Например, это функциональные гены 11ι ЮНН, ЮН12, ЮН13, ЮН14, ЮН15 и ЮН16.
Термин гены зародышевой линии или гены зародышевой линии антитела в настоящем документе означает последовательности иммуноглобулина, кодируемые нелимфоидными клетками, не претерпевшими процесс созревания, ведущий к генетической перестройке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина.
Термин каркасный белок в настоящем документе означает аминокислотные последовательности вариабельной области легкой или тяжелой цепей, кодируемые человеческими зародышевыми генами. Таким образом, этот термин охватывает и каркасную область, и антигенсвязывающий участок.
Используемый в данном изобретении термин антиген означает любую молекулу, которая прямо или косвенно может приводить к выработке антител. Понятие антиген также включает кодирующую белок нуклеиновую кислоту.
Термин гомолог означает белковые последовательности, имеющие от 40 до 100% сходства по отношению к рассматриваемой последовательности. Гомологами человеческого ТЬК3 являются полипептиды других видов, имеющие от 40 до 100% сходства по отношению к уже известной последовательности человеческого ТЬК.3. Идентичность между двумя пептидными цепочками, определенная в процентном соотношении, может быть вычислена путем попарного совмещения с помощью настройки по умолчанию в модуле Άίί§ηΧ программного обеспечения Уее1ог ΝΤΙ ν.9.0.0 (ΙηνίΙΐΌβοη. СА). Термин ТЬК3 обозначает человеческий ТЬК3 (ЬиТЬК3) и его гомологи. Полная нуклеотидная и аминокислотная последовательности человеческого ТЬК3 показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 и 2 соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности внеклеточного домена (ЕСГО) человеческого ТЬК3 представлены в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3 и 4 соответственно.
Используемый в данном изобретении термин по существу, идентичный означает, что аминокислотные последовательности двух антител или фрагментов антител при сравнении являются идентичными или имеют незначительные отличия. Незначительными отличиями являются замещения 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот в аминокислотной последовательности антитела или фрагмента антитела. Аминокислотные последовательности, по существу, идентичные последовательностям, представленным в данном изобретении, также рассматриваются как часть данного изобретения. В некоторых случаях идентичность последовательностей может достигать 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Идентичность в процентном соотношении может быть вычислена, как описано выше. Для сравнения пептидных цепочек наилучшим образом подходят вариабельные участки тяжелой или легкой цепи.
Используемый в данном изобретении термин в сочетании с означает, что описанные активные вещества могут использоваться совместно, образуя смесь, по отдельности или последовательно в любом порядке.
- 7 021512
Используемый в данном изобретении термин воспалительное заболевание означает местную (локальную) реакцию на клеточное повреждение, частично опосредованную активностью цитокинов, хемокинов или воспалительных клеток (например, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, макрофагов), которое в большинстве случаев сопровождается болью, покраснением, припухлостью и утратой тканью своей нормальной функции. Используемый в данном изобретении термин воспаление легких означает воспалительное заболевание, поражающее легкие или связанное с ними.
Используемый в данном изобретении термин моноклональное антитело (тАЬ) означает антитело (или фрагмент антитела), полученное из популяции, по существу, гомогенных антител. Моноклональные антитела высокоспецифичны и, как правило, направлены против единственной антигенной детерминанты. Определение моноклональные означает, по существу, гомогенный характер антител и не требует использования какого-либо определенного способа производства антител. Например, мышиные тАЬк можно получить гибридомным методом согласно КоЫет е! а1. (ИаШте 256:495-497, 1975). Химерные тАЬк, содержащие вариабельную область легкой и тяжелой цепи, полученные из донорного антитела (обычно мышиного) и постоянные области легкой и тяжелой цепей, полученные из акцепторного антитела (обычно другого вида млекопитающих, например, человека), можно получить по методу, описанному в патенте № 4816567. Гуманизированные тАЬ, имеющие СЭК из донорного не человеческого иммуноглобулина (обычно мышиного) и оставшиеся части молекулы, взятые из одного или нескольких человеческих иммуноглобулинов, можно получить с помощью методик, известных специалистам, например, как описано в патенте № 5225539. Человеческие каркасные последовательности, использующиеся получения гуманизированных антител, могут выбираться специалистами в этой области из соответствующих баз данных. В случае необходимости, для сохранения аффинности связывания гуманизированные тАЬ могут быть дополнительно модифицированы включением измененных оснований каркасного участка с помощью способов, предложенных Онееп е! а1. (Ргос. №0. Асай. §сь (И8А), 86:10029-10032, 1989 и Нойдкоп е! а1., Вю/Тесйпо1оду, 9:421, 1991).
Полностью человеческие тАЬ, не содержащие ни одной экзогенной последовательности, могут быть получены от мышей, имеющих человеческий трансген, с помощью существующих методов (см., например, ЬопЬетд Иа!иге 368:856-859, 1994; РМлуПй е! а1., №Ниге Вю!есЬпо1оду 14:845-851, 1996; и Мепйе/ е! а1., Иа!иге Оепейск 15:146-156, 1997). Человеческие тАЬ могут быть получены и оптимизированы с помощью комбинаторных фаговых библиотек, а также с помощью других доступных способов (см., например, Кпарр1к е! а1., 1. Мо1. Вю1. 296:57-86, 2000; и КгеЬк е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!й. 254:67-84 2001). Фрагменты антител, например РаЬ, Р(аЬ')2, Рй и йАЬ, могут быть получены путем расщепления антител или методами рекомбинантной технологии. Например, фрагменты РаЬ и Р(аЬ')2 могут быть получены путем обработки антител ферментом, например пепсином.
Используемый в данном изобретении термин эпитоп означает часть антигена, с которой специфически связываются антитела. Эпитопы обычно состоят из химически активных (неполярных, полярных или гидрофобных), поверхностно расположенных функциональных групп, таких как боковые группы аминокислот или полисахаридов, и могут иметь специфическую трехмерную структуру, а также специфический заряд. Строение эпитопа может быть линейным или прерывистым, например конформационный эпитоп, который формируется в результате пространственного взаимодействия аминокислот, не находящихся в непрерывной аминокислотной последовательности антигена, в отличие от взаимодействия линейно связанных аминокислот. Конформационный эпитоп включает эпитопы, возникающие в результате пространственного свертывания белков антигенов, при котором аминокислоты из различных участков линейной последовательности антигена оказываются в тесной близости в трехмерном пространстве.
Используемый в данном изобретении термин паратоп означает часть антитела, с которой специфически связывается антиген. Паратоп может быть линейным или дискретным, образованным за счет пространственных взаимоотношений между аминокислотами, не находящимися в непрерывной последовательности, в отличие от взаимодействия линейно связанных аминокислот. Термины паратоп легкой цепи и паратоп тяжелой цепи или аминокислотные остатки паратопа легкой цепи и аминокислотные остатки паратопа тяжелой цепи означает аминокислотные остатки легкой и тяжелой цепей, контактирующие с антигеном.
Используемый в данном изобретении термин специфическое связывание относится к антителам, проявляющим большую аффинность при связывании с определенными антигенами, по сравнению с другими антигенами или белками. Как правило, связывание антитела характеризуется константой диссоциации (Кс) 10-7 М или менее. Связывание с предопределенным антигеном происходит при Кс, в два раза меньшей, чем Кс связывания со неспецифичным антигеном (например, В8А, казеин или любой другой полипептид), отличным от предопределенного антигена. Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используются как взаимозаменяемые вместе с выражениями антитело, которое специфически связывается с антигеном или специфичное к антигену антитело, например, антитело, специфичное к ТЬК.3. Константа диссоциации может быть измерена с помощью стандартных способов, описанных далее.
Использующийся в настоящем изобретении термин биологическая активность ТЬК.3 или активация ТЬК.3 относится к любой активности, являющейся результатом связывания лиганда с ТЬК.3. Лиган- 8 021512 ды ТЬК3 включают двухцепочечную РНК, поли(1:С) и эндогенную мРНК, например, мРНК, высвобожденную из некротических клеток. В отдельных случаях, активация ТЬК3 приводит к активации ΝΡ-κΒ в ответ на связывание лиганда ТЬК3.
Экспериментальная оценка активации ΝΡ-κΒ может быть осуществлена с использованием генарепортера после индукции рецептора лигандом поли(1:С) (А1ехорои1ои с1 а1., №Пиге 413:732-738, 2001; Наскег е1 а1., ΕΜΒΟ 1. 18:6973-6982, 1999). В других случаях активация ТЬК3 приводит к активации факторов (ΙΡΡ-3, ΙΡΡ-7), участвующих в интерфероновом ответе, в ответ на лиганд ТЬК3. Экспериментальная оценка опосредованной рецептором ТЕК3 активации ΙΚΕ может быть сделана с помощью генарепортера, контролируемого интерферон-стимулированными элементами (1п1ег£егоп-8Йти1а1ей гекропке с1етеп1 - Ι8ΡΕ). В отдельных случаях активация ТЕК3 приводит к секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов, например, ΊΝΡ-α, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-12, СХСЬ5/1Р-10 и К.АЛТЕ§. Высвобождение цитокинов и хемокинов из клеток, тканей или в циркуляционных потоках может быть измерено с помощью хорошо известных иммунологических тест-систем, таких как ИФА.
В данном изобретении использованы общепринятые одно- и трехбуквенные коды обозначения аминокислот
Аминокислота Трехбуквенный код Однобуквенный код
Аланин А1а А
Аргинин Агд К
Аспарагин Азп N
Аспарагиновая
Азр П
кислота
Цистеин Суз с
Глутаминовая кислота С1и Е
Глутамин С1п 0
Глинин С1 у О
Гистидин ΗΪ3 н
Изолейцин Т1е I
Лейцин Ьеи ь
Лизин Ьуз к
Метионин МеЬ м
Фенилаланин РЬе г
Пролин Рго Р
Серин Зег 8
Треонин Тйг Т
Триптофан Тгр И
Тирозин Туг Υ
Валин Уа1 V
Композиции данного изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам, способным ингибировать биологическую активность ТЬК3, и к использованию этих антител. Антагонисты ТЕК3 могут связываться с ТЕК3 и ингибировать активацию ТЕК.3. Примеры механизмов, по которым указанные антитела могут ингибировать активацию ТЕК.3, включают ингибирование ш У11го. ш νί\Ό или ш κίΐυ путем связывания лигандов с ТЬК.3, ингибирования димеризации рецептора, ингибирования ТЕК3 в эндосоме, ингибирования киназной активности дальнейшего сигнального пути или ингибирования транскрипции матричных РНК ТЕК3. Другие антитела-антагонисты, способные ингибировать активацию ТЕК3 за счет других механизмов, также являются частью настоящего изобретения. Данные антагонисты находят применение в качестве исследовательских и диагностических реагентов, а также терапевтических агентов.
В природе разнообразие антител создается благодаря множеству генов зародышевой линии, кодирующих вариабельные области, и множеству соматических событий. Соматические события включают рекомбинацию переменного генного сегмента, сегмента разнообразия (Ό) и сегмента присоединения (1), а при образовании участка УЪ - рекомбинацию V и 1 сегментов. Сам процесс рекомбинации может быть неточным, приводя к уменьшению или увеличению числа аминокислот в месте соединения У(Э)Е Эти механизмы разнообразия действуют в развивающихся В-клетках до антигенной стимуляции. После антигенной стимуляции экспрессирующиеся гены антител в В-клетках претерпевают соматическую мутацию. На основании оценки числа сегментов генов зародышевой линии произвольная рекомбинация этих сегментов и произвольное спаривание УН-УЪ может дать начало до 1,6 х 107 разных антител (Еипйатеп1а1 1ттипо1о§у, 3гй ей. (1993), ей. Раи1, Кауеп Ргекк, №ν Уогк, Ν.Υ.). Если учитывать другие процессы, спо- 9 021512 собствующие разнообразию антител (например, соматические мутации), полагают, что возможна генерация до 1010 разных антител (1шшипод1оЪи1т Сепез, 2пб еб. (1995), ебз. Ιοηΐο е! а1., Лсабеш1с Ргезз, 8ап И1едо, СайГ.). Поскольку в обеспечении разнообразия антител участвует много процессов, очень маловероятно, что полученные независимо моноклональные антитела с такой же антигенной специфичностью будет иметь идентичные аминокислотные последовательности.
Изобретение представляет новые участки связывания антигенов и цепи иммуноглобулина, полученные с использованием библиотек человеческих генов иммуноглобулинов. Структура, несущая антигенсвязывающий участок, обычно является тяжелой или легкой цепью антитела, или частью указанных структур, где антигенсвязывающий участок располагается на своем естественном месте, согласно приведенному выше описанию.
В настоящем изобретении предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЕВ3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, в том числе антитела, содержащие аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 (НСИВ1, НСИВ2 и НСЭВ3) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (СИВ) и аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 (ЬСЭВ1, ЕСИВ2 и ЕСИВ3) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (СИВ), показанные в табл. 1а.
Таблица 1а
15** СИВ как общий типичный элемент
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬВ3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность НСИВ2, представленную в 8Ε^ ГО ΝΟ: 192, где НСИВ2 последовательности 8Ε^ ГО ΝΟ: 192 НСИВ2 определяется формулой (I)
- 10 021512
Хаа6- • 1~Хаа? -Хааз -Н-З-Хаад-И-Υ’ ’Ν-ϋ-Υ-;
где
Хаа6 может быть Агд или Ьуз;
Хаа? может быть Туг, Ηΐ3 или Зег;
Ха а е может быть МеЬ, Агд или Туг; и
Хаа? может быть Ьуз или Агд.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность НСГОК2, показанную в 8ЕО ГО N0: 194, где НСГОК2 последовательности 8Е0 ГО N0: 194 определяется формулой (III)
Ι-Ι-0 -Хаа^-Е-З-К-И-У-И-Хаа^-У-А-Хаап-З-У-К-З, (III) где
Хаа15 может быть Ьуз, ТЬг или Не;
Хаа и может быть Азп или Азр; и Хаа!? может быть Уа1 или Ьей;
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность НСГОК2, показанную в §Е0 ГО N0: 196, где НСГОК2 из 8Е0 ГО N0: 196 определяется, как показано в формуле (V)
Χ,;δί( Τ ·ϋ-Ε-;:·ϋ-5-Υ-Τ-М-У-Хаа^-Р-В-Г-О-С, (V) где
Хаа?4 может быть РЬе или Агд; и Хаа25 может быть А1а или Зег.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность БСГОВЗ, показанную в §Е0 ГО N0: 191, где БСГОВЗ из 8Е0 ГО N0: 191 определяется, как показано в формуле (II)
Хаа1-8-У-В-Хаа2-Хаа3-Хаа4-Хаа5-Т-7, (II) где
Хаа; может быть А1а, С1п, 61у или Зег;
Хаа2 может быть С1у, С1и или Зег;
Хаа3 может быть Азр или Азп;
Хаа4 может быть С1и или Зег и Хааг может быть РЬе, А1а или ьей.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность БСГОВЗ, показанную в §Е0 ГО N0: 193, где ЬСОКЗ из 8Е0 ГО N0: 193 определяется, как показано в формуле (IV)
Хааю-З-У-О-Хаац-Р-Хаахг-Хаагз-Хаан-У, (IV) где
Хаа ю может быть (31п или Зег;
Хаац может быть ТЬг, . С1и . или Азр;
Хаа12 может быть Уа1 или Азп;
Хаагз может быть Туг или РЬе; и
Ха а 14 может быть Зег, Азп или С1п; или
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, включая антитела, содержащие аминокислотную последовательность БСГОВЗ, показанную в §Е0 ГО N0: 195, где БСЭКЗ из 8Е0 ГО N0: 195 определяется, как показано в формуле (VI)
ζ)—^2—Хааге —Ха а 19—Ха а2о—Хаа2г— Хаа22 —Ха а 2з—Т, (VI) где
Хаа^ может быть Туг, С1у или А1а;
Хаа19 может быть С1у, С1и или Азп;
Хааго может быть Зег или ТЬг;
Хааг! может быть Уа1, 11е или Ьей; хаа22 может быть Зег или Ьей; и
Хаагз может быть 11е, Зег, Рго или Туг.
В настоящем изобретении также предлагаются изолированные антитела и их фрагменты, способные реагировать с ТЬКЗ, содержащие аминокислотные последовательности 1, 2 и 3 (НСГОКЕ НСГОК2 и НСГОКЗ) определяющего комплементарность участка тяжелой цепи (СОК) и аминокислотные последова- 11 021512 тельности 1, 2 и 3 (ЬСИК!, ЬСНК2 и ЬСИКЗ) определяющего комплементарность участка легкой цепи (СИК), показанные в табл. 1а.
Антитела, чьи аминокислотные последовательности антигенсвязывающих участков не отличаются существенным образом от последовательностей, представленных в табл. 1а (ЗЕО ГО N0: 49-121 или 191196), рассматриваются как часть настоящего изобретения. Как правило, это относится к замене аминокислот на другие аминокислоты, имеющие сходный заряд, гидрофобные или стереохимические характеристики. Также возможны дополнительные замены в каркасных участках, в отличие от антигенсвязывающих участков, в случае, если они не изменяют свойств антитела. Возможны замещения, улучшающие свойства антитела, такие как стабильность или аффинность. Одно, два, три, четыре, пять или шесть замещений могут быть сделаны в антигенсвязывающем участке. Возможно замещение 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% или 30% аминокислотных остатков каркасного фрагмента при условии сохранения желаемых свойств антитела.
Консервативные модификации приведут к созданию молекул, имеющих функциональные и химические характеристики, близкие к исходной молекуле. Существенные модификации функциональных и/или химических характеристик молекул могут быть достигнуты путем тех замещений в аминокислотной последовательности, которые приводят к изменениям (1) в структуре каркаса молекулы в районе замещения, например, к плоской или спиральной конформации, (2) в заряде или гидрофобности молекулы в районе замещения или (3) в размере молекулы. Например, консервативные аминокислотные замещения могут означать замещения природных аминокислотных остатков на неприродные, которые не сопровождаются изменением полярности или с незначительными изменениями полярности в районе замещения. Более того, любой природный аминокислотный остаток в полипептиде может быть замещен аланином согласно способу, описанному как аланин-сканирующий мутагенез (МасТеппап с1 а1., Ас1а РЬу8ю1. 8сап<Т Зирр1. 643:55-67, 1998; ЗакаИ е1 а1., Αάν. Вюрйук. 35:1-24, 1998). Любое желательное аминокислотное замещение (консервативное или нет) может быть запланировано специалистом в случае необходимости. Например, аминокислотное замещение может быть использовано для того, чтобы идентифицировать важные аминокислотные остатки в последовательности или с целью увеличения/уменьшения аффинности молекул, предложенных в настоящем изобретении. Некоторые аминокислотные замещения показаны в табл. 1Ь.
В некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные замещения могут быть осуществлены путем введения в молекулу неприродных аминокислотных остатков, которое обычно происходит при химическом синтезе белков. Аминокислотные замещения могут быть осуществлены, например, с помощью ПЦР мутагенеза (патент США № 4683195). Могут быть созданы библиотеки новых вариантов с помощью хорошо известных способов, например применения случайных (ΝΝΚ) или неслучайных кодонов, таких как кодоны ΌνΚ, кодирующие 11 аминокислот (ΑС^ЕΟΚNКδΥV), а также поиска вариантов с необходимыми свойствами в уже существующих библиотеках, как показано в примере 1. В табл. 1с показаны замещения, сделанные с целью улучшения характеристик антител в трех родственных антителах-антагонистах ТЬК.3 в пределах участков ТСГОК3 и НСГОК2.
В зависимости от определения антигенсвязывающих участков аминокислотные остатки антигенсвязывающих участков антител, предложенных в настоящем изобретении, и, следовательно, аминокислотные остатки каркасных участков могут слегка отличаться для каждой тяжелой и легкой цепи.
Таблица 1Ь
Исходный остаток Примеры замещений Больше консервативных замещений
А1а (А) \/а1, Ьеи, 11е Уа1
Агд (К) Ьуз, С1п, Азп Ьуз
Азп (Ν) С1п С1п
Азр (Б) С1и С1и
Суз (С) Зег, А1а Зег
61п (0) Азп Азп
С1у (С) Рго, А1а А1а
ΗΪ3 (Н) Азп, С1п, Ьуз, Агд Агд
Не (I) Ьеи, Уа1, Мес, А1а, РЬе, НОРЛЕЙЦИН Ьеи
Ьеи (Ь) НОРЛЕЙЦИН, Не, Уа1, Мес, А1а, РЬе Не
Ьуз (К) Агд, 1, 4 Диаминомасляная кислота, С1п, Азп Агд
МеС (М) Ьеи, РЬе, 11е Ьеи
РЬе (Р) Ьеи, Уа1, 11е, А1а, Туг Ьеи
Рго (Р) А1а С1у
Зег (8) ТЬг, А1а, Суз ТЬг
ТЬг (Т) Зег Зег
Тгр (И) Туг, РЬе Туг
Туг (Υ) Тгр, РЬе, ТЬг, Зег РЬе
νβΐ (V) 11е, МеС, Ьеи, РЬе, А1а, норлейцин Ьеи
- 12 021512
В табл. 2а и 2Ь показаны остатки антигенсвязывающих участков некоторых антител, предложенных в настоящем изобретении, согласно Кабату, Чотии и ΙΜΟΤ, а также их композитные последовательности.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или фрагменты антител, способные взаимодействовать с ΤΡΚ3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, где антитела содержат аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой (УН) и легкой (УЪ) цепей, а также предлагаются вариабельные участки для каждой отдельной тяжелой и легкой цепи, как показано в табл. 3а. Р17, Р18 и Р19 относятся к вариантам антител, содержащих аминокислотную последовательность-консенсус для семейств 17, 18 и 19 соответственно (см. пример 1).
Таблица1с
- 13 021512
Хотя варианты осуществления, проиллюстрированные в примерах, содержат вариабельные участки, один для тяжелой и один для легкой цепи, специалисты поймут, что альтернативные варианты осуществления могут содержать различные вариабельные участки тяжелой или легкой цепи. Одиночный вариабельный участок может использоваться для поиска второго вариабельного участка, способного к формированию двухдоменного специфического антиген-связывающего фрагмента, способного, например, связываться с ТБК3. Такой поиск может осуществляться с помощью методов фагового отображения, например, с использованием иерархического двойного комбинаторного подхода, описанного в публикации РСТ Νο. ШО 92/01047. Согласно указанному методу индивидуальная колония, содержащая клон Н или Б цепей, используется для инфицирования всей библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (Ь или Н), а появляющийся в результате двухцепочечный специфический антигенсвязывающий домен селективно отбирается в соответствии с методами фагового отображения.
- 14 021512
Таблица 2а
ШАЪ определение СОК НСОК1 НСОК2 НСРКЗ
5Е<Э ю Последовательность 5Εζ) Ю Последовательность 5Εζ) Ю Последовательность
14 1МСТ 82 СУЗГТПУИ 86 ΙϋΡδϋδΥΤΝΥ 84 ΑΚΕΣΥΟΟΥΜΌΤΡΟδ
14 Кабат ΝΥΝνσ ΓΙΟΡ3Ο3ΥΤΝΥΑΡ5Γ0 ΕΙιΥΟΟΥΜϋΤΕϋδ
14 Чотиа 0Υ5ΓΤ Ρ5ϋ5ΥΤ ЬУОСУМОТГО
14 общий типичный элемент 111 ΟΥδΓΤΝΥΗνΟ 112 ΓΙΟΡ5Ο3ΥΤΝΥΑΡ3Γ0 84 АКЕЬУОСУМОТТОЗ
15 1МСТ 82 0Υ3ΡΤΝΥΗ 86 ΙΠΡ3Ρ5ΥΤΝΥ 84 АКЕБУОСУМОТТОЗ
15 Кабат ΝΥΗνα ΠΟΡ5ϋ3ΥΤΝΥΑΡ3Ρ0 ΕΣΥΟΟΥΜΌΤΡΟδ
15 Чотиа (3Υ5ΡΤ Ρ3Π3ΥΤ ЬУОСУМОТГО
15 общий типичный элемент 111 ΟΥδΓΤΝΥΜνα 112 ΓΙΏΡ5Π5ΥΤΝΥΑΡ3Ε0 84 АКЕЬУОСУМОТГОЗ
15-1 1МСТ 82 ΟΥ5ΡΤΝΥΜ 86 ΙΟΡ5Ώ5ΥΤΝΥ 84 ΑΚΕΣΥΟΟΥΜΟΤΓϋδ
15-1 Кабат ΝΥΝνΟ ΚΙΟΡ5Π5ΥΤΝΥΑΡ5Ρ0 ΕΣΥΟΟΥΜΟΤΓϋδ
15-1 Чотиа ΟΥ5ΓΤ Ρ3ϋ3ΥΤ ΕΥφΟΥΜΏΤΡΟ
15-1 общий типичный элемент 111 ΰΥδΕΤΝΥΗνο 114 ΚΙΡΡ5ϋ3ΥΤΝΥΑΡ3Γ0 84 АКЕЬУОСУМОТгаЗ
15-2 1МСТ 82 0Υ3ΓΤΝΥΗ 86 ΙΟΡ3Ω3ΥΤΝΥ 84 АКЕБУфСУМОТРОЗ
15-2 Кабат ΝΥΝΙΟ ΓΙϋΡ5Ο3ΥΤΝΥΑΡ5Γ0 ΕΣΥ0ΘΥΜΟΤΓϋ5
15-2 Чотиа (3Υ5ΓΤ Ρ5ϋ5ΥΤ ъуосумотго
15-2 общий типичный элемент 115 ΟΥ3ΓΤΝΥΜΙΟ 112 ΕΙΟΡ5Ο5ΥΤΝΥΑΡ5Ε0 84 АКЕЬУОСУМОТГОЗ
15-3 1МСТ 82 СУЗГТЫУИ 86 ΙΟΡ5Ε5ΥΤΝΥ 84 ΑΚΕΙ.Υζ)ΟΥΜΟΤΓΟ5
15-3 Кабат ΝΥΗΙ5 86 ΕΙΟΡ3Ρ3ΥΤΝΥΑΡ3Ε0 84 ЕЬУОСУМОТГОЗ
15-3 Чотиа сузрт Ρ5ϋ5ΥΤ ЬУОСУМЭТГО
15-3 общий типичный элемент 116 6Υ5ΓΤΝΥΗΙ5 112 ΕΙ0Ρ505ΥΤΝΥΑΡ3Ε0 84 АКЕЬУОСУМОТРРЗ
15-4 1МСТ 82 0Υ5ΓΤΝΥΝ 86 ΙΟΡ5Γ5ΥΤΝΥ 84 АКЕЬУОСУМОТРОЗ
15-4 Кабат ΝΥΜνΟ ΓΙΟΡ5Ώ5ΥΤΝΥ3Ρ5Ρΰ ЕЪУОСУМОТГОЗ
15-4 Чотиа СУ5РТ Ρ5Ο5ΥΤ ΣΥΟΟΥΜϋΤΕϋ
15-4 общий типичный элемент 111 ΟΥδΓΤΝΥΜνΟ 117 ΕΙΟΡ5Ο5ΥΤΝΥ3Ρ5Ε0 84 ΑΚΕΣΥζΧΙΥΜϋΤΕΏδ
15-5 1МСТ 82 6Υ5ΕΤΝΥΝ 86 ΐϋΡδϋδΥΤΝΥ 84 АКЕЬУОСУМОТгаЗ
15-5 Кабат ΝΥΜΙ5 ΚΙΟΡ3Ο5ΥΤΝΥ5Ρ5Γ<2 ЕЪУ<2СУМОТГО5
15-5 Чотиа СУ5ЕТ Ρ5ϋ5ΥΤ ЬУОСУМОТРО
15-5 общий типичный элемент 116 ΟΥ5ΓΤΝΥΜΙ5 118 ΚΙΌΡ5Ο5ΥΤΝΥ5Ρ5Γ0 84 ΑΚΕίΥΟΟΥΜϋΤΓΏδ
15-6 1МСТ 82 0Υ3ΕΤΝΥΝ 86 ΙΠΡ5Ρ5ΥΤΝΥ АКфЬУОСУМОТТОЗ
15-6 Кабат ΝΥΜΙ5 γιορ503υτνυαρ5ΡΟ φΕΥΟΟΥΜϋΤΓΟδ
15-6 Чотиа 0Υ5ΕΤ Ρ5ϋ5ΥΤ ΕΥΟΟΥΜΏΤΡϋ
15-6 общий типичный элемент 116 ΟΥ3ΕΤΝΥΜΙ5 112 Ε1ΟΡ5ϋ5ΥΤΝΥΑΡ5Ε0 119 ΑΚΟΙ,ΥΟΟΥΜϋΊΤϋδ
15-7 ΙΜ6Τ 82 ΟΥδΕΤΝΥΜ 86 ΙΟΡ5ϋ5ΥΤΝΥ 84 АКЕЬУОбУМОТРПЗ
15-7 Кабат ΝΥΜν6 ΠϋΡ5Ο5ΥΤΝΥΑΡ3Γ<3 ΕΕΥΟΟΥΜΏΤΓΟδ
15-7 Чотиа СУ5ЕТ Ρ305ΥΤ ίΥΩΟΥΜβΤΓΟ
15-7 общий типичный элемент 111 6Υ5ΓΤΝΥΗν<3 112 ΓΙΟΡ5Ο5ΥΤΝΥΑΡ5Γζ) 84 АКЕЬУОСУМПТГРЗ
15-8 1МСТ 82 αΥδΓΤΝΥΜ 86 ΐϋΡδϋδΥΤΝΥ 84 ΑΚΕίΥ00ΥΜΌΤΡϋ5
15-8 Кабат ΝΥΝνΟ ριορ5Ο5υτνυαρ5Γ0 ЕЬУОСУМРТГОЗ
15-8 Чотиа СУЗЕТ Ρ5ϋ3ΥΤ ΣΥΟΟΥΜΟΤΓΟ
15-8 общий типичный элемент 111 ΟΥδΓΤΝΥΜνΟ 112 ΓΙΏΡ5ϋ5ΥΤΝΥΑΡ5Ε0 84 АКЕЬУОСУМОТРОЗ
15-9 1МСТ 82 ΟΥ5ΕΤΝΥΜ 86 ΐϋΡδϋδΥΤΝΥ 119 АКОЪУОСУМОТГГЗ
15-9 Кабат ΝΥΝΙ3 ΚΙΌΡ5Ο5ΥΤΝΥ5Ρ5Εζ)Ο <2ίΥ<2ΟΥΜΏΤΓΟ5
15-9 Чотиа СУЗЕТ Ρ5ϋ5ΥΤ ΕΥ06ΥΜϋΊΤϋ
15-9 общий типичный элемент 116 ΟΥ3ΕΤΝΥΜΙ5 118 κΐΓΡ505ΥΤΝΥ5Ρ5Ρ0(3 119 ΑΚςΣΥΟΟΥΜΟΤΓΟδ
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются изолированные антитела или фрагменты антител, способные взаимодействовать с ТЬК.3, содержащие вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, имеющие по меньшей мере 95%-ное сходство с аминокислотной последовательностью определенного вариабельного участка, как показано в табл. 3а.
Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированных антителах, имеющих определенную аминокислотную последовательность тяжелой и легкой цепей, как показано в табл. 3Ь.
Следующий аспект данного изобретения заключается в изолированных полинуклеотидах, кодирующих любое из антител, представленных в настоящем изобретении и его дополнениях. Некоторые полинуклеотиды описываются в настоящем изобретении, однако, другие полинуклеотиды, которые, принимая во внимание вырожденность генетического кода или предпочтительность использования кодонов в данной экспрессионной системе, кодируют предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты, также рассматрива- 15 021512 ются как часть настоящего изобретения.
Таблица 2Ъ
•пАЬ определение СОР ЬСОВ1 ЬСОЕ2 ЬСОРЗ
3Εζ> Ю N0: Последовательность ЗЕф Ιϋ N0: Последовательность 5Е0 Ю ΝΟ: Последовательность
14 ΙΜΟΤ 79 <251С1У 80 ААЗ 85 ООАЕТЧЗРТ
14 Кабат НА5<251СЪУЪА ААЗЗЬОЗ ООАЕТЧЗРТ
14 Чотиа 5051СЬУ АА5 АЕТЧЗР
14 общий типичный элемент 109 КАЗОЗКЗЬУЬА 110 ААЗЗЬСЗ 85 <2<2АЕТЧ5РТ
15 1МСТ 79 051СЬУ 80 ААЗ 87 ОООМТЬЗУТ
15 Кабат КА5<251С1/УЬА ΑΑ55Ι/25 ΟΟΟΝΤί,δΥΤ
15 Чотиа ЗОЗКЗЬУ ААЗ ΰΝΤΙ5Υ
15 общий типичный элемент 109 КАЗОЗКЗЬУЪА 110 АА55103 113 ζ)<3<3ΝΤΠ3ΥΤ
15-1 1МСТ 79 ОЗКЗЬУ 80 ААЗ 87 ООСИТЬЗУТ
15-1 Кабат КАЗОЗКЗЬУЬА ААЗЗЬОЗ ООСЫТЪЗУТ
15-1 Чотиа 50516ЬУ ААЗ СЫТЬЗУ
15-1 общий типичный элемент 109 ВА5<251СЪУЬА 110 АА55ЫЭЗ 113 00<3Ν·Π5ΥΤ
15-2 1МСТ 79 ОЗЮЬУ 80 ААЗ 87 ООСЛТЬЗУТ
15-2 Кабат КАЗОЗЮЬУЬА АА55Ы25 ООСЫТЬЗУТ
15-2 Чотиа ЗОЗКЗЬУ ААЗ СЦТЪЗУ
15-2 общий типичный элемент 109 КАЗОЗЮЬУЬА 110 АА35Ы25 113 ООСЫТЬЗУТ
15-3 1МСТ 79 О31СЬУ 80 ААЗ 87 ООСЫТЬЗУТ
15-3 Кабат ΚΑ5Ώ5ΙΟΕΥ1Α ААЗЗЬОЗ 000ΝΤ!3ΥΤ
15-3 Чотиа ЗОЗЮЬУ ААЗ ецтьзу
15-3 общий типичный элемент 109 РАЗОЗЮЬУЬА 110 ААЗЗЬОЗ 113 0<20ΝΤΠ5ΥΤ
15-4 ΙΜ6Τ 79 О51СЬУ 80 ААЗ 87 ООСЫТЬЗУТ
15-4 Кабат КАЗОЗКЗЬУЬА ААЗЗЬйЗ ООСЫТЪЗУТ
15-4 Чотиа 5О51С1/У ААЗ СЦТЬЗУ
15-4 общий типичный элемент 109 РАЗСЗТСЬУЪА 110 АА35Ю5 113 000ΝΤΠ3ΥΤ
15-5 1МСТ 79 Ο5ΙΟ1Υ 80 ААЗ 87 ΟΟΟΝΤι,εγτ
15-5 Кабат КАЗОЗЮЬУЬА ААЗЗЬфЗ ΟΟΟΝΤ!5ΥΤ
15-5 Чотиа ЗОЗЮЬУ ААЗ СЯТЬЗУ
15-5 общий типичный элемент 109 РА5О51СЬУЬА 110 ААЗЗЬОЗ 113 ςςΘΝΤΠ3ΥΤ
15-6 1МСТ 79 ОЗКЗЬУ 80 ААЗ 87 ΟΟΟΝΤΣ3ΥΤ
15-6 Кабат КА5<2516ЬУЬА ААЗЗЬОЗ ςςΰΝτπεγτ
15-6 Чотиа 5<251СЬУ ААЗ СЫТЬЗУ
15-6 общий типичный элемент 109 КА5О51СЬУЬА 110 АА55Ы25 113 <2<2ΟΝΤΙ3ΥΤ
15-7 1МСТ Ο5Ι33Υ 80 ААЗ 87 СССЫТЬЗУТ
15-7 Кабат ΚΑ503Ι85ΥΣΑ АА85Ы25 ООСИТЬЗУТ
15-7 Чотиа 5Ω5Ι33Υ ААЗ ΟΝΤΕ3Υ
15-7 общий типичный элемент 120 КА205153УЬА 110 ААЗЗЬОЗ 113 ооеытъзут
15-8 1МСТ 79 ОЗКЗЬУ 80 ААЗ 87 ФОСЫТЬЗУТ
15-8 Сабат КАЗОЗКЗЬУЬЫ ААЗЗЬОЗ ОООЫТЬЗУТ
15-8 Чотиа 3031СБУ ААЗ СЖТЬЗУ
15-8 общий типичный элемент 121 КАЗОЗТСЬУЪЦ 110 ААЗЗЬОЗ 113 ООСЫТЬЗУТ
15-9 1МСТ 79 <251С1У 80 ААЗ 87 ООСЫТЬЗУТ
15-9 Кабат КАЗОЗЮЪУЪА ААЗЗЬфЗ ООСЫТЬЗУТ
15-9 Чотиа 5<251СЬУ ААЗ СЫТЬЗУ
15-9 общий типичный элемент 109 КАЗОЗЮЬУЬА 110 АА55Ь<25 113 СОСЫТЬЗУТ
Таблица 3 а
№ лгАЬ: 5Е0 Ю N0: № шАЬ: 5Ε0 Ю ΝΟ:
НУ ЬУ Η7 Σν
16 6 5 15-1 124 41
17 8 7 15-2 125 41
18 10 9 15-3 126 41
19 12 11 15-4 127 41
1 14 13 15-5 128 41
2 16 15 15-6 129 41
3 18 17 15-7 42 122
4 20 19 15-8 42 123
5 22 21 15-9 159 41
6 24 23 15-10 129 225
7 26 25 Г17 198 197
8 28 27 Г18 200 199
9 30 29 Е19 202 201
10 32 31 С1811 164 163
11 34 33 9Ώνΰ/Ο3ν 212 209
12 36 35 10ΰν<2/Ώ5ν 213 210
13 38 37 12ζ)νζ)/ζ)3ν 214 211
14 40 39 14Ενζ) 215 39
15 42 41 15Εν<2 216 41
Некоторыми антителами-антагонистами могут быть антитела изотипов 1дО, ΙβΌ. 1дО, 1дА или 1дМ. Кроме того, эти антитела-антагонисты могут модифицироваться на постранскрипционном уровне за счет таких процессов, как гликозилирование, изомеризация, дегликозилирование или ненатуральная ковалентная модификация, такая как добавление активной группы полиэтиленгликоля (РЕО) или липидизация. Такие модификации могут происходить ίη νίνο или ίη νίίτο. Например, предлагаемые в настоящем изобретении антитела могут быть конъюгированы с полиэтиленгликолем с целью усовершенствования их фармакокинетических характеристик. Конъюгация может быть выполнена с помощью известных специалистам способов. Показано, что конъюгация терапевтических антител с ПЭГ усиливает фармакодинамику, не влияя на функцию (ЭссксП с! а1., Ιηΐ. ί. Сапсег 87:382-390, 2000; Κηίβΐιΐ с! а1., Р1а1с1с18 15:409418, 2004; Ьсопд с! а1., СуФкшс 16:106-119, 2001; Уап§ с! а1., Рго1сш Епд. 16:761-770, 2003).
Таблица 3Ь
№ тАЬ: Тяжелая цепь Легкая цепь
8Ε0 Ю ΝΟ: 5Ε0 Ιϋ ΝΟ:
14 102 155
15 102 156
15-1 130 156
15-2 131 156
15-3 132 156
15-4 133 156
15-5 134 156
15-6 135 156
15-7 102 157
15-8 102 158
15-9 160 156
15-10 135 227
Ε17 204 203
Γ18 206 205
Γ19 208 207
14ЕУ0 220 155
15Ενθ 220 156
5429 166 165
С1811 168 167
Фармакокинетические свойства антител, описанных в настоящем изобретении, также могут быть усилены за счет модификаций Рс с применением способов, хорошо известных специалистам. Например, тяжелая цепь иммуноглобулина изотипа 1дО4 в шарнирном участке содержит мотив Су8-Рго-8сг-Су8 (СР8С), способный формировать дисульфидные мостики между тяжелыми цепями или внутри тяжелой цепи, например, два Су8-остатка в мотиве СР8С могут образовывать дисульфидный мостик с двумя дру- 17 021512 гими остатками в другой тяжелой цепи (между), или два остатка Су8 внутри данного СР8С мотива могут образовывать дисульфидный мостик друг с другом (внутри). Считается, что ίη νίνο ферменты, осуществляющие изомеризацию, способны конвертировать дисульфидные мостики между тяжелыми цепями во внутрицепочечные мостики и Осе уегка (Ла1Ьег8е апб ЗсЬиигтап, 1ттипо1оду 105:9-19, 2002). Соответственно, поскольку пара тяжелая:легкая цепи (Н:Ь) в молекулах иммуноглобулина Ι§04 с внутрицепочечными мостиками в шарнирном участке тяжелой цепи не связаны друг с другом ковалентной связью, она может диссоциировать на Н:Ь мономеры, а вслед за этим реассоциировать, формируя биспецифичную, гетеродимерную молекулу иммуноглобулина Ι§04. В биспецифичном антителе 1§О два фрагмента РаЬ молекулы различаются по эпитопам, с которыми они связываются. Замещение аминокислотного остатка §ет в мотиве СР8С шарнирного участка Ι§04 на остаток Рго приводит к 1§О1-подобному поведению, например, молекулы формируют стабильные дисульфидные мостики между тяжелыми цепями и, следовательно, не могут участвовать в обмене Н:Ь с другой молекулой иммуноглобулина Ι§04. В одном из вариантов осуществления описанные в данном изобретении антитела составляют Рс домен иммуноглобулина Ι§04 с мутацией δ в Р в мотиве СРδС. Мотив СРδС, как правило, расположен у остатка 228 зрелой тяжелой цепи, но расположение этого мотива может изменяться в зависимости от длины СОК.
Кроме того, в антителах, описанных в настоящем изобретении, участки, влияющие на связывание с рецепторами Рс, отличными от рецептора РсКп, могут быть удалены. Например, в антителах, описанных в настоящем изобретении, участки, связывающие рецептор Рс, вовлеченный в активность АЭСС, могут быть удалены. Например, мутация Ьеи234/Ьеи235 в шарнирном участке Ι§01 в Ь234Л/Ь235Л или мутация РЬе235/Ьеи236 в шарнирном участке Ι§04 в Р235Л/Ь236Л минимизирует связывание РсК и уменьшает способность иммуноглобулина опосредовать комплементарно зависимую цитотоксичность и АЭСС. В одном варианте осуществления настоящего изобретения описанные антитела содержат Рс домен иммуноглобулина Ι§04 с мутацией Р235Л/Ь236Л. Расположение этих аминокислотных остатков в зрелых тяжелых цепях указано выше, но может изменяться в зависимости от длины СОК. Некоторые антитела с мутациями Р235Л/Ь236Л являются антителами, чьи тяжелые цепи кодируются последовательностью, показанной в δΕρ ΙΌ N0: 218, 219 или 220.
Полностью человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные и аффинно-зрелые молекулы антител или фрагменты антител являются частью настоящего изобретения, также как гибридные и химерные белки. Аффинность антитела к антигену может быть улучшена с помощью продуманной конструкции или случайного созревания аффинности с использованием хорошо известных способов случайного или направленного мутагенеза или комбинаторных фаговых библиотек. Например, возможно замещение остатков зоны верньера, располагающихся преимущественно в каркасной области, или остатков, определяющих аффинность, ЛЭК. для регуляции аффинности антитела (патент № 6639055; публикации РСТ N0. >0 10/045340).
Частью настоящего изобретения являются полностью человеческие, адаптированные к человеку, гуманизированные, аффинно-зрелые молекулы антител или фрагментов антител, модифицированные с целью улучшения стабильности, селективности, перекрестной реактивности, аффинности, иммуногенности или достижения других желательных биологических характеристик. Стабильность антитела определяется целым рядом факторов, включая (1) пространственную укладку индивидуальных доменов, влияющую на естественную стабильность, (2) поверхностное взаимодействие белков, определяющее спаривание НС и ЬС, (3) глубину расположения полярных и заряженных аминокислотных остатков, (4) сеть водородных мостиков между полярными и заряженными аминокислотными остатками; а также (5) поверхностный заряд и распределение полярных аминокислотных остатков наряду с другими внутри- и межмолекулярными взаимодействиями (>огп е1 а1., ί. Мо1. Βίο1., 305:989-1010, 2001). Аминокислотные остатки, способные дестабилизировать структуру, могут быть идентифицированы на основании кристаллической структуры антитела или путем молекулярного моделирования, а эффект определенных аминокислотных остатков на стабильность антитела может быть проверен путем создания мутаций и оценки их влияния. Один из способов увеличить стабильность антитела заключается в увеличении срединной точки термоперехода (Тт), измеряемой путем дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Как правило, Тт белка имеет положительную корреляцию с его стабильностью и отрицательную корреляцию с подверженностью нарушениям третичной структуры и денатурации в растворах, а также деградации, которая также зависит от склонности белка к нарушению третичной структуры (Кетте1е е1 а1., ВюрЬагт., 13:36-46, 2000). Ряд исследований свидетельствует о корреляции между степенью физической стабильности, измеренной как термостабильность путем ДКС, и измерениями, проведенными с помощью других способов (Оир1а е1 а1., ΑΑРδ РЬагт. δ^. 5Е8, 2003; 2Ьап§ е1 а1., ί РЬагт. δ^. 93:3076-3089, 2004; Маа е1 а1., 1пР I РЬатт., 140:155-168, 1996; Веби-Аббо е1 а1., РЬатт. Ке8., 21:1353-1361, 2004; Кетте1е е1 а1., РЬагт. Ке8., 15:200-208, 1997). Результаты исследований состава позволяют предположить, что Тт РаЬ-фрагмента влияет на долговременную физическую стабильность соответствующего тАЬ. Различие аминокислот каркасного фрагмента или антигенсвязывающих участков может значительно влиять на термическую стабильность домена РаЬ (Уакш е1 а1., ΡΕΒδ ЬеЬ. 353: 143-146, 1994).
Предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты могут связывать ТЬК3 с Κι, меньшей либо равной 10-, 10- , 10-, 10- , 10- или 10- М. Аффинность данной молекулы к ТЬК3, например,
- 18 021512 такой как антитело, может быть определена экспериментально с помощью любого подходящего способа. Такие способы могут включать использование аппаратуры В1асоге или К1пЕхА, набора реагентов для ИФА или способов конкурентно-связывающего анализа, хорошо известных специалистам.
Антитела-антагонисты, с необходимой аффинностью связывающиеся с данным гомологом ТЬК3, могут быть выбраны в библиотеках вариантов или фрагментов с помощью способов, основанных на созревании аффинности антитела. Антитела-антагонисты могут быть идентифицированы с помощью соответствующих способов на основе их способности ингибировать биологическую активность ТЬК3. Такие способы могут включать тестовую систему с геном-репортером или измерение с помощью уже известных способов производства цитокинов.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в векторе, содержащем по меньшей мере один предложенный в данном изобретении полинуклеотид. Такие векторы могут быть плазмидными, вирусными, бакуловирусными экспрессионными векторами, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, пригодными для интродукции предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов в данный организм или в данное генетическое окружение.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клетках-хозяевах, имеющих любой из предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов, кодирующих полипептид, включающий в свой состав вариабельный участок тяжелой цепи иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в 8Е0 ΙΌ ΝΘ: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 или 216, или вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО ΝΘ: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210, 211 или 225.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клетках-хозяевах, имеющих любой из предложенных в настоящем изобретении полинуклеотидов, кодирующих полипептид, включающий в свой состав тяжелую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО ΝΘ: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 или 168, или легкую цепь иммуноглобулина с аминокислотной последовательностью, представленной в 8ЕО ГО ΝΘ: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 167 или 227. Такими клетками-хозяевами могут быть эукариотические, бактериальные, растительные клетки или клетки архей. Как правило, используются эукариотические клетки млекопитающих, насекомых, птиц или другие клетки животного происхождения. Эукариотические клетки млекопитающих включают бессмертные клеточные линии, такие как гибридомы или клеточные линии миеломы, например, 8Р2/0 (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Манассас, УА, СКЬ-1581), Ν80 (Европейская коллекция клеточных культур (ЕСАСС), Солсбери, Уилтшир, Великобритания, ЕСАСС № 85110503), ΡΘ (АТСС СКЬ-1646) и Ад653 (АТСС СКЬ-1580) - мышиные клеточные линии. Обычно используется линия клеток миеломы человека И266 (АТТС СКЕ-ТГВ-196). Другие полезные клеточные линии включают линии, полученные из яичников китайского хомячка (СНО), например, линии ί'.ΉΘ-Ι<18ν (Ъоп/а Вю1од1ек, ^а1кегкуШе, МО), ΟΗΘ-Κ1 (АТСС СКЬ-61) или ΌΟ44.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в способе получения антител, способных реагировать с ТЬК3, включающем культивирование предложенных в настоящем изобретении клеток-хозяев, и отборе антител, производимых клетками-хозяевами. Способы создания и очистки антител хорошо известны специалистам в данной области.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения заключается в клеточной линии гибридомы, производящей предложенные в настоящем изобретении антитела.
Еще один вариант осуществления изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками К416, К418, Ь440, Ν441, Е442, Υ465, Ν466, К467, Υ468, К488, К489, А491, К493, Ν515, Ν516, Ν517, Н539, Ν541, 8571, Ь595 и К619, идент. № последовательности: 2с, толл-подобного рецептора 3 (ТЬК3).
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу или его фрагменту, при этом антитело связывается с аминокислотными остатками 8115, Ό116, К117, А120, К139, Ν140, Ν141, У144, К145, Т166, Ц167, У168, 8188, Е189, Ό192, А195 и А219, 8ЕО ГО ΝΘ: 2, толлподобного рецептора 3 (ТЬК3).
Несколько хорошо известных способов могут быть использованы для определения эпитопа антител, предложенных в настоящем изобретении. Например, в случае, когда известна структура каждого из компонентов, может быть использован анализ ίη кШсо белок-белковой стыковки с целью идентификации способных к взаимодействию участков. Может быть проведено избирательное замещение водорода дейтерием в антигене и антителе с целью определения участков антигена, способных связываться с антителом. Сегментный и точечный мутагенез, модифицирующие антиген, могут быть использованы для определения местоположения необходимых для связывания антитела аминокислот. Для таких больших белков, как ТЬК3, картирование путем точечного мутагенеза может быть облегчено предварительным определением участка связывания с помощью компьютерного анализа соединения белков, сегментного мутагенеза или избирательного замещения водорода дейтерием. В случае, когда известна структура каждого из компонентов, может быть использован анализ белок-белковой стыковки ίη кШсо с целью идентифика- 19 021512 ции способных к взаимодействию участков. Со-кристаллическая структура комплекса антиген-антитело может использоваться для идентификации остатков, участвующих в образовании эпитопа и паратопа.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с ТЬР3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в §Еф ΙΌ ΝΟ: 2, через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа \33, Р50, Ό52, Ό54, Υ56, N58, Р61, Е95, Υ97, Υ100 и О100Ь и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа ф27, Υ32, N92, Т93, Ь94 и §95. Остатки Чотиа паратопа тяжелой цепи и паратопа легкой цепи соответствуют остаткам тяжелой цепи \33, Р50, Ό52, Ό55, Υ57, N59, Р62, Е99, Υ101, Υ104 и Ό106 §Еф ГО ΝΟ: 216 и остаткам легкой цепи ф27, Υ32, N92, Т93, Ь94 и §95 §Еф ГО ΝΟ: 41.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к изолированному антителу, имеющему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, или его фрагменту, при этом антитело связывается с ТЬР3, имеющим аминокислотную последовательность, показанную в §Еф ГО NΟ: 2, через вариабельную область тяжелой цепи с остатками Чотиа №1а, ф52, Р52Ь, §53, К54, Υ56, Υ97, Р98, Р99 и Υ100 и вариабельную область легкой цепи с остатками Чотиа 029, §30, Υ31, Υ32, Е50, Ό51, Υ91, Ό92 и Ό93. Остатки Чотиа паратопа тяжелой и легкой цепей соответствуют остаткам тяжелой цепи N32, ф54, Р56, §57, К58, Υ60, Υ104, Р105, Р106 и Υ107 §Еф ГО NΟ: 214 и остаткам легкой цепи 028, §29, Υ30, Υ31, Е49, Ό50, Υ90, Ό91 и Ό92, §Еф ГО 211.
Изолированные антитела, имеющие определенные остатки паратопа, связывающие ТЬР3, могут быть получены, например, встраиванием остатков паратопа в подходящий каркасный белок, сборкой искусственных каркасных белков в цельные антитела, экспрессией полученных антител и исследованием антител на способность к связыванию ТЬР3 или влияние на биологическую активность ТЬР3. В качестве примера каркасных белков можно привести аминокислотные последовательности вариабельных областей человеческих антител, кодируемые человеческими генами зародышевой линии. Выбор каркасного белка может основываться, например, на общей гомологии последовательности, % идентичности между остатками паратопа или идентичности канонической структуры каркасного белка и примерного антитела, например, тАЬ 15ЕУ0 или тАЬ 120У0/0§У. Человеческие гены зародышевой линии описаны (см., например, работу ТотДпкоп е1 а1., ί. Μοί. ΒίοΙ 227:776-798, и в международных базах данных 1тМипоОепеТюк (1М0Т) (1ι11ρ_://_\γ\γ\γ_ίιι·^1_ο^)). Также можно использовать консенсунсные последовательности человеческих каркасных областей, как описано в патенте № 6300064. Выбор подходящего каркасного белка может производиться, например, в соответствии с методами, описанными в публикации РСТ №. \\'Ο 10/045340.
Примерами человеческих генов зародышевой линии, которые можно использовать для получения каркасных белков, в которые встраиваются остатки паратопа, являются гены, кодируемые Ук1, УХ3, УН5, УН6, ίκ, ίλ и ίΐι. ί-области зародышевой линии используются полностью или частично для выбора последовательностей РР4. Например, остатки паратопа легкой цепи тАЬ 15ЕУф могут быть встроены в каркасный участок Ук1, кодируемый 10КУ1-39*01, непосредственно соединенный с ί-областью, кодируемой 10КП. Также могут использоваться последовательности, кодируемые другими генами Ук1, и последовательности РР4 других генов ίκ могут замещать 10КП. Остатки паратопа тяжелой цепи тАЬ 15ЕУ0 могут встраиваться в каркасный участок УН5, кодируемый 10НУ5-51*01, и за ними может следовать приблизительно 11-13 остатков, например 12 остатков, составляющих НСЭР3, и последовательность РР4, кодируемая Ι0ΗΠ. 11-13 Остатков могут располагаться между РР3-областью (САР) и началом РР4 области (\0ф в большинстве ίΗ-областей) и включать 4 определенных остатка паратопа из тАЬ 15ЕУ0 УН. Также могут использоваться последовательности, кодируемые другими генами УН5, и последовательности других генов ίΗ могут замещать Ι0ίΗ1. В другом примере остатки паратопа легкой цепи тАЬ 12фУ0/0§У могут быть встроены в каркасный участок Уλ3, кодируемый ЮЬУ3-1*01, непосредственно соединенный с ί-областью, кодируемой ЮГО2. Также можно использовать последовательности, кодируемые иными генами νλ3 и ίλ. Длина ЬСОР3 поддерживается на уровне приблизительно 911 остатков, например 10 остатков. Эти приблизительно 9-11 остатков располагаются между концом области РР3 (УУС в большинстве У лямбда каркасных белков) и началом области РР4 (Р00 в большинстве областей ГО) и включают 3 определенных остатка паратопа из тАЬ 12фУ0/0§У. Остатки паратопа тяжелой цепи тАЬ 12фУ0/0§У могут встраиваться в каркасный участок УН6, кодируемый I0ΗУ61*01, и за ними может следовать приблизительно 9-11 остатков, например 10 остатков, составляющих ΗС^Р3, и последовательность РР4, кодируемая Ι0ίΗ1. Приблизительно 9-11 остатков могут располагаться между РР3-областью (САР) и началом РР4 области (\0ф в большинстве ίΗ-областей) и включать 4 определенных остатка паратопа из тАЬ 12фУ0/0§У УН. Последовательности РР4 других генов ίΗ могут замещать Ι0ΗΠ. Связывание с ТЬР3 и биологическую активность полученного антитела можно оценить стандартными методами. Ориентация вариабельных областей легких и тяжелых цепей тАЬ 15ЕУф и тАЬ 12фУ0/0§У с генами Ук1, УН5, Ук3, УН6, ίκ, ίλ или ίΗ показана на фиг. 32-35. Искусственные антитела с встроенным паратопом могут быть далее модифицированы путем замены остатков зоны верньера или остатков, определяющих аффинность, для улучшения свойств антитела, например,
- 20 021512 аффинности, как описано выше. До тех пор пока антитело с встроенным паратопом сохраняет способность к связыванию ТЬК3, аминокислотная последовательность каркасного участка антитела с встроенным паратопом может быть на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательностям каркасной области тАЪ 15ЕУО или 12ОУр/р§У.
Последовательности антиген-связывающих участков могут встраиваться в дополнение к остаткам паратопов с использованием стандартных методов. Например, возможна встройка полной последовательности НСГОК3 или ЬСОК3.
Другой аспект настоящего изобретения относится к изолированным антителам или их фрагментам, способным реагировать с ТЬК3, которые конкурируют за связывание с ТЬК3 с моноклональными антителами, причем эти моноклональные антитела состоят из аминокислотных последовательностей участков 1, 2 и 3, определяющих комплементарность (сотр1етейагИу йеЮгтийнд гедюик, СОК) определенных тяжелых цепей, аминокислотных последовательностей СОК 1, 2 и 3 определенных легких цепей, а также из аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных тяжелых цепей (УН) или аминокислотных последовательностей вариабельных участков определенных легких цепей (УЪ) Как правило, моноклональные антитела, представленные в настоящем изобретении, являются изолированными антителами, содержащими вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕО ГО N0: 216, и аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, представленную в §Е0 ГО N0: 41, а также антитела, содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, представленную в §Е0 ГО N0: 214, и аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, представленную в §Е0 ГО N0: 211.
Анализ конкуренции за связывание с ТЬК3 может быть проведен ίη νίίτο с помощью уже известных способов. Например, оценка связывания Μ§Ό §и1£о-Тад™ NН§-эфир-меченого антитела с ТЬК3 в присутствии немеченого антитела может быть проведена с помощью ИФА. Как правило, в настоящем изобретении используются антитела тАЪ 12, тАЪ 15 и тАЪ с1811 (см. табл. 3а). Ранее известные антитела с1068 против ТЬК3 и их производные (описанные в публикации РСТ N0. \У0 06/060513А2), ТЬК3.7 (еВюкаепсек, кат. № 14-9039) и 1тдепех 1МО-315А (1тдепех 1МО-315А; против аминокислотной последовательности 55-70, У^N^ТНN^^КК^РААN, человеческого ТЬК3) не конкурируют за связывание с ТЬК3 с тАЪ 12, 15 или с тАЪ с1811, как показано в примере 5.
Следующий аспект настоящего изобретения заключается в изолированном антителе, способном реагировать с ТЬК3, которое обладает по меньшей мере одним из следующих свойств:
a) связывается с человеческим ТЬК3 с Кй <10 нМ;
b) уменьшает биологическую активность ТЬК3 в анализе ίη νίίτο с использованием гена-репортера Ж-кВ и поли(1:С) на >50%, при концентрации 1 мкг/мл;
c) на >60% ингибирует продукцию ГО-6 либо СХСЬ5/1Р-10 в клетках ВЕА§-2В, стимулированных воздействием <100 нг/мл поли(1:С), при концентрации 10 мкг/мл;
ά) на >50% ингибирует продукцию ГО-6 либо СХСЬ5/1Р-10 в клетках ВЕА§-2В, стимулированных воздействием <100 нг/мл поли(1:С), при концентрации 0,4 мкг/мл;
е) на >50% ингибирует продукцию ГО-6 в клетках NНВЕ, стимулированных воздействием 62,5 нг/мл поли(1:С), при концентрации 5 мкг/мл;
ί) на >50% ингибирует продукцию ГО-6 в клетках NНВЕ, стимулированных воздействием 62,5 нг/мл поли(1:С) при концентрации 1 мкг/мл;
д) на >20% ингибирует поли(1:С)-индуцированную продукцию 1Р№у, ГО-6 или ГО-12 в клетках РВМС при концентрации 1 мкг/мл;
Т) ингибирует биологическую активность ТЬК3 яванского макака в анализе ίη νίίτο, с использованием гена-репортера Ж-кВ при 1С50 <10 мкг/мл; или
ί) ингибирует биологическую активность ТЬК3 яванского макака в экспериментальной системе ίη νίίτο, с использованием гена-репортера 1§КЕ при 1С50 <5 мкг/мл.
Способы лечения
Предложенные в настоящем изобретении антагонисты ТЬК3, например антитела-антагонисты ТЬК3, могут использоваться для воздействия на иммунную систему. Опуская теоретическое обоснование, авторы утверждают, что предложенные в настоящем изобретении антагонисты могут модулировать иммунную систему, предотвращая или уменьшая связывание лиганда с ТЬК3, димеризацию ТЬК3, интернационализацию ТЬК3 или перенос ТЬК3. Предложенные в настоящем изобретении способы могут быть использованы для лечения любого животного. Например, это могут быть млекопитающие, в том числе человек, грызуны, собаки, кошки и сельскохозяйственные животные. Например, представленные в настоящем изобретении антитела могут найти применение в качестве антагонистов активности ТЬК3 при лечении воспаления, воспалительных заболеваний и метаболических расстройств, а также в изготовлении медикаментозных препаратов для лечения указанных заболеваний, причем настоящее изобретение также предлагает предназначенную для введения дозу.
Вообще, воспалительные, инфекционные или иммуноопосредованные воспалительные состояния,
- 21 021512 которые могут быть предотвращены или вылечены введением предложенных в настоящем изобретении антител-антагонистов ТЬКЗ, включают заболевания, опосредованные действием цитокинов или хемокинов, а также заболевания, которые целиком или частично возникают в результате активации ТЬКЗ или сигнального пути ТЬКЗ. Примерами таких воспалительных состояний являются связанные с сепсисом состояния, воспалительные заболевания пищеварительного тракта, аутоиммунные, воспалительные и инфекционные заболевания. Также считается, что рак, сердечно-сосудистые заболевания, нарушения метаболизма, невралгические и фиброзные заболевания могут быть предотвращены или вылечены введением предложенных в настоящем изобретении антител-антагонистов ТЬКЗ. Воспаление может затрагивать одну ткань или быть системным. Как правило, поражаются ткани дыхательных путей, легкие, желудочно-кишечный тракт, тонкий и толстый кишечник, толстая кишка, прямая кишка, сердечнососудистая система, ткань сердца, кровеносные сосуды, суставы, мозг, синовиальные ткани, хрящевая ткань, эпителий, эндотелий, печень и жировая ткань. Типичными системными воспалительными состояниями являются цитокиновый шторм или гиперцитокинемия, синдром системной воспалительной реакции (§1К§), реакция трансплантат против хозяина (ΟνΗΌ), острый респираторный дистресс-синдром (АКЭ§), тяжелый острый респираторный дистресс-синдром (§ЛК§), тяжелые вирусные инфекции, грипп, пневмония, шок или сепсис.
Воспаление является защитной реакцией организма на атаку проникающего агента. Воспаление состоит из последовательности событий, в которой участвуют многие клеточные или гуморальные медиаторы. С другой стороны, подавление воспалительных реакций может приводить к ослаблению иммунитета; тем не менее, при отсутствии контроля, воспаление может приводить к серьезным осложнениям, таким как хронические воспалительные заболевания (например, астма, псориаз, артрит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, воспалительное заболевание пищеварительного тракта и тому подобные), септическому шоку и полиорганной недостаточности. Важно, что все эти заболевания имеют общие воспалительные медиаторы, такие как цитокины, хемокины, воспалительные клетки и другие медиаторы, секретируемые этими клетками.
Активация ТЬКЗ лигандами поли(1:С), двухцепочечной РНК или эндогенными матричными РНК ведет к активации сигнального пути, приводящего к синтезу и секреции провоспалительных цитокинов, активации и рекрутингу участвующих в воспалительной реакции клеток, таких как макрофаги, гранулоциты, нейтрофилы и эозинофилы, а также к клеточной смерти и разрушению ткани. ТЬКЗ индуцирует секрецию 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-12, ТМР-а, ΜΙΡ-1, СХСЬ5/1Р-10 и КАЫТЕ§, а также провоспалительных цитокинов и хемокинов, участвующих в привлечении и активации иммунокомпетентных клеток, приводя к разрушению ткани в случае аутоиммунных и других воспалительных заболеваний. Эндогенные матричные РНК, являющиеся лигандами ТЬКЗ, высвобождаются из некротических клеток в процессе воспаления и могут приводить к возникновению замкнутой положительной обратной связи, которая активирует ТЬКЗ, приводя к продолжению воспалительного процесса и дальнейшему разрушению ткани. Антагонисты ТЬКЗ, такие как антитела-антагонисты ТЬКЗ, могут участвовать в нормализации секреции цитокинов, уменьшать привлечение участвующих в воспалительном процессе клеток, а также уменьшать повреждение ткани и клеточную смерть. Следовательно, антагонисты ТЬКЗ имеют терапевтический потенциал в лечении воспаления и целого спектра воспалительных заболеваний.
В качестве примера воспалительного состояния, связанного с сепсисом, можно привести синдром системной воспалительной реакции (ССВР), септический шок или синдром полиорганной недостаточности. Двухцепочечная РНК, высвобождающаяся при вирусной, бактериальной, грибковой инфекции или паразитарной инвазии, а также некротическими клетками, может способствовать развитию сепсиса. Опуская теоретическое обоснование, утверждается, что лечение антагонистами ТЬКЗ может дать положительный терапевтический эффект, увеличив время жизни пациентов, страдающих от связанных с сепсисом воспалительных заболеваний, или предотвратив распространение местного воспалительного процесса (например, в легких) и переход воспаления в системное за счет естественной антимикробной активности, а также за счет взаимодействия с антимикробными агентами, минимизируя локальное воспаление, участвующее в развитии патологии, или за счет любой комбинации указанных эффектов. Такое вмешательство может быть достаточным для проведения необходимого для выживания пациента дополнительного лечения (например, лечения основной инфекции или уменьшения уровня цитокинов). Сепсис может исследоваться на животных моделях, например, у мышей, путем введения Ό-галактозамина и поли(1:С). В таких моделях Ό-галактозамин и гепатотоксин действуют как сенсибилизаторы при сепсисе, а поли(1:С) индуцирует сепсис, имитируя эффект двухцепочечной ДНК, и активирует ТЬКЗ. Лечение антагонистом ТЬКЗ способно повысить выживаемость животных в экспериментах с сепсисом на мышах, следовательно, антагонисты ТЬКЗ могут использоваться для лечения сепсиса.
Воспаление желудочно-кишечного тракта является воспалением слизистой оболочки и включает острое и хроническое состояние. Острое воспаление обычно характеризуется коротким начальным периодом и инфильтрацией или притоком нейтрофилов. Хроническое воспаление обычно характеризуется относительно более длительным начальным периодом и инфильтрацией или притоком мононуклеарных клеток. Слизистая оболочка может быть слизистой оболочкой пищеварительного тракта (включая тонкий и толстый кишечник), прямой кишки, выстилающего слоя желудка или ротовой полости. Примеры хро- 22 021512 нических воспалительных заболеваний включают воспалительное заболевание пищеварительного тракта, индуцированные внешними воздействиями колиты (например, воспаление ЖКТ, (например, колиты), вызванное или сопутствующее (например, в качестве побочного эффекта) терапевтическим режимам, таким как химиотерапия, радиотерапия и тому подобные), инфекционный колит, ишемический, коллагеновый или лимфоцитный колит, некротический энтероколит, колиты, вызванные другими заболеваниями, такими как хроническая грануломатозная болезнь или целиакия, пищевые аллергии, гастриты, инфекционные гастриты или энтероколиты (например, хронический гастрит, вызванный инфекцией НеПсоЬас!ег ру1оп), а также другие формы желудочно-кишечного воспаления, вызванные инфекционным агентом.
Воспалительные заболевания пищеварительного тракта включают группу хронических воспалительных заболеваний обычно неизвестной этиологии, например, язвенный колит и болезнь Крона. Клинические и экспериментальные наблюдения позволяют предположить, что патогенез воспалительных заболеваний ЖКТ основан на многих факторах, включающих генетическую предрасположенность и влияние окружающей среды. При воспалении пищеварительного тракта повреждение ткани является результатом неправильного или чрезмерного иммунного ответа на антиген или микрофлору кишечника. Существует несколько животных моделей воспалительных заболеваний пищеварительного тракта. Наиболее распространена модель колита, индуцированного введением 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты/этанола (ТИВ§), и модель с использованием оксазалона, который индуцирует хроническое воспаление и изъязвление прямой кишки (№ига!Б е! а1., 1п!егп. Кеу. 1ттипо1 19:51-62, 2000). В другой модели используется декстрансульфат натрия (ДСН), который индуцирует острый колит, сопровождающийся такими симптомами, как кровавая диарея, потеря веса, сокращение прямой кишки и вызываемое инфильтрацией нейтрофилов изъязвление слизистой оболочки. ДСН-индуцированные колиты гистологически характеризуются инфильтрацией участвующих в воспалении клеток в собственную пластинку слизистой оболочки, лимфоидной гиперплазией, поражением центральной крипты и изъязвлением эпителия (Непйпсккоп е! а1., СНшса1 МюгоЬю1оду Ке\'1е\У5 15:79-94, 2002). Другая модель основана на адоптивном переносе наивных СЭ45КВ СЭ4 Т-клеток мышам линий КАО или §СГО. В данной модели наивные Тклетки донора атакуют кишечник реципиента, вызывая хроническое воспаление пищеварительного тракта и симптомы, сходные с воспалительным заболеванием пищеварительного тракта человека (Кеай апй Ро\упе. Сигг. Рго!ос. 1ттипо1. СБар!ег 15 ит! 15.13, 2001). Введение предложенных в настоящем изобретении антагонистов в любую из названных моделей может быть использовано для оценки потенциальной эффективности указанных антагонистов в облегчении симптомов и изменении течения болезней, связанных с воспалительным процессом в пищеварительном тракте, например, воспалительного заболевания пищеварительного тракта. Существуют несколько возможностей лечения воспалительных заболеваний ЖКТ, например, антитела против ТИР- уже в течение десятилетия используются для лечения болезни Крона (Уап АкксБе е! а1., Еиг. I. РЬагтасо1. ЕриЬ Ос! 2009). Тем не менее, значительная часть пациентов невосприимчива к используемым в настоящее время способам лечения (Напаиег е! а1., Ьапсе! 359:15411549, 2002; Напаиег е! а1., Оак!гоеп!его1оду 130:323-333, 2006) и, следовательно, необходима разработка новых подходов к лечению указанных пациентов.
Другим примером воспалительного состояния является воспалительный процесс в легких. Типично, воспаление легких включает вызванные инфекцией заболевания легких, в том числе связанные с вирусными, бактериальными, грибковыми, паразитарными и прионовыми инфекциями; индуцированные аллергеном заболевания легких; индуцированные загрязнением окружающей среды заболевания легких, такие как асбестоз, силикоз и бериллиоз; вызванные аспирацией желудочного содержимого, а также вызванные иммунной дисрегуляцией заболевания, воспалительные заболевания, зависящие от генетической предрасположенности, такие как муковисцидоз, заболевания, индуцированные физической травмой легких, например травма при искусственной вентиляции. Указанные воспалительные заболевания также включают астму, эмфизему, бронхиты, хронические обструктивные заболевания легких (ХОЗЛ), саркоидозы, гистиоцистозы, лимфоангиоматозы, острое повреждение легких, синдром острого нарушения дыхания, хроническое заболевание легких, бронхопульмональную дисплазию, внебольничную пневмонию, госпитальную пневмонию, вызванную искусственной вентиляцией легких пневмонию, сепсис, вирусную пневмонию, инфекции вирусом гриппа, парагриппозные инфекции, инфекции ротавирусом, инфекции человеческим метапневмовирусом, респираторно-синциальные инфекции, легочный аспергиллез и другие грибковые инфекции. Как правило, связанные с инфекцией воспалительные заболевания могут включать вирусную или бактериальную пневмонию, в том числе тяжелую пневмонию, муковисцидоз, бронхит, обострения заболеваний дыхательных путей и синдром острого нарушения дыхания (СОНД). Такие связанные с инфекцией заболевания могут вовлекать множественные инфекции, такие как первичную вирусную и вторичную бактериальную инфекции.
Астма является воспалительным заболеванием легких, которое характеризуется гиперчувствительностью дыхательных путей (ГДП), бронхостенозом, хрипами в легких, эозинофильным или нейтрофильным воспалением, гиперсекрецией слизи, субэпителиальным фиброзом и увеличением уровня иммуноглобулина 1дЕ. Больные астмой испытывают приступы, ухудшение симптомов, чаще всего вследствие инфекций респираторного тракта (например, риновирус, грипп, гемофильная палочка НаеторШик шйи- 23 021512 еп/а и пр.). Астматические приступы могут провоцироваться факторами окружающей среды (например, аскариды, насекомые, животные (например, кошки, собаки, кролики, мыши, крысы, хомячки, морские свинки и птицы), грибки, загрязнение воздуха (например, табачный дым), раздражающие газы, запахи, испарения, аэрозоли, химикаты, пыльца, физические упражнения или холодный воздух). Кроме астмы некоторые хронические, поражающие легкие воспалительные заболевания характеризуются нейтрофильной инфильтрацией дыхательных путей, например хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), бактериальная пневмония и муковисцидоз (Ьтйеп е1 а1., Еиг. Кекри. ί. 15:973-977, 2000; Кактап е1 а1. , СПп. 1ттипо1. 115:268-276, 2005), а такие заболевания, как ХОЗЛ, аллергические риниты и муковисцидоз, характеризуются гиперчувствительностью дыхательных путей (Раку апй О'Вугпе, Ат. ί. Кекр1г. Сгк. Саге Мей. 163:822-823, 2001). В качестве животных моделей для изучения астмы и воспаления дыхательных путей обычно используют провокацию овальбумином, а также модели, в которых сенсибилизация животного достигается введением метахолина (Некке1 е1 а1., Еиг. ί. Ркагтасо1. 293:401-412, 1995). Ингибирование продукции цитокинов и хемокинов в культурах человеческих эпителиальных бронхиальных клеток, бронхиальных фибробластов или клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей может быть использовано в качестве экспериментальных моделей ш νίΙΐΌ. Введение предложенных в настоящем изобретении антагонистов в любую из указанных моделей может быть использовано для оценки эффективности данных антагонистов в облегчении симптомов и изменении течения астмы, воспалений дыхательных путей, ХОЗЛ и других подобных заболеваний.
Другие воспалительные заболевания и нейропатии, которые могут быть предупреждены или вылечены представленными в настоящем изобретении способами, являются болезнями, вызванными аутоиммунными процессами. Эти заболевания и нейропатии включают рассеянный склероз, системную красную волчанку и нейродегенеративные заболевания и расстройства центральной нервной системы (ЦНС), например болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, биполярное аффективное расстройство и амиотрофический боковой склероз, болезни печени, например, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, неалкогольная жировая инфильтрация (жировой метаморфоз) печени/стеатогепатит, фиброз, гепатит С (НСУ) и гепатит В (НВУ), диабет и резистентность к инсулину, сердечно-сосудистые расстройства, например атеросклероз, церебральные кровотечения, инсульт и инфаркт миокарда, артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит и ювенильный ревматоидный артрит, остеопороз, остеоартрит, панкреатит, фиброз, энцефалит, псориаз, гигантоклеточный артериит, анкилозный спондилит, аутоиммунный гепатит, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), воспалительные заболевания кожи, трансплантаты, рак, аллергии, эндокринные заболевания, заживление ран, другие аутоиммунные заболевания, гиперчувствительность дыхательных путей, а также клеточные, вирусные или опосредованные прионами инфекции и заболевания.
Артриты, включая остеоартрит, ревматоидный артрит, артрит, развившийся в результате повреждения суставов, и другие подобные заболевания, являются обычными воспалительными заболеваниями, лечение которых может быть улучшено за счет терапевтического использования противовоспалительных белков, таких как представленные в настоящем изобретении антагонисты. Например, ревматоидный артрит (РА) является системным заболеванием, поражающим все тело, и одной из самых часто встречающихся форм артрита. Поскольку ревматоидный артрит приводит к поражению тканей, лиганды ТЕК.3, скорее всего, присутствуют в месте воспаления. Активация сигнального пути ТБК3 может приводить к непрекращающемуся воспалению и повреждению других тканей в воспаленном суставе. Существуют животные модели для изучения ревматоидного артрита. Например, при моделировании коллагениндуцированного артрита (КИА) у мыши развивается хронический воспалительный артрит, который сильно напоминает человеческий ревматоидный артрит. Введение представленных в настоящем изобретении антагонистов ТБК3 экспериментальным мышам с КИА может быть использовано для оценки применения указанных антагонистов для облегчения симптомов и изменения течения болезни.
Сахарный диабет (лат. 0|аЬе1ек те11кик) является многофакторным заболеванием и характеризуется гипергликемией (БеКоИк е1 а1., (ейк.), 0|аЬе1ек Ме11кик, Е1рртсок-К.ауеп РиЬкккегк, Ркйайе1рк1а, Ра. И.З.А. 1996, а также все упомянутые в работе ссылки). Неконтролируемая гипергликемия может приводить к увеличению преждевременной смертности вследствие повышения риска микро- и макроангиопатий, включая нефропатии, нейропатии, ретинопатии, гипертензии, цереброваскулярные заболевания и ишемическую болезнь сердца. Следовательно, контроль гомеостаза глюкозы является критически важным в лечении диабета.
Диабеты могут быть разделены на две большие группы, основываясь на вызывающих заболевание дефектах: диабет типа 1 (инсулинозависимый сахарный диабет, ΙΌΌΜ), возникающий при отсутствии в поджелудочной железе пациента производящих инсулин бета-клеток, и диабет типа 2 (инсулиннезависимый сахарный диабет, ΝΙΌΌΜ), возникающий у пациентов с нарушением секреции инсулина бетаклетками и/или резистентностью к действию инсулина.
Диабет типа 2 характеризуется устойчивостью к инсулину, сопровождаемой относительной, но не абсолютной, инсулиновой недостаточностью. У инсулин-резистентных индивидуумов секретируется аномально высокое количество инсулина, что имеет компенсаторный эффект. При недостаточном количестве инсулина для компенсации резистентности к инсулину и контроля концентрации глюкозы разви- 24 021512 вается состояние нарушения толерантности к глюкозе. У значительного числа индивидуумов во время болезни секреция инсулина уменьшается и концентрация глюкозы в плазме возрастает, приводя к клиническому диабету. Связанные с жировой тканью воспаления в значительной степени связаны с развитием резистентности к инсулину, диабетом типа 2, дислипидемией и сердечно-сосудистыми заболеваниями. У страдающих ожирением пациентов макрофаги перемещаются в жировую ткань и накапливаются там, приводя к выработке провоспалительных цитокинов, таких как ΤΝΡ-α и 1Ь-6, свободных жирных кислот и адипокинов, способных влиять на инсулиновый сигнальный путь и индуцировать развитие резистентности к инсулину. Активация рецепторов ТЬК3 на макрофагах может приводить к состоянию, способствующему воспалению в жировой ткани. Существует несколько моделей для изучения резистентности к инсулину. Например, у экспериментальных животных с алиментарным ожирением развивается гипергликемия и резистентность к инсулину, сопровождающиеся набором веса. Введение представленных в настоящем изобретении антагонистов ТЬК3 экспериментальным животным с алиментарным ожирением может быть использовано для оценки эффективности антагонистов для облегчения осложнений, связанных с диабетом типа 2, и изменения течения болезни.
К раковым заболеваниям относятся злокачественные изменения в клетке, ткани, органе, организме, будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания, как лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (лимфолейкоз) (ОЛЛ), В-лимфобластный, либо Т-лимфобластный ОЛЛ, острый мелиелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический мелиелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (МДС), лимфома, болезнь Ходжкина (лимфогранулематоз), злокачественная лимфома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, саркома Капоши, колоректальная карцинома, карцинома поджелудочной железы, рак почки, рак молочной железы, назофарингеальная карцинома, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальциемия, связанная со злокачественным ростом, твердые (локализованные) опухоли, аденокарциномы, плоскоклеточные карциномы, саркомы, злокачественная меланома, в особенности метастатическая меланома, гемангиома, метастазирующая опухоль, связанная с раком резорбция костной ткани и связанная с раком боль.
Типично, сердечно-сосудистые заболевания включают сердечно-сосудистые нарушения в клетках, ткани, органе, организме, будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания, как синдром внезапной смерти, инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, кровотечение, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, атеросклероз на фоне сахарного диабета, гипертензия, артериальная гипертензия, вазоренальная гипертензия, обморок, шок, сифилис сердечно-сосудистой системы, остановка сердца, легочное сердце (лат. сог ри1топа1е), первичная легочная гипертензия, сердечные аритмии, суправентрикулярная эктопическая систола, трепетание предсердий, мерцание предсердий (хроническое или приступообразное/пароксизмальное), реперфузионный синдром, воспалительный ответ на искусственное кровообращение, хаотическая или политопная предсердная тахикардия, тахикардия с узкими комплексами 0К8, специфические аритмии, фибрилляция желудочков, аритмии, связанные с нарушением функции пучка Гиса, атриовентрикулярный блок, атриовентрикулярная блокада, ишемии миокарда, заболевания коронарной артерии, стенокардия (лат. ап§1па ресΐοτίδ), инфаркт миокарда, кардиомиопатия, дилатационная (застойная) кардиомиопатия, рестриктивная кардиомиопатия, порок сердца, эндокардит, перикардит, опухоли сердца, аневризм аорты и периферическая аневризма, расслаивающая аневризма аорты, воспаление аорты, окклюзия абдоминальной аорты и ее ответвлений, заболевания периферических кровеносных сосудов, окклюзии артериальных сосудов, атеросклероз периферических артерий, тромбоангиит (лат. 1ЬготЬоапд1Ш8 оЬШегапк), функциональные расстройства периферических артерий, феномен Рейно и виброболезнь, акроцианоз, эритромелалгия, венозные заболевания, тромбоз вен, варикозное расширение вен, артериовенозная фистула, лимфедема, липедема, нестабильная стенокардия, реперфузионное повреждение, постперфузионный синдром и ишемически-реперфузионное повреждение.
Типично, неврологические заболевания включают неврологические нарушения в клетках, ткани, органе, организме, будь то животное или человек, включая, помимо прочего, такие заболевания, как нейродегенеративные болезни, рассеянный склероз, мигрень, СПИД-деменция, демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидный синдром и церебеллярные расстройства, такие как поражения кортико-спинальной системы; заболевания, поражающие базальные ганглии, или церебеллярные расстройства; гиперкинетические синдромы, такие как хорея Гентингтона и сенильная хорея; медикаментозные нарушения движения, такие как нарушения, вызываемые блокировкой допаминовых рецепторов; гипокинетические нарушения движения, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий супрануклеарный паралич; структурные нарушения мозжечка; спиноцеребеллярные дегенерации, такие как спинальная атаксия, атаксия Фридрейха, мозжечковые кортикальные дегенерации, мультисистемные дегенерации (Менцеля, Дежерина-Тома, Ши-Драгера и МачадоДжозефа); системные расстройства (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальные мультисистемные расстройства); демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и расстройства моторной функции, такие как нейрогенные мышечные атрофии (дегенерация моторных нейронов, например амиотрофический боковой склероз, дет- 25 021512 ская и юношеская спинальные мышечные атрофии); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна в зрелом возрасте; деменция с тельцами Леви; сенильная деменция с тельцами Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельда-Якоба; подострый склерозирующий лейкоэнцефалит, болезнь Галлервордена-Шпатца и деменция боксеров.
Типичные фиброзные заболевания включают фиброз печени (включая, помимо прочего, такие заболевания, как вызванный алкоголем цирроз, цирроз, индуцированный вирусной инфекцией, аутоиммунный гепатит); фиброз легких (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, идиопатический фиброз легких); фиброз почек (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, вызванный диабетом нефрит, гломерулонефрит, вызванный системной красной волчанкой нефрит); фиброзы кожи (включая, помимо прочего, такие заболевания, как склеродермия, гипертрофические и келлоидные рубцы); миелофиброз; нейрофиброматоз; фиброму; фиброзные изменения кишечника и фиброзные спайки, возникающие в результате хирургического вмешательства. В этих способах фиброз может быть органоспецифическим или системным. Органоспецифический фиброз может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: фиброз легких, фиброз печени, фиброз почек, фиброз сердца, фиброз сосудов, фиброз кожи, фиброз глаза, фиброз костного мозга и пр. Фиброз легких может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: идиопатический легочный фиброз, медикаментозный легочный фиброз, астма, саркоидоз или хроническая обструктивная болезнь легких. Фиброз печени может быть связан по меньшей мере с одним из следующих заболеваний: цирроз, шистосомоз или холангит. Цирроз может быть либо алкогольным, либо возникшим после гепатита С или первичным билиарным циррозом. Холангит является склерозирующим холангитом. Фиброз почек может быть связан с диабетической нефропатией или с вызванным системной красной волчанкой гломерулосклерозом. Фиброз сердца может быть связан с инфарктом миокарда. Фиброз сосудов может быть связан с повторным сужением артерий после ангиопластии или атеросклерозом. Фиброз кожи может быть связан с возникшими в результате ожога рубцами, гипертрофическими рубцами, келлоидными рубцами или нефрогенной фиброзирующей дермопатией. Фиброз глаза может быть связан с ретро-орбитальным фиброзом, с хирургическим вмешательством при лечении катаракты или пролиферативной витреоретинопатией. Фиброз костного мозга может быть связан с идиопатическим миелофиброзом или медикаментозным миелофиброзом. Другие фиброзы могут быть выбраны из таких заболеваний, как болезнь Пейрони, контрактура Дюпюитрена (синдром) или дерматомиозит. Системные фиброзы могут быть системными склерозами или реакцией трансплантат против хозяина.
Введение/составление фармацевтических композиций
Терапевтически эффективное количество агента, эффективного в лечении или профилактике заболевания, при котором желательна активность ТЬК3, может быть определено путем стандартных исследовательских способов. Например, доза агента, эффективная в лечении или профилактике воспалительных заболеваний, таких как астма, болезнь Крона, язвенных колит иди ревматоидный артрит, может быть определена введением агента в соответствующую модель, такую как представленные здесь модели.
Кроме того, в случае необходимости, для оптимизации дозы могут быть использованы тестсистемы ίη νίίτο. Точное определение эффективной дозы (например, с помощью клинических испытаний) может быть осуществлено специалистами на основании нескольких факторов. Такими факторами являются подлежащее лечению или профилактике заболевание, симптомы заболевания, масса тела пациента, иммунологический статус пациента и другие известные специалистам факторы. Точная доза, предназначенная для применения в формуле композиции, зависит от способа введения препарата, а также от тяжести болезни и должна определяться на основании врачебного решения и состояния каждого пациента. Эффективная доза может быть экстраполирована исходя из кривой динамики доза-ответ, полученной в экспериментах на животных или ίη νίΐτο.
В представленных в настоящем изобретении способах антагонисты ТЬК3 могут вводиться по одному или в сочетании по меньшей мере с одной дополнительной молекулой. В качестве дополнительных молекул могут выступать другие молекулы-антагонисты ТЬК3 или молекулы, имеющие терапевтическое значение, не опосредованное сигнальным путем рецептора ТЬК3. Уменьшающие производство или активность цитокинов компаунды, состоящие из антибиотиков, противовирусных, паллиативных или прочих веществ, являются примерами таких дополнительных молекул.
Для введения предназначенного для терапевтического использования агента может быть использован любой приемлемый путь введения, который обеспечивает попадание агента к пациенту. Фармацевтические композиции данных агентов являются особенно полезными при парэнтеральном введении, например, внутрикожном, внутримышечном, внутрибрюшном, внутривенном, подкожном или интраназальном.
Предложенный в данном изобретении агент может быть изготовлен в виде фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество агента в качестве активного компонента вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Термин носитель относится к растворителям, адъювантам, связывающим веществам или среде, вместе с которыми активное соединение будет вводиться. Фармацевтическая среда может быть жидкой, как, например, вода или масла, включая масла, получаемые из нефти, масла растительного, животного или синтетического происхождения, например арахисовое, соевое, ми- 26 021512 неральное, кунжутное и другие подобные масла. Например, могут быть использованы 0,4% раствор поваренной соли и 0,3% раствор глицина. Указанные растворы стерильны и обычно не содержат твердых примесей. Стерилизация проводится с использованием общепринятых, хорошо известных способов стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать принятые в фармацевтике вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, например, вещества, необходимые для контроля и изменения рН, стабилизаторы, увеличивающие плотность, увлажняющие и придающие окраску агенты и т.д. Концентрация предложенного в данном изобретении агента в таких фармацевтических формулировках может значительно варьировать, т.е. от менее чем 0,5% (обычно не менее 1%) до 15-20% от веса и определяется, в первую очередь, на основании необходимой дозы, объема, вязкости и т.д., в соответствии с выбранным способом введения.
Таким образом, предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции, предназначенные для внутримышечного введения, могут содержать 1 мл стерильного буферного раствора, а также приблизительно от 1 нг до 100 мг, например приблизительно от 50 нг до 30 мг, или предпочтительнее приблизительно от 5 до 25 мг предложенного в настоящем изобретении антитела-антагониста ТЬК3. Сходным образом, предложенная в настоящем изобретении фармацевтическая композиция для внутривенного введения может содержать приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и приблизительно от 1 до 30 мг, или предпочтительнее приблизительно от 5 до 25 мг предложенного в настоящем изобретении антагониста. Способы изготовления парэнтерально вводимых композиций хорошо известны и их детальное описание может быть найдено (см., например, в КетшдЮи'з РЬагтасеийса1 δс^еηсе. 15!Ь ей., Маск РиЬЬзЫид Сотраиу, Еаз!ои, РА).
Предложенные в настоящем изобретении антитела-антагонисты могут быть лиофилизированы для хранения и впоследствии перед использованием восстановлены (растворены) в подходящем носителе. Было показано, что этот способ эффективен для обычно используемых иммуноглобулинов и белковых препаратов, при этом могут быть использованы известные специалистам способы лиофилизации и восстановления.
Настоящее изобретение сейчас будет охарактеризовано с помощью нижеприведенных примеров, описывающих настоящее изобретение, но не ограничивающих его.
Пример 1
Идентификация и получение антагонистов тАЬ против ЬиТЬК3
Комбинаторная библиотека человеческих антител Мο^рЬοδуз (НиСАЬ®) Оо1й рЬаде Фзр1ау ЬЬгагу (МогрЬозуз АО, Мартинсрид, Германия) использовалась в качестве источника фрагментов человеческих антител и планировалась для получения антител против очищенного антигена ТЬК3, полученного путем экспрессии аминокислот 1-703 человеческого ТЬК3 (ЬиТЬК3) (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 4) с полигистидиновым хвостом на С-конце и очистки методом аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов. Аминокислоты 1-703 соответствуют предсказанному внеклеточному домену (ЕСЭ) ЬиТЬК3. РаЬ-фрагменты, специфически связывающиеся с внеклеточным доменом ЬиТКЬ3, выбирали путем представления белка ТЬК3 различными способами, чтобы идентифицировать разнородный набор фрагментов антител, секвенировали и подтверждали его уникальность. Используя различные стратегии, было отобрано 62 белка-кандидата (с различными последовательностями У-сегмента), способных связываться исключительно с внеклеточным доменом ЬиТЬК3.
Эти 62 белка, идентифицированные как способные связываться исключительно с внеклеточным доменом ЬиТЬК3, были проверены на способность нейтрализовать его активность с помощью целого ряда работающих на клеточном уровне тест-систем, пригодных для анализа противовоспалительной активности. Используя предварительные показатели активности (см. далее пример 2), из 62 были отобраны четыре кандидата (РаЬ 16-19), определяющие семейства 16-19, в качестве исходного материала для созревания тяжелой цепи С.ГОК2 (НСЭК2) и легкой цепи СГОК3 (ЬСЭК3). Один из исходных кандидатов (кандидат 19) имел Ν-связанный гликозилированный участок в НСЭК2; с целью избавиться от гликозилированного участка в гене, кодирующем названный белок-кандидат, была индуцирована мутация, заменяющая δе^ на А1а (δ на А). После созревания СЭК четырех исходных кандидатов было выбрано 15 дочерних кандидатов (кандидаты 1-15) для дальнейшей характеризации, согласно описанию, приведенному ниже в примере 2. Вариабельные участки легкой и тяжелой цепей каждого из 19 кандидатов перечислены в табл. 3. Указанные кандидаты будут далее называться тАЬ 1-19 или РаЬ 1-19, в зависимости от того, являются ли они РаЬ-фрагментами антител или представляют собой полную клонированную последовательность антитела (пример 3). Вследствие особенности дизайна экспрессионного вектора крайними сегментами вариабельных участков зрелых антител у всех кандидатов являются ОУЕ для тяжелой цепи и ΌΙ для легкой цепи. Предпочтительными последовательностями для указанных сегментов являются последовательности генов клеток зародышевой линии, имеющие высокую степень сходства с последовательностью кандидата. Для семейств 17 и 18 последовательность генов клеток зародышевой линии была ОУО для УН и δΥ для УЪ. Последовательности семейства 19 являются последовательностями ЕУО для УН и ΌΙ для УЪ. Последовательность δΥ является уникальной для лямбда подгруппы 3, и существуют свидетельства гетерогенности δ или Υ в отношении конечного остатка. Таким образом, консенсунсный конец ρδΥ из выдающейся подгруппы лямбда 1 был сочтен более подходящей заменой Э!Е для УЪ се- 27 021512 мейств 17 и 18. Эти изменения были внесены в кандидаты 9, 10 и 12 из семейства 18 и кандидаты 14 и 15 из семейства 19. В этом процессе были оптимизированы кодоны областей УН и УЪ этих антител. Варианты Ν-конца аминокислотных последовательностей вариабельного участка легкой цепи, полученные из клеток зародышевой линии, которые являются вариантами кандидатов 9, 10 и 11, показаны в 8ЕЦ ΙΌ ΝΘ: 209-211, а варианты Ν-конца аминокислотных последовательностей вариабельного участка тяжелой цепи, полученные из клеток зародышевой линии, которые являются вариантами кандидатов 9, 10, 12, 14 и 15, показаны в 8ЕЦ ГО ΝΘ: 212-216 соответственно. Варианты Ν-конца данных кандидатов называются в настоящем изобретении кандидат/тАЬ/РаЬ 9ЦУЦ/Ц8У, 10ОУО/О8У, 12ЦУЦ/Ц8У, 14ЕУЦ или 15ЕУЦ. Варианты Ν-конца, полученные из клеток зародышевой линии, экспрессированные как тАЬ, не оказывают влияния на связывание ТЬК3 или на способность антител ингибировать биологическую активность ТЬК3 по сравнению с исходными белками (данные не показаны).
Пример 2
Определение активности антагониста ТЬК3 ίη νίΐΐΌ
Охарактеризованных выше кандидатов с созревшим СОК были отобраны как потенциально пригодные для лечения человека, была определена эффективность связывания и способность оказывать нейтрализующий эффект на активность рецептора. Результаты исследования активности и результаты для четырех исходных РаЬ, РаЬ 16-19 и фрагментов РаЬ 15, содержащих созревшие СОК, РаЬ 1-15, либо их У-участки, не заимствованные из клеток зародышевой линии, приводятся далее.
Ингибирование сигнального каскада ΚΝΓ-Β и кКЕ
Клетки 293Т культивировали в средах ЭМЕМ и О1и1аМах ОпуНгодеи СагкЬай, СА), содержащих инактивированный с помощью термического воздействия РВ8, затем клетки были трансфецированы введением 30 нг ρΝΤ-κΒ или плазмиды-репортера кКЕ, содержащей ген люциферазы светлячка, 13,5 нг вектора плазмидной ДНК 3,1, 5 нг вектора рЬРЪ-ТК и 1,5 нг вектора плазмидной КДНК, кодирующего РЬ ТЬК3 (8ЕЦ ГО ΝΘ: 2). Плазмида рЬКЬ-ТК содержит ген люциферазы КенШа (люцифераза коралла, Кеш11а гешГогтк), регулируемый Н8У-1 промотором тимидинкиназы (Рготеда, Майки νΙ). Антитела ТЬК3 инкубировались в течение 30-60 мин перед добавлением поли(ЬС) (ОЕ НеаИЬсаге, Ркса1а\уау, Νί). Планшеты инкубировались в течение 6 или 24 ч при 37°С перед добавлением люциферазного реагента ЭнакОк; последующий анализ планшет проводился с помощью прибора Ρ^υΘ5ίа^. Нормализацию значений (относительная интенсивность сигнала) получили делением КЬИ (интенсивность сигнала, измеренная в относительных единицах люминесценции - ге1аИуе 1ит^ηе5сеηсе ιιπίκ КЬИ) люциферазы светлячка на КЬИ коралловой люциферазы (Кеш11а). Путем стимуляции агентом поли(РС), являющимся агонистом ТЬК3 (1 мкг/мл), добивались специфического ингибирования каскада передачи сигнала с участием NΡ-кΒ или кКЕ, стимулирующего производство люциферазы светлячка, что достигалось за счет инкубации клеток с антителами против ТЬК3 (0,4, 2,0 и 10 мкг/мл). Результаты анализа ΝΤ-кВ показаны на фиг. 1 как выраженное в процентах относительное ингибирование люцифераз Ρ^^еΠу/Рен^11а с 5465 в качестве положительного контроля (нейтрализация тАЬ против человеческого ТЬК3) и тАЬ против человеческого тканевого фактора (859) в качестве контроля для человеческого изотипа Ι§04. >50% Ингибирование было достигнуто при концентрации тАЬ 0,4-10 мкг/мл. с1068 и ТЬК3.7 ингибируют около 38 и 8% биологической активности ТЬК3 при концентрации 10 мкг/мл. Сходные результаты были получены при использовании гена-репортера кКЕ (данные не показаны).
Производство цитокинов клетками ВЕА8-2В
Клетки ВЕА8-2В (8У-40 трансформированные нормальные человеческие клетки бронхиального эпителия) высевались на чашки, покрытые коллагеном типа 1, и, перед добавлением поли(РС), инкубировались с антителами против человеческого ТЬК3 или без них. Через 24 ч после обработки собирали надосадочную жидкость и определяли содержание цитокинов и хемокинов с помощью сделанной по заказу тест-системы, основанной на гибридизации на поверхности шариков, для определения ГО-6, ГО-8, ССЬ-2/МСР-1, ССЬ5/КАОТЕ8 и СХСЫ0ЛР-10. Результаты показаны на фиг. 2 как % ингибирования отдельных цитокинов/хемокинов после обработки тАВ, при концентрации 0,4, 2,0 и 10 мкг/мл. 5465 положительный контроль; 859 - контроль изотипа.
Производство цитокинов клетками NΗΒΕ
Производство цитокинов может быть также изучено в нормальных клетках человеческого эпителия ЩНВЕ) (Ъоп/а, Vа1ке^5ν^11е, МО). Клетки NΗΒΕ были размножены, а затем перенесены на покрытые коллагеном чашки для инкубации в течение 48 ч; после этого использованную среду удалили и добавили 0,2 мл свежей среды. Клетки инкубировались с тАЬ против человеческого ТЬК3 или без них в течение 60 мин перед добавлением поли(РС). Спустя 24 ч надосадочную жидкость собирали и хранили при -20°С, либо анализировали на содержание ГО-6. Результаты представлены графически на фиг. 3 как выраженное в процентах ингибирование секреции ГО-6 в результате обработки тАЬ в дозах от 0,001 до 50 мкг/мл. 5465 - положительный контроль; 859 - контроль изотипа. Большинство тАЬ вызывали по меньшей мере 50% ингибирование выработки ГО-6 при концентрации <1 мкг/мл и ингибирование до 75% при концентрации <5 мкг/мл.
- 28 021512
Производство цитокинов клетками РВМС
Производство цитокинов также было изучено в мононулеарных клетках периферической крови человека (РВМС). Кровь, полученная от доноров, собиралась в содержащие гепарин пробирки, к которым осторожно, в качестве нижнего слоя, добавляли раствор Фиколл Пак Плюс (Р1со11-Рас|ие Р1и§). Пробирки центрифугировались и клетки РВМС, формирующие белый слой непосредственно над слоем Рюо11, были собраны и высеяны на планшеты. После этого клетки РВМС культивировали с тАЬ против человеческого ΈΡΒ3 или без них перед добавлением 25 мкг/мл поли(1:С). Через 24 ч отбирали надосадочную жидкость и определяли концентрацию цитокинов с помощью технологии Ьитшех. Результаты представлены на графике на фиг. 4, где показано выраженное процентное суммарное ингибирование ΙΡΝ-γ, ГЬ-12 и ГЬ-6 при использовании единичной дозы тАЬ (0,4 мкг/мл) с 5465 в качестве положительного контроля; 1ш1дС4 использован в качестве контроля изотипа.
Производство цитокинов клетками НΑδМ
Вкратце, клетки гладкой мускулатуры дыхательных путей человека (НΑδМ) инкубировались с тАЬ против человеческого ΈΡΒ3 или без них, после чего к клеткам была добавлена комбинация 500 нг/мл поли(1:С) и 10 нг/мл ΊΝΡ-α. Спустя 24 ч супернатанты собрали и определили уровень цитокинов с помощью технологии Ьитшех. Результаты показаны графически на фиг. 5 в виде концентраций хемокина СС^5/ΒΑNТЕδ при трех дозах тАЬ (0,4, 2 и мкг/мл). 5465 - положительный контроль; Ы§С4 - контроль изотипа.
Результаты исследования клеток человека ίπ νίΙΐΌ подтверждают способность предложенных в настоящем изобретении антител уменьшать производство цитокинов и хемокинов в результате связывания с 1шП.Н3
Пример 3
Конструкции антител в полную длину
Четыре исходных фрагмента РаЬ (кандидаты № 16-19) и 15 дочерних РаЬ (кандидаты № 1-15) тяжелых цепей были клонированы в клетках, содержащих мутацию в гене иммуноглобулина 1дО4 (мутация δ229Ρ Рс). Кандидаты ‘ΐρΥρ/ρδΥ, Κ^Υρ/ΟδΥ, ΡΡΥρ/ρδΥ, 14ЕУЦ или 15ЕУЦ были клонированы в клетках, содержащих мутации в гене иммуноглобулина 1дО4, мутации Р235А/Ь236А и δ229Ρ Рс.
Зрелые, имеющие полную длину аминокислотные последовательности тяжелых цепей показаны в δΡΡ ГО ΝΟ: 90-102 и 218-220
Кандидат 5Е0 ГР ΝΟ:
16 90
17 91
18 92
19 93
1 94
2 95
3 96
4 97
5, б, 7 98
8 99
9 100
10, 11 , 12 101
13, 14 , 15 102
9Εν<2 218
ΙΟΕνα, 12ЕУ0 219
14ΕΥ(2, 15Εν<2 220
Для экспрессии эти последовательности тяжелых цепей могут включать Ν-концевую лидерную последовательность, например, МΑVУVТ^^Ρ^МΑΑΑ^δI^Α (ЪЕР ΙΌ ΝΟ: 103). Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь кандидатов 14ЕУЦ и 15ЕУЦ с лидерной последовательностью, а также зрелую форму (без лидерной последовательности), показаны в δΞΡ ГО ΝΟ: 104 и 105 соответственно. Подобным образом, для экспрессии последовательности легкой цепи антител настоящего изобретения могут включать Ν-концевую лидерную последовательность, например, МСVΡТ^V^С^^^^\V^Т^ΑΒС (δερ ΙΌ ΝΟ: 106). Нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь кандидата 15 после оптимизации кодонов с лидерной последовательностью, а также зрелую форму (без лидерной последовательности), показаны в δΞΡ ΙΌ ΝΟ: 107 и 108 соответственно.
Пример 4
Характеристика связывания тАЬ против ΈΡΒ3
Значения ЭК50 при связывании тАЬ с внеклеточным доменом (ЕСО) человеческого ΈΡΒ3 определяли методом ИФА. Белок ЕСО человеческого Т^Β3 разводили до 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и аликвоты по 100 мкл вносили в каждую лунку 96-луночного планшета (Соттпд Ιικ., Ас1оп, МА).
- 29 021512
После инкубации в течение ночи при 4°С планшет трижды промывали отмывочным буфером, содержащим 0,05% Твин-20 (З1§та-А1бг1сБ) в ФСБ. В лунки вносили 200 мкл блокирующего раствора 2% БВ1оск (АррНеб Вюзу^етз, Роз!ег СгЕу, СА) и 0,05% твина-20 в фосфатно-солевом буфере. После блокирования в течение 2 ч при комнатной температуре планшет трижды промывали добавлением серийных разведений кандидатов 1-9 антител против ТБКЗ в блокирующем буфере тАЬ против ТБКЗ, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч и трижды промывали. Затем добавляли конъюгированные с пероксидазой овечьи антитела против человеческого (ОЕ НеаББсаге, Р1зса1а^ау, N1), разведенные в соотношении 1:4000 в блокирующем буферном растворе, инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем трижды промыли в отмывочном буфере. Связывание выявляли путем 10-15-минутной инкубации в ТМВ-З (РБхдегаЫ ^бизБтез ШегпаБопа^ ^с., Сопсогб, МА). Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 2Ы Н2З04 и измеряли поглощение при 450 нм (вычитая поглощение при 650 нм) с помощью спектрофотометра ЗРЕСТКА Мах (Мо1еси1аг ОеМсез Согр., Зиппууа1е, СА). Значения ЭК50 определяли способом нелинейной регрессии с помощью программного обеспечения ОгарБРаб Рпзт (ОгарБРаб ЗоПуаге, ^с., Зап В1е§о, СА).
Значения ЭК50 определяли в реакции связывания, инкубируя БиТБКЗ (табл. 4) с 100 мкл 4-кратных серийных разведений тАЬ от 2,5 мкг/мл до 0,6 пг/мл. Отрицательными контрольными образцами служили античеловеческий тканевой фактор тАЬ 859 и Би ^Ο4κ.
Аффинность связывания для БиТБКЗ ЕСО определяли также с помощью В1асоге-анализа. Полученные данные (не показаны) продемонстрировали, что Кб тАЬ 1-19 при связывании с БиТБКЗ ЕСО составляет менее 10-8 М.
Таблица 4
Пример 5
Конкурентное связывание с эпитопами
Эксперименты по связыванию с эпитопами проводили с целью определения конкурентных групп или групп эпитопов антител против ТБКЗ.
При конкурентном ИФА 5 мкл очищенного человеческого белка ТБКЗ ЕСО (20 мкг/мл), синтезированного в соответствии с описанием в примере 1, вносили в лунки планшета МЗВ Н1§БВтб (Мезо Зса1е В1зсоуегу, ОаББегзЬигд, МВ) и выдерживали 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 150 мкл блокирующего буфера А (Мезо Зса1е В1зсоуегу) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Планшеты трижды промывали буфером 0,1 М НЕРЕЗ, рН 7,4, затем добавляли смесь меченых тАЬ против ТБКЗ с разными конкурирующими агентами. Меченые антитела (10 нМ) инкубировали с увеличивающимися концентрациями (от 1 нМ до 2 мкМ) немеченых антител против ТБКЗ, затем смесь вносили в обозначенные лунки в объеме 25 мкл. После 2 ч инкубации с осторожным встряхиванием при комнатной температуре планшеты трижды промывали буфером 0,1 М НЕРЕЗ (рН 7,4). Буфер МЗВ Кеаб Вийег Т разводили дистиллированной водой 4 раза и вносили в лунки в объеме 150 мкл/лунку, а затем анализировали с помощью прибора ЗЕСТ0К ^адег 6000. Антитела метили эфиром МЗВ ЗиБо-Тад™ ЫНЗ согласно инструкции производителя (Мезо Зса1е В1зсоуегу).
Оценивали следующие антитела против ТБКЗ: тАЬ 1-19, полученные из комбинаторной библиотеки антител человека МогрБозуз (МогрБоЗуз Нитап СотЬта1опа1) (показаны в табл. За); с1068 (описанные в Ж) 06/06051ЗА2), с1811 (крысиные тАЬ против мышиных ТБКЗ, полученные из гибридомы крыс, иммунизированных мышиным белком ТБКЗ), ТБКЗ.7 (еВюзшепсез, Сан-Диего, Калифорния, кат. номер 14-90З9) и ГМО-З15А (против аминокислот человеческого ТБКЗ аминокислот 55-70 (УБЫБТН- З0 021512
N^^КК^РААN) от 1тдепех, Сан-Диего, Калифорния). Для тАЬ 9, 10, 12, 14 и 15 в данном исследовании использовали варианты 90νρ/0δν, 10θνθ/θδν, 120νρ/0δν, 14ЕУО или 15ЕУЦ.
При количественной оценке конкуренции антитела против ТЬК3 взаимодействовали с пятью различными группами. Группа А: тАЬ 1, 2, 13, 14ЕУЦ, 15ЕУЦ, 16, 19; группа В: тАЬ 3, 4, 5, 6, 7, 8, 90νρ/0δν, 100νρ/0δν, 11, 120νρ/0δν, 17, 18; группа С: антитело 1тдепех 1МО-315А; группа Ό: антитела ТБК3.7, с1068; и группа Е: антитело с1811.
Пример 6
Картирование эпитопов
Для дальнейшего картирования эпитопов в соответствии с описанием, приведенным в примере 5, отбирали репрезентативные антитела из различных наборов эпитопов. Картирование эпитопов проводили с помощью различных способов, в числе которых эксперименты по замене сегментов ТЕК3, мутагенез, замена Н/ϋ (водорода на дейтерий) и компьютерное моделирование белок-белковой стыковки (ТЬе Ерйоре Марршд РгоФсок, Мебюбк ш Мо1еси1аг Вю1оду, νο1. 6, О1еп Е. Могп8 еб., 1996).
Замена сегментов ТЕК3. Химерные человеческие-мышиные белки ТЕК3 использовали для обнаружения местоположения крупных антителсвязывающих доменов в ТЕК3. Внеклеточный домен человеческого белка делили на три сегмента (аа 1-209, аа 210-436, аа 437-708 в соответствии с нумерацией аминокислот в человеческом ОепВапк Асс. №. №_003256). Химерный белок МТ5420 был создан путем замены аминокислот человеческого ТЕК3 210-436 и 437-708 на соответствующие мышиные аминокислоты (мышиный ТЬК3, ОепВапк Асс. №. №_569054, аминокислоты 211-437 и 438-709). Химера МТ6251 была создана путем замены человеческих аминокислот в положениях 437-708 на аминокислоты мышиного ТЬК3 (мышиный ТЬК3, ОепВапк Асс. №. №_569054, аминокислоты 438-709). Все конструкты были созданы на основе вектора рСЕР4 (Ьйе ТесЬпо1од1е8, Карлсбад, Калифорния) с помощью стандартных методик клонирования. Белки экспрессировали в НЕК293 клетках как белки с У5-Н186, присоединенным к С-концу, и очищали в соответствии с описанием в примере 1.
тАЬ с1068. тАЬ с1068 с высокой аффинностью связывается с ЕСГО человеческого ТЬК3, однако не связывается надлежащим образом с мышиным ТЕК3. с1068 утеряло способность связываться как с МТ5420, так и с МТ6251, из чего можно сделать вывод, что участок связывания располагался в пределах последовательности аминокислот 437-708 \УТ белка человеческого ТЕК3.
тАЬ 12ρνρ/ρδν. тАЬ 12ρνρ/ρδν связывалось с обеими химерами, указывая на то, что участок связывания тАЬ 12ρνρ/ρδν располагался в пределах последовательности аминокислот 1-209 белка человеческого ТЕК3 с последовательностью, показанной в δΕ^ ГО N0: 2.
Стыковка белок-белок 1п 8Шсо. Кристаллическая структура тАЬ 15ЕУЦ (см. ниже) и опубликованная структура человеческого ТЬК3 (Ве11 е1 а1., Е ЕпбоФхш Ке8. 12:375-378, 2006) были минимизированы по энергии в СНАКМт (Вгоок8 е1 а1., Е СотрШаГ СЬет. 4:187-217, 1983) для использования в качестве стартовых моделей для докинга. Стыковка белок-белок изучалась с помощью программы 2Э0СКрго 1.0 (Ассе1гу8, δаη О|едо, СА), эквивалентной 2О0СК 2.1 (СЬеп и >епд, Рго1еш8 51: 397-408, 2003) с угловой сеткой 6 градусов. Известный участок №гликозилирования по остатку А8п в человеческом ТЕК3 (А8п 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 и 636) (8ип е1 а1., Е Вю1. СЬет. 281:11144-11151, 2006) блокировали от участия в образовании комплекса антиген-антитело по термину епегду в алгоритме программы ΖΌ0ΟΚ. Было получено 2000 исходных положений, которые использовали при группировке, затем положения при белок-белковой стыковке уточняли и повторно оценивали в программе КЭ0СК (Ы е1 а1., Рго1еи18 53:693-707, 2003). Визуально проверили 200 положений с наиболее высокими начальными оценками по ΖΌ0ΟΚ и 200 лучших положений по КЭ0СК.
Кристаллизация 15ЕУЦ проводилась способом диффузии пара при 20°С (Вепуегшб и Мандат, №Щге Рго1осо18 2:1633-51, 2007). Начальный скрининг проводили с помощью автомата Нубга на 96луночных планшетах. В эксперименте капли по 0,5 мкл раствора белка смешивали с 0,5 мкл резервуарного раствора. Капли уравновешивали против 90 мкл резервуарного раствора. Раствор РаЬ в 20 мМ Трисбуфера, рН 7,4, содержащий 50 мМ №С1, концентрировали до 14,3 мг/мл с помощью ячеек Аткоп ИНга5 кДа. Скрининг проводили с помощью νί/агб I & II (Етега1б В^у81ет8, Бейнбридж Айленд, Вашингтон) и использовавшихся в лаборатории лотков с ячейками для кристаллизации. Кристаллизацию фрагментов РаЬ 12ρνρ/ρδν проводили похожим способом.
Данные по дифракции рентгеновских лучей собирали и обрабатывали с помощью микрофокусного генератора рентгеновских лучей Шдаки МкгоМах™-007НР, снабженного конфокальной оптикой 08тк™ Уа^^Маx™, детектором δаШ^η 944 ССГО и системой криоохлаждения Х-81геат™ 2000 (Ктдаки, Вудлендс, Техас). Интенсивность дифракции выявляли по вращению кристалла более чем на 270°, причем время экспозиции при повороте кристалла на полградуса составляло 120 с. Данные рентгенографии обрабатывали с помощью программы Э*ТКЕК (Шдаки). Структуру определяли способом молекулярного замещения с помощью программы РЬа8ег или СNX (Ассе1гу8, Сан-Диего, Калифорния). Положения атомов и температурные коэффициенты уточняли с помощью программы КЕРМАС с использованием всех данных в диапазоне разрешения 15-2,2 А для РаЬ 15ЕУЦ и 50-1,9 А для РаЬ 12ρνρ/ρδν. Молекулы воды добавляли при пиках электронной плотности (Ро-Рс) с точкой отсечения 3σ. Все кристаллографиче- 31 021512 ские вычисления проводили с помощью набора программ ССР4 (СоНаЬогаНме СотрШабопа1 Рго)ес1, ШтЬег 4. 1994. ССР4 киПе: программы для кристаллографии белков. Ас1а Сгук1а11одг. Ό50:760-763). Коррекцию модели осуществляли с помощью программы СООТ (Етк1еу е1 а1., Ас1а Сгук1а11одг. Ό60:2126-2132, 2004).
Расшифровка кристаллической структуры тАЬ 15ЕУЦ показала, что на участке контакта с антителом в тяжелой цепи содержится множество отрицательно заряженных остатков (Ό52, Ό55, Е99, Ό106 и Ό109). Таким образом, в распознавании тАЬ 15ЕУЦ и ТЬК3, по всей вероятности, участвуют положительно заряженные остатки. Имитации белок-белковой стыковки выявили хорошую комплементарность антитела и двух больших участков ТЬК3 с множеством положительно заряженных остатков. При симуляции взаимодействия ТЬК3 с антителом против ТЬК3 были выявлены остатки на ТЬК3, участвующие в этом взаимодействии: К64, К182, К416, К467, Υ468, К488, К489 и К493.
Исследования с помощью мутагенеза. С помощью единичных и комбинированных точечных мутаций изменяли поверхностные остатки внеклеточного домена ТЬК3 в участках, которые, как было установлено выше, формировали эпитопы тАЬ 12 и тАЬ 15ЕУЦ и проверяли способность полученных мутантных белков к связыванию антител.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 1-703 человеческого ТЬК3 (ЕСГО), (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4; ΟеηΒаηк номер доступа ΝΡ_003256) клонировали согласно стандартным протоколам. Все мутанты создавали способом сайт-направленного мутагенеза с помощью набора реагентов Цшскскапде II ХЬ (81га1адепе, Сан-Диего, Калифорния) в соответствии с протоколом производителя и с использованием олигонуклеотидов, показанных в табл. 5а. Мутации идентифицировали секвенированием ДНК. Белки экспрессировали под контролем СМУ-промотора, присоединяя к С-концу гистидиновый хвост (Н1к-1ад), в клетках линии НЕК293 и очищали в соответствии с описанием в примере 1.
Количественная оценка связывания. Активность связывания тАЬ 12ЦУЦ/Ц8У и тАЬ 15ЕУЦ с человеческим ТЬК3 и его искусственными вариантами оценивали с помощью ИФА. Чтобы ускорить процесс, мутантов в предсказанном участке связывания тАЬ 15ЕУЦ коэкспрессировали в клетках НЕК, осуществляя котрансфекцию мутантного ТЬК3 ЕСГО содержащего гистидиновый хвост на С-конце, с тАЬ 12ОУО/О8У, а затем очищали металл-аффинной хроматографией. Полученный образец представлял собой комплекс мутанта ТЬК3 с тАЬ 12. Данный способ пригоден потому, что участки связывания тАЬ 12ЦУЦ/Ц8У и тАЬ 15ЕУЦ расположены вдали друг от друга, и, таким образом, точечные мутации в одном сайте вряд ли повлияют на эпитоп другого сайта. Эти комплексы использовались при исследовании связывания методом ИФА. В лунки планшета Μ8Ό ШдкВшб (Меко 8са1е Ойсоуегу, Гейтерсбург, Мэриленд) вносили по 5 мкл раствора ТЬК3 ЕСГО дикого типа или мутантных белков в ФБР (20 мкг/мл). Планшеты инкубировали 60 мин при комнатной температуре, а затем вносили блокирующий раствор А Μ8Ό (Меко 8са1е 01ксоуегу, ОаккегкЬигд, ΜΌ). В табл. 5а показаны последовательности смысловых олигонуклеотидов. При реакции мутагенеза использовали антисмысловые олигонуклеотиды с комплементарными последовательностями.
- 32 021512
Таблица 5а
Вариант Олиго 5еч Ю N0:
Р64Е 5' ССГГАСССАГААГбААСТСбАбАбАТТАССАбССбССААС 3' 136
К182Е 5'СААбАССТТСТАТГАТСАААСААТСАСАТТСААССССТАААААСТбААС 3' 137
К416Е 5' ССТГАСАСАТАСТСААССТААСССАСААТААААТСТСАААААТАС 3' 138
К467Е/ Ϊ468Α 5' САААТСТАТСТТТССТАСААССАСбСССТССАбСТСАСТАССААСТС 3' 139
8488/ 5' 140
8489/ К493Е ЗССТТСААСОАСТбАГССТССАССАССТбССССТГбАСААТбТССАТАССТСТССТТС 3'
Г4725/ 8473Т/ N4745 5' СТАССТССАССТСТСТАССАССТССТТТСССТТССТССС 3' 141
Ν196Α 5' СААСААСТССАТАТСТТТСССССТТСАГСТТТАААААААТТАСАСТТС 3' 169
2167А 5' ОТСАГСТАСААААТТАССААСТССОСТТСАССТССААААГСТСС 3 ' ПО
К163Б 5' СТСАГААГСССТТСТСАТСТАСАСААТТАббААСТСАбСГТСАСС 3' 171
К147Е 5' СААААТТАААААТААТСССТТТСТСААССАССАСААТТТААТСАСАТТАбАТСТСГС 3' 172
К145Е 5' СААААТТАААААТААТСССТТТ6ГССАССА6ААСААТТТААТСАСАТТАС 3' 173
У144А 5' СА6ААААГТАААААТААТСССТТГССААА2САСААСААТГТААТСАСАТТАС 3' 174
Ν140Α 5' ССААСТСААТССАбААААТТАААОСТААТСССГТТСТСААбСАбААб 3' 175
ϋΐιβκ 5' СААГСАССТАТСГСААСТТТСТСбТААААССТГТСССТТСТбСАС 3' 176
□536К 5' СТСГТСАСАААСГАСАААТТСТСААСТТССАССАТААСААСТТАССАС 3' 177
Э536А 5' СТТСАСАААСТАСАААТТСТСССАТТ0САССАТААСААСТТА6САС 3' 178
Х619Е 5' СТАААСТСАТТбААССТТСАбСАСААТСТСАГААСАТССОТТС 3' 179
К619А 5' СТСТАААСГСАГТСААССТГСАССССААГСТСАТААСАТСССТТСАС 3' 180
Е570К 5' ССАСАТССГТААСТТСАССГССААССССГТТСАССАС 3' 181
Ν541Α 5' ОАААТТСТССАТТТССАССАТААСОССГТАССАССССТСТССАААС 3' 182
2538А 5' 6А6АААСГА6АААТТСТС6АТТТС6С6САТААСААСТТА6САС6СС 3' 183
Н539Б 5' СТАСАААТТСТССАТТГССАССААААСААСТТАССАССССТСТб 3' 184
Н539А 5’ СТАСАААТТСТССАТТГССАСССГААСААСТТАССАССССТСТС 3' 185
Ν517Α 5' САТТСТССАТСТААССААСААССССАТАСССААСАТАААТОАТОАС 3' 186
У465А 5' СААААТАТТТТССАААТСТАТСТТТСССССААСАА0ТАССТССА5СТ6АС 3' 187
8488Е 5' СССТТСААСбАСТСАГССТССАААСССТСеСССТТАААААТС 3' 188
К489Е 5' СТТСААСбАСТСАТССТСССАОАОбТОССССГТАААААТОТОС 3' 189
К467Е 5' ССАААТСТАТСТГТССТАСААССАСТАССТССАССТСАСТАС 3' 190
На следующий день планшеты промывали и добавляли меченые Μ8Ώ 8и1Го-1а§ тАЬ 15ЕУ^ в концентрациях от 500 до 1 пМ на 1,5 ч. После промывки для обнаружения меченых антител использовали буфер Μ8Ώ Кеай Вийег Т и измеряли планшеты на приборе 8ЕСТОК 1та§ег 6000. Для оценки активности связывания тАЬ 12^V^/^8V с человеческим ТЬК3 и его вариантами осуществляли совместную экспрессию с тАЬ 15ЕV^, оценивали связывание с помощью ИФА, как было описано для тАЬ 15ЕV^, но детектирующие антитела метили тАЬ 12^V^/^8V.
тАЬ 12^V^/^8V. Как было определено в исследованиях с заменой сегмента, участок связывания с тАЬ 12^V^/^8V располагался в пределах аминокислотной последовательности 1-209 человеческого ТЬК3. Были проанализированы следующие ТЬК3 мутанты: О116К, Ы196А, Ы140А, У144А, К145Е, К147Е, К163Е и ^167А. ТЬК3 дикого типа и мутант У144А связывались с тАЬ 12^V^/^8V с приблизительно одинаковой активностью (фиг. 6А). Антитело не связывалось с мутантным ТЬК3 О116К, и аффинность связывания с мутантом К145Е была значительно меньше. Таким образом, было определено, что близко стоящие остатки Ώ116 и К145 на поверхности ТЬК3 являются ключевыми фрагментами эпитопа для тАЬ 12^V^/^8V (фиг. 7А).
Два критических остатка тАЬ 12^V^/^8V, связывающиеся с эпитопом, располагались вблизи поверхности участка связывания двухцепочечной РНК на Ν-конце эктодомена ТЬК3 (РнЪег е! а1., Ыа1иге 81гас1. & Мо1. Вю1., 15:761-763, 2008). В состав полного эпитопа будут входить и другие остатки, относящиеся к соседним участкам, не выявленные мутационным анализом. Не вдаваясь в конкретную теорию, считается, что связывание тАЬ 12^V^/^8V с соответствующим эпитопом на ТЬК3 может прямо или косвенно препятствовать связыванию двухцепочечной РНК с эктодоменом ТЬК3, из-за чего нарушается димеризация рецептора и активация следующих сигнальных путей.
тАЬ 15ЕV^. Анализу подверглись следующие мутанты ТЬК3: К64Е, К182Е, К416Е, У465А, К467Е, К488Е, К489Е, И517А, О536А, О536К, р538А, Н539А, Н539Е, И541А, Е570К, К619А, К619Е, двойной мутант К467Е/У468А, тройной мутант Т4728/К473Т/И4748 и тройной мутант К488Е/К489Е/К493Е. ТЬК.3 дикого типа, мутанты К64Е, К182Е, К416Е и тройной мутант Т4728/К473Т/И4748 продемонстрировали сопоставимую активность связывания с тАЬ 15ЕV^ (фиг. 6В и табл. 5Ь). Антитело не связывается с мутантами ТЬК3 К467Е, К489Е, К467Е/У468А и К488Е/К489Е/К493Е (фиг. 6В и 6С). У остальных вариантов белка активность связывания была средней в сравнении с наибольшей активностью К488Е. Все эти мутанты связываются с тАЬ 12^V^/^8V. Эти результаты говорят о том, что остатки К467 и К489 были критическими детерминантами эпитопа тАЬ 15ЕV^. Остаток К488 также является частью эпитопа. Эти остатки находились близко друг от друга на той же поверхности ТЬК3 (фиг. 7А). Полученные результаты продемонстрировали также, что остатки
- 33 021512
Υ465, Υ468, N517, И5З6, О5З8, Н5З9, N541, Е570 и К619, расположенные на той же поверхности, что и К467, К488 и К489, также являются частью эпитопа. Этот вывод был в дальнейшем подкреплен исследованиями по замене Η/О в шЛЬ 15Εν(). На фиг. 7А показаны участки связывания эпитопа шЛЬз Ι2ωνω'ω^ν и 15Ενρ (черным) и С1068 тАЬ (серым), наложенные на структуру человеческого ТЬКЗ. Эпитоп для тАЬ 15Ενφ охватывает остатки Υ465, К467, Υ468, К488, К489, N517, И5З6, О5З8, Н5З9, N541, Е570 и К619.
Исследования с заменой Η/О. При замене Η/О методики, используемые для анализа возмущений антителами, были аналогичны описанным ранее (Иатиго е! а1., I. Бюто1. Тесйшциез 14:171-182, 200З; Ηοτπ е! а1., ВюсИетЫту 45:8488-8498, 2006) с некоторыми модификациями. Рекомбинантный ТЕКЗ ЕСТ) (экспрессированный из клеток 819 с гистидиновым хвостом на С-конце и очищенный) инкубировали в растворе на основе дейтерированной воды в течение указанного периода времени, при этом в него внедрялся дейтерий, замещающий атомы водорода. Дейтерированный ТЬКЗ ЕСТ) отделяли на колонке, содержащей иммобилизованные тАЬ 15Εν(φ и промывали буферным водным раствором. Затем белок ТЬКЗ ЕСТ) элюировали с колонки и - после обработки протеазами - определяли местоположение дейтерий-содержащих фрагментов с помощью масс-спектрометрического анализа. Используемый в качестве эталона образец ТЬКЗ ЕСТ) был обработан тем же способом, но с дейтерированной водой его выдерживали после иммобилизации на колонке с антителами, а затем промывали и элюировали так же, как экспериментальный образец. Предполагалось, что областями, связанными с антителом, являются участки, относительно защищенные от обмена дейтерия на водород и, следовательно, содержащие больше дейтерия, эталонный образец ТЬКЗ ЕСТ). Около 80% белка можно было картировать относительно специфических пептидов. Карты замен Η/Ό при возмущении ТЬКЗ ЕСТ) антителами тАЬ 15Εν() показаны на фиг. 7В. Для ясности изображен только сегмент ТЬКЗ вблизи участка, подвергшегося воздействию тАЬ 15Εν(). Оставшиеся части белка ТЬКЗ ЕСТ) дальше к N и С-концу практически не были затронуты.
В исследованиях с заменой Η/О были идентифицированы пептидные сегменты 465УЫКУТ0Т471, 51,|8ННН1ДН1НГ)Г)МЕ526 и 529ТЕКТ5з2 8Еф II) N0: 2, которые являлись участками, где ТЬКЗ особенно сильно изменился при связывании с тАЬ 15Εν(). По своей природе замена Η/О является способом линейного картирования, и обычно с помощью этого способа нельзя определить, какие остатки пептидного сегмента в большей степени затронуты связыванием антитела. Однако значительное совпадение результатов исследований с заменой и мутациями дает дополнительные доказательства того, что показанная на фиг. 7А поверхность является участком связывания тАЬ 15Εν(). Этот участок связывания находится в том же участке последовательности аминокислот, что и участок, описанный выше для тАЬ с1068 (публикация РСТ N0. νθ 06/06051ЗА2), но который был обнаружен на неперекрывающейся поверхности (фиг. 7А), что согласуется с данными об отсутствии перекрестной конкуренции между этими антителами.
Эпитоп, с которым связывается тАЬ 15Εν(φ располагается проксимальнее участка связывания двухцепочечной ДНК на С-конце ТЬКЗ (Ве11 е! а1., Ргос. №11. АсаТ 8с1. (И8А) 10З:8792-8797, 2006; КапΙΐΐΐι-Китаг е! а1., I Вю1 Сйет, 282:7668-7678, 2007; Ыи е! а1., Зиепсе, З20:З79-З81, 2008). Без связи с какой-либо теорией считается, что при связывании тАЬ 15Εν() с его эпитопом ТЬКЗ возникает стерическое столкновение с молекулой лиганда двухцепочечной РНК и/или с димером-партнером, то есть становятся невозможными связывание лиганда и лиганд-индуцированная димеризация рецептора.
Т аблица 5Ь
- З4
Пример 7
Синтез вариантов с повышенной термостабильностью
Для создания вариантов антител с повышенной термостабильностью и с одновременным сохранением биологической активности и минимизацией иммуногенности применялись способы структурной инженерии.
Для инженерии выбрали тАЬ 15Εν(). С целью минимизации иммуногенности вызывали мутации только гаметического типа, которые, на основании данных о структуре, могли быть полезными. В результате поиска ВЕА8Т установили, что человеческим генам гаметического типа соответствовали νί, и νΗ последовательности тАЬ 15Εν() (8Е() ΙΌ N0: 41 и 8Е() II) N0: 216 соответственно). Наиболее близкородственными последовательностями гаметического типа были последовательности СепВапк Асс. № ААС09093 и Х59318 для νΗ и νΕ соответственно. Между νΗ и νΕ гаметического типа и УН и УЬ последовательностями тАЬ 15Εν() были обнаружены следующие отличия: (νΗ) ν34Ι, 0358, Р50Е, А61З и ()6711: (νΕ) 0308, 1.318 и А34№ Выявленные отличия в последовательности нанесли на карту кристаллической структуры тАЬ Οίνο и выбрали для инженерии те остатки, которые предположительно могли изменить упаковку и интерфейс взаимодействия. Остатки идентифицировали на основании кристаллической структуры антитела (см. пример 6). (1) В сердцевине νΗ вблизи ν34 была обнаружена небольшая ограниченная полость. Эта полость была достаточно велика, чтобы вместить немного большую боковую цепь, например, Не. (2) Е99 в νΗ С1Ж3 был погружен в поверхность соприкосновения νί Ι/νΐ, без сети водородных связей. Отрицательно заряженная карбоксилатная группа Е99 в практически гидрофобном окружении была связана с соседними остатками преимущественно вандерваальсовыми (вдв) связями. Погружение заряженной группы обычно является энергетически невыгодным и оказывает дестабилизирующее действие. (3) Р50 νΗ - это остаток в составе νί Ι/νΐ, интерфейса. У него объемистая ароматическая боковая цепь, которая может, таким образом, отрицательно влиять на процесс конъюгации. Образование водородных связей и вдв в Ρν были просчитаны и визуально проверены в Руто1 (тегете://_руто1_огд). Погруженные полости в νΗ и νΕ доменах были просчитаны с помощью программы Сатег (Ре!гек е! а1., ВМС ВютЕоттайсз, 7:316, 2006). Вся молекулярная графика создавалась в Руто1. Мутации в векторах экспрессии, кодирующих фрагменты РаЬ или 1дО4 полностью человеческих антител, созданных в соответствии с методикой, описанной в примере 3, вносили с использованием стандартных способов клонирования с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза ()шск СИапде II XI, (81та1адепе, Сан-Диего, Калифорния), СИапце-ГГ Ми1йр1е Ми1а1юп 8ке 1)1гес1еЗ Ми1ацепез1з Κϊί (И8В Согротайоп, Кливленд, Огайо) или набора для сайт-направленного мутагенеза ()шск СИапде II (81та1адепе, Сан-Диего, Калифорния). Реакции проводили в соответствии с рекомендациями соответствующего производителя. Полученные клоны секвенировали для подтверждения, и полученные искусственные варианты обозначали как тАЬз 15-1 - 15-10 в соответствии с модифицированной легкой или тяжелой цепью. Каждый вариант цепи (Н или Ь) экспрессировался с диким типом I, или Н цепи тАЬ 15Εν() для получения антител тАЬ 15-10, за исключением того, что тяжелая цепь для тАЬ 1501- была из тАЬ 15-6. Список 8Е() ГО N0: относительно СЭЕ, вариабельные области легкой и тяжелой цепей и полная длина тяжелой и легкой цепей тАЬ 15Εν() и их искусственных вариантов показаны в табл. 6. В табл. 7 показаны праймеры для получения каждого варианта.
Таблица 6
Связывание тАЬ 15-1 - 15-9 с ТЕЕ3 количественно оценивали с помощью ИФА. ЕС1) человеческого ТЕЕ3 (100 мкл ТЕК3-ЕС1) при концентрации 2 мкг/мл) иммобилизовали на черных планшетах МамзогЬ (еВС озиепсе) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали и блокировали, растворенные антитела наносили порциями по 50 мкл в каждую лунку по два раза. Осторожно встряхивая, планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Связывание обнаруживали с помощью люминесцентного субстрата Р0Э (ЕосИе АррПеЗ 8с1епсе, Маннхейм, Германия, кат. № 11582950001) и козьих античеловеческих Рс:ПЕР (1аскзоп IттипοЕезеа^сй, Вест Гроув, Пенсильвания, кат. № 109-035-098), планшет помещали в планшетный фотометр 8рес!гаМах (Мо1еси1аг Эетюез, Саннивейл, Калифорния) и проводили анализ.
Эксперименты с дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК) проводили на МюгоСаГз Аи!о VР-капиллярной системе для ДСК (МтсгоСа1, ЕЕС, Нортгемптон, Массачусетс), в которой температурные различия между эталонными и опытными лунками непрерывно измерялись и калибровались по блокам пита- 35 021512 ния. Образцы нагревали с 10 до 95°С со скоростью нагрева 60°С/ч. Время до сканирования составляло 15 мин, период фильтрования 10 с. Концентрация при ДСК-экспериментах составляла приблизительно 0,5 мг/мл. Анализ полученных термограмм проводили с помощью программного обеспечения МюгоСа1 Опшп 7 (МютоСа1, ЬЬС).
Таблица 7
Кандидат Я·: Мутанты Праймеры 5Е0 Ю N0:
15-1 НС: Г50К ЗССТСЗАСТССАТСССССССАТССАССССАОСС 142
СССТССССТССАТСССОСССАТССАСТССАЗСС 143
15-2 НС: 57341 АСАССГААСТССССТТСССС 144
ЗСАТСТСССЗСАСССАССССАТССАСТАСТТССТСААС 145
15-3 НС: У341/О353 АСАССГААСТССССТТСССС 146
ЗСАТСТСССССАСССАССТСАТССАСТАСТТССТСААС 147
15-4 НС: А615/067Н АСАССГААСТССССТТСССС 144
СССТСАТССТСАССТСССССТССААССТАССССГСТАСТТССГСТАС 148
15-5 НС: Г50К/У341/ С355/ А615/067Н 2ТТСАССААСТАСТССАТСАССТСССГСС6ССАСАТСС 149
СССТСАТССТСАССТСССССТССААССТАСООСТСТАСТТССГСТАС 148
15-6 НС: У341/3353/ Е99О ЗСССАТЗТАСТАСТСССССССССАССГСТАССА66ССТАС 150
ЗТАССССТССГАСАЗСТСССССССССАСТАСТАСАТСССС 151
15-7 ЬС: С303/Ь315 ЗССАСССАСАССАТСАССАССГАССТССССТССТАССАСС 152
ЗСТССТАССАССССАССТАССТССТСАТССТСТСССТССС 153
15-8 ЬС: Α34Ν АСАССГААСТССССТТСССС 144
ЗЗСССТТСТЗСТССТАССАСТТСАССТАССТССТСАТССТСТС 154
15-9 НС: Е50К/У341/ С355 /А615/067Н/ Е990 ССССАТСТАСТАСГСССССССССАССТСТАССАССССТАС 150
ЗТАССССТССГАСАЗСТСССССССЗСАСТАСТАСАТСССС 151
15-10 ЬС: 595Р САССССААСАСССТССССТАСАССТТС66ССАС 228
СТСССССААССТСТАЗСССАСССТСТТССССТС 229
Термостабильность (Тт) созданных вариантов измеряли с помощью ДСК (табл. 8). Связывание вариантов антител с ТБК3 было сопоставимым со связыванием исходного антитела.
Таблица 8. Краткий обзор температур плавления (Тт) вариантов и обоснование для их получения
Кандидат Ν': Мутации Обоснование ТМ (°С) ΔΤΜ (°С)
15ЕУ0 ΝΤ 64, 7 0
15-1 НУ Ε50Κ поверхность соприкосновения УН/УЬ 69,3 4,6
15-2 ну У341 упаковка ядра 57Н 66,9 2,2
15-3 Ην У341/С355 водородная связь, упаковка ядра УН 71,2 6,5
15-4 Ην Α615/067Η Упаковка УН/УЬ, поверхностный заряд УН 65, 4 0,7
15-5 Ην Γ50κ/ν34Ι/ С355/ Α613/067Η Поверхность соприкосновения УН/УЬ, водородные связи, сердцевина УН 76,2 11,5
15-6 Ην У341/С343/ Ε99Ο Водородные связи, упаковка сердцевины УН, удаление 75 10,3
15-7 ЬУ С305/Ь315 поверхностные полярные остатки ь- СОК1 63,1 -1,6
15-8 ЬУ Α34Ν взаимодействие УЬ/УН 64 -0,7
15-9 Ην Е50КА/341/ С355/ А613/067Н/ Ε990 Поверхность соприкосновения УН/УЬ, водородные связи, сердцевина УН 76 11,3
15-10 ьу 595Ρ Стабилизация канонической структуры 76, 6 11,9
Пример 8
Создание суррогатного антитела против ТБК3
Было получено химерное антагонистическое крысиное/мышиное антитело против мышиных ТБК3, называемой здесь тАЬ 5429, для изучения эффектов ингибирования сигнального пути ТБК3 т у1уо, поскольку гуманизированные антитела, полученные в примере 1, не обладали достаточной специфичностью или антагонистической активностью в отношении мышиного ТБК3. Суррогатное химерное тАЬ 5429, как и родительское крысиное антитело к мышиному ТБК3 с1811, подавляло сигнальный путь ТБК3 уйго и т у1уо и облегчало патогенные механизмы при нескольких экспериментально индуцированных заболеваниях у мышей.
Данные, которые обсуждаются ниже, наводят на мысль о роли ТБК3 в индукции и поддержании патологического воспаления и частично обосновывают терапевтическое применение антагонистов ТБК3 и антител-антагонистов ТБК3, например, при острых и хронических воспалительных заболеваниях, в том числе при гиперцитокинемии, астме и воспалении дыхательных путей, воспалительных заболеваниях пищеварительного тракта и ревматоидном артрите, вирусных инфекциях и сахарном диабете ΙΙ типа.
- 36 021512
Создание суррогатного тАЪ 5429
СО крыс иммунизировали рекомбинантным мышиным эктодоменом ТЬК3 (аминокислоты 1-703 §Е0 ГО N0: 162, ΟеηВаηк Асс. N0. Ж_569054), созданным обычными способами. Лимфоциты двух крыс, демонстрировавшие титры антител, специфичных к мышиному ТЬК3, сливали с Р0 миеломными клетками. Идентифицировали ряд моноклональных антител, реагирующих с мышиным ТЬК3, и проверили их эффективность в качестве антагонистов ίη νίίτο путем количественных измерений с мышиным люциферазным репортером и мышиными эмбриональными фибробластами. Для дальнейшей работы выбрали гибридомную линию С1811А. Функциональные гены вариабельного участка тАЪ с1811, секретируемого гибридомой, секвенировали. Затем клонированные гены вариабельных участков тяжелой и легкой цепи вставляли в плазмидные векторы экспрессии, что позволило получить кодирующие последовательности для создания химерного Ка1/Ва1Ь С ти1дО1/ тАЪ, созданного как и тАЪ 5429, с помощью рутинных методов. Антитела экспрессировались, как описано в примере 3. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей тАЪ 5429 показаны соответственно в §Е0 ГО N0:164 и §Е0 ГО N0: 163, а полные последовательности тяжелой и легкой цепей показаны в §Е0 ГО N0:166 и §Е0 ГО N0: 165 соответственно. Полные последовательности тяжелой и легкой цепей тАЪ с1811 показаны соответственно в §Е0 ГО N0: 168 и §Е0 ГО N0: 167.
Характеристика тАЪ 5429
Способность тАЪ 5429 к нейтрализации сигналов ТЬК3 охарактеризовали в ходе анализов ίη νίίτο. Анализ и результаты активности описываются ниже.
Анализ мышиного люциферазного гена-репортера кДНК мышиного ТЬК3 (§Е0 ГО N0: 161, ΟеηВаηк Асс. Ж: NМ_126166) амплифицировали методом ПЦР из кДНК селезенки мыши (ВО Вю8с1Спсс8, ВеДЕнТО МА) и клонировали в вектор рСЕР4 (ИГОе ТесЬηο1οд^еδ, Саг81ЪаД, СА) стандартными методами. 200 мкл Клеток НЕК293Т вносили в 96-луночные планшеты с белым прозрачным дном при концентрации 4 х 104 клеток на лунку в полной модифицированной среде Игла и на следующий день брали для трансфекции с использованием липофектамина 2000 (Iην^ί^οдеη Согр^ Саг81ЪаД, СА) и 30 нг рЖ-кВ люциферазы светлячка ^раиде^, §аη ^^едο, СА) или 30 нг р1§КЕ люциферазы светлячка (ВО Вю8с1Спсс8, ВеДЕнТО МА), 5 нг рЬКЬ-ТК контрольной люциферазы Кет11а (Рготеда Жгр., ΜΗάίκοιι VI) репортерных плазмид, 1,5 нг СЕР4, кодирующий полную длину мышиного ТЬК3, и 13,5 нг пустого вектора плазмидной ДНК 3.1 (Ше ТесЬηο1οд^е8, Саг81ЪаД, СА) до общего количества ДНК 50 нг/лунку. Через 24 ч после трансфекции клетки инкубировали от 30 мин до 1 ч при 37°С с антителами против мышиного ТЬК3 в свежей полной бессывороточной среде Игла перед добавлением 0,1 или 1 мкг/мл поли(1:С). Через 24 ч планшеты измеряли с помощью системы для анализа люциферазы НиаБО^ (Рготеда, Мэдисон, Висконсин). Количество относительных световых единиц измеряли с помощью мультиридера ЕЕи081аг 0РТ1МА с программным обеспечением 0РТ1МА (ВМО ЬаЪ1есН ОтЪН, Германия). Нормализованные уровни (люциферазные отношения) получали путем деления относительных световых единиц (КЕИ) со светлячковыми люциферазами на КЕИ КенШа. тАЪ 5429, а также его родительские тАЪ с1811 и тАЪ 15 (табл. 3 а) уменьшали индуцированную поли(1:С) активацию Ж-кВ и пропорционально дозе (фиг. 8А и 8В), что доказывает их способность быть антагонистами ТБК3. Измеренные в ходе анализа 1§КЕ 1С50 составляли соответственно 0,5, 22 и 0,7 мкг/мл для тАЪ 5249, тАВ 15 и тАЪ с1811 соответственно.
Анализ с использованием мышиных эмбриональных фибробластов (МЕР)
Клетки С57ВЬ/6 МЕР получили из компании АгР8 0рРти8 (0рР-МЕР™ С57ВЬ/6 - 0001). Клетки помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (ВО Ра1сοη) в количестве 20000 клеток/лунку в 200 мкл среды МЕР ГОМЕМ с глутамаксом, 10% инактивированных нагреванием РВ§, 1х ЖАА и 10 мкг/мл гентамицина). Инкубацию во всех случаях проводили при 37°С/5% СО2. Через 24 ч в лунки планшетов добавляли тАЪ 5429 или тАЪ с1811. Планшеты инкубировали с тАЪ в течение 1 ч, после чего в каждую лунку добавляли поли(1:С) при концентрации 1 мкг/мл. Супернатанты собирали после 24 ч инкубации. Концентрацию цитокинов определяли с помощью набора бусин (Iην^ί^οдеη Согр., Карлсбад, Калифорния) для обнаружения СХСБ10/1Р-10 согласно протоколу производителя. Результаты представили в виде графиков, созданных с помощью программного обеспечения ОгарТРаД Рп8т. Оба антитела уменьшали индуцированные поли(1:С) концентрации СХСБ10/1Р-10 в зависимости от дозы. Это показывает, что такие антитела могут быть антагонистами эндогенных ТБК3 и могут ингибировать сигналы ТБК3 (фиг. 9).
Проточная цитометрия - поверхностное окрашивание
Нокаутные мыши по гену С57ВЬ/6 и ТБК3 (ТБК3К0) (С57ВЬ/6 фон; самки, 8-12 недель, Асе Ашта18, 1пс.), по 10 животных в группе, получали внутрибрюшинно дозу в 1 мл 3% тиогликолевой среды (§1дта), через 96 ч мышей подвергали эвтаназии и брюшину каждой мыши промывали 10 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. Извлеченные тиогликолевой средой брюшинные макрофаги ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере, затем оценивали жизнеспособность клеток с помощью окрашивания Трипановым синим. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 250 мкл буфера РАС§ (ФБР -Са2+-Мд2+, содержащий 1% инактивированного нагреванием РВ§ и 0,09% азида натрия) и хранили
- 37 021512 на льду. Для блокирования Рс-рецепторов на макрофагах применяли реагент СЭ16/32 (еВюкиепсе) в концентрации 10 мкг/106 клеток в течение 10 мин. Клетки в концентрации 106 клеток вносили аликвотами по 100 мкл/лунку для поверхностного окрашивания. Конъюгированные с А1е\а-Р11юг 647 (молекулярные зонды) тАЬ с1811 и тАЬ 1679 (крысиные антитела против мышиного ТЬР3, не специфичные по отношению к ТЬР3, используются в качестве изотипического контроля) добавляли в концентрации 0,25 мкг/106 клеток и инкубировали на льду в темноте в течение 30 мин. Клетки промывали и ресуспендировали в 250 мкл буфера РАС§. При окрашивании для оценки жизнеспособности 7-ΆΛΌ (ΒΌ Вюкиепсек, Веййгй, МА) добавляли в концентрации 5 мкл/лунку не более чем за 30 мин до исследования образцов на РАС§ СаНЬиг, что позволяло выявить мертвые клетки. Образцы собирали с помощью РАС§ СаНЬиг, применяя программное обеспечение Се11 Оиек1 Рго. Для анализа собранных данных путем построения гистограмм применяли РС§ Ехргекк.
Связывание тАЬ с1811 с мышиными брюшинными макрофагами (полученными с помощью тиогликолевой среды) из С57ВЬ/6 и Т^Р3КΟ мышей оценивали способом проточной цитометрии для оценки специфичности связывания. тАЬ 5429 при таком количественном определении не использовали, так как мышиный Рс участок этого химерного антитела предположительно участвует в неспецифическом связывании. тАЬ с1811 не связывался с макрофагами Т^Р3КΟ и увеличивал связывание с поверхностью клеток С57ВЬ/6 брюшинных макрофагов, что говорит о специфичности тАЬ по отношению к ТЬР3 (фиг. 10). тАЬ 5429 с теми же участками связывания, что и у тАЬ с1811, предположительно обладает такой же специфичностью при связывании, как и тАЬ с1811.
Пример 9
Антитела-антагонисты ТЬР3 защищают от опосредованного ТЬР3 системного воспаления
Модель
В качестве модели опосредованного ТЬР3 системного воспаления использовали индуцированную поли(РС) системную цитокин/хемокиновую модель. В этой модели поли(РС) (РIС), введенный внутрибрюшинно, индуцировал системные цитокиновый и хемокиновый ответы, которые были частично опосредованы ТЬР3.
Самки мышей С57ВЬ/6 (8-10-недельные) или самки мышей Т^Р3КΟ (С57ВЬ/6 фон; 8-10недельные, Асе Атта1к, Ιικ.) получали подкожно: тАЬ 5429 в концентрации 10, 20 или мг/кг в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, тАЬ с1811 - в концентрации 2, 10 или 20 мг/кг в 0,5 мл ФСБ или 0,5 мл ФСБ (контроль с помощью среды). Через 24 ч после введения дозы антител мышам вводили внутрибрюшинно по 50 мкг поли(РС) (АтегкНат кат. №. 26-4732 партия № ΙΗ0156) в 0,1 мл ФСБ. Кровь из глазной орбиты собирали через 1 и 4 ч после инъекции поли(РС). Сыворотку получали из цельной крови и определяли в ней концентрации цитокина и хемокина с помощью Бипипе\.
Результаты
Поли (РС) при внутрибрюшинном введении индуцировал системный цитокиновый и хемокиновый ответ, который был частично опосредован ТЬР3, как было доказано по значительно уменьшившемуся синтезу ряда цитокинов и хемокинов у животных Т^Р3КΟ (табл. 9А). Зависимыми от ТЬР3 индуцированными поли(РС) медиаторами служили ГО-6, КС, ССБ2/МСР-1 и ГОР-«. через 1 ч после инъекции поли(РС) и ГО-1, ССЬ5/РАетЕ§ и Т>-«. через 4 ч после инъекции поли(РС). Как тАЬ с1811, так и тАЬ 5429 значительно снижали концентрации этих ТЬР3-зависимых медиаторов, что доказывает способность антител уменьшать количество сигналов с ТЬР3 ш νίνο (табл. 9В). В табл. 9 указаны средние концентрации цитокина и хемокина (пг/мл) у шести животных на группу ± станд. ошибка среднего. Полученные данные наводят на мысль, что антагонисты ТЬР3 могут найти применение для снижения избыточных концентраций опосредованных ТЬР3 цитокинов и хемокинов при таких состояниях, как цитокиновая буря или смертельный шок.
Таблица 9А
С57ВЬ/6 тькзко
Р1С - + - +
ШАЬ 5429 (гад/кд) - - - -
тАЬ с1811 (тд/кд) - - - -
1 ч обработка Р1С
ГМГсс 6,005±0,32 319,4±34,1* 9,13+4,41 43,80+10,13**
КС 129,3+9,83 2357+491,5* 152,0±21,34 432,3±90,66**
1Ь-б 40,91+5,66 5317+856,7* 120,1+99,99 1214+294,9**
МСР-1 84,67+18,45 694,6+127,8* 67,85+34,16 249,9+55,60**
4 ч обработка Р1С
ΙΕ-Ια 28,21±17, 78 796,7+45,0* 13,94+13,84 408,5+29,91*·
ΚΑΝТЕ5 20,87+1,738 4511±783,4* 36,01+4,484 706,3±84,36**
ΤΝΓα 0,10±0 561,7+81,84* 3,215±3,115 305,8+53,63**
*р<0,001 Однофакторный дисперсионный анализ для С57ВБ/6 ФБР **р<0,001 Однофакторный дисперсионный анализ для С57ВБ/6 РГО
- 38 021512
Таблица 9В
С57ВБ/6
рю + + + + + +
тАЬ 5429 (гад/кд) 50 20 10 -
тАЬ С1811 (гад/кд) - - - 20 10 2
1 ч обработка РТС
таг-а 29,33+ 3,76*** 31,05+ 1,59*** 59,55+ 12,71*** 32,54+ 3,89*** 42,22+ 7,04*** 42,61+ 10,58***
КС 466,3+ 92,35*** 440,3+ 10,01*** 744,6+ 103,1** 637,3+ 151,0*** 944,2+ 130,9** 919,3+ 231,2**
1Ь-6 480,2+ 62,88*** 375,9± 46,14*** 705,2± 149,8*** 739,2+ 113,3*** 1047± 222*** 1229+ 378,4***
МСР-1 168,5± 15,04** 321,6+ 206, 7 219,2+ 70,58* 184,0+ 14,92** 278,3+ 53,57 414,9+ 97, 17
4 ч обработка РТС
1Ь-1а 343,0+ 33,01*** 452,6± 94,86** 481,1+ 121,0* 354,8+ 45,43*** 351,7+ 68,85*** 352,4+ 39,60***
ΚΑΝΤΕ2 1381+ 169,7*** 2439+ 308, 7** 1601 + 398,9*** 1303 + 168,0*** 1365+ 474,1*** 2209+ 402,5**
ΤΝΓ-α 100,1+ 8,5*** 205,1± 41,85*** 226,1± 64,72*** 138,9+ 26,0*** 121,6+ 38,85*** 223,8+ 47,74***
***р<0,001, **р<0,01, *р<0,05: Статистические данные однофакторного дисперсионного анализа сравнивали с группой С57ВБ/6 + Р1С
Пример 10
Антитела-антагонисты ТЬК3 снижают гиперчувствительность дыхательных путей
Модель
Гиперчувствительность дыхательных путей индуцировали поли(1:С).
Самок мышей С57ВЬ/6 (12-недельных) или самок мышей ТЬК3КО (С57ВЬ/6 фон; 12-недельные, Асе Атта1з, 1ис.) анестезировали изофлураном и вводили им интраназально несколько доз (10-100 мкг) поли(1:С) в 50 мкл стерильного ФСБ. Мышам трижды вводили поли(1:С) (или ФСБ) с 24-часовым периодом отдыха перед каждым введением. Через 24 ч после последнего введения поли(1:С) (или фосфатносолевого буфера) измеряли функцию легких и гиперреактивность дыхательных путей к метахолину методом плетизмографии всего тела (система ВиХСО). Мышей помещали в камеру для плетизмографии всего тела и позволяли привыкнуть к обстановке в течение 5 мин. После определения исходных показателей мышам давали увеличивающиеся дозы распыленного метахолина ^дта, Сент-Луис, Миссури). Распыляемый метахолин давали в течение 2 мин, затем в течение 5 мин собирали данные, затем делали 10-минутный перерыв перед последующими увеличивающимися дозами метахолина. Измеряли резистентность к увеличению потока воздуха (улучшенный показатель паузы (Реий)) и представляли в виде среднего значения Реий за 5 мин записи (система ВиХСО). После измерений легочной функции мышь подвергали эвтаназии и канюлировали легкие. Делали инъекцию 1 мл ФСБ в легкие, вытягивали жидкость обратно и получали таким образом смыв с бронхов и легких (БАЛ). Ткани легких вынимали и замораживали. БАЛ центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин), собирали бесклеточные супернатанты и хранили при -80°С до момента анализа. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл ФСБ для подсчета общего количества клеток и отдельных фракций клеток. Мультиплексный анализ проводили в соответствии с протоколом производителя с помощью набора МиШр1ех 1ттииоаззау (МПИроге, Биллерика, Массачусетс).
Результаты
Предшествующие наблюдения показали, что интраназальное введение поли(1:С) индуцировало опосредованное ТЬК3 ухудшение функции легких у мышей при одновременном повышении улучшенного показателя паузы (РеиН) в ходе плетизмографии всего тела (Вихсо) в сравнении с исходным показателем и повышение гиперчувствительности к распыляемому метахолину (индикатору гиперчувствительности дыхательных путей) (публикация РСТ №э. АО 06/060513А2). Такое ухудшение функции легких связано с притоком нейтрофилов в легкие и увеличением уровней провоспалительных цитокинов/хемокинов в легких. В этом исследовании эффект тАЬ 1811 и тАЬ 5429 оценивали при индуцированном поли(1:С) ухудшении функции легких путем подкожного введения каждого из антител в дозе 50 мг/кг перед введением поли(1:С).
Опосредованное ТЬК3 ухудшение функции легких значительно уменьшалось при введении животным антител-антагонистов ТЬК3 перед введением поли(1:С). Опосредованное ТЬК3 повышение исходного РеиН и чувствительности дыхательных путей к метахолину удалось предотвратить у животных, которым вводили антитела против ТЬК3 (фиг. 11). У животных, получивших антитела против ТЬК3, опосре- 39 021512 дованный ТЬК3 приток нейтрофилов в легкие мышей и образование хемокинов в дыхательных путях снижался. Число нейтрофилов (фиг. 12) и уровень СХСЫ0/1Р-10 (фиг. 13) определяли в бронхолегочном смыве. Исследования повторяли по меньшей мере три раза с похожими результатами. Данные, приведенные на фиг. 11-13, получены в одном репрезентативном исследовании. Каждый символ представляет собой один результат по одной мыши, а горизонтальные черточки показывают среднее значение для группы. Исследование показало, что антитела-антагонисты ТЬК3 при системном введении достигают легких, снижая в используемой модели опосредованное ТЬК3 ухудшение функции легких, инфильтрацию нейтрофилами дыхательных путей, образование хемокинов и воспаление дыхательных путей. Таким образом, антагонисты ТЬК3 могут быть полезны при лечении или профилактике респираторных заболеваний, для которых характерна гиперчувствительность дыхательных путей, например, астмы, аллергического ринита, хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и муковисцидоза.
Пример 11
Антитела-антагонисты ТЬК3 защищают от воспалительных заболеваний пищеварительного тракта
Модель
В качестве модели воспалительного заболевания пищеварительного тракта использовали колит, индуцированный ДСН.
Самок мышей С57ВЬ/6 (<8-недельных) или мышей ТЬК3КО (С57ВЬ/6 фон; <8-недельных, массой от 16,5 до 18 г, Асе АпипаЕ, 1пс.) кормили кормом, обученным гамма-лучами, начиная с дня -1. ДСН (декстрансульфат) (МР ВютсбюаИ, Ашота, ОН, кат. №: 160110; 35-50 кДа; 18-20% серы, лот № 82471) разводили в автоклавированной подкисленной питьевой воде до конечной концентрации 5%. Воду с декстрансульфатом давали в течение 5 дней, после чего заменяли ее обычной водой. Воду мышам на протяжении всего исследования давали без ограничений. Каждый день все бутылки с водой взвешивали для учета потребления воды. На 0, 2 и 4 день мышам вводили внутрибрюшинно 5 мг/кг (0,1 мг в 0,1 мл ФСБ) тАЬ 5429, мышиных антител против ΤΝΡ-α или фосфатно-солевой буфер в качестве контроля. За мышами наблюдали ежедневно на протяжении всего исследования и взвешивали их на 0-4 дни и на 7 день. На 2 и 7 дни исследования мышей подвергали эвтаназии. Брюшную полость мышей вскрывали, восходящую ободочную кишку отрезали в месте соединения со слепой кишкой. Отрезки кишки собирали и фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине. Затем отрезки кишки заливали парафином, готовили срезы и окрашивали гематоксилином-эозином (Н&Е) (ЦиаИск Мо1сси1аг ЬаЬк, Санта-Барбара, Калифорния). Гистопатологические исследования кишки проводили ветеринарные патологи слепым способом, описанным ниже (РаШоМсйтх, Сан-Хосе, Калифорния).
Гистопатологические исследования
Исследовали два сегмента толстого кишечника, тонкого кишечника и прямой кишки и рассчитывали следующие изменяющиеся показатели: (ί) некроз отдельных клеток; (ίί) эпителиальные язвы; (ίίί) отторжение эпителиальных масс; (ίν) абсцесс крипт; (ν) пролиферацию клеток; (νί) пролиферацию клеток крипт; (νίί) образование грануляционной ткани в 1атша ргорпа (собственной пластинке слизистой оболочки); (νίίί) грануляционной ткани в подслизистой оболочке; (ίχ) инфильтрации подслизистой оболочки воспалительными клетками, преимущественно нейтрофилами; и (х) отек подслизистой оболочки.
Однократно определяли тяжесть состояния на основании следующих стандартных определений:
- отсутствуют;
- легкие, очаговые или редко встречается;
- легкие, множественные очаги;
- умеренные, часто встречаются, но на ограниченных участках;
- тяжелые, часто встречаются на многих участках или на больших участках соответствующей ткани;
- очень тяжелые, на больших участках соответствующей ткани.
Результаты
Предшествующие наблюдения показали, что у животных ТЬК3КО значительно меньше гистопатологических изменений в сравнении с мышами дикого типа при моделировании воспалительного заболевания пищеварительного тракта, индуцированного приемом ДСН внутрь (публикация РСТ Νο. \УО 06/60513А2), что наводит на мысль о том, что сигналы ТЬК3 играют какую-то роль при патогенезе этой модели. Известно, что РНК условно-патогенных бактерий или РНК млекопитающих, высвобождающаяся из некротических клеток, может быть эндогенным лигандом, стимулирующим сигналы ТЬК3 (Капко с! а1., 1ттиш1у 23165-231175 2005; Капко с! а1., I. Βίο1. Скст. 279:12542-12550 2004), и, следовательно, стимуляция эндогенными лигандами ТЬК3 кишечника может усиливать и закреплять воспаление при колите, индуцированном декстрансульфатом.
Тяжесть заболевания была меньше у получивших ДСН животных при введении им антител против ТЬК3, судя по суммарным гистопатологическим показателям (фиг. 14). На фиг. 14 в виде горизонтальных линий показаны средние значения, стандартные отклонения и 95% доверительные интервалы параметров, используемых при оценке тяжести заболевания. Значительное ухудшение параметров наблюдалось у животных дикого типа, получивших ДСН, при введении антител против ТЬК3 (р<0,05) в сравнении с животными дикого типа, не получавшими антител. ТЬКЗКО животные, получившие ДСН, были
- 40 021512 защищены от индуцированных ДСН заболеваний. У получавших декстрансульфат животных, которым вводили тАЬ против мышиного ТЫР-а, отсутствовало улучшение гистопатологических параметров в эксперименте с декстрансульфатом. Следовательно, такая модель может быть полезна при оценке изучаемых терапевтических средств, предназначенных для людей, не отвечающих на терапию анти-ТЫР-а, а нейтрализующие антитела против ТЬК3 могут быть полезны пациентам с воспалительными заболеваниями пищеварительного тракта, которые не отвечают на терапию анти-ТЫР-а.
Модель
В качестве модели воспалительного заболевания пищеварительного тракта использовали модель переноса Т-клеток. При этом у мышей 8СГО индуцировали воспаление кишечника переносом популяции избегнувших Т-супрессоров наивных Т-клеток иммунокомпетентных мышей, которые атаковали антиген-представляющие клетки в слизистой кишечника.
Для индукции хронического колита наивные Т-клетки (СЭ4+СЭ45КВ Т-клетки) инъецировали внутрибрюшинно реципиентам - мышам 8СГО. Мышам вводили либо ФСБ (500 мкл/мышь внутрибрюшинно; контроль со средой), тАЬ 5429 (0,1 мг/мышь внутрибрюшинно), либо антитела против ТЫР-а (0,05 мг/мышь внутрибрюшинно; положительный контроль), начиная с 48 ч после переноса Т-клеток, а после этого - дважды в неделю на протяжении 8 недель исследования. Через 8 недель после переноса Т-клеток (или когда мышь теряет >15% от начального веса тела) животных подвергали эвтаназии и извлекали кишечник. Кишечник фиксировали, заливали парафином и окрашивали гематоксилином-эозином (Н&Е). Гистопатологические параметры (инфильтрации клеток, абсцессы крипт, эпителиальные эрозии, потерю бокаловидных клеток и утолщение стенок пищеварительного тракта) количественно оценивали специалисты слепым способом.
Результаты
У животных, которым переносили Т-клетки, при лечении антителами против ТЬК3 тяжесть заболевания уменьшалась, о чем говорит значительное снижение у них сводной гистопатологической оценки в сравнении с контрольными животными (р<0,05) (фиг. 15А). Для получения сводной оценки оценивали абсцессы крипт, язвы, нейтрофильный инфлюкс, потерю бокаловидных клеток, количество ненормальных крипт, воспаление собственной пластинки и вовлечение в процесс нескольких слоев стенки. Наблюдалось значительное уменьшение абсцессов крипт, числа язвенных очагов и нейтрофильных инфлюксов (для всех р<0,05) (фиг. 15В). Антитела против ТЫР-а в дозах, достоверно обеспечивающих оптимальное улучшение, использовали как положительный контроль.
Исследования с помощью хорошо изученных моделей воспалительных заболеваний пищеварительного тракта (ДСН и перенос Т-клеток) показали, что при системном введении антитела-антагонисты ТЬК3 достигают слизистой кишечника и уменьшают воспаление пищеварительного тракта, индуцированное двумя разными патогенными механизмами. Таким образом, антагонисты ТЬК3 могут найти применение при лечении воспалительных заболеваний пищеварительного тракта, в том числе не поддающихся лечению анти-ТЫР-а, и в других случаях, опосредованных иммунными механизмами патологий пищеварительного тракта.
Пример 12
Антитела-антагонисты ТЬК3 защищают от коллаген-индуцированного артрита
Модель
Коллаген-индуцированный артрит (КИА) использовали как модель ревматоидного артрита.
Самцов мышей Β10ΚΙΙΙ (6-8-недельных, 1асккоп ЬаЬк) делили на группы по 15 животных в группе (группы артрита) или по 4 на группу (контрольные животные). Группе артрита под изофлюрановым наркозом вводили коллаген ΙΙ типа путем инъекции (Е1ак1ш Рго6ис1к) и полный адъювант Фрейнда с добавлением М. 1иЬегси1ок1К (ТОГсо) на 0 и 15 день. На 12 день мышей с развивающимся из-за коллагена ΙΙ типа артритом рандомизировали в зависимости от веса тела на опытные группы и вводили им подкожно (п/к) на 12, 17 и 22 (612, 617, 262) дни тАЬ 5429 (25 мг/кг), в качестве отрицательного контроля - антитело СУАМ (рекомбинантное тАЬ, неспецифичное у мышей) (5 мг/кг) или антитела против ТЫР- (5 мг/кг, положительный контроль). Контрольным мышам вводили носитель (фосфатно-солевой буфер) или дексаметазон (0,5 мг/кг, Ое\, стандартный компонент) подкожно (п/к) раз в сутки на 12-25 дни. За животными наблюдали ежедневно с 12 по 26 день. Осматривали передние и задние лапки для оценки по клинической системе (см. ниже). Животные подвергались эвтаназии на 26 день исследования, их гистопатологические показатели оценивали слепым способом (шкала приведена ниже). Исследование эффективности проводили с учетом веса тела животных и оценок по клинической шкале артрита. Все животные выжили к концу исследования.
Критерии клинической оценки дистальных частей передних и задних конечностей
- норма;
- затронуты суставы задних или передних лапок, или минимальные диффузная эритема и припухлость;
- затронуты суставы задних или передних лапок, или легкие диффузная эритема и припухлость;
- затронуты суставы задних или передних лапок, или умеренные диффузная эритема и припух- 41 021512 лость;
- заметные диффузная эритема и припухлость, или затронуты суставы 4 пальцев;
- тяжелая диффузная эритема и тяжелая припухлость всей лапки, неспособность сгибать пальцы.
Способы гистопатологической оценки суставов мышей при артрите, спровоцированном коллагеном
ΙΙ типа
При оценке лапок или голеностопных (лучезапястных) суставов у мышей с артритом, спровоцированным коллагеном ΙΙ типа, учитывается тяжесть изменений, а также число отдельных пораженных заболеванием суставов. При поражении только 1-3 суставов лапы или голеностопных (лучезапястных) суставов без поражения запястных/плюсневых/пальцевых или предплюсневых/тибиотарсальных суставов произвольно оценивали максимальную тяжесть по 1, 2 или 3 параметрам из перечисленных ниже в зависимости от тяжести изменений. Если поражено более 2 суставов, критерии, перечисленные ниже, применяются к наиболее пораженному суставу/большинству суставов.
Клинические данные с целью оценки кистей анализировали с помощью площади под кривой в 1-15 дни и рассчитывали % ингибирования с учетом контрольных показателей.
Оценка
- норма;
- минимальная инфильтрация воспалительными клетками синовиального слоя и околосуставной ткани пораженных суставов;
- легкая инфильтрация, в случае лапок, ограниченность в пораженных суставах;
- умеренная инфильтрация с умеренным отеком, в случае лапок, ограниченность движений в пораженных суставах;
- заметная инфильтрация в большинстве участков с заметным отеком;
- тяжелая диффузная инфильтрация с тяжелым отеком.
Паннус
- норма;
- минимальная инфильтрация паннуса в хряще и субхондральной кости;
- легкая инфильтрация с краевыми зонами деструкции твердых тканей в пораженных суставах;
- умеренная инфильтрация с умеренной деструкцией пораженных суставов;
- заметная инфильтрация с заметной деструкцией архитектуры сустава в большинстве суставов;
- тяжелая инфильтрация и тотальная или почти тотальная деструкция архитектуры сустава, поражены все суставы.
Повреждения хряща
- норма;
- минимальная или небольшая потеря окраски толуидиновым синим в отсутствие явной потери хондроцитов или разрыва коллагена в пораженных суставах;
- небольшая потеря окраски толуидиновым синим с очаговой легкой (поверхностной) потерей хондроцитов и/или разрывами коллагена в пораженных суставах;
- умеренная потеря окраски толуидиновым синим и многоочаговой умеренной (глубокой в средней зоне) потерей хондроцитов и/или разрушением коллагена в пораженных суставах;
- заметная потеря окраски толуидиновым синим с многоочаговой заметной (глубокой в глубокой зоне) потерей хондроцитов и/или разрушением коллагена в большинстве суставов;
- сильная потеря окраски толуидиновым синим с многоочаговой выраженной (от глубокой до крайней) потерей хондроцитов и/или разрушением коллагена во всех суставах.
Резорбция кости
- норма;
- минимальная с маленькими участками резорбции, не явно выраженная при малом увеличении, редкие остеокласты в пораженных суставах;
- легкая с более многочисленными участками резорбции, не явно выраженная при малом увеличении, более многочисленные остеокласты в пораженных суставах;
- умеренная с заметной резорбцией медуллярной трабекулярной и кортикальной кости без распространяющихся на весь кортекс дефектов, потеря некоторых медуллярных трабекул, явные повреждения при малом увеличении, более многочисленные остеокласты в пораженных суставах;
- заметные распространяющиеся на все корковое вещество дефекты, часто с искаженным профилем остальной кортикальной поверхности, с заметной потерей медуллярной кости, многочисленными остеокластами, поражено большинство суставов;
- тяжелые распространяющиеся на все корковое вещество дефекты и разрушение архитектуры всех суставов.
Результаты
Дексаметазон (Эех) и антитела против мышиного ΊΝΓ-α использовали как положительный контроль, фосфатно-солевой буфер использовали как контроль среды, а СУАМ использовали как отрицательный контроль антител. Все виды терапии начинались на 12 день исследования при развитии заболевания суставов. Заболеваемость в контрольной группе, получавшей носитель, достигла 100% к 22 дню. У
- 42 021512 групп отрицательного контроля, получавших антитела СVАМ или носитель, были самые высокие оценки по системе клинической оценки. Значительное снижение клинической оценки наблюдалось в группах, получавших Эе.х (р<0,05 для 18-26 дней), 5 мг/кг антител к ТМР-а (р<0,05, дни 18-26) или 25 мг/кг тАЬ 5429 (р<0,05, дни 18-2З и 25-26) (фиг. 16). Клиническая оценка тяжести артрита, выраженная как площадь под кривой (ЛИС), значительно снижалась при применении 25 мг/кг тАЬ 5429 (4З% снижение), 5 мг/кг антител к ТИР-а (52%) или дексаметазона (69%) по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель. На фиг. 17 показаны средние и стандартные отклонения АИС для каждой группы.
Также оценивались гистопатологические эффекты разных препаратов. Резорбция костей кистей значительно снижалась при введении 25 мг/кг тАЬ 5429 (снижение на 47%) в сравнении с контролем при введении среды. У мышей из группы положительного контроля, получивших 5 мг/кг антител против ТНР-а, значительно уменьшалось воспаление суставов лап (ЗЗ%), повреждение хрящей (З8%) и снижалась сводная оценка суставов лап (З7%). Введение Ое.х значительно уменьшило все гистопатологические параметры суставов лап (7З%-е снижение сводных оценок).
Эти данные демонстрируют, что антитела-антагонисты ТЬКЗ облегчают симптомы клинических и гистопатологических заболеваний в модели КИА, что наводит на мысль о возможности применения антагонистов ТЬКЗ для лечения ревматоидного артрита.
Пример 14
Антитела-антагонисты ТЬКЗ защищают от острых летальных вирусных инфекций
Модель
Экспериментальное заражение вирусом гриппа А использовали в качестве модели острой летальной вирусной инфекции.
На -1, 4, 8 и 12 дни самки мышей С57ВЬ/6 (12-недельные) или самки мышей ТЬКЗК0 (С57ВЬ/6 фон; 12-недельные, АСЕ Аттик, шс., по 15 мышей в группе) получали подкожно тАЬ 5429 в дозе 20 мг/кг или только ФСБ. На 0 день мышей подвергали анестезии изофлураном и вводили интраназально вирус гриппа А/РК/8/З4 (АТСС, Рокленд, Мэриленд, партия № 218171) в 25 мкл ФБР (эквивалент 105,55 СЕГО50). Животных в течение 14 дней осматривали дважды в день: измеряли вес тела и проверяли выживаемость. Для оценки прогрессирования заболевания и небольших улучшений в ответ на обработку вирусом гриппа А использовали шкалу клинической оценки.
Шкала клинической оценки
- нормальные, живые и реагирующие животные, без видимых признаков заболевания;
- взъерошенная шерсть, обычная или слегка уменьшенная подвижность;
- взъерошенная шерсть, сгорбленная поза при ходьбе, животное неохотно двигается, затрудненное дыхание;
- взъерошенная шерсть, затрудненное дыхание, неподвижность, тремор;
- взъерошенная шерсть, животное неспособно ходить даже при небольшом подталкивании, потеря сознания, холодное тело при прикосновении;
- смерть.
Результаты
В рамках исследования оценивали выживаемость, ежедневно определяли оценку по шкале клинической оценки и регистрировали изменения веса. Инфицированным гриппом А мышам в группе \УТ вводили тАЬ 5429 (20 мг/кг), тогда как инфицированные мыши в группе А ТЬКЗК0 не получали тАЬ 5429. При этом в обеих группах обнаружено статистически значимое увеличение выживаемости (р<0,001 и р<0,01 соответственно) в сравнении с инфицированными вирусом гриппа мышами С57ВЬ/6, что указывает на возможность профилактики гибели от гриппа с помощью антагонистов ТЬКЗ или путем создания дефицита ТЬКЗ (фиг. 18). Оценка по шкале клинической оценки была значительно ниже в группе, получавшей 20 мг/кг тАЬ 5429, а также в группе ТЬКЗК0 (фиг. 19). Вес мышей оценивали в течение 14 дней после введения вируса гриппа. У мышей С57ВЬ/6, получивших дозу вируса гриппа А, вес неизменно снижался. Однако, и у мышей С57ВЬ/6, получавших 20 мг/кг тАЬ 5429, и у мышей ТЬКЗК0 вес тела был значительно больше, чем у мышей \УТ С57ВЬ/6, зараженных вирусом гриппа (фиг. 20). Полученные результаты показывают, что при моделировании острой летальной вирусной инфекции антителаантагонисты ТЬКЗ уменьшают тяжесть клинических симптомов и смертность и наводят на мысль о применении антагонистов ТЬКЗ в качестве средства профилактики у людей с острыми инфекциями.
Пример 15
Антитела-антагонисты ТЬКЗ улучшают течение гипергликемии и снижают уровень инсулина в плазме крови
Модель
Моделирование алиментарного ожирения использовали в качестве модели гипергликемии с инсулинорезистентностью и ожирением.
Животных С57ВЬ/6 \УТ (приблизительно З-недельных, 1аскзоп ЬаЬз) и животных ТЬКЗК0 (С57ВЬ/6 фон; приблизительно З-недельных, Асе Аттак, Шс.) содержали на диете с высоким содержанием жиров в течение 12-16 недель. Как мыши ТЬКЗК0, так и мыши \УТ С57ВЬ/6 получали либо нор- 4З 021512 мальную пищу, либо пищу с высоким содержанием жиров (Рштпа Те51Э1е1 кат. № 58126), содержащую 60,9% ккал жиров и 20,8% ккал углеводов. Цикл день:ночь составлял 12:12 ч, воду и пищу мыши получали без ограничений. Вес каждой мыши в каждой из групп измеряли еженедельно. МАЬ 5429 вводили внутрибрюшинно дважды в неделю в течение первой недели, затем один раз в неделю в течение 7 недель. Для измерений концентраций инсулина в указанные сроки использовали сыворотку из образцов крови из глазницы. Проверку переносимости глюкозы проводили через 7 недель путем внутрибрюшинного введения глюкозы в дозе 1,0 мг/г веса тела после ночи натощак. Кроме того, измеряли инсулин и глюкозу натощак.
НΟМΑ-IΒ рассчитывали, подставляя концентрации глюкозы натощак и инсулина (12) в следующее уравнение: НΟМΑ-IΒ = ((глюкоза натощак (ммоль/л) х инсулин натощак (мЕд/л))/ 22,5 (^а11асе е1 а1., О1аЬе1е8 Саге 27:1487-1495, 2004). Глюкозу в крови натощак (ВС) определяли с помощью глюкозооксидазного анализа. Инсулин натощак определяли с помощью набора реагентов ЕЬКА для определения инсулина у крыс/мышей (Сгу81а1 СЬет, кат. № 90060).
Результаты
После 12-16 недель на диете с высоким содержанием жиров у животных \УТ ΌΙΟ развивалась гипергликемия и гиперинсулинемия. Переносимость глюкозы была лучше у животных \УТ ΌΙΟ, но не у ^Β3ΚΟ ΌΙΟ, при применении тАЬ 5429. У животных, получавших тАЬ 5429, через 60, 90, 120 и 180 мин после введения глюкозы концентрация глюкозы в сыворотке была значительно ниже, чем в контрольной группе, получавшей только фосфатно-солевой буфер 21А). По сравнению с мышами \УТ ΟΙΟ, не получавшими тАЬ, АиС у получавших тАЬ 5429 животных \УТ ΟΙΟ была ниже примерно на 21%. Также у животных \УТ ΟΙΟ, получавших тАЬ 5429, уменьшались концентрации инсулина натощак (фиг. 22). У животных ΈΓΒ3ΚΟ ΌΙΟ улучшений концентрации инсулина натощак при введении тАЬ 5429 не наблюдалось. Анализ результатов исследования гомеостатической модели (НОМА) выявил улучшение чувствительности к инсулину у животных \УТ ΟΙΟ, получавших тАЬ 5429, но не у животных ΈΓΒ3ΚΟ ΌΙΟ. Содержание НΟМΑ-IΒ составляло соответственно 14,0±9,8, 8,7±4,9, 9,0±3,0 у животных \УТ ΟΙΟ, не получавших тАЬ 5429, животных \УТ ΟΙΟ, получавших 5 мг/кг тАЬ 5429 и 20 мг/кг тАЬ 5429. Никакого воздействия на животных ΈΓΒ3ΚΟ ΌΙΟ антитела не оказывали.
Исследование показало, что антитела-антагонисты ΈΓΒ3 повышали инсулинорезистентность и снижали уровни глюкозы натощак при моделировании ΌΙΟ без потери веса, то есть антагонисты ΈΓΒ3 могут быть полезными при лечении гипергликемии, инсулинорезистентности и диабета ΙΙ типа.
Пример 16
Антитела-антагонисты ΈΓΒ3 защищают от бактерий и индуцированных вирусами воспалительных реакций
Реагенты
Нетипируемые штаммы НаеторЬШак тЛиеп/а (ΝΈΠί) 35, выделенные из организма пациентов с ХОЗЛ с бактериальными осложнениями, были получены от д-ра Т.Р. МигрЬу (Медицинский центр ВиГίа1ο УА, Баффало, Нью-Йорк). Человеческий риновирус 16 получили из Американской коллекции типовых культур (АТСС) с ТСГО(50) = 2,8 х 107/мл.
Анализ стимуляции ΝΈΠί
Клетки МНВЕ (Ъоп/а, Уокерсвилл, Мэриленд) сеяли на 96-луночные планшеты для культивирования тканей МюгоЮЧ (ВО Вюктепсек, Бедфорд, Массачусетс) в количестве 1 х 105/лунку. ЭТНц выросшие на агаровых планшетах в течение 16-20 ч, ресуспендировали в питательной среде до концентрации ~2 х 108 КОЕ/мл, добавляли 100 мкг/мл гентамицина на 30 мин и наносили при концентрации ~2 х 107/лунку на 96-луночные планшеты, содержащие МНВЕ. Через 3 ч собирали надосадочную жидкость и заменяли свежей питательной средой с антителами или без них (до конечной концентрации 0,0850 мкг/мл). Еще через 24 ч инкубации трижды определяли содержание в клеточных супернатантах цитокинов и хемокинов с помощью набора реагентов СуЮкте 25-р1ех АВ Ьеаб, Нитап (включающим ΙΌ-1 β, Ю-ША, ΙΌ-2, ΙΌ-2Β, ΙΌ-4, ΙΌ-5, ΙΌ-6, ΙΌ-7, ΙΌ-8, ΙΌ-10, I^12р40р70, ΙΌ-13, ΙΌ-15, ΙΌ-17, ТХР-α, ΙΡΝ-α, ΙΡΝγ, СМ-ϋδΡ, МГР-1а, МГОЛв, ТР-10, МТС, Иотмп, ΒΑNТЕδ и МСР-1) (ЫГе ТесНпокшех Карлсбад, Калифорния) и мультиплексного флуоресцентного анализатора Ьиттех 100Ιδ и ридера (Ьиттех СогрогаЛоп, Остин, Техас).
Анализ стимуляции риновирусами
Клетки МНВЕ сеяли на 96-луночные планшеты для культивирования тканей МюгоЮЧ (ВО ВюксЛ епсек, Бедфорд, Массачусетс) в количестве 1 х 105 клеток/лунку. На следующий день антитела (в конечной концентрации 0,08-50 мкг/мл) добавляли к клеткам МНВЕ или ВЕΑδ-2В и инкубировали в течение 1 ч, затем добавляли 10 мкл/лунку риновируса. Еще через 24 ч инкубации наличие цитокинов и хемокинов в клеточных супернатантах оценивали с помощью прибора 1иттех в соответствии с вышеприведенным описанием.
Результаты тАЬ 15ЕУЦ ингибировали индуцированный НТН| синтез ^-10/0^0^-10 и ΒΑNТЕδ/СС^5 в зависимости от дозы, тогда как при введении контрольного антитела, человеческого ЦС4 Ъщта, Сент-Луис,
- 44 021512
Миссури), было выявлено отсутствие ингибирования стимуляции ЭТИ (фиг. 2ЗА). тАЬ 15Ενρ также ингибировали индуцированный риновирусом синтез СХСЫ0/1Р-10 и ССЬБ/КАИТЕЗ (фиг. 2ЗВ).
Пример 17
Антитела-антагонисты ТЬКЗ подавляют воспалительные реакции в астроцитах
Способы
Нормальные человеческие астроциты от 2 доноров (Ьоп/а, Уолкерсвилл, Мэриленд) вносили в 24луночный планшет в количестве 75000 клеток/лунку и оставляли на ночь для прикрепления к подложке. На следующий день к астроцитам добавили 200 нг/мл поли(1:С) и/или 10 мкг/мл тАЬ 18 на 24 ч. Концентрацию цитокинов измеряли с помощью прибора Ьитшех.
Результаты
Индуцированный поли(1:С) синтез 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-12, ШИ-а, ШЫ-у, СХСЬ9/МЮ, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4, ССЬБ/КАИТЕЗ и СХСЫ0/1Р-10 ингибировали тАЬ 18, как показано в табл. 10.
Таблица 10
Донор 1 11,-6 11,-8 11,-12 ΙΓΝ-α ΙΓΝ-у
Без обработки 876,0+36,8 539,7+32,6 16,6+0,5 28,8*1,5 12,3+0,3
тАЬ 18 1011,9+57,4 1401,9± 49,7 17,1+0,5 31,6+0,7 10,4±0,2
Поли (1:С) о1* о1 30,3±1,5 47,1±3,1 35,9+1,0
Поли (1: С) + гпАЬ 18 2225,0 + 108, 1 6104,4± 259, 9 16,8+0,9 30,5+1,6 11,7+0,6
Донор 2
Без обработки 729,1 + 7,1 248,2± 4,7 14+0,5 19,5±1,8 10, 5+0, 5
тАЬ 18 779,0+9,8 1132,6+30,6 14,3±0,6 20,8+1,9 10,5 + 0,1
Поли (1:0 о1 01 25,5±0,4 36,3+1,9 30,8 + 0,9
Поли (1:0 + шАЬ 18 3393,3+ 107,5 8660,4+ 354,3 16,2±0,3 24,7+1,2 12,6±0,3
Донор 1 СХСЬ9/М1С ССЬЗ/МГР-1а ССЬ4 СЬ5/КАНТЕ$ СХСЫО/ ГР- 10
Без обработки 12,6*0,7 21±0,9 14,8+0,7 Ь1** ы
тАЬ 18 14,8±1,7 19,5+1,5 14,8+1,1 Ы ы
Поли (1:0 78,3±4,8 1569,3+ 36,9 159,7+12,7 788,2+94,9 461,4*10,3
Поли (1:С)+ тАЬ 18 18,5+1,6 31,2+1,9 13,2+0,9 Ы 6,9±0,5
Донор 2
Без обработки 9,9+1,6 12,3+1,7 11,3+0,3 Ы Ы
тАЬ 18 8,9+0,7 13,2+1,5 11,1+0,7 ы ы
Поли (1:0 62+3,8 1552,9± 41,1 140,7+4,8 546,8±21,7 533,2+15
Поли (1:0 + тАЬ 18 18,3+2,7 бб,б±3,8 12,1+0,8 Ь1 29,1+6,2
*о1: выше предела обнаружения **Ь1: ниже предела обнаружения
Пример 18
Антитела-антагонисты ТЬКЗ подавляют воспалительные реакции в клетках эндотелия
Способы
Клетки ΗυνΕί’ (Ьоп/а, Уолкерсвилл, Мэриленд) культивировали в содержащей сыворотку питательной среде, рекомендованной компанией Ьоп/а. Клетки ресуспендировали в бессывороточной среде (Ъоп/а, Уолкерсвилл, Мэриленд), сеяли на 96-луночные планшеты в количестве З х 105 клеток/мл и инкубировали при З7°С, 5% С02 в течение 24 ч. Поли(1:С) (ОЕ ^;·ι1ι1κ;πό, РВсаЦиуау, N1) добавляли в увеличивающихся концентрациях (1,5-100 мкг/мл) и инкубировали 24 ч при З7°С. Для исследования ингибирования цитокинов тАЬ 15Ενρ добавляли к клеткам в разных концентрациях (0-50 мкг/мл и инкубировали З0 мин, а затем добавляли 20 мкг/мл поли(1:С) в течение 24 ч. Собирали надосадочную жидкость и измеряли концентрацию цитокинов с помощью набора для анализа человеческих цитокинов З0-р1ех и технологии Ьитшех МАР ОпуЦгодеп Согр., Карлсбад, Калифорния). Для определения экспрессии δΙСАМ-1 к клеткам ΗυVΕС добавляли 20 мкг/мл поли(1:С) и различные концентрации тАЬ 15Ενρ (0,8-50 мкг/мл). Уровни экспрессии 81САМ-1 в клеточных супернатантах определяли с помощью ИФА (К&Э 5у5!еш5). Жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора реагентов Се11ТИегО1о (Рготеда, Мэдисон, Висконсин).
Результаты
Клетки ПЕЛТУ в ответ на поли(1:С) продуцировали следующие цитокины: 1Ь-1КА, 1Ь-2, 1Ь-2К, 1Ь6, 1Ь-7, СХСЬ8/1Ь-8, 1Ь-12 (р40/р70), 1Ь-15, 1Ь-17, ТЯР-а, ΙΡ^α, ΙΡ^γ, ОМ-С8Р, ССЬЗ/М1Р-1а, ССЬ4/М1Р-13, СХСЫ0/1Р-10, ССЬ5/КАЭТЕ8, ССЬ2/МСР-1, νΕΟΡ, О-С8Р, ΡΟΡ-Ьавю и ΗΟΡ (табл. 11). тАЬ 15Ενρ в зависимости от дозы снижали концентрации всех цитокинов, индуцированных поли(1:С)
- 45 021512 (табл. 12). Способность тАЬ 15Ενθ снижать индуцированный поли(ЕС) синтез Т№-а, ССЬ2/МСР-1, ССЬ5/КА№ТЕ8 и СXС^10/IР-10 наводит на мысль, что ингибирование опосредованных ТЬК3 реакций может защищать от инфильтрации лейкоцитами и Т-клетками (которая может привести к атеросклерозу). Ингибирование νΕΟΡ тАЬ 15Ενθ также наводит на мысль о потенциальной пользе блокады ТЬК3 при патологиях, опосредованных νΕΟΡ, в том числе при ангиогенезе ряда злокачественных опухолей и заболеваний глаз, таких как возрастная макулодистрофия.
Функция ТОТ^а и №N-7 при привлечении лейкоцитов и повышении экспрессии адгезионных молекул на активированном эндотелии (Эоиказ е! а1., Ат. 1. Ра!Ио1. 145:137-47, 1994; РоЬег е! а1., Ат. 1. Ра!Ио1. 133: 426-33, 1988). ССЬ2/МСР-1, ССЬ5/КАОТЕ8 и СХ^Ю/ТО-Ю участвовали в привлечении моноцитов и Т-клеток и вносили вклад в развитие атеросклероза (ЬииЬдегд е! а1., С1ш. Iттиηο1. 2009). Клетки эндотелия синтезируют νΕΟΡ при ангиогенезе при аномальном росте тканей или развитии ряда злокачественных опухолей (ЕСепдооЬ е! а1., Се11. Iттииο1. 249:55-62, 2007).
Таблица 11
Поли (1:0 мкг/мл 1Ь-6 СХСЬ8/1Ь-8 ССЬ2/МСР-1
10 846,8+50,9 12876,0+2314,0 11813,4+1420,9
5 751,3+2,1 11363,7+108,2 11365,7+113,1
2,5 607,1+91,6 10961,5+2200,7 11607,3+2155,7
1,25 419,2+178,4 9631,5+3675,8 11690,9+3189,9
0,63 263,8+81,4 6231,9+1568,0 9075,6+1152,2
0,31 183,5+168,3 5257,9+1855,0 8106,8+1193,1
0,16 111,9+72,5 4057,6+1127,4 6619,8+1728,2
не поли (I:С) 0,00 1286,6+300,8 1360,1+245,4
Поли мкг/мл (1:0 ΙΕ-2Κ 11,-15 ΙΕ-17
100 784,4+45,4 61,3+12,5 43,8+5,3
50 718,6+56,8 61,3+12,5 47г6+0
25 735,7+23,4 56,7+18,9 58,3+4,9
12, 5 650,5+29,8 38,8+6,5 39,8+10,9
6, 25 643,4+39,9 34,2+0 32,1+0
3,13 681,8+24,3 38,8+6,5 43,8+5,3
1,56 578,6+10,5 29,4+6,7 36,1+5,6
не поли (1:0 0,0 0, 0 0, 0
Поли мкг/мл (1:0 1РКй СХСЫ0/1Р-Ю СС1Л/М1Р-1Р
100 50,7+0 3803,1+185,5 234,5+19,7
50 44,9+1,7 2235,9+184,6 291,6+41,8
25 46,1+0 2403,0+271,9 278,7+4,7
12,5 41,2+3,5 2185,4+64,9 243,8+63,4
6,25 36,1+0 2100,0+288,1 201,9+46,2
3, 13 40,0+1,8 3553,2+197,1 191,5+20,8
1,56 42,5+1,7 2064,3+242,1 165,3+16,3
не поли (I :С) 0,0 0,0 0, 0
Поли (1:0 мкг/мл ΡΑΝΤΕ5 ΤΝΓα УЕСГ
100 6266,9+1708,7 12,8+3,2 581,1+181,4
50 2919,7+119,4 11,5+3,2 637,9+47,7
25 2805,1+176,7 9,8+2,8 700,3+62,5
12,5 2598,6+68,6 7,3+0,9 513,2+73,5
6,25 2449,2+830,6 6,9+1,4 440,4+29,5
3,13 3117,1+795,7 7,3+0,9 393,9+40,2
1,56 2481,0+719,3 6,0+1,8 358,4+74,8
не поли (1:0 4,9+4,5 1,9+0,4 32,1+8,8
концентрация в пг/мл
Растворимый фактор межклеточной адгезии 1 (ДСАМ-Ц образующийся при протеолизе, является маркером активации клеток эндотелия. ГСАМ-1 играет ключевую роль в миграции и активации лейкоцитов, его концентрация в клетках эндотелия и эпителия при воспалении повышается, он опосредует адгезию этих клеток к лейкоцитам через молекулы интегринов ЬРА-1 и Мас-1. В активированных с помощью поли(кС) активировала клетки эндотелия, повышая экспрессию НСАМ-Е которая снижалась при добавлении тАЬ 15Ενθ (фиг. 24А).
- 46 021512
Таблица 12
тАЬ 15 (ьакг/шт) 50, 00 10,00 2,00 0, 40 0,08 0,016 0,003 0
Р1С + + + + + + + -
1Ь-6 177,8±5,6* 214,6+3,6* 359,2+57,6* 727,2+50,5* 10000+0 10000+0 10000+0 10000 + 0
;ХСЬ8/ГЬ-8 1040,7+ 185,9 1765,9+97,1 6460,3+ 3684,4 57349,5+ 6293,4 72422,8+ 88279,2 47047,5+ 52393,1 76066,5+ 11354,1 96478,0+ 122298,4
СС12/МСР-1 1187, 7± 165,4* 1955,4+72,7» 9054,4+ 4110,9* 20000+0,0 20000 + 0, 0 20000+0,0 20000+0,0 20000+0,0
1Ь-2К 25,0±35,3* 0,0+0,0* 312,3+ 137,6* 521,5+5,5 664,7+9,8 661,2+14,8 698,4+57,6 654,2+14,8
11,-15 0,0 + 0,0* 0,0+0,0* 0,0+0,0* 4,1+0,0* 38,8+6,5 43,4+0,0 38,8+6,5 43,4+0,0
11,-17 1,3±1,8* 11,8+16,8 11,8+16,8 27,9+6,0 47,4+10,4 54,3+20,2 40,0+0,0 51,2+5,1
ΙΓΝα 0,9±1,3* 0,9+1,3* 19,0+7,7* 36,1+0,0 44,9+1,7 41,2+3,5 47,3+1,7 40,0+1,8
2ХСЫ0/1Р-10 0,0+0,0* 58,1+2,6* 633,0+471,6* 1441,4+97,1 3023,8+ 166,1 2107,5+372,6 2346,4+ 226,1 2157,4+ 282,7
ССЬ4/М1Р-1 β 0,0+0,0* 0,0+0,0* 2,9+4,1* 62,1+7,2* 176,6+21,3* 227,5+19, 9 248,3+19,4 281,7+37,5
ΡΑ.ΝΓΕ5 3,0+0,0+ 15,4+4,5* 201,1+169,1* 952,4+41,1* 2454,4+ 98,5* 2698,1+88,6* 2624,4+ 129,8 * 3459,7+ 181,8
ΓΝΓα 1,9±0,4* 1,6+0,0* 2,2+0,0* 3,4+0,0 6,3+0,5 8,5+0,0 7,6+1,4 6,9+2,3
УЕСЕ 87,2+8,7* 28,6+8,7* 88,3+52,1* 156,1+6,4* 479,6+14,1 544,6+8,3 533,5+70,2 607,3+29,9
* Показывает значимые значения р (менее 0,05) в сравнении концентраций тАЬ15 только с поли(ГС)
Значения представлены как среднее (пг/мл) ± станд. ошибка среднего
Это наводит на мысль о том, что антитела-антагонисты ТЬК3 могут ингибировать миграцию лейкоцитов и, следовательно, повреждение тканей, спровоцированное миграцией воспалительных клеток к очагу.
Для анализа жизнеспособности клетки НИУЕС культивировали, сеяли на планшеты и стимулировали поли(ТС), как описывалось выше. тАЬ 15ЕУЦ в зависимости от дозы восстанавливали индуцированное поли(ТС)снижение жизнеспособности клеток НИУЕС (фиг. 24В).
Снижение активации клеток эндотелия может уменьшать избыточную инфильтрацию иммунных клеток и повреждение тканей, спровоцированное цитокинами, концентрация которых при воспалении увеличивается. Воспаление и сверхэкспрессия цитокинов и молекул адгезии в клетках эндотелия играют основную роль при развитии атеросклероза и гипертензии. Полученные данные позволяют обосновать потенциально полезное применение антагонистов ТЬК3 при болезнях кровеносных сосудов, в том числе васкулитах, и при болезнях, вызывающих дисфункцию эндотелия. Другое заболевание, для которого свойственно воспаление и сверхэкспрессия цитокинов, - это саркома Капоши (К8), которая часто встречается при иммуносупрессии и у ВИЧ-инфицированных пациентов, возбудителем которой является герпесвирус саркомы Капоши (К8НУ). Синтез УЕОР и цитокинов обусловливает выживание клеток саркомы Капоши (Ыуепдоой е( а1., Се11 Iттиηо1. 249:55-62, 2007). Антагонисты ТЬК3 могут быть полезны при снижении ангиогенного риска, связанного с саркомой Капоши и другими опухолями, при профилактике потери жизнеспособности клетками, при сохранении целостности защитного эндотелиального барьера, который предотвращает транссудацию, потенциально серьезное заболевание, связанное с повреждением органов и угрожающим жизни воспалением, таким как сепсис. Антагонисты ТЬК3 могут быть полезными и при вирусных инфекциях, провоцирующих патологии клеток эндотелия, например, при вирусной геморрагической лихорадке, возбудителями которой являются члены семейства флавивирусов (например, Денге, желтой лихорадки), филовирусов (Эбола, Марбурга), буньявирусов (например, хантавирус, найровирус, флебовирус) и аренавирусов (например, Луйо, Ласса, аргентинская, боливийская, венесуэльская геморрагические лихорадки (8ЩЬаш1уа е( а1., В1оой 113:714-722, 2009).
Пример 20
Перекрестные реакции антител-антагонистов с ТЬК3 яванских макак и мышей
Активность в отношении ТЬК3 яванского макака или мыши оценивали путем количественного определения гена-репортера ГОКЕ, как описано в примере 2. кДНК ТЬК3 макака (8ЕЦ ΙΌ ΝΘ: 217) и мыши (8ЕЦ ГО ΝΘ: 161) амплифицировали из цельной крови, клонировали в векторе рСЕР4 (С1оп1есН) и экспрессировали, как описано выше. У макак при анализах ΝΤ-кВ и ГОКЕ Ю50 тАЬ 15ЕУЦ составляли соответственно 4,18 и 1,74 мкг/мл, тогда как для человеческого ТЬК3 при NΡ-кΒ и ГОКЕ Ιί'.'50 составляли 0,44 и 0,65 мкг/мл соответственно. Контрольные изотипные антитела не влияли на ТЬК3 по результатам этих анализов.
Пример 21
Терапевтическая доза антител-антагонистов ТЬК3 защищает от острых летальных вирусных инфекций
В примере 14 описывается профилактическое лечение инфекции вирусом гриппа А (введение в дни -1, 4, 8 и 12) антителами-антагонистами ТЬК3. Этот пример показывает, что терапевтическое примене- 47 021512 ние антител-антагонистов ТЬК3 (на 3 день после появления клинических симптомов инфекции вирусом гриппа А) эффективно увеличивает выживаемость.
Модель
В качестве модели острой летальной вирусной инфекции использовали экспериментальное заражение вирусом гриппа А, как описано в примере 14, за исключением того, что животным вводили тАЬ 5249 через 3 дня после заражения вирусом гриппа А, и возраст животных был 8 недель. В качестве контроля изотипа использовали антитела против 1дО1 мыши производства ВюЬедепб. Антитела вводили через 3, 7 и 11 дней после заражения вирусом гриппа А.
В рамках исследования оценивали выживаемость, ежедневно определяли оценку по шкале клинической оценки и регистрировали изменения веса. И у мышей С57В1/6, получавших тАЬ 5249, и у мышей ТЫК3К0 показано статистически значимое повышение выживаемости (р<0,028 и р<0,001 соответственно), по сравнению с мышами С57ВЬ/6, которым вводили антитела против 1дО1 мыши в качестве контроля изотипа и вирус гриппа (фиг. 25). В группе мышей С57ВЬ/6, получивших тАЬ 524, и мышей ТЕК3К0 клиническая оценка была ниже (фиг. 26), а масса тела выше (фиг. 27) по сравнению с мышами С57ВЬ/6, которым вводили антитела против 1дО1 мыши в качестве контроля изотипа и вирус гриппа А. Полученные результаты показывают, что при моделировании острой летальной вирусной инфекции антителаантагонисты ТЬК3 уменьшают тяжесть клинических симптомов и смертность и наводят на мысль о применении антагонистов ТЬК3 в качестве средства профилактики у людей с острыми инфекциями.
Пример 22
Эпитопы и паратопы антител-антагонистов ТЬК3 по результатам рентгенокристаллографии
Внеклеточный домен ТЬК3 человека кристаллизовали в комплексе с РаЬ-фрагментами тАЬ 15ЕУЦ, тАЬ ПЦУЦ/ЦЗУ и тАЬ с1068.
Методы
Экспрессия и очистка белков
Экспрессию и очистку внеклеточного домена ТЬК3 (аминокислоты 1-703 из δΕ^ ГО N0: 2) три РаЬфрагмента проводили, как описано выше.
Приготовление четвертичного комплекса ТЬК3 ЕСГО-3 РаЬ мг Внеклеточного домена человеческого ТЬК3 смешивали с 2,4 мг каждого РаЬ-фрагмента и инкубировали при 4°С в течение 3,5 ч, что соответствует молярному соотношению 1 ТЬК3 ЕСГО:1.1 РаЬ. Комплекс очищали методом анионообменной хроматографии на колонке МопоЦ 5/50 ОЬ (ОЕ НеаНЬсаге, Пискатауэй, Нью Джерси), уравновешивали 20 мМ трис рН 8,5, 10% глицерином (буфер А) и элюировали 20 мМ трис рН 8,5, 10% глицерином, 1 М №С1 (буфер В). Примерно 2,48 мг комплекса в 1,74 мл разводили до 10 мл буфером А, вносили в колонку со скоростью протекания 1 мл/мин и элюировали с линейным градиентом 0-40% В, подавая более 40 объемов колонки. Проводили пять последовательных циклов очистки. Фракции, соответствующие пику 1, сливали вместе, концентрировали с помощью центрифужного фильтра Ашюоп-15 шЬ иИга-30000 М>С0 и Мюгосоп 30000 М>С0 до 14,49 мг/мл в 20 мМ трис рН 8,5, 27 мМ №С1, 10 % глицерина (коэффициент затухания: А280 (1 мг/мл) = 1,31).
Кристаллизация
Автоматический скрининг кристаллов проводили с помощью автомата для кристаллизации белков 0гух4 (Эоид1а8 1п81гитеп18), дозируя равные объемы белка и резервуарного раствора в формате сидячей капли с использованием планшета Согтпд 3550 (Согтпд 1пс., Ас1оп, МА). Начальный скрининг проводили с помощью лотка с ячейками для кристаллизации НатрФп НТ (НК2-130, НатрФп Ке8еагсЬ, А1|8о У1е_)о, СА). Мелкие кристаллы, полученные в разных условиях, использовали для получения кристалловзатравок, а затем применяли метод микропереноса кристаллов (МПК) в качестве затравки для скрининга условий кристаллизации. Было проведено несколько циклов очистки, основанных на условиях начального скрининга, при которых получались мелкие кристаллы. Условия в резервуаре при МПК подбирались на основе тех, которые давали маленькие кристаллы после очистки: 18-28% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 3350, 1М ЫС1, рН 4,5 и 2,0-2,9 М (N^^0^ 5% ПЭГ400, рН 4,5, исследовались разные значения рН и разные добавки. Скрининг кристаллизации методом МПК проводился с помощью автомата для кристаллизации белков 0гух4 (Эоид1а8 ИМгитепЩ), компоненты дозировались в следующих соотношениях: 1 часть белкового раствора:0,25 частей маточного кристалла-затравки:0,75 частей резервуарного раствора. Кристаллы с разрешением дифракционной решетки до ~10-А образовывались в растворе с концентрацией от 0,1 М №·ι ацетата рН 4,5, 2,9 М (N^^0^ 5% метилпентандиола (МПД) и 0,1 М №·ι ацетата рН 4,5, 26% ПЭГ3350, 1 М ЫС1.
В попытке повысить разрешение кристаллов МПК в вышеуказанных условиях сочетали с дополнительным скринингом с использованием избранных компонентов комплекта для дополнительного скрининга НатрФп НК2-428 (НатрФп Ке8еагсЬ, А1|8о У1С|о, СА) в следующем объемном соотношении: 1 ч раствора белка:0,125 ч маточного раствора затравки:0,2 ч аддитивного раствора:0,675 резервуарного раствора. Кристаллы ЬК3 ЕСГО в комплексе с РаЬ-фрагментами, подходящими для рентгеновской дифракции, с разрешением до ~5-А получали с помощью МПК в сочетании с дополнительным скринингом из раствора, содержащего 0,1 М №·ι ацетата рН 4,5, 28% ПЭГ 3350, 1 М ЫС1 и 30 мМ О1и-О1и-О1и.
- 48 021512
Сбор данных рентгенодифракционного анализа четвертичного комплекса ТЬК3 ЕСГО
Для получения данных рентгенодифракционного анализа кристалл (размер ~1,0 х 0,5 х 0,1 мм3) на несколько секунд погружали в синтетический маточный раствор (0,1 М Ж ацетата, рН 4,5, 28% ПЭГ3350, 1 М ЫС1, 16% глицерина) и быстро замораживали в потоке азота при 100 К. Данные о дифракции рентгеновских лучей собирали и обрабатывали с помощью микрофокусного генератора рентгеновских лучей Ктдаки М1сгоМах™-007НР, снабженного конфокальной оптикой 08шю™ УапМах™, детектором §а1игп 944 ССГО и системой криоохлаждения Х-8Реат™ 2000 (Юдаки, Вудлендс, Техас). Интенсивность дифракции измеряли при вращении кристалла на 250° со временем экспозиции 1 мин на каждый поворот на половину градуса с максимальным разрешением 5 А. Данные о дифракции рентгеновских лучей обрабатывали с помощью программы О*ТКЕК (РйидтаШ, Ас1а С^у8ίа11οд^арЬ^са §есί^οη Ό, 55:17181725, 1999). Кристаллы принадлежат к группе моноклинных кристаллов С2 со следующими параметрами элементарной ячейки: а = 214,90 А, Ъ = 142,08 А, с = 125,04 А и β = 103,17°. Асимметричная ячейка содержит одну молекулу комплекса. Статистика данных рентгенодифракционного анализа представлена в табл. 13.
Таблица 13
Сбор данных
Пространственная группа Оси элементарной ячейки (А)
Углы элементарной ячейки (°) Разрешение (А)
Отсутствие уникальных отражений Полнота (%)
Избыток
С2 ‘чпегде <Ι/σ>
214/90, 142,08, 125,04 90, 103,17, 90 30-5,0 15,877 99,8 5, 2 0,121 7, 1 (5,18-5,00) (1589) (99,б) (4.9) ¢0,312) (2.9)
Уточнение структуры
Разрешение (А)
Ксгузг/К£Гее (%)ь
Число отражений
Рабочий набор
Исследуемый набор (5% данных) Ктаб. идеальных значений Длина связи (А)
Углы связи (°)
Число атомов белка
График Рамачандрана
Благоприятные области (%) Разрешенные (%)
Запрещенные (%)
29,4-5,0 26,8/30,О
15,792
788
0, 007 0, 744 15,442
93,1
98,8
1,2
Определение структуры
Кристаллическая структура ТЬК3 ЕСГО - РаЪ 15ЕУО - РаЪ 12ОУр/р§У - РаЪ С1068 определялась с помощью программы РТа8ег (КеаД, Ас1а ΟίΛΈΕιΠοβΓ. Ε’ΐΎ8Ει11ο8Γ. Ό. Вю1. ΟπΈΕιΠοβΓ. 57:1373-1382, 2001). Моделями поиска были структуры ΙΌ 1ζίν ТЬК3 ЕСГО (банк данных о белках (РОВ) после удаления всех гликанов, С1юе еί а1., §с1спсс 309:581-585, 2005) и определенные кристаллические структуры высокого разрешения всех фрагментов РаЪ (итоговые данные о кристаллах и статистику для этих РаЪ-фрагментов см. в табл. 13). Угол изгиба фрагмента РаЪ 12ОУр/р§У значительно отличался от такового в свободной форме. Была получена серия моделей РаЪ 12ОУр/р§У путем подстановки разных углов изгиба с интервалом ~5°, одна из которых хорошо согласовалась с электронной плотностью. Уточнение структуры проводили с помощью программы РНЕ№Х (АДат8 еί а1., I. §уηсЬ^οί^οη КаШаЕ 11:53-55, 2004). Уточненная структура представляла собой жесткие домены остова (каждый из доменов У или С) у РаЪ-фрагментов и 13 жестких сегментов (определения, использовавшиеся при детализации структуры: 30-60, 61-108, 109156, 157-206, 207-257, 258-307, 308-363, 364-415, 416-464, 465-514, 515-570, 571-618, 619-687) для ТЬК3 ЕСГО с одним В фактором для каждого жесткого остова РаЪ и одним В для всего комплекса ТЬК3 ЕСГО.
Структуру каждого из жестких остовов РаЪ-фрагмента уточняли поправками на смещение/колебание/вращение атомов (ТЬ§), а внеклеточный домен ТЬК3 ЕСГО был разделен на 2 ТЬ§ сегмента по остатку 330 §ЕО ГО N0: 2. Плотность гликанов была видима в 10 из 15 участков ^гликозилирования. Затем добавляли модели углеводов из кристаллической структуры внеклеточного домена ТЬК3 (С1юе еί а1., §с1Спсс 309:581-585, 2005, РОВ 81гисЦ.1ге ГО: 1ζίν). После уточнения структуры жесткого остова видимая плотность короткого отсутствующего сегмента во внеклеточном домене ТЬК3 (остатки 337-342 из §ЕО ГО N0: 2) была введена в модель вместе с соответствующим сегментом из внеклеточной структуры ТЬК3 2а0ζ Ве11 еί а1., Ргос. №Й. АсаД. §ст (И§А) 102:10976-10980, 2005, РОВ 81гис1иге ГО: 2а0ζ). С-конец ТЬК3 ЕСГО со- 49 021512 держал дополнительную плотность, соответствующую 2а0/. Этот сегмент (647-703 оГ 8ЕЦ ГО ЫО: 2) был затем заменен (остатки 647-687) 2а0\у. Таким образом, модель ТЬК3 ЕСГО представляла собой гибрид между структурами ТЬК3 1ζΐ№ и 2а0/ и была определена как состоящая из 13 жестких сегментов основания (диапазон аминокислот: 30-60, 61-108, 109-156, 157-206, 207-257, 258-307, 308-363, 364-415, 416-464, 465-514, 515570, 571-618, 619-687).
По-видимому, ЬСГОК3 из РаЬ 12ЦУЦ/Ц8У принимали конформацию, отличающуюся от таковой у свободной формы. Симулированный отжиг с несколькими точками старта проводили со стандартными параметрами с помощью программы РНЕЫСХ. Модели этого ЬСГОК3 оценивали визуально по карте электронной плотности и включали в исходную модель конформацию с лучшим соответствием. Процесс уточнения структуры контролировали по показателю КГГее против 5% отражений, установленных до начала вычислений. В этом конечном цикле включали один В-фактор для каждого остатка. Исследование модели и ручное построение области изгиба РаЬ-фрагментов и боковых цепей на поверхности сопряжения белок-белок проводили с помощью программы СООТ (Етк1еу е1 а1., Ас1а Сгук1а11одг. Ό. Вю1. Сгук1а11о§г. 60: 2126-32, 2004). Окончательные значения Ксгук1 и КГГее составили 26,8 и 30,0% соответственно для всех 15 792 независимых отражений до 5,0 А. Статистика определения точной структуры приведена в табл. 13 и 14.
Результаты
Молекулярная структура четвертичного комплекса ЬК3 ЕСГО-три РаЬ
Общая молекулярная структура комплекса показана на фиг. 28. В асимметричной единице присутствует одна молекула ТЬК3 ЕСГО и одна молекула каждого РаЬ. Модель структуры ТЬК3 ЕСГО включает все остатки с 30 до 687 ЬиТЬК3 (8ЕЦ ГО ЫО: 2). Что касается трех РаЬ-фрагментов, были включены все остатки из соответствующих несвязанных форм, за исключением ионов растворителя и молекул воды. Молекула ТЬК3 ЕСГО по общей топологии очень сходна с ранее описанными структурами (гткб 0.79 А для 1ζΐ№, 613 Са'к и 1,37 А для 2а0/, 595 Са'к). Все РаЬ-фрагменты по структуре идентичны своим несвязанным формам, за исключением ЬСГОК3 в РаЬ 12СУО/О8У, как описано в методах, а как и участки изгиба и некоторые боковые цепи в месте соединения ТЬК3 ЕСГО/РаЬ.
- 50 021512
Таблица 14
Сбор данных
РаЬ 12£ν(2/Ο$ν ГаЪ 15ЕУ£ ГаЬ сЮ68
Пространственная группа Р2, Р2у Р2!
Размеры ячейки
а, Ъ, с (А) 75,83, 80,35, 83,06 54,68, 74,74, 64,99 82,48, 136,94, , 83,25
а, Р, у (°) 90, 115,24, 90 90, 103,69, 90 90, 114,95, , 90
Разрешение (А) 70-2,5 (2,59-2,50) 49-2,2 (2,28-2,20) 50-1,9 (2 ,0-1,9)
Уникальные отражения 27,785 (1653) 24,439 (1859) 117,490 1 :5916)
Полнота (%) 88,5 (53) 94, 2 (72,8) 89, 3 1 :45,2)
Избыток 4 (1,8) 5, 2 (4,3) 3,2 (2)
0,164 (0,297) 0, 088 (0,445) 0,065 (0,264)
<1о> (без усреднения) 2,9 (1,2) 3, 8 (1,4) 5, 7 (1,6)
Уточнение структуры
Разрешение (А) 15-2,5 (2,56-2,50) 15-2,2 (2,26-2,20) 75,38-1,90 (1,94-1,90)
К„у5С/К,„е <°)Ь 19,7/25,4 (30,8/40,8) 19,3/26, 9 (24,6/31,1) 20,4/27,7 (39, 8/51,1)
Число отражений
Рабочий набор 26,723 23,308 111,413
Тестовая совокупность 882 1,008 5, 917
Число атомов
Белки 7, 046 3, 705 13,421
Растворитель (вода и т.п.) 486 333 1,779
Длины связи (А) 0,012 0,013 0, 023
КМЗб углы связи (’) 16 1,5 2
График Рамачандрана0
Благоприятные области (%) 923 96, 8 97, 2
Разрешенные (%) 98,9 99, 3 99, 7
Запрещенные (%) 1,1 0,7 0,3
Значения для наибольшего разрешения показаны в ()
Кщегде = Σ|[<Ι>|/ΣΙ, где I - интенсивность измеренного отражения, а <1> - средняя интенсивность всех измеренных отражений.
Ь Нсг/ес = ςΙ |рн4ал. 1-1Ррасч. I 1/Ь| Гна!5л., где Рдабл. к Ррасч. наблюдаемые и расчетные коэффициенты, а К£геа вычисляется для набора произвольно выбранных 5% отражений перед уточнением структуры.
с График Рамачандрана строили с помощью программы Мо1РгоЫру (Бачаз, Ι.Ν., еб а1., Νικζΐθίο АС10е Кез, 32:И615-9, 2004).
Эпитопы и паратопы
Остатки, участвующие в связывании между ТЬК3 ЕСЭ и тремя РаЬ-фрагментами, показаны на фиг.
28В. РаЬ ΡΟΥΟ/ΟδΥ связывается вблизи Ν-конца ТЬК3 ЕСЭ. Конформационный эпитоп состоял из остатков ТЬК3 ЬКК 3-7 (аминокислоты 100-221 8ЕО ГО NΟ: 2). Связывание РаЬ 12ОУО/О8У приводило к погружению примерно на 928 А2 и 896 А2 для антигена и антитела соответственно. Что касается РаЬ 12ОУО/О8У, кристаллическая структура идентифицировала следующие остатки эпитопа ТЬК3 (ЪЕО ГО
2): δ115, Ό116, К117, А120, К139, N140, N141, У144, К145, Т166, 0167, У168, 8188, Е189, Ό192, А195 и А219. Что касается РаЬ 12ОУО/О8У, кристаллическая структура идентифицировала следующие остатки паратопа: (8ЕО ГО NΟ: 211): О28, δ29, Υ30, Υ31, Е49, Ό50, Υ90, Ό91 и Ό92. Тяжелая цепь (8ЕО ГО 214): N32, 054, К56, δ57, К58, Υ60, Υ104, Р105, Р106 и Υ107.
РаЬ 15ЕУО и РаЬ с1068 связывали неперекрывающиеся эпитопы, охватывающие ЬКК 15-23 (аминокислоты 406-635 8ЕО ГО NΟ: 2) вблизи С-конца (фиг. 28). РаЬ-фрагмент 15ЕУО погружен на 1080 А2 и 1064 А2 в поверхность антигена и антитела соответственно, тогда как РаЬ с1068 был погружен на 963 А2 и 914 А2 соответственно. Эпитоп для РаЬ 15ЕУО включает остатки К416, К418, Ь440, N441, Е442, Υ465, N466, К467, Υ468, К488, К489, А491, К493, N515, N516, N517, Н539, N541, δ571, Ь595 и К619 из ТЬК3, показанные в 8ЕО ГО NΟ: 2. Что касается РаЬ 15ЕУ0, его кристаллическая структура идентифицировала следующие остатки паратопа (8ЕО ГО NΟ: 41): 027, Υ32, N92, Т93, Ь94 и δ95. Тяжелая цепь (8ЕО ГО
216): А33, Р50, Ό52, Ό55, Υ57, N59, Р62, Е99, Υ101, Υ104 и Ό106.
Относительно РаЬ с1068 кристаллическая структура идентифицировала следующие остатки эпитопа ТЬК3 (8ЕО ГО 2): Е446, Т448, 0450, К453, К473, N474, А477, Ь478, Р480, δ498, Р499, 0503, Р504, К507, Ό523, Ό524, Е527, Е530 и К559. Относительно РаЬ с1068 его кристаллическая структура идентифицировала следующие остатки паратопа: легкая цепь: Н30, N31, Υ32, N50, Е66, δ67, О68 (д1ус). Тяже- 51 021512 лая цепь: Т30, Т31, Υ32, Ш33, Н35, Е50, N52, N54, N55, К57, N59, У99, М102, Ι103 и Т104.
Механизмы нейтрализации и предпосылки функции ТЬК3 тАЬ 15ЕУЦ: эпитоп тАЬ 15ЕУЦ содержит остатки ТЬК3 N517, Н539 и N541, перекрывающиеся с С-концом участка связывания двухцепочечной РНК (Вс11 с! а1., Ргос. №ц1. Асаб. §ск И8А, 103:8792-7, 2006). Таким образом, не вдаваясь в конкретную теорию, полагают, что тАЬ 15ЕУЦ конкурирует за связывание с ТЬК3 с его лигандом и препятствует лиганд-индуцированной димеризации, необходимой для формирования сигнальной единицы (Ни с! а1., 8сюпсс 320:379-81, 2008). На фиг. 29 показан механизм прямой конкуренции тАЬ 15ЕУЦ. В зависимости от концентрации антител этот механизм приведет к полному ингибированию активации ТЬК3, индуцированному поли(1:С) или двухцепочечной РНК.
тАЬ 12ОУО/О8У и тАЬ с1068: как показано на фиг. 30, эти два антитела не соприкасаются непосредственно с лигандом двухцепочечной ДНК. Таким образом, маловероятно, что они будут нейтрализовать функцию ТЬК3 по механизму, сходному с таковым у тАЬ 15ЕУЦ. Кроме того, РаЬ-фрагменты ориентированы в сторону от лиганда (фиг. 30). По структуре и тАЬ 12ОУО/О5>У, и РаЬ с1068 способны связываться с сигнальной единицей, не нарушая ее функцию. Со стерической точки зрения маловероятно, что два РаЬ-фрагмента молекулы тАЬ способны одновременно связываться с двумя молекулами ТЬК3 в одной сигнальной единице, тем самым препятствуя димеризации ТЬК3, опосредованной двухцепочечной РНК. Не вдаваясь в конкретную теорию, полагают, что связывание тАЬ 12ОУО/О8У или тАЬ с1068 с ТЬК3 препятствует объединению сигнальной единицы из-за стерических столкновений антител и соседних сигнальных единиц. Связывание ТЬК3 с двухцепочечной РНК не ограничено сигнальной единицей, определяемой комплексом двухцепочечной РНК:ТЬК3 (Ни с! а1., 8сюпсс, 320: 379-81, 2008). Возможно, что группировка нескольких сигнальных единиц может привести к усилению сигнализации, или эффективная сигнализация ТЬК3 требует такой группировки. Расположение тАЬ 12ОУО/О8У и тАЬ с1068 может блокировать объединение и приводить к нейтрализации активности ТЬК3. Следовательно, максимальный нейтрализующий эффект антител будет зависеть от степени разделения сигнальных единиц изза связывания антитела. Как показано на фиг. 30, тАЬ 12ОУО/О8У будет способствовать большему разделению, чем тАЬ с1068, что может обусловливать большую силу действия тАЬ 12ОУО/О8У. Это согласуется с наблюдением, что тАЬ с1068 и тАЬ 15ЕУЦ способны привести к ~50 и 100% нейтрализации ТЬК3, при концентрации насыщения соответственно, и что активность тАЬ 12ОУО/О8У проявляется сразу. Таким образом, исследования структуры и нейтрализации ТЬК3 позволяют предположить модель сигнализации посредством ТЬК3, в которой для эффективной сигнализации необходимо объединение сигнальных единиц двухцепочечной РНК:ТЬК3. тАЬ 12ОУО/О8У и тАЬ с1068 также определяют класс антител, способных к частичной модуляции сигнализации посредством ТЬК3, не препятствуя связыванию лиганда или димеризации рецептора.
- 52 021512
Список последовательностей <110> СЕЫГОСОК ОКТНО В1ОТЕСН ШС.
<120> АНТАГОНИСТЫ ТОЛЛ-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА 3 <130> СЕЫ5242РСТ1 <140> РСГ/и52010/0329б4 <141> 2010-04-29 <150> 12/609675 <151> 2009-10-30 <150> 61/109974 <151> 2008-10-31 <150> 61/161860 <151> 2009-03-20 <150> 61/165100 <151> 2009-03-31 <150> 61/173686 <151> 2009-04-29 <160> 229 < 170> ГазСБЕф для ВД1п(3<5«5 версия 4.0 <210> 1 <211> 2712 <212> ДНК <213> Нопо заргелз <400> 1 а!дадасада с!11дсс11д СаЬсСасСЬС Сдддддддсс 1111дссс11: •ЬдЪдсайссЬ ссассассаа дЪдсас!д11 адосаСдаад 11дс1дас1д аадйсдассс аддьасссда гдайсСассс асааасасаа садъд^йдаа аассааслса дааданасс адссдссаас сссасааддс асадссадсх да!д1адда1 сСаасассаС съсаааассд дадссадаас ъдъдссадаа 11аааад111 ¢933001:003 дсасаасдад с1а1сссаас 111ссда1аа 11с1дсасда аъгсдассда асессаесю асдъссаась саа!ссадаа 331:0001:1:1:9 ¢033903933 даа¢¢¢аа¢с аса1Ъада!с ¢д¢с¢са¢аа 1с1асаааа1 1аддаас1са дд11садс!д даааа!с1сс аададс¢¢с¢ аа¢аааа¢¢с аадсдс1ааа аадсдаадаа с¢дда¢а¢с¢ 11дссаа1Ю ааэССададС 1д1са1сдаа 1сааа11ааа дад1111с1с сад9д¢д¢¢¢ ддаадаССаС 11ддссЬсЬЬ ¢с¢даасаа¢ дСссадсСдд дСссСадссС сСаСдСХСдд ааСЪадсааа сасаадсаСС сддаа¢с¢д¢ с1с1дад1аа Сссассасса дсааСасаас Ъ11с1Ьддда сСааадСдда саааСсСсас с1сг.сссаса асаасСЬааа сдсддссддс аасдаЫссС ссдсссддс! даа¢а¢¢¢с¢ ¢сс¢адад¢а СааСааоаСа садсаСССдс. 111с1сас1с сЬ111саа!д ¢дадд¢асс¢ даа¢¢¢дааа сдд!с1111а ¢¢33803889 дссСсзсСсс ссаада!1да 1даИ111с1 ¢¢¢сад¢ддс ¢аааа¢д¢¢¢ ааса¢ддаад а¢аа¢даьа¢ ¢ссаддса¢а аааадсаа¢а ¢$¢¢030899 с¢дааа¢ас¢ ¢аад¢с¢а¢с саас¢сс¢¢¢ асаадСССдс даасСОСдас 111д1а1сзс ЦдсйсаИс 1ссс11асас аСас1саасс Саассаадаа аааа!адада дЪдаСдсССС с!сС1дд11д ддссасс1ад аад1асССда ааСдааанд ддсаадаасС сасаддссад дааСддадад дСсСадаааа аю1а1с111 сссасаасаа дсассСдсад сСдасСадда асссссссдс адсс11саас дас1даедс1 ссдаадддсд дсссНаааа асдйддайад ссаъъссадс сЮ11сд1аа с11даоса11 седдаес1аа дсаасаасаа
1ддда1дс1д садссассСд ссссасссас аасхадссед ас11ссса!д аасс!11дсс аассааааа!
1ддс11дюа а11а!сааас а1с111аааа
1саодсаа11
1асададаад садссадсСд
1а1дс1сдаС сссасаасСа илдсасддд
1а111ссс11 ддадсассИ а11да!ааас аааСдаааса
1аааа1с1са ссЬдддссъс
СаСЩодаа сЪЪддЬссса сСсЮсиса сасадссаас
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
5З 021512 аСаааСдаСд асаСдССдда дддСсССдад ааасСадааа ССсСодаССС дсадсаСаас 1620 аасССадсас ддсСсСддаа асасдсааас ссСддСддСс ссаСССаССС ссСааадддС 1680 сСдСсСсасс СссасаСссС СаасССддад СссаасддсС ССдасдадаС ссеадССдад 1740 дСсССсаадд аСССаЬССда асЬааадаСс аСсдаСССад даССдааСаа СССаааоаоа 1800 сССссадсаС ссдсосссаа Саассаддсд сссесааадс сассдаассс ссадаадаас 1860 сСсаСаасаС ссдССдадаа дааддССССс дддссадсСС СсаддаассС дасСдадССа 1920 дасаСдсдсс ссаасосссс Сдассдсасд сдсдааадса ссдсссддсс сдссаассдд 1980 аССаасдада сссаСассаа саСсссСдад сСдСсаадсс асСассСССд саасасСсса 2040 ссссассасс асдддссссс адсдадассс СССдаСасаС саСсССдсаа адасадсдсс 2100 сссСССдаас СсСССССсаС даСсааСасс адСаСссСдС СдаСССССаС сСССаССдСа 2160 ссссссассс ассссдаддд ссддаддаса сссссссасс ддаасдсссс адСасаСсда 2220 дСссССддсС СсааадаааС адасадасад асадаасадС ссдаасасдс адеасасаса 2280 эССсаСдссС аСааадаСаа ддаССдддСс СдддаасаСС СсСсССсааС ддааааддаа 2340 дассаасссс соаааСсссд сссддаадаа адддассссд аддсдддсдс ссссдаасса 2400 даадсааССд ССаасадсаС саааадаадс адаааааССа СССССдССаС аасасассаС 2460 сСаССаааад асссвСгагд сэааадаССС ааддСасаСс аСдсадССса асаадсСаСС 2520 даасааааСс СддаССссаС СасаССддСС ССссССдадд адассссада СсаСааасСд 2580 аасоасдсас сссдсссдед аададдаасд сссааасосс ассдсасссс дааоСддсса 2640 дССсадааад аасддаСадд СдссСССсдС саСаааССдс аадСадсасС СддаСссааа 2700 аассссдСас ас 2712 <2Ю> 2 <211> 904 <212> РКТ <213> ното зархепз <400> 2
Мес Агд С1п ТЬг Ьеи Рго Суз 11е Туг РЬе Тгр С1у С1у Ьеи Ьеи Рго
1 5 10 15
РЬе 61у МеС Ьеи Суз А1а Зег Зег ТЬг ТЬг Ьуз Суз ТЬг Уа1 Зег ΗΪ3
20 25 30
С1и νβΐ А1а Азр Суз Зег Н1з Ьеи Ьуз Ьеи ТЬг С1п Уа1 Рго Азр Азр
35 40 45
Ьеи Рго ТЬг Азп 11е ТЬг Уа1 Ьеи Азп Ьеи ТЬг Н1з Азп С1п Ьеи Агд
50 55 60
Агд ьеи Рго А1а А1а АЗП РЬе ТЬг Агд Туг Зег С1п Ьеи ТЬг Зег Ьеи
65 70 75 80
Азр Уа1 61 у РЬе АзП ТЬг 11е зег Ьуз ьеи 61и РГО С1и Ьеи Суз О1п
85 90 95
Ьуз Ьеи Рго МеС Ьеи Ьуз Уа1 ьеи Айп Ьеи С1п Нг$ А$П О1и Ьеи Зег
100 105 НО
С1п Ьеи 5ег Азр ьуз ТЬг РЬе А1а РЬе Суз ТЬг АЗП Ьеи ТЬг С1и Ьеи
115 120 125
ΗΪ6 Ьеи МеС Зег Азп Зег Не 61п Ьуз Не Ьуз Азп Азп Рго РЬе УаЬ
130 135 140
ЬуЗ 61п Ьуз Азп Ьеи Не ТЬг Ьеи АЗр Ьеи зег Ηίε АЗП С1у Ьеи Зег
145 150 155 160
Зег ТЬг Ьуз Ьеи 61у ТЬг 61п Уа1 С1п Ьеи б1и Азп Ьеи 61п С1и Ьеи
165 170 175
Ьеи Ьеи Зег Азп Азп Ьуз Не С1п А1а Ьеи Ьуз Зег С1и С1и Ьеи Азр
180 185 190
Не РЬе А1а Азп Зег Зег Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи 61и Ьеи Зег Зег Азп С1п
195 200 205
Не Ьуз 61и РЬе Зег Рго С1у Суз РЬе Нгз А1а 11е 61у Агд Ьеи РЬе
210 215 220
61у Ьеи РЬе Ьеи АЗП Азп Уа1 61п Ьеи С1у Рго Зег Ьеи ТЬг 61 и Ьуз
225 230 235 240
Ьеи Суз Ьеи 61и Ьеи А1а Азп ТЬг Зег Не Агд Азп Ьеи Зег Ьеи Зег
245 250 255
АЗП Зег 61п Ьеи Зег ТЬг ТЬг Зег Азп ТЬг ТЬг РЬе Ьеи С1у Ьеи Ьуз
260 265 270
Тгр ТЬг АЗП Ьеи ТЬг МеС Ьеи Азр Ьеи Зег Туг Азп Азп Ьеи Азп Уа1
275 280 285
- 54 021512
5/а1 С1у Азп Азр Зег РЬе 290
Ьеи С1и Туг Азп Азп Не 305 310
Ьеи РЬе Азп νβΐ Агд Туг 325
Зег 11е Зег Ьеи А1а Зег 340
Тгр Ьеи Ьуз Суз Ьеи С1и 355
С1у Не Ьуз Зег Азп МеС 370
Зег Ьеи Зег Азп Зег РЬе 385 390
РЬе Уа1 Зег Ьеи А1а Ηίβ 405
Азп Ьуз Не Зег Ьуз Не 420
Ьеи <31и УаЬ Ьеи Азр Ьеи 435
С1у С1п С1и Тгр Агд С1у 450
Туг Азп Ьуз Туг Ьеи С1п 465 470
Зег Ьеи С1п Агд Ьеи МеС 485
Зег Зег Рго Зег Рго РЬе 500
Ьеи Зег Азп Азп Азп Не 515
Ьеи С1и Ьуз Ьеи <31 и Не 530
Ьеи Тгр Ьуз Ηίβ А1а Азп 545 550
Ьеи Зег Н1з Ьеи Нгз Не 565
11е Рго УаЬ <31и Уа1 РЬе 580
Ьеи С1у Ьеи Азп Азп Ьеи 595
С1п Уа1 Зег Ьеи Ьуз 5ег 610 \?а1 С1и Ьуз Ьуз Уа1 РЬе 625 630
Азр Мес Агд РЬе Азп Рго 645
РЬе Уа1 Азп Тгр Не Азп 660
Зег Нгз Туг Ьеи Суз Азп 675
Агд Ьеи РЬе Азр ТЬг Зег 690
РЬе РЬе МеС. Не Азп ТЬг 705 710
Ьеи Ьеи Г1е Нгз РЬе О1и 72 5
Зег Уа1 Ягз Агд 5/а1 Ьеи 740
С1п РЬе С1и Туг А1а А1а 755
Тгр Уа1 Тгр С1и Ηίβ РЬе 770
Ьуз РЬе Суз Ьеи С1и б1и 785 790
С1и А1а Не Уа1 Азп Зег Не 805
11е ТЬг ΗΪ5 Нгз Ьеи Ьеи Ьу5 820
Ηίβ Ηίβ А1а ν®1 С1п 01п А1а 835
Ьеи \/а1 РЬе Ьеи С1и С1и 11е 850 855
Суз Ьеи Агд Агд С1у МеС РЬе 865 870
Уа1 С1п Ьуз <31и Агд Г1е С1у 885
Ьеи С1у Зег Ьуз Азп Зег Уа1 900
А1а Тгр Ьеи Рго С1п 295
С1п Нгз Ьеи РЬе Зег 315
Ьеи Азп Ьеи Ьуз Агд 330
Ьеи Рго Ьуз Не Азр 345
Нгз Ьеи Азп МеС С1и 360
РЬе ТЬг 31у Ьеи Не 375
ТЬг Зег Ьеи Агд ТЬг 395
Зег Рго Ьеи Нгз Не 410
С1и Зег Азр А1а РЬе 425
СЬу Ьеи Азп С1и Пе 440
Ьеи С1и Азп Не РЬе 455
Ьеи ТЬг Агд Азп Зег 475
Ьеи Агд Агд Уа1 А1а 490 <31п Рго Ьеи Агд Азп 505
А1а Азп Г1е Азп Азр 520
Ьеи Азр Ьеи С1п Нгз 535
Рго С1у С1у Рго 11е 55 5
Ьеи Азп Ьеи С1и Зег 570
Ьуз Азр Ьеи РЬе <31и 585
Азп ТЬг Ьеи Рго А1а 600
Ьеи Азп Ьеи С1п Ьуз 615 <31у Рго А1а РЬе Агд 635
РЬе Азр Суз ТЬг Суз 650
С1и ТЬг Ηίβ ТЬг Азп 665
ТЬг Рго Рго Н1з Туг 680
Зег Суз Ьуз Азр Зег 695
Зег Не Ьеи Ьеи Не 715
О1у Тгр Агд Не Зег 730
С1у РЬе Ьуз О1и Не 745
Туг 11е Не Нгз А1а 760
Зег Зег МеС С1и Ьуз 775
Агд Азр РЬе С1и А1а 795 ьуэ Агд Зег Агд Ьуа Не 810
Азр Рго Ьеи Суз Ьуз Агд 825
Не С1и С1п Азп Ьеи Азр 840 845
Рго Азр Туг Ьуз Ьеи Азп 860
Ьуз 5ег Нгз Суз Т1е Ьеи 875
А1а РЬе Агд Н1з Ьуз Ьеи 890
Нгз
Ьеи
300
НГЗ
Зег
Азр
Авр
АЗП
380
Ьеи
Ьеи
Зег
С1у
С1и
460
РЬе
Ьеи
Ьеи
Азр
Азп
540
Туг
Азп
Ьеи
Зег
Азп
620
Азп
С1и
Не
Нгз
А1а
700
РЬе
РЬе
Азр
Туг
С1и
780
О1у
Не
РЬе
830
Зег
ΗΪ3
С1п <31и Туг РЬе РЬе
Зег Ьеи Ηίβ С1у 320
РЬе ТЬг Ьуз С1п 335
РЬе Зег РЬе <31п 350
Азп Азр Не Рго 365
Ьеи Ьуз Туг Ьеи
ТЬг Азп С1и ТЬг 400
Азп Ьеи ТЬг Ьуз 415
Тгр Ьеи С1у Нгз 430 <31п 31и Ьеи ТЬг 445
Не Туг Ьеи Зег
А1а Ьеи Уа1 Рго 480
Ьуз Азп Уа1 Азр 495
ТЬг Не Ьеи Азр 510
МеС Ьеи С1и С1у 525
Азп Ьеи А1а Агд
РЬе Ьеи Ьуз С1у 560
О1у РЬе Азр С1и 575
Ьуз Не Пе Азр 590
Уа1 РЬе Азп Азп 605
Ьеи Не ТЬг Зег
Ьеи ТЬг <31и Ьеи 640
Зег Не А1а Тгр 655
Рго <31и Ьеи Зег 670
С1у РЬе Рго Уа1 685
Рго РЬе С1и Ьеи
Не РЬе Не Уа1 720
Туг Тгр Азп Уа1 735
Агд 31п ТЬг С1и 750
Ьуз Азр Ьуз Азр 765
Азр <31п Зег Ьеи
Уа1 РЬе 61и Ьеи 800
РЬе Уа1
815
Ьуз Уа1
Не Не
А1а Ьеи
Тгр Рго 880
Уа1 А1а
895 <210> 3 <211> 2109 <212> ДНК <213> Ногпо заргепз <400> 3 аСдадасада сСССдссССд СаСсСасССс сдддддддсс сбЬСдсссСС СдСдсаСссС ссассассаа дсдсассдсс адссаСдаад сСдсСдасСд аадссдассс аддсасссда сдасссассс асааасаСаа садСдССдаа ааСсаассса даадассасс адссдссаас сссасааддс асадссадсс даСдЬаддаС ССаасассаС сСсаааасСд дадссадааС СдСдссадаа ссаааадссс СдаассСсса дсасааСдад сСаСсСсаас сысСдаСаа ссссдсасда аСССдасСда асСссаСеСс аСдСссаасС сааСссадаа аасссссссд Ссаадсадаа дааСЪСааСс асаССадаСс СдСсСсаСаа СсСасааааС СаддаасСса ддССсадсСд дааааЬсссс аададессес аасаааассс аадсдсСааа аадсдаадаа сСддаСассС ссдссааССс аааССададС сдссассдаа СсаааССааа дадССССсСс садддсдССС ддаадаССаС ССддссСсСС СсСдаасааС дСссадсСдд дСсссадссС сСаСдСССдд аассадсааа сасаадсаСЬ сддааСссдС. сСсСдадСаа Сссассасса дсаасасаас ссссссддда сСааадСдда саааСсСсас сССЬссСаса асаасССааа СдСддССддС аасдаССссС сСдсССддсс даасассссс ссссададса саасаасаса садсасссдс ссссссассс сССССсааСд сдаддСассС дааСССдааа сддСсССССа сСааасааад дссСсасСсс ссаадаССда сдэссссссс ссСсадСддс сааааСдССС аасаеддаад асаасдасас сссаддсаса аааадсааса сдсссасадд сСдаааСасС СаадСсСаСс саасСссССС асаадСССдс даасСССдас СССдСаСсас ссдсссассс ссссссасас асасссаасс саассаадаа ааааСадада дсдасдессс сссССддССд ддссассСад аадсасссда ааЬдааассд ддсаадаасС сасаддссад дааЬддадад дссСадаааа асесассссс сссасаасаа дСассСдсад сСдасСадда асСссСССдс адссЬСсаас дасСдаСдсС ссдаадддСд дсссСЬаааа аСдСддаСад ссаССссадс сСсССсдСаа сЬЬдассасс сСддаСссаа дсаасаасаа аСаааСдаСд асаЬдССдда дддЬсЬСдад ааассадааа ссессдассс аасССадсас ддсСсСддаа асасдсааас ссСддЬддСс ссаСССаССС сСдСсСсасс ЬссасасссС СаасССддад сссаасддсс ссдасдадас дСсССсаадд асссасссда асСааадаСс аСсдаСССад дассдаасаа сССссадсаС сСдЪсСССаа СааСсаддСд СсСсСааадС саССдаассС сссасаасас ссдссдадаа дааддССССс дддссадсСС ссаддаассс даСаСдсдсС ССааСссссс Сдассдсасд сдсдааадса ссдессддсс аССаасдада сссаСассаа саСссссдад ссдссаадсс ассассСССд ссСсасСаСс аСдддССссс адСдадаеЬС СССдаСасаС саСсССдсаа ссссссдаа
СдддаСдсСд 60 садссассСд 120 ссССасссаС 180 аассадсССд 240 асССсссаСд 300 ааессссдсс 360 аассааааас 420 ЬддссСдСса 480 аЬСаСсааас 540 аъссссаааа 600 ЬсасдсааСС 660 Сасададаад 720 садссадссд 780 ТаСдсЬсдаС 840 бссасаасСа 900 Тбсдсасддд 960 ЬаСССсссСС 1020 ддадсассСС Ю80 аьсдаьааас 1140 аааСдаааса 1200 СаааассСса 1260 еесдддсссс 1320 СаССССсдаа 1380 сЬСддСссса 1440 сбсСссССса 1500 саСадссаас 1560 дсадсасаас 1620 ссСааадддС 1680 сссадссдад 1740 сссааасаса 1800 ЪсадаадааС 1860 дассдадсса 1920 сдссаассдд 1980 саасасСсса 2040 адасадСдсс 2100
2109 <210> 4 <211> 703 <212> РКТ <213> Нолю заргепз
- 55 021512 <400> 4
МеС. Агд С1п ТЬг Ьеи Рго Суз Не туг РЬе Тгр С1у С1у Ьеи Ьеи Рго
1 5 10 15
РЬе С1у МеС Ьеи Суз А1а Зег Зег ГЬг ТЬг Ьуз Суз ТЬг Ча1 Зег Нхз
20 25 30
<31и Ча1 А1а Азр Суз Зег Нхз Ьеи Ьуз Ьеи ТЬг О1п Ча1 Рго Азр Азр
35 40 45
Ьеи Рго ТЬг Азп Не ТЬг Ча! Ьеи Азп Ьеи ТЬг Ηίδ Азп С1п Ьеи Агд
50 55 60
Агд Ьеи Рго А1а А1а Азп РЬе ГЬг Агд Туг Зег С1п Ьеи ТЬг Зег Ьеи
65 70 75 80
Азр Ча1 <31у РЬе Азп ТЬг Не Зег Ьуз Ьеи С1и Рго С1и Ьеи Суз С1п
85 90 95
Ьуз Ьеи Рго Мес Ьеи Ьуз Ча1 Ьеи Азп Ьеи 61п Ηίδ Азп С1и Ьеи Зег
100 !05 110
51п Ьеи Зег Азр Ьуз ТЬг РЬе А1а РЬе Су 5 ТЬг Αεη Ьеи ТЬг <31и Ьеи
115 120 125
Нхз Ьеи мес Зег Азп Зег Не С1п Ьуз Не Ьуз Азп Азп РГО РЬе Ча1
130 135 140
Ьуз С1п Ьуз Азп Ьеи Не ТЬг Ьеи Азр Ьеи Зег Нхз Азп С1у Ьеи Зег
145 150 155 160
Зег ТЬг Ьуз Ьеи С1у ТЬг С1п Ча1 С1п Ьеи <31и Азп Ьеи С!п С1и Ьеи
165 170 175
Ьеи Ьеи Зег Азп Азп Ьуз 11е С1п А!а Ьеи Ьуз Зег С1и С1и Ьеи Азр
180 185 190
Не РЬе А1а Азп 5ег Зег Ьеи Ьув Ьуз Ьеи С1и Ьеи Зег Зег Аеп О1п
195 200 205
Не Ьуз 61и РЬе Зег Рго 61у Суе РЬе Шз А1а Не О1у Агд Ьеи РЬе
210 215 220
О1у Ьеи РЬе Ьеи Азп Азп Ча! О1п Ьеи <31у Рго Зег Ьеи ТЫ О1и Ьуз
225 230 23 5 240
Ьеи Суз Ьеи <31и Ьеи А1а Азп ТЬг Зег Не Агд Азп Ьеи Зег Ьеи Зег
245 250 255
Азп Зег С1п Ьеи Зег ТЬг ТЬг Зег Азп ТЬг ТЬг РЬе Ьеи О1у Ьеи Ьуз
260 265 270
тгр ТЬг Азп Ьеи ТЬг мес Ьеи Азр Ьеи Зег Туг Азп Азп ьеи Азп Ча1
275 280 285
Ча1 61у Азп Азр Зег РЬе А1а Тгр Ьеи Рго от Ьеи 61и Туг РЬе РЬе
290 295 300
Ьеи 61и Туг Азп Азп Не от Ηίδ Ьеи РЬе Зег Нхз Зег Ьеи Нхз О1у
305 ЗЮ 315 320
Ьеи РЬе Азп Ча1 Агд Туг Ьеи Азп Ьеи Ьуз Агд Зег РЬе ТЬг Ьуз С1п
325 330 335
Зег 11е Зег Ьеи А1а Зег Ьеи Рго Ьуз Не Азр Азр РЬе Зег РЬе С1п
340 345 350
Тгр Ьеи Ьуз Суз Ьеи С1и Нхз Ьеи Азп МеС 31и Азр Азп Азр Не Рго
355 360 365
О1у Не Ьуз Зег Азп Мес РЬе ТЬг <31у Ьеи Не Азп Ьеи Ьуз Туг Ьеи
370 375 380
Зег Ьеи Зег Азп 5ег РЬе ТЫ Зег Ьеи Агд ТЬг Ьеи ТЬг Азп 01и ТЬг
385 390 395 400
РЬе Ча1 Зег Ьеи А1а ΗΪ3 Зег Рго Ьеи Шз Не Ьеи Азп Ьеи ТЬг Ьуз
405 410 415
Азп Ьуз Не Зег Ьуз Не С1и Зег Азр А1а РЬе Зег Тгр Ьеи О1у Нхз
420 425 430
Ьеи <31и ча1 Ьеи Азр Ьеи С1у Ьеи Азп С1и Не С1у 31п С1и Ьеи ТЬг
435 440 445
С1у 61п <31и Тгр Агд С1у Ьеи С1и Азп Не РЬе 01и Не Туг Ьеи Зег
450 455 460
Туг Азп Ьуз Туг Ьеи 61п Ьеи ТЬг Агд Азп Зег РЬе А1а Ьеи Ча1 Рго
465 470 475 430
Зег Ьеи <31п Агд Ьеи МеС Ьеи Агд Агд Ча1 А1а Ьеи Ьуз Азп ча1 АЗр
485 490 495
Зег Зег Рго Зег Рго РЬе О1п Рго Ьеи Агд Азп Ьеи ТЬг Не Ьеи Азр
500 505 510
Ьеи зег Азп Азп Азп Не А1а Азп 11е Азп Азр Азр Мес Ьеи 61и 61у
515 520 525
Ьеи С1и Ьуз Ьеи С1и Не Ьеи Азр Ьеи 01п Нхз Азп Азп Ьеи А1а Агд
530 535 540
Ьеи Тгр Ьуз Шз А1а Азп Рго 61у <31у Рго Не Туг РЬе Ьеи Ьуз С1у
545 550 555 560
Ьеи Зег Ηίδ Ьеи Шз 11е Ьеи Азп Ьеи С1и 5ег Азп О1у РЬе Азр С1и
565 570 575
Не Рго Ча1 31и Ча1 РЬе Ьуз Азр Ьеи РЬе С1и Ьеи Ьуз Не Не Азр
580 585 590
Ьеи С1у Ьеи Азп Азп Ьеи Азп ТЬг Ьеи Рго А1а Зег Ча1 РЬе Азп Азп
595 600 605
С1п Ча1 Зег Ьеи Ьуз Зег Ьеи Азп Ьеи С1п Ьуз Азп Ьеи 11е ТЬг Зег
610 615 620
Ча1 С1и Ьуз Ьуз Ча! РЬе С1у Рго А1а РЬе Агд АЗП Ьеи ГЬг С1и Ьеи
625 630 635 640
Азр МеС Агд РЬе Азп Рго РЬе Азр Суз ТЬг Суз С1и Зег Не А1а Тгр
645 650 655
РЬе Ча1 Азп Тгр 11е Азп С1и ТЬг Ηίδ ГЬг Азп Не Рго С1и Ьеи Зег
660 665 670
Зег Нхз Туг Ьеи Суз Азп ТЬг Рго Рго Шз Туг Нхз 61у РЬе Рго Ча1
675 680 685
Агд Ьеи РЬе Азр ТЬг Зег Зег Суз Ьуз Азр Зег А1а Рго РЬе С1и
690 695 700
<210> 5 <211> 107 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Кандидат 16 ЧЬ
<400> 5
Азр Не Θΐη Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 61у
1 5 10 15
Азр Агд Ча1 ТЬг 11е ТЫ Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг С1у А1а Зег Азп Ьеи О1п Зег О1у Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а Ча1 Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азр Азр РЬе Зег 11е
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ча1 31и Не Ьуз
100 105
<210> 6
<211> 116
<212> РРТ
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Кандидат 16 ЧН
<400> 6
С1п Ча1 С1и Ьеи Ча1 <31п Зег С1у А1а С1и ЧаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у 61и
10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЬе Азп А$п Туг 20 25 30
Тгр Не О1у Тгр νβΐ Агд <31п МеС. Рго С1у Ьуз С1у Ьеи (31и Тгр МеС. 35 40 45
С1у Не 11е Азр Рго С1у Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е Зег ТЬг А1а Туг
70 75 80
Ьеи О1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеЬ Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд Азп Не Туг С1и РЬе Азр Туг Тгр <31у <51п «31у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 НО
ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 7 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 17 VI <400> 7
Азр Не С1и Ьеи ТЬг С1п Рго Рго 5ег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго С1у С1п
ТЬг А1а Агд Не Зег Суз Зег <31у Азр А1а Ьеи 61у С1у Туг РЬе Уа1
20 25 30
Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Уа1 Ьеи Уа1 Не Туг
35 40 45
Азр Азр Азр Азп Ахд Рго Зег 61у Не Рго С1и Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЫ А1а ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег <31у ТЬг С1п А1а С1и
65 70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз А1а Зег Туг Азр С1у Азр С1и РЬе ТЬг
Уа1 РЬе С1у С1у б1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 100 105 <210> 8 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 17 УН <400> 8
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго СЬу Ьеи
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а Не Зег С1у Азр 20 25
Зег А1а А1а Тгр О1у Тгр 11е Агд С1п Зег Рго 35 40
Тгр Ьеи С1у Агд 11е Туг МеС Агд Зег Ьуз Тгр 50 55
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд Не ТЬг 11е Азп Рго 65 70 75
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго
Туг Туг Суз А1а Агд ΗΪ3 ТЬг Туг Рго Туг Ьеи 100 105
Уа1 Ьуз
Зег Уа1
61у Агд 45
Туг Азп 60
Азр ТЬг
С1и Азр
Зег РЬе
Рго Зег 31п 15
Зег ТЬг Агд 30
С1у Ьеи С1и
Азр Туг А1а
5ег Ьуз Азп 80
ТЬг А1а Уа1 95
Азр Уа1 Тгр
110
О1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 9 <211> 108 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 18 Н <400> 9
Азр 11е С1и Ьеи ТЬг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго С1у С1п 15 10 15
ТЬг А1а Агд Не Зег Суз Зег О1у Азр Азп Х1е С1у Зег Туг Туг Уа1 20 25 30
Н±з Тгр Туг б!п О1п Ьуз Рхо С1у С1п А1а Рго Уа1 Ьеи Уа1 11е Туг 35 40 45
С1и Азр Зег С1и Агд Рго Зег С1у 11е Рго С1и Ахд РЬе Зег С1у Зег 50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег О1у ТЬг С1п А1а С1и
70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег С1п РЬе Зег РЬе
О1у Уа1 РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 100 105 <210> 10 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтети' <220>
<223> Кандидат 18 УН последовательность <400> 10 С1п Уа1 С1и
ТЬг Ьеи Зег
Зег А1а А1а 35
Тгр Ьеи С1у 50
Уа1 Зег Уа1 65
С1п РЬе Зег
Туг Туг Суз ьеи С1п 5
Ьеи ТЬг 20
Тгр О1у
Не Не
Ьуз Зег
Ьеи <31п 85
А1а Агд 100
ТЬг Ьеи
О1п Зег
Суз А1а
Тгр Не
С1п Ьуз 55
Агд Не 70
Ьеи Азп
Туг Зег
Уа1 ТЬг
О1у Рго 31у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег <31п 10 15
Не Зег С1у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп
Агд О1п Зег Рго С1у Агд &1у Ьеи С1и
Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг А1а 60
ТЬг 11е Азп Рго Азр ТЫ Зег Ьуз Азп 75 80
Зег Уа1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1
Туг Рго РЬе Туг Зег 11е Азр Туг Тгр 105 110
Уа1 Зег Зег <210> 11 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
- 57 021512 <223> Кандидат 19 УЬ <400> 11
Азр 11е С1п МеС ТЬг С1п Зег 1 5
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз 20
Ьеи А1а Тгр Туг С1л С1п Ьуз 35
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п 50 55
Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе 65 70
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг
Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 10 15
Агд А1а Зег Θΐη Зег 11е <31у Ьеи Туг 25 30
Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые
45
Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
ГЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 31п Рго 75 80
Суз <31п С1п Туг С1у Зег Уа1 Зег Ые 90 95 <210> 12 <211> 121 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность
Зег Ьеи Ьуз
Тгр Уа1 <31у 35
С1у РЬе Ые 50
С1п С1у С1п 65
Ьеи <31п Тгр
А1а Агд С1и
Ьеи Уа1 5
11е Зег 20
Тгр Уа1
Азр Рго
Уа1 ТЬг
5ег Зег 85
Ьеи Туг 100
Ьеи Уа1 (31п Зег С1у
Суз Ьуз 61у
Агд С1п МеС 40
Зег Азр Зег 55
11е Зег А1а 70
Ьеи Ьуз А1а
С1п <31у Туг
А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз 10
Зег С1у Туг Зег РЬе 25
Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45
Туг ТЬг Азп Туг А1а 60
Азр Ьуз Зег 11е Зег 75
Зег Азр ТЬг А1а МеС 90
МеС Азр ТЬг РЬе Азр :
105
Зег
Рго С1у <31и 15
ТЬг Азп Туг 30
31и Тгр Мес
Рго Зег РЬе
ТЬг А1а Туг 80
Туг Туг Суз 95 <210> 13 <211> 108 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <400> 13
Азр 11е Уа1 Ьеи ТЬг 1 5
С1и Агд А1а ТЬг Ьеи
Туг Ьеи А1а Тгр Туг 35
11е Туг Азр А1а Зег 50
Θΐη Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго <31у 10 15
Зег Суз Агд А1а Зег С1п Туг 11е Азр 11е Зег 25 30
С1п 61п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи 40 45
Зег Агд А1а ТЬг С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у 65
Рго С1и Азр РЬе А1а
ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1и 70 75 80
Уа1 Туг Туг Суз С1п С1л Туг Туг Зег Ьеи Зег
Ые ТЬг РЬе Пу С1п 100
61у ТЬг Ьуз Уа1 31и 11е Ьуз 105 <210> 14 <211> 119 <212> РВТ <213> Синтетическая <220>
<223> Кандидат 1 νΗ <400> 14
Пу νθ1 Ии Ьеи ν&1 1 5
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег
Тгр Не Зег Тгр Ча! 35
01у Уа1 Ые Азр Рго 50
С1п С1у Ип Уа1 ТЬг 65
Ьеи С1п Тгр Зег Зег 85
А1а Агд С1и Тгр С1у 100
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 115 последовательность
С1п Зег
Суз Ьуз
Агд С1п
Зег Азр 55
11е Зег 70
Ьеи Ьуз
Ые 61у
Зег Зег
Пу А1а
Пу Зег 25
А1а Рго 40
Зег туг
А1а Аар
А1а Зег
С1у МеС 105
Ии ν?1 Ьуа 10
Ну Туг Зег
С1у Ьуз <31у
ТЬг Азп Туг 60 ьуз Зег 11е 75
Азр ТЬг А1а 90
Уа1 Азр 11е
Ьуз Рго
РЬе ТЬг 30
Ьеи <31и 45
А1а Рго
Зег ТЬг
МеС Туг
Тгр Иу 110
Иу С1и 15
Азр Азп
Тгр МеС
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Ип С1у <210> 15 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>
<223> Кандидат 2 УЬ <400> 15
Азр Ые Ип МеС ТЬг 1 5
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е
Ьеи Азп Тгр Туг С1п 35
Туг 21у А1а Зег Азп 50
Зег Иу Зег Иу ТЬг 65
Ии Азр РЬе А1а Уа1 85
ТЬг РЬе С1у <31п О1у 100 последовательность
Ип Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у Ю 15
ТЬг Суз Агд А1а Зег Ип С1у 11е Зег Зег Тгр 25 30
С1п Ьуз Рго Иу Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые 40 45
Ьеи Ип Зег С1у Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 55 60
Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи (51п Рго 70 75 80
Туг Туг Суз 61п С1п Туг Азр Азр РЬе Зег Ые <210> 16 <211> 116 <212> РКТ
- 58 021512 <213? Синтетическая последовательность <220>
<223? Кандидат 2 УН <400? 16
С1п Уа1 С1и 1
Зег ьеи Ъуа
Тгр Не С1у
С1у Не Не 50
С1п С1у С1п 65
Ьеи С1п Тгр
А1а Агд Азп
ТЬг Уа1 Зег 115
Ьеи Уа1 5
Не Зег 20
Тгр Уа1
Азр Рго
Уа1 ТЬг
Зег Зег 85
11е Туг
100
Зег
С1п Зег
Суз Ьуз
Агд С1п
С1п Азр 55
Не Зег 70
Ьеи Ьуз
С1и РЬе
С1у АЬа
С1у Зег 25
МеЬ Рго
Зег Тгр
А1а А$р
А1а Зег
С1и Уа1 Ю
С1у Туг
С1у Ьуз
ТЬг Азп
Ьуз Зег 75
Азр ТЬг 90
Тгр 51у
Ьуз Ьуз
Зег РЬе
61у Ьеи 45
Туг А1а 60
Не Зег
А1а Меь
О1п О1у
С1и
Туг меь
РЬе
Туг
Суз
Уа1
Рго С1у 15
АЗП Азп 30
С1и Тгр
Рго Зег
ТЬг А1а
Туг Туг 95
ТЬг Ьеи НО <210> 17 <211> 107 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 3 УЬ <400> 17
Азр Не С1и Ьеи ТЬг 1 5
ТЬг А1а Агд Не Зег
Зег Тгр Туг С1п С1п 35
Азр Азр Азр Азп Агд 50
Азп Зег С1у Азп ТЬг 65
Азр С1и А1а Азр Туг 85
Уа1 РЬе С1у С1у 61у 100
С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго <31у 10 15
Суз Зег С1у Азр А1а Ьеи С1у С1у Туг РЬе 25 30
Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго УаЬ Ьеи Уа1 Не 40 45
Рго Зег О1у Не Рго (31и Агд РЬе Зег С1у 55 60
А1а ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег С1у ТЫ С1п А1а 70 75
Туг Суз А1а Зег Туг Азр <31у Азр 31и РЬе
С1п
УаЬ
Туг
Зег
С1и
ТЫ
ТЫ Ьуз Ьеи ТЬг ν*1 Ьеи 105 <210? 18 <211? 122 <212> РЕТ <213? Синтетическая последовательность <220?
<223? Кандидат 3 УН <400> 18
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег 1 5
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 20
Зег А1а А1а Тгр С1у 35
Тгр Ьеи С1у Агд Не 50
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег 65
С1п РЬе Зег Ьеи С1п 85
Туг Туг Суз АЬа Агд 100
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи 115
Тгр 11е
Нгз Агд 55
Агд Г1е 70
Ьеи Азп
НЬз ТЬг
УаЬ ты
С1у Рго
Не Зег 25
С1у Ьеи Уа1 Ьуз 10
С1у Азр Зег Уа1
Агд С1п 40
Агд Зег
ТЬг 11е
Зег Уа1
Туг Рго 105
Уа1 зег 120
Зег Рго
Ьуз Тгр
Азп Рго 75
ТЬг Рго 90
Туг Ьеи
Зег
Рго Зег 15
Зег ТЫ 30
С1у Агд 45
Туг Азп 60
Азр ТЬг
С1и Азр
Зег РЬе
С1у Ьеи
Азр Туг
Зег Ьуз
ТЬг А1а 95
С1п
Агд
СЬи
АЬа
Азп
УаЬ
Тгр <210> 19 <211? 107 <212? РЕТ <213> Синтетическая последовательность <400? 19
Азр 11е С1и Ьеи ТЬг 1 5
ТЫ А1а Агд Не Зег
Зег Тгр Туг <31п С1п 35
Азр Азр Азр Азп Агд 50
Азл Зег О1у Азп ТЬг 65
Азр 51и А1а Азр Туг 85 (31п Рго
Суз Зег
Ьуз Рго
Рго Зег 55
А1а ТЬг 70
Туг Суз
ГЫ Ьуз
Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго <31у 10 15
С1у Азр А1а Ьеи 61у С1у Туг РЬе 25 30 (31у 31п АЬа Рго Уа1 Ьеи Уа1 11е
45
С1у 11е Рго С1и Агд РЬе Зег С1у
Ьеи ТЬг 11е Зег СЬу ТЬг С1п А1а 75
А1а Зег Туг Азр <31у Азр С1и РЬе <31п
УаЬ
Туг
Зег
С1и
ТЬг <210? 20 <211? 122 <212? РЕТ <213? Синтетическая последовательность <220?
<223? Кандидат 4 УН
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг 20
Зег АЬа АЬа Тгр О1у 35
Тгр Ьеи С1у Ьуз Не 50
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег 65
О1п РЬе Зег Ьеи С1п 85
Туг Туг Суз АЬа Агд 100
С1у <31п С1у ТЬг Ьеи 115
С1п Зег
Суз АЬа
Тгр Не
Зег Туг 55
Агд Не 70
Ьеи Азп
ΗΪ3 ТЬг
Уа1 ТЬг <31у Рго
Не Зег 25
Агд С1п 40
Агд Зег
ТЬг Не
Зег Уа1
Туг Рго 105
Уа1 зег 120
51у Ьеи Ю
31у Азр
Зег Рго
Агд Тгр
Азп Рго 75
ТЬг Рго 90
Туг Ьеи
Зег
УаЬ Ьуз
Зег Уа1
СЬу Агд 45
Туг Азп 60
Азр ТЬг
С1и Азр
Зег РЬе
Рго Зег 15
Зег ты 30 <31у Ьеи
Азр Туг
Зег Ьуз
ТЬг А1а 95
Θΐη
Агд
СЬи
АЬа
Азп
Уа1
Тгр
- 59 021512 <210> 21 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <400> 21
Азр Не 31и Ьеи ТЬг О1п Рго Рго Зег Ча! Зег Ча1 А1а Рго С1у 31п
ТЬг А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр А1а Ьеи С1у О1у Туг РЬе Ча1 20 25 30
Зег Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Ча1 Ьеи Ча1 Г1е Туг 35 40 45
Азр Азр Азр Азп Агд Рго Зег С1у Г1е Рго <31и Агд РЬе Зег С1у Зег 50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег С1у ТЬг С1п А1а С1и
70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр С1и Азр Зег А1а ТЬг <210> 22 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг 20
Зег А1а А1а Тгр <31у 35
Тгр Ьеи С1у Агд 11е 50
Ча1 Зег Ча1 Ьуз Зег 65
С1п РЬе 5ег Ьеи С1п 85
Туг Туг Суз А1а Агд 100
31у 31п С1у ТЬг Ьеи 115
С1п Зег С1у Рго С1у Ьеи Ча1 Ьуз Рго Зег С1п 10 15
Суз А1а Не Зег <31у Азр Зег Ча1 Зег ТЬг Агд 25 30
Тгр 11е Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и 40 45
Туг Мей Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а 55 60
Агд 11е ТЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп 70 75 80
Ьеи Азп Зег Ча1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Ча1
95
Н1з ТЬг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЬе Азр Ча1 Тгр
105 НО
Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег
120 <210> 23 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 6 ЧЬ <400> 23
Азр Не С1и Ьеи ТЬг С1п Его Рго Зег Ча1 Зег Ча! А1а Рго С1у С1п
ТЬГ А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр А1а Ьеи С1у 01у Туг РЬе Ча1
20 25 30
Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Й1п А1а Рго ча1 Ьеи Ча1 Не Туг
35 40 45
Азр Азр А5Р Азп Агд Рго Зег С1у Не Рго 61и Агд РЬе Зег С1у Зег
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег <31у ТЬг С1п А1а С1и
70 75 80
Азр е!и А1а Азр Туг Туг Суз С1у Зег Туг Азр Зег Азп Зег Ьеи ТЬг
Ча! РЬе С1у С1у 61у ТЬг Ьуз ьеи ТЬг Ча1 Ьеи 100 105 <210> 24 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 6 ЧН <400> 24
С1п Ча1 С1и Ьеи С1п 1 5
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг
Зег А1а А1а Тгр С1у 35
Тгр Ьеи С1у Агд Не 50
Ча! 5ег Ча1 Ьуз Зег 65
С1п РЬе Зег Ьеи <31п 85
Туг Туг Суз А1а Агд 100
С1у С1п б1у ТЬг Ьеи 115
С1п Зег
Суз А1а
Тгр 11е
Туг Мей. 55
Агд 11е 70
Ьеи Азп
Н15 ТЬг
Ча1 ТЬг
61у Рго
11е 5ег 25
Агд 61п 40
Агд Зег
ТЬг Не
Зег Ча1
Туг Рго 105
Ча1 Зег 120
С1у Ьеи 10
С1у Азр
Зег Рго
Ьуз Тгр
АЕП РГО 75
ТЬг Рго 90
Туг Ьеи
Зег
Ча1 Ьу5 Рго
Зег Ча1 Зег 30
С1у Агд С1у 45
Туг Азп Азр 60
Азр ТЬг Зег
С1и Азр ТЬг
Зег РЬе Азр 110
Зег С1п 15
ТЬг Агд
Ьеи С1и
Туг А1а
Ьуз Азп 80
А1а Ча1 95
Уа1 Тгр <210> 25 <211> 107 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 7 ЧЬ <400> 25
Азр Не С1и Ьеи ТЬг 61п Рго Рео Зег Ча1 Зег Ча1 А1а Рго С1у С1п 15 10 15
ТЬг А1а Агд 11е Зег Суз Зег С1у Азр А1а Ьеи С1у (31у Туг РЬе Ча1
20 25 30
Зег Тгр туг С1п С1п Ьуа Рго С1у С1п А1а Рго ча1 Ьеи Ча1 Не Туг
35 40 45
Азр Азр Азр Азп Агд Рго Зег 31у Не Рго С1и Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
Азп Зег С1у А5П ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег С1у ТЬг С1п А1а 61и
65 70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Зег Зег Туг Азр Зег Азр Зег Ьеи ТЬг
- 60 021512
90 95 νβΐ РЪе С1у С1у С1у ТЪг Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи
100 105 <210> 26 <211> 122 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 7 νΗ <400> 26
С1п νβΐ С1и Ьеи Θΐη С1п Зег С1у Рго С1у Ьеи νβΐ Ьуз Рго Зег Θΐη 15 10 15
ТЪг Ьеи Зег Ьеи ТЪг Суз А1а 11е Зег С1у Азр Зег Уа1 Зег ТЪг Агд 20 25 30
Зег А1а А1а Ггр С1у Тгр 11е Агд С1п Зег Рго О1у Агд С1у Ьеи О1и 35 40 45
Тгр Ьеи С1у Агд Не Туг МеС. Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а 50 55 60
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд 11е ТЪг 11е Азп Рго Азр ТЪг Зег Ьуз Азп
70 75 80
Θΐη РЪе Зег Ьеи 01п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЪг Рго С1и Азр ТЪг А1а νβΐ
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Нхз ТЪг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЪе Азр Уа1 Ггр
100 105 110
С1у С1п О1у ТЪг Ьеи ЛаЬ ТЪг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 27 <211> 108 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 8 УЬ <400> 27
Аер Не С1и Ьеи ТЪг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег νβΐ А1а Рго С1у С1п
1 5 10 15
ТЪг А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр Αδη Пе С1у Зег Туг Туг уа1
20 25 30
Ηί3 Тгр Туг СЬп С1п Ьуз Рго 01у С1п А1а Рго νβΐ Ьеи Уа1 Не Туг
35 40 45
С1и Азр Зег 61и Агд Рго Зег С1у 11е Рго С1и Агд РЪе Зег <31у Зег
50 55 60
Αδη Зег С1у Αδη тьг А1а ТЪг Ьеи ТЪг Пе Зег <31у ТЪг 61п А1а О1и
65 70 75 80
Азр 61и А1а Азр туг Туг Суз 01п Зег Туг Азр Зег 01η РЪе Зег РЪе
85 90 95
С1у Уа1 РЪе С1у 01у 61у ТЪг Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи
100 105 <210> 28 <211> 122 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 8 УН <400> 28 <31п Уа1 С1и Ьеи С1п О1п Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п 15 10 15
ТЪг Ьеи Зег Ьеи ТЪг Суз А1а 11е Зег С1у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр 11е Агд <31п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи <31и 35 40 45
Тгр Ьеи 61у 11е Не О1п ТЪг Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а 50 55 60
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд 11е ТЪг 11е Азп Рго Азр ТЪг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЪе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЪг Рго С1и Азр ТЪг А1а Уа1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЪе Туг Зег Не Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЪг Ьеи Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 29 <211> 108 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 9 УЬ <400> 29
Азр Не С1и Ьеи ТЪг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 15 10
ТЪг А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр Азп Не С1у 20 25
Нхз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у С1п А1а Рго Уа1 35 40
С1и Азр Зег С1и Агд Рго Зег <31у Не Рго С1и Агд 50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЪг А1а ТЪг Ьеи ТЪг Не Зег С1у 65 70 75
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз <31п Зег Туг Азр Зег
90
С1у Уа1 РЪе 01у С1у С1у ТЪг Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи 100 105
А1а
Зег
Ьеи
РЪе
ТЪг
С1п
Рго
Туг
Уа1
Зег
С1п
РЪе
О1у
Туг
Не
О1у
А1а
Зег
С1п
Уа1
Туг
Зег
С1и
РЪе
61п
Азп
С1и
А1а
Азп
- 61 021512
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1 95 90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег 11е Азр Туг Тгр 100 105 110 <31у С1п <31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег 115 120 <210> 31 <211> 107 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 10 УЬ <400> 31
А§р Не СЬи Ьеи ТЬг СЬп Рго Рго Зег УаЬ Зег УаЬ АЬа Рго СЬу СЬп
1 5 10 15
ТЬг АЬа Агд Не Зег Суз 5ег СЬу Азр Азп Не СЬу Зег Туг Туг УаЬ
20 25 30
Ηίδ Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп А1а Рго УаЬ Ьеи УаЬ 11е Туг
35 40 45
С1и Азр Зег СЬи Агд Рго Зег 31у Не Рго СЬи Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
А5П Зег СЬу АЗП ТЬг АЬа ТЫ Ьеи ТЬг Не Зег СЬу ТЬг СЬп А1а СЬи
65 70 75 80
Азр СЬи АЬа Азр Туг Туг Суз С51п Зег Туг Азр ТЬг Рго УаЬ Туг Зег
85 90 95
УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи
100 105
<210> 32 <211> 122 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 10 УН <400> 32
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п 15 Ю 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а Г1е Зег С1у Азр Зех Уа1 $ег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Не Агд СЬп Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи СЬи 35 40 45
Тгр Ьеи СЬу Не Не О1п Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг АЬа 50 55 60
УаЬ Зег Уа1 Ьуз Зег Агд Не ТЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зет Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а УаЬ
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег 11е Азр Туг Тгр
100 105 НО
С1у СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <2Ю> 33 <211> 107 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 11 УЬ <400> 33
Азр 11е С1и Ьеи ТЬг СЬп Рго Рго Зег Уа1 Зег УаЬ А1а Рго СЬу СЬп 15 10 15
ТЫ А1а Агд Не Зег Суз Зег 61у Азр Азп Не СЬу Зег Туг Туг УаЬ 20 25 30
Нхз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп А1а Рго УаЬ Ьеи УаЬ Не Туг 35 40 45
СЬи Азр Зег С1и Агд Рго Зег С1у Не Рго СЬи Агд РЬе Зег СЬу Зег 50 55 60
Азп Зег СЬу Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЫ Не Зег С1у ТЬг С1п А1а СЬи
70 75 80
Азр СЬи А1а Азр Туг Туг Суз Зег Зег Туг Азр СЬи Рго Азп РЬе Азп
90 95
УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЫ Ьуз Ьеи ТЫ УаЬ Ьеи
100 105 <210> 34 <211> 122 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 11 νΗ <400> 34
СЬп УаЬ С1и Ьеи СЬп СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег СЬп 15 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег СЬу Азр Зег УаЬ Зег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр СЬу Тгр Не Агд СЬп Зег Рго С1у Агд СЬу Ьеи СЬи 35 40 45
Тгр Ьеи СЬу Не Не СЬп Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг АЬа 50 55 60
УаЬ Зег УаЬ Ьуз Зег Агд Не ТЬг 11е Азп Рго Азр ТЫ Зег Ьуз Азп
70 75 80
СЬп РЬе Зег Ьеи СЬп Ьеи Азп Зег УаЬ ТЬг Рго СЬи Азр ТЬг А1а УаЬ
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег 11е Азр Туг Тгр
100 105 НО
СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 120
Зег СЬп 15
Зег Азп
Ьеи СЬи
- 62 021512
40 45
Тгр Ьеи С1у Не Не С1п Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг А1а
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд 11е ТЬг 11е Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег \7а1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго рЬе Туг Зег Не Азр Туг Тгр
100 105 НО <51у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 36 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 12 УН <400> 36
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1у
ТЬг Ьеи $ег Ьеи ТЬг Су$ А1а Г1е Зег С1у 20 25
Зег А1а А1а Тгр О1у Тгр Г1е Агд (31п Зег 35 40
Тгр Ьеи С1у Г1е Не С1п Ьуз Агд Зег Ьуз 50 55
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд 11е ТЬг Не Азп 65 70
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Αεη Зег Уа1 ТЬг
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе 100 105
О1у О1п 61у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120
Ьеи Уа1
Азр Зег
Рго С1у
Тгр Туг 60
Рго Азр 75
Рго С1и
Туг Зег
Ьуз Рго
Уа1 Зег 30
Агд О1у 45
Азп Азп
ТЬг Зег
Азр ТЬг
Не Азр 110
Зег С1п 15
Зег А?п
Ьеи С1и
Туг А1а
Ьуз Азп 80
А1а Уа1 95
Туг Тгр <210> 31 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 13 УЬ <400> 37
Азр Не С1п МеЪ ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Зег 11е О1у Ьеи Туг 30
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе 45
Зег Агд РЬе Зег 31у 60
Зег Зег Ьеи С1п Рго 80
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п
Ьеи А1а Тгр Туг С1п (ЗЬп Ьуз Рго С1у Ьуз А1а 35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго 50 55
Зег С1у Зег С1у ТЬг Агр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п <51п С1у С1и Зег Не Ьеи Зег 85 90 95
ТЬг РЬе (31у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 100 105 <210> 38 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность ' <220>
<223> Кандидат 13 УН <400> 38 <31п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 15 10
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг 20 25
Тгр Уа1 (31у Тгр Уа1 Агд С1п МеС. Рго С1у Ьуз 35 40
С1у РЬе Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп 50 55
О1п С1у 31п Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 65 70 75
Ьеи <31п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг
Ьуз Ьуз Рго
Зег РЬе ТЬг 30
С1у Ьеи С1и 45
Туг А1а Рго 60
Не Зег ТЬг
А1а МеС Туг
А1а Агд <31и Ьеи Туг С1п <51у Туг МеС Азр ТЬг 100 105
С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120
О1у <31и 15
Азп Туг
Тгр МеС
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Тгр <31у <210> 39 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 14 VI, <400> 39
Азр 11е 61п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 15 10
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е 20 25
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз 35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи е1п Зег С1у νβΐ Рго Зег Агд 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег
70 75
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п А1а С1и ТЬг
Уа1 61у 15
Ьеи Туг
Ьеи 11е
Зег 31у <31п Рго 80
Зег Рго 95
ТЬг РЬе <31у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз 100 105 <210> 40 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 14 УН <400 40
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у б1и
- 63 021512
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЪе ТЪг Азп 20 25 30
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 Агд С1п МеС. Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр 35 40 45
С1у РЪе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЪг Азп Туг А1а Рго Зег
С1п С1у С1п Уа1 ТЪг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е Зег ТЪг А1а 65 70 75
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЪг А1а МеС Туг Туг 85 90 95
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п С1у Туг МеС Азр ТЪг РЪе Азр Зег Тгр 100 105 110
С1п С1у ТЪг Ьеи Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег 115 120
Туг
МеС
РЪе
Туг
Суз
С1у <210> 41 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15 УЬ <400> 41
Азр 11е <31п МеС ТЪг С1п Зег Рго Зег Зег
Азр Агд \7а1 ТЪг 11е ТЪг Суз Агд А1а Зег 20 25
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз 35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 50 55
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 65 70
С1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз С1п С1п
ТЪг РЪе 51у С1п С1у ТЪг Ьуз Уа1 С1и Не 100 105
Ьеи Зег
С1п Зег
А1а Рго
Рго Зег 60
Не Зег 75
С1у Азп
Ьуз
А1а Зег
11е С1у
Ьуз Ьеи 45
Агд РЪе
Зег Ьеи
ТЪг Ьеи
Уа1
Ьеи
Ьеи
Зег <31п
Зег
С1у
Туг
Не
С1у
Рго
Туг <210> 42 <211> 121 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15 νΗ <400> 42
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЪе ТЪг Азп
25 30
Тгр Уа1 31у Тгр Уа1 Агд С1п МеС Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 31и Тгр
40 45
С1у РЪе Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЪг Азп Туг А1а Рго Зег
55 60
С1п С1у С1п Уа1 ТЪг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЪг А1а 65 70 75
Ьеи 31п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЪг А1а МеС Туг Туг 85 90 95
А1а Агд θΐυ Ьеи Туг С1п С1у Туг МеС Азр ТЪг РЪе Азр Зег Тгр 100 105 110
С1и
Туг
Мес
РЪе
Туг
Суз
С1у
С1п С1у ТЪг Ьеи ν^Ι ТЪг \7а1 Бег Бег 115 120 <210> 43 <211> 7 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223>
Кандидат 1 ЬСОРН <400> 43
С1п Туг Не Азр 11е Бег Туг 1 5 <210> 44 <211> 3 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 1 ЬСПК.2 <400> 44
Аар А1а Бег 1 <210> 45 <211> 9 <212> РВГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 1 ЬСРКЗ <400> 45 <31п 61п Тут* Туг 5ед Ьеи 5ег Не ТЪг <210> 46 <211> 8 <212 <213 ркт
Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 1 НСРК1 <400> 46
О1у Туг Бег РЪе ТЪг Азр Азп Тгр <220>
<223> Кандидат 1 НСПК2 <210> 47 <211> 8 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
- 64 021512 <400> 47
Не Αερ Рго £ег Азр 5ег <31п ТЬг 1 5 <210> 48 <211> 12 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 1 НСОКЗ <400-> 48
А1а Агд С1и Тгр <33_у Не С1у С1у МеЬ Уа1 Азр Не 15 10 <210> 49 <211> б <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 2 ЬСйК1 <400> 49
О1п <31у 11е 5ег 5ег Тгр 1 5 <210> 50 <211> 3 <212> РЕГ <213> Синтетическая последовательность <2 20>
<223> Кандидат 2 ЬСОК2 <400> 50
С1у А1а 5ег <210> 51 <211> 9 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <22 0>
<223> Кандидат 2 ЬСОКЗ <400> 51
С1п С1п Туг Азр Азр РЬе £ег Не ТЬг 1 5
<210:
<211:
<212:
<213:
- 65 021512 <220>
<223> СапсИйаЬез 3,4 ЬСОВЗ <400> 57
А1а Зег Туг Азр С1у Азр С1и РЬе ТЬг Уа1 <210> 58 <211> 10 <212> РНГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИйаЬеа 3 НСОК1 <4О0> 58
С1у Азр Зег Уа1 Зег ТЬг Агд Зег А1а А1а <210> 59 <211> 10 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИйа+ее 3 НСОК2 <400> 59
Не Ηίδ Агд Агд Зег Ьуз Туг тгр Азп Азр 15 10 <210> 60 <211> 12 <212> РЕГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНйаЬез 3,4,5,6,7 НСОКЗ <400> 60
А1а Агд Шз ТЬг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЬе Азр Уа1 <210> 61 <211> 10 <212> Рвт <213> Синтетическая последовательность <223> СапйХйаЬез 4,5,6,7 НСБК1 <400> 61
С1у Азр Зег Уа1 Зег ТЬг Агд Зег А1а А1а 15 10 <210> 62 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИйасе 4 НСОК2
Т1е Зег Туг Агд Зег Агд Тгр Туг Азп Азр <210> 63 <211> 10 <212> РРТ <213> Синтетичес оследовательность <220>
<223> СапсНйаЬе 5 ЬСОРЗ <400> 63
31п Зег Туг Азр <51и Азр Зег А1а ТЬг νβΐ <210> 64 <211> 9 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИйаЪез 5,6,7 НСОК2 <400> 64
11е Туг Мес Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп <210> 65 <211> 10 <212> РВ.Г <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапйхдаЬе 6 ЬСОКЗ <400> 65
С1у Зег Туг Азр Зег Азп
1ег Ьеи ТЬг Уа1 <210> 66 <211> 10 <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность
- 66 021512 <220>
<223> СапахйаЬе 7 ЬСОВЗ <400> 66
Зег Зег Туг Азр Зег Азр Зег Ьеи ТЬг Уа1 15 10 <210> 67 <211> 6 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Сапсиааье 8,9,10,11,12 ЬСОВ1 <400> 67
Азл Пе С1у Зег Туг Туг 1 5 <210> 68 <211> 3 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СэлсНааГе 8,9,10,11,12 ЬСОВ2 <400> 68
Οΐυ Азр Зег <210> 69 <211> 11 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИиаЬе 8, 9 ЬСРВЗ <400> 69
С1п Зег Туг Азр Зег С1п РЬе Зег РЬе (51у Уа1 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНбаье 78,9,10,11,12 НСЭВ1 <400> 70
С1у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а А1а 1 5 10 <210> 71 <211> 9 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсЫбаЬе 8 НСБВ2 <400> 71
Не С1п ТЬг Агд Зег Ьуз Туг Тгр Азп 1 5 <210> 72 <211> 12 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапЫбаЬе 8,9,10,11,12 НСОВЗ <400> 72
А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег Не Авр Туг 15 10 <210> 73 <211> 9 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИба+е 9 НСРВ2 <400> 73
Не С1п Не Агд Зег Ьуз Туг Тгр Азп 1 5 <210> 74 <211> 10 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапЫЬаДе 10 ЬСОВЗ <400> 74
О1п Зег Туг Азр ТЬг Рго Уа1 Туг Зег Уа1 1 5 10 <210> 75 <211> 9 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИдаСе 10 НСОК2 <400> 75
Не <31п Ьуз Агд 5ел Ьуз Туг Тгр Азл <210> 76 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Сапйхйаде 11 ЬСОКЗ <40О> 76
Зег Зег Туг Азр С1и Рг 1 5
Азл РЬе Азп \Ла1 10 <210> 77 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетмчес эя последовательность <220>
<223> СапсНсйаДе 11,12 НСОК2 <400> 77
Не С1п Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп <210> 78 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Сапсиааее 12 ЬСОКЗ <400> 78
Зег Зег Туг Азр Азр Рго Азп РЬе <31п Уа1 <210> 79 <211> б <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223>
СапсН-ЗаЪе 13, 14, 15 ЬСЭК1 <400> 79 <31п Зег 11е С31у Ьеи Туг <210> 80 <211> 3 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СагкПДаДе 13, 14, 15 ЬСОК2 <400> 80 А1а А1а Зег <210> 81 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИдаДе 13 ЬСОКЗ <400> 81
С1п С1п С1у С1и Зег Не Ьеи Зег ТЬг <210> 82 <211> 8 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНйаДе 13, 14, 15 НСРК1 <400> 82
С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг Тгр <210> 83 <211> 8 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <400> 83
11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг <210> 84 <211> 14 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНЬаСез 13, 14, 15, 15-1, 15-2, 15-3, 15-4, 15-5, 15-7,15-8 НСРЕЗ
- 68 021512 <400> 84
А1а Агд 61и Ьеа Туг С1п С1у Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр 5ег 15 10 <210> 85 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<22Э> Сапа±ааЬе 14 ЬСДКЗ <400> 85 <31п С1п А1а С1и ТЬг Уа1 5ег Рго ТЬг 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНраСе 14, 15 НСЛК2 <400> 86
11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ГЬг Азп Туг 15 10 <210> 87 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНсЗаЪе 15 ЬСОКЗ <400> 87
С1п С1п <31у Азп ТЬг· Ьей Зег Туг ТЬг 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНЗаЪе 16 НСОКЗ <400> 88
Не Азр Рго С1у Азр Зег Туг ТЬг 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИдаде 10 ЬСОКЗ <400> 89
С1п С1п Туг С1у Зег Уа1 Зег 11е ТЬг 1 5 <210> 90 <211> 443 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 16, полная длина тяжелой цели <400> 90
С1п Уа1 С1и Ьей Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у С1и 15 10 15
Зег Ьей Ьуз 11е Зег Суз Ьуз С1у Зег 61у Туг Зег РЬе Азп Азп Туг 20 25 30
Тгр 11е <31у Тгр Уа1 Агд С1п МеД Рго С1у Ьуз С1у Ьей С1и Тгр МеД 35 40 45
С1у 11е Не Азр Рго С1у Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе
55 60
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ГЬг А1а Туг
70 75 80
Ьей С1п Тгр Зег Зег Ьей Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеД Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд Азп Не Туг <31и РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьей Уа1
100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Уа1 РЬе Рго Ьей А1а
115 120 125
Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег Θΐυ Зег ТЬг А1а А1а Ьей О1у Суз Ьей
130 135 140
Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у
145 150 155 160
А1а Ьей ТЬг Зег С1у Уа1 Ηίδ ГЬг РЬе Рго А1а йа! Ьей С1п Зег Зег
165 170 175
С1у Ьей Туг Зег Ьей Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьей
180 185 190
С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Шз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг
195 200 205
Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг С1у Рго Рго Суз Рго Рго
210 215 220
Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьей С1у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьей РЬе Рго
225 230 235 240
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей МеД Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг
245 250 255
Суз νβΐ νβΐ νβΐ Азр \7а1 Зег С1п С1и Азр Рго С1и Йа1 С1п РЬе Азп
260 265 270
Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 61υ Уа1 Ηίδ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд
275 280 285
О1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Йа1 Ьей ТЬг Уа1
290 295 300
Ьей НЬз С1п Азр Тгр Ьей Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Йа1 Зег
305 310 315 320
Азп Ьуз С1у Ьей Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз
- 69 021512
325 330 335
С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго бег С1п С1и
340 345 350
С1и Меб ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 бег Ьеи ГЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе
355 360 365
Туг Рго бег Азр Не А1а νβΐ С1и Тгр С1и бег Азп С1у С1п Рго С1и
370 375 380
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр бег Азр С1у бег РЬе
385 390 395 400
РЬе Ьеи Туг бег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз бег Агд Тгр С1п С1и С1у
405 410 415
Азп Уа1 РЬе бег Суз бег Уа1 Меб Ηί8 С1и А1а Ьеи Нхз Азп Н1з Туг
420 425 430
ТЬг С1п Ьуз бег Ьеи бег Ьеи бег Ьеи <31у Ьуз
435 440 <210> 91 <211> 449 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 17, полная длина тяжелой цепи <400> 91
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п бег С1у 1 5
ТЬг Ьеи бег Ьеи ТЬг Суз А1а Не 20 бег А1а А1а Тгр С1у Тгр 11е Агд
Тгр Ьеи С1у Агд Не Туг МеЬ Агд
55
Уа1 бег Уа1 Ьуз бег Агд 11е ТЬг 65 70
С1п РЬе бег Ьеи С1п Ьеи Азп бег 85
Туг Туг Суз А1а Агд Ηίδ ТЬг Туг 100
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 115 120 бег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз
130 135
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи νβΐ Ьуз 145 150 νβΐ бег Тгр Азп бег С1у А1а Ьеи 165
А1а Уа1 Ьеи С1п бег бег С1у Ьеи 180 νβΐ Рго бег бег бег Ьеи С1у ТЬг 195 200
Нхз Ьуз Рго бег Азп ТЬг Ьуз Уа1
210 215
С1у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго 225 230 бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз 245
Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 260
Рго С1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг 275 280
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и
Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго бег С1п 10 15 бег С1у Азр бег Уа1 бег ТЬг Агд
30
С1п бег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и бег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а 60
Не Азп Рго Азр ТЫ бег Ьуз Азп 75 80
Уа1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1
Рго Гуг Ьеи бег РЬе Азр Уа1 Тгр
105 110 бег бег А1а бег ТЬг Ьуз С1у Рго
125 бег Агд бег ТЬг бег С1и бег ТЬг 140
Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг 155 160
ТЬг бег С1у Уа1 Нхз ТЬг РЬе Рго 170 175
Туг бег Ьеи бег бег Уа1 Уа1 ТЬг
185 190
Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр 205
Азр Ьуз Агд Уа1 С1и бег Ьуз Туг 220
А1а Рго С1и РЬе Ьеи О1у С1у Рго 235 240
Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мет Не бег 250 255
Уа1 Уа1 Азр Уа1 бег <31п С1и Азр
265 270
Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Нхз Азп 285
О1п РЬе Азп бег ТЬг Туг Агд Уа1
290 295
Уа1 бег УаЬ Ьеи ТЬг \/а1 Ьеи Нхз 305 310
Туг Ьуз Суз Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуе
325
ТЫ 11е бег Ьуз А1а Ьуз О1у 31п 340
Ьеи Рго Рго бег С1п С1и С1и Мее 355 360
Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго
370 375 бег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп 385 390
Азр бег Азр С1у бег РЬе РЬе Ьеи
405 бег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп νβΐ 420
А1а Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЫ О1п 435 440
Ьуз
300
С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз <31и 315 320
61у Ьеи Рго бег бег 11е С1и Ьуз 330 335
Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг
345 350
ТЬг Ьуз Азп О1п 17а1 5ег Ьеи ГЬг
365 бег Азр Не А1а νιΐ 01и Тгр С1и 380
Туг Ьуз ТЬг ТЫ Рго Рго Уа1 Ьеи 395 400
Туг бег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 410 415
РЬе бег Су5 бег \7а1 Мее Нхз С1и
425 430
Ьуз бег Ьеи бег Ьеи бег Ьеи 61у
445 <210> 92 <211> 449 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 18, полная длина яжелои цепи <400> 92
С1п Уа1 С1и Ьеи СЬп С1п бег 31у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго бег (31п 15 10 15
ТЫ Ьеи бег Ьеи ТЫ Суб А1а 11е бег С1у Азр бег 7а1 бег бег Азп 20 25 30 бег А1а А1а Тгр СЬу Тгр Не Агд С1п бег Рго О1у Агд С1у Ьеи (31и 35 40 45
Тгр Ьеи С1у Не Не СЬп Ьуз Агд бег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг А1а
55 60
Уа1 бег Уа1 Ьуз бег Агд Не ГЬг 11е Азп Рго Азр ТЫ бег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе бег Ьеи СЬп Ьеи Азп бег Уа1 ты· Рго С1и Азр ТЬг А1а Уа1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг бег Туг Рго РЬе Туг бег Не Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 бег бег А1а бег ТЫ Ьуз С1у Рго
115 120 125 бег Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз бег Агд бег ТЫ бег С1и бег ГЬг
130 135 140
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи νεί Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг
145 150 155 160
Уа1 бег Тгр Азп бег С1у А1а Ьеи ТЬг бег С1у УаЬ Нхз ТЬг РЬе Рго
165 170 175
А1а Уа1 Ьеи С1п бег бег С1у Ьеи Туг бег Ьеи бег бег Уа1 Уа1 ТЬг
180 185 190
Ча1 Рго бег бег бег Ьеи С1у ГЬг Ьуз ТЫ Туг ТЫ Суз Азп Уа1 Азр
195 200 205
Нхз Ьуз Рго бег Азп ТЫ Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд νβΐ С1и бег Ьуз Туг
210 215 220
С1у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи О1у 61у Рго
225 230 235 240 бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго ьуз Азр ТЬг ьеи Мее Х1е бег
- 70 021512
Агд ТЬг
Рго С1и
А1а Ьуз 290
Уа1 5ег 305
Туг Ьуз тьг Не
Ьеи Рго
Суз Ьеи 370
5ег Азп 385
Азр Зег
Зег Агд
А1з ьеи
Ьуз
Рго С1и 260
Уа1 С1п
275
ГЬг ЬуЗ
Уа1 Ьеи
Суз Ьуз
Зег Ьуз 340
Рго Зег 355
Уа1 Ьуз
31у С1п
Азр С1у
245
Уа1 ТЬг Суз 7а1
РЬе Азп
Рго Агд
ТЬг Уа1 310 \7а1 Зег 325
АЬа Ьуз
С1п ©1и
С1у РЬе
Рго 31и 390
Зег РЬе 405
С1и <31у
Тгр С1п 420
Шз Азп Нхз Туг 435
Тгр Туг 280
С2и С1и 295
Ьеи Н1з
Азп Ьуз
С1у С1п
61и Мер 360
Туг Рго 375
Азп Азп
РЬе Ьеи
Азп 7а1
250 Уа1 νβΐ 265 νβΐ Азр
С1л РЬе
С1 п Азр <31у Ьеи
330 Рго Агд 345
ГЬг Ьуз
Зег Азр
Туг Ьуз
Туг 5ег
410 РЬе 8ег 425
Ьуз Зег
Азр Уа1 <31у Уа1
Азп Зег
300 Тгр Ьеи 315
Рго Зег
С1и Рго
Азп С1п
11е АЬа
380 ТЫ ТЬг 395
Агд Ьеи
Суз 5ег
Ьеи Зег
Зег С1п 270
С1и Уа1 285
ТЫ Туг
Азп С1у
Зег Не
С1п Уа1 350
Уа1 5ег 365
Уа1 С1и
Рго Рго
ТЬг Уа1
255
С1и А5р
ΗΪ3 Азп
Агд Уа1
Ьуз 61и 320
С1и Ьуз 335
Туг ТЫ
Ьеи ТЬг
Тгр С1и
Уа1 Ьеи 400
Азр Ьуз 415
Ηίε С1и
Уа1 МеТ 430
Ьеи Зег Ьеи С1у 445 <210> 93 <211> 448 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <223> Кандидат 19, полная длина тяжелой цепи <400> 93
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суе Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 Агд С1п Мед Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 51и Тгр Мед 35 40 45
61у РЬе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг АЬа Рго Зег РЬе 50 55 60
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг АЬа Туг
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг АЬа Мед Туг Туг Суз $5 90 95
А1а Агд <31и Ьеи Туг 61п <31у Туг МеД Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр С1у 100 105 110
С1п С1у ГЬг Ьеи νβΐ ТЬг Уа1 Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз 51у Рго Зег 115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ГЬг Зег С1и Зег ТЬг АЬа
130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз ьеи Уа1 ьуз Азр Туг РЬе Рго 01и его Уа1 ГЬг Уа1
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег <31у А1а Ьеи тЬг $ег б1у ν&1 Ηίε тЬг РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи 61п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ГЬг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ГЬг Ьуз ГЬг Туг ГЬг Суз Азп Уа1 Азр ΗΪ8
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг С1у
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи С1у С1у Рго Зег
225 230 235 240 νβΐ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеД Не Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго С1и Уа1 ТЫ Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег С1п 61и Азр Рго
260 265 270
С1и Уа1 31п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у \7а1 С1и Уа1 Ηίε Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЫ Ьуз Рго Агд С1и <51и <31п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 УаЬ
290 295 300
Зег Уа1 Ьеи ТЫ Уа1 Ьеи Нхз <31п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз <31у Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз ТЫ
325 330 335
Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п УаЬ Туг ТЫ Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег <31п С1и 31и МеД ГЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЫ Суз
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз <31у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа ЧаЬ С1и Тгр С1и Зег
370 375 380
Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ГЫ ТЫ Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр <31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЫ Уа1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр Θΐη Θΐυ С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеД Нхз С1и А1а
420 425 430
Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЫ О1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи <31у Ьуз
435 440 445 <210> 94 <211> 446 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательное!
длина тяжелой цепи
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз 20
Тгр Не Зег Тгр νβΐ Агд 35
С1у Са1 Г1е Азр Рго Зег 50
С1п С1у Θΐη Уа1 ТЬг Не 65 70
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи
АЬа Агд <31и Тгр С1у 11е 100
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег 115
Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег 130
С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр 145 150
Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЫ
Зег С1у АЬа
Ьуз О1у Зег 25
С1п АЬа Рго 40
Азр Зег Туг 55
Зег А1а Азр
Ьуз А1а Зег
С1и Ча! ьуз Ю
СЬу Туг Зег
СЬу Ьуз 61у
ТЬг Азп Туг 60
Ьуз Зег Не 75
Азр ГЬг А1а 90
Уа1 Азр Не
31у С1у МеД 105
Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз С1у 120
Агд Зег ТЬг Зег <31и Зег 135 140
Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1
155
Зег <31у Уа1 Нхз ТЬг РЬе
Ьуз Рго
РЬе ТЫ 30
Ьеи С1и 45
А1а Рго
Зег ТЫ
МеД Туг
Тгр С1у 110
Рго Зег 125
ТЬг А1а
ТЫ Ча1
Рго А1а
С1у С1и 15
Азр Азп
Тгр МеД
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
С1п С1у
Уа1 РЬе
АЬа Ьеи
Зег Тгр 160
Уа1 Ьеи
- 71 021512
С1п Зег
Зег Зег
Зег Азп 210
Суз Рго 225
Ьеи РЬе
С1и Уа1
С1п РЬе
Ьуз Рго 290
Ьеи ТЬг 305
Ьуз Уа1
Ьуз А1а
Зег С1п
Ьуз С1у 370 <31п Рго 385 <51у Зег <31п С1и
Азп Н1з
165
Зег С1у Ьеи Туг Зег Ье< 180
ТЬг Ьуз ТЬг Ту:
20'
Уа1 Азр
Рго Суз
Рго Рго
Ьеи С1у ’ 195 ТЬг Ьуз ’
ТЬг Суз 260
Азп Тгр 275
Агд С1и νβΐ Ьеи
Зег Азп
Ьуз С1у 340
61и 61и 355
РЬе Туг (31и Азп
РЬе РЬе
Рго А1а 230
Ьуз Рго 245
Уа1 Уа1
Туг Уа1
С1и С1п
Ηίδ С1п 310
Ьуз С1у 325
С1п Рго
Меи ТЬг
Рго Зег
Азп Туг 390
Ьеи Туг 405
Уа1 РЬе
С1у Азп 420
Туг ТЬг С1п Ьуз 435
170
Зег Зег УаЬ Уа1 ТЬг 185
ТЬг Суз
Ьуз Агд 215
Рго С1и
Ьуз Азр
Уа1 Азр
Азр 61у 280
РЬе Азп 295
Азр Тгр
Ьеи Рго
Агд С1и
Ьуз Азп 360
Азр Не 375
Ьуз ТЬг
Зег Агд
Зег Суз νβΐ С1и
РЬе Ьеи
ТЬг Ьеи 250
Уа1 Зег 265
Уа1 б1и
Зег ТЬг
Ьеи Азп
175
Уа1 Рго Зег 190
Н1з Ьуз Рго
Азп Уа1 Азр 1 205
Зег Ьуз Туг С1у Рго Рго 220
51у С1у Рго Зег Уа1 РЬе 235 240
Мер 11е Зег Агд ТЬг Рго
255
С1п С1и Азр Рго С1и Уа1 270
Уа1 Ηίδ Азп А1а Ьуз ТЬг 285
Туг Агд Уа1 νβΐ Зег Уа1 300
О1у Ьуз С1и 315
11е С1и Ьуз
Зег Зег 330
Рго С1п Уа1 Туг ТЫ 345
С1п Уа1
Туг Ьуз Суз 320
ТЬг Не Зег 335
Ьеи Рго Рго 350
Суз Ьеи Уа1
А1а Уа1
ТЬг Рго
Ьеи ТЬг 410
Зег Уа1 425
Зег Ьеи
Зег Ьеи ТЫ <
365 <31и Тгр 31и Зег Азп С1у 380
Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр 395 400
УА1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр
415
Меи Н1з С1и А1а Ьеи Н1з 430
Зег Ьеи <31у Ьуз <210> 95 <211> 443 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 2, полная длина тяжелой цепи <400> 95
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз 61у Зег 61у Туг Зег РЬе Азп Азп Туг 20 25 30
Тгр 11е С1у Тгр УаЬ Агд С1п Меи Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 31и Тгр Меи 35 40 45
С1у Не Г1е Азр Рго С1п Азр Зег Тгр ТЫ Азп Туг А1а Рго Зег РЬе
С1п С1у <31п Ча1 ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а Меи Туг Туг Суз
А1а Агд Азп Не Туг С1и РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 100 105 НО
ТЫ Ча1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а 115 120 125
Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег 51и Зег ТЫ А1а А1а Ьеи (31у Суз Ьеи
130 135 140
Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1 Зег Тгр Азп Зег 61у
145 150 155 160
А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 Нгз ТЬг РЬе Рго А1а νβϊ Ьеи <51п Зег Зег
165 170 175
61у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи
180 185 190
61у ТЬг Ьуз ТЫ Туг ТЬг Суз Азп νβΐ Азр Нхз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг
195 200 205
Ьуз νβΐ Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг С1у Рго Рго Суз Рго Рго
210 215 220
Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи 61у С1у Рго Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго
225 230 235 240
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС Не Зег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг 245 250 255
Суз Уа1 νβΐ Уа1 Азр νβΐ Зег С1п ОЬи Азр Рго О1и Уа1 61п РЬе Азп 260 265 270
Ггр Туг \7а1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Ηίε Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 275 280 285
О1и <51и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг νβΐ 290 295 300
Ьеи Ηίε С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз 1/а1 Зег
305 310 315 320
Азп Ьуз 51у Ьеи Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз
325 330 335
С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и 340 345 350
С1и Меи ТЬг Ьуз Азп С1п ν&ΐ $ег Ьеи ТЬг Суз ьеи νβΐ Ьуз С1у РЬе 355 360 365
Туг Рго Зег Азр Не А1а \/а1 С1и Тгр С1и Зег Азп С1у С1п Рго С1и 370 375 380
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РЬе
385 390 395 400
РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуё Зег Агд Тгр 61п 01и С1у
405 410 415
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Меи Низ 21и А1а Ьеи Ηϊδ Азп Н±з Туг 420 425 430
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз
435 440 <210> 96 <211> 449 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 3, полная длина тяжелой цепи <400> 96
61п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег <31у Рго С1у Ьеи νβΐ Ьуз Рго Зег <31п 15 Ю 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а Пе Зег 01у Азр Зег Уа1 Зег ТЬг Агд 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Не Агд С1п Зег Рго С1у Агд 51у Ьеи О1и 35 40 45
Тгр Ьеи О1у Агд Пе Ыз Агд Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а 50 55 60
Уа1 Зег νβΐ Ьуз Зег Агд Пе ТЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго 01и Азр ТЬг А1а Уа1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд ΗΪ3 ТЬг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЬе Азр Уа! Тгр
- 72 021512
100 105 НО
С1у СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ 5ег 5ег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу
115 120 125
Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег
130 135 140
АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ 145 150 155
Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе 165 170 175
АЬа Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 УаЬ 180 185 190
УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 195 200 205
НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз
210 215 220
СЬу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи РЬе Ьеи СЬу СЬу 225 230 235
Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е 245 250 255
Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег 31п 51и 260 265 270
Рго СЬи УаЬ С1п РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр С1у Уа1 СЬи УаЬ НЬз 275 280 285
АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
Уа1 Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи Нхз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз 305 310 315
Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Не СЬи 325 330 335
ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз С1у 61п Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг 340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег СЬп С1и С1и Меб ТЬг Ьуз Азп СЬп Уа1 Зег Ьеи 355 360 365
Суз Ьеи Уа1 Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ СЬи Тгр
370 375 380
Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 385 390 395
Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр 405 410 415
Зег Агд Тгр С1п О1и СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суе Зег УаЬ МеС Нхз 420 425 430
АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи 435 440 445
Ьуз
Рго
ТЬг
ТЬг
160
Рго
ТЬг
Азр
Туг
Рго
240
Зег
Азр
Азп
Уа1
СЬи
320
Ьуз
ТЬг
ТЬг
СЬи
Ьеи
400
Ьуз
СЬи
СЬу <210> 97 <211> 449 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 4, полная длина тяжелой цепи <400> 97
СЬп УаЬ СЬи Ьеи СЬп С1п Зег СЬу Рго С1у Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег 12 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег СЬу Аер Зег УаЬ Зег ТЬг
25 30
Зег А1а А1а Тгр СЬу Тгр 11е Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи
40 45
Тгр Ьеи С1у Ьуз Не Зег Туг Агд Зег Агд Тгр Туг Азп Азр Туг
СЬп
Агд
СЬи
АЬа
Азп
УаЬ
Тгр
Рго
ТЬг
ТЬг
160
Рго
ТЬг
Азр
Туг
Рго
240
Зег
Азр
Азп
УаЬ
СЬи
320
Ьуз
ТЫ
ГЫ
СЬи
Ьеи
400
Ьуз
СЬи
СЬу
55 60
Уа1 Зег УаЬ Ьуз Зег Агд 11е ТЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз 65 70 75
СЬп РЬе Зег Ьеи СЬп Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго СЬи Азр ТЫ АЬа 85 90 95
Туг Туг Суз АЬа Агд Нхз ТЬг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЬе Азр УаЬ 100 105 110
СЬу С1п СЬу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЫ Ьуз СЬу 115 120 125
Зег Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег
130 135 140
АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ 145 150 155
Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЫ Зег С1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе 165 170 175
АЬа Уа1 Ьеи О1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ 180 185 190
УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЫ Ьуз ГЫ Туг ТЫ Суз Азп УаЬ 195 200 205
НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз
210 215 220
СЬу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи РЬе Ьеи СЬу СЬу 225 230 235
Зег УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб Не 245 250 255
Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ Уа1 Уа1 Азр УаЬ Зег СЬп СЬи 260 265 270
Рго СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу УаЬ С1и Уа1 НЬз 275 280 285
АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд
290 295 300
УаЬ Зег Уа1 Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз 305 310 315
Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег Не СЬи 325 330 335
ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго С1п УаЬ Туг 340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег СЬп С1и С1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи 355 360 365
Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр 11е АЬа УаЬ С1и Тгр
370 375 380
Зег Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ 385 390 395
Азр Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг УаЬ Азр 405 410 415
Зег Агд Тгр СЬп СЬи СЬу Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеЬ Нхз 420 425 430
АЬа Ьеи Нхз Азп Нхз Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зех Ьеи 435 440 445
Ьуз <210> 98 <211> 449 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидаты 5, 6, 7, полная длина тяжелой цепи <400> 98
С1п УаЬ СЬи Ьеи СЬп СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег
- 73 021512
1 5 10 15
ТЪг Ьеи Зег Ьеи ТЪг Суз АЬа Не Зег С1у Азр Зег Уа1 Зег ТЪг Агд
20 25 30
Зег А1а АЬа Тгр С1у Тгр Не Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и
35 40 45
Тгр Ьеи С1у Агд Пе Туг МеС Агд Зег Ьуз Тгр Туг АЗП Азр Туг А1а
50 55 60
νβΐ Зег Уа1 Ьуз Зег Агд Не ТЪг Г1е Азп Рго Азр ТЪг Зег Ьуз Азп
65 70 75 80
С1п РЪе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЪг Рго (31и Азр ТЪг А1а Уа1
85 90 95
Туг Туг Суз АЬа Агд Ηίε ТЪг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЪе Азр Уа1 Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЪг Ьеи ν3ΐ ТЪг νβΐ Зег Зег А1а Зег ТЪг Ьуз <31у Рго
115 120 125
Зег Уа1 РЪе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЪг Зег С1и Зег ТЪг
130 135 140
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туе РЪе Рго С1и Рго Уа1 ТЪг
145 150 155 160
Уа1 Зег Тгр Азп Зег С1у АЬа Ьеи ТЪг Зег 61у Уа1 ΗΪ8 ТЪг РЪе Рго
165 170 175
А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЪг
180 185 190
Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЪг Ьуз ТЪг Туг ТЪг Суз Азп Уа1 Азр
195 200 205
Ηίδ Ьуз Рго Зег Азп ТЪг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг
210 215 220
С1у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЪе Ьеи С1у С1у Рго
225 230 235 240
Зег УаЬ РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЪг Ьеи Мес 11е Зег
245 250 255
Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1 νβΐ Азр Уа1 Зег <31п С1и Азр
260 265 270
Рго С1и Уа1 С1п РЪе Азп Тгр Туг Уа1 Азр 31у УаЬ <31и Уа1 Ηίδ Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЪе Азп Зег ТЪг Туг Агд Уа1
290 295 300
Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи ΗΪ3 С1п Азр тгр Ьеи Азп С1у Ьуз (31и
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег Не <31и Ьуз
325 330 335
ТЪг Пе Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд 61и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг
340 345 350
ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и Мес ТЪг Ьуз Азп С1п νβΐ Зег ьеи ТЪг
355 360 365
Суз Ьеи νβΐ Ьуз С1у РЪе Туг Рго Зег Азр 11е А1а νβΐ С1и Тгр <31и
370 375 380
Зег Азп С1у С1п Рго <31и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг ТЪг Рго Рго Уа1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр <31у Зег РЪе РЪе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п С1и <31у Азп Уа1 РЪе Зег Суз Зег Уа1 Мес Н1з <31и
420 425 430
А1а Ьеи Ηίδ АЗП ΗΪ3 Туг ТЪг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у
435 440 445
Ьуз <210> 99 <211> 449 <212> РВ.Т <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 8, полная длина тяжелой цепи <400> 99
С1п 1 \7а1 С1и Ьеи С1п С1п Зег 5 С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег 61п
10 15
ТЪг Ьеи Зег Ьеи ТЪг Суз А1а Пе Зег С1у Азр Зег νβΐ Зег Зег Азп
20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Не Агд <31п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и
35 40 45
тгр Ьеи С1у Не Не С1п ТЪг Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а
50 55 60
Уа1 Зег Уа1 ьуз Зег Агд Пе ТЪг Не Азп Рго Αερ ТЪг зег Ьуз Азп
65 70 75 80
С1п РЪе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЪг Рго С1и Азр ТЪг А1а Уа1
85 90 95
Туг Туг Суз АЬа Агд Туг Зег Туг Рго РЪе Туг Зег Пе Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п 01у ТЪг Ьеи νβΐ ТЪг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЪг Ьуз С1у Рго
115 120 125
Зег νβΐ РЪе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЪг Зег С1и Зег ТЪг
130 135 140
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи νβί Ьуз Азр Туг РЪе Рго С1и Рго νβΐ ТЪг
145 150 155 160
Уа1 Зег тгр А5П Зег <31у А1а Ьеи ТЪг Зег &1у Уа1 Ηίδ ТЪг РЪе Рго
165 170 175
А1а Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 νβΐ ТЪг
180 185 190
Уа1 Рго Зег Зег Зег Ьеи <31у ТЪг Ьуз ТЪг Туг ТЪг Суз Азп Уа1 Азр
195 200 205
Ηίδ Ьуз Рго Зег Азп ТЪг ьуз Уа1 Αδρ Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг
210 215 220
С1у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЪе Ьеи 31у С1у Рго
225 230 235 240
Зег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЪг ьеи МеС Пе Зег
245 250 255
Агд ТЪг Рго С1и νβΐ ТЪг Суз νβί νβΐ Уа1 Αερ Уа1 Зег С1п С1и Αδρ
260 265 270
Рго 51и Уа1 С1п РЪе Азп Тгр Туг νβΐ Азр <31у νβΐ С1и Уа1 Ηίδ Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и 31п РЪе Азп Зег ТЪг Туг Агд Уа1
290 295 300
Уа1 Зег ¥а1 Ьеи ТЪг νβΐ Ьеи Ηί5 С1п Азр Тгр Ьеи Αεη С1у Ьуз С1и
305 310 315 320
Туг Ьуз Су5 Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуз 31у Ьеи Рго Зег Зег Пе 61и Ьуз
325 330 335
ТЪг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у 61п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг
340 345 350
ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и МеС ТЪг Ьуз Азп С1п νβΐ Зег Ьеи ТЪг
355 360 365
Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЪе Туг Рго Зег Азр Пе А1а Уа1 С1и Тгр <31и
370 375 380
Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг ТЪг Рго Рго Уа1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЪе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЪг Уа1 АЗр ЬуЗ
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЪе Зег Суз Зег Уа1 МеС Ηίδ С1и
420 425 430
А1а Ьеи Ηίδ АЗП Ηίδ туг ТЪг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи О1у
435 440 445
Ьуз <210> 100 <211> 449 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 9, полная длина тяжелой цепи <400> 100
СЬп Ча1 С1и Ьеи С1п СЬп Зег С1у Рго С1у Ьеи Ча1 Ьуз Рго Зег С1п
1 5 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег СЬу Азр Зег чаь Зег Зег АЗП
20 25 30
£ег А1а А1а Тгр С1у Тгр Ые Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и
35 40 45
тгр Ьеи О1у Ые Ые СЬп Ые Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а
50 55 60
Ьеи Зег Ча1 Ьуз Зег Агд Ые ТЬг не Азп Рго Азр ТЫ Зег Ьуз Азп
65 70 75 80
СЬп РЬе Зег Ьеи СЬп Ьеи Азп Зег Ча1 ТЬг Рго О1и Азр ТЬг А1а Ча1
85 90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег Ые Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго
115 120 125
Зег Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег 31и Зег ТЬг
130 135 140
А1а А1а Ьеи <51у Суз Ьеи ЧаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Ча1 ТЬг
145 150 155 160
Ча1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Ча1 ΗΪ5 ТЬг РЬе Рго
165 170 175
А1а Ча1 Ьеи СЬп Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Ча1 Ча1 ГЬг
180 185 190
Ча1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Ча1 Азр
195 200 205
ΗΪ3 Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Ча1 Азр Ьуз Агд Ча1 61и Зег Ьуз Туг
210 215 220
С1у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи 31 у С1у Рго
225 230 235 240
Зег Ча1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС Ые Зег
245 250 255
Агд ТЬг Рго С1и Ча1 ты Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег СЬп С1и Азр
260 265 270
Рго С1и Ча1 СЬп РЬе Азп Тгр Туг Ча1 Азр С1у Ча1 С1и Ча1 Н1з Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Ча1
290 295 300
Ча1 Зег Ча1 Ьеи ТЬг ЧаЬ Ьеи ΗΪ5 С1п Азр Тгр ьеи Азп С1у Ьуз С1и
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег 11е О1и Ьуз
325 330 335
ТЬг Ые Зег Ьуз А1а Ьуз С1у СЬп Рго Агд С1и Рго СЬп Ча1 Туг ТЬг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег СЬп С1и С1и Мес ТЫ Ьуз Азп СЬп Ча1 Зег Ьеи ТЬг
355 360 365
Суз Ьеи Ча1 Ьуз 31у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Ча1 С1 и Тгр С1и
370 375 380
Зег Азп С1у СЬп Рго С1и Азп АЗП Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Ча1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Ча1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр СЬп С1и О1у Азп Ча1 РЬе Зег Суз Зег Ча1 МеС Ηί3 С1и
420 425 430
А1а Ьеи НЬз Азп ΗΪ5 Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег : Ьеи С1у
435 440 445
Ьуз <210> 101 <211> 449 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидаты 10,11, 12, полная длина тяжелой цепи <400> 101
С1п Ча1 С1и Ьеи С1п С1п Зег О1у Рго С1у Ьеи Ча1 Ьуз Рго Зег С1п 15 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег С1у Азр Зег Ча1 Зег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр 11е Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи С1и 35 40 45
Тгр Ьеи С1у 11е 11е 61п Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг А1а
55 60
Ча1 Зег Ча1 Ьуз Зег Агд 11е ТЬг 11е Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Ча1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а Ча1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег 11е Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго
115 120 125
Зег Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег О1и Зег ТЬг
130 135 140
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Ча1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Ча1 ТЬг
145 150 155 160
Ча1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Ча1 Ηίδ ТЬг РЬе Рго
165 170 175
А1а Ча1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Ча1 Ча1 ТЬг
180 185 190
Ча1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Ча1 Азр
195 200 205
НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Ча1 Азр Ьуз Агд Ча1 С1и Зег Ьуз Туг
210 215 220
01у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи С1у С1у Рго
225 230 235 240
Зег Ча1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС 11е Зег
245 250 255
Агд ТЬг Рго С1и Ча1 ТЬг Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег О1п С1и Азр
260 265 270
Рго С1и Ча1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Ча1 Азр С1у Ча1 О1и Ча1 Ηί® Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Ча1
290 295 300
Ча1 Зег Ча1 Ьеи ТЬг Ча1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег 11е С1и Ьуз
325 330 335
ТЬг 11е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Ча1 Туг ТЬг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и МеС ТЬг Ьуз Азп С1п Ча1 Зег Ьеи ТЬг
355 360 365
Суз Ьеи Ча! Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Ча1 С1и Тгр С1и
370 375 380
Зег Азп С1у С1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС НЬз 51и
420 425 430
А1а Ьеи Ηίε Азп Нгз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у <210> 102 <211> 448 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <223> Кандидаты 13,14,15,15-7,15-8 полная длина тяжелой цепи <400> 102
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз Ьуз 61у Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 Агд С1п МеЪ Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр МеЪ 35 40 45
С1у РЬе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе 50 55 60
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеЪ Туг Туг Суз
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п С1у Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр С1у 100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег 115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а 130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго УаЬ ТЬг Уа1
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег О1у Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Ηίε
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ С1и Зег Ьуз Туг С1у
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и РЬе Ьеи С1у 51у Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС Не Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго С1и УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр Уа1 Зег СЬп СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи Уа1 СЬп РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηϊε С1п Азр тгр ьеи Азп СЬу ьуз С1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТЬг
325 330 335
Не Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег СЬп С1и С1и МеС ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз
355 360 365
Ьеи УаЬ Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не АЬа УаЬ С1и Ггр С1и Зег
370 375 380
Азп С1у <31п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п С1и С1у Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеС Ηίδ СЬи А1а
420 425 430
Ьеи Ηίδ Αδη Ηίδ Туг ТЬг 61п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз
435 440 445 <210> 103 <211> 19 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <223> Ν-концезая лидерная последовательность для экспрессии тяжелых цепе <400> 103
МеС А1а Тгр Уа1 Тгр ТЬг Ьеи Ьеи РЬе Ьеи МеС А1а А1а А1а 61п Зег 15 10 15
Не 51п АЬа <210> 104 <211> 1401 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина тяжелых цепей 1дС4 Кандидата15ЕУ0 с лидерной последовательностью <400> 104 аСддсССддд дСдсадсСдд
Сдсаадддса ддсаадддсс ссъадсССсс садСддадса садддоСаса дсСЪссасса адсасадссд
СддаасСсад ддасСсСасС
СасассСдса ааасаЪддсс сссссдсъсс сдсдсддсдд ддсдсддадд сдъдСддСса ъдсааддСсС дддсадсссс аассаддСса
Сдддададса сдсддасссс
Сдсададсдд дсддсСасад
СддадСддаС адддссаддС дссСдааддс сддасасдсъ адддсссаСс сссСдддсСд дсдсссъдас сссСсадсад асдСадаСса ссссаСдссс ссссаааасс сддасдсдад сдсасаасдс дсдСссСсас ссаасааадд дададссаса дссСдассСд асдддсадсс дссассссъд сдссдаддСд сССсассаас дддсССсаСс дассаСсадс садсдасасс сдасадсСдд сдъссссссс ссСддъсаад садсддсдъд сдСддъдасс саадсссадс ассаСдссса сааддасаос ссаддаадас саадасааад сдъссСдсас ссъсссдСсс ддЪдСасасс сссддссааа ддадаасаас асддсадсъд аадаадсссд сасЪдддсдд дассссадсд дссдасаада дссаСдСасС ддссадддса сСддсдсссС дасСасССсс сасасссъсс дСдсссСсса аасассаадд дсассЬдадд сссасдассъ сссдаддСсс ссдсдддадд саддасСддс
СссаСсдада сЪдсссссаС ддссссЪасс
Сасаадасса сссааадСаС дсдададссС дсъдддСдсд асадсСасас дсаСсадсас асСдсдсссд сссСддСдас дсСссаддад ссдаассддС сддссдъссс дсадсССддд
Сддасаадад ссдссддддд сссддасссс адсъсаасСд адсадССсаа сдаасддсаа ааассасссс сссаддадда ссадсдасаС сдссСсссдС ссаадсадад даадассадс ссадаЪдссс саасСасдсд сдссСассъд сдадсСдСас сдСдадсадс сассъссдад дасддСдСсд асадСссъса сасдаааасс адССдадСсс ассаСсадъс
СдаддСсасд дСасдСддас садсасдСас ддадСасаад сааадссааа даСдассаад сдссдСддад дсъддасссс
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
- 76 021512 дасддсбссб бсббссбсба садсаддсба ассдбддаса ададсаддбд дсаддадддд 1320 аабдбсббсб сабдсбссдб дабдсабдад дсбсбдсаса ассасбасас асадаададс 1380 сбсбсссбдб сбсбдддбаа а 1401 <210> 105 <211> 1344 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Тяжелые цепи 1д34 Кандидата 15ЕЧ(3 без лидерной последовательности <400> 105 даддбдсадс бддбдсадад сддсдссдад дбдаадаадс ссддсдадад ссбдаадабс 60 адсбдсаадд дсадсддсба садсббсасс аасбасбддд бдддсбдддб дсдссадабд 120 сссддсаадд дссбддадбд дабдддсббс абсдасссса дсдасадсба сассаасбас 180 дсдссбадсб бссадддсса ддбдассабс адсдссдаса ададсабсад сассдссбас 240 сбдсадбдда дсадссбдаа ддееадсдас ассдссабдб асбасбдсдс ссдсдадсбд 300 бассадддсб асабддасас дббсдасадс бддддссадд дсасссбддб дассдбдадс 360 адсдсббсса ссаадддссс абссдбсббс ссссбддсдс ссбдсбссад дадсассбсс 420 дададсасад ссдсссбддд сбдссбддбс ааддасбаеб бссссдаасс ддбдасддбд 480 бсдбддаасб саддсдсссб дассадсддс дбдсасассб бсссддсбдб ссбасадбсс 540 бсаддэсбсб асбсссбсад садсдбддбд ассдбдсссб ссадсадсбб дддсасдааа 600 ассбасассб дсаасдбада беасаадссс адсаасасса аддбддасаа дададббдад 660 бссааабабд дбсссссабд сссассабдс ссадсассбд аддссдссдд дддассабса 720 дбсббссбдб бссссссааа асссааддас асбсбсабда бсбсссддас сссбдаддбс 780 асдбдсдбдд бддбддасдб дадссаддаа дассссдадд бссадббсаа сбддбаедбд 840 дабддсдбдд аддбдсабаа бдссаадаса аадссдсддд аддадсадбб саасадсасд 900 бассдбдбдд бсадсдбссб сассдбссбд сассаддасб ддсбдаасдд сааддадбас 960 аадбдсаадд бсбссаасаа аддссбсссд бссбссабсд адаааассаб сбссааадсс 1020 ааадддсадс сссдададсс асаддбдбас асссбдсссс сабсссадда ддадабдасс 1080 аадаассадд бсадссбдас сбдссбддбс аааддсббсб ассссадсда сабсдссдбд 1140 дадбдддада дсаабдддса дссддадаас аасбасаада ссасдссбсс сдбдсбддас 1200 бссдасддсб ссббсббссб сбасадсадд сбаассдбдд асаададсад дбддсаддад 1260 дддаабдбсб бсбсабдсбс сдбдабдсаб даддсбсбдс асаассасба сасасадаад 1320 адссбсбссс бдбсбсбддд бааа 1344 <210> 106 <211> 20 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Ν-кониевая лидерная последовательность для экспрессии легких цепей <400> 106
Меб О1у Уа1 Рго ТЬг С1п Уа1 Ьеи <31у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи ТЬг 15 10 15
Азр А1а Агд Суз 20 <2Ю> 107 <211> 702 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина легкой цепи Кандидата 15 с лидерной последовательность <400> 107 абдддбдбдс саасбсаддб аббаддабба сбдсбдсбдб ддсббасада бдсаадабдб 60 дасабссада бдасссадад ссссадсадс сбдадсдсса дсдбдддсда ссдсдбдасс 120 абсассбдсс дсдссадсса дадсабсддс сбдбассбдд ссбддбасса дсадаадссс 180 ддсааддссс ссаадсбдсб дабсбасдсс дссадсадсс бдсададсдд сдбдсссадс 240 сдсббсадсд дсадсддсад сддсассдас ббсасссбда ссабсадсад ссбдсадссс 300 даддасббсд ссассбасба сбдссадсад ддсаасассс бдадсбасас сббсддссад 360 ддсассаадд бддадабсаа дсдбасддбд дсбдсассаб сбдбсббсаб сббсссдсса 420 бсбдабдадс адббдааабс бддаасбдсс бсбдббдбдб дссбдсбдаа баасббсбаб 480 сссадададд ссааадбаса дбддааддбд дабаасдссс бссаабсддд баасбсссад 540 дададбдбса сададсадда садсааддас адсассбаса дссбсадсад сасссбдасд 600 сбдадсааад садасбасда дааасасааа дбсбасдссб дсдаадбсас ссабсадддс 660 сбдадсбсдс ссдбсасааа дадсббсаас аддддададб дб 702 <210> 108 <211> 642 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Легкая цепь Кандидата 15 без лидерной последовательности (начинается с 01<2) <400> 108 дасабссада бдасссадад ссссадсадс сбдадсдсса дсдбдддсда ссдсдбдасс 60 абсассбдсс дсдссадсса дадсабсддс сбдбассбдд ссбддбасса дсадаадссс 120 ддсааддссс ссаадсбдсб дабсбасдсс дссадсадсс бдсададсдд сдбдсссадс 180 сдсббсадсд дсадсддсад сддсассдас ббсасссбда ссабсадсад ссбдсадссс 240 даддасббсд ссассбасба сбдссадсад ддсаасассс бдадсбасас сббсддссад 300 ддсассаадд бддадабсаа дсдбасддбд дсбдсассаб сбдбсббсаб сббсссдсса 360 бсбдабдадс адббдааабс бддаасбдсс бсбдббдбдб дссбдсбдаа баасббсбаб 420 сссадададд ссааадбаса дбддааддбд дабаасдссс бссаабсддд баасбсссад 480 дададбдбса сададсадда садсааддас адсассбаса дссбсадсад сасссбдасд 540 сбдадсааад садасбасда дааасасааа дбсбасдссб дсдаадбсас ссабсадддс 600 сбдадсбсдс ссдбсасааа дадсббсаас аддддададб дб 642 <210> 109 <211> 11 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Смешанная последовательность ЬСОК1 Кандидатов 15, 15-1, 15-2, 15-3, 15· 4, 15-5, 15-6, 15-9 <400> 109
Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Ьеи Туг Ьеи А1а 1 5 10 <210> 110 <211> 7 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> ЬСЭК2 Кандидатов 15, 15-1 _ 15-9 <400> 110
А1а А1а Зег Зег Ьеи <31п Зег 1 5
- 77 021512 <210> 111 <211> 10 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Смешанная последовательность НССВ1 Кандидатов 15, 15-1, 15-4, 15-7, 15<400> 111
С1у Туг Зег РЪе ТЪг Азп Туг Тгр Уа1 С1у <210> 112 <211> 17 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Смешанная последовательность НСОВ2 Кандидатов 15, 15-2, 15-3, 15-6, 157, 15-8 <400> 112
РЪе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЪг Азп Туг А1а Рго Зег РЪе <31п <210> 113 <211> 9 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Смешанная последовательность ЬСЦКЗ Кандидатов 15, 15-1 _ 15-9 <400> 113
С1п С1п С1у Азп ТЪг Ьеи Зег Туг ТЪг <210> 114 <211> 17 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> НСОР2 Кандидатов 15-1 <400> 114
Агд 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЪг Азп Туг А1а Рго Зег РЪе С1п <210> 115 <211> 10 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапйМаЪее 15-2 НСОК1 <400> 115
С1у Туг 5ег РЪе ТЪг Азп Туг Тгр Г1е С1у <210> 116 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223>
Сапс11с1аС.ез 15-3, 15-5, 15-6, 15-9 ЕСОР1 <400> 116
С1у Туг Зег РЪе ТЪг Азп Туг Тгр 11е Зег 15 10 <210> 117 <211> 17 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИбаДез 15-4 НСЭК2 <400> 117
РЪе Не Азр Рго Зег
Азр Зег Гу1
ТЪг Азп Туг Зег Рго 10
Зег РЪе С1п <210> 118 <211> 17 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНааЪез 15-5, 15-9 НССР2 <400> 118
Агд 11е Αερ Рго Зег Азр Зег Туг ТЪг Азп Туг Зег Рго Зег РЪе С1п <210> 119 <211> 14 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223>
СапсНйасез 15-6, 15-9 нсокз <400> 119
А1а Агд θΐη Ьеи Туг С1п <31у Туг Мед Азр ТЪг РЪе Адр Зег 15 Ю
- 78 021512 <210> 120 <211> 11 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИЦаСез 15-7 ЪССЕЯ <400> 120
Агд А1а 5ег С1п Зег Не Зег Зег Гуг Ьеи А1а <210> 121 <211> 11 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНс1аЬе5 15-8 ЬСГОК!
<400> 121
Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у ьеи Гуг ьеи Азп <210> 122 <211> 107 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсИйаСев 15-7 УЬ <4С0> 122
Азр Не 61η МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Зег Зег Туг 25 30
С1п Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго ьуз ьеи ьеи Не
Авр Агд Уа1 ТЬг Не 20
Ьеи АЬа Тгр ТуГ 61п
40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи <31п Зег <31у ’Ή1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг 65
С1и Азр РЬе АЬа ТЬг 85
ТЬг РЬе С1у 31п <31у 100
Азр РЬе ТЬг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 70 75 80
Туг Туг Суз С1п СЬп (31у Азп ТЬг Ьеи Зег Туг 90 95
ТЬг Ьуз Уа1 31и Не Ьуз
105 <210> 123 <211> 107 <212> РЕГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНдаСез 15-8 УЬ <400> 123
Авр Не С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 Ю 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Ьеи Туг
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг АЬа А1а Вег Зег Ьеи С1п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег 31у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
70 75 80
С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз 31п С1п С1у Азп ТЬг Ьеи Зег Туг
90 95 <210> 124 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
1п Зег С1у АЬа С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго 10
Зег Ьеи Ьуз Т1е Зег Суз Ьуз С1у 5ег С1у Туг Зег РЬе ТЬ1
Тгр Уа1 С1у Тгр 35 <31у Агд Г1е Азр 50
СЬп С1у СЬп Уа1 65
Ьеи С1п Тгр Зег
А1а Агд С1и Ьеи 100
СЬп С1у ТЬг Ьеи 115
УаЬ Агд
Рго Зег
ТЬг Не 70
Туг СЬп
УаЬ ТЬг
С1п МеС Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и 40 45
Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг АЬа Рго
60
Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг
Ьуз А1а Зег Азр ТЬг АЬа МеС туг 90
С1у Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр Зег 105 110
Уа1 Зег Зег 120
Азп Туг
Тгр МеС
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Тгр 31у <210> 125 <211> 121 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <400> 125
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 СЬп Зег С1у АЬа СЬи Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у СЬи 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег 61у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр Не О1у Тгр УаЬ Агд СЬп МеС Рго С1у Ьуз С1у Ьеи СЬи Тгр МеС 35 40 45
31у РЬе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе 50 55 60
С1п С1у О1п УаЬ ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е Зег ТЬг А1а Туг
70 75 80
Ьеи 61п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеС Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1и Ьеи Туг СЬп С1у Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр С1у
100 105
С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 126 <211> 121 <212> РКГ <213> Синтетическая последовательность <400> 126
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 О1п Зег С1у А1а С1и Уа1 15 10
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг 20 25
Тгр 11е Зег Тгр Уа1 Агд С1п МеЬ Рго С1у Ьуз 35 40
С1у РЬе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азл 50 55
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 65 70 75
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п О1у Туг МеЪ Азр ТЬг 100 105
С1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120
Ьуз Ьуз
Зег РЬе
С1у Ьеи 45
Туг А1а 60
Не Зег
А1а Меб
РЬе Азр
Рго С1у <31и 15
ТЬг Азл Туг 30
С1и Тгр МеЬ
Рго Зег РЬе
ТЬг А1а Туг 80
Туг Туг Суз 95 <210> 127 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
-4 УН
Зег Ьеи Ьуз
Тгр Уа1 С1у 35
С1у РЬе Не 50
С1п С1у Ηΐβ 65
Ьеи 01л Тгр
А1а Агд С1и
Ьеи Уа1 5
Не Зег 20
Тгр Уа1
Азр Рго
Уа1 ТЬг
Зег Зег 85
Ьеи Туг 100
Ьеи Уа1
С1п Зег
Суз Ьуз
Агд О1л
Зег Азр 55
Не Зег 70
Ьеи Ьуз <31п С1у ’
ТЬг Уа1 :
С1у А1а
С1у Зег 25
МеЬ Рго 40
Зег Туг
А1а Азр
А1а Зег
С1и Уа1 10
С1у Туг
С1у Ьуз
ТЬг Азп
Ьуз Зег 75
Азр ТЬг 90
Азр ТЬг
Ьуз Ьуз Рго
Зег РЬе ТЬг 30
С1у Ьеи О1и 45
Туг Зег Рго 60
11е Зег ТЬг
А1а Мер Туг
С1у С1и 15
Азп Туг
Тгр Мел
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Тгр С1у <210> 128 <211> 121 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНйаЛе 15-5 УН
<400> 12 ’8
<31и Уа1 σΐη Ьеи Уа1 <31п Зег С1у А1а бЛи УаЛ Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег 01у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр Не Зег Тгр Уа1 Агд С1п мел Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Мел
35 40 45
ЗЛу Агд не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг АЗП Туг Зег Рго Зег РЬе
50 55 60
01п С1у Ηΐβ Уа1 ТЬг Не Зег АЛа Авр Ьуз Зег Не Зег ТЬг АЛа Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Авр ТЬг АЛа Мел Туг Туг Суз
85 90 95
АЛа Агд бЛи Ьеи Туг (31п С1у Туг мел АЗр ТЬг РЬе Азр Зег тгр О1у
100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЛ Зег Зег
115 120
<210> 129 <211> 121 <212> РКГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> СапсНйаье 15-6 УН <400> 129
С1и УаЛ С1п Ьеи Уа1 С1п Зег бЛу А1а б1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго СЛу б!и
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз СЛу Зег СЛу Туг Зег РЬе ТЬг АЗП Туг
20 25 30
Тгр Не Зег Тгр УаЛ Агд С1п МеЛ Рго С1у Ьуе С1у Ьеи С1и Тгр МеЛ
35 40 45
СЛу РЬе Не Авр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг АЛа Рго Зег РЬе
50 55 60
б1п ОЛу б1п УаЛ ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Авр ТЬг А1а Меь Туг туг Суз
85 90 95
АЛа Агд С1п Ьеи Туг С1п С1у Туг мел Авр тЬг РЬе Авр Зег Тгр СЛу
100 105 НО
С1л С1у ТЬг Ьеи УаЛ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 130 <211> 448 <212> РКГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-1, полная длина тяжелой цепи <400> 130
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьув Ьуз Рго <31у <31и 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Г1е Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 Агд СЛп МеЬ Рго С1у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Мер 35 40 45
Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе 55 60
11е Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг 70 75 80
Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а Мей Туг Туг Суз 90 95
С1п С1у Туг Мей Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр <31у 105 110
ТЬг Ча1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег 120 125
Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а 135 140
Ча1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С51и Рго Ча1 ТЬг Ча1 150 155 160
А1а Ьеи ТЬг Зег 51у Ча1 Нхз ТЬг РЬе Рго А1а 170 175
С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Ча! Ча1 ТЬг Ча1 185 190
О1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Ча! Азр Н1з 200 205
Ьуз Ча1 Азр Ьуз Агд Ча1 С1и Зег Ьуз Туг 31у 215 220
Суз Рго А1а Рго <31и А1а А1а С1у С1у Рго Зег 230 235 240
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мей Не Зег Агд 250 255
Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег С1п С1и Азр Рго 265 270
Тгр Туг Ча1 Азр <31у Ча1 О1и Ча1 Нхз Азп А1а 280 285
С1и С1и О1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Ахд Ча1 Ча1 295 300
Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг 310 315 320
Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг 330 335 <31у С1п Рго Агд С1и Рго О1п Ча1 Туг ТЬг Ьеи 345 350 <31и Мей ТЬг Ьуз Азп <31п Ча1 Зег Ьеи ТЬг Суз 360 365
Туг Рго Зег Азр Г1е А1а Ча1 С1и Тгр С1и Зег 375 380
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Ча1 Ьеи Азр 390 395 400
РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Ча1 Азр Ьуз Зег 410 415
Азп Ча1 РЬе Зег Суз Зег Ча1 Мей Нхз 61и А1а 425 430
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз 440 445
С1у Агд Не Азр Рго 50
С1п С1у <31п Ча1 ТЬг 65
Ьеи С1п Тгр Зег Зег 85
А1а Агд С1и Ьеи туг 100
С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 115
Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а 130
А1а Ьеи <51у Суз Ьеи 145
Зег Тгр Азп Зег С1у 165
Ча1 Ьеи 31п Зег Зег 180
Рго Зег Зег Зег Ьеи 195
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг 210
Рго Рго Суз Рго Рго 225
Ча1 РЬе Ьеи РЬе Рго 245
ТЬг Рго С1и Ча1 ТЬг 260
С1и Ча1 С1п РЬе Азп 275
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 290
Зег Ча1 Ьеи ТЬг Ча1 305
Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег 325
11е Зег Ьуз А1а Ьуз 340
Рго Рго Зег 61п С1и 355
Ьеи Ча1 Ьуз С1у РЬе 370
Азп С1у С1п Рго С1и 385
Зег Азр С1у Зег РЬе 405
Агд Тгр С1п С1и О1у 420
Ьеи Нхз Азп Н1з Туг 435 <210> 131 <211> 448 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>
<223> Кандидат 15-2, <400> 131 <31и Ча1 С1п Ьеи Ча!
5
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег последовательность , полная длина тяжелой цели <31п Зег С1у А1а С1и Ча! Ьуз Ьуз Рго С1у С1и 10 15
Суз Ьуз С1у Зег 21у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
25 30
Тгр Не С1у 35 Тгр Ча! Агд С1п мей 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и 45 Тгр Мей
С1у РЬе Не Αερ Рго Зег Αερ Зег Туг ТЬг Азп Туг А1а Рго Зег РЬе
50 55 60
С1п С1у С1п Ча1 ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а Мес туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п С1у Туг Мей Азр ТЬг РЬе АЗр Зег Тгр С1у
100 105 НО
С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча! Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз 61у Рго Бег
115 120 125
Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а
130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи Ча! Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Ча! ТЬг Ча!
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Бег С1у Ча1 Нхз ТЬг РЬе Рго А1а 165 170 175
ча1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег ча1 ча1 ТЬг ча1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Ча1 Азр Нхз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Ча! Азр Ьуз Агд Ча1 С1и Зег Ьуз Туг С1у
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а А1а С1у 61у Рго Зег
225 230 235 240
Ча1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мей Не Зег Агд 245 250 255
ТЬг Рго С1и Ча1 ТЬг Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег С1п С1и Азр Рго 260 265 270
С1и Ча! С1п РЬе Азп Тгр Туг Ча! Азр 0>1у Ча1 <31и Ча1 Нхз А$п А1а 275 280 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Ча1 Ча1 290 295 300
Зег Ча1 Ьеи ТЬг Ча! Ьеи Нхз <31п Азр Тгр Ьеи Азп 01у Ьуз <31и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Ча! Зег Азп Ьуз <31у Ьеи Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг
325 330 335
Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у 01п Рго Агд С1и Рго С1п ча! туг ТЬг Ьеи 340 345 350
Рго Рго Зег С1п С1и <31и Мей ТЬг Ьуз Азп <31п Ча1 Зег Ьеи ТЬг Суз 355 360 365
Ьеи Ча1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Ча1 С1и Тгр С1и Зег 370 375 380
Азп 51у <31п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Ч&1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Ча1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п С1и <31у Азп Ча1 РЬе Зег Суз Зег Ча! Мей Нхд <31и АЬа
420 425 430
Ьеи Н!з Азп Н1з Туг ТЬг <31п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи 5ег Ьеи С1у Ьуз
435 440 445 <210:
<211:
<212:
<213:
132
448
РРТ
Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-3» полная длина тяжелой цепи
- 81 021512 <400> 132
С1и Уа1 С1п Ьей Уа1 1 5
Зег Ьей Ьуз Не Зег
Тгр 11е Зег Тгр Уа1 35
С1у РЬе 11е Азр Рго 50
С1п С1у Θΐη Уа1 ТЬг 65
Ьей С1п Тгр Зег Зег 85
А1а Агд 31и Ьей Туг 100 <31 η С1у ТЬг Ьей Уа1 115
Уа1 РЬе Рго Ьей А1а 130
А1а Ьей 31у Суз Ьей 145
Зег Тгр Азп Зег <31у 165
Уа1 Ьей С1п Зег Зег 180
Рго Зег Зег Зег Ьей 195
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг 210
Рго Рго Суз Рго Рго 225
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго 245
ТЬг Рго 31и Уа1 ТЬг 260
С1и Уа1 61п РЬе Азп 275
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд 290
Зег Уа1 Ьей ТЬг Уа1 305
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег 325
Не Зег Ьуз А1а Ьуз 340
Рго Рго Зег С1п С1и 355
Ьей Уа1 Ьуз С1у РЬе 370
Азп С1у 61п Рго <31и 385
Зег Азр С1у Зег РЬе 405
Агд Тгр <31п <31и С1у 420
Ьеи ΗΪ5 Азп Ηίδ Туг 435
С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз 10
Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег 25
Агд С1п МеД Рго С1у Ьуз С1у 40
Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг 55 60
11е Зег А1а Азр Ьуз Зег 11е 70 75
Ьей Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а 90
С1п С1у Туг МеД Азр ТЬг РЬе 105
ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг 120
Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег 135 140
Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и 150 155
А1а Ьей ГЬг Зег С1у Уа1 Ηίδ 170
С1у Ьей Туг Зег Ьей Зег Зег 185
61у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз 200
Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и 215 220
Суз Рго А1а Рго С1и А1а А1а 230 235
Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьей 250
Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег 265
Тгр Туг Уа1 Азр б1у Уа1 С1и 280
С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг 295 300
Ьей Н1з С1п Азр Тгр Ьей Азп 310 315
Азп Ьуз С1у Ьей Рго Зег Зег 330
С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п 345
С1и МеД ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1 360
Туг Рго Зег Азр Не А1а УаЬ 375 380
Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго 390 395
РЬе Ьей Туг Зег Агд Ьей ТЬг 410
Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 425
ТЬг С1п Ьуз Зег Ьей Зег Ьей 440
Ьуз Рго С1у С1и 15
РЬе ТЬг Азп Туг 30
Ьеп С1и Тгр МеД 45
А1а Рго Зег РЬе
Зег ТЬг А1а Туг 80
МеД Туг Туг Суз 95
Азр Зег Тгр 31у 110
Ьуз С1у Рго Зег 125
С1и Зег ТЬг А1а
Рго Уа1 ТЬг Уа1 160
ТЬг РЬе Рго А1а 175
Уа1 Уа1 ТЬг Уа1 190
Азп Уа1 Азр Н.13 205
Зег Ьуз Туг С1у
С1у С1у Рго Зег 240
МеД Не Зег Агд 255
С1п С1и Азр Рго 270
Уа1 Ηίδ Азп А1а 285
Туг Агд Уа1 Уа1
С1у Ьуз С1и Туг 320
11е С1и Ьуз ТЬг 335
Уа1 Туг ТЬг Ьей 350
Зег Ьей ТЬг Суз 365
С1и Тгр С1и Зег
Рго Уа1 Ьей Азр 400
Уа1 Азр Ьуз Зег 415
МеД Шз С1и А1а 430
Зег Ьей С1у Ьуз 445 <210> 133 <211> 448 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>
<223> Кандидат 15-4, <400> 133
С1и Уа1 С1п Ьей Уа1 1 5
Зег Ьей Ьуз 11е Зег
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 35
С1у РЬе Не Азр Рго 50 последовательность полная длина тяжелой цепи
С1п Зех С1у А1а С1и Уа1 Ьуз 10
Суз Ьуз <31у Зег 61у Туг Зег 25
Агд С1п МеД Рго С1у Ьуз С1у 40
Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг 55 60
Ьуз Рго С1у 61и 15
РЬе ГЬг Азп Туг 30
Ьей 31и Тгр МеД 45
Зег Рго Зег РЬе
<31п С1у ΗΪ5 νβΐ ТЬг не 5ег А1а Азр ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьей С1п Тгр Зег Зег Ьей Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеД Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <31и Ьей Туг 01η С1у Туг МеД Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр 61у
100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьей Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз (31у Рго Зег
115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьей А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1п Зег ТЬг А1а 130 135 140
А1а Ьей С1у Суз Ьей Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг Уа1
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег 61у А1а Ьей ГЬг Зег <31у Уа1 Ηίδ ГЬг РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьей С1п Зег 180 Зег С1у Ьей Туг Зег Ьей Зег Зег Уа1 Уа1 ТЬг Уа1
185 190
Рго Зег Зег Зег Ьей С1у ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр н±з
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг 61у
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а А1а С1у 31у Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 РЬе Ьей РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ГЬг Ьей МеД Не Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго <31и Уа1 ТЬг Суе Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Зег <31п 51υ Азр Рго
260 265 270
О1и Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг νβΐ Азр С1у Уа1 <31υ νβΐ Ηίδ Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1
290 295 300
Зег Уа1 Ьей ГЬг Уа1 Ьеи Ηί? <51п Азр Тгр Ьеи Азп £1у Ьуз £1υ Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьей Рго Зег Зег Г1е С1и Ьуз ТЬг
325 330 335
Не Зег Ьуз А1а Ьуз 61у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьей
340 345 350
Рго Рго Зег 01п 61и С1и МеД ТЬг Ьуз Азп <31п Уа1 Зег Ьей ТЬг Суз
355 360 365
Ьей Уа1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Уа1 <31и Тгр С1и Зег
370 375 380
Азп С1у 31п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьей Азр
385 390 395 400 бег Азр 61у Зег РЬе РЬе Ьей Туг Зег Агд Ьей ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п С1и С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеД Ηίε С1и А1а
420 425 430
Ьей Ηί3 Азп Ηίε Туг ТЬг 61п Ьуз Зег Ьей Зег Ьеи Зег Ьей 61у Ьуз
435 440 445
- 82 021512 <210> 134 <211> 448 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-5, полная длина тяжелой цепи <400> 134
С1и Уа1 С1п ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а СЬи Уа1 Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Пе Зег Суз Ьуз СЬу Зег <31_у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
тгр 11е Зег Тгр Уа1 Агд С1п МеС Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи тгр МеС
35 40 45
СЬу Агд Пе Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Зег Рго Зег РЬе
50 55 60
С1п С1у НЬз УаЬ ТЬг 11е Зег А1а Азр Ьуз Зег Пе Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг АЬа МеС Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд СЬи Ьеи Туг С1п СЬу Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр СЬу
100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьеи УаЬ ТЫ УаЬ Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз С1у Рго Зег
115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЫ А1а
130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ТЬг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ НЬз ТЫ РЬе Рго АЬа
165 170 175
Уа1 Ьеи С1п Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ νβΐ ТЬг УаЬ
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЫ Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп νβΐ Азр НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг еьу
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи А1а А1а СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьув Азр ТЬг Ьеи МеС Пе Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго СЬи νβΐ ТЬг Суз Уа1 УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи Уа1 С1п РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу Уа1 СЬи УаЬ ΗΪ3 Азп А1а
275 230 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 УаЬ
290 295 300
Зег νβΐ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ΗΪ5 С1п Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Сув Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТЬг
325 330 335
Не Зег Ьуз А1а Ьуз СЬу С1п Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег С1п СЬи СЬи МеС. ТЬг Ьуз Азп 61п Уа1 Зег Ьеи ТЬг Суз
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр Пе АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег
370 375 380
Азп С1у С1п Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п С1и СЬу Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег УаЬ МеС НЬз <31и АЬа
420 425 430
Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз 435 440 445 <210> 135 <211> 448 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-6, полная длина тяжелой цепи <400> 135
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег С1у А1а С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у СЬи
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Пе Зег Суз Ьуз СЬу Зег СЬу Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
20 25 30
Тгр Пе Зег Тгр УаЬ Агд СЬп МеС Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр МеС
35 40 45
СЬу РЬе Пе Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг АЬа Рго Зег РЬе
50 55 60
С1п СЬу СЬп УаЬ ТЬг Пе Зег А1а Азр Ьуз Зег Т1е Зег ТЬг АЬа Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеС Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд СЬп Ьеи туг СЬп СЬу Туг Мес Азр ТЬг РЬе Азр Зег тгр СЬу
100 105 110
СЬп СЬу ТЬг Ьеи νβΐ ТЬг УаЬ Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег
115 120 125
УаЬ РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи Зег ТЬг А1а
130 135 140
А1а Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго Уа1 ТЬг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу УаЬ НЬз ТЫ РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ ТЫ УаЬ
180 185 190
РГО Зег Зег Зег Ьеи СЬу ТЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи А1а А1а СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
УаЬ РЬе ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мес Пе Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа
275 280 285
Ьуз ТЫ Ьуз Рго Агд СЬи СЬи С1п РЬе АЗП Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
Зег УаЬ Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Не СЬи Ьуз ТЬг
325 330 335
11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеС ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз
355 360 365
Ьеи УаЬ ьуз СЬу РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1а УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег
370 375 380
Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр
285 390 395 400
Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Гуг Зег Агд Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег 405 410 415
Агд Тгр 51п С1и С1у Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег Уа1 МеЬ Ηίε СЬи А1а 420 425 430
Ьеи Нхз Азп НЬз Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз 435 440 445 <210> 136 <211> 40 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 136 ссъъасссас. ааЬсаасЬсд ададаььасс адссдссаас <210> 137 <211> 49 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 137 саададстьс с.аС.ЬаЬсааа сааЬдадаСЛ саадсдсЪаа ааадьдаад <210> 138 <211> 45 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 138 ссЬЬасасаЬ асЬсаассЬа ассдадааЬа аааЬсЬсааа ааСад <210> 139 <211> 47 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 139 даааЬсЬаНс ЬЬЬссъасаа сдаддсссЬд садсьдасьа ддаасьс <210> 140 <211> 58 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 140 дссььсаасд асСдаЪдсЬс даддаддСдд сссссдадаа СдСддаСадс СсЬссссс <211> 39 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 141 дСассСдсад сСдСсСасда дсСссСССдс сССддСссс <210> 142 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 142 дссСддадСд дасдддссдд аСсдасссса дед <210> 143 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 143 сдсСддддЬс даСссддссс
1СссасЬсса ддс <210> 144 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 144 ададдСаасС сссдССдсдд <210> 145 <211> 38 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 145 дсаСсСддсд сасссадссд аСссадСадС сддСдаад <210> 146 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 146 ададдСаасС сссдССдсдд
- 84 021512 <210> 147 <211> 38 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 147 дсагсСддсд сасссадсЪд аЪссадьаде рддьдаад 38 <210> 148 <211> 47 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 148 сдссдагддС. сасдЬддссс гддаадсЪад ддсГдЬадьъ ддьдьад 47 <210> 149 <211> 38 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 149 сГЪсассаас РасРддаРса дсРдддЬдсд ссадаЬдс 38 <210> 150 <211> 40 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 150 сдссаРдРас СасРдсдссс дссадсРдРа ссадддсРас 40 <210> 151 <211> 40 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 151 дРадсссРдд РасадсРддс дддсдсадГа дРасаРддсд 40 <210> 152 <211> 40 <212> ДНК <213> Ногпо зархепз <400> 152 дссадссада дсаРсадсад сРассРддсс рддрассадс 40 <210> 153 <211> 40 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 153 дсьддРасса ддссаддРад сРдсРдалдс РсРддсРддс 40 <210> 154 <211> 43 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер <400> 154 сдддсРРсРд сЬддРассад РРсаддРадс РдсРдаРдсР сРд 43 <210> 155 <211> 214 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 14, полная длина легкой цепи <400> 155
Азр Не СЬп Мер ТЪг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЪг Не ТЪг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Ьеи Туг 20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1л Ьуз Рго <51у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег 31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 21у
55 60
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр ГЪе ТЪг Ьеи ТЪг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
70 75 80
С1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз 31п С1п А1а С1и ТЪг \/а1 Зег Рго
90 95
ТЪг РЪе С1у С1п С1у ТЪг Ьуз \/а1 С1и Не Ьуз Агд ТЪг Уа1 А1а А1а
100 105 НО
Рго Зег Уа1 РЪе Пе РЪе Рго Рго Зег Азр 01и С1п Ьеи Ьуз Зег (31у
П5 120 125
ТЪг А1а Зег Уа1 νβΐ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЪе Туг Рго Агд С1и АЬа
130 135 140
Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз νβΐ Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег О1у Азп Зег <ЗЬп
145 150 155 160
С1и Зег νβΐ ТЪг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЪг Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
Зег ТЪг Ьеи ТЪг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз С1и Уа1 ТЪг Нхз €1п С1у Ьеи Зег Зег Рго νβΐ ТЪг Ьуз Зег
195 200 205
РЪе Азп Агд С1у 61и Суз
210 <210> 156 <211> 214 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15, 15-1, 15-2, 15-3, 15-4, 15-5, 15-6, 15-9, полная длина легкой цепи <400> 156
Азр Не С1п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег 15 10
Азр Агд 7а1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег 20 25
Ьеи А1а Ггр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз 35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 50 55
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ГЬг 65 70
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не 100 105
Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр 115 120
ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп
130 135 ьуз νβΐ С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а ьеи 145 150
С1и Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр 165 170
Зег ГЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг 180 185
А1а Суз С1и νβΐ ТЬг Ηίε С1п С1у Ьеи Зег 195 200
РЬе Азп Агд О1у С1и Суз
210
Ьеи Зег
С1п Зег
А1а Рго
Рго Зег 60
Не Зег 75
С1у Азп
Ьуз Агд
С1и СЬп
РЬе Туг 140
С1п Зег 155
Зег ТЬг
61и Ьуз
Зег Рго
А1а Зег
Не С1у
Ьуз Ьеи 45
Агд РЬе
Зег Ьеи
ТЬг Ьеи
ТЬг Уа1 110
Ьеи Ьуз 125
Рго Агд
С1у Азп
Туг Зег
Ηίε Ьуз 190
Уа1 ТЬг 205
Уа1 С1у 15
Ьеи Туг
Ьеи Не
Зег 61у
С1п Рго 80
Зег Туг 95
АЬа А1а
Зег СЬу
С1и А1а
Зег СЬп 160
Ьеи Зег 175
Уа1 Туг
Ьуз Зег <210> 157 <211> 214 <212> РРТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-7, полная длина легкой цепи <400> 157
Азр Не С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 1 5 Ю
Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 20 25
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз АЬа Рго 35 40
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у УаЬ Рго Зег 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег 65 70 75
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п 61п С1у Азп
ТЬг РЬе С1у СЬп С1у ТЬг Ьуз УаЬ С1и Не Ьуз Агд 100 105
Рго Зег УаЬ РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п 115 120
ТЬг А1а Зег Уа1 УаЬ Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг 130 135 140
Ьуз УаЬ С1п Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи СЬп 145 150 155
С1и Зег УаЬ ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег
165 170
Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и
180 185
А1а Суз С1и УаЬ ТЬг Ηίε С1п С1у Ьеи Зег Зег
195 200
РЬе Азп Агд С1у С1и Суз
210
А1а Зег
11е Зег 30
Ьуз Ьеи 45
Агд РЬе
Зег Ьеи
ТЬг Ьеи
ТЬг УаЬ 110
Ьеи Ьуз 125
Рго Агд
Зег С1у
ТЬг Туг
Ьуз Ηίε
Рго 1/а1 205
Уа1 СЬу 15
Зег Гуг
Ьеи Не
Зег С1у
С1п Рго 80
Зег Туг 95
А1а АЬа
Зег С1у
СЬи А1а
Азп Зег СЬп 160
Зег Ьеи Зег 175
Ьуз Уа1 Туг 190
ТЬг Ьуз Зег <210> 158 <211> 214 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15-8, <400> 158
Азр Не СЬп МеС ТЬг 1 5
Азр Агд УаЬ ТЬг Не 20
Ьеи Азп Тгр Туг СЬп 35
Туг АЬа АЬа Зег Зег 50
Зег СЬу Зег СЬу ТЬг 65
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу 100
Рго Зег 7а1 РЬе Не 115
ТЬг А1а Зег УаЬ νβΐ 130
Ьуз УаЬ СЬп Тгр Ьуз 145
С1и Зег УаЬ ТЬг С1и 165
Зег ГЬг Ьеи ТЬг Ьеи 180
А1а Суз С1и УаЬ ТЬг 195
РЬе Азп Агд СЬу О1и 210 полная длина легкой цепи
С1п Зег
ТЬг Суз
С1п Ьуз
Ьеи С1п 55
Азр РЬе 70
Туг Туг
ТЬг Ьуз
РЬе Рго
Суз Ьеи 135
УаЬ Азр 150
СЬп Азр
Зег Ьуз
Ηίε СЬп
Суз
Рго Зег
Агд АЬа 25
Рго 61у 40
Зег СЬу
ТЬг Ьеи
Суз СЬп
УаЬ СЬи 105
Рго Зег 120
Ьеи Азп
Азп АЬа
Зег Ьуз
Зег Ьеи 10
Зег СЬп
Ьуз А1а
УаЬ Рго
ТЬг Не 75
С1п СЬу 90
Не Ьуз
Азр СЬи
Азп РЬе
Ьеи С1п 155
Азр Зег 170
Туг С1и
Зег А1а
Зег Не
Рго Ьуз 45
Зег Агд 60
Зег Зег
Азп ТЬг
Агд ТЬг
Зег УаЬ СЬу 15
СЬу Ьеи Туг 30
Ьеи ьеи 11е
РЬе Зег СЬу
Ьеи СЬп Рго 80
Ьеи Зег Туг 95
УаЬ АЬа АЬа 110
Ьуз Зег СЬу
61п Ьеи 1 125
Туг Рго Агд 61и А1а 140
Зег С1у А1а Азр 185
С1у Ьеи Зег Зег 200
ТЬг Туг
Ьуз Ηίε
Азп Зег С1п 160
Зег Ьеи Зег 175
Ьуз Уа1 Туг 190
ТЬг Ьуз Зег <210> 159 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> УН Кандидата 15-9 <400> 159
С1и Уа1 С1п Ьеи УаЬ С1п Зег СЬу А1а С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у С1и 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
- 86 021512
Тгр Не Зег Тгр УаЬ Агд СЬп МеС Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр МеС 35 40 45
СЬу Агд Е1е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Зег Рго Зег РЬе 50 55 60
СЬп С1у Ηίε УаЬ ТЬг Т1е Зег А1а Азр Ьуз Зег ТЬе Зег ТЬг АЬа Туг
Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеС Туг Гуг Суз 85 90 95
А1а Агд СЬп Ьеи Туг СЬп СЬу Туг МеС Азр ТЫ РЬе Азр Зег Тгр СЬу 100 105 110
СЬп С1у ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 120 <210> 160 <211> 448 <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Кандидат 15—9, полная длина тяжелой цепи <400> 160
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬп Зег О1у АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у С1и
Зег Ьеи Ьуз Х1е 5ег Суз Ьуз СЬу Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр 11е Зег Тгр Уа1 Агд СЬп МеС Рго С1у Ьуз СЬу Ьеи С1и Тгр МеС 35 40 . 45
СЬу Агд 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Зег Рго Зег РЬе 50 55 60
СЬп С1у Нгз Уа1 ТЬг ГЬе Зег АЬа Азр Ьуз Зег 11е 5ег ТЬг АЬа Туг
70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа Зег Азр ТЬг АЬа МеС Туг Туг Суз
АЬа Агд СЬп Ьеи Туг СЬп С1у Туг МеС Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр О1у 100 105 110
СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЫ Уа1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз 61у Рго Зег 115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ТЬг А1а 130 135 140
А1а Ьеи С1у Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Уа1 ТЬг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи ТЬг Зег СЬу Уа1 НЬз ТЬг РЬе Рго А1а
165 170 175
Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ Уа1 ТЬг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ГЫ Туг ТЬг Суз Азп УаЬ Азр НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд Уа1 С1и Зег Ьуз Туг С1у
210
215
220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи А1а А1а СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
УаЬ РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мес Не Зег Агд
245 250 255
ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ Уа1 Азр УаЬ Зег СЬп С1и Азр Рго
260 265 270
СЬи УаЬ СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ С1и Уа1 НЬз Азп АЬа
275 280 285
Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
Зег УаЬ Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи Туг 305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Не С1и Ьуз ТЬг 325 330 335
Т1е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд С1и Рго СЬп УаЬ Туг ТЬг Ьеи 340 345 350
Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеС ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ТЬг Суз 355 360 365
Ьеи УаЬ Ьуз 61у РЬе Туг Рго Зег Азр Пе АЬа УаЬ СЬи Тгр СЬи Зег 370 375 380
Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго УаЬ Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр С1п 61и С1у Азп УаЬ РЬе Зег Суз Зег УаЬ Мес НЬз СЬи АЬа
420 425 430
Ьеи НЬз Азп НЬз Туг ТЫ С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз
435 440 445 <210> 161 <211> 2718 <2Ь2> ДНК <213> Миз тизси1из <4О0> 161 аьдааадддб сГГсГддСдС.
ГГдаадсГаа сасаассаас
ГСддаГдсад
ГГдГГдааад дГсГГсГдса адсаасссЫ
ГсаГсГасаа аааааГаааа сдааадЫгдд аГЬддсаадГ аадсЫедсГ сгдсгддсса даГсЫСссГ сГдаддиаСс ддасГсГсса сЫдсггсас сГоаасаГдд адгсгдаадГ асаГНдгдг
ГсаааааГад сггаагдаэа дадаГсГасс сосадссггс гсассгысс аасаГаааГд ааГаасСЛад дддсГдЬсГс ддддГСЬЬса ааасггдаас аассГсаГаа
ГГадагаидс
ГддаГсаасс ссасагсагг дсссссылд дгасгдсгса сддаегсггд аГааЫсагд саадассааг дГГссГсГГа сГЬссасааа сасасагасс
Гсадаадаии даГГГаасГс
ГаГГдаассЬ сдаассидас
Гсааааасса адГГдддаас иссГГдсдЫ.
асггдгсаис
ГаГГсдсссГ дддаасГГРс ссадсдадад асаасаассб
ГдГсГсидда ассГдаддСа агсссаасаг аГдасааГаа ассгаэдгсг сасггдсгса сааагддгас
ГЛдаасаааа гагссгагаа ааадасгдаГ дсссгсысд аддассгдсС ссаддсГсГд ассГссасаи адаасГГаГГ саьгсаысг саГсСдЫда дсггсаагсс адасссасас аГРаиддсГГ аасгссгсгг ггсасагсда дтсаадда сссагааада сисгсаааиь
ГсГааидиас ссаагдсасг
ГдаГдаЪсЫ ассассЬасс саГЫсаааа дсаасаЬааГ адаасгсдаб даадааГсГа дддддГссаа дсдаадГдаа аааГссасН ссбсГГдаас ааасасаадс сасгггсгсг ссаГдаЬдГс дСасаасааС ссгдадЬСГд
ГдасдаЬГГГ
ГэГГссаэдб
ЬГссаааасГ
ГГсГсссбГд гггсхсыдд асгсадсддс саааГассГс дсГсаддадд гаасггдасс ддадддГсГС дааасдсдса сгидааьгьа сдаасьааад гдаЬдассад дааддаГдГГ дГГсдасГдс гаагагсгсс.
сссссГдаад саГааГсадс дддсгддадд ааГадасаса сададасГдд ггдссЬадаа
ГссГНдддд дидадасаса сссГсГааса ааснгасаа сиддадссад дадсГсСсГс сГаагдгсга агсаааггад сбддадаасс даасГГдадЬ ааададьгсг аасдсссаас абссадааГс дддсСдаадС ддсаасддСГ аСасадсдГс аадсдадсаС СссСССсааС ассаааадса сссасаадсс сСсасСсСса ССаддссаас саддааедда саасСдгсСа дСддсссССа аслссддасс дадаасссад аассссддгд дадЬссаасд адсассаагс асаГсСсСаа ГЬсдддссдс асдсдсдааа дадсгдГсса сыггсдага ассадСаСдс агсгсстт саддсСдадс дГсГдддаас дааадддасГ дасссссдьс асдсадссда
СаасадСдСС даСасадсса аассдСдсса адассссСда асСсааСаса аСССдсссса сссаадаасЬ
ССссСддсаа ссссддддьд
Сдаассссса
СсСсссгддс ддасаааСсС ссССсСссСа
СдСссссссд ссассаадса ддССааааСа аСассССсас сдсааассьс асССаасдаа
СсаддаСасС даддсссдад ссадССссСС ааааСдСдда
Саадсаасаа ааасссГдда дссссдгсаа дсССадаСда
СаддасЬдаа ддСсасСдаа сггсссаааа дсасссссьд сгсасгассг сагсаСссЬд ссссддгссс асГддааГдГ адСССдааГа аСССсСсссе ссдаадсадд ссСаСддаСС сСдсадссаг дааСсссасС асССдссаСс ааСасСсссС
СсааассССС сааааССааа саасддссса дсСсССадса
ССсгСсСССа
СССссадаса ссСсасадад
Саасаассад сасссадсСс
СсСсссаадс сссссссьас аадсдсссса
СССддааСаС дддаССддСд аасаеаСдаа ааассасаСс
СдаСсСсддс ааасасассс сдсаССддСс сасссссссс саасаСадсс сгсгсадсас ссссссдаад ааСсссадСс
Саасггааас ссГссадаад ссгдаасадс диГСдГСаас сидсаасасс
Гааадасадс
ГаГасГСдсд
ССсадСдсаС сасадссСас аагддаадаа сдгссгсдда
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
- 87 021512 сссдаадсаа ссдссаасад саСсаааада адссдааааа ссаССССсдъ ЬаСсасасас 2460 саСЛСаССаа аадасссСсС дСдсадаада ССсааддСас аСсасдсадС СсадсаадсС 2520 аССдадсааа аСсСддаССс ааССаСасСд аСССССсСсс адааСаССсс адассасааа 2580 сСааассаСд сасСсСдССС дсдаададда аСдСССаааС сСсаССдсаС сССдаассдд 2640 ссадССсада аадаасддаЪ ааасдссССС саСсаСаааС СдсаадСадс асССддассС 2700 сддаасссад сасассаа 2718 <210> 162 <211> 905 <212> РВТ <213> Миз шизсиЬиз <400> 162
МеС Ьуз СЬу Суз бег Зег Туг Ьеи Мес Туг Зег РЬе СЬу С1у Ьеи Ьеи 15 10 15
Зег Ьеи Тгр Не Ьеи Ьеи УаЬ Зег Зег ТЬг Азп СЬп Суз ТЬг УаЬ Агд 20 25 30
Туг Азп УаЬ А1а Азр Суз Зег НЬз Ьеи Ьуз Ьеи ТЬг НЬз 11е Рго Азр
Азр Ьеи Рго Зег Азп Не ТЬг УаЬ Ьеи Азп Ьеи ТЬг НЬз Азп СЬп Ьеи 50 55 60
Агд Агд Ьеи Рго Рго ТЬг Азп РЬе ТЬг Агд Туг Зег СЬп Ьеи А1а Не
70 75 80
Ьеи Азр А1а СЬу РЬе Азп Зег Не Зег Ьуз Ьеи СЬи Рго СЬи Ьеи Суз
С1п Не Ьеи Рго Ьеи Ьеи Ьуз УаЬ Ьеи Азп Ьеи С1п НЬз Азп С1и Ьеи 100 105 110
Зег СЬп Не Зег Азр 61п ТЬг РЬе УаЬ РЬе Суз ТЬг Азп Ьеи ТЬг С1и 115 120 125
Ьеи Азр Ьеи МеС Зег Азп Зег Не НЬз Ьуз Не Ьуз Зег Азп Рго РЬе
130 135 140
Ьуз Азп СЬп Ьуз Азп Ьеи Не Ьуз Ьеи Азр Ьеи Зег НЬз Азп СЬу Ьеи
145 150 155 160
Зег Зег ТЬг Ьуз Ьеи СЬу ТЬг СЬу УаЬ СЬп Ьеи СЬи Азп Ьеи 31п СЬи
165 170 175
Ьеи Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Азп Ьуз Не Ьеи АЬа Ьеи Агд Зег С1и СЬи Ьеи
180 185 190
СЬи РЬе Ьеи СЬу Азп Зег Зег Ьеи Агд Ьуз Ьеи Азр Ьеи Зег Зег Азп
195 200 205
Рго Ьеи Ьуз СЬи РЬе Зег Рго СЬу Суз РЬе СЬп ТЬг Не СЬу Ьуз Ьеи
210 215 220
РЬе АЬа Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп АЬа СЬп Ьеи Азп Рго НЬз Ьеи ТЬг СЬи
225 230 235 240
Ьуз Ьеи Суз Тгр СЬи Ьеи Зег Азп ТЬг Зег Не СЬп Азп Ьеи Зег Ьеи
245 250 255
А1а Азп Азп СЬп Ьеи Ьеи АЬа ТЬг Зег С1и Зег ТЬг РЬе Зег СЬу Ьеи
260 265 270
Ьуз Тгр ТЬг Азп Ьеи ТЬг СЬп Ьеи Азр Ьеи Зег Туг Азп Азп Ьеи НЬз
275 280 285
Азр УаЬ С1у Азп СЬу Зег РЬе Зег Туг Ьеи Рго Зег Ьеи Агд Туг Ьеи
290 295 300
Зег Ьеи СЬи Туг Азп Азп Не С1п Агд Ьеи Зег Рго Агд Зег РЬе Туг
305 310 315 320
СЬу Ьеи бег Азп Ьеи Агд Туг Ьеи Зег Ьеи Ьуз Агд А1а РЬе ТЬг Ьуз
325 330 335
31п Зег УаЬ Зег Ьеи АЬа Зег НЬз Рго Азп Не Азр Азр РЬе Зег РЬе
340 345 350
СЬп Тгр Ьеи Ьуз Туг Ьеи СЬи Туг Ьеи Азп МеС Азр Азр Азп Азп Не
355 360 365
Рго Зег ТЬг Ьуз Зег Азп ТЬг РЬе ТЬг СЬу Ьеи УаЬ Зег Ьеи Ьуз Туг
370 375 380
Ьеи Зег Ьеи Зег Ьуз ТЬг РЬе ТЬг Зег Ьеи С1п ТЬг Ьеи ТЬг Азп СЬи 385 390 395 400
ТЬг РЬе УаЬ бег Ьеи АЬа Ηίε бег Рго Ьеи Ьеи Т1гг Ьеи Αεη Ьеи ТЬг 405 410 415
Ьуз Азп НЬз Не бег Ьуз 11е АЬа Азп СЬу ТЬг РЬе Зег Тгр Ьеи СЬу 420 425 430
СЬп Ьеи Агд Не Ьеи Азр Ьеи СЬу Ьеи Азп О1и Не СЬи 61п Ьуз Ьеи 435 440 445 бег СЬу СЬп СЬи Тгр Агд СЬу Ьеи Агд Азп 11е РЬе СЬи Не Туг Ьеи
450 455 460 бег Туг Азп Ьуз Туг Ьеи СЬп Ьеи бег ТЬг бег бег РЬе АЬа Ьеи УаЬ
465 470 475 480
Рго бег Ьеи СЬп Агд Ьеи МеС Ьеи Агд Агд УаЬ АЬа Ьеи Ьуз Азп УаЬ
485 490 495
Азр Не бег Рго бег Рго РЬе Агд Рго Ьеи Агд Азп Ьеи ТЬг Пе Ьеи
500 505 510
Азр Ьеи бег Азп Азп Азп 11е АЬа Азп Не Азп СЬи Азр Ьеи Ьеи СЬи
515 520 525
СЬу Ьеи СЬи Азп Ьеи СЬи Не Ьеи Азр РЬе СЬп НЬз Азп Азп Ьеи АЬа
530 535 540
Агд Ьеи Тгр Ьуз Агд АЬа Азп Рго СЬу СЬу Рго УаЬ Азп РЬе Ьеи Ьуз
545 550 555 560
СЬу Ьеи бег НЬз Ьеи НЬз Не Ьеи Азп Ьеи СЬи бег Азп СЬу Ьеи Азр
565 570 575
СЬи Не Рго УаЬ СЬу УаЬ РЬе Ьуз Азп Ьеи РЬе СЬи Ьеи Ьуз бег Пе
580 585 590
Азп Ьеи СЬу Ьеи Азп Азп Ьеи Азп Ьуз Ьеи СЬи Рго РЬе Не РЬе Азр
595 600 605
Азр СЬп ТЬг бег Ьеи Агд бег Ьеи Азп Ьеи СЬп Ьуз Азп Ьеи Пе ТЬг
610 615 620 бег УаЬ СЬи Ьуз Азр УаЬ РЬе СЬу Рго Рго РЬе СЬп Азп Ьеи Азп бег
625 630 635 640
Ьеи Азр Меи Агд РЬе Азп Рго РЬе Азр Суз ТЬг Суз С1и бег Не бег
645 650 655
Тгр РЬе УаЬ Азп Тгр Не Азп СЬп ТЬг Нхз ТЬг Азп Не бег С1и Ьеи
660 665 670 бег ТЬг Нхз Туг Ьеи Суз Азп ТЬг Рго Нхз Нхз Туг Туг СЬу РЬе Рго
675 680 685
Ьеи Ьуз Ьеи РЬе Азр ТЬг бег бег Суз Ьуз Азр бег АЬа Рго РЬе СЬи
690 695 700
Ьеи Ьеи РЬе Не Пе Зег ТЬг бег Меь Ьеи Ьеи УаЬ РЬе 11е Ьеи УаЬ
705 710 715 720
УаЬ Ьеи Ьеи 11е Нхз Г1е СЬи С1у Тгр Агд Не 5ег РЬе Туг Тгр Азп
725 730 735
УаЬ бег УаЬ Нхз Агд Не Ьеи СЬу РЬе Ьуз СЬи Пе Азр ТЬг СЬп АЬа
740 745 750
СЬи СЬп РЬе СЬи Туг ТЬг АЬа Туг Пе Пе Нхз АЬа Нхз Ьуз Азр Агд
755 760 765
Азр Тгр УаЬ Тгр СЬи НЬз РЬе бег Рго МеС СЬи СЬи СЬп Азр 61п бег
770 775 780
Ьеи Ьуз РЬе Суз Ьеи СЬи СЬи Агд Аар РЬе СЬи АЬа СЬу УаЬ Ьеи СЬу
785 790 795 800
Ьеи СЬи АЬа Пе УаЬ Азп бег ЬЬе Ьуз Агд бег Агд Ьуз ГЬе ЬЬе РЬе
805 8Ь0 8Ь5
УаЬ Пе ТЬг Нхз Нхз Ьеи Ьеи Ьуз Азр Рго Ьеи Суз Агд Агд РЬе Ьуз
820 825 830
УаЬ НЬз НЬз А1а УаЬ СЬп СЬп АЬа Не СЬи СЬп Азп Ьеи Азр бег Пе
835 840 845
11е Ьеи 11е РЬе Ьеи СЬп Азп Пе Рго Азр Туг Ьуз Ьеи Азп Нхз АЬа
850 855 860
Ьеи Суз Ьеи Агд Агд СЬу МеС. РЬе Ьуз бег Нхз Суз 11е Ьеи Азп Тгр
865 870 875 880
Рго УаЬ СЬп Ьуз СЬи Агд 11е Азп АЬа РЬе Нхз Нхз Ьуз Ьеи СЬп УаЬ
885 890 895
АЬа Ьеи СЬу бег Агд Азп бег АЬа Нхз
900 905
- 88 021512 <210> 163 <211> 107 <212> РКТ <213> ЕаССиз гаССиэ <400> 163
Азр Не СЬп МеС Ткг С1п 5ег Рго ТЬг Зег Ьеи Зег А1а Зег Ьеи СЬу
10 15
СЬи ТЬг УаЬ ТЬг Т1е СЬи Суз Агд АЬа 2ег СЬи Азр Не Туг Азп СЬу 20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз Зег Рго СЬп Ьеи Ьеи Пе 35 40 45
Туг Азр Зег Азп Зег Ьеи НЬз ТЬг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
55 60
Агд СЬу Зег СЬу ТЬг СЬп Туг Зег Ьеи Агд Не Азп Зег Ьеи С1п Зег
70 75 80
СЬи Азр УаЬ А1а Зег Туг рье Суз СЬп СЬп Туг Туг Азр Туг Рго Ьеи
90 95
ТЬг РЬе СЬу Зег СЬу ТЬг Ьуз Ьеи СЬи 1Ье Ьуз
ХСО 105 <210> 164 <211> 119 <212> РКТ <213> ВаССиЗ гаССиЗ <400> 164
СЬи УаЬ СЬп Ьеи УаЬ АЬа 5ег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго СЬу АЬа 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз Уа1 А1а Зег С1у Рке ТЬг РЬе Зег Азр Туг 20 25 30
Тгр МеС А1а Тгр УаЬ Агд СЬп ТЬг Рго СЬу Ьуз Рго Мес СЬи Туг Пе 35 40 45
СЬу Азр Пе Ьуз Зег Азр СЬу Зег Ьуз УаЬ Азп Туг АЬа Рго Зег Ьеи 50 55 60
Ьуз Азп Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Азр Азп А1а Агд ТЬг ТЬг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи С1п МеС Зег Азп УаЬ Агд Зег СЬи Азр ТЬг АЬа ТЬг Туг Туг Суз
90 95
Азп Агд Азр 1Ье СЬу Рго Азр Ггр Туг РЬе Азр РЬе Тгр СЬу Рго СЬу
100 105 110
ТЬг МеС УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег
Ы5 <2Ь0> 165 <211> 234 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Гибрид вариабельной области крысы и постоянной области мыши <400> 165 мес СЬу УаЬ рго тьг
5
Азр АЬа Не Суз Азр
АЬа Зег Ьеи СЬу СЬи 35
Не Туг Азп СЬу Ьеи
СЬп Ьеи Ьеи Пе Туг 65
Агд Рке Зег С1у Агд 85
Зег Ьеи СЬп Зег С1и 100
Азр Туг Рго Ьеи тЬг 115
АЬа Азр АЬа А1а Рго 130
Ьеи ТЬг Зег С1у СЬу 145
Рго Ьуз Азр 11е Азп 165
Азп С1у УаЬ Ьеи Азп 180
Туг Зег Мес Зег Зег 195
НЬз Азп Зег Туг Ткг 210
Пе УаЬ Ьуз Зег РЬе 225
СЬп
Пе
Ткг
АЬа
Азр
С1у
Азр
Рке
Ткг
А1а
150
Уа1
Зег
Ткг
Суз
Азп
230
Ьеи Ьеи
СЬп МеС
УаЬ Ткг 40
Тгр туг
Зег Азп
Зег СЬу
УаЬ АЬа
СЬу Зег 120
УаЬ Зег 135
Зег УаЬ
Ьуз Тгр
Тгр Ткг
Ьеи Ткг 200
С1и АЬа 215
Агд Азп
СЬу Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ггр Пе Ткг ЬО 15
Ткг СЬп 5ег Рго Ткг Зег Ьеи 5ег 25 30
Пе 61и Суз Агд АЬа Зег СЬи Азр 45
СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз Зег Рго
Зег Ьеи НЬз 75
Ткг СЬп Туг 90
Зег Туг РЬе 105
СЬу Ткг Ьуз
Не Рке Рго
Уа1 Суз Рке 155
Ьуз Пе Азр 170
Азр СЬп Азр 185
Ьеи Ткг Ьуз
Ткг НЬз Ьуз
С1и Суз
ТЬг СЬу Уа1 Рго Зег 80
Зег Ьеи Агд Пе Азп 95
Суз СЬп СЬп Туг Туг 110
Ьеи СЬи Не Ьуз Агд 125
Рго Зег Зег СЬи СЬп 140
Ьеи Азп Азп Рке Туг 160
СЬу Зег СЬи Агд СЬп 175
Зег Ьуз Азр Зег Ткг 190
Азр С1и Туг СЬи Агд 205
Ткг Зег Ткг Зег Рго 220 <210> 166 <211> 462 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>
<223> НуЬгЬд о£ гаС гедгоп <400> 166
МеС Ьуз Ьеи Агд Ьеи 1 5
УаЬ С1п Суз СЬи УаЬ
Рго С1у АЬа Зег Ьеи ' 35
Зег Азр Туг Тгр МеС 50
СЬи Туг Пе СЬу Азр 65
Рго Зег Ьеи Ьуз Азп 85
Ткг Ьеи Туг Ьеи СЬп 100
Туг Туг Суз Азп Агд
115
СЬу Рго С1у Ткг МеС 130
Зег Уа1 Туг Рго Ьеи 145
Уа1 Ткг Ьеи СЬу Суз 165
УаЬ Ткг Ггр Азп Зег 180
А1а Уа1 Ьеи СЬи Зег 195
Рго 5ег Зег Рго Агд 210
Рго АЬа Зег Зег Ткг последовательность чагхаЫе гедЬоп апсЬ пгоизе сопзСапС
Зег Ьеи Пе Рке Пе Суз АЬа Ьеи Ьеи Ьуз Азр 10 15
СЬп Ьеи УаЬ А1а Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи Уа1 Ьуз 25 30
Ьуз Ьеи Зег Суз УаЬ АЬа Зег С1у Рке Ткг Рке 40 45
АЬа Тгр УаЬ Агд СЬп Ткг Рго С1у Ьуз Рго МеС
60
ГЬе Ьуз Зег Азр СЬу Зег Ьуз УаЬ Азп Туг АЬа 70 75 80
Агд Рке Ткг 11е Зег Агд Азр Азп АЬа Агд Ткг
95
МеС Зег Азп Уа1 Агд Зег СЬи Азр ГЬг АЬа Ткг
105 110
Азр 11е СЬу Рго Азр Тгр Туг Рке Азр Рке Тгр
120 125
УаЬ Ткг УаЬ Зег Зег А1а Ьуз Ткг ГЬг Рго Рго
135 140
АЬа Рго СЬу Зег АЬа А1а СЬп Ткг Азп Зег МеС 150 155 160
Ьеи Уа1 Ьуз СЬу Туг Рке Рго СЬи Рго УаЬ Ткг
170 175
СЬу Зег Ьеи Зег Зег С1у УаЬ НЬз Ткг Рке Рго
185 190
Азр Ьеи Туг Ткг Ьеи Зег Зег Зег Уа1 Ткг Уа1
200 205
Рго Зег 31и Ткг УаЬ Ткг Суз Азп УаЬ АЬа Н1з
215 220
Ьуз УаЬ Азр Ьуз Ьуз 11е УаЬ Рго Агд Азр Суз
- 89 021512
225
С1у Суз Ьуз Рго
Пе РЬе
Ьуз Уа1 <31п РЬе 290
С1п Рго 305
Ьеи Рго
Агд Уа1
Ьуз ТЬг
Рго Ьуз 370
ТЪг Азр 385
С1п Рго
С1у Зег
С1и А1а
Азп Нхз 450
Рго Рго 260
ТЬг Суз 275
Зег Тгр
Агд С1и
Пе МеС
Азп Зег 340
Ьуз С1у 355
С1и С1п
РЬе РЬе
А1а 31и
Туг РЬе 420
С1у Азп 435
Нхз ТЪг
230
Суз Пе Суз ТЪг Уа1 245
Ьуз Рго
Уа1 Уа1
РЪе Уа1
Ьуз Азр Уа1 265
Уа1 Азр Пе 280
Азр Азр Уа1 295
РЪе Азп Зег
С1и О1п 310
Нхз С1п Азр Тгр Ьеи 325
А1а А1а
Агд Рго
МеС А1а
РЪе Рго А1а 345
Ьуз А1а Рго 360
Ьуз Азр Ьуз 375
Азр Пе ТЪг
Рго С1и 390
Азп Туг Ьуз Азп ТЪг 405
Уа1 Туг
ТЪг РЪе
51и Ьуз
Зег Ьуз Ьеи 425
ТЪг Суз Зег
235 Рго С1и 250
Ьеи ТЪг
Зег Ьуз <31и Уа1
ТЪг РЪе
315 Азп С1у 330
Рго 11е
31п Уа1
Ча1 Зег
Уа1 61и
395 С1п Рго 410
Азп Уа1
Уа1 Ьеи
Нхз Зег
Уа1 Зег
Пе ТЪг
240
Зег Уа1 РЪе 255
Ьеи ТЪг Рго 270
Рго С1и Уа1
Азр Азр I 285
Нхз ТЪг А1а С1п ТЪг 300
Агд Зег '
Ьуз С1и
С1и Ьуз
Уа1 Зег О1и 320
РЪе Ьуз Суз 335
ТЪг 11е Зег 350
Пе Рго Рго
Туг ТЪг 365
Ьеи ТЪг Суз МеС Пе 380
Тгр С1п :
Пе МеС.
С1п Ьуз
Нхз С1и 445
Рго С1у 460
Ггр Азп <31у 400
Азп ТЪг Азп 415
Зег Азп Тгр 430
С1у Ьеи Нхз
Ьуз <210> 167 <211> 234 <212> РРТ <213> РаССиз гассиз <400> 167
МеС С1у Уа1 Рго ТЪг 1 5
Азр А1а Пе Суз Азр
А1а Зег Ьеи С1у С1и 35
Пе Туг Азп С1у Ьеи 50
С1п Ьеи Ьеи Не Туг 65
Агд РЪе Зег С1у Агд 85
Зег ьеи С1п Зег С1и 100
Азр Туг Рго Ьеи ТЪг 115
А1а Азр А1а А1а Рго 130
Ьеи ТЪг Зег <31у С1у 145
Рго Ьуз Азр 11е Азп 165
Азп С1у Уа1 Ьеи Азп 180
Туг Зег МеС Зег Зег 195
Нхз Азп Зег Туг ТЪг
С1п Ьеи Ьеи
Пе С1п МеС
ТЪг νβΐ ТЪг 40
А1а Тгр Туг 55
Азр Зег Азп 70
С1у Зег С1у
Азр Уа1 А1а
РЪе С1у Зег 120
ТЪг Уа1 Зег 135
А1а Зег Уа1 150
Уа1 Ьуз Тгр
С1у Ьеи 10
ТЪг С1п 25
Пе С1и
С1п 61η
Зег Ьеи
ТЪг С1п 90
Зег Туг 105
С1у ТЪг
11е РЪе
Уа1 Суз
Ьеи Ьеи Ьеи
Зег Рго ТЪг
Суз Агд А1а 45
Ьуз Рго С1у 60
Нхз ТЪг С1у 75
Туг Зег Ьеи
РЪе Суз С1п
Тгр 11е ТЪг 15
Зег Ьеи Зег 30
Зег <31и Азр
Ьуз Зег Рго νβΐ Рго Зег 80
Агд Пе Азп 95
31п Туг Туг 110
Пе Ьуз Агд
210
Пе Уа1 Ьуз Зег РЪе 225
Ьуз Пе 170
Зег Тгр ТЪг Азр О1п 185
ТЪг Ьеи ТЪг Ьеи ТЪг 200
Суз <31и А1а ТЪг Нхз
Ьуз Ьеи С1и :
125
Рго Рго Зег Зег С1и С1п 140
РЪе Ьеи Азп Азп РЪе Туг 155 160
Азр С1у Зег С1и Агд О1п
175
Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЪг 190
Ьуз Азр С1и Туг С1и Агд 205
Ьуз ТЪг Зег ТЪг Зег Рго
215
Азп Агд Азп ί <210> 168 <211> 462 <212> РРТ <213> РаССиз гаССиз <400> 168
МеС Ьуз Ьеи Агд Ьеи Зег 1 5
Уа1 С1п Суз <31и Уа1 С1п 20
Рго С1у А1а Зег Ьеи Ьуз 35
Зег Азр Туг Тгр Мес А1а 50
61и Туг Пе С1у Азр Пе 65 70
Рго Зег Ьеи Ьуз Азп Агд
ТЪг Ьеи Туг Ьеи О1п МеС 100 туг Туг Суз Азп Агд Азр 115
С1у Рго С1у ТЪг МеС Уа1 130
Зег Уа1 Туг Рго Ьеи А1а 145 150
Уа1 ТЪг Ьеи С1у Суз Ьеи
165
Уа1 ТЪг Тгр Азп Зег С1у 180
А1а νβΐ Ьеи С1и Зег Азр 195
Рго Зег Зег Рго Агд Рго 210
Рго А1а Зег Зег ТЪг Ьуз 225 230 <31у Суз Ьуз Рго Суз Пе
245
Пе РЪе Рго Рго Ьуз Рго 260
Ьуз Уа1 ТЪг Суз νβΐ Уа1 275
С1п РЪе Зег Тгр РЪе Уа1 290
С1п Рго Агд С1и <31и С1п 305 310
Ьеи Рго Пе МеС Нхз С1п
325
Агд Уа1 Азп Зег А1а А1а 340
Ьуз ТЪг Ьуз С1у Агд Рго 355
Рго Ьуз С1и С1п Мес А1а 370
ТЪг Азр РЪе РЪе Рго С1и 385 390
С1п Рго А1а С1и Азп Туг
405
О1у Зег Туг РЪе Уа1 Туг
Ьеи Пе РЪе
Ьеи Уа1 А1а 25
Ьеи Зег Суз 40
Тгр Уа1 Агд 55
Ьуз Зег Азр
РЪе ТЪг Пе
Зег Азп Уа1 105
Пе Е1у Рго 120
ТЪг Уа1 Зег 135
Рго С1у Зег
Пе Суз 10
Зег С1у
Уа1 А1а
С1п ТЪг
С1у Зег 75
Зег Агд 90
Агд Зег
Азр Тгр
Зег А1а
А1а Ьеи
С1у С1у
Зег С1у 45
Рго С1у 60
Ьуз Уа1
Азр Азп
С1и Азр
Ьеи Уа1 Ьуз 30
РЪе ТЪг РЪе
Ьуз Рго МеС
Азп Туг А1а 80
А1а Агд ТЪг 95
ТЪг А1а ТЪг 110
Азр РЪе Тгр
А1а А1а 155
Уа1 Ьуз <31у Туг РЪе 170
Зег С1у
Туг РЪе 125
Ьуз ТЪг ТЪг Рго Рго 140
01п ТЪг
Зег Ьеи Зег 185
Ьеи Туг ТЪг 200
Зег С1и ТЪг 215
Уа1 Азр Ьуз
Ьеи Зег
Уа1 ТЪг
Ьуз Пе 235
Суз ТЪг Уа1 Рго С1и 250
Ьеи ТЪг
Ьуз Азр Уа1 265
Уа1 Азр Пе 280
Азр Азр Уа1 295
РЪе Азп Зег
Рго С1и
Уа1 Нхз
Азп Зег МеС 160
Рго Уа1 ТЪг 175
ТЪг РЪе Рго 190
Уа1 ТЪг Уа1
Зег Зег 205
Суз Азп Уа1 А1а Нхз 220
Уа1 Рго
Зег Ьуз
С1и Уа1
ТЪг РЪе 315
Азр Тгр Ьеи Азп С1у 330
Рго Пе
РЪе Рго А1а 345
Ьуз А1а Рго 360
Ьуз Азр Ьуз 375
Азр Пе ТЪг
Ьуз Азп ТЪг
Зег Ьуз Ьеи
С1п Уа1
Уа1 Зег
Уа1 01и 395
61п Рго 410
Азп Уа1
Уа1 Зег
Пе ТЪг
Агд Азр Суз 240
Зег Уа1 РЪе 255
Ьеи ТЪг Рго 270
Рго С1и Уа1
Азр Азр I 285
Нхз ТЪг А1а С1п ТЪг 300
Агд Зег '
Ьуз С1и
С1и Ьуз
Уа1 Зег СЬи 320
РЪе Ьуз Суз 335
ТЪг Не Зег 350
Пе Рго Рго
Туг ТЪг 365
Ьеи ТЪг Суз МеС Пе 380
Тгр С1п
Пе МеС
31п Ьуз
Тгр Азп СЬу 400
Азп ТЪг Азп 415
Зег Азп Тгр
- 90 021512
О1и А1а (31у Азп ТЬг РЬе ТЬг Суз 5ег Ча1 Ьеи Нхз С1и 61у Ьеи Шз 435 440 445
А&п Нхс Нхе ТЬг С1и Ьуз Зег Ьеи Зег Шз Зег Рго О1у Ьуз <210> 169 <211? 48 <212? ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза ТЬВЗ <400> 169 даадаасРдд асасссссдс сдссссасес. ссааааааас сададссд <210> 170 <211> 44 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> ПО дСсасосаса ааЫЪаддаа ссдсддссса дсСддааа&С сЪсс <210> 171 <211> 45 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 171 сесаьааьдд сССдСсаСсС асадааССад даасЬсаддС Ссадс <210> 172 <211> 57 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220?
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 172 дааааССааа ааСааьсссС ЪРдЬсаадса ддадааСЬСа аСсасаССад аСсСдСс <210> 173 <211> 50 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 173 даааассааа ааСааСсссР ссдссдадса даадаассса аСсасаССад <210> 174 <211> 52 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 174 садааааРЬа ааааСааСсс сСССдсааад садаадааЫ. СааСсасаСС ад <210> 175 .
<211> 47 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 175 ссаасРсааС ссадаааась ааадсЬааРс ссРЬРдСсаа дсадаад <210> 176 <211> 45 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 176 сааЪдадсЬа РсРсаасЬбР сьсдраааас сГЬБдссЪРс Рдсас <210> 177 <211> 48 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 177 дРсЬРдадаа асьадааабД сРсаадДРдс адсадаасаа сехадсас <210> 178 <211> 46 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 178 сТРдадааас РадаааРРсР сдсаГЛдсад сабаасаасб бадсас <210> 179 <211> 43 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬВЗ <400> 179 сгааадъсаД РдаассТРса ддадааЬсбс аРаасаьссд РРд <210> 180 <211> 47 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 180 сСсиааадСс аСидаессСи саддсдааСс СсаСаасаСс сдбСдад <210> 181 <211> 37 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 181 ссасаЬссРР аасЬЬдаддС ссаасддсЬЬ Сдасдад <210> 182 <211> 46 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 182 дааасисисд аьссдсадса Саасдсссиа дсасддсссс ддааас <210> 183 <211> 46 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 183 дадааасиад зааССсЬсда досддсдсас. аасаасьиад сасддс <210> 184 <211> 44 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 184 съадаааьсс тсдаРРРдса ддаааасаас РСадсасддс Сеид <210> 185 <211> 44 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 185 сС.адаааи.Ъс и.сдаии.С.дса ддсЪаасаас Ытадсасддс ъсид <210> 186 <211> 46 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность арианта ТЬКЗ <210> 187 <211> 50 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 187 дааааи.аи.и.0 с.сдаааСсЪа с.сС.ьс.ссдсс аасаадоасс Ьдсадсидас <210> 188 <211> 41 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Олигонуклеотид для мутагенеза варианта ТЬКЗ <400> 188 дссЫдсаасд аси.дабдсъд ааадддьддс ссюьааааас. д <210> 189 <211> 43 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность арианта ТЬКЗ <400> 189 сЫссааодас ЪдаОдсС.ссд ададдбддсс сииаааааид Ъдд <210> 190 <211> 42 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <210> 191 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
- 92 021512 <220>
<221> Прочие приложения <222> (1) <223> Где Хаа может быть Ала, Глн, Гли или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (5) <223> Где Хаа может быть Глу, Гли или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (б) <223> Где Хаа может быть Асл или Асн <220>
<22ί> Прочие приложения <222> (7) <223> Где хаа может быть Глу или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (8) <223> Где Хаа может быть Фен, Ала или Лей <400> 191
Хаа 5ег Туг Азр хаа Хаа Хаа Хаа тЬд Уа1 15 10 <2Ю> 192 <211> 18 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность для семейства 17 НС6Н2 <220>
<221> Прочие приложения <222> (1>
<223> Где Хаа может быть Арг или Лиз <220>
<221> Прочие приложения <222> (3>
<223> Где Хаа может быть Тир, Гис или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (4) <223> Где Хаа может быть Мет, Арг или Тир <220>
<221> Прочие приложения <222> (7) <223> Где Хаа может быть Лиз или Арг <400> 192
Хаа Не Хаа Хаа Агд 5ег Хаа Тгр Гуд Азп Азр Туг А1а Уа1 £ег ν»1 15 10 15
Туз 5ег <210> 193 <211> 10 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность для семейства 18В ЬСЮВЗ <220>
<221> Прочие приложения <222> (1) <223> Где Хаа может быть Глн или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> <5) <223> Где Хаа может быть Тре, Глу или Асп <220>
<221> Прочие приложения <222> (7) <223> Где Хаа может быть Вал или Асн <220>
<221> Прочие приложения <222> <8) <223> Где Хаа может быть Тир или Фен <220>
<221> Прочие приложения <222> <9) <223> Где Хаа может быть Сер, Асн или Глн <400> 193
Хаа 2ег Туг Αερ Хаа 1 5
Рго Хаа Хаа Хаа Уа1 10 <210>
<211>
<212>
<213>
<220 <223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
Консенсусная последовательность для семейства 18В НСРР.З
Прочие приложения (4)
Где Хаа может быть Лиз, Тре или Иле
Прочие приложения (11)
Где Хаа может быть Асн или Асп
Прочие приложения < 14 >
Где Хаа может быть Вал или Ле <400> 194
Не Не С1п Хаа Агд 5ег Ьуз Тгр Туг Азп Хаа Туг А1а Хаа 2ег Уа1
1 Ьуз 5' 5 эг 10 15
<2Ю> 195
<211> 9
<212> РКТ
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Консенсусная последовательность для семейства 19 ЬСОКЗ
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (3)
<223> Где Хаа может быть Тир, Глу или Ала
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (4)
<223> Где Хаа может быть Глу, Гли или Асн
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (5)
<223> Где Хаа может быть Сер или Тре
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (6)
<223> Где Хаа может быть Вал, Иле или Лей
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (7)
<223> Где Хаа может сыть Сер или Лей
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (8)
<223> Где Хаа может быть Иле, Сер, Про или Тир
<400> 195
С1п С1п Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа ТЬг
1 5
<2Ю> 196
<211> 17
<212> РКТ
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Консенсусная последовательность для семейства 19 НС6К2
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (1)
<223> Где Хаа может быть Фен или Агд
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (12)
<223> Где Хаа может быть Ала или Сер
<400> 196
Хаа Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Хаа Рго Зег РЬе С1п
1 5 10 15
С1у
<210> 197
<211> 107
<212> РКТ
<213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи семейства 17 <220>
<221> Прочие приложения <222> (88)
<223> Где Хаа может быть Ала, Глн, Гли или Сер
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (92)
<223> Где Хаа может быть Глу, Гли или Сер
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (93)
<223> Где Хаа может быть Асп или Асн
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (94)
<223> Где Хаа может быть Глу или Сер
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (95)
<223> Где Хаа может быть Фен, Ала или Лей
<400> 197
Азр Не С1и Ьеи ТЬг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго С1у С1п
1 5 10 15
ТЬг А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр А1а Ьеи С1у С1у Туг РЬе Уа1
20 25 30
Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у б1п А1а Рго Уа1 Ьеи Уа1 Не Туг
35 40 45
Азр Азр Азр Азп Агд Рго Зег (31у 11е Рго С1и Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег С1у ТЬг С1п А1а С1и
65 70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг туг Суз Хаа Зег Туг Азр Хаа Хаа Хаа Хаа ТЬг
85 90 95
Уа1 РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
100 105
- 94 021512 <210> 198 <2Ы> 122 <212> РКГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой пели семейства 17 <220>
<221> Прочие приложения <222> (52) <223> Где Хаа может быть Арг или Лиз <220>
<221> Прочие приложения <222> (54) <223> Где Хаа может быть Тир, Гис или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (55) <223> Где Хаа может быть Мет, Арг или Тир <220>
<221> Прочие приложения <222> (58) <223> Где Хаа может быть Лиз или Арг <400> 198
СЬп УаЬ СЬи Ьеи СЬп СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег СЬп
1 5 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз АЬа 1Ье Зег СЬу Аер Зег УаЬ Зег ТЬг Агд
20 25 30
Зег АЬа АЬа Тгр СЬу Тгр Не Агд СЬп Зег Рго СЬу Агд СЬу Ьеи СЬи
35 40 45
Тгр Ьеи СЬу Хаа Пе Хаа Хаа Агд Зег Хаа Тгр Туг Αεη Αερ туг АЬа
50 55 60
УаЬ Зег УаЬ Ьуе Зег Агд Не ТЬг Не Αεη Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
С1п РЬе Зег Ьеи С1п 85
Туг Туг Су$ АЬа Агд 100
01у СЬп СЬу ТЬг Ьеи 115
Ьеи Азп Зег УаЬ ГЬг 90
Н15 ТЬг Туг Рго Туг 105
УаЬ ТЬг Уа1 Зег Зег 120
80
Рго СЬи Азр ГЬг АЬа УаЬ
Ьеи Зег РЬе А§р УаЬ Тгр 110 <210> 199 <211> 107 <212> РВТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цели семейства 18В <220>
<221> Прочие приложения <222> (88) <223> Где Хаа может быть Глн или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (92) <223> Где Хаа может Сыть Тре, Глу или Асп <220>
<221> Прочие приложения <222> (94) <223> Где Хаа может быть Вал или Асн <220>
<221> Прочие приложения <222> (95) <223> Где Хаа может быть Тир или Фен <220>
<221> Прочие приложения <222> (96) <223> Где Хаа может быть Сер, Асн или Глн <400> 199
Азр Пе СЬи Ьеи ТЬг СЬп Рго Рго Зег УаЬ Зег УаЬ АЬа Рго С1у СЬп
1 5 10 15
ТЬг АЬа Агд Пе 5ег Суз Зег СЬу Азр АЗП 11е СЬу Зег Туг Туг Уа1
20 25 30
Ηίε Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго УаЬ Ьеи УаЬ Пе Туг
35 40 45
СЬи Азр Зег СЬи Агд Рго Зег СЬу 11е Рго СЬи Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
Азп Зег СЬу АЗП ТЬг АЬа ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег С1у ТЬг СЬп АЬа СЬи
65 70 75 80
Азр СЬи АЬа АЗр Туг Туг Суз Хаа Зег Туг Азр Хаа Рго хаа Хаа Хаа
85 90 95
УаЬ РЬе С1у СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ Ьеи
100 105 <210> 200 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи
семейства 18А и 18В
<220> <221> <222> <223> Прочие приложения
(55) Где Хаа может быть Лиз, Тре или Иле
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (62)
<223> Где Хаа может быть Асн или Асп
<220>
<221> Прочие приложения
<222> (65)
<223> Где Хаа может быть Вал или Лей
<400> 200
С1п Уа1 С1и Ьеи С1п С1п Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п
1 5 10 15
ты Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а Не Зег <31у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп
20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Г1е Агд С1п Зег Рго С1у Агд С1у Ьеи 61и
35 40 45
Тгр Ьеи 61у Не Не С1п хаа Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Хаа Туг А1а
50 55 60
Хаа Зег Уа1 Ьуз Зег Агд 11е ТЬг Не Азп Рго Адр ТЫ Зег Ьуз Азп
65 70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго <31и Азр гЬг А1а Уа1
85 90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег Не А5р Туг Тгр
100 105 110
01у С1п (31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг νβΐ 5ег Зег
115 120
<210> 201 <211> 107 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220» <223> Консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи семейства 19 <220>
<221> Прочие приложения <222> (91) <223> Где Хаа может быть <220>
<221> Прочие приложения <222> (92) <223> Где Хаа может быть
Тир, Глу или Ала
Глу, Гли или Асн <220>
<221> Прочие приложения <222> (93) <223> Где Хаа может быть Сер или Тре <220?
<221> Прочие приложения <222> (94) <223? Где Хаа может быть
Вал, Иле или Лей <220>
<221> Прочие приложения <222> (95) <223> Где Хаа может быть Сер или Лей <220>
<221> Прочие приложения <222> (96) <223> Где Хаа может быть Иле, Сер, Про или Тир <400> 201
Азр Не б1п Мер ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Зег Не <31у Ьеи Туг 20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег б1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у 50 55 60
Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго
70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа
90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не Ьуз
100 105 <210> 202 <211> 121 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цели семейства 19 <220>
<221> Прочие приложения <222> (50) <223> Где Хаа может быть Фен или Агд <220>
<221> Прочие приложения <222> (61) <223> Где Хаа может быть Ала или Сер <400> 202
С1п Уа1 С1и Ьеи Уа1 О1п Зег <31у А1а С1и Ча1 Ьуз Ьуз Рго О1у С1и 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр Уа1 С1у Тгр Уа1 Агд С1п Меб Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Меб 35 40 45
С1у Хаа Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп Туг Хаа Рго Зег РЬе 50 55 60
С1п С1у С1п Уа1 ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег Не Зег ТЬг А1а Туг
70 75 80
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЫ А1а Меб Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п С1у Туг Меб Азр ТЬг РЬе Азр Зег Тгр <31у
100 105 110
С1п С1у ТЬг Ьеи νβΐ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 203 <211> 214 <212> РЕТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина консенсусной последовательности легкой цепи, семейство 17 <220>
<221> Прочие приложения <222> (88) <223> Где Хаа может быть Ала, Глн, Гли или Сер
- 96 021512 <220>
<221> Прочие приложения <222> (92) <223> Где Хаа может быть Глу, Гли или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (93) <223> Где Хаа может быть Асп или Асн <220>
<221> Прочие приложения <222> (94) <223> Где Хаа может быть Глу или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (95) <223> Где Хаа может быть Фен, Ала или Лей <400> 203
Азр Не СЬи Ьеи ТЬг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 АЬа Рго С1у С1п 15 10 15
ТЬг А1а Агд 11е Зег Суз Зег 31у Азр А1а Ьеи С1у С1у Туг РЬе Уа1 20 25 30
Зег Тгр Туг 61η СЬп Ьуз Рго СЬу С1п А1а Рго Уа1 Ьеи Уа1 11е Туг 35 40 45
Азр Азр Азр Азп Агд Рго Зег СЬу 11е Рго С1и Агд РЬе Зег С1у Зег
55 60
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ГЬг 11е Зег С1у ГЬг С1п А1а СЬи
70 75 80
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Хаа Зег Туг Азр Хаа Хаа Хаа Хаа ТЬг
90 95
Уа1 РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг УаЬ ьеи Агд ТЬг Уа1 АЬа АЬа
100 105 110
Рго Зег Уа1 РЬе 11е РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1л Ьеи Ьуз Зег СЬу
115 120 125
ТЬг АЬа Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд СЬи АЬа
130 135 140
Ьуз Уа1 С1п Тгр Ьуз Уа1 Азр Азп А1а Ьеи СЬп Зег С1у Азп Зег С1п
145 150 155 160
СЬи Зег Уа1 ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
Зег ГЬг Ьеи ТЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Азр Туг С1и Ьуз Нхз Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз С1и Уа1 ТЬг НЬз С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго νβΐ ТЬг Ьуз Зег
195 200 205
РЬе Азп Агд СЬу С1и Суз
210 <210> 204 <211> 449 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина консенсусной последовательности тяжелой цепи, <220>
<221> Прочие приложения <222> (52) <223> Где Хаа может быть Арг или Лиэ <220>
<221> Прочие приложения <222> (54) <223> Где Хаа может быть Тир, Гис или Сер <220>
<221> Прочие приложения <222> (55) <223> Где Хаа может быть Мет, Арг или Тир <220>
<221> Прочие приложения <222> (58) <223> Где Хаа может Сыть Лиз или Арг <400> 204
С1п 1/а1 С1и Ьеи СЬп СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго 15 10
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег СЬу Азр Зег л/а! Зег 20 25 30
Зег АЬа А1а Тгр СЬу Тгр Не Агд СЬп Зег Рго С1у Агд СЬу 35 40 45
Тгр Ьеи СЬу Хаа 11е Хаа Хаа Агд Зех Хаа Тгр Туг Азп Азр 50 55 60 \>а1 Зег УаЬ Ьуз Зег Агд Не ГЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег
70 75
С1л РЬе 5ег Ьеи О1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго СЬи Азр ТЬг
90
Туг Туг Суз АЬа Агд НЬз ТЬг Туг Рго Туг Ьеи Зег РЬе Азр 100 105 НО
СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи νβΐ ТЬг νβΐ 5ег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз 115 120 125
5ег ч/а! РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег СЬи 130 135 140
А1а А1а Ьеи С1у Суз Ьеи νβΐ Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго
145 150 155 νβΐ Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег СЬу ναΐ НЬз ГЬг
165 170
А1а Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег νβΐ 180 185 190
УаЬ Рго Зег Зег Зег Ьеи СЬу ГЬг Ьуз ТЬг Туг ТЬг Суз Азп 195 200 205
НЬз Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз νβΐ Азр Ьуз Агд νβΐ СЬи Зег 210 215 220
СЬу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи АЬа АЬа СЬу
225 230 235
Зег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеС.
245 250
Агд ТЬг Рго СЬи УаЬ ТЬг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр Уа1 Зег СЬп 260 265 270
Рго СЬи Уа1 СЬп РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр СЬу 1/а1 СЬи УаЬ 275 280 285
АЬа Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе Азп Зег ТЬг Туг 290 295 300 νβΐ Зег УаЬ Ьеи ТЬг νβΐ Ьеи НЬз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу
305 310 315
Туг Ьуз Суз Ьуз νβΐ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Не
325 330
ТЬг 11е Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп νθΐ 340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеС ТЬг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег
Зег СЬп 15
ГЬг Агд
Ьеи СЬи
Гуг АЬа
Ьуз Азп 80
АЬа Уа1 95 νθΐ Тгр
СЬу Рго
Зег ТЬг
УаЬ ТЬг 160
РЬе Рго 175
УаЬ ТЬг νβΐ Азр
Ьуз Туг
СЬу Рго 240
Не Зег 255
СЬи Азр
НЬз Азп
Агд νβΐ
Ьуз С1и 320
СЬи Ьуз 335
Туг ТЬг
Ьеи ТЬг
- 97 021512
355 360 365
Суз Ьеи Уа1 Ьуз <31у РЬе Туг Рго 5ег Азр Не А1а Ча1 С1и Тгр С1и
370 375 380
Зег Азп С1у Θΐη Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр (31у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг <Ла1 Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Тгр С1п 61и С1у Азп \7а1 РЬе Зег Суз Зег Ча1 Меи Ыз С1и
420 425 430
А1а Ьеи Нхз Азп Ηίε Туг ТЬг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у
435 440 445
Ьуз <210> 205 <211> 214 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность • Полная длина консенсусной последовательности легкой цепи, семейство 18 <220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения <88)
Где Хаа может быть Глн или Сер
Прочие приложения <92}
Где Хаа может быть Тре, Глу или Асп
Прочие приложения <94)
Где Хаа может быть Вал или Асн <220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения <95)
Где Хаа может быть Тир или Фен
Прочие приложения (96)
Где Хаа может быть Сер, Асн или Глн <400> 205
Азр Не С1и Ьеи ТЬг <31п Рго Рго Зег Уа1 Зег Ча1 А1а Рго 15 10
ТЬг А1а Агд Не Зег Суз Зег С1у Азр Азп Не С1у Зег Туг 20 25 30
Ыз Тгр Туг С1п Θΐη Ьуз Рго С1у С1п А1а Рго Ча1 Ьеи Ча1 35 40 45
61и Азр Зег <31и Агд Рго Зег С1у Не Рго С1и Ахд РЬе Зег 50 55 60
Азп Зег С1у Азп ТЬг А1а ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег С1у ТЬг 31п
70 75
Азр С1и А1а Азр Туг Туг Суз Хаа Зег Туг Азр Хаа Рго Хаа
90 <31у О1п Ь5
Туг Уа1
Не Туг
С1у Зег
А1а <31и 80
Хаа Хаа 95
А1а А1а
Рго Зег Уа1 РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр С1и С1п Ьеи Ьуз Зег С1у
115 120 125
ТЬг А1а Зег Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе Туг Рго Агд С1и А1а
130 135 140
Ьуз Уа1 <31п Ггр Ьуз νβΐ Азр Азп А1а Ьеи ¢31 п Зег 51у Азп Зег 51л
145 150 155 160
<51и Зег Уа1 ТЬг С1и 51п Азр Зег Ьуз Азр Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
5ег ТЬг ьеи ТЬг ьеи Зег ьу$ А1а А$р Туг <31и Ьуз Н1е Ьуз Уа1 Туг
180 185 190
А1а Суз С1и νβΐ ТЬг Ηίβ С1п С1у Ьеи Зег Зег Рго ν«1 ТЬг Ьуз Зег
195 200 205
РЬе Азп Агд 51у С1и Суз
210 <210> 206 <211> 449 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина консенсусной последовательности тяжелой цепи, семейство 1$А и 18В <220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения (55)
Где Хаа может быть Лиз, Тре или Иле <220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения (62)
Где Хаа может быть Асн или Асп <220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения (65)
Где Хаа может быть Вал или Лей <400> 206 С1п Уа1 С1и
ТЬг Ьеи Зег
Зег А1а А1а 35
Тгр Ьеи С1у 50
Хаа Зег Уа1 65
С1п РЬе Зег
Туг Туг Суз
С1у С1п С1у 115
Зег Уа1 РЬе 130
А1а А1а ьеи 145
Уа1 Зег Тгр
Ьеи б!п 5
Ьеи ТЬг 20
Тгр С1у
Не Не
Ьуз Зег
Ьеи С1п 85
А1а Агд 100
ТЬг ьеи
Рго Ьеи
С1у СуЗ
АзП ЗеГ
С1п Зег
Суз А1а
Тгр Не
С1п Хаа 55
Агд 11е 70
Ьеи Азп
Туг Зег
Уа1 тЬг
А1а Рго 135
Ьеи νβΐ 150
С1у А1а б1у Рго
Не Зег
Агд С1п 40
Агд Зег
ТЬг Не
Зег νεί
Туг Рго 105
Уа1 Зег 120
Суз Зег ьуз Азр ьеи ТЬг
С1у Ьеи νβΐ 10
61у Азр Зег
Зег рго С1у ьуз Тгр Туг 60
Азп Рго Азр 75
ТЬг Рго С1и 90
РЬе Туг Зег
Зег А1а Зег
Агд Зег ТЬг 140
Туг РЬе Рго 155
Зег С1у Уа1
Ьуз Рго ν&1 Зег 30
Агд С1у 45
Азп Хаа
ТЬг Зег
Азр ТЬг
11е Азр 110
ТЬг Ьуз 125
Зег С1и
С1и Рго
Н1з ТЬг
Зег Й1п 15
Зег Адп
Ьеи <з1и
Туг А1а
Ьуе Азп 80
А1а Уа1 95
Туг Тгр <51у Рго
Зег ТЬг νβΐ ТЬг 160
РЬе Рго
- 98 021512
А1а νβΐ
УаЛ Рго
НЛз Ьуе 210
СЛу Рго 225
5ег УаЛ
Агд ТЬг
Рго С1и
165
Ьеи С1п Зег 180
Зег Зег Зег 195
Рго Зег Азп
Зег С1у
Ьеи СЛу
ТЬг Ьуз 215
Рго Суз Рго Рго Суз 230
Рго Рго
РЬе Ьеи РЬе 245
Рго 01и Уа1 260
Уа1 С1п РЬе 275
ТЬг Ьуз Рго
АЛа Ьуз 290
Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТЬг 305
Туг Ьуз Суз Ьуз УаЛ 325
ТЬг Не
Ьеи Рго
Суз Ьеи 370
Зег Азп 385
Азр Зег
Зег Агд
А1а Ьеи
Ьуз
Зег Ьуз АЛа 340
Рго Зег С1п 355
УаЛ Ьуз СЛу
ТЬг Суз
Азп Тгр
Агд С1и 295
УаЛ Ьеи 310
Зег Азп
Ьуз С1у
О1и С1и
РЬе Туг 375
С1у С1п Рго С1и Азп 390
РЬе РЬе
Азр СЛу Зег 405
Тгр С1п С1и 420
НЛз АЗП НЛз 435
С1у Азп
Туг ТЬг
Ьеи Туг 185
ТЬг Ьуз 200
Уа1 Азр
Рго АЛа
Ьуз Рго
Уа1 УаЛ 265
Туг УаЛ 280
С1и С1п
НЛз С1п
Ьуз СЛу
С1п Рго 345
МеЛ ТЬг 360
Рго Зег
Азп Туг
Ьеи Туг
УаЛ РЬе 425
61п Ьуз 440
Ьеи Зег
Туг ТЬг
Агд Уа1 220
С1и АЛа 235
Азр ТЬг
Азр УаЛ
СЛу Уа1
Азп Зег 300
Тгр Ьеи 315
Рго Зег
Зег УаЛ 190
Суз Азп 205
С1и Зег
АЛа СЛу
Ьеи МеС
Зег С1п 270
С1и Уа1 285
ТЬг Туг
Азп СЛу зег Пе
175
УаЛ ТЬг
УаЛ Азр
Ьуз Туг
С1у Рго 240
11е Зег 255
С1и Азр
НЛз Азп
Агд Уа1
Ьуз С1и 320
С1и Ьуз 335 <210 207 <211> 214 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
С1и Рго
Азп С1п
11е АЛа 380
ТЬг ТЬг 395
Агд Ьеи
Суз Зег
Ьеи Зег
С1п УаЛ 350
Уа1 Зег 365
УаЛ С1и
Рго Рго
ТЬг Уа1
УаЛ МеС 430
Ьеи Зег 445
Туг ТЬг
Ьеи ТЬг
Тгр С1и
УаЛ Ьеи 400
Азр Ьуз 415
НЛз С1и
Ьеи СЛу
Полная длина консенсусной последовательности легкой цепи, семейство 19
Прочие приложения (91)
Где Хаа может быть Тир, Глу или Ала
Прочие приложения (92)
Где Хаа может быть Ала или Сер
Прочие приложения (93)
Где Хаа может быть Сер или Тре <221> Прочие приложения <222> (94) <223> Где Хаа может быть Вал, Иле или Лей <220>
<221> Прочие приложения <222> (95) <223> Где Хаа может быть Сер или Лей <220>
<221> Прочие приложения <222> (96) <223> Где Хаа может быть Иле, Сер, Про или Тир <400> 207 Азр Не С1п
Азр Агд Уа1
Ьеи А1а Тгр 35
Туг А1а А1а 50
Зег С1у Зег 65
С1и Азр РЬе
МеС ТЬг 5
ТЬг Не 20
Туг С1п
Зег Зег <31у ТЬг
А1а ТЬг 85
ТЬг РЬе С1у С1п О1у 100
РЬе Не
Рго Зег Уа1 115
ТЬг А1а Зег 130
Ьуз Уа1 С1п 145
С1и Зег Уа1
Уа1 Уа1 тгр Ьуз
ТЬг С1и 165
Зег ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи
А1а Суз С1и 195
РЬе Азп Агд 210
Уа1 ТЬг
С1у О1и <31п 5ег
ТЬг Суз
С1п Ьуз
Ьеи С1п 55
Азр РЬе 70
Туг Туг
ТЬг Ьуз
РЬе Рго
Суз Ьеи 135
Уа1 Азр 150 <31 п Азр
Зег Ьуз
НЛз С1п
Суз
Агд А1а 25
Рго С1у 40
Зег С1у
ТЬг Ьеи
Суз С1п
Уа1 С1и 105
Рго Зег 120
Ьеи Азп
Азп А1а
Зег Ьуз
А1а Азр 185
С1у Ьеи 200
Зег Ьеи Зег А1а Зег 10
Зег С1п
Зег Не С1у 30
Рго Ьуз Ьеи 45
Зег Агд РЬе 60
Зег Зег Ьеи
Ьуз А1а
Уа1 Рго
ТЬг Не 75
С1п Хаа Хаа Хаа Хаа 90
Не Ьуз
Азр 01и
Азп РЬе
Ьеи С1п 155
Азр Зег 170
Туг С1и
Зег Зег
Уа1 С1у 15
Ьеи Туг
Ьеи Не
Зег 61у
С1п Рго 80
Хаа Хаа 95
А1а А1а
Зег С1у
61и А1а
Агд ТЬг νβΐ 110
С1п Ьеи Ьуз 125
Туг Рго Агд 140
Зег С1у Азп Зег С1п 160
ТЬг Туг Зег Ьеи Зег 175
Уа1 Туг
Ьуз Ηίε Ьуз 190
Рго Уа1 ТЬг 205
Ьуз Зег <210> <211> <212> <213>
448
РКГ
Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина консенсусной последовательности тяжелой цепи семейство 19 <220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
Прочие приложения (50)
Где Хаа может быть Фен или Агд
Прочие приложения (61)
Где Хаа может быть Ала или Сер
- 99 021512
<400> 208
СЬп Уа1 СЬи Ьеи Уа1 СЬп 5ег СЬу АЬа СЬи УаЬ Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег СЬу Туг Зег РЬе ТЫ Азп Туг
20 25 30
Тгр Уа1 СЬу Тгр Уа1 Агд СЬп МеД Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр МеД
35 40 45
СЬу Хаа Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЫ Азп Туг Хаа Рго Зег РЬе
50 55 60
СЬп СЬу СЬп Уа1 ТЫ Не зег АЬа Азр Ьуз Зег Не Зег ты А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи С1л Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа Зег Азр ГЫ А1а МеД Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд СЬи Ьеи Туг СЬп СЬу Туг МеД Аэр ТЬг РЬе Аэр Зег Тгр СЬу
100 105 НО
СЬп СЬу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег АЬа Зег ТЬг Ьуз СЬу Рго Зег
115 120 125
Уа1 РЬе Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег ТЫ Зег СЬи Зег ГЬг А1а
130 135 140
АЬа Ьеи СЬу Суэ Ьеи Уа1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго СЬи Рго УаЬ ГЬг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег СЬу А1а Ьеи ТЫ Зег СЬу УаЬ Ηίδ ТЫ РЬе Рго АЬа
165 170 175
Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ Уа1 ТЫ νβΐ
180 185 190
Рго 5ег Зег Зег Ьеи СЬу ТЫ Ьуз ТЫ Туг ТЬг Суз Азп Уа1 Азр Ηίε
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго СЬи А1а А1а СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго ЬуЗ Аёр ТЫ Ьёи МеД Не 5ег Агд
245 250 255
ТЫ Рго СЬи Уа1 ТЬг Суз Уа1 νβΐ Уа1 Аэр Уа1 Зег СЬп СЬи Аэр Рго
260 265 270
СЬи Уа1 СЬп РЬе Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу Уа1 СЬи УаЬ Ηίε Азп А1а
275 280 285
Ьуз ТЫ Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп РЬе АЗП Зег ТЫ Туг Агд УаЬ Уа1
290 295 300
Зег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηίε СЬп Азр Тгр Ьеи Αεη С1у ЬуЗ СЬи Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Аэп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег 11е СЬи Ьуз ТЫ
325 330 335
Не Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг ГЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеД ТЫ Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи ГЬг Суз
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз СЬу РЬе туг Рго Зег Азр Не А1а УаЬ СЬи тгр СЬи Зег
370 375 380
Азп СЬу СЬп Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз ТЫ ТЫ Рго Рго Уа1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр СЬу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЫ УаЬ Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд тгр СЬп СЬи СЬу Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег ν<1 МеД Ηίε СЬи А1а
420 425 430
Ьеи Ηίε Азп Ηίδ Туг ТЫ СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу Ьуз
435 440 445
<210> 209 <211> 108 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи варианта ОЗУ Кандидата 9
<400> 209
С1п Зег Уа1 Ьеи тЬг С1п Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго СЬу С1п
1 5 10 15
ТЬг А1а Агд I1е Зег Суз Зег 61у Азр Азп Не С1у Зег Туг Туг УаЬ
20 25 30
Ηίε Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п АЬа Рго Уа1 Ьеи УаЬ 1Ье Туг
35 40 45
СЬи Азр Зег С1и Агд Рго Зег СЬу Не Рго С1и Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
Αεη Зег СЬу Азп ТЬг АЬа ТЫ Ьеи ГЬг 1Ье Зег СЬу ТЫ 61п АЬа СЬи
65 70 75 80
Азр С1и АЬа Αερ Туг Туг Суз С1п Зег Туг Азр Зег СЬп РЬе Зег РЬе
85 90 95
СЬу Уа1 РЬе СЬу СЬу СЬу ТЫ Ьуз Ьеи ТЫ УаЬ Ьеи
100 105
<210> 210 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Вариабельная область легкой цепи варианта ОЗУ Кандидата 10 <400> 210
СЬп Зег УаЬ Ьеи ТЫ СЬп Рго Рго Зег УаЬ Зег УаЬ А1а Рго СЬу СЬп
1 5 10 15
ТЬг АЬа Агд Не Зег Суз Зег СЬу Азр Азп Не СЬу Зег Туг Туг УаЬ
20 25 30
Ηίε Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп А1а Рго УаЬ Ьеи УаЬ Не Туг
35 40 45
СЬи Αερ Зег СЬи Агд Рго Зег СЬу Не Рго СЬи Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
Αεη Зег СЬу Азп ТЬг АЬа ТЫ Ьеи ТЬг Не Зег С1у ТЫ С1п АЬа СЬи
65 70 75 80
Αερ СЬи АЬа Αερ Туг Туг Суз СЬп Зег Туг Азр ТЫ Рго Уа1 Туг Зег
85 90 95
УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЫ Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи
100 105
<210> 211 <211> 107 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи варианта ОЗУ Кандидата 12
<400> 211
СЬп Зег Уа1 ьеи ТЫ СЬп Рго Рго Зег Уа1 Зег Уа1 А1а Рго СЬу С1п
1 5 10 15
ТЫ А1а Агд Не Зег Суз 5ег С1у Азр Азп Не СЬу Зег Туг Туг Уа1
20 25 30
Ηίδ Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу С1п АЬа Рго УаЬ Ьеи Уа1 Не Туг
35 40 45
СЬи Азр Зег СЬи Агд Рго Зег СЬу Не Рго С1и Агд РЬе Зег С1у Зег
50 55 60
Азп Зег СЬу Азп ТЬг А1а ТЫ Ьеи ТЫ 11е Зег 61у ТЫ С1п АЬа С1и
100
Азр 61и А1а Азр Туг Туг Суз Зег Зег Туг Азр Азр Рго Азп РЬе СЬп 85 90 95
Уа1 РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи 100 105 <210> 212 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи варианта Кандидата 9 <400> 212
С1п νβΐ С1п Ьеи С1л С1п Зег С1у Рго С1у 15 10
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег С1у
Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег £1п 15
Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Т1е Агд С1п Зег Рго С1у Агд 31у Ьеи <31и
35 40 45
тгр Ьеи С1у Не Пе С1п Пе Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а
50 55 60
Ьеи 5ег Уа1 Ьуз Зег Агд Пе ТЬг Не Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг Рго С1и Азр ТЬг А1а ν&1
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег 11е 100 105
С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120
Азр Туг Тгр 110 <210> 213 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<22 3> Вариабельная область тяжелой цепи варианта ОУ<Э Кандидата 10 <400> 213
С1п Уа1 С1п Ьеи (31п С1п Зег С1у Рго С1у Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег <51п 15 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег 51у Азр Зег Уа1 Зег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр Не Агд С1п Зег Рго О1у Агд 61у Ьеи 31и
35 40 45
Тгр Ьеи С1у Не Не С1п Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг А1а
50 55 60
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Зег Агд Не ТЬг Не АЗП Рго Азр ТЫ Зег ьуз Азп
<31п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Уа1 ТЬг 85 90
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе 100 105
С1у С1п С1у ГЬг ьеи Уа1 ТЬг Уа1 5ег Зег 115 120
Рго С1и
Туг Зег
Азр ТЬг А1а Уа1 95
Г1е Азр Туг Тгр 110 <210> 214 <211> 122 <212> РКТ <213> Синтетичес оследовательность <220>
<223> Вариабелен область тяжелой цепи варианта <2ν<2 Кандидата 12 ты Ьеи Зег Ьеи 20
Зег А1а А1а Тгр 35
Тгр Ьеи С1у Не 50
Йа1 Зег Уа1 Ьуз 65
С1п РЬе Зег Ьеи
Туг Туг Суз А1а 100
С1у 31п О1у ТЬг 115
С1п (31п 5
ТЬг Суз
С1у Тгр
Не С1п
Зег Агд 70 <31п Ьеи 85
Агд Туг
Ьеи Уа1
Зег С1у
А1а Не
11е Агд 40
Ьуз Агд 55
11е ТЬг
Азп Зег
Зег Туг
Рго С1у Ьеи Уа1 10
Зег С1у Азр Зег 25
С1п Зег Рго О1у
Зег Ьуз Тгр Туг 60
Т1е Азп Рго Азр 75
Уа1 ТЬг Рго С1и 90
Рго РЬе Туг Зег 105
Зег Зег
Ьуз Рго
Уа1 Зег 30
Агд С1у 45
АЗП Азп
ТЬг Зег
Азр ГЬг
Зег С1п 15
Зег Азп
Ьеи С1и
Туг АЬа
Ьуз Азп 80
А1а νβΐ 95
Туг Тгр <210> 215 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Вариант Εν<2 кардидата 14 <400> 215
С1и νβΐ Θΐη Ьеи Уа1 С1п Зег О1у А1а О1и Уа1 15 10
Зег Ьеи Ьуз Не Зег Суз Ьуз С1у Зег С1у Туг 20 25
Тгр νβΐ С1у Тгр νβΐ Агд С1п МеД Рго С1у Ьуз 35 40
С1у РЬе Т1е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ГЬг Азп 50 55
О1п О1у <31п Уа1 ТЬг Г1е Зег А1а Азр Ьуз Зег 65 70 75
Ьеи 51п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг
Ьуз Рго
РЬе ТЬг 30
Ьеи <31и 45
А1а Рго
Зег ТЬг
МеД Туг
А1а Агд 31и Ьеи Туг С1п С1у Туг МеД Аэр ТЬг 100 105
С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120
С1у С1и 15
Азп Туг
Тгр Мед
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Тгр С1у <210> 216 <211> 121 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Вариант ЕУО кардидата 15 <400> 216 <31и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго <31у С1и 15 Ю 15
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз Ьуз О1у Зег <31у Туг Зег РЬе ТЬг Азп Туг
- 101 021512
Тгр Ча1 С1у Тгр Ча1 Агд С1л Мей Рго С1у Ьуз 35 40
С1у РЬе 11е Азр Рго Зег Азр Зег Туг ТЬг Азп 50 55
С1п £1у д1п Ча1 ТЬг Не Зег А1а Азр Ьуз Зег 65 70 75
Ьеи С1п Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг
90
А1а Агд С1и Ьеи Туг С1п С1у Туг Мей Азр ТЬг
100 105
С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег
115 120 <31у Ьеи 51и 45
Туг А1а Рго 60
Не Зег ТЬг
А1а Мей Туг
РЬе Азр Зег 110
Тгр Мей
Зег РЬе
А1а Туг 80
Туг Суз 95
Тгр С1у <210> 217 <211> 2712 <212> ДНК <213> Масаса ГазсхсиЬагхз <400> 217 айдадасада сйййдссййа йассйасййй йддйддддас йдйдсайссй ссассаасаа айдсасйдйй адссаадаад аадййаасйс аддйасссда йдайсйсссс асааасайаа аайсаасйса даадаййасс адсйдссаай йййасаадай дайдйаддай ййаасйссай сйсаааасйд дадссадаай ййаааадййй йдаассйсса дсасаайдэд сйайсйсаас ййсйдсасда айййдасдда асйссайсйс айдйссаасй аайсссйййд йааадсадаа даайййаайс асаййадайс йсйасаааай йаддаасйса ддййсадсйд даааайсйес аэйаааайсс аадсдсйааа аадйдаадаа сййддйайсс аадййададй йдйсайсдаа йсаааййааа дадййййсйс ддаадаййай йдддссйсйй йсйдаасаай дйссадсйдд сйайдйййдд ааййадсааа сасаадсдйй сддаайсйдй йссассасса дсаайасаас йййсййддда сйааадйдда сйййсссаса асаасййааа йдйдаййддй аасдаййссй даайайййсй йссйддадйа йаайаайайа садсайййдс сййййсаайд йдсддйассй даайййдааа сддйсййййа дсййсдсйсс ссаадаййда йдайййййсй йййсддйддс аасайддаад айаайдайай ййсаддсайа аааадсаайа сйдааайасй йаадйсйайс саасйссййй асаадйййдс йййдйайсас ййдсйсаййс йсссййасас айасйсаасс аааайадада дйддйдссйй сйсййддййд ддссассйад аайдаааййд ддсаадаасй сасаддссад даайддадйд айсйайсййй ссйасаасаа дйассйдсаа сйдасйаада адссййсаас дасйдайдсй ссдаадддйд дсссййаааа ссаййссадс сйсййддйаа ссйдассайй сйддайсйаа айааайдайд асайдййдда аддйсййдад ааасйадааа аасййадсас ддсйсйддаа асасдсааас ссйддйддйс сйдйсйсасс йссасайссй йаасййддад йсйаайддсй дйсййсаадд айййайсйда асйааадайс аййдайййад сййссадсдй сйдйсйййда йаайсаддйд йсйсйааадй сйсайаасай садййдадаа дааддййййс дддссадсйй дайайдсдсй ййаайсссйй йдаййдсаса йдйдааадйа аййаасаада сссасдссаа сайсссйдад сйдйсаадсс ссссасйайс айдддййссс адйдадасйй йййдайасай сссйййдаас йсйййййсай дайсаайасс адйайссйдй сййсйсайсс асйййдаддд сйддаддайа йсйййййасй дййсййддйй йсааадааай адасадасад асадаасадй аййсасдссс айааадайаа ддаййдддйс йдддаасайй дассаайсйс йоаааййййд йсйддаадаа адддасйййд даадсааййд ййаасадсай саааадаадс адаааааййа сйаййаааад аоссаййайд саааадаййс ааддйасайс даасаааайс йддаййссай йайаййдайй ййссййдадд ааесайдсае йсйдйййдсд аададдаайд йййааайсйс ййййдсссйй ййдсйдасйд садйдййдаа айадссаасй йдйдссаааа йййсйдайаа саайссадаа йдйсйсайаа аададсййсй ййдссааййс садддйдййй дйссссдссй сйсйдадйаа сааассйсас ййдйййддсй йсйсйсасйс сйааасааад йаасайдййй
Ьдййсасадд ааасйййдас йаассаадаа аадйасййда дйсйадаааа асйссйййдс айдйддаййд дсаасаасаа ййсйддаййй сйдйййаййй ййдасдадай даййдаайаа саййдаассй йсаддаассй ййдссйддйй асйассйййд сайссйдсаа йдайййййай ддаайдйййс ййдаайайдс йсйсййсаай аддсаддйдй йййййаййай айдссдййса адаййссада асйдсайсйй йдддайдсйд сздссассйд йсййасссай аасйайсййд асййсссайд аасййййдсс ааййааааай йддсййдйса аййайсааас айсйййаааа йсасдсаайй сасададаад садссадсйд йайдсйсдай йссасайсйа йййдсасддд йайййсссйй ддадсассйй аййдайааас ааайдаааса йаааайсйса сййдддосйй йаййййсдаа сййддйссда сйсйссййса сайадссаас дсадсайаас ссйааадддй сссадййдад йййааасаса йсадаадаай дадйаасййа йдййааййдд саасасйсса адасадйдсс сйййдййдйа адйасайсда адсайайайа ддааааддаа ййййдаасйд аасасассай асаадсйайй ййайааасйд даасйддсса
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1630
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640 дййсадааад аасйсадйас аасддайадд йдссйййсай сайааасйдс аадйадсасй йддайссааа 2700 ай 2712 <210> <211>
<212>
<213>
218
449
РРТ
Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина тяжелой цепи кандидата 9 ЕЧО с 3229Р, Р235А/Ь236А <400> 218
О1и Ча1 С1п Ьеи С1п С1п Зег О1у Рго б1у Ьеи Ча1 Ьуз Рго Зег С1п 15 10 15
ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз А1а 11е Зег С1у Азр Зег Ча1 Зег Зег Азп 20 25 30
Зег А1а А1а Тгр С1у Тгр 11е Агд С1п Зег Рго <31у Агд С1у Ьеи С1и 35 40 45
Тгр Ьеи <31у 11е Не С1п 11е Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а
55 60
Ьеи Зег Ча1 Ьуз Зег Агд 11е ГЬг 11е Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи С1п Ьеи Азп Зег Ча1 ТЬг Рго 61и Азр ТЬг А1а Ча1
90 95
Туг Туг Суз А1а Агд Туг Зег Туг Рго РЬе Туг Зег Не Азр Туг Тгр
100 105 110
С1у (31п С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча1 Зег Зег А1а Зег ТЬг Ьуз <31у Рго
115 120 125
Зег Ча1 РЬе Рго Ьеи А1а Рго Суз Зег Агд Зег ТЬг Зег С1и Зег ГЬг
130 135 140
А1а А1а Ьеи <31у Суз Ьеи Ча1 Ьуз Азр Туг РЬе Рго С1и Рго Ча1 ТЬг
145 150 155 160
Ча1 Зег Тгр Азп Зег С1у А1а Ьеи ТЬг Зег С1у Ча1 Ηίδ ГЬг РЬе Рго
165 170 175
А1а Ча1 Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Ча1 Ча1 ТЬг
180 185 190
Ча1 Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у ТЬг Ьуз ГЬг Туг ТЬг Суз Азп Ча1 Азр
195 200 205
Ηίδ Ьуз Рго Зег Азп ТЬг Ьуз Ча1 Азр Ьуз Агд Ча1 С1и Зег Ьуз Туг
210 215 220
61у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А1а Рго С1и А1а А1а С1у С1у Рго
225 230 235 240
Зег Ча1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи Мей 11е Зег
245 250 255
Агд ТЬг Рго <31и Ча1 ТЬг Суз Ча1 Ча1 Ча1 Азр Ча1 Зег С1п С1и Азр
260 265 270
Рго С1и Ча1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Ча1 Азр С1у Ча1 <31и Ча1 Нхз Азп
275 280 285
А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РЬе Азп Зег ТЬг Туг Агд Ча1
290 295 300
Ча1 Зег Ча1 Ьеи ТЬг Ча1 Ьеи Нхз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и
305 310 315 320
Туг Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго Зег Зег 11е <31и Ьуз
325 330 335
ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Ча1 Туг ТЬг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и 31и Мей ТЬг Ьуз Азп С1п Ча1 Зег Ьеи ТЬг
355 360 365
Суз Ьеи Ча1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не А1а Ча1 <31и Тгр С1и
370 375 380
Зег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Ча1 Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр С1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Ча! Азр Ьуз
102 021512
405 410 415
5ег Агд Ггр СЬп СЬи СЬу Αεη УаЬ Рке Зег Суз 5ег УаЬ МеС Ηίε СЬи
420 425 430
А1а Ьеи Ηίδ Азп Ηίε Туг Ткг 61п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у
435 440 445
Ьуз <210> 219 <211> 449 <212> РЕГ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Тяжелая цель кандидатов ЬОЕУО, 12ЕУ<2 с 5229Р, Г235А/Ь236А <400> 219
СЬи 1 УаЬ СЬп Ьеи СЬп 5 СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег СЬп
10 15
Ткг Ьеи Зег Ьеи Ткг Суз АЬа Пе Зег СЬу Азр Зег УаЬ Зег Зег Азп
20 25 30
Зег АЬа АЬа Тгр СЬу Тгр Не Агд СЬп Зег Рго СЬу Агд СЬу Ьеи СЬи
35 40 45
Тгр Ьеи СЬу Не Не СЬп Ьуз Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азп Туг АЬа
50 55 60
ν«ι Зег УаЬ ьуз 5ег Агд Не Ткг Пе А®п Рго Азр Ткг $ег Ьуд А§п
65 70 75 80
СЬп Рке Зег Ьеи СЬп Ьеи Азп Зег УаЬ Ткг Рго СЬи Азр Ткг АЬа УаЬ
85 90 95
Туг Туг Суз АЬа Агд Туг Зег Туг Рго Рке Туг Зег Не Азр Туг Тгр
100 105 110
СЬу СЬп СЬу Ткг Ьеи УаЬ Ткг УаЬ 5ег Зег АЬа Зег Ткг Ьуз СЬу Рго
115 120 125
Зег УаЬ Рке Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег Ткг Зег СЬи Зег Ткг
130 135 140
АЬа АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг Рке Рго СЬи Рго УаЬ Ткг
145 150 155 160
УаЬ Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа ьеи Ткг Зег СЬу ν»ΐ НЬз Ткг Рке Рго
Ь65 170 175
А1а Уа1 Ьеи СЬп Зег Зег СЬу Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег УаЬ УаЬ Ткг
180 185 190
УаЬ Рго Зег Зег 5ег Ьеи СЬу Ткг Ьуз Ткг Туг Ткг Суз Азп УаЬ Азр
195 200 205
НЬз Ьуз Рго Зег Азп Ткг Ьуз УаЬ Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг
210 215 220
СЬу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи АЬа АЬа СЬу СЬу Рго
225 230 235 240
Зег УаЬ Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг Ьеи мед Не Зег
245 250 255
Агд Ткг Рго СЬи УаЬ Ткг Суз Уа1 УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр
260 265 270
Рго СЬи УаЬ СЬп Рке Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп
275 280 285
АЬа Ьуз Ткг Ьуз Рго АГд СЬи СЬи СЬп Рке Азп Зег Ткг Туг Агд УаЬ
290 295 300
УаЬ Зег УаЬ Ьеи Ткг УаЬ Ьеи НЬЗ СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз СЬи
305 310 ЗЬ5 320
Туг Ьуз Суз Ьуз УаЬ Зег Азп Ьуз СЬу Ьеи Рго Зег Зег Пе СЬи Ьуз
325 330 335
Ткг Не Зег Ьуз АЬа Ьуз СЬу СЬп Рго Агд СЬи Рго СЬп УаЬ Туг Ткг
340 345 350
Ьеи Рго Рго Зег СЬп СЬи СЬи МеД Ткг Ьуз Азп СЬп УаЬ Зег Ьеи Ткг
355 360 365
Суз Ьеи УаЬ Ьуз СЬу Рке Туг Рго Зег Азр 11е А1а УаЬ СЬи Тгр СЬи 370 375 330
Зег Азп СЬу 61п Рго СЬи Азп Азп Туг Ьуз Ткг Ткг Рго Рго УаЬ Ьеи
385 390 395 400
Азр Зег Азр СЬу Зег Рке Рке Ьеи Туг Зег Агд Ьеи Ткг УаЬ Азр Ьуз
405 410 415
Зег Агд Ггр СЬп С1и С1у Азп УаЬ Рке Зег Суз Зег УаЬ МеС НЬз С1и
420 425 430
АЬа Ьеи НЬз Азп НЬз Туг Ткг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи СЬу
435 440 445
Ьуз <210> 220 <211> 443 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Полная длина тяжелой цепи варианта ЕУО тАЫ4 и тАЫ5 5229Р, Г235А/Ь23бА <400> 220
С1и УаЬ С1п Ьеи УаЬ С1п Зег СЬу АЬа С1и УаЬ Ьуз Ьуз Рго С1у С1и 15 10 15
Зег Ьеи Ьуз 11е Зег Суз Ьуз С1у Зег СЬу Туг Зег Рке ГЬг Азп Туг 20 25 30
Тгр УаЬ СЬу Тгр УаЬ Агд СЬп МеС Рго СЬу Ьуз С1у Ьеи СЬи Тгр МеС 35 40 45
С1у Рке Не Азр Рго Зег Азр Зег Туг Ткг Азп Туг А1а Рго Зег Рке
55 60
СЬп СЬу СЬп УаЬ Ткг 1Ье Зег АЬа Азр Ьуз Зег 1Ье Зег Ткг АЬа Туг
70 75 80
Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз АЬа Зег Азр Ткг АЬа МеС Туг Туг Суз
90 95
АЬа Агд СЬи Ьеи Туг СЬп СЬу Туг МеС Азр Ткг Рке Азр Зег Тгр СЬу 100 105 НО
СЬп СЬу Ткг Ьеи УаЬ Ткг УаЬ Зег Зег АЬа Зег Ткг Ьуз С1у Рго Зег 115 120 125
УаЬ Рке Рго Ьеи АЬа Рго Суз Зег Агд Зег Ткг Зег СЬи Зег Ткг АЬа
130 135 140
АЬа Ьеи СЬу Суз Ьеи УаЬ Ьуз Азр Туг Рке Рго СЬи Рго УаЬ Ткг УаЬ
145 150 155 160
Зег Тгр Азп Зег СЬу АЬа Ьеи Ткг Зег СЬу УаЬ НЬз Ткг Рке Рго АЬа
165 170 175
УаЬ Ьеи С1п Зег Зег С1у Ьеи Туг Зег Ьеи Зег Зег Уа1 Уа1 Ткг Уа1
180 185 190
Рго Зег Зег Зег Ьеи С1у Ткг Ьуз Ткг Туг Ткг Суз Азп Уа1 Азр НЬз
195 200 205
Ьуз Рго Зег Азп Ткг Ьуз Уа1 Азр Ьуз Агд УаЬ СЬи Зег Ьуз Туг СЬу
210 215 220
Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго АЬа Рго СЬи АЬа АЬа СЬу СЬу Рго Зег
225 230 235 240
УаЬ Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр Ткг Ьеи МеС 11е Зег Агд
245 250 255
Ткг Рго СЬи УаЬ Ткг Суз УаЬ УаЬ УаЬ Азр УаЬ Зег СЬп СЬи Азр Рго
260 265 270
СЬи УаЬ СЬп Рке Азп Тгр Туг УаЬ Азр СЬу УаЬ СЬи УаЬ НЬз Азп АЬа
275 280 285
Ьуз Ткг Ьуз Рго Агд СЬи СЬи СЬп Рке Азп Зег Ткг Туг Агд УаЬ УаЬ
290 295 300
103
зег Ча1 Ьеи ТЬг Ча1 Ьеи Нхз СЬп Азр Тгр Ьеи Азп СЬу Ьуз С1и Туг
305 310 315 320
Ьуз Суз Ьуз Ча1 Зег Азп Ьуз 61у Ьеи Рго Зег Зег Ые С1и Ьуз ТЬг
325 330 335
Г1е Зег Ьуз А1а Ьуз С1у СЬп Рго Агд С1и Рго СЬп Ча1 Туг ГЬг Ьеи
340 345 350
Рго Рго Зег СЬп С1и 31и Мес ТЬг Ьуз Азп СЬп Ча1 Зег Ьеи ГЬг Суз
355 360 365
Ьеи Ча1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр 11е А1 а Ча1 С1и Тгр С1и Зег
370 375 380
Азп СЬу СЬп Рго С1и Азп АЗП Туг Ьуз ГЬг ТЬг Рго Рго ча1 Ьеи Азр
385 390 395 400
Зег Азр 61 у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд Ьеи ТЬг Ча1 Азр Ьуз Зег
405 410 415
Агд Тгр СЬп С1и С1у Азп Ча1 РЬе Зег Суз Зег Ча1 Мес ΗΪ3 С1и А1а
420 425 430
Ьеи Нхз Азп НХЗ Туг ТЬг СЬп Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег Ьеи С1у Ьуз
435 440 445
<210> 221 <211> 95 <212> РВТ <213> Ното ! Зархепз
<400> 221
Азр 11е СЬп Мес ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 СЬу
1 5 10 15
Азр Агд Ча1 ГЫ Г1е ТЫ Суз Агд А1а Зег СЬп Зег Ые Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п СЬп Ьуз Рго СЬу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег СЬу Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ые Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Туг Зег ТЬг Рго
85 90 95
<210> 222 <211> 98 <212> РВТ <213> Ното : Зархепз
<400> 222 СЬи Ча1 СЬп Ьеи Ча1 СЬп Зег СЬу А1а СЬи Ча1 Ьуз Ьуз Рго СЬу СЬи
1 5 10 15
Зег Ьеи Ьуз Ые Зег Суз Ьуз СЬу Зег С1у Туг Зег РЬе ТЫ Зег Туг
20 25 30
Тгр 11е СЬу Тгр ЧаЬ Агд СЬп МеС Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи С1и Тгр МеС
35 40 45
СЬу Ые Ые Туг Рго СЬу Азр Зег Азр ТЬг Агд Туг Зег Рго Зег РЬе
50 55 60
СЬп С1у СЬп ЧаЬ ТЬг Ые Зег АЬа Азр Ьуз Зег Ые Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп Тгр Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Азр ТЬг А1а МеС Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд <210> 223 <211> 87 <212> РКТ <213> Ното Зархепз <400> 223
Зег Туг СЬи Ьеи ТЫ СЬп Рго Рго Зег Ча1 Зег ЧаЬ Зег Рго СЬу СЬп
1 5 10 15
ТЬг АЬа Зег Ые ТЫ Суз Зег СЬу Азр Ьуз Ьеи СЬу Азр Ьуз Туг АЬа
20 25 30
Суз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп Зег Рго ЧаЬ Ьеи Ча1 Ые Туг
35 40 45
СЬп Азр Зег Ьуз Агд Рго Зег СЬу 1Ье Рго СЬи Агд РЬе Зег СЬу Зег
50 55 60
Азп Зег СЬу Азп ТЬг АЬа ТЫ Ьеи ТЬг 11е Зег СЬу ТЬг СЬп АЬа МеС
65 70 75 80
АЗр СЬи А1а Азр Туг Туг Суз
85
<210> 224 <211> 101 <212> РВТ <213> Ното Зархепз
<400> 224 СЬп Ча1 СЬп Ьеи СЬп СЬп Зег СЬу Рго СЬу Ьеи ЧаЬ Ьуз Рго Зег СЬп
1 5 10 15
ТЬг Ьеи 5ег Ьеи ТЬг Суз АЬа Ые Зег СЬу Азр Зег Ча1 Зег Зег Азп
20 25 30
Зег АЬа АЬа Тгр Азп Тгр Ые Агд СЬп Зег Рго Зег Агд СЬу Ьеи СЬи
35 40 45
Тгр Ьеи С1у Агд ТЬг Туг Туг Агд Зег Ьуз Тгр Туг Азп Азр Туг А1а
50 55 60
Ча1 Зег Ча1 Ьуз Зег Агд 11е ТЬг 11е Азп Рго Азр ТЬг Зег Ьуз Азп
65 70 75 80
С1п РЬе Зег Ьеи СЬп Ьеи Азп Зег Ча! ТЬг Рго СЬи Азр ТЬг А1а Ча1
85 90 95
Туг Туг Суз АЬа Агд
100
<210> 225 <211> 107 <212> РВТ <213> Синте: ;кач последовательность
<220>
<223> Замена Р953 из легкой цепи тАЬ 15
<400> 225
Азр Не О1п МеС ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АЬа Зег ЧаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд Ча1 ТЫ Ые ТЬг Суз Агд АЬа Зег С1п Зег Ые С1у Ьеи Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг АЬа А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег СЬу Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп СЬу Азп ТЬг Ьеи Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз Ча1 СЬи Ые Ьуз
104
100 105 <210> 226 <211> 9 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> тАЬ 15-10 ЬСОКЗ <400> 226
СЬп СЬп СЬу Αεη ТЬг Ьеи Рго Туг ТЬг 1 5 <210> 227 <211> 214 <212> РКТ <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Легкая цепь тАЬ 15-10
<400> 227
Азр Не 61п МеЬ ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаЬ СЬу
1 5 10 15
Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суе Агд А1а Зег СЬп Зег 11е СЬу Ьеи Туг
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг СЬп СЬп Ьуе Рго СЬу Ьуе А1а Рго Ьу8 Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг АЬа АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Бег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ГЬг Пе Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп СЬу Азп ТЬг Ьеи Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу С1п СЬу ТЬг Ьуе УаЬ СЬи Пе Ьуз Агд ТЬг УаЬ АЬа А1а
100 105 110
Рго Зег УаЬ РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр СЬи СЬп Ьеи Ьуз Зег СЬу
115 120 125
ТЬг АЬа Зег УаЬ Уа1 Суз Ьеи Ьеи Αεη Αεη РЬе Туг Рго Агд СЬи А1а
130 135 140
Ьуз νβΐ СЬп Тгр Ьуз УаЬ Азр Азп А1а Ьеи С1п Зег С1у Азл Зег С1п
145 150 155 160
СЬи Зег УаЬ ТЬг СЬи СЬп Азр Зег Ьуз Αερ Зег ТЬг Туг Зег Ьеи Зег
165 170 175
Бег ТЬг Ьеи ГЬг Ьеи Зег Ьуз АЬа Αερ Туг О1и Ьуз Ηίε Ьуз уаь Туг
180 185 190
А1а Суе СЬи Уа1 ТЬг Ηίε С1п СЬу Ьеи Зег Зег Рго УаЬ ТЬг Ьуб Зег
195 200 205
РЬе Αεη Агд СЬу С1и Суе 210 <210> 228 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер для мутагенеза для тАЬ 15-10 <400> 228 садддсааса сссбдсссса сассггсддс сад 33 <2Ю> 229 <211> 33 <212> ДНК
Синтетическая последовательность <220>
<223> Праймер для мутагенеза для тАЬ 15-10 <400> 229 сьддссдаад дьдбадддса дддЬдсъдсс сгд 33

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное антитело или его фрагмент, способное реагировать с ТЬК3, содержащее вариабельную область тяжелой и легкой цепи, где антитело содержит:
    a) вариабельную область тяжелой цепи 5>ЕО ГО N0: 214; или
    b) вариабельную область легкой цепи 5>ЕО ГО N0: 211; или
    c) вариабельную область тяжелой цепи 5>Е0 ГО N0: 214 и вариабельную область легкой цепи 5>Е0 ГО N0: 211; или
    ά) аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (0ΌΚ) 1, 2 и 3 (Η0ΌΚ1, Η0ΌΚ2 и НСЭК3) тяжелой цепи, представленные 5>Е0 ГО N0: 70, 77 и 72, или
    е) аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (0ΌΚ) 1, 2 и 3 (ЬСОК.1, БС0Е2 и БС0Е3) легкой цепи, представленные 5>Е0 ГО N0: 67, 68 и 78, или
    ί) аминокислотные последовательности СЭЕ 1, 2 и 3 тяжелой цепи, представленные 5>Е0 ГО N0: 70, 77 и 72, и аминокислотные последовательности СОК 1, 2 и 3 легкой цепи, представленные 5>Е0 ГО N0: 67, 68 и 78, или
    - 105 021512
    д) вариабельную область тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 95% идентична вариабельной области, имеющей аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NΟ: 214, или
    1ι) вариабельную область легкой цепи, которая по меньшей мере на 95% идентична вариабельной области, имеющей аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NΟ: 211.
  2. 2. Изолированное антитело или его фрагмент по п.1, где антитело является полностью человеческим или адаптированным для человека.
  3. 3. Изолированное антитело или его фрагмент по п.1 или 2, имеющее изотип 1дС1, 1дС2, 1дС3 или
    1дС4.
  4. 4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела по пп.1-3, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NΟ: 214.
  5. 5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела по пп.1-3, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО NΟ: 211.
  6. 6. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.4 или 5.
  7. 7. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.6.
  8. 8. Способ получения антитела, способного реагировать с ТЬК3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.7 и выделение антитела, продуцируемого клеткой-хозяином.
EA201171307A 2009-04-29 2010-04-29 Антагонисты толл-подобного рецептора 3 EA021512B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17368609P 2009-04-29 2009-04-29
US12/609,675 US8409567B2 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Toll-like receptor 3 antagonists
PCT/US2010/032964 WO2010127113A2 (en) 2009-04-29 2010-04-29 Toll-like receptor 3 antagonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201171307A1 EA201171307A1 (ru) 2012-07-30
EA021512B1 true EA021512B1 (ru) 2015-07-30

Family

ID=43032773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201171307A EA021512B1 (ru) 2009-04-29 2010-04-29 Антагонисты толл-подобного рецептора 3

Country Status (32)

Country Link
EP (2) EP2425008B1 (ru)
JP (1) JP5727463B2 (ru)
KR (2) KR20120040141A (ru)
CN (1) CN102482699A (ru)
AU (1) AU2010241581A1 (ru)
BR (1) BRPI1016191A2 (ru)
CA (1) CA2760525A1 (ru)
CL (1) CL2011002703A1 (ru)
CO (1) CO6450607A2 (ru)
CR (1) CR20110642A (ru)
DK (1) DK2425008T3 (ru)
EA (1) EA021512B1 (ru)
EC (1) ECSP11011428A (ru)
ES (1) ES2556239T3 (ru)
HR (1) HRP20151352T1 (ru)
HU (1) HUE028021T2 (ru)
IL (1) IL215906A0 (ru)
ME (1) ME02280B (ru)
MX (2) MX349056B (ru)
MY (1) MY180699A (ru)
NI (1) NI201100187A (ru)
NZ (1) NZ596036A (ru)
PE (1) PE20121493A1 (ru)
PL (1) PL2425008T3 (ru)
PT (1) PT2425008E (ru)
RS (1) RS54451B1 (ru)
SG (1) SG175396A1 (ru)
SI (1) SI2425008T1 (ru)
SM (1) SMT201500293B (ru)
UA (1) UA112282C2 (ru)
WO (1) WO2010127113A2 (ru)
ZA (1) ZA201108724B (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2350304T3 (pl) 2008-10-31 2017-06-30 Janssen Biotech, Inc Związki antagonistyczne receptora podobnego do toll 3
US20130090457A1 (en) * 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
ES2543095T3 (es) 2009-07-10 2015-08-14 Innate Pharma Agentes de unión a TLR3
US20140065154A1 (en) * 2011-01-12 2014-03-06 Innate Pharma Tlr3 binding agents
CN103443124A (zh) * 2011-01-17 2013-12-11 诺沃—诺迪斯克有限公司 Il-21配体
EP2755685A4 (en) * 2011-09-12 2015-07-01 Janssen Biotech Inc TOLL-LIKE RECEPTOR-3 ANTAGONISTS FOR THE TREATMENT OF METABOLISM AND CARDIAC DISEASES
MX361773B (es) * 2012-05-31 2018-12-17 Innate Pharma Agentes de ligación a tlr3.
KR101878023B1 (ko) 2015-12-07 2018-07-16 현대자동차주식회사 차량용 전원 관리 시스템
CN113484526B (zh) * 2021-08-11 2024-08-23 上海迈晋生物医药科技有限公司 一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031573A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
US20070098716A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Duffy Karen E Toll Like Receptor 3 Modulators, Methods and Uses

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
JP2004016021A (ja) * 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
TWI487535B (zh) 2004-11-30 2015-06-11 Centocor Inc 類鐸受體３（ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ３）拮抗劑，方法及用途
EP2347038A4 (en) 2008-10-14 2013-06-12 Janssen Biotech Inc METHOD FOR HUMANIZATION AND AFFINITY TREATMENT OF ANTIBODIES
PL2350304T3 (pl) * 2008-10-31 2017-06-30 Janssen Biotech, Inc Związki antagonistyczne receptora podobnego do toll 3

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003031573A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
US20070098716A1 (en) * 2005-10-27 2007-05-03 Duffy Karen E Toll Like Receptor 3 Modulators, Methods and Uses

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FLORIS FRANSEN et al. Agonists of Toll-Like Receptors 3, 4, 7, and 9 Are Candidates for Use as Adjuvants in an Outer Membrane Vaccine against Neisseria meningitidis Serogroup B. Infection and Immunity, 2007 Dec; 75(12), с. 5939-5946 *
KAREN E. DUFFY et al. Down modulation of human TLR3 function by a monoclonal antibody. Cellular Immunology, 2007 Aug; 248(2), с. 103-114 *
MISAKO MATSUMOTO et al. Subcellular Localization of Toll-Like Receptor 3 in Human Dendritic Cells. J. Immunol, 2003; 171(6): 3154-3162 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUE028021T2 (en) 2016-11-28
PE20121493A1 (es) 2012-11-05
KR101758713B1 (ko) 2017-07-18
NZ596036A (en) 2014-03-28
SMT201500293B (it) 2016-01-08
SI2425008T1 (sl) 2015-12-31
CL2011002703A1 (es) 2012-07-20
HRP20151352T1 (hr) 2016-01-01
PL2425008T3 (pl) 2016-03-31
KR20170018110A (ko) 2017-02-15
JP2012525425A (ja) 2012-10-22
ME02280B (me) 2016-02-20
PT2425008E (pt) 2015-12-04
CA2760525A1 (en) 2010-11-04
WO2010127113A2 (en) 2010-11-04
EP2425008A1 (en) 2012-03-07
CR20110642A (es) 2012-07-16
RS54451B1 (sr) 2016-06-30
ZA201108724B (en) 2013-06-26
UA112282C2 (uk) 2016-08-25
EP2425008A4 (en) 2012-11-07
KR20120040141A (ko) 2012-04-26
HK1170536A1 (zh) 2013-03-01
IL215906A0 (en) 2012-01-31
JP5727463B2 (ja) 2015-06-03
SG175396A1 (en) 2011-12-29
BRPI1016191A2 (pt) 2020-12-08
DK2425008T3 (en) 2015-10-05
AU2010241581A1 (en) 2011-11-17
MX2011011623A (es) 2011-11-18
MX349056B (es) 2017-07-06
ES2556239T3 (es) 2016-01-14
CO6450607A2 (es) 2012-05-31
EP2425008B1 (en) 2015-09-16
MY180699A (en) 2020-12-07
NI201100187A (es) 2012-05-24
ECSP11011428A (es) 2012-02-29
EA201171307A1 (ru) 2012-07-30
EP3020822A1 (en) 2016-05-18
CN102482699A (zh) 2012-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022832B1 (ru) Выделенное антитело, способное взаимодействовать с tlr3
EA021512B1 (ru) Антагонисты толл-подобного рецептора 3
EA015589B1 (ru) Антитела против миостатина и их применение
EA025169B1 (ru) Антитела к рецептору ii tgf-бета
US20130090457A1 (en) Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
US8460659B2 (en) Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
US20240270858A1 (en) Therapeutics and methods for treating or ameliorating metabolic disorders
MX2014002982A (es) Antagonistas del receptor tipo toll 3.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): MD RU