[go: up one dir, main page]

EA020818B1 - Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение - Google Patents

Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA020818B1
EA020818B1 EA201001628A EA201001628A EA020818B1 EA 020818 B1 EA020818 B1 EA 020818B1 EA 201001628 A EA201001628 A EA 201001628A EA 201001628 A EA201001628 A EA 201001628A EA 020818 B1 EA020818 B1 EA 020818B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
replacement
modified
amino acid
run
Prior art date
Application number
EA201001628A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001628A1 (ru
Inventor
Эдвин Л. Мэдисон
Кристофер Тсэнос
Original Assignee
Каталист Биосайенсиз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Каталист Биосайенсиз, Инк. filed Critical Каталист Биосайенсиз, Инк.
Publication of EA201001628A1 publication Critical patent/EA201001628A1/ru
Publication of EA020818B1 publication Critical patent/EA020818B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Заявлены модифицированные полипептиды фактора VII. Такие модифицированные полипептиды фактора VII включают фактор VIIa и другие формы фактора VII. Среди описанных модифицированных полипептидов фактора VII имеются такие, которые имеют измененную активность, обычно измененную прокоагулянтную активность, включая увеличенную прокоагулянтную активность. Следовательно, такие модифицированные полипептиды могут быть использованы в терапии.

Description

(57) Заявлены модифицированные полипептиды фактора VII. Такие модифицированные полипептиды фактора VII включают фактор УИа и другие формы фактора VII. Среди описанных модифицированных полипептидов фактора VII имеются такие, которые имеют измененную активность, обычно измененную прокоагулянтную активность, включая увеличенную прокоагулянтную активность. Следовательно, такие модифицированные полипептиды могут быть использованы в терапии.
020818 В1
Родственные заявки
Преимущество приоритета принадлежит предварительной заявке на патент США № 61/124021 Е6№ΐη Майкоп и СЬг1к1орЬег ТЬапок Модифицированные полипептиды фактора VII и их применение, поданной 11 апреля 2008 г.
Эта заявка близка соответствующей заявке США 12/384915 Ейуй Майкоп и СРгпкЮрЬег ТЬапок Модифицированные полипептиды фактора VII и их применение, поданной 10 апреля 2009 г., которая также претендует на приоритет предварительной заявки США 61/124021.
Где это возможно, содержание указанных выше заявок включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Где это возможно, содержание заявки США № 12/082662 Ейуй Майкоп, СНпкЮрЬег ТЬапок, 8ап6га УаидЬ Кидд1ек и 8Ьаип СоидЫш Модифицированные полипептиды фактора VII и их применение, поданной 11 апреля 2008 г., и соответствующей международной заявки № РСТ/и8 2008/04795 Ейуш Майкоп, СйпкЮрНег ТЬапок, 8ап6га УаидЬ Кидд1ек и 8Наип СоидЫш Модифицированные полипептиды фактора VII и их применение, поданной 11 апреля 2008 г., также включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Перечень последовательностей включен в настоящий документ в качестве ссылки на компакт-диске.
Электронная версия Перечня последовательностей на компакт-диске (СЭ-К) прилагается к настоящему документу в четырех экземплярах (названных копия 1, копия 2, копия 3 и СКР), содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме. Машиночитаемые файлы на каждом из вышеупомянутых компакт-дисков, созданные 10 апреля 2009 г., являются идентичными, обладают размером 1200 килобайт и названы 49198ЕС.РС1.ТХТ.
Область техники
В настоящем изобретении предусмотрены модифицированные белки для лечебных целей. В частности предусмотрены модифицированные полипептиды фактора VII, которые включают фактор МПа и другие формы фактора VII, и их применение.
Уровень техники
Гемостаз представляет собой комплекс физиологических процессов, приводящий к прекращению кровотечения. Тромбоциты, белки плазмы и кровеносные сосуды с эндотелиальными клетками являются тремя составляющими этого процесса, каждое из них играет важную роль в событиях, которые непосредственно следуют за повреждением тканей и при нормальных обстоятельствах приводят к быстрому образованию сгустка. Центральное место в каскаде свертывания занимает ряд протеолитических актов, в которых некоторые белки плазмы (или факторы свертывания крови) последовательно активируются в каскаде другими ранее активированными факторами свертывания, что приводит к быстрому образованию тромбина. Большие количества образованного в этом каскаде тромбина затем расщепляют фибриноген до фибриновых пептидов, которые необходимы для образования сгустка.
Факторы свертывания циркулируют в крови в виде неактивных одноцепочечных зимогенов и активируются путем расщепления по одной или нескольким позициям с образованием двухцепочечной активированной формы белка. Фактор VII (РМИ), витамин К-зависимый белок плазмы, первоначально циркулирует в крови как зимоген. Зимоген РМП активируется протеолитическим расщеплением по одному сайту, Агд152-Пе153, с образованием протеазы, состоящей из двух цепей, связанных простой дисульфидной связью (Р^^. РМПа связывает свой кофактор, тканевый фактор (ТФ), с образованием комплекса, в составе которого РМПа может эффективно активировать фактор X (РХ) в РХа, тем самым начиная серию событий, которые приводят к образованию фибрина и гемостазу.
Несмотря на то, что в большинстве случаев достигается нормальный гемостаз, дефекты в процессе могут привести к кровоточивости, при которой увеличивается необходимое для формирования сгустка время. Такие нарушения могут быть врожденными или приобретенными. Например, гемофилия А и гемофилия В являются наследственными заболеваниями, характеризующимися недостатком фактора VIII (Р^Н) и фактора IX (РХХ) соответственно. Заместительная терапия является традиционным способом лечения гемофилии А и гемофилии В и включает внутривенное введение фактора VIII или РРХ, которые представляют собой полученные из человеческой плазмы или рекомбинантные белки. Во многих случаях, однако, пациенты вырабатывают антитела (также известные как ингибиторы) против вводимых белков, которые уменьшают или сводят на нет эффективность лечения. Рекомбинантный РМПа (Ыоуокеуеп® (фактор свертывания МПа (рекомбинантный))) был одобрен для лечения пациентов с гемофилией А или В, у которых присутствуют ингибиторы фактора VIII или РРХ, а также для использования для остановки кровотечений или предотвращения кровотечения, связанного с травмой и/или хирургическим вмешательством. Рекомбинантный РМПа также был одобрен для лечения пациентов с врожденным дефицитом РМП и все чаще используется не по прямому назначению, например для лечения кровотечений, связанных с другими врожденными или приобретенными нарушениями свертываемости крови, травмами и операциями у пациентов, не больных гемофилией.
Применение рекомбинантного РVРIа для ускорения образования сгустка подчеркивает его растущее значение в качестве терапевтического средства. Лечение РVРIа в значительной мере не удовлетворяет медицинские потребности. Например, на основании данных клинических испытаний для помощи пациенту с гемофилией при остром кровотечении в среднем необходимы 3 дозы РVРIа в течение 6 ч или
- 1 020818 большего периода времени. Для снижения этих потребностей необходимы более эффективные варианты РУНа. Таким образом, одной из целей настоящего изобретения является обеспечение модифицированных полипептидов РУН с улучшенными лечебными свойствами.
Сущность изобретения
В настоящем документе представлены модифицированные полипептиды фактора У11 (РУН). В частности, здесь представлены модифицированные полипептиды фактора VII, проявляющие прокоагулянтную активность. Полипептиды фактора VII обладают модификациями первичной последовательности по сравнению с немодифицированными полипептидами РУН и могут включать аминокислотные вставки, удаления и замены. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН включают полипептиды РУН, которые обладают повышенной устойчивостью к ингибиторам, таким как антитромбин III (ΑΤ-ΙΙΙ) и ингибитор пути тканевого фактора (ТРР1), полипептиды РУН, которые обладают повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη, полипептиды РУН, которые обладают увеличенной каталитической активностью в присутствии и/или в отсутствие ТФ, полипептиды РУН, которые обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как увеличенный период полураспада, полипептиды РУН, которые обладают повышенной способностью связывать тромбоциты и/или аффинностью к поверхности тромбоцитов, полипептиды РУН с повышенной способностью связывать сывороточный альбумин и/или аффинностью к сывороточному альбумину, и полипептиды РУН с повышенной способностью связывать интегрин тромбоцитов апъвз и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов апъвз. Модифицированные полипептиды РУН могут содержать любую комбинацию предусмотренных в настоящем документе модификаций, при которой один или более видов активности или свойств полипептида изменены по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Обычно модифицированный полипептид РУН сохраняет прокоагулянтную активность. Также в настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки, которые кодируют/экспрессируют модифицированные полипептиды РУН. В данной заявке представлены также фармацевтические композиции, изделия, наборы и методы лечения. Полипептиды РУН включают аллельные и видовые варианты полипептидов и другие варианты, которые имеют модификации, затрагивающие другие виды активности и/или свойства. Также предусмотрены активные фрагменты полипептидов РУН, которые включают предусмотренные модификации. Примеры полипептидов РУН представляют собой полипептиды, которые включают последовательность аминокислот, приведенную в 8ЕО ГО N0: 3, а также их варианты, обладающие 60, 65, 70, 75, 80, 85, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или большей идентичностью последовательности с ними.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН (РУН), содержащие модификацию полипептида РУН в позиции 0286 полипептида РУН с последовательностью аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, или в соответствующих остатках полипептида РУН. Модификация может представлять собой замену аминокислоты, вставку аминокислоты (аминокислот), удаление аминокислоты (аминокислот) или их комбинацию. Если модификация представляет собой замену аминокислоты, аминокислота может быть заменена на основную аминокислоту (например, Агд (К), Ьу8 (К) и Ηίδ (Н)) или аминокислоту, выбранную из Агд (К), Ьу8 (К) Ηίδ (Н), Туг (Υ), ОН (О), РЬе (Р), Мс1 (М), Не (I), Ьеи (Ь), Уа1 (У), Рго (Р), С1и (Е), Тгр (V), Αδρ (Ό) и Суδ (С). Примеры таких аминокислотных замен включают О286К, О286К, Ρ286Η, (7286^/ Р286С, Р286Р, О286М Р286ф Р286Ь, О286\\ Р286Р, 02861/ О286\У. Ο286Ω и О286С. Такие изменения могут быть введены в немодифицированный полипептид РУН, содержащий последовательность, приведенную в 8Е0 ГО N0: 1-3, или в его аллельный или видовой вариант, или вариант, обладающий, по крайней мере, 60% идентичностью последовательности с РУН 8Е0 ГО N0: 1-3, или изменения могут быть введены в активный фрагмент полипептида РУН, включающий последовательность аминокислот, приведенную в 8Е0 ГО N0: 1-3, или в его аллельный или видовой вариант, или вариант, обладающий по крайней мере 60% идентичностью последовательности с РУН 8Е0 ГО N0: 1-3. Например, модифицированный полипептид РУН может представлять собой активный фрагмент, который включает замену в положении, соответствующем положению 0286 в полипептиде РУН.
В некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН содержат аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 286 в полипептиде РУН с последовательностью аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, или содержат аминокислотную замену в соответствующем остатке в полипептиде РУН, где модификация представляет собой замену в положении 286 на основную аминокислоту, что приводит к модифицированному полипептиду РУН, который проявляет увеличенную коагулянтную активность по сравнению с полипептидом РУН, который не обладает модификацией в положении 286. Основные аминокислоты могут быть выбраны из Агд (К), Ενδ (К) и Ηίδ (Η). Например, предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РУН может содержать замену С1п (О) на Агд (К) в позиции 286.
В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН включают только одну модификацию в положении 286. В других примерах модифицированные полипептиды РУН также содержат одну или несколько дополнительных модификаций в другом положении в полипептиде РУН. Дополнительная модификация может представлять собой замену аминокислоты, вставку или удаление. Например, допол- 2 020818 нительная модификация может представлять собой замену аминокислоты в положении, выбранном из А51, 852, Р54, 860, ()66, Υ68, К109, 8119, А122, 0124, Т130,
Е132, У158, К161, А175, ϋ196, К197, К199, К202, Н216, 8222, 0237, Т239, Н257, ()286,
Ь287, К290 А292, А294, Е296, М298, Ь305, 8314, 0318, Р321, К337, К341, ()366, Н373,
Р374, Е394, Р395 и К.396. Примеры таких модификаций включают ϋ196Κ, ϋ196Κ,
Ώ196Α, ϋ196Υ, ϋ196Ρ, Ш963У, ϋ196Ρ, Э1961, Κ197Υ, Κ197Α, Κ197Ε, Κ197ϋ, Κ197Ε,
Κ197Μ, Κ197Ι, К197У, Κ197Ρ, К1973У, Κ199Α, Κ199ϋ, Κ199Ε, О2373У, Ο237Τ, 02371,
О237У, Τ239Α, Κ290Α, Κ290Ε, Κ290ϋ, Κ290Ν, Κ290(), Κ290Κ, Κ290Μ, К290У, Κ341Ε,
Κ341Κ, Κ34Κ), Κ341Ν, Κ341Μ, К34Ю, О237Т238вставкаА, О237Т238вставка8,
О237Т238вставкаУ, О237Т238вставкаА8, О237Т238вставка8А, Э196К197вставкаК, О196К197вставкаК, О196К197вставкаУ, О196К197вставка\У, П196К197вставкаА,
П196К197вставкаМ, К1971198вставкаЕ, К1971198вставкаУ, К197И98вставкаА,
К1971198вставкаЗ, Т2393, Τ239Ν, Т239(), Т239У, Т239Ь, Т239Н, Τ239Ι, Е287Т, М298(),
Р321К, Р321Е, Ρ321Υ, Р3218, ()366ϋ, ()366Е, ()366Ν, ()366Т, ()3663, ()366У, ()3661,
ОЗббЬ, ()366М, Η373ϋ, Н373Е, Н3738, Н373Р, Η373Ι, Н373Р, Н373А, К1618, К161А,
К161У, Н2165, Н216А, Н216К, Н216К, 3222А, 3222К, 3222У, 3222Ν, 3222Е, 5222ϋ,
Н257А, Н2573, замена 01а из ΡΙΧ, {замена 01а из Р1Х/Е40Ь}, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}, {замена 01а из Р1Х/()443}, {замена 01а из ΡΙΧ/ΜΙ9Κ }, {замена 01а из Р1Х/М19К/
Е40Ь/К431/()445}, замена 01а из РХ, замена 01а из белка С, замена 01а из белка 8, замена 01а из тромбина, 852А, 860А, Ε394Ν, Р395А, К3965, К2025, Α292Ν, А2943,
Ο318Ν, А1753, Κ109Ν, Α122Ν, 01248, Α51Ν, Τ130Ν, Е1325, 552Ν, Р545, 8119Ν,
Р1218, Τ128Ν, Р129А, ()66Ν, Υ688,
81038111удаление/вставка()КРМЕО1СРРК\УОСР\УЕООР,
Н1158126удаление/вставка()КРМЕО1СГРКТОСР№ЕООР,
Τ128Р134удаление/вставка()КРМЕО1СРРЮУССР9/ЕООР,
81038111удаление/вставка1ЕО1СРРК\УОСЬ\УЕ,
Н1158126удаление/вставка1ЕО1СРРК№ОСГЗУЕ,
Τ128Р134удаление/вставка1ЕО1СРРК\УОСР’'УЕ,
81038111удаление/вставкаО1СРРК\УОСР''УЕО,
Η1158126удаление/вставкаО1СРРКАУОСР\УЕО,
Т128Р134удаление/вставкаО1СРРК\УОСЬ^ЕО, Р406вставка1ЕО1СРРКЗУОСЬ\У, Р406вставкаООО81ЕО1СРРК^ОСР^, Р406ветавкаО1СРРКАУОСР\УЕО, Р406вставкаООО8О1СРРКАУОСГ\УЕО ,81038111удаление/вставка5РОКОО1КЮУ,
Н1158126удаление/вставка5РОКОО1КЫУ, ΤΙ27Р134удаление/вставка8РОКОП1КМУ, Р406ветавкаС5РОКОО1К№УС, Р406вставкаООО8С5РОКООПШУС, У158Т, У158О,
Ь287Т, Е296У, М298К и М298().
Примеры предусмотренных в данной заявке модифицированных полипептидов РУН включают полипептиды, содержащие модификации
- 3 020818 (5286К/М298(2, (3286К/замена
01а из ΡΙΧ, (3286К/Н257А, р286К78222А, (2286К/5222А/Н257А, (2286К/3222А/замена О1а из ИХ, О286К/Н257А/замена 01а из ИХ, 0286К.78222А/Н257А/ замена 01а из ИХ, (}286К/М298р/К341<3, <3286К/М298(5/К199Е, р286К/М298(}/замена О1а из ИХ,
Р286К/(2366У, ρ286Κ/Α292Ν/Α2948/0366ν, А1753/О286К/Р366У,
3222А/<3286К/р366У, Н2578/0286К, Н2578/р286К/0366У,
3222А/Н257А/О286Е/О366У, О286К/Н373А, 3222А/Н257А/р286К/М158(3, (2286К/К34Ю, ζ)286Κ/ρ366ϋ, Ο286Κ/Ρ366Ν, р286К/М298(ДО366О,
Ρ286Κ/Μ298ρ/<3366Ν, (2286К/Н373Р, (5286К/М298О/Н373Р, {замена 01а из Р1Х/Е40Ь}/(3286К/М298р, {замена 01а из ИХ/К431}/(}286К/М298<5, {замена 01а из ИХ/(}443}/р286К/М2989, {замена 01а из ИХ/М19К}/(3286К/М298(3, {замена 01а из
ИХ/М19К/Е40Ь/К431/р448}/р286К/М298Р,Т128Ы/Р129А/р286К,
Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Μ298Ρ,Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Η373Ε, νΐ58ϋ/ζ)286Κ/Ε296ν/Μ298(3, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α/Ρ286Κ., замена 01а из ΡΙΧ/ΊΊ28Ν/Ρ129Α/<5286Κ/Μ298(2, Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/Η257Α/Ο286Κ/Μ2989, Τ128Ν/Ρ129Α/Ρ286Κ/Μ298Ρ/Η373Ρ, 352А/360А/(2286К., замена 01а из
ИХ/852А/860А/8222А/(2286К, 352А/360А/(}286К/М298р, замена 01а из ИХ/852А/860А/р286К/М298(}, 852А/560А/3222А/Н257А/9286К/М298(2,
552Α/860Α/ζ)286Κ/Η373Ρ/, 352А/360А/(}286К/М2989/Н373Р, Т239У/(}286К, замена 01а из Р1Х/8222А/Т239У/()286К, Т239У/р286К/М298(2,
3222А/Т239У/Н257А/р286К/М298(3, замена О1а из ИХ/Т239У/(}286К/М298(3 ,
Т239У/О286КУН373Р, Т239У/О286К/М298О/Н373Р, Т2391/()286К, замена 01а из ИХ/3222А/Т2391/(2286К, Т2391/(2286К/М298<3,
3222А/Т2391/Н257А/(2286К/М298(3, замена 01а из ΡΙΧ/Τ239Ι^286Κ/Μ298ς,
Т2391/(3286К/Н373Р, Т2391/р286К/М298(}/Н373Р, замена 01а из ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ/Η373Ρ, замена 01а из ИХ/8222А/(}286К/М298р, замена 01а из ИХ/8222А/<3286К/М298(3/Н373Р, У158О/0286К/Е296У/М298(уН373Р,
Н257А/(}286К/М298Р, Н2573/р286К/М298О, замена 01а из ИХ/8222А/Н2578/(}286К/, 3222А/Н2573/(2286К/М298(2, Н2573/9286К/М298(уН373Р,
3222А/р286К/М298(3/Н373Р, 3222А/(}286К/М298(2, Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/<2286Κ, Α122Ν/Ο1248/Α1753/<2286Κ, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/8222А/р286Е, замена 01а из ΡΙΧ/Α122Ν/Ο1243/Α1753/3222Α/0286Κ,
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758^286Κ/Μ298<}, Α122Ν/Ο1248/Α1758/(}286Κ/Μ298(}, Т128Н/Р129А/А1758/8222А/Н257А/Р286К/М298О,
Α122Ν/01248/А175 8/8222А/Н257А/<3286К/М298р,
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/Ρ286Κ7Μ298Ρ/Η373Ρ,
Α122Ν/Ο1243/Α1753/0286Κ/Μ298Ρ/Η373Ρ, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/<}286Κ/Μ298(2,
Τ128Ν/Ρ129Α^286Κ/Μ298Ο^366Ν, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/(}286Κ/Μ298<3/(3366Ν, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/ρ286Κ/Μ298ρ/ρ366Ν,
VI58ϋ/ρ286Κ/Ε296ν/Μ298<3, Τ128Ν/Ρ129Α/9286Κ/Μ298(3/9366Ν/Η373Ρ, Τ239ν/ρ286Κ/Μ298(2/(2366Ν, Τ239Ι/<3286Κ/Μ298<3/ζ)366Ν,
Τ128Ν/Ρ129 Α/Τ239ν/ζ)286Κ7Μ2980,
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/Τ239ν/Η257Α/Ο286Κ/Μ298Ο,
Т128Н/Р129А/Т239У/р286К/М298р/Н373Р, Τ128Η/Ρ129Α/Τ239Ι/9286Κ/Μ298Ο или Τ128Ν/Ρ129А/Т2391/(}286К/М298р/Н373Р.
В заявке предусмотрены модифицированные полипептиды РУ11, содержащие две или более моди- 4 020818 фикаций в полипептиде РУН, их аллельные или видовые варианты или их активные фрагменты. По меньшей мере одна из модификаций в таких полипептидах находится в положении, соответствующем положению 0286 в полипептиде РУ11 с последовательностью аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, или в соответствующих остатках в полипептиде РУ11, предусмотренном в настоящем документе, при условии, что модификация в положении 0286), отдельно или в сочетании с любой другой модификацией, не приводит к введению нового сайта гликозилирования по сравнению с немодифицированным полипептидом РУ11. Такие модификации могут представлять собой замены аминокислот, вставки или удаления. Например, модификация в положении 0286) может представлять собой замену на аминокислоту, выбранную из Лгд (К), Ьуз (К) Ηΐδ (Н), Туг (Υ), О1у (О), Рйе (Р), Ме! (М), 11е (I), Ьеи (Ь), Уа1 (V), Рго (Р), О1и (Е), Тгр(\У), Азр (Ό) и Суз (С). В некоторых примерах, модификация представляет собой О286К. Одна или несколько других модификаций может быть выбрана из модификаций
Ш96К, Ώ196Κ, Ώ196Α, ϋ196Υ,
Ш96Р, ϋ196Ψ, Ш96Ь, Ш961, Κ197Υ, Κ197Α, Κ197Ε, Κ197ϋ, К197Ц Κ197Μ, Κ197Ι,
К197У, Κ197Ρ, К197АУ, Κ199Α, Κ199ϋ , Κ199Ε, О237УУ, Ο237Τ, 02371, О237У, Τ239Α,
Κ290Α, Κ290Ε, Κ290ϋ, Κ290Ν, Κ2900, Κ290Κ, Κ290Μ, К290У, Κ341Ε, Κ341Κ, К34Щ,
Κ341Ν, Κ341Μ, Κ341Ώ, О237Т238вставкаА, О237Т238вставка8, О237Т238вставкаУ, О237Т238вставкаА8, О237Т238вставка8А , О196К197вставкаК, О196К197вставкаК, О196К197вставкаУ, О196К197вставка\\ф О196К197вставкаА, О196К197вставкаМ, К197И98вставкаЕ, К1971198вставкаУ, К1971198вставкаА, К1971198вставка8, Т2398,
Τ239Ν, Т239О, Т239У, Т239Ь, Т239Н, Τ239Ι, Е287Т, Р321К, Р321Е, Ρ321Υ, Р3218,
Ο366ϋ, О366Е, Ο366Ν , (5366Т, 03668, О366У, ¢)3661, ОЗббЬ, О366М, Η373ϋ, Н373Е,
Н3738, Н373Р, Н373А, К1618, К161А, К161У, Н2168, Н216А, Н216К, Н216К, 8222А,
8222К, 8222У, 8222Ν, 8222Е, 8222ϋ, Н257А , Н2573, замена О1а из ГОС, {замена 01а из РОС/Е40Ь}, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}, {замена 01а из ΡΙΧ/0448}, {замена 01а из ΡΙΧ/Μ19Κ}, {замена О1а из РОС/М19К/Е40Ь/К431/0443}, замена 01а из РХ, замена О1а из белка С, замена О1а из белка 8, замена 01а из тромбина, 852А, 860А, Ε394Ν, Р395А,
К.3963, К2023, Α292Ν, А2943, Ο318Ν, А1758, Κ109Ν, Α122Ν, 01248, Α51Ν, Τ130Ν ,
Е1328, 352Ν, Р548, 8119Ν, Ы218, Τ128Ν, Р129А, Ο66Ν, Υ688,
81038111удаление/вставка0КЕМЕО1СЕРКтеСЬ\УЕООР,
Η11581 гбудаление/вставкаОКЬМЕОЮЬРКАУОСЬУУЕООР,
ΤΙ 28Р134удаление/вставка0КЕМЕО1СЕРК\УОСЕ\УЕООР,
81038111удаление/вставка1Е01СЕРК\У0СЬАУЕ,
Η1158126удаление/вставка1ЕО1СЬРК\У ОСЬХУЕ,
ΤΙ 28Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРЮ¥ОС1ЛУЕ,
81038111удаление/вставкаО1СЕРКАУОСЕ5УЕО,
Η1158126удаление/вставкаО1СЕРК\УОСЬ\УЕО,
ΤΙ28Р134удаление/вставкаО1СЕРКАУОСЬАУЕО, Р406вставка1ЕО1СЕРКАУОСЬ\У, Р406вставкаООО81ЕО1СЕРКАУОСЫУ, Р406вставкаО1СЕРК\УОСЕ\УЕО, Р406вставкаОООЗО1СЕРК\¥ОСЫУЕО, 31033111 удал ение/вставкаЗРОКООПОАф Н1158126удаление/вставка8РОКОО1КЛУ, ΤΙ 27Р134удаление/вставка8РОКОО1КЛУ, Р406вставкаС8РОКОО1ККУС, Р406вставкаООО8С8РОКОО1КНУС, У158Т, У158О,
Ь287Т, Е296У, М298К и М298О.
В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУ11 включают модификацию в положении, соответствующем положению Р54, 066, Ь121, А122, Р129 или Е132 в полипептиде РУ11 с аминокислотной последовательностью, приведенной в ЗЕО ГО N0: 3, или включают модификацию в соответствующих остатках в полипептиде РУИ. Примеры модификаций включают Р543, Ο66Ν, Ь1213, Α122Ν, Р129А и Е1323. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУ11, содержащие модификацию в положении, соответствующем Р54, 066, Ь121, А122, Р129 или Е132, также содержат одну или несколько дополнительных модификаций, включая замену аминокислоты, вставку и удаление в другом положении полипептида РУ11. Такие модификации включают Р543, 352Ν, Υ583, 3119Ν, О1243, Τ128Ν, Τ130Ν, ν158Ό, А1753, 3222А, О2413, Е296У, М2980, Е394Ч Р395А, К3963, Ο318Ν и О366У. Таким
- 5 020818 образом, примеры сочетания модификаций полипептида РУН, предусмотренные здесь, включают 8119Я/Ь1218, ΤΙ 28Ν/Ρ129А, А122Ν/Ο1248, А122Ν/Ο1248/А1758,
Α122Ν/Ο1248/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968, Α122Ν/Ο1248/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ.3968/Ο318Ν, Α122Ν/Ο1248/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968, 852Ν/Ρ548/Α122Ν/Ο1248/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968, 352Ν/Ρ543, 8119ЖЛ213/А1753, Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758, Τ130Ν/Ε1323, 066Ν/Υ688,
Τ128Ν/Ρ129А/У158О/Е296У/М2980, ΤΙ28Ν/Ρ129А/8222А,
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/(5366ν, Α122Ν/Ο1243/Α1753/0366ν,Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/3222Α, Α122Ν/Ο1248/Α1758/8222Α , Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ο и Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ο/Η373Ρ.
Кроме того, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУ11, включающие модификацию
Т2398, Т239О, Т239У, Т239Ь, Т239Н,
Τ239Ι, Р321К, Р321Е, Ρ321Υ, Р3218, 03660, Ο366Ν, О366У, 03661, ОЗббЬ, О366М,
Н373О, Н373Е, Н3738, Н373Р, Н373А, К1618, К161У, Н2168, Н216К, Н216К, 8222А,
3222К, 3222У, 8222Ώ, 3222Ν, 5222Е или Н2578 в полипептиде РУ11 с последовательностью аминокислот, приведенной в 8РС) ГО N0: 3, или в соответствующих остатках в полипептиде РУ11. Дополнительно такие модифицированные полипептиды РУ11 также могут содержать одну или несколько дополнительных модификаций в другом положении, например, в аминокислотной позиции
А51, 852, Р54, 860, $66, Υ68, К109, 8119, А122, 0124, Т130, Е132, У158, К161,
А175, 0196, К197, К199, К202, Н216, 8222, 0237, Т239, Н257, 0286, Ь287, К290 А292,
А294, Е296, М298, Ь305, 8314, 0318, Р321, К337, К341, 0366, Н373, Р374, Е394, Р395 и К.396. Примеры модификаций по этим положениям включают Ο286Ν, 0286Е, 02860,
02868, О286Т, О286К, О286К, О286А, О286У, О286М, О286Ь, 0286Υ, Ш96К, Э196К,
Э196А, ϋ196Υ, Ώ196Ρ, Ο196Ψ, О196Ц 01961, Κ197Υ, К197А, К197Е, К197Ц К197Ь,
К197М, Κ197Ι, К197У, К197Р, Κ197Ψ, К199А, К199Ц К199Е, Ο237Ψ, О237Т, 02371,
О237У, Т239А, К290А, К290Е, К290О, Κ290Ν, К290О, К290К, К290М, К290У, К341Е,
К341К., К341О, Κ341Ν, К341М, К34ГО, О237Т238вставкаА, О237Т238вставка8, О237Т238вставкаУ, О237Т238вставкаА8, О237Т238вставка8А, О196К197вставкаК, О196К197вставкаК, О 196К197вставкаУ, О 196К197вставка\У, О196К197вставкаА, О196К197вставкаМ, К1971198вставкаЕ, К197И98вставкаУ, К197И98вставкаА, К1971198вставка8, Т2398, Τ239Ν, Т239О, Т239У, Т239Ь, Т239Н, Τ239Ι, Ь287Т, Р321К,
Р321Е, Ρ321Υ, Р3218, 03660, О366Е, Ο366Ν, О366Т, 03668, О366У, 03661, О366Ц О366М, Η373ϋ, Н373Е, Н3738, Н373Р, Н373А , К1618, К161А, К161У, Н2168, Н216А,
Н216К, Н216К, 3222А, 8222К, 3222У, 3222Ν, 3222Е, 82220, Н257А, Н2573, замена 01а из ΡΙΧ, замена О1а из РХ, замена О1а из белка С, замена О1а из белка 8, замена 01а из тромбина, замена О1а из ΡΙΧ, {замена 01а из Р1Х/Е40Ь}, {замена О1а из ΡΙΧ/Κ43Ι}, {замена 01а из ΡΙΧ/0443}, {замена 01а из Р1ХУМ19К), {замена О1а из Р1Х/М19К/Е401УК431/0443}, 352А, 360А, Ε394Ν, Р395А, К3963, К2023, Α292Ν, А2943,
Ο318Ν, А1758, Κ109Ν, Α122Ν, 01248, Α51Ν, Τ130Ν, Е1328, 852Ν, Р548, 8119Ν,
Ы218, Τ128Ν, Р129А, 066Ν, Υ688,
8103811 1удаление/вставка0КЕМЕО1СЕРКЛУОСЕ\УЕООР,
Н1 ^З^будаление/вставкаОКЕМЕОКЗЬРК^УОСЕАУЕООР, Т128Р134удаление/вставка0КЕМЕО1СЬРКЛ\Х}СЕ\УЕООР,
8103811 Цдаление/вставкаШОЮЬРК^ОСЬ^Е,
Η1158126удаление/вставка1ЕО1СЕРК^ОСЬ^Е,
- 6 020818
Τ128Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРКЛУОСЬАУЕ,
81038111 удаление/вставкаО1СЬР1ШОСЕ\УЕО,
Η1158126удаление/вставкаО1СРРК.\¥ОСР9/ЕО,
Τ128Р134удаление/вставкаО1СЕРЮУОСЬ)УЕО, Р406вставка1ЕО1СЕРКЛУОСЬ \У, Р406вставкаООО31ЕО1СЕРК\УОСЬАУ, Р406вставкаО1СЬРКЛУОСЕ\УЕО, Р406вставкаОООЗО1СЕРЮУОСЬАУЕО, 81038111удаление/вставкаЗРОК.ООПШУ,
Η1158126удаление/вставкаЗРОК.ОО1КЯ V, Τ127Р134удаление/вставка8Р ΟΚΟϋΙΚΝν, Р406вставкаС8РОКОО1К14УС, Р406вставкаОООЗСЗРОКООПШУС, У158Т, У158О,
Ь287Т, М298К и М298(). Таким образом, комбинация модификаций может включать модификации (2366О/Н373Е, О366У/Н373У, О366У/Н373Ь, О366У/Н3731,
8222К/Н257А, Н216А/8222А, 82228/замена О1а из ΡΙΧ, 8222А/Н257А/замена О1а из ΡΙΧ, 8222А/М298О, 3222А/Н257А/М2980, 8222Α/Α292Ν/Α2948/0366ν,
А1758/8222А/О366У, 8222А/0366У, Н2578/0366У, 8222А/Н373А, М298О/Н373Р, 852А/860А/8222А, 8222А/Т239У, У158О/Т239У/Е296У/М298(5, 8222Α/Τ239Ι,
У158О/Е296У/М2980/Н373Р, замена 01а из Р1Х/(}366У, Μ298<2/<2366Ν/Η373Ρ, Т239У/М298О/Н373Р и Τ239Ι/Μ298Ο/Η373Ρ.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие две или более модификаций в полипептиде РУ11, их аллельные и видовые варианты или активные фрагменты, в которых две или более модификаций аминокислот выбраны из модификаций аминокислот Н216А, Н257А, Ε394Ν, Р395А, К3968, Κ109Ν, Α292Ν, А1758, Н257А и замена О1а из Р1Х. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУ11 относятся к полипептидам с модификациями, выбранными из Н216А/Н257А, Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968 и Κ109Ν/Α1758. Кроме того, также могут быть включены модификации М1298С) или А2948. Таким образом, в настоящем документе также предусмотрены модифицированные полипептиды РУ11, включающие модификации, выбранные из Н216А/Н257А, Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968 и Κ109Ν/Α1758. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУ11 также содержат соответствующие модификации М1298С) или Α2948. Это может привести, например, к модифицированным полипептидам РУ11, включающим модификации I Ι257ΑΑ1298() или Κ109Ν/Α292Ν/Α2948. Также в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУ11, включающие модификации 852Α/860Α/ν158Ώ/Ε296ν/Μ298ρ или У158Э/Т2391/Е296У/М298.
В некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУ11 содержат связывающую сывороточный альбумин последовательность, такую как последовательность аминокислот, приведенная в любой из последовательностей 8ΕΡ ГО ΝΟ: 103-109, или ее часть, достаточную для связывания сывороточного альбумина. Такие модифицированные полипептиды РУ11 могут проявлять повышенную аффинность к сывороточному альбумину или повышенную способность связывать сывороточный альбумин по сравнению с немодифицированным полипептидом РУ11. Например, модифицированные полипептиды РУ11, содержащие связывающую сывороточный альбумин последовательность, могут обладать повышенной аффинностью или повышенной способностью связывать сывороточный альбумин по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более. Связывающая сывороточный альбумин последовательность может заменить непрерывную последовательность аминокислотных остатков немодифицированного полипептида РУН. Модифицированные полипептиды РУ11, содержащие связывающую сывороточный альбумин последовательность, могут содержать модификации, выбранные из
- 7 020818
81038111удаление/вставка9К.ЬМЕО1СЬРК\УОСЬ^ЕООР,
Н1153126удаление/вставкарКЕМЕО1СЕРКУОСЕУЕООР,
Т128Р134удаление/вставкарКЕМЕШСЕРКУОСЕУЕООР,
8103811 будаление/вставкаШОТСЕРКУССЬУЕ,
Η1158126удаление/вставка1ЕО1СЕРКУ ОСЕУЕ,
Т128Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРК.\УОСЕ\УЕ,
81038111удаление/вставкаО1СЕРКЛУОСЕУЕО,
Н1155126удаление/вставкаО1СЕРКЛУОСЕУЕО,
Т128Р134удаление/вставкаО1СЕРКЛУСгСЕУ Εϋ, Р406вставка1ЕО1СЬРКЛУОСЕ\У, Р406вставкаООО81ЕО1СЕРКУОСЕУ, Р406вставкаШСЕРКУОСЕУЕО и Р406вставкаООО8О1СЕРКУОСЕУЕО.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие связывающую интегрин тромбоцитов ацьЗз последовательность. Такие модифицированные полипептиды РУН могут проявлять повышенную аффинность или связывание с интегрином тромбоцитов аПъ33 по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Например, модифицированные полипептиды РУ11, содержащие связывающую интегрин тромбоцитов αιιπβ3 последовательность, могут обладать аффинностью или связыванием с интегрином тромбоцитов аПъ33 повышенным по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с немодифицированным полипептидом РУ11. Примеры связывающей сывороточный альбумин последовательности, которая может заменить непрерывную последовательность аминокислотных остатков немодифицированного полипептида РУН, включают последовательности аминокислот, приведенные в любой из 8ЕР ГО N0: 110-112, или их части, достаточные для связывания интегрина тромбоцитов аць33. Модифицированные полипептиды РУН содержат модификации, выбранные из
81038111удаление/вставка8РОКООНШУ, Н1158126удаление/вставкаЗРОКОО1РНУ, Т127Р134удаление/вставка8РОК.ОО1КНУ, Р406вставкаСЗРОКСГО1КНУС и Р406вставкаООО8С8РОКОО1КНУС.
Модифицированные полипептиды РУН, содержащие связывающие сывороточный альбумин или интегрин тромбоцитов аПъ33 последовательности, также могут содержать одну или несколько дополнительных модификаций в других положениях полипептида РУН, таких как замена аминокислоты в положении, соответствующем положению О237У. Таким образом, в настоящем документе также предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие модификации, выбранные из 81038111удаление/вставкаПГО1СЕРК.УОСЕУЕ/О237У,
81038111удаление/вставкаО1СЕРКУОСЕУЕО/Сг237У,
Н1153126удаление/вставка9КЕМЕО1СЬРКтеСЕАУЕООР/О237У,
Н1158126удаление/вставка1ЕО1СЬРКУОСЕУЕ/О237У,
Н1158126удаление/вставкаГЖЛ ТКЖХ'ЕУ ЕО/О237V,
Т128Р134удаление/вставка(2К.ЕМЕО1СЕРК.УОСЕУЕООР/О237У,
Т128Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРКУ ОСЬУЕ/023 7У,
81038111удаление/вставкарКЕМЕО1СЕРКУОСЕУЕООР/О237У и
Т128Р134удаление/вставкаВ1СЕРК.УОСЕУЕО/О237У.
В некоторых примерах в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более модификаций. В дополнительных примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУЛ содержат гетерологичный домен О1а или его часть, достаточную для связывания фосфолипидов. Такие полипептиды могут проявлять повышенную аффинность или повышенное связывание с фосфолипидами по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, например аффинность или связывание с фосфолипидами, повышенные по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более. Гетерологичные домены О1а могут быть выбраны из домена О1а фактора IX (Р1Х), фактора X (РХ), протромбина, белка С, белка 8, остеокальцина, матриксного белка О1а, Огоу1й-агге§1-8рес1Йс белка 6 (Оа§6) и белка Ζ и в некоторых примерах могут иметь последовательность
- 8 020818 аминокислот, приведенную в любой из 8ΕΘ ГО N0: 83-91, 93 и 94, или ее часть, достаточную для связывания фосфолипидов. Нативный домен С1а фактора РУН или его непрерывная часть, которая может включать аминокислоты 1-45 в полипептиде РУН с последовательностью аминокислот, приведенной в 8К() ГО N0: 3, или соответствующие остатки в полипептиде РУН, можно удалить и заменить гетерологичным доменом С1а, или его частью, достаточной для связывания фосфолипидов. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУ11 могут обладать повышенной устойчивостью к антитромбину III по сравнению с немодифицированным полипептидом РУ11. Такие модифицированные полипептиды РУ11 могут обладать большей устойчивостью к антитромбину III по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с устойчивостью немодифицированного полипептида РУН. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН также могут обладать повышенной каталитической или коагулянтной активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, например повышенной по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% и более по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Кроме того, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут обладать повышенной устойчивостью к ТРИ по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Такие модифицированные полипептиды РУН могут быть более устойчивы к ТРИ по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% и более по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН также могут обладать повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη2+ по сравнению с немодифицированными полипептидами РУН. Например, модифицированные полипептиды РУН могут быть более устойчивы к ингибиторному эффекту Ζη2+ по меньшей мере приблизительно на 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% и более по сравнению с немодифицированными полипептидами РУН.
В некоторых примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН содержат одну или несколько модификаций, которые вводят и/или ликвидируют один или несколько сайтов гликозилирования по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Например, 1, 2,
3, 4, 5, 6 или более сайтов гликозилирования могут быть введены или ликвидированы. Сайты гликозилирования, которые могут быть введены или ликвидированы, включают сайты Ν-гликозилирования и Огликозилирования. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать одну или несколько других модификаций аминокислот, повышающих устойчивость к антитромбину-Ш, увеличивающих связывание и/или аффинность к фосфолипидам, повышающих аффинность к тканевому фактору, увеличивающих собственную активность, увеличивающих ТФзависимую активность, увеличивающих коагулянтную активность, изменяющих конформацию полипептида для изменения зимогенности, увеличивающих каталитическую или коагулянтную активность, сдвигающих равновесие между высокоактивной и менее активной конформациями РУНа в пользу высокоактивной конформации, повышающих устойчивость к протеазам, уменьшающих гликозилирование, увеличивающих гликозилирование, снижающих иммуногенность, повышающих стабильность и/или способствующих связыванию химических групп. В некоторых примерах измененная зимогенность относится к более зимогенподобной форме или менее зимогенподобной форме.
В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, содержат одну или несколько других модификаций аминокислот, выбранных из
8279С/У302С, Ь280С/М301С, У281С/У302С,
8282С/У299С, вставки тирозина в положение 4, Р48, Р4Т, Р10(}, Р10Е, ΡΙΟϋ, Ρ10Ν, (}21Ν, К28Р, К28Е, 130С, Ι30ϋ, Ι30Ε, Κ32ϋ, Κ32(}, Κ32Ε, Κ32Ο, Κ32Η, Κ32Τ, К32С,
- 9 020818
К32А, К323, РЗЗС, ИЗЗР, ϋ33Ε, ϋ33Κ, А34С, А34Е, Α34ϋ, Α34Ι, А34Ь, Α34Μ, А34У, Α34Ρ, А34АУ, Α34Υ, Κ36ϋ, Κ36Ε, Т37С, Τ37ϋ, Τ37Ε, К38С, Κ38Ε, Κ38Τ, Κ38ϋ, К38Ь, Κ38Ο, Κ38Α, Κ388, Κ38Ν, Κ38Η, Ь39Е, Ь39<3, Ь39Н, Ψ41Ν, АУ41С, УУ41Е, АУ4Ю, Ι42Κ, Ι42Ν, 1428, Ι42Α, 142(2, Ι42Ν, 1428, Ι42Α, Ι42<2, Ι42Κ, 343<2, 343Ν, Υ44Κ, Υ44Ο, Υ44ϋ, Υ44Ε, 845С, 845ϋ, 845Ε, ϋ46Ο, Α51Ν, 853Ν, Ο58Ν, 0598, Ο59Τ, Κ62Ε, Κ62Κ, Κ62ϋ, Κ62Ν, Κ62(2, Κ62Τ, Ь65(2, Ь658, Ε65Ν, Р7Ю, Ρ71Υ, Ρ71Ε, Ρ7Κ2, Ρ71Ν, Ρ743, Ρ74Α, Α75Ε, Α75ϋ, Ε77Α, Ε82(2, Ε82Ν, Ε828, Ε82Τ Τ83Κ, N958, Ν95Τ, 0978, Ο97Τ, Υ1Ο1Ν, ϋ104Ν, Τ106Ν, Κ109Ν, Ε116ϋ, Ο117Ν, Ο124Ν, 8126Ν, Τ128Ν, Ы41С, Ы4Ю, Ы41Е, Ε142ϋ, Е142С, К143С, Κ143ϋ, Κ143Ε, Κ144Ε, К144С, Κ144ϋ, Ν145Υ, N1450, Ν145Ρ, Ν145Μ, N1458, N1451, Ν145Ε, Ν145Τ, Ν145ν, Ν145Ρ, Ν145Κ, Ν145Η, N145(2, Ν145Ε, Ν145Κ, Ν145ΧΥ, Ν145ϋ, N1450, К157У, К157Ь, Κ157Ι, Κ157Μ, Κ157Ρ, Κ157λΥ, Κ157Ρ, Κ157Ο, Κ1573, Κ157Τ, К157С, Κ157Υ, Κ157Ν, Κ157Ε, Κ157Κ, Κ157Η, К157Э, Κ157<2, У158Ь, У1581, У158М, У158Р, У158АУ, У158Р, У158О, У1588, У158Т, У158С, νΐ58Υ, νΐ58Ν, У158Е, У158К, У158К, У158Н, У158О, У158(2, Α1758, Α175Τ, Ο179Ν, 118685 1186Τ, νΐ88Ν, Κ2028, Κ202Τ, 12058, Ι205Τ, ϋ212Ν , Ε220Ν, Ι230Ν, Ρ231Ν, Ρ236Ν, Ο237Ν, (2250С, У253И, Ε265Ν, Τ267Ν, Ε270Ν, Α274Μ, А274Ь, Α274Κ, Α274Κ, Α274Ώ, А274У, Α274Ι, Α274Ρ, А274АУ, Α274Ρ, Α274Ο, Α274Τ, А274С, Α274Υ, Α274Ν , Α274Ε, Α274Η, Α2748, Α274(2, Ρ275Η, Κ277Ν, Ρ2788, Ρ278Α. Ρ278Ν, Ρ278(2, Ρ278Ο, Ε280Ν, Ь288К, Ь288С, Ь288О, ϋ289Ο, ϋ289Κ, Ь288Е, К290С, Κ290Ο, Κ290Α, Κ2908, Κ290Τ, Κ290Κ, Κ290ϋ, Κ290Ε, Ο291Ε, О29Ю, О291С, Ο291Ν, Ο291Κ, А292С, Α292Κ, Α292ϋ, Α292Ε, Τ293Κ, Е296У, Ε296Σ, Ε296Ι, Ε296Μ, Ε296Ρ, Е296АУ, Ε296Ρ, Ε296Ο, Ε2968, Ε296Τ, Е296С, Ε296Υ, Ε296Ν, Ε296Κ, Ε296Κ, Ε296Η, Ε296ϋ, Ε2960, Μ298Ο, М298У, М298Ь, Μ298Ι, Μ298Ρ, Μ298Ψ, Μ298Ρ, Μ298Ο, Μ2988, Μ298Τ, М298С, Μ298Υ, Μ298Ν, Μ298Κ, Μ298Κ, Μ298Η, Μ298Ε, М298Э, Ρ3033, Ρ303Τ, Κ304Υ, Κ304Ρ, К304Ь, Κ304Μ, Κ304Ο, Κ304Τ, Κ304Α, Κ3048, Κ304Ν, Ь305У, Ε305Υ, Ι305Ι, Ь305Р, Ь305А, Ь305М, Ь305\У, Ь305Р, Ь305О, Ь3058, Ь305Т, Ь305С, Ε305Ν, Ь305Е, Ь305К, Ь305К, ЬЗО5Н, Ь305О, ЬЗО5(2, Μ306ϋ, Μ306Ν, ϋ3098, ϋ309Τ, (2312Ν, (}313К, (^313ϋ, (2313Е, 8314А, 8314У, 83141, 3314М, 8314Р, 3314ЛУ, 8314Р, 83140, 8314Ь, 8314Т, 8314С, 3314Υ, 3314Ν, 3314Е, 8314К, 3314К, 3314Н, 8314ϋ, 3314(2, К315К, КЗ 150, КЗ 15А, КЗ 158, К315Т, КЗ 15(2, К315С, Κ315ϋ, К315Е, Κ316Ώ, К316С, К316Е, У317С, У317К, У317И, У317Е, Ο318Ν, N322Υ, N3220, Ν322Ρ, Ν322Μ, N3228, N3221, Ν322Ρ, Ν322Τ, Ν322ν, Ν322Ρ, Ν322Κ, Ν322Η, N322(2, Ν322Ε, Ν322Κ, Ν322\ν, N3220, 033ΙΝ, Υ3328, Υ332Α, Υ332Ν, Υ332(2, Υ332Ο, ϋ334Ο, ϋ334Ε, ϋ334Α, О334У, ϋ334Ι, ϋ334Μ, ϋ334Ρ, ϋ334λ¥, ϋ334Ρ, О334Ц ϋ334Τ, Э334С, ϋ334Υ, ϋ334Ν, Ώ334Κ, Ρ334Κ, Ρ334Η, ϋ334δ,
- 10 020818
0334(^, 83360, 8336Ε, 8336Α, 8336У, 83361, 8336Μ, 8336Ρ, 8336Ψ, 8336Ρ, ЗЗЗбЬ, 3336Τ, 8336С, 3336Υ, 3336Ν, 8336Κ, 3336Κ, 3336Η, 3336ϋ, 8336<}, К337Ь, К337У, Κ337Ι, Κ337Μ, Κ337Ρ, Κ337Ψ, Κ337Ρ, Κ337Ο, Κ3378, Κ337Τ, К337С, Κ337Υ, Κ337Ν, Κ337Ρ, Κ337Κ, Κ337Η, Κ337ϋ, Κ337(), Κ341Ρ, К34Щ, Κ341Ο, Κ341Τ, Κ341Α, Κ3418, Ο342Ν, Η348Ν, Κ353Ν, Υ357Ν, Ι361Ν, Ρ374Ρ, Ρ374Α, Р374У, Ρ374Ι, Р374Ь, Ρ374Μ, Р374ХУ, Ρ374Ο, Ρ3748, Ρ374Τ, Р374С, Ρ374Υ, Ρ374Ν, Ρ374Ρ, Ρ374Κ, Ρ374Κ, Ρ374Η, Ρ374ϋ, Ρ374ζ>, ν376Ν, Κ.379Ν, Ь390С, Ь390К, Ь39(Ю, Ь390Р, М39Ю, М391С, М391К, Μ391Ν, М391Р, К.392С, Κ.392ϋ, К.392Е, 8393ϋ, 5393С, 8393К, 8393Ρ, Ρ394Κ, Ρ395Κ, Р394С, Ρ395ϋ, Р395С, Ρ395Ρ, Κ396Κ, К396С, Κ396ϋ, Κ396Ρ, Ρ397Ώ, Ρ397Κ, Р397С,
Ρ397Ρ, Ο398Κ, О398С, Ο398ϋ, Ο398Ρ, У399С, У399Р, У399К, У399Р, Ь400К, Ь401К,
Ь401С, Ь40Ю, Ь401Р, Κ402ϋ, К.402С, К.402К, К.402Р, А403К, А403С, А403Э, А403Р,
Р404Р, Ρ404ϋ, Р404С, Р404К, Р405К, Р406С, Κ32Ν/Α343, Κ32Ν/Α34Τ, Ρ31Ν/ϋ33δ,
Ρ31Ν/Ό33Τ, Ι30Ν/Κ328, Ι30Ν/Κ32Τ, Α34Ν/Κ368, Α34Ν/Κ36Τ, Κ38Ν/Ρ403, Κ38Ν/Ρ40Τ, Τ37Ν/Ρ393, Τ37Ν/Ρ39Τ, Κ.36Ν/Κ383, Κ.36Ν/Κ38Τ, Ο9ΝΛν418, Ρ39ΝΛΥ41Τ, Ρ40Ν/Ι423, Ρ40Ν/Ι42Τ, Ι42Ν/Υ448, Ι42Ν/Υ44Τ, Υ44Ν/ϋ468, Υ44Ν/ϋ46Τ, Ο46Ν/Ώ488, ϋ46Ν/ϋ48Τ, Ο47Ν/(349δ, Ο47Ν/(}49Τ, Κ143Ν/Ν1458, Κ143Ν/Ν145Τ, Ρ142Ν/Κ.1448, Ρ142Ν/Κ144Τ, Ь14Ш/К1438, Ы4Ш/К143Т, Ι140Ν/Ρ1428,1140Ν/Ρ142Τ, Κ144Ν/Α1468, Κ144Ν/Α146Τ,
Α146Ν/Κ1488, Α146Ν/Κ148Τ, 8147Ν/Ρ1498/, 8147Ν/Ρ149Τ, Κ290Ν/Α2923,
Κ290Ν/Α292Τ, ϋ289Ν/Ο2918, ϋ289Ν/Ο291Τ, Ρ288Ν/Κ2903, Ρ288Ν/Κ290Τ,
Ρ287Ν/Ο2898, Ь287Ж)289Т, Α292Ν/Α2943, Α292Ν/Α294Τ, Τ293Ν/Ρ2958,
Τ293Ν/Ρ295Τ, Κ.315Ν/ν317δ, Κ315Ν/ν317Τ, 8314Ν/Κ3168, 3314Ν/Κ316Τ,
(2313Ν/Κ.3153, Ο313Ν/Κ315Τ, Κ316Ν/Ο3188, Κ316Ν/Ο318Τ, ν317Ν/ϋ319δ,
ν317Ν/ϋ319Τ, Κ341Ν/ϋ3438, Κ341Ν/ϋ343Τ, 8339Ν/Κ3418, 8339Ν/Κ341Τ,
Ο343Ν/Ο3458, ϋ343Ν/Ο345Τ, Κ.392Ν/Ρ3948, Κ392Ν/Ρ394Τ, Ρ390Ν/Κ.3923,
Ρ390Ν/Κ392Τ, Κ389Ν/Μ3918, Κ389Ν/Μ391Τ, 3393Ν/Ρ3953, 3393Ν/Ρ395Τ,
Ρ394Ν/Κ.3968, Ρ394Ν/Κ.396Τ, Ρ395Ν/Ρ3973, Ρ395Ν/Ρ397Τ, Κ.396Ν/Ο3988,
Κ.396Ν/Ο398Τ, Ρ397Ν/ν3998, Ρ397Ν/ν399Τ, 0398Ν/Ρ4003, 0398Ν/Ρ400Τ,
Υ399Ν/Ρ4018, Υ399Ν/Ρ401Τ, Ρ400Ν/Κ.4023, Ρ400Ν/Κ.402Τ, Ь40Ш/А4033,
Ь40Ш/А403Т, Κ402Ν/Ρ4048, Κ402Ν/Ρ404Τ, Α403Ν/Ρ4053, Α403Ν/Ρ405Τ, Ρ404Ν/Ρ4063 и Ρ404Ν/Ρ406Τ.
В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН также содержат замещение позиций 300-322, 305-322, 300-312 или 305-312 соответствующими аминокислотами трипсина, тромбина или РX или содержат замещение позиций 310-329, 311-322 или 233-329 соответствующими аминокислотами трипсина.
Примеры модифицированных полипептидов РУН, предусмотренных в настоящем документе, имеют последовательности аминокислот, приведенные в любой из ЗЕС) ΙΌ N0: 113-273. В некоторых примерах модификации вводят в немодифицированный полипептид РУ11, который представляет собой аллельный или видовой вариант полипептида, приведенного в ЗЕР ΙΌ N0: 3. Аллельный, или видовой, или другой вариант может обладать 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности с полипептидом, приведенном в ЗЕР ΙΌ N0: 3, исключая модификацию аминокислоты (аминокислот). Модифицированный полипептид РУ11, предусмотренный в настоящем документе, может представлять собой человеческий полипептид, не человеческий полипептид и/или зрелый полипептид. В некоторых примерах модифицирована только первичная последовательность. В других примерах также включены химическая модификация или пост-трансляционные модификации. Например, модифицированный полипептид РУН может быть гликозилирован, карбоксилирован, гидроксилирован, сульфатирован, фосфорилирован, альбуминирован или конъюгирован с полиэтиленгликольным (ПЭГ) фрагментом.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут представлять собой одноцепочечные полипептиды, двухцепочечные полипептиды и/или быть активными или активированными. Активация может быть осуществлена протеолитическим расщеплением в процессе самоактивации, расщеплением фактором IX (ΡΙΧ), расщеплением фактором X (РХа), расщеплением фактором XII (РХ11а) или расщеплением тромбином.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут сохранить
- 11 020818 один или более видов активности немодифицированного полипептида РУН. Например, модифицированные полипептиды РУ11 могут содержать модификации в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или в 60 аминокислотных позициях, пока полипептид сохраняет по меньшей мере одну активность немодифицированного полипептида РУН. Такие модифицированные полипептиды РУН могут сохранять по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более активности немодифицированного полипептида РУН. В некоторых примерах один или более видов активности выбраны из связывания тканевого фактора (ТФ), активации фактора X (РХ), активации фактора IX (Р1Х), связывания фосфолипидов и коагулянтной активности. Кроме того, сохраненные активности могут быть увеличены или уменьшены по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. В некоторых примерах коагулянтная активность увеличена по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, например увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РУН. Активность может быть измерена ίη νίίΓΟ, ех νίνο или ίη νίνο.
В настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие последовательность нуклеотидов, кодирующую модифицированные полипептиды РУН по изобретению. Также предусмотрены векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновой кислоты, в том числе прокариотические векторы, вирусные векторы или эукариотические векторы, такие как векторы млекопитающих. Вирусные векторы могут быть выбраны из аденовируса, адено-ассоциированного вируса, ретровируса, вируса герпеса, лентивируса, поксвируса и цитомегаловируса. В настоящем документе предусмотрены клетки, содержащие эти векторы, в том числе эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих. Примером клеток млекопитающих являются клетки почки детеныша хомяка (ВНК-21), клетки 293 или клетки СНО. В некоторых примерах клетки экспрессируют модифицированный полипептид РУН. Таким образом, в настоящем документе также предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, продуцируемые этими клетками.
В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективную концентрацию или количество любого модифицированного полипептида РУН, молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или клеток, предусмотренных в настоящем документе, в фармацевтически приемлемом носителе. В некоторых примерах фармацевтическая композиция составлена для локального, системного или местного введения, такого как оральное, носовое, легочное, буккальное, трансдермальное, подкожное, интрадуоденальное, энтеральное, парентеральное, внутривенное или внутримышечное введение. Фармацевтические композиции также могут быть составлены для контролируемого высвобождения и/или введения одной дозой.
В настоящем документе предусмотрены способы лечения введением субъекту предусмотренной в настоящем документе фармацевтической композиции, где субъект страдает заболеванием или состоянием, которое поддается лечению введением РУН или прокоагулянта, например введением активного РУН (РУНа). В некоторых примерах лечение фармацевтической композицией улучшает или смягчает симптомы, связанные с заболеванием или состоянием. В других примерах способы лечения, предусмотренные в настоящем документе, также включают наблюдение за изменением у субъекта симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, которое подвергается лечению введением РУН или прокоагулянта. Заболевания или состояния, подвергающиеся лечению по способам, предусмотренным здесь, могут быть выбраны из нарушений свертывания крови, гематологических нарушений, геморрагических расстройств, гемофилий (таких как гемофилия А, гемофилия В или гемофилия С, врожденная или приобретенная гемофилия), дефицита фактора УН и нарушений, связанных с кровотечением, в том числе кровотечением, вызванным операцией (такой как операция на сердце, ангиопластика, операция на легких, абдоминальная операция, операция на позвоночнике, операция на головном мозге, операция на сосудах, стоматологическая операция или трансплантация органов) или травмой. В некоторых примерах, кровотечение проявляется в виде острых гемартрозов, хронической гемофильной артропатии, гематомы, гематурии, кровотечения в центральной нервной системе, желудочно-кишечного кровотечения или кровоизлияния в мозг. В дополнительных примерах кровотечение происходит из-за удаления зубов. Трансплантационная хирургия может представлять собой трансплантацию костного мозга, сердца, легких, поджелудочной железы и печени.
В некоторых примерах предусмотренный здесь способ лечения может быть использован для лечения субъекта, который вырабатывает аутоантитела к фактору УШ или фактору IX. Способы, предусмотренные здесь, также могут включать введение одного или нескольких дополнительных факторов свертывания крови, таких как очищенные из плазмы или рекомбинантные факторы свертывания, прокоагулянтов, включая витамин К, производные витамина К и ингибиторы белка С, плазмы, тромбоцитов, эритроцитов и кортикостероидов или лекарственных средств.
В настоящем документе предусмотрены изделия, содержащие упаковочный материал и фармацевтическую композицию, предусмотренную в настоящем документе, помещенную в упаковочный материал. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН, содержащиеся в фармацевтической композиции, эффективны для лечения связанного с РУН заболевания или нарушения, а упаковочный
- 12 020818 материал включает этикетку, указывающую, что модифицированные полипептиды РУН используют для лечения связанного с РУП заболевания или нарушения. Кроме того, в настоящем документе предусмотрены комплекты, включающие описанную здесь фармацевтическую композицию, устройство для введения композиции и, при необходимости, инструкции для введения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен каскад свертывания крови. Показаны внутренний и внешний пути свертывания, приводящие к независимому образованию РХа, и схождение путей в общей путь для образования тромбина и фибрина с образованием сгустка. Эти пути взаимосвязаны. На чертеже изображен порядок молекул, участвующих в активации каскада, в котором зимоген преобразуется в активированную протеазу путем расщепления одной или нескольких пептидных связей. Активированная протеаза затем служит активирующей протеазой для следующей молекулы зимогена в каскаде, что, в конечном счете, приводит к образованию сгустка.
На фиг. 2 приведена клеточная модель свертывания (см., например, НоГГтап и др., (2001) ТЬготЬ Наеток! 85:958-965). Изображены акты коагуляции, разделенные на три этапа, где начало коагуляции осуществляется путем активации РХ с образованием РХа под действием ТФ/РУПа комплекса на несущей ТФ клетке, в результате чего образуется небольшое количество тромбина в результате активации РХа/ РУа комплексом. Усиление каскада происходит при связывании тромбина с тромбоцитами и их активации, что инициирует активацию достаточного количества соответствующих факторов свертывания крови для образования РУ111а/Р1Х и РУа/РХа комплексов. Распространение коагуляции происходит на поверхности большого количества активированных тромбоцитов в месте повреждения, что приводит к быстрому увеличению количества тромбина, образующего достаточное количество фибрина из фибриногена для формирования сгустка в месте повреждения.
На фиг. 3 приведены механизмы, посредством которых РУПа могут инициировать образование тромбина. Фиг. 3 иллюстрирует ТФ-зависимый путь образования тромбина фактором РУ11а, который действует на поверхности ТФ-несущей клетки и включает образование комплекса РУ11а с ТФ для активации РХ с образованием РХа. На фигуре также показаны ТФ-независимые пути образования тромбина фактором РУ11а, в ходе которых РУ11а связывается с фосфолипидами на поверхности активированных тромбоцитов и активирует РХ в РХа, который, в свою очередь, образует комплекс с РУа и расщепляет протромбин с образованием тромбина.
Подробное раскрытие изобретения
Последовательность изложения.
A. Определения
B. Обзор гемостаза
1. Адгезия и агрегация тромбоцитов
2. Свертывание
a. Инициация
b. Усиление
c. Распространение
3. Регуляция свертывания
C. Фактор У11 (РУП)
1. Структура и организации РУ11
2. Пост-трансляционные модификации
3. Процессинг РУ11
4. Активация РУ11
5. Функции РУ11
a. Зависимая от тканевого фактора активность РУ11а
b. Не зависимая от тканевого фактора активность РУ11а
6. РУ11 как лекарственное средство
Ό. Модифицированные полипептиды РУ11
1. Увеличение каталитической активности
а. Примеры изменений для увеличения каталитической активности
1. Основные аминокислотные замены в положении 286.
II. Другие мутации в положении 286.
2. Повышенная устойчивость к АТ-ΙΙΙ. Примеры модификаций для достижения повышенной устойчивости к АТ-ΙΙΙ.
3. Повышенная устойчивость к ингибированию Ζη2+. Примеры модификаций для повышения устойчивости к ингибированию Ζη2+.
4. Изменение гликозилирования. Примеры модификаций для изменения гликозилирования.
5. Увеличение связывания сывороточного альбумина и/или интегрина тромбоцитов αΙΛβ3.
a. Примеры полипептидов РУП со связывающей сывороточный альбумин последовательностью.
b. Примеры полипептидов РУП со связывающей интегрин тромбоцитов απ1,β3 последовательностью
- 13 020818
6. Модификация введением гетерологичного домена С1а
7. Дополнительные модификации и их комбинации
a. Модификации, которые повышают устойчивость к ΤРРI
b. Модификации, которые увеличивают собственную активность
c. Модификации, которые повышают устойчивость к протеазам
б. Модификации, которые повышают аффинность к фосфолипидам е. Модификации, которые изменяют гликозилирование £. Модификации, которые облегчают связывание химических групп
д. Примеры сочетания мутаций
Е. Получение полипептидов РУН
1. Векторы и клетки
2. Системы экспрессии
a. Прокариотические системы экспрессии
b. Дрожжи
c. Насекомые и клетки насекомых б. Клетки млекопитающих
е. Растения
2. Очистка
3. Гибридные белки
4. Модификации полипептидов
5. Нуклеотидные последовательности
Р. Оценка активности модифицированных полипептидов РУН
1. Ш νΐίτο тесты
a. Пост-трансляционные модификации
b. Протеолитическая активность
c. Коагулянтная активность
6. Связывание с другими белками и/или ингибирование другими белками е. Связывание фосфолипидов
2. Не человеческие животные модели
3. Клинические анализы
С. Композиции и введение
1. Композиции
a. Дозировки
b. Лекарственные формы
2. Введение модифицированных полипептидов РУН
3. Введение нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированные полипептиды РУН (генная терапия)
H. Терапевтическое применение
I. Врожденные связанные с кровоточивостью нарушения
a. Гемофилии
b. дефицит РУН
c. другие
2. Приобретенные нарушения свертываемости крови
a. приобретенная в результате химиотерапии тромбоцитопения
b. другие коагулопатии
c. кровотечение вследствие трансплантации
б. кровотечение вследствие антикоагулянтной терапии е. приобретенная гемофилия
3. Кровотечения вследствие травмы и хирургического вмешательства
I. Комбинированная терапия
ί. Изделия и комплекты
К. Примеры
А. Определения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют тот же смысл, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Если не указано иное, все патенты, заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности СепЬапк, базы данных, веб-сайты и другие опубликованные материалы, упомянутые в настоящем документе, приведены в качестве ссылки в полном объеме. Если для упоминаемого в настоящем документе термина существует множество определений, предпочтительно приведенное в этом разделе определение. В случае приведения ссылки на ИКЬ или другого подобного идентификатора или адреса понимается, что идентификатор может изменяться и информация в сети Интернет может появляться и исчезать, но аналогичную информацию можно найти в сети Интернет. Подобная ссылка свидетельствует о наличии ин- 14 020818 формации и открытом доступе. В настоящем документе термины путь свертывания или свертывание относятся к серии актов активации, которые приводят к образованию нерастворимого сгустка фибрина. В каскаде или пути свертывания неактивные сериновые протеазы (также называемые зимогенами) превращаются в активные протеазы путем расщепления одной или нескольких пептидных связей, указанные протеазы затем служат для активации следующей молекулы протеазы в каскаде. На конечном этапе протеолитического каскада фибриноген протеолитически расщепляется тромбином с образованием фибрина, который затем сшивается в месте повреждения и формирует сгусток. В настоящем документе термин гемостаз относится к остановке кровотечения или притока крови в орган или часть тела. Термин гемостаз может охватывать весь процесс свертывания крови для предотвращения потери крови после повреждения кровеносного сосуда и последующее растворение тромба после восстановления тканей.
В настоящем документе термины коагуляция или свертывание относятся к образованию нерастворимых сгустков фибрина или к процессу, посредством которого факторы свертывания крови взаимодействуют в каскаде свертывания, что, в конечном счете, приводит к образованию нерастворимых сгустков фибрина.
Протеаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз ковалентной пептидной связи. Этот термин включает зимогенную форму и активированные одноцепочечную и двухцепочечную формы протеаз. Упоминание протеазы относится ко всем формам. В зависимости от каталитической активности их активного центра и механизма расщепления пептидных связей в целевом субстрате протеазы включают, например, сериновые протеазы, цистеиновые протеазы, аспарагиновые протеазы, треониновые протеазы и металлопротеазы. В настоящем документе сериновые протеазы или сериновые эндопептидазы относятся к классу пептидаз, которые характеризуются наличием остатка серина в активном центре фермента. Сериновые протеазы участвуют в широком спектре функций в организме, в том числе в свертывании крови и воспалении, а также функционируют в качестве пищеварительных ферментов у прокариот и эукариот. Механизм расщепления связей сериновыми протеазами основан на нуклеофильной атаке целевой пептидной связи серином. Цистеин, треонин или молекула воды, связанная с аспартатом или металлом, также могут играть эту роль. Выровненные боковые цепи серина, гистидина и аспартата формируют каталитическую триаду, общую для большинства сериновых протеаз. Активный центр сериновых протеаз представляет собой расщелину, где связывается полипептидный субстрат.
Рассматриваемый в настоящем документе фактор VII ^^1, Р7, также упоминается как фактор 7, фактор свертывания VII, сывороточный фактор VII, сывороточный ускоритель преобразования протромбина, 8РСА, проконвертин и эптаког α) относится к сериновым протеазам, которые являются частью каскада свертывания. РУЛ включает домен О1а, два ЕОР домена (ЕОР-1 и ЕОР-2) и домен сериновой протеазы (или пептидазный домен 81), который высоко консервативен у всех членов семейства пептидазы 81 сериновых протеаз, например химотрипсина. Последовательность примера предшественника Р^Р с сигнальным пептидом и пропептидом приведена в 8ЕЦ ГО N0: 1. Пример зрелого полипептида РVРI приведен в 8ЕЦ ГО N0: 3. РVII встречается в одноцепочечной зимогенной, зимогеноподобной двухцепочечной цепи и полностью активированной двухцепочечной форме. Полная активация, которая происходит при конформационном изменении зимогеноподобной формы, происходит при связывании с кофактором фермента, тканевым фактором. Кроме того, могут быть введены мутации, приводящие к конформационным изменениям в отсутствие тканевого фактора. Следовательно, упоминание РVРI включает его одноцепочечные и двухцепочечные формы, включая зимогеноподобную и полностью активированную двухцепочечные формы.
При упоминании полипептида РVРI также подразумевают полипептиды-предшественники и зрелые полипептиды РVII в одноцепочечной или двухцепочечной форме, их активные усеченные формы, подразумевают аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, в том числе полипептиды по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или более идентичные последовательности предшественника полипептида, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 1 или последовательности его зрелой формы. Также подразумевают модифицированные полипептиды РVII, такие как приведенные в 8ЕЦ ГО N0: 113 и 273 и их варианты. Также подразумевают полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере одну активность РVII, такую как связывание ТФ, связывание фактора X, связывание фосфолипидов и/или коагулянтная активность РVII. При сохранении активности она может быть изменена, например снижена или повышена по сравнению с РVРI дикого типа, пока уровень сохраненной активности достаточен для получения заметного воздействия. Полипептиды РVII включают, но не ограничиваются, тканеспецифическими изоформами и их аллельными вариантами, синтетическими молекулами, полученными трансляцией нуклеиновых кислот, белками, полученными химическим синтезом, таким как синтез, который включает лигирование коротких полипептидов, белками, полученными рекомбинантными методами, белками, выделенными из человеческих и не человеческих тканей и клеток, химерными полипептидами РVII и их модифицированными формами. РVII полипептиды также включают фрагменты или части РУII, которые имеют достаточную длину или включают соответствующие районы для сохранения по меньшей мере одного вида активности (при активации при необходимости) полноразмерного зрелого полипептида. Полипептиды РVII также включают полипептиды с химическими или посттрансляционными модификациями и полипептиды без химических или
- 15 020818 посттрансляционных модификаций. Такие модификации включают, но не ограничиваются, пегилированием, альбуминированием, гликозилированием, фарнизилированием, карбоксилированием, гидроксилированием, фосфорилированием и другими известными в уровне техники модификациями полипептидов.
Примеры полипептидов РУН включают полипептиды млекопитающих, включая человека. Примеры аминокислотных последовательностей РУН человеческого происхождения приведены в 8ЕЦ ГО № 1, 2 и
3. Примеры вариантов таких человеческих полипептидов РУН включают любые полипептидыпредшественники, приведены в 8ЕЦ ГО N0: 18-74. Полипептиды РУН также включают любые полипептиды не человеческого происхождения, включая, но не ограничиваясь, мышиными, собачьими, кошачьими, заячьими, птичьими, бычьими, бараньими, свиными, лошадиными, рыбьими, лягушачьими полипептидами и полипептидами фактора УП приматов. Примеры РУП полипептидов не человеческого происхождения включают, например, полипептиды коровы (Вок !аигик, 8ЕЦ ГО N0: 4), мыши (Мик тикси1ик, 8ЕЦ ГО N0: 5), карликового шимпанзе (Рапратксик, 8ЕЦ ГО N0: 6), шимпанзе (Рап 1год1ойу!ек, 8ЕЦ ГО N0: 7), кролика (0гус!о1адик ситси1ик, 8ЕЦ ГО N0: 8), крысы (Кайик погуедюик, 8ЕЦ ГО N0: 9), резусмакаки (Масаса ти1айо, 8ЕЦ ГО N0: 10), свиньи (8ик ксгоГа, 8ЕЦ ГО N0: 11), собаки (Сатк ГатШаПк, 8ЕЦ ГО N0: 12), полосатого данио (Вгасйуйапю геПо, 8ЕЦ ГО N0: 13), рыбы фугу (Риди гиЬПрек, 8ЕЦ ГО N0: 14), курицы (Оа11ик Оа11ик , 8ЕЦ ГО N0: 15), орангутанга (Ропдо рудтаеик, 8ЕЦ ГО N0: 16) и гориллы (ОогШа догШа, 8ЕЦ ГО N0: 17).
Специалисту в данной области техники очевидно, что указанные позиции зрелого полипептида фактора УП (8ЕЦ ГО N0: 3) отличаются на 60 аминокислотных остатков от позиций изоформы предшественника полипептида РУЛ, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 1, где изоформа полипептида фактора УП содержит сигнальный пептид и пропептидную последовательность. Таким образом, первая аминокислота из 8ЕЦ ГО N0: 3 соответствует шестьдесят первому (61) аминокислотному остатку из 8ЕЦ ГО N0: 1. Специалисту в данной области также очевидно, что указанные позиции зрелого полипептида фактора УП (8ЕЦ ГО N0: 3) отличаются на 38 аминокислотных остатков от позиций предшественника полипептида РУП, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 2, который представляет собой изоформу Ь полипептида фактора УП, содержащую сигнальный пептид и пропептидную последовательность. Таким образом, первый аминокислотный остаток из 8ЕЦ ГО N0: 3 соответствует тридцать девятому (39) аминокислотному остатку из 81Т) ГО N0: 2.
В настоящем документе соответствующие остатки относятся к остаткам, которые находятся в соответствующих локусах. Близкие полипептиды или варианты полипептидов могут быть выровнены любым способом, известным специалистам в данной области. При таких способах обычно добиваются максимального совпадения, и способы включают выравнивание вручную и выравнивание с помощью многочисленных доступных программ выравнивания (например, ВЬАЗТР и другие известные специалистам в данной области программы). По выравниванию последовательностей полипептидов специалист в данной области может определить соответствующие остатки, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве ориентиров. Например, за счет выравнивания последовательностей полипептидов фактора УП, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве ориентиров, специалист в данной области может определить соответствующие остатки. Например, аланин в положении 1 (А1) из 8ЕЦ ГО N0: 3 (зрелый фактор УП) соответствует аланину в положении 61 (А61) из 8ЕЦ ГО N0: 1 и аланину в положении 39 (А39) из 8ЕЦ ГО N0: 2. В других случаях могут быть идентифицированы соответствующие районы. Например, домен 01а соответствует аминокислотным позициям с А1 до Р45 из 8ЕЦ ГО N0: 3, аминокислотным позициям с А61 до 8105 из 8ЕЦ ГО N0: 1 и аминокислотным позициям с А39 до 883 из 8ЕЦ ГО N0: 2. Специалист в данной области также может использовать консервативные аминокислотные остатки в качестве ориентиров для нахождения соответствующих аминокислотных остатков между человеческими и не человеческими последовательностями и среди человеческих и не человеческих последовательностей. Например, аминокислотные остатки с 843 до Е163 из 8Е0 ГО N0: 3 (человеческий) соответствуют остаткам с 883 до Е203 из 8ЕЦ ГО N0: 4 (бычий). Нахождение соответствующих позиций также может быть основано на структурном выравнивании, например компьютерном выравнивании, структуры белка. В других случаях могут быть идентифицированы соответствующие районы. В настоящем документе термины прорайон, пропептид или пропоследовательность относятся к домену или сегменту, которые расщепляются с образованием зрелого белка. Они могут включать сегменты, функционирующие для подавления протеолитической активности, маскирующие каталитический центр и, таким образом, предотвращающие образование каталитического интермедиата (т.е. пространственно блокирующие сайт связывания субстрата). Прорайон представляет собой аминокислотную последовательность, расположенную на Оконце зрелого биологически активного полипептида, и может состоять всего лишь из нескольких аминокислот или представлять собой многодоменную структуру.
В настоящем документе термин зрелый фактор УП относится к полипептиду РУП, у которого отсутствует сигнальная последовательность и пропептидная последовательность. Как правило, сигнальная последовательность направляет белок для секреции через эндоплазматический ретикулум (ЭР) и через аппарат Гольджи и отщепляется после прохождения в ЭР в процессе трансляции. Пропептидная последовательность функционирует при посттрансляционной модификации белка и отщепляется до секреции
- 16 020818 белка из клетки. Таким образом, зрелый белок РУН представляет собой секретируемый белок. В одном примере зрелый человеческий полипептид ΡΥΙΙ приведен в 8ЕО ГО N0: 3. Приведенная в 8Е0 ГО N0: 3 аминокислотная последовательность отличается от последовательностей полипептидовпредшественников, приведенных в 8Е0 ГО N08: 1 и 2, в последовательности 8Е0 ГО N0: 3 отсутствует сигнальная последовательность, которая соответствует остаткам 1-20 в 8Е0 ГО N08: 1 и 2; и отсутствует пропептидная последовательность, соответствующая аминокислотным остаткам 21-60 в 8Е0 ГО N0: 1 и аминокислотным остаткам 21-38 в 8Е0 ГО N0: 2. Упоминание зрелого полипептида ΡΥΙΙ относится к одноцепочечной зимогенной форме и двухцепочеченой форме.
В настоящем документе термины белок дикого типа или нативный белок по отношению к полипептиду ΡΥΙΙ обозначают полипептид ΡΥΙΙ, кодируемый нативным или встречающимся в естественных условиях геном, включая аллельные варианты, присутствующие в организме, таком как человек или другие животные. Упоминание фактора ΥΙΙ дикого типа без упоминания вида относится к факторам ΥΙΙ дикого типа любого вида. Полипептиды ΡΥΙΙ дикого типа включают полипептиды-предшественники, их фрагменты и процессированные формы, включая полипептиды без сигнального пептида, а также любые их пре- или посттрансляционно процессированные формы. Полипептиды ΡΥΙΙ дикого типа также включают посттрансляционно модифицированные полипептиды, включая, но не ограничиваясь гликозилированными, карбоксилированными и гидроксилированными полипептидами. Нативные полипептиды ΡΥΙΙ также включают одноцепочечные и двухцепочечные формы. Например, у людей экспрессируется нативный ΡΥΙΙ. Примеры аминокислотной последовательности человеческого ΡΥΙΙ дикого типа приведены в 8Е0 ГО N08: 1, 2 и 3, а аллельные варианты и их зрелые формы приведены в 8Е0 ГО N08: 44-100. Другие животные также производят нативный ΡΥΙΙ, включая, но не ограничиваясь, коровой (Вок 1аиги8, 8Е0 ГО N0: 4), мышью (Мик ти5си1и5, 8Е0 ГО N0: 5), карликовым шимпанзе (Рапрашксик, 8Е0 ГО N0: 6), шимпанзе (Рап 1год1обу1с5. 8Е0 ГО N0: 7), кроликом (0гус1о1адик сишси1и5, 8Е0 ГО N0: 8), крысой (Ка11и5 погуедюик, 8Е0 ГО N0: 9), резус-макакой (Масаса ти1а11о, 8Е0 ГО N0: 10), свиньей (8ик ксгоГа, 8Е0 ГО N0: 11), собакой (Сашк ГаппПагЕ 8Е0 ГО N0: 12), полосатым данио (ВгасЬубато гегю, 8Е0 ГО N0: 13), рыбой фугу (Риди гаЪпрек, 8Е0 ГО N0: 14), курицей (Са11ик Са11ик, 8Е0 ГО N0: 15), орангутангом (Ропдо рудтаеик, 8Е0 ГО N0: 16) и гориллой (СогШа догШа, 8Е0 ГО N0: 17).
В настоящем документе видовые варианты относятся к вариантам полипептидов среди различных видов, в том числе различных видов млекопитающих, таких как мышь и человек. В настоящем документе аллельные варианты относятся к изменениям в белках среди представителей одного и того же вида. В настоящем документе варианты сплайсинга относятся к вариантам, образованным в результате различного процессинга первичного транскрипта геномной ДНК, что приводит к более чем одному типу мРНК.
В настоящем документе термин зимоген относится к протеазам, которые активируются посредством протеолитического расщепления, в том числе расщепления, приводящего к созреванию, такого как активационное расщепление, и/или посредством образования комплекса с другим белком(белками) и/или кофактором(кофакторами). Зимоген является неактивным предшественником протеолитических ферментов. Такие предшественники, обычно, хотя и не обязательно, обладают большим размером, чем активная форма белка. Зимогены сериновых протеаз преобразуются в активные ферменты путем специфического расщепления, в том числе каталитического и автокаталитического расщепления, или путем связывания активирующего кофактора, которое приводит к активному ферменту. Как правило, зимогены присутствуют в одноцепочечной форме. Зимогены, как правило, являются неактивными и могут быть преобразованы в зрелый активный полипептид каталитическим или автокаталитическим расщеплением по одному или нескольким протеолитическим сайтам с образованием мультицепочечного, такого как двухцепочечный, полипептида. Зимоген, таким образом, представляет собой ферментативно неактивный белок, который преобразуется в протеолитический фермент под действием активатора. Расщепление может быть осуществлено посредством самоактивации. Множество белков свертывания представляют себя зимогены, они неактивны, но расщепляются и активируются при инициировании системы свертывания после повреждения сосуда. Полипептиды ΡΥΙΙ существуют в плазме крови в виде зимогенов до расщепления протеазами, такими как, например, активированный фактор ΙΧ (ΡΙΧ), активированный фактор X (РХа), активированный фактор ΧΙΙ (РХПа), тромбин, или до самоактивации с образованием зимогеноподобной двухцепочечной формы, которая затем требует дальнейшего изменения конформации для полноценной активности.
В настоящем документе зимогеноподобный белок или полипептид относится к белку, который был активирован протеолитическим расщеплением, но еще обладает свойствами, которые связывают белок с зимогеном, такими как, например, низкая или нулевая активность или конформация, которая напоминает конформацию зимогенной формы белка. Например, при отсутствии связи с тканевым фактором двухцепочечная активированная форма ΡΥΙΙ является зимогеноподобным белком, она сохраняет похожую на нерасщепленный зимоген ΡΥΙΙ конформацию и поэтому обладает очень низкой активностью. При связывании с тканевым фактором двухцепочечная активированная форма ΡΥΙΙ претерпевает конформационные изменения и приобретает свою полную активность фактора свертывания.
В настоящем документе активационная последовательность относится к аминокислотной последовательности зимогена, которая представляет собой сайт, необходимый для активационного расщепле- 17 020818 ния или расщепления для созревания с образованием активной протеазы. Расщепление активационной последовательности может быть автокаталитическим или катализироваться активирующим партнером.
В настоящем документе активационное расщепление является одним из видов расщепления для созревания, которое вызывает изменение конформации, необходимое для проявления полной ферментативной активности. Это классический путь активации, например, для сериновых протеаз, в которых расщепление приводит к появлению нового Ν-конца, взаимодействующего с консервативным районом протеазы, таким как Л§р194 в химотрипсине, что вызывает конформационные изменения, необходимые для проявления активности. Активация может привести к образованию мультицепочечной формы протеазы. В некоторых случаях одноцепочечная форма протеазы может проявлять протеолитическую активность.
Используемый в настоящем документе термин активированный фактор УН или РУНа относится к любой двухцепочечной форме полипептида РУН. Двухцепочечная форма обычно является результатом протеолитического расщепления, но может быть получена синтетическим путем. Активированный фактор УН, таким образом, включает зимогеноподобную двухцепочечную форму с низкой коагулянтной активностью, полностью активированную форму (с приблизительно в 1000 раз большей активностью), которая образуется при связывании с тканевым фактором, и мутированные формы, которые существуют в полностью активированной двухцепочечной форме или проходят конформационные изменения с образованием полностью активированной формы. Например, одноцепочечная форма полипептида РУН (см., например, 5>ЕЭ ГО N0: 3) претерпевает протеолитическое расщепление между аминокислотными остатками К152 и 1153 зрелого полипептида РУН. Продукты расщепления, тяжелая цепь РУН и легкая цепь РУН, которые удерживаются вместе дисульфидной связью (между аминокислотными остатками С135 и С262 в РУН из 5>ЕЭ ГО N0: 3), образуют двухцепочечный активированный РУН фермент. Протеолитическое расщепление может быть осуществлено, например, активированным фактором IX (ИХ), активированным фактором X (РХа), активированным фактором XII (РХНа), тромбином или путем самоактивации.
В настоящем документе свойство полипептида РУН относится к физическим или структурным свойствам, таким как трехмерная структура, рф период полураспада, конформация и другие подобные физические характеристики.
В настоящем документе активность полипептида РУН относится к любой активности, проявляемой полипептидом фактора УН. Такие активности могут быть исследованы ίη νίΐΓΟ и/или ίη νίνο и включают, но не ограничиваются, свертывание или коагулянтную активность, прокоагулянтную активность, протеолитическую или каталитическую активность, такую как активация фактора X (РХ) или активация фактора IX (РК), антигенность (способность связываться с анти-РУН антителом или конкурировать с полипептидом за связывание с анти-РУН антителом), способность связывать тканевый фактор, фактор X или фактор IX и/или способность связываться с фосфолипидами. Активность может быть оценена ίη νίΐΓΟ или ίη νίνο с использованием признанных тестов, например путем измерения свертывания ίη νίΐΓΟ или ίη νίνο. Результаты таких анализов показывают, что полипептид проявляет активность, которая может коррелировать с активностью полипептида ίη νίνο, где ίη νίνο активность может быть оценена как биологическая активность. Анализы для определения функциональности или активности модифицированной формы РУН известны специалистам в данной области. Примеры тестов для оценки активности полипептида РУН включают анализ на тромбопластиновое время (ТВ), или анализ на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) для оценки коагулянтной активности, или анализы с использованием хромогенных синтетических субстратов, как описано в примерах ниже, для оценки каталитической или протеолитической активности.
В настоящем документе выражение проявление по меньшей мере одного вида активности или сохранение по меньшей мере одного вида активности относится к активности модифицированного полипептида РУН по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН того же вида и в тех же условиях. Например, модифицированный полипептид РУН в двухцепочечной форме сравнивают с немодифицированным полипептидом РУН в двухцепочечной форме в одинаковых экспериментальных условиях, где различием между двумя полипептидами является только модификация исследуемого полипептида. В качестве другого примера модифицированный полипептид РУН в одноцепочечной форме сравнивают с немодифицированным полипептидом РУН в одноцепочечной форме в одинаковых экспериментальных условиях, где различием между двумя полипептидами является только модификация исследуемого полипептида. Как правило, модифицированный полипептид РУН, который сохраняет и проявляет по меньшей мере один вид активности немодифицированного полипептида РУН в такой же форме, сохраняет активность в достаточной степени, поэтому при введении ίη νίνο модифицированный полипептид РУН терапевтически эффективен в качестве прокоагулянтного лекарственного средства. В большинстве случаев для проявления терапевтической эффективности в качестве прокоагулянта модифицированный полипептид РУН должен сохранить приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более от активности немодифицированного полипептида РУН в той же форме, который проявляет терапевтическую эффективность как прокоагулянт. Активность, которая необходима для поддержания терапевтической эффективности в качестве прокоагулянта, может быть определена эмпирически, если это необходимо. Как правило, сохранение от 0,5 до 20%, от 0,5 до 10%, от 0,5 до 5% активности достаточно для сохранения терапевтической
- 18 020818 эффективности в качестве прокоагулянта ίη νίνο.
Подразумевается, что проявляемая или сохраненная модифицированным полипептидом РУН активность может представлять собой любую активность, включая, но не ограничиваясь коагуляцией или коагулянтной активностью, прокоагулянтной активностью; протеолитической или каталитической активностью, такой как активация фактора X (РХ) или активация фактора IX (РК); антигенностью (способностью связываться с анти-РУП антителом или конкурировать с полипептидом за связывание с антиРУН антителом); способностью связывать тканевый фактор, фактор X или фактор IX; и/или способностью связываться с фосфолипидами. В некоторых случаях модифицированный полипептид РУН может сохранять активность РУН, при этом активность увеличена по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. В некоторых случаях модифицированный полипептид РУН может сохранять активность, при этом активность снижена по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Активность модифицированного полипептида РУН может составлять любой процент от активности немодифицированного полипептида, включая, но не ограничиваясь, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более от активности ^модифицированного полипептида, где оба полипептида представлены в одной форме. Например, модифицированный полипептид РУН может обладать повышенной или пониженной активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН в той же форме. Например, он может сохранить по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98% или по меньшей мере 99% от активности немодифицированного полипептида РУН. В других вариантах активность увеличена по меньшей мере приблизительно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 раз или более по сравнению с немодифицированным РУН. Конкретный уровень сохраненной активности зависит от предполагаемого использования полипептида и может быть определен эмпирически. Активность может быть измерена, например, с использованием ίη νΐίτο или ΐη νίνο анализов, таких как анализы, описанные здесь или в примерах ниже.
В настоящем документе активность свертывания, коагулянтная активность или прокоагулянтная активность относятся к способности полипептида вызывать коагуляцию. Анализы для оценки коагулянтной активности известны специалистам в данной области и включают анализ на протромбиновое время (ПВ) или анализ на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).
В настоящем документе термины каталитическая активность или протеолитическая активность со ссылкой на РУН относятся к способности белка РУН катализировать протеолитическое расщепление субстрата и являются взаимозаменяемыми. Анализы для оценки такой активности известны в данной области техники. Например, протеолитическая активность РУН может быть измерена с помощью хромогенных субстратов, таких как субстрат 5>рес1го/уте РУНа (СΗз§Ο2-^-СΗΑ-Βиί-Α^д-ρNΑ), где за расщеплением субстрата следят по оптическому поглощению и скорость гидролиза субстрата определяют с помощью линейной регрессии.
В настоящем документе термин собственная активность со ссылкой на РУН относится к каталитической, протеолитической и/или коагулянтной активности белка РУН в отсутствие тканевого фактора.
В настоящем документе термин домен (представляет собой последовательность из трех или более, как правило 5, 7 и более аминокислот) относится к части молекулы, такой как белок или кодирующая нуклеиновая кислота, которая структурно и/или функционально отличается от других частей молекулы и является идентифицируемой. Например, домены включают те участки полипептидной цепи, которые способны самостоятельно формировать складчатую структуру в белке, состоящую из одного или нескольких структурных мотивов и/или распознаваемую по функциональной активности, такой как протеолитическая активность. Белок может иметь один или несколько различных доменов. Например, домен может быть идентифицирован, определен или различен по гомологии последовательности в близких членах семейства, такой как гомология с мотивами, которые определяют протеазный домен или С1а домен. В другом примере домен можно отличить по его функции, например по протеолитической активности или способности взаимодействовать с биомолекулами, например, по связыванию ДНК, связыванию лиганда и димеризации. Домен самостоятельно может проявлять биологическую функцию или активность, так что домен самостоятельно или при слиянии с другой молекулой может проявлять активность, такую как, например, протеолитическая активность или способность связывать лиганд. Домен может представлять собой линейную последовательность аминокислот или не линейную последовательность аминокислот. Многие полипептиды содержат множество доменов. Такие домены известны и могут быть идентифицированы специалистами в данной области. Для иллюстративных целей в настоящем документе приводятся определения, но подразумевается, что специалист в данной области может распознать конкретный домен по названию. Если необходимо, для выявления доменов может быть использовано соответствующее программное обеспечение.
В настоящем документе протеазный домен представляет собой каталитически активную часть протеазы. Упоминание протеазного домена протеазы подразумевает одно-, двух- и мультицепочечные формы любого из белков по настоящему изобретению. Протеазный домен белка содержит все необходимые свойства для проявления его протеолитической активности, такие как, например, каталитический центр. Протеазный домен РУН обладает гомологией и структурным сходством с протеазными доменами
- 19 020818 белков семейства химотрипсина/трипсина, включая каталитическую триаду. Например, в последовательности зрелого полипептида РУЛ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, протеазный домен соответствует аминокислотным позициям с 153 до 392.
В настоящем документе γ-карбоксиглутаматный (01а) домен относится к части белка, например витамин К-зависимого белка, которая содержит посттрансляционные модификации путем витамин Кзависимого карбоксилирования глутаматных аминокислотных остатков, как правило, большей части, но не всех глутаматных аминокислотных остатков. 01а домен ответственен за высокоаффинное связывание ионов кальция и связывание отрицательно заряженных фосфолипидов. Как правило, домен 01а начинается на Ν-конце зрелой формы витамин К-зависимых белков и заканчивается консервативным ароматическим остатком. В зрелом полипептиде РУ11 домен 01а соответствует аминокислотным позициям с 1 по 45 в примере полипептида, приведенном в 8Е0 ГО N0: 3. Домены 01а хорошо известны и их локусы в конкретных полипептидах могут быть определены. Домены 01а различных витамин К-зависимых белков обладают гомологией последовательности, структурной и функциональной гомологией, включая кластеризацию Ν-концевых гидрофобных остатков в гидрофобную группу, которая выступает посредником во взаимодействии с отрицательно заряженными фосфолипидами на поверхности мембраны клетки. Примеры других 01а-содержащих полипептидов включают, но не ограничиваются, Р1Х, РХ, протромбином, белком С, белком 8, остеокальцином, белком 01а, 0гоМЬ-агге81-8рес1Йс белком 6 (0а§6) и белком Ζ. Домены 01а этих и других белков приведены в любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 83-94.
Используемые в настоящем документе термины нативный или эндогенный со ссылкой на домен 01а относятся к нативному домену 01а, связанному со всем полипептидом или частью полипептида, обладающего доменом 01а. Для целей настоящего изобретения нативный домен 01а упоминают в связи с полипептидом РУН. Например, нативный домен 01а из РУН, приведенный в 8Е0 ГО N0: 92, соответствует аминокислотам 1-45 из последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3.
В настоящем документе гетерологичный домен 01а представляет собой домен 01а из полипептида того же вида или другого вида, который не является 01а доменом РУН.
Примеры гетерологичного домена 01а включают домены 01а из 01а-содержащих полипептидов, включая, но не ограничиваясь, Р1Х, РХ, протромбин, белок С, белок 8, остеокальцин, матриксный белок 01а, 0го\\П1-агге51-5рес1Лс белоком 6 (0а§6) и белком Ζ. Домены 01а этих и других белков приведены в любой из последовательностей 8Е0 ГО N0: 83-91, 93 и 94.
В настоящем документе непрерывная часть домена 01а относится по меньшей мере к двум или нескольким непрерывно соединенным аминокислотам, как правило, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 или более аминокислотам вплоть до всех аминокислот, которые составляют домен 01а.
Используемый в настоящем документе термин достаточная для связывания фосфолипидов часть домена 01а относится по меньшей мере к одной аминокислоте, как правило, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 или более аминокислотам домена, но менее чем всем аминокислотам домена, при этом полипептид, который содержит такие аминокислоты, связывает фосфолипиды.
Используемый в настоящем документе термин замена по отношению к домену 01а или термин замена домена 01а относится к процессу, посредством которого эндогенный домен 01а белка заменен с использованием рекомбинантных, синтетических или других методов на домен 01а другого белка. В контексте замены домена 01а домен 01а представляет собой любой набор аминокислот из домена 01а и соседних районов, который сохраняет способность связывать фосфолипиды. Как правило, замена домена 01а включает замену от 40 до 50 аминокислот эндогенного белка последовательностью от 40 до 50 аминокислот другого белка, но может включать меньше или больше аминокислот.
Используемый в настоящем документе термин домен эпидермального фактора роста (Е0Р) (Е0Р1 или Е0Р-2) относится к части белка, обладающей гомологией последовательности со специфической частью последовательности эпидермального фактора роста (Е0Р), включающей от 30 до 40 аминокислотных остатков. Е0Р домен включает шесть остатков цистеина, которые (в Е0Р) образуют дисульфидные связи. Основой структуры домена Е0Р является двухцепочечный β-лист, за которым следует петля с коротким С-концевым двухцепочечным листом. РУН включает два домена Е0Р: Е0Р-1 и Е0Р-2. Эти домены соответствуют аминокислотным позициям 46-82 и 87-128 соответственно, в последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3.
В настоящем документе термины немодифицированный полипептид или немодифицированный РУН и их грамматические модификации относятся к исходному полипептиду, который был выбран для модификации, как это предусмотрено в настоящем документе. Исходный полипептид может представлять собой природную форму, дикий тип полипептида. Кроме того, исходный полипептид может быть изменен или мутирован, так что он отличается от нативной изоформы дикого типа, но, тем не менее, полипептид может упоминаться в настоящем документе в качестве исходного немодифицированного полипептида по отношению к последующей его модификации, производимой по настоящему документу. Таким образом, известные в уровне техники белки, которые были изменены для получения желаемого увеличения или уменьшения конкретного вида активности или свойства по сравнению с немодифицированным белком, могут быть выбраны и использованы в качестве исходного немодифицированного полипеп- 20 020818 тида. Например, белок, который был изменен относительно его нативной формы путем одной или нескольких аминокислотных замен и который обладает увеличенным или уменьшенным требуемым свойством, например белок, в котором модифицирован аминокислотный остаток или остатки для изменения гликозилирования, может представлять собой целевой белок для дальнейшей модификации того же или другого свойства и упоминаться в настоящем документе как немодифицированный. Примеры модифицированных полипептидов РУН известны и включают любые полипептиды РУН описанные, например, в патентах США №№ 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 и 6806063, опубликованных заявках США №№ 20030100506 и 20040220106 и международных заявках №№ АО 1988010295, АО 200183725, АО 2003093465, АО 200338162, АО 2004083361, АО 2004108763, АО 2004029090, АО 2004029091, АО 2004111242 и АО 2005123916.
Используемые здесь термины модифицированные полипептиды фактора VII и модифицированный фактор VII относятся к полипептиду РУЛ, который обладает одним или более отличиями аминокислотной последовательности по сравнению с немодифицированным полипептидом фактора УН. Одно или несколько отличий аминокислотной последовательности могут представлять собой мутации аминокислот, такие как одну или несколько аминокислотных замен (замещений), вставок и удалений или могут представлять собой вставку и удаление целых доменов, а также любые их комбинации. Как правило, модифицированный полипептид РУН обладает одним или несколькими модификациями первичной последовательности по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Например, модифицированный полипептид РУН, предусмотренный в настоящем документе, может обладать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более аминокислотными отличиями по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Любые модификации допустимы, пока полученный полипептид проявляет по меньшей мере одну активность нативного полипептида РУН, такую как, например, каталитическая активность, протеолитическая активность, способность связывать ТФ или способность связываться с активированными тромбоцитами.
В настоящем документе термин ингибиторы коагуляции относится к белкам или молекулам, которые ингибируют или предотвращают свертывание или образование сгустков. Ингибирование или предотвращение коагуляции можно наблюдать ίη νίνο или ίη νίίτο и проанализировать с помощью любого способа, известного в уровне техники, включая, но не ограничиваясь анализом тромбопластинового времени (ТВ) или активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ).
В настоящем документе ингибитор пути тканевого фактора (ТРИ, также известный как ТРРИ1) является ингибитором Кунитца, который участвует в формировании четвертичного ТФ/РУПа/ТРРПРХа ингибиторного комплекса, в котором активность РУНа ингибирована. После альтернативного сплайсинга ТРΡI экспрессируется с образованием двух предшественников, ТРРР/. (δΕΟ ГО NΟ: 75) и ТРР1р (δΕΟ ГО NΟ: 77) предшественников, которые расщепляются во время секреции с образованием зрелых белков, содержащих 276 аминокислот (δΕΟ ГО NΟ: 76) и 223 аминокислоты (δΕΟ ГО NΟ: 78) соответственно. ТРИ содержит 3 домена Кунитца, из которых домен Кунитца 1 отвечает за связывание и ингибирование РУНа. В настоящем документе ТРИ-2 (также известный как плацентарный белок 5 (РР5) и связанный с матриксом ингибитор сериновых протеаз (ΜδΡΡ) относится к гомологу ТРИ Состоящий из 213 аминокислот зрелый белок ТРРН2 (δΕΟ ГО NΟ: 79) содержит три домена Кунитца, которые обладают 43, 35 и 53% идентичности первичной последовательности с доменами Кунитца 1, 2, 3 ТРИ-1 соответственно. ТРИ-2 играет роль в регуляции расщепления и реконструкции внеклеточного матрикса и не считается важным фактором свертывания.
В настоящем документе антитромбин III ^Т-Ш) относится к ингибиторам сериновых протеаз (серпинам). АТ-Ш синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего 464 аминокислотных остатка (δΕΟ ГО NΟ: 95), который расщепляется во время секреции с образованием зрелого антитромбина, включающего 432 аминокислоты (δΕΟ ГО NΟ: 96).
В настоящем документе кофакторы относятся к белкам или молекулам, которые связываются с другими специфическими белками или молекулами с образованием активного комплекса. В некоторых примерах связывание с кофактором необходимо для оптимальной протеолитической активности. Например, тканевый фактор (ТФ) является кофактором РУНа. Связывание РУНа для ТФ индуцирует конформационные изменения, которые приводят к увеличению протеолитической активности РУНа по отношению к его субстратам, РХ и РРХ.
В настоящем документе тканевый фактор (ТФ) относится к трансмембранному гликопротеину, включающему 263 аминокислоты (δΕΟ ГО NΟ: 97), который функционирует в качестве кофактора для РУНа. Тканевый фактор конститутивно экспрессируется в гладкомышечных клетках и фибробластах и способствует инициации коагуляции путем связывания РУН и РУНа при контакте указанных клеток с кровотоком после повреждения тканей.
В настоящем документе активированные тромбоциты относятся к тромбоцитам, в которых связывание молекул, таких как коллаген, тромбоксан А2, АДФ и тромбин индуцирует различные изменения в морфологии, фенотипе и функции клеток, что, в конечном счете, способствует коагуляции. Например, форма активированных тромбоцитов изменяется на более аморфную форму с пальцеобразными выступами. Активированные тромбоциты также претерпевают флип-переход клеточной мембраны, заклю- 21 020818 чающийся в перемещении фосфатидилсерина и других отрицательно заряженных фосфолипидов, которые обычно присутствуют на внутренней стороне клеточной мембраны, на внешнюю, обращенную к плазме поверхность мембраны. Мембраны активированных тромбоцитов представляют собой поверхность, на которой осуществляются многие из реакций свертывания. Активированные тромбоциты также секретируют везикулы, содержащие такие прокоагулянтные факторы, как фактора Виллебранда, РУ, тромбин, АДФ и тромбоксан А2, и склеиваются друг с другом с образованием тромбоцитной пробки, которая стабилизируется фибрином с формированием сгустка.
В настоящем документе термин увеличенное связывание и/или увеличенная аффинность к активированным тромбоцитам, а также любые его грамматические изменения относятся к увеличению способности полипептида или белка, например полипептида РУН, связываться с поверхностью активированных тромбоцитов по сравнению с исходным полипептидом или белком. Например, способность модифицированного полипептида РУН связываться с активированными тромбоцитами может быть больше, чем способность немодифицированного полипептида РУН связываться с активированными тромбоцитами. Связывание и/или аффинность полипептида к активированным тромбоцитам может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со связыванием и/или аффинностью немодифицированного полипептида. Анализы для определения связывания и/или аффинности полипептида к активированным тромбоцитам известны в области техники. Связывание полипептида РУН с активированными тромбоцитами опосредуется взаимодействием аминокислот в домене О1а полипептида РУН с отрицательно заряженными фосфолипидами, такими как фосфатидилсерин, на активированных тромбоцитах. Таким образом, способы анализа связывания полипептидов, таких как полипептиды РУН, с активированными тромбоцитами основаны на использовании мембран ивезикул, которые содержат фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин. Например, способность полипептида связываться с активированными тромбоцитами отражается на способности полипептида связываться с фосфолипидными везикулами, которую можно измерить с помощью рассеяния света.
В настоящем документе термин увеличенное связывание и/или аффинность к фосфолипидам, а также любые его грамматические изменения относятся к увеличению способности полипептида или белка связываться с фосфолипидами по сравнению с исходным полипептидом или белком. Фосфолипиды могут включать любые фосфолипиды, но особенно фосфатидилсерин. Связывание и/или аффинность полипептида к фосфолипидам может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со связыванием и/или аффинностью немодифицированного полипептида. Анализы для определения аффинности и/или связывания полипептида с фосфолипидами известны в уровне техники. Например, связывание полипептида РУЛ с фосфолипидными везикулами может быть определено по относительному рассеянию света под углом 90° к падающему свету. Для определения константы диссоциации измеряют интенсивность рассеяния света на фосфолипидных везикулах и на фосфолипидных везикулах с РУН. Для измерения аффинности полипептидов РУН к фосфолипидным мембранам также может быть использован поверхностный плазмонный резонанс, например, измеренный на биосенсоре В1Асоге.
В настоящем документе повышенная устойчивость к ингибиторам, повышенная устойчивость к ΑΤ-ΙΙΙ или повышенная устойчивость к ТРР1 относятся к любому снижению чувствительности полипептида к действию ингибитора, такого как ΑΤ-ΙΙΙ или ТРР1, по сравнению с начальным полипептидом, таким как немодифицированный полипептид РУН Повышенная устойчивость к ингибитору, такому как ΑΤ-ΙΙΙ, может быть оценена по связыванию модифицированного полипептида РУН с ингибитором. Повышенная устойчивость к ингибиторам, таким как ΑΤ-ΙΙΙ, также может быть оценена путем измерения собственной активности или коагулянтной активности полипептида РУН в присутствии ΑΤ-ΙΙΙ. Анализы для определения связывания полипептида с ингибитором известны в уровне техники. Для ковалентных ингибиторов, таких как, например, ΑΤ-ΙΙΙ, может быть измерена константа скорости второго порядка для ингибирования. Для нековалентных ингибиторов, таких как, например, ΤΕΡΙ, может быть измерена константа ингибирования. Кроме того, для измерения связывания полипептидов РУН с ΑΤ-ΙΙΙ или другими ингибиторами также может быть использован поверхностный плазмонный резонанс, измеренный, например, с помощью биосенсора ВМсоге. Однако для ковалентных ингибиторов, таких как ΑΤ-ΙΙΙ, с помощью ВМсоге может быть измерена только скорость ассоциации. Анализы для определения ингибиторного эффекта, например ингибиторного эффекта ΑΤ-ΙΙΙ, на коагулянтную активность или собственную активность РУН также известны в уровне техники. Например, может быть измерена способность модифицированного полипептида РУН расщеплять его субстрат РХ при наличии или в отсутствие ΑΤΙΙΙ, при этом может быть определена степень, в которой ΑΤ-ΙΙΙ ингибирует реакцию. Полученные результаты можно сравнить со способностью немодифицированного полипептида РУН расщеплять его субстрат РХ при наличии или в отсутствие ΑΤ-ΙΙΙ. Модифицированный полипептид может обладать повышенной устойчивостью к ингибитору, например, повышенной на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более устойчивостью к воздействию ингибитора по сравнению с немодифицированным полипептидом.
Используемые в настоящем документе термины повышенная устойчивость к ингибированию
- 22 020818
Ζιν', повышенная устойчивость к ингибиторному эффекту Ζιν' или повышенная устойчивость к Ζιν' означают любое уменьшение чувствительности полипептида к ингибиторному эффекту Ζιν' по сравнению с начальным полипептидом, таким как немодифицированный полипептид РУН. Повышенная устойчивость к Ζιν' может быть оценена, например, по измерению собственной активности или коагулянтной активности полипептида РХ!! в присутствии Ζπ, как описано в примере 11. Повышенная устойчивость к ингибиторному эффекту Ζιν' может быть результатом снижения связывания с Ζιν'. Снижение связывания Ζιν' может быть оценено путем измерения количества связанного Ζιν' на молекулу РVIIа, путем измерения аффинности связывания Ζιν' с РVIIа или путем измерения ТС50 для ингибирования активности РVIIа цинком. Модифицированный полипептид может обладать повышенной устойчивостью к воздействию Ζ^', например повышенной на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более устойчивостью к воздействию Ζ^' по сравнению с немодифицированным полипептидом.
В настоящем документе связывающая сывороточный альбумин последовательность относится к последовательности аминокислотных остатков, которая может связывать сывороточный альбумин. Таким образом, при вставке в полипептид РVII связывающей сывороточный альбумин последовательности может быть увеличена аффинность или связывание полипептида с сывороточным альбумином. Модифицированный полипептид может обладать повышенной аффинностью и/или связыванием с сывороточным альбумином, например повышенной на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более аффинностью и/или связыванием с сывороточным альбумином по сравнению с немодифицированным полипептидом. Обычно связывающая сывороточный альбумин последовательность включает 10 или более аминокислот, обычно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 или более аминокислот. Примеры связывающих сывороточный альбумин последовательностей приведены в 8ЕЦ ГО N08: 103-109.
В настоящем документе связывающая интегрин тромбоцитов апьРз последовательность относится к последовательности аминокислотных остатков, которая может связывать интегрин тромбоцитов απ1,β3. Таким образом, при вставке в полипептид РАН связывающей интегрин тромбоцитов απ1,β3 последовательности может быть увеличена способность полипептида РУН связывать интегрин тромбоцитов апьв3 и, следственно, тромбоциты, в том числе активированные тромбоциты. Модифицированные полипептиды РУН, включающие связывающую интегрин тромбоцитов απ1,β3 последовательность, проявляют увеличенную аффинность и/или связывание с интегрином ащфз и/или тромбоцитами. Модифицированный полипептид может обладать повышенной аффинностью и/или связыванием с интегрином тромбоцитов апьв3, например повышенной на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более аффинностью и/или связыванием с интегрином тромбоцитов апьв3 по сравнению с немодифицированным полипептидом. Обычно связывающая интегрин тромбоцитов апьв3 последовательность содержит по меньшей мере 5 или более аминокислот, как правило, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 или более аминокислот. Примеры связывающих интегрин тромбоцитов апьв3 последовательностей приведены в 8ЕЦ ГО N0: 110-112.
В настоящем документе сайт гликозилирования относится к аминокислоте в полипептиде, к которой может быть присоединен углеводный фрагмент. Как правило, гликозилированный белок содержит один или более аминокислотных остатков, таких как аспарагин или серин, для прикрепления углеводных фрагментов.
В настоящем документе нативный сайт гликозилирования относится к аминокислоте, к которой в полипептиде дикого типа присоединен углеводный фрагмент. В РVII существует четыре нативных сайта гликозилирования, два сайта ^гликозилирования в положениях N145 и N322 и два сайта Огликозилирования в положениях 852 и 860, положения соответствуют позициям аминокислот в последовательности зрелого полипептида РVII, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3.
В настоящем документе ненативный сайт гликозилирования относится к аминокислоте, к которой в модифицированном полипептиде присоединен углеводный фрагмент и к которой не присоединен такой фрагмент в полипептиде дикого типа. Ненативные сайты гликозилирования могут быть введены в полипептид РVII с помощью замен аминокислот. Сайты О-гликозилирования могут быть созданы, например, путем замены нативного остатка аминокислоты на серин или треонин.
Сайты ^гликозилирования могут быть созданы, например, путем создания мотива Акп-Хаа8ег/ТЬг/Сук, где Хаа не является пролином. Создание указанной консенсусной последовательности модификацией аминокислот может включать, например, замену одного нативного аминокислотного остатка на аспарагин, замену одного нативного аминокислотного остатка на серин, треонин и цистеин или двойную замену аминокислот, включающую первую замену нативного аминокислотного остатка на аспарагин и вторую замену нативного аминокислотного остатка на серин, треонин и цистеин.
Используемый здесь термин биологическая активность относится к активности соединения ш νίуо или физиологической реакции, которая проявляется при ш νί\Ό введении соединения, композиции или другой смеси. Биологическая активность, таким образом, охватывает терапевтический эффект и фармацевтическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологическую активность можно
- 23 020818 наблюдать в ΐη νΐΐίο системах, предназначенных для исследования или использования такой активности. Таким образом, в настоящем документе биологическая активность полипептида РУ11 охватывает коагулянтную активность.
Используемый здесь термин оценка и его грамматические изменения относятся к качественному и количественному определению абсолютного значения активности полипептида, а также к получению индекса, коэффициента, процента, визуального показателя или другого показателя уровня активности. Оценка может быть прямой или косвенной. Например, обнаружение расщепления субстрата полипептида может осуществляться прямым измерением продукта или косвенным путем через определение активности расщепленного субстрата.
В настоящем документе термин нумерация химотрипсина относится к нумерации аминокислот зрелого полипептида химотрипсина из 8Ε^ ГО N0: 80. Протеазный домен другой протеазы, такой как, например, протеазный домен фактора VII, может быть выровнен с химотрипсином. В этом случае аминокислотам фактора VII, которые соответствуют аминокислотам химотрипсина, дают номера аминокислот химотрипсина. Соответствующие позиции могут быть определены специалистом в данной области техники с помощью ручного выравнивания или с помощью многочисленных доступных программ выравнивания (например, ВЕАЗТР). Соответствующие позиции также могут быть определены на основании структурного выравнивания, например с помощью компьютерного выравнивания структуры белка. Утверждение, что аминокислоты полипептида соответствуют аминокислотам указанной последовательности, относится к аминокислотам, идентифицированным в процессе выравнивания полипептида с раскрытой последовательностью с достижением максимальной идентичности или гомологии (выравниваются консервативные аминокислоты) с помощью стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм САР. Соответствующие химотрипсиновые номера аминокислот с 1 по 406 из полипептида РУН, приведенного в 8Ε^ ГО N0: 3, представлены в табл. 1. Аминокислотные позиции, соответствующие приведенной в 8Ε^ ГО N0: 3 последовательности, показаны обычным шрифтом, аминокислотные остатки на этих позициях выделены жирным шрифтом, соответствующие номера по нумерации химотрипсина выделены курсивом. Например, при выравнивании зрелого фактора VII (8Ε^ ГО N0: 3) со зрелыми химотрипсином (8Ε^ ГО N0: 80) изолейцину (I) в положении 153 в факторе VII дается номер 116 по нумерации химотрипсина. Последующие аминокислоты пронумерованы соответственно. В еще одном примере глутаминовая кислота (Е) в положении 210 зрелого фактора VII (8Ε^ ГО N0: 3) соответствует аминокислотной позиции Е70 по нумерации химотрипсина. Если остаток присутствует в протеазе, но отсутствует в химотрипсине, аминокислотному остатку дают буквенное обозначение. Например, остатки, которые являются частью петли с аминокислотой 60 по нумерации химотрипсина, но представляют собой вставку в последовательность фактора VII по сравнению с химотрипсином, называют, например, К60а, ^06, К60с и N606. Эти остатки соответствуют К197, П98, К199 и N200 соответственно, по нумерации последовательности зрелого фактора VII (8Ε^ ГО N0: 3).
Таблица 1
Нумерация . фактора VII по химотрипсину
153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167
I V О О К V С Р к 0 Е С Р ЗУ <5
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
- 24 020818
168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182
V Ь Ь Ь V N 0 А Ω Ь С 0 0 Т Ь
31 32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197
I N Т I Ψ V V 8 А А Н С Р ϋ К
47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 60А
198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212
I К N К. N Ь I А V Ь 0 Е н ϋ
60В 60С 60ϋ 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227
ь 8 Е н ϋ 0 ϋ Е Ω 8 К К V А Ω
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87
228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242
V I I Р 8 Т Υ V Р 0 Т Т N Н ϋ
88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
I А Ь Ь К. Ь Н Ω Р V V Ь Т ϋ Η
103 104 105 106 107 108 109 по 111 112 113 114 115 116 117
258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272
V V Р ь С Ь Р Е К Т Р 8 Е К Τ
118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 129 А 129В 129С
273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287
Ь А Р V К. Р 8 Ь V 8 0 О Ω Ь
129ϋ 129Е 129Р 1290 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144
288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302
Ь ϋ Κ. Ο Α Τ Α Ь Ε Ь Μ V ь Ν V
145 146 147 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317
Ρ Κ. Ь Μ Τ Ω ϋ С Ь Ω Ω δ Κ. Κ V
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 170Α 170Β 170С 170ϋ 170Ε
318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332
0 ϋ 8 Ρ Ν I Τ Ε Υ Μ Ρ С Α Ο Υ
170Р 1700 170Η 1701 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184Α 184
333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347
8 ϋ Ο 8 Κ ϋ 8 С Κ Ο ϋ 8 Ο Ο Ρ
185 186 187 188Α 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198
348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362
Η Α Τ Η Υ Κ Ο Τ Υ Ь Τ Ο I V
199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213
363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377
8 Ο Ω Ο С Α Τ V Ο Η Ρ Ο V Υ
214 215 216 217 219 220 221Α 221 222 223 224 225 226 227 228
378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392
Τ Κ. V δ Ω Υ I Ε XV Ь Ω Κ Ь Μ Κ
229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243
393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406
8 Ε Ρ Κ Ρ Ο V Ь Ь Κ. Α Ρ Ρ Ρ
244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257
- 25 020818
В настоящем документе нуклеиновые кислоты включают ДНК, РНК и их аналоги, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (РNΑ) и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Когда речь идет о зондах или праймерах, которые по желанию являются мечеными, например, обнаруживаемой меткой, например люминесцентной или радиоактивной меткой, подразумеваются одноцепочечные молекулы. Такие молекулы, как правило, обладают такой длиной, что их мишени при зондировании или праймировании библиотеки являются статистически уникальными или встречаются в виде низкого числа копий (обычно менее 5, как правило, менее 3). Обычно зонд или праймер содержит последовательность по меньшей мере из 14, 16 или 30 непрерывно расположенных нуклеотидов, комплементарных или идентичных интересующему гену. Зонды и праймеры могут включать 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов в длину.
В настоящем документе пептид относится к полипептиду, который включает от 2 до 40 аминокислот в длину.
В настоящем документе аминокислоты, входящие в различные аминокислотные последовательности, предусмотренные здесь, обозначаются в соответствии с известными трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами (табл. 2). Нуклеотиды, входящие в различные фрагменты нуклеиновых кислот, называют стандартными однобуквенными обозначениями, обычно используемыми в уровне техники.
В настоящем документе аминокислота представляет собой органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислот. В настоящем документе аминокислоты включают двадцать природных аминокислот, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (например, аминокислоты, у которых α-атом углерода имеет боковую цепь).
Аббревиатуры для аминокислотных остатков в соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов, описанной в I. Βΐο1. СЬет., 243:3552-3559 (1969) и принятой 37 С.Р.К, §§ 1.821-1.822, приведены в табл. 2.
Таблица 2
Таблица соответствия
Обозначение
однобуквенное трехбуквенное аминокислота
Υ Туг Тирозин
О О1у Глицин
Р РЬе Фенилаланин
м Ме! Метионин
А А1а Аланин
8 8ег Серин
I Не Изолейцин
Ь Ьеи Лейцин
Т ТгЬ Треонин
V Уа1 Валин
Р Рго Пролин
К Ьуз Лизин
н Ηίδ Гистидин
Ω О1п Глутамин
Е О1и Глутаминовая кислота
Ζ О1х О1и и/или О1п
У/ Тгр Триптофан
к Агд Аргинин
ϋ Азр Аспарагиновая кислота
N Азп Аспарагин
В Азх Азр и/или Азп
с Суз Цистеин
X Хаа Неизвестная или другая
Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков, представленные в настоящем документе в виде формулы, ориентированы слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу.
Кроме того, термин аминокислотный остаток в широком смысле включает аминокислоты, перечисленные в табл. соответствия (табл. 2), модифицированные и необычные аминокислоты, такие как упомянутые в 37 С.Р.К. §§ 1.821-1.822 и включенные здесь в качестве ссылки. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или в конце аминокислотной последовательности указывает на пептидную связь с дальнейшей последовательностью из одного или более аминокислотных остатков, с аминоконцевой группой, такой как N1Р, или с карбоксильной группой, такой как СООН.
В настоящем документе термин гидрофобные аминокислоты включает любую из аминокислот, для которой с использованием непрерывной шкалы гидрофобности Айзенберга установлено, что она является гидрофобной. Примерами являются природные гидрофобные аминокислоты, такие как изолейцин, фенилаланин, валин, лейцин, триптофан, метионин, аланин, глицин, цистеин и тирозин (Т^епЬегс и
- 26 020818 др., (1982) Рагайау 8утр. СНет. 8ос.17:109-120). Неприродные гидрофобные аминокислоты также включены в этот термин.
В настоящем документе кислые аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту из природных аминокислот. Неприродные кислые аминокислоты также включены в этот термин.
Используемый здесь термин природные аминокислоты относится к 20 Ь-аминокислотам, которые встречаются в полипептидах.
Используемый здесь термин неприродные аминокислоты относится к органическим соединениям, содержащим аминогруппу и карбоксильную группу, которые не являются природными аминокислотами, перечисленными в табл. 2. Неприродные аминокислоты, таким образом, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот за исключением 20 природных аминокислот и включают, но не ограничиваются, Ό-изостереомеры аминокислот. Примеры неприродных аминокислот известны специалистам в данной области и могут быть включены в модифицированные полипептиды фактора УП.
В настоящем документе конструкция ДНК представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит сегменты ДНК, комбинированные и составленные в порядке, не встречающемся в природе. Конструкция ДНК существует как результат человеческой деятельности и включает клоны и другие копии подвергнутых манипуляции молекул.
В настоящем документе сегмент ДНК представляет собой часть большей молекулы ДНК с указанными свойстами. Например, сегмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть большей молекулы ДНК, например плазмиды или фрагмента плазмиды, который при его прочтении от 5'-конца к 3'-концу кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида.
Используемый здесь термин полинуклеотид означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, читаемый от 5' к 3' концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы ш уНго или получены комбинированием натуральных и синтетических молекул. Длина полинуклеотидной молекулы дается здесь в нуклеотидах (сокращенно нт) или парах оснований (сокращенно Ьр).
Термин нуклеотиды используется для одноцепочечных и двухцепочечных молекул, где позволяет контекст. Когда термин применяется к двухцепочечной молекуле, он используется для обозначения общей длины и является синонимом термина пара оснований. Для специалиста в данной области техники очевидно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут незначительно отличаться по длине, и концы их могут быть расположены уступом, поэтому все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида не могут образовывать пары. Такие неспаренные концы обычно не превышают 20 нуклеотидов в длину.
В настоящем документе первичная последовательность относится к последовательности аминокислотных остатков в полипептиде.
Используемый здесь термин сходство для двух белков или нуклеиновых кислот относится к близости аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть основано на степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков.
Способы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области. Например, в одном способе оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают таким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности между последовательностями. Идентичность относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. При выравнивании аминокислотных последовательностей и в некоторой степени последовательностей нуклеотидов также можно принять во внимание консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Консервативными различиями являются те, при которых сохраняются физико-химические свойства участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей и по всем остаткам) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкий район или районы).
Используемые здесь термины гомология и идентичность употребляются как синонимы, но гомология по отношению к белкам может включать консервативные замены аминокислот. В общем, для определения соответствующих позиций последовательности аминокислот выравнивают для достижения наибольшего совпадения (см., например, Сотри1аПопа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., изд, 0хГогй Ишуегкйу Ргекк, №\ν Уогк, 1988; ВюсотриНпд: ИогтаНск апй Оепоте Рго)ес1к, 8тПН. Ό.\ν., изд, Асайетю Ргекк, №ν Уогк, 1993; СотрШег Апа1уык оГ 8еднепсе Оа1а, часть Ι, СггГйп, А.М., апй ОпГНп, Н. 0., изд., Нитапа Ргекк, №ν 1егкеу, 1994; 8еднепсе Апа1уык ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Неш_)е, 0., Асайетю Ргекк, 1987; и 8еднепсе Апа1уык РПтег, ОПЬккоу, М. апй Оеуегенх, I., изд., М 8(оск1оп Ргекк, №ν Уогк, 1991; СагШо и др. (1988) 81АМ.1 АррНей МаШ 48:1073).
В настоящем документе термин идентичность последовательности относится к числу идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований) при сравнении исследуемого и исходного полипептида или полинуклеотида. Гомологичные полипептиды обладают заранее определенным числом идентичных или
- 27 020818 гомологичных аминокислотных остатков. Гомология подразумевает консервативные аминокислотные замены и идентичные остатки. Идентичность последовательности может быть определена по стандартному алгоритму выравнивания, использующему выбранные по умолчанию штрафы за разрыв в последовательности, установленные разработчиком. Гомологичные молекулы нуклеиновой кислоты обладают заранее определенным числом идентичных или гомологичных нуклеотидов. Гомология подразумевает замены, которые не изменяют закодированные аминокислоты (т.е. молчащие замены) и идентичные остатки. Существенно гомологичные молекулы нуклеиновых кислот обычно гибридизуются в умеренных условиях или в жестких условиях по всей длине нуклеиновой кислоты или по меньшей мере приблизительно по 70, 80 или 90% от полной длины интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодона в гибридизуемой молекуле нуклеиновой кислоты. (Для определения гомологии белков консервативные аминокислоты а также идентичные аминокислоты могут быть выровнены, в этом случае процент идентичности и процент гомологии отличаются). Обладают ли любые две молекулы нуклеиновой кислоты нуклеотидными последовательностями (или любые два полипептида имеют аминокислотные последовательности), которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны, может быть определено с помощью известных алгоритмов, таких как программа РА8ТА с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано Реагкоп и др., Ргос. №ιΐ1. Асаб. 8с1. И8А 85: 2444 (1988) (другие программы включают пакет программ 0С0 (Эеуегеих. I.. и др., №с1ею Аибк КекеагсЬ 12(1): 387 (1984)), ВЬА8ТР, ВЬА8Т^ РА8ТА (А1ксЬи1, 8.Р., и др., I. Мо1ес. Вю1. 215:403 (1990); 0шбе Ю НидеСотри1егк, Магбп I. ВЫюр, изд., Асабетю Ргекк, 8ап Э1едо (1994), и СагШо и др. 81АМ I АррНеб МаШ 48: 1073 (1988)). Например, функция ВЬА8Т базы данных Национального центра биотехнологической информации может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески доступные или общедоступные программы включают программу ^NА8ίа^ МедАПдп (МабАоп, Висконсин) и программу 0ар генетической компьютерной группы университета Висконсина ииАегкбу оГ ААсопкш 0епеНск СотрШег 0гоир (ИА0) (МабАоп, Висконсин). Процент гомологии или идентичность белков и/или молекул нуклеиновых кислот могут быть определены, например, путем сравнения информации о последовательностях с использованием программы 0АР (см., например, №еб1етап и др., I. Мо1. Вю1. 48: 443 (1970), с изменениями, внесенными 8тНН и АаЮгтап (Абν. Арр1. МаШ. 2: 482 (1981)). Программа 0АР определяет сходство как число выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы 0АР могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для совпадения и 0 для не совпадения) и взвешенную матрицу сравнения СпЬккох и др., №с1. Ас1бк Кек. 14: 6745 (1986), как описано 8сН\уаг1/ и ОауНоГГ, Абак оГ Рго!еш 8едиепсе апб 81гис1иге, №Аопа1 Вютебюа1 КекеагсН Роипбабоп, сс. 353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 для каждого разрыва в последовательности, дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве и (3) штраф не применяется для разрывов в концах последовательности.
Таким образом, используемый здесь термин идентичность относится к сравнению исследуемого и начального полипептида или полинуклеотида. Например, фраза по меньшей мере на 90% идентичны относится к идентичности от 90 до 100% по отношению к начальному полипептиду. Принимая для иллюстративных целей длину исследуемого и начального полипептидов за 100 аминокислот, идентичность на уровне 90% и более свидетельствует о том, что не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в исследуемом полипептиде отличается от начального полипептида. Подобные сравнения можно провести между исследуемым и начальным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайно распределенных по всей длине аминокислотной последовательности, или различия могут быть сосредоточены в одном или нескольких местах различной длины вплоть до максимально допустимой, например, 10/100 различающихся аминокислот (около 90% идентичности). Различия определяются как замены, вставки и удаления нуклеиновых оснований и аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше приблизительно 85-90%) результат не должен зависеть от программы и параметров штрафа за разрыв, такие высокие уровни идентичности могут быть легко оценены, часто без использования программного обеспечения.
В настоящем документе термины в значительной степени идентичные или сходные варьируются в зависимости от контекста, как это понимает специалист в данной области техники.
В настоящем документе выровненная последовательность относится к использованию гомологии (сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих позиций в последовательности нуклеотидов или аминокислот. Как правило, две или более последовательности, которые связаны 50% и более идентичности, выравниваются. Выровненное множество последовательностей относится к 2 или более последовательностям, которые являются выровненными в соответствующих позициях, и может включать выравнивание последовательностей, полученных из РНК, таких как Е8Т и другие кДНК, с последовательностью геномной ДНК.
В настоящем документе термин специфически гибридизируется относится к отжигу через комплементарное спаривание оснований молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида) с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области известны ш уйго и ш νί\Ό
- 28 020818 параметры, которые влияют на специфическую гибридизацию, такие как длина и состав конкретной молекулы. Особенно важные для ίη νίίΓΟ гибридизации параметры дополнительно включают температуру отжига и отмывания, состав буфера и концентрацию соли. Примеры условий отмывания для удаления неспецифически связанных молекул нуклеиновой кислоты включают 0,1 х 88РЕ, 0,1% 8И8, 65°С при высокой жесткости, и 0,2 х 88РЕ, 0,1% 8И8, 50°С при умеренной жесткости. Эквивалентные условия известны в уровне техники. Специалист в данной области может легко изменить условия, подходящие для конкретной задачи для достижения специфической гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты.
В настоящем документе выделенный или очищенный полипептид или белок или его биологически-активная часть практически не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или тканей, из которых происходит белок, или является в значительной степени свободным от химических веществ-предшественников и других химических веществ при химическом синтезе. Препараты могут быть определены как существенно чистые, если они являются свободными от легко обнаруживаемых примесей, определяемых с помощью стандартных способов анализа, таких как тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), используемых специалистами в области техники для оценки чистоты, или препараты могут быть определены как достаточно чистые, если дальнейшая очистка не изменяет физические и химические свойства вещества, такие как протеолитическая и биологическая активность. Способы очистки соединений для получения существенно химически чистых соединений известны специалистам в данной области. Существенно химически чистые соединения, однако, могут представлять собой смесь стереоизомеров. В таких случаях дополнительная очистка может увеличить удельную активность соединения.
Термин практически свободный от клеточного материала относится к препаратам белков, где белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантно. В одном варианте термин практически свободный от клеточного материала относится к препарату протеазы, имеющему приблизительно менее 30% (на сухой вес) белков, не являющихся протезами (также называемых здесь загрязняющими белками), как правило, менее 20% белков, не являющихся протезами, или 10% белков, не являющихся протезами, или приблизительно менее 5% белков, не являющихся протезами. Если протеаза или ее активная часть являются рекомбинантными, то они являются существенно свободными от культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее приблизительно или точно 20, 10 или 5% от объема препарата протеазы.
Используемый здесь термин практически не содержат химических веществ-предшественников и других химических веществ относится к препарату протеазы, в котором белок отделен от химических веществ-предшественников и других химических веществ, которые использовали в синтезе белка. Этот термин включает препараты протеазы, имеющие менее 30% (на сухой вес), 20, 10, 5% или менее химических веществ-предшественников или химических веществ или компонентов, не являющихся протеазой.
В настоящем документе получение рекомбинантными методами с помощью методов рекомбинантной ДНК относится к использованию хорошо известных способов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК.
В настоящем документе вектор (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетки для их экспрессии или репликации. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть разработаны для осуществления интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы, такие как бактериальные искусственные хромосомы, искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих. Выбор и использование таких векторов хорошо известны специалистам в данной области.
В настоящем документе экспрессия означает процесс, посредством которого нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК и транслируется в пептид, полипептид или белок. Если нуклеиновая кислота происходит от геномной ДНК, то при наличии соответствующей выбранной эукариотической клеткихозяина или организма экспрессия может включать процессинг, такой как сплайсинг РНК.
В настоящем документе вектор экспрессии включает векторы, способные экспрессировать ДНК, функционально связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные районы, которые способны вызывать экспрессию таких фрагментов ДНК. Такие дополнительные сегменты могут включать промоторные и терминаторные последовательности и, при необходимости, могут включать одну или несколько точек начала репликации, один или более маркеров для отбора, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.п. Векторы экспрессии обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК, или вектор может содержать элементы того и другого. Таким образом, вектор экспрессии относится к рекомбинантным ДНК или РНК конструкциям, например плазмидам, фагам, рекомбинантным вирусам или другим векторам, которые после введения в соответствующую клетку-хозяина приводят к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие векторы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются в эписомном состоянии, или векторы, которые интегриру- 29 020818 ются в геном клетки-хозяина.
В настоящем документе вектор также включает вирусный вектор или вирусные векторы. Вирусные векторы представляют собой сконструированные вирусы, функционально связанные с экзогенным геном для передачи (как носитель или челкок) экзогенного гена в клетки.
В настоящем документе аденовирус относится к любому вирусу из группы ДНК-содержащих вирусов, которые вызывают конъюнктивит и инфекции верхних дыхательных путей у человека.
В настоящем документе голая ДНК относится к свободной от гистонов ДНК, которая может быть использована для получения вакцин и генной терапии. Голая ДНК представляет собой генетический материал, который передается от клетки к клетке во время переноса генов, называемого трансформацией или трансфекцией. При трансформации или трансфекции очищенная или голая ДНК, поглощенная клеткой-реципиентом, дает клетке-реципиенту новую характеристику или фенотип.
В настоящем документе термины функционально или функционально связанный по отношению к сегментам ДНК означают, что сегменты расположены так, что они функционируют в соответствии с их назначением, например транскрипция инициируется на промоторе и проходит через кодирующий сегмент до терминатора.
В настоящем документе агент модулирует активность белка или экспрессию гена или нуклеиновой кислоты, уменьшает или увеличивает или иным образом изменяет активность белка или каким-либо образом усиливает или ослабляет или иным образом изменяет экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке.
В настоящем документе химерный белок или гибридный белок относится к полипептиду, функционально связанному с другим полипептидом. Химерные или гибридные белки, предусмотренные в настоящем документе, могут включать один или несколько полипептидов ГУП или их части и один или несколько других полипептидов с любым одним или несколькими сигналами управления транскрипции/трансляции, сигнальными последовательностями, меткой для локализации, меткой для очистки, доменом иммуноглобулина С и/или нацеливающим агентом. Химерные полипептиды ГУП также включают полипептиды с эндогенными доменами или районами, обмененными с другим полипептидом. Эти химерные или гибридные белки включают белки, полученные с помощью рекомбинантной технологии как гибридные белки, полученные химическими методами белки, например полученные путем химического соединения, например соединения сульфгидрильных групп, белки, полученные с использованием любого другого способа, с помощью которого по меньшей мере один полипептид (т.е. ГУП) или его часть связаны прямо или косвенно через линкер(линкеры) с другим полипептидом.
В настоящем документе понятие функционально связанные по отношению к гибридному белку относится к протеазе и не протеазе, которые гибридизованы в одной рамке считывания друг с другом. Полипептид, не являющийся протеазой, может быть гибридизован с Ν-концом или С-концом протеазы.
В настоящем документе нацеливающий агент представляет собой любой фрагмент, такой как белок или его активная часть, который обеспечивает специфическое связывание с молекулой клеточной поверхности, такой как рецептор клеточной поверхности, которая в некоторых случаях может интернализовать связанный конъюгат или его часть. Нацеливающий агент также может представлять собой агент, который способствует или облегчает, например, аффинное выделение или очистку конъюгата, прикрепление конъюгата к поверхности или выявление конъюгата или комплекса, содержащего конъюгат.
В настоящем документе производное или аналог молекулы относится к части молекулы или модифицированной молекуле.
Используемый здесь термин заболевание или расстройство относится к патологическим состояниям организма, возникшим в результате факторов или состояний, включающих, но не ограничивающихся, инфекцией, приобретенными состояниями, генетическими состояниями, и характеризующихся идентифицируемыми симптомами. Заболевания и расстройства по настоящему документу включают заболевания и расстройства, затрагивающие коагуляцию, включая опосредованные участвующими в коагуляции белками заболевания и расстройства и заболевания и расстройства, в которых участвующие в коагуляции белки играют важную роль в этиологии и патологии. Заболевания и расстройства также включают вызванные отсутствием белков заболевания и расстройства, такие как гемофилии, при которых коагуляция не происходит из-за дефицита или дефекта белков, такие заболевания и расстройства представляют особый интерес в настоящем документе.
В настоящем документе термин прокоагулянт относится к любому веществу, которое способствует свертыванию крови.
В настоящем документе термин антикоагулянт относится к любому веществу, которое препятствует свертыванию крови.
В настоящем документе гемофилия относится к заболеванию, связанному с кровотечениями, обусловленному дефицитом в крови факторов свертывания. Гемофилия может быть результатом, например, отсутствия, уменьшения экспрессии или снижения функционирования фактора свертывания крови. Наиболее распространенным типом гемофилии является гемофилия А, являющаяся результатом дефицита фактора УШ. Второй по распространенности тип гемофилии представляет собой гемофилию В, являющуюся результатом дефицита фактора IX. Гемофилия С, которую также называют дефицитом ГХ1, явля- 30 020818 ется более мягкой и менее распространенной формой гемофилии.
Используемый здесь термин врожденная гемофилия относится к типам гемофилии, которые наследуются. Врожденная гемофилия является результатом мутации, удаления, вставки или другой модификации гена фактора свертывания крови, при которых фактор свертывания не образуется, образуется в меньшем количестве или не функционирует. Например, наследственные мутации в генах факторов свертывания крови, таких как фактор УШ и фактор IX, приводят к врожденным гемофилиям, гемофилии А и В соответственно.
В настоящем документе термин приобретенная гемофилия относится к типу гемофилии, который развивается в зрелом возрасте в результате образования аутоантител, которые инактивируют РУШ.
Используемый здесь термин нарушение свертываемости крови относится к состоянию, при котором у субъекта снижена способность останавливать кровотечения. Нарушения свертываемости крови могут быть наследственными или приобретенными и могут возникнуть в результате, например, дефекта или недостаточности пути коагуляции, дефекта или недостаточности активности тромбоцитов или дефектов сосудов.
В настоящем документе приобретенное нарушение свертываемости крови относится к нарушению свертываемости крови, вызванному недостаточностью свертывания вследствие заболевания печени, дефицита витамина К или применения кумадина (варфарина) или другой антикоагулянтной терапии.
В настоящем документе лечение субъекта, страдающего заболеванием или состоянием, означает, что полипептид, композиция или другой продукт, предусмотренный в этом документе, вводят субъекту.
В настоящем документе терапевтический агент, схема лечения, радиопротектор или химиотерапевтический агент означают обычные лекарства и лекарственную терапию, включая вакцины, которые известны специалистам в данной области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в уровне техники.
В настоящем документе лечение представляет собой любой способ уменьшения или иного благотворного изменения симптомов состояния, расстройства или заболевания. Поэтому лечение включает профилактику, терапию и/или излечение. Лечение также включает любое фармацевтическое использование композиции по настоящему документу. Лечение также включает любое фармацевтическое использование предусмотренных в настоящем документе модифицированных РУН и композиций.
В настоящем документе улучшение симптомов заболевания или расстройства посредством лечения, например, фармацевтической композицией или лекарственным средством, относится к любому уменьшению, постоянному или временному, устойчивому или кратковременному, симптомов, связанному с введением или приписываемому введению композиции или лекарственного средства.
В настоящем документе профилактика или предотвращение относится к способам уменьшения риска развития заболевания или состояния. Профилактика включает уменьшение риска развития заболевания или состояния и/или предотвращение ухудшения симптомов или развития заболевания, или уменьшение риска ухудшения симптомов или развития заболевания.
В настоящем документе эффективное количество соединения или композиции для лечения конкретного заболевания представляет собой количество, которое является достаточным для улучшения или любого уменьшения симптомов, связанных с заболеванием. Такое количество может быть введено одной дозой или согласно режиму введения, при котором введение эффективно. Указанное количество может привести к выздоровлению, но обычно приводит к улучшению симптомов заболевания. Обычно для достижения желаемого улучшения симптомов требуются повторные введения.
В настоящем документе пациент или субъект, подвергающийся лечению, включает человека и животных, не представляющих собой человека, в том числе млекопитающих. Млекопитающие включают приматов, таких как люди, шимпанзе, гориллы и низшие приматы; домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, свиньи, козы, коровы; и грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и песчанки.
В настоящем документе комбинация относится к любому соединению двух или более элементов. Комбинация может быть пространственной или относится к использованию двух или более элементов для одной цели.
В настоящем документе композиция относится к любой смеси двух или более продуктов или соединений (например, агентов, модуляторов, регуляторов, и т.д.). Композиция может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную или неводную рецептуру или их комбинации.
В настоящем документе изделие представляет собой продукт, который изготавливается и продается. В настоящем документе термин включает модифицированные протеазы и нуклеиновые кислоты, содержащиеся в упаковке.
В настоящем документе жидкая композиция относится к любой композиции, которая может течь. Таким образом, жидкие композиции включают композиции в полужидкой форме, пасты, растворы, водные смеси, гели, лосьоны, кремы и другие подобные композиции.
В настоящем документе набор относится к комбинации, помещенной в упаковку, по желанию содержащей реагенты и другие продукты и/или компоненты для осуществления способов по изобретению с помощью элементов комбинации. Например, в настоящем документе предусмотрены наборы, содержащие модифицированные протеазы или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению и еще один
- 31 020818 элемент, предназначенный для введения, диагностики или оценки биологической активности или свойства. По желанию, наборы включают инструкции по использованию.
В настоящем документе антитела включают фрагменты антител, такие как РаЬ фрагменты, которые состоят из легкой цепи и вариабельного района тяжелой цепи.
В настоящем документе рецептор относится к молекуле, обладающей аффинности к конкретному лиганду. Рецепторы могут быть природными или синтезированными молекулами. Рецепторы могут быть упомянуты как антилиганды.
В настоящем документе животные включают любых животных, включая, но не ограничиваясь, приматов, таких как человек, горилла и низшие приматы; грызунов, таких как мыши и крысы; птиц, таких как куры; жвачных животных, таких как козы, коровы, олени, овцы, мелкий домашний скот, такой как свиньи; и других животных. В понятии не включающие человека животные люди исключены из числа предусмотренных животных. Предусмотренные здесь протеазы могут происходить из любого источника, включая животных, растения, прокариоты и грибы.
В настоящем документе генная терапия включает перенос гетерологичных нуклеиновых кислот, таких как ДНК, в определенные клетки, клетки-мишени млекопитающих, особенно человека, страдающего расстройством или состоянием, для которого известна такая терапия. Нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, вводят в выбранные клетки-мишени непосредственно либо в векторе или другом средстве доставки таким образом, что гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, экспрессируются и производят таким образом закодированный терапевтический продукт. Альтернативно, гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, могут каким-либо образом влиять на экспрессию ДНК, которая кодирует терапевтический продукт, или могут кодировать продукт, такой как пептид или РНК, который каким-либо образом влияет, прямо или косвенно, на экспрессию терапевтического продукта. Генная терапия также может быть использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей генетический продукт, который заменяет дефектный ген или дополняет генетический продукт, продуцируемый млекопитающим или клеткой, в которые введена нуклеиновая кислота. Введенная нуклеиновая кислота может кодировать терапевтическое соединение, такое как протеаза или модифицированная протеаза, которые обычно не производятся млекопитающим-хозяином или не производятся в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически полезное время.
Гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, кодирующие терапевтический продукт, могут быть модифицированы до введения в клетки страдающего хозяина для усиления или иного изменения продукта или его экспрессии. Генетическая терапия также может включать доставку ингибитора, репрессора или другого модулятора экспрессии генов.
В настоящем документе гетерологичная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в нормальных условиях не продуцируется клеткой ίη νίνο, в которой она экспрессируется, или представляет собой нуклеиновую кислоту, которая продуцируется клеткой, но находится в другом локусе, или представляет собой нуклеиновую кислоту, которая иначе экспрессируется, или влияет на экспрессию эндогенных нуклеиновых кислот или кодирует посредник, который изменяет экспрессию эндогенных нуклеиновых кислот, таких как ДНК, путем воздействия на транскрипцию, трансляцию, или другие регулируемые биохимические процессы. Гетерологичная нуклеиновая кислота, как правило, не является эндогенной для клетки, в которую она введена, но такая нуклеиновая кислота может быть получена из другой клетки или получена синтетически. Гетерологичная нуклеиновая кислота может быть эндогенной нуклеиновой кислотой, но экспрессироваться с другого локуса или обладать изменениями в экспрессии. Обычно, но не обязательно, такие нуклеиновые кислоты кодируют РНК и белки, которые обычно не продуцируются клеткой или продуцируются клеткой, в которой экспрессированы нуклеиновые кислоты, иным образом. Гетерологичная нуклеиновая кислота, такая как ДНК, также может быть упомянута как чужеродная нуклеиновая кислота, такая как ДНК. Таким образом, гетерологичные нуклеиновые кислоты или чужеродные нуклеиновые кислоты включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые не присутствуют в такой ориентации или позиции, как аналогичная молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, присутствующая в геноме. Гетерологичная нуклеиновая кислота также может относиться к молекуле нуклеиновой кислоты из другого организма или вида (т.е. экзогенной нуклеиновой кислоте).
Любая нуклеиновая кислота, такая как ДНК, которую специалист в области техники определяет или рассматривает как гетерологичную или чужеродную для клетки, в которой нуклеиновая кислота экспрессируется, рассматривается здесь как гетерологичная нуклеиновая кислота; гетерологичная нуклеиновая кислота включает экзогенно внесенную нуклеиновую кислоту, которая экспрессируется эндогенно. Примеры гетерологичных нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются, нуклеиновые кислоты, которые кодируют отслеживаемые белки-маркеры, такие как белок, который придает лекарственную устойчивость, нуклеиновые кислоты, которые кодируют терапевтически эффективные вещества, такие как противораковые агенты, ферменты и гормоны, и нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, которая кодирует другие типы белков, такие как антитела. Антитела, кодируемые гетерологичными нуклеиновыми кислотами, могут быть секретированы или экспрессированы на поверхности клеток, в которые были введены гетерологичные нуклеиновые кислоты.
- 32 020818
В настоящем документе терапевтически эффективный продукт в генной терапии представляет собой продукт, который кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, как правило, ДНК, который при введении нуклеиновой кислоты в хозяина экспрессируется и улучшает или устраняет симптомы и проявления наследственного или приобретенного заболевания или который вылечивает заболевание. Терапевтически эффективный продукт также подразумевает биологически активные молекулы нуклеиновых кислот, такие как интерферирующие и антисмысловые РНК.
В настоящем документе утверждение, что полипептид состоит в основном из указанной последовательности аминокислот означает, что только указанная ее часть или ее фрагмент присутствует в полипептиде полной длины. Полипептид, по желанию, как правило, включает дополнительные аминокислоты из другого источника или может быть вставлен в другой полипептид.
В настоящем документе упоминание понятий в единственном числе также включает множественное число, если контекст с очевидностью не указывает на иное. Таким образом, например, упоминание соединения, включающего внеклеточный домен относится к соединениям с одним или несколькими внеклеточными доменами.
В настоящем документе диапазоны и количества могут быть обозначены, как конкретные значения или диапазоны с добавлением термина приблизительно. Термин приблизительно также включает в себя точное значение. Следовательно, приблизительно 5 оснований означает приблизительно 5 оснований, а также 5 оснований.
В настоящем документе термины по желанию или необязательно означают, что описанные явления или обстоятельства могут иметь место или не иметь места и что описание включает случаи, когда указанное явление или обстоятельство происходит, и случаи, когда это не так. Например, необязательно замещенная группа означает, что группа не является замещенной или является замещенной.
В настоящем документе аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иное, употребляются в соответствии с их обычным использованием и являются признанными аббревиатурами или употребляются в соответствии с Комиссией по биохимической номенклатуре ШРЛС-ШВ (см. (1972) ВюсЬет. И: 1726).
В. Обзор гемостаза.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды фактора ΥΙΙ (ΡΥΙΙ). Такие полипептиды ΡΥΙΙ модифицированы для увеличения коагулянтной активности. Соответственно, эти полипептиды имеют множество применений и возможностей применения, например, в качестве терапии для изменения гемостаза и других близких биологических процессов. Чтобы оценить предусмотренные в настоящем документе модификации и возможности применения таких модифицированных молекул ΡΥΙΙ, необходимо понимание системы свертывания крови и каскада реакций свертывания. Приведенное ниже обсуждение обеспечивает такое понимание и является вступлением к обсуждению фактора ΥΙΙ и его модификаций.
Гемостаз является физиологическим механизмом остановки кровотечения, являющегося результатом повреждения сосудов. Нормальный гемостаз зависит от клеточных компонентов и растворимых белков плазмы и включает ряд сигнальных актов, которые в конечном итоге приводят к образованию сгустков. Процесс коагуляция быстро запускается после травмы, повреждающей кровеносный сосуд и эндотелиальные клетки. В первой фазе свертывания активируются тромбоциты, формирующие гемостатическую пробку в месте повреждения. Вторичный гемостаз происходит с участием факторов коагуляции плазмы, которые действуют в протеолитическом каскаде, приводя к образованию нитей фибрина, которые укрепляют тромбоцитарную пробку. При травме сосуда приток крови непосредственно к травмированному участку ограничен за счет сужения сосуда, что позволяет тромбоцитам прикрепиться к экспонированному фибриллярному коллагену субэндотелиальной соединительной ткани. Адгезия тромбоцитов зависит от фактора фон Виллебранда (νΑΡ), который связывается с эндотелием в течение трех секунд после травмы, тем самым способствуя адгезии и агрегации тромбоцитов. Активация агрегированных тромбоцитов приводит к секреции различных факторов, в том числе АДФ, АТФ, тромбоксана и серотонина. Также высвобождаются молекулы адгезии, фибриноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин и фибронектин. Такая секреция способствует дополнительной адгезии и агрегации тромбоцитов, усилению активации тромбоцитов и сужению кровеносных сосудов, а также экспонированию анионных фосфолипидов на поверхности тромбоцитов, которые служат платформами для сборки ферментных комплексов свертывания крови. Тромбоциты изменяют фору, формируя псевдоподии, что еще больше способствует агрегации тромбоцитов, приводящей к рыхлой тромбоцитарной пробке.
Одновременно запускается пептидазный каскад свертывания (каскад коагуляции). Каскад свертывания включает ряд активационных актов, включающих протеолитическое расщепление. В таком каскаде неактивные сериновые протеазы (также называемые зимогенами) превращаются в активные протеазы путем расщепления одной или нескольких пептидных связей, где активированные протеазы затем служат активирующими протеазы для следующей молекулы зимогена в каскаде, что, в конечном счете, приводит к формированию сгустка поперечно-сшитого фибрина. Например, каскад приводит к образованию активированных молекул, таких как тромбин (продукт расщепления протромбина), что еще больше активирует тромбоциты, а также приводит к образованию фибрина в процессе расщепления фибриногена.
- 33 020818
Затем фибрин формирует сшитый полимер вокруг тромбоцитарной пробки для стабилизации сгустка. После исправления повреждений фибрин расщепляется фибринолитической системой, основными компонентами которой являются плазминоген и активатор плазминогена тканевого типа (ΐΡΑ). Оба этих белка были включены в полимеризующийся фибрин, где они взаимодействуют с образованием плазмина, который, в свою очередь, действует на фибрин для растворения образованного сгустка. Во время образования сгустков ингибиторы факторов свертывания также циркулируют в крови для предотвращения образования сгустков вне места повреждения.
Действие системы от травмы до формирования сгустка и последующий фибринолиз описаны ниже.
1. Адгезия и агрегация тромбоцитов.
Свертывание крови активно блокируется при нормальных условиях. Эндотелий сосудов поддерживает расширение кровеносных сосудов, препятствует адгезии и активации тромбоцитов, подавляет коагуляцию, усиливает расщепление фибрина и обладает противовоспалительными свойствами. Клетки эндотелия сосудов секретируют молекулы, такие как оксид азота (НО) и простациклин, которые ингибируют агрегацию тромбоцитов и расширяют кровеносные сосуды. Высвобождение этих молекул активирует растворимую гуанилатциклазу (рГЦ) и цГМФ-зависимую протеинкиназу I (сОЫ) и увеличивает уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), что вызывает расслабление гладкой мускулатуры в стенке сосуда. Кроме того, эндотелиальные клетки экспрессируют на поверхности клетки АДФазы, такие как СБ39. которые контролируют активацию и агрегацию тромбоцитов путем преобразования АДФ, высвобожденного из тромбоцитов, в адениновые нуклеотиды, ингибирующие тромбоциты. Эндотелий играет важную роль в регуляции ферментов фибринолитического каскада. Эндотелиальные клетки непосредственно содействуют образованию плазмина через экспрессию рецепторов плазминогена (аннексина II) и урокиназы, а также через секрецию активатора плазминогена тканевого типа и урокиназного активатора плазминогена, все они способствуют растворению сгустка. Эндотелиальные клетки также играют активную роль в подавлении свертывания через образование гепарансульфата, который увеличивает кинетику ингибирования тромбина и других факторов свертывания крови антитромбином III.
При острой сосудистой травме, однако, сосудосуживающие механизмы преобладают и эндотелий приобретает протромботический, прокоагулянтный и провоспалительный характер. Это достигается за счет уменьшения количества эндотелиальных расширяющих агентов: аденозина, NΟ и простациклина, а также прямым действием АДФ, серотонина и тромбоксана на гладкомышечные клетки сосудов, что вызывает их сокращение (Вескег, Нешй1 и др., 2000). Главным толчком к изменению функции эндотелия, который приводит к формированию гемостатического тромба, является потеря эндотелиального барьера между кровью и компонентами внеклеточного матрикса (ЕСМ) (Кцддеп (2002) Νΐ Мей 8:1227-1234). Циркулирующие тромбоциты выявляют и различают зоны поражения эндотелия и прикрепляются к экспонированному субэндотелию. Их взаимодействие с различными тромбогенными субстратами и локально образованными или высвобожденными агонистами приводит к активации тромбоцитов. Этот процесс описывают как включающий два этапа: 1) прикрепление - начальное связывание с поверхностью и 2) агрегацию - склеивание тромбоцитов друг с другом ^ауаде и др., (2001) Сигг Орш Нета1о1 8:270-276).
Адгезия тромбоцитов начинается, когда циркулирующие тромбоциты связываются с экспонированным коллагеном через взаимодействие со связывающими коллаген белками на поверхности клеток и через взаимодействие с фактором Виллебранда, присутствующим на эндотелии. Фактор Виллебранда представляет собой белок мультимерной структуры и переменного размера, секретируемый эндотелием в двух направлениях: базолатерально и в кровоток. Фактор Виллебранда также связывается с фактором УШ, что играет важную роль в стабилизации фактора УШ и его существовании в крови.
Адгезия и последующая активация тромбоцитов достигаются при связывании фактора Виллебранда через домен А1 с ΟΡΦ (часть гликопротеинового рецепторного комплекса тромбоцитов ΟΡΚ-ΕΧ-Ϋ). Взаимодействие между фактором Виллебранда и ΟΡΦ регулируется поперечной силой, так что увеличение поперечного натяжения приводит к соответствующему увеличению аффинности фактора Виллебранда к ΟΡΦ.
Интегрин α1β2, также известный как белок ΥΕΑ-2 на лейкоцитах, является главным рецептором коллагена тромбоцитов, и связывание с этим рецептором генерирует внутриклеточные сигналы, которые способствуют активации тромбоцитов. Связывание α1β2 облегчает связывание с рецепторами коллагена низкой аффинности ΟΡ УТ. Указанные рецепторы являются частью суперсемейства иммуноглобулинов и генерируют самый мощный внутриклеточный сигнал активации тромбоцитов. Активация тромбоцитов приводит к высвобождению аденозиндифосфата (АДФ), который превращается в тромбоксан А1.
Активации тромбоцитов также приводит к экспрессии на поверхности тромбоцитов гликопротеина рецептора ПВ-Ша (ΟΡ ГВ-Ша), также известного как интегрин тромбоцитов αΠι,β3 Рецепторы ΟΡ ПВ-Ша позволяют тромбоцитам присоединяться друг к другу (агрегировать) за счет молекул фибриногена, связывающих тромбоциты через рецепторы. Это приводит к образованию тромбоцитарной пробки на месте повреждения, что способствует предотвращению дальнейшей потери крови, а поврежденные ткани сосудов высвобождают факторы, которые запускают каскад коагуляции и образование стабилизированной фибриновой сетки вокруг тромбоцитарной пробки.
- 34 020818
2. Каскад свертывания.
Коагуляционный путь представляет собой протеолитический путь, в котором каждый фермент присутствует в плазме в виде зимогена, неактивной формы. Расщепление зимогена приводит к образованию активной формы из молекулы-предшественника. Кофакторы активированных протеаз, такие как гликопротеины РУШ и РУ, также активируются в каскаде реакций и играют важную роль в формировании сгустка. Коагуляционный путь функционирует как система положительных и отрицательных обратных связей, которые контролируют процесс активации, где конечной целью пути является образование тромбина, который затем может превращать растворимый фибриноген в фибрин с образованием сгустка. Факторы коагуляции, как правило, обозначают римскими цифрами со строчной буквой а для указания активированной формы. В табл. 3 ниже приведен примерный перечень факторов, включая их общепринятое название и роль в свертывании. Как правило, указанные белки участвуют в свертывании крови по одному или нескольким путям, таким как внутренний, внешний или общий пути свертывания (см. фиг. 1). Как будет показано ниже, эти пути взаимосвязаны, и свертывание крови, как полагают, происходит по клеточной модели, а активация фактора УП (РУН) является основным инициатором свертывания.
Τаблица 3
Факторы коагуляции
Фактор Тривиальное название путь характеристика
I Фибриноген Оба -
II Протромбин Оба Содержит Ν-концевой домен О1а
III Тканевый фактор Внешний -
IV Кальций Оба -
V Проакцелерин, лабильный фактор, акцелератор-глобулин Оба Белковый фактор
VI (νΐα) Акцелерин (Является фактором V)
VII Проконвертин, сывороточный ускоритель предвращения тромбина, котромбопластин Внешний Эндопептидаза с доменом О1а
VIII Антигемофильный фактор А, антигемофильный глобулин Внутренний Белковый фактор
IX Кристмас-фактор, антигемофильный фактор В, плазменный компонент тромбопластина Внутренний Эндопептидаза с доменом О1а
X Фактор Стюарта-Прауэра Оба Эндопептидаза с доменом О1а
XI Плазменный предшественник тромбопластина внутренний Эндопептидаза
XII Фактор Хагемана внутренний Эндопептидаза
XIII Протрансглутамидаза, стабилизирующий фибрин фактор, фибринолигаза Оба Т ранспептидаза
* Τаблица адаптирована из М.'ЭД’. Κίπ§ (2006) на шеИишЪзлР-МагсРезРЫооИЫт
Образование тромбина исторически было разделено на три пути, внутренний (в предположении, что все компоненты пути содержит плазма), внешний (в предположении, что один или более компонентов пути являются внешними по отношению к плазме) пути, которые обеспечивают альтернативные маршруты образования активированного фактора Х (РХа), и окончательный общий путь, приводящий к образованию тромбина (фиг. 1). Эти пути вместе участвуют во взаимосвязанном и взаимозависимом процессе, приводящем к свертыванию. Была разработана клеточная модель коагуляции, описывающая эти пути (фиг. 2) (Нойшап и др. (2001) ТРгошЪ Наешоз! 85:958-965). В этой модели внешний и внутренний пути осуществляются на различных клеточных поверхностях, несущей тканевый фактор (ΤΦ) клетке и тромбоците соответственно. Процесс коагуляции разделен на отдельные фазы, инициацию, усиление и распространение, в ходе которых внешний и внутренний пути функционируют на различных этапах для получения большого количества тромбина, необходимого для преобразования достаточного количества фибриногена в фибрин для образования сгустка.
а. Инициация.
РУН считают фактором свертывания, отвечающим за инициацию каскада свертывания, которая зависит от его взаимодействия с ΤΦ. ΤΦ является трансмембранным гликопротеидом, экспрессируемым в различных клетках, таких как гладкомышечные клетки, фибробласты, моноциты, лимфоциты, гранулоциты, тромбоциты и эндотелиальные клетки. Миелоидные клетки и эндотелиальные клетки экспрессируют ΤΦ только при стимулировании, например, провоспалительными цитокинами. Гладкомышечные клетки и фибробласты, однако, экспрессируют ΤΦ конститутивно. Соответственно, как только эти клетки вступают в контакт с кровотоком после повреждения тканей, свертывание быстро инициируется связыванием ΤΦ с фактором УП или РУПа в плазме.
- 35 020818
Как будет показано ниже, большая часть РМП в крови присутствует в зимогенной форме с небольшим количеством, примерно составляющим 1%, присутствующим в виде РМПа. Однако в отсутствие связывания с ТФ даже РМПа обладает зимогеноподобными характеристиками и не проявляет значительную активность, пока не образует комплекс с ТФ. Таким образом, РМП плазмы требует для полноценной активности протеолитического расщепления, а также дополнительных конформационных изменений при взаимодействии с ТФ. Было показано, что ряд протеаз, в том числе факторы БХа, Ха, ХПа и тромбин, способны расщеплять РМП ίη νίίτο, этот процесс ускоряется в присутствии ТФ. РМПа также может активировать РМП в присутствии ТФ, этот процесс называется самоактивацией. Небольшие количества РМПа присутствуют в крови, вероятно, из-за активации фактором РХа и/или РРХ (Айбдооке и др., (1992) Βίοοά 80:25-28, и Ви1епа5 и др. (1996) ВюсНетМгу 35:1904-1910). Комплексы ТФ/РМПа могут, таким образом, быть сформированы прямым связыванием РМПа с ТФ или связыванием РМП с ТФ и последующей активацией РМП в РМПа протеазой плазмы, такой как РХа, РБХ, РХПа или сам РМПа. Комплекс ТФ/РМПа остается связанным с несущей ТФ клеткой, где он активирует небольшие количества РХ с образованием РХа в так называемом внешнем пути коагуляции.
Комплекс ТФ/РМПа также расщепляет небольшие количества РБХ с образованием РБХа. РХа ассоциирует со своим кофактором ΡУа с образованием комплекса на несущей ТФ клетке, который затем может превращать протромбин в тромбин. Образуется небольшое количество тромбина, которого, однако, недостаточно для поддержания необходимого уровня образования фибрина для полного свертывания.
Кроме того, активные РХа и РБХа ингибируются в кровотоке антитромбином III (АТ-Ш) и другими серпинами, которые описаны более подробно ниже. Это, как правило, предотвращает свертывание крови в кровотоке. При наличии травмы, однако, повреждение сосуда приводит к агрегации тромбоцитов и активации в этом месте образования тромбина, что приводит к усилению коагуляционного сигнала.
b. Усиление.
Усиление происходит, когда тромбин связывается с тромбоцитами и активирует их. Активированные тромбоциты высвобождают ΡУ из альфа-гранул, который активируется тромбином с образованием ΡУа. Тромбин также высвобождает и активирует РМШ из ΡУШ/νАΡ комплекса на мембране тромбоцитов и расщепляет ΡXI в РХБа Эти реакции приводят к активированным тромбоцитам с ΡУа, РМШа и РБХа на поверхности, которые представляют собой основу для стремительного увеличения количества тромбина на этапе распространения.
c. Распространение.
Распространение коагуляции происходит на поверхности большого количества тромбоцитов в месте повреждения. Как описано выше, активированные тромбоциты несут РХЫ, РМШа и ΡУа на своей поверхности. Именно здесь осуществляется внешний путь свертывания. РХЫ активирует РБХ с образованием РБХа, который затем может связаться с РМШа. Этот процесс вместе с образованием небольшого количества РБХа при расщеплении закрепленного на несущей ТФ клетке ТФ/РМПа комплекса приводит к большому количеству ΡXIа/ΡУШа комплексов, которые, в свою очередь, могут активировать значительное количество РХ с образованием РХа. Молекулы РХа связываются с ΡУа с образованием протромбиназных комплексов, которые активируют протромбин в тромбин.
Тромбин действует в положительной обратной связи, активируя еще больше тромбоцитов и снова инициируя процессы, описанные для фазы усиления.
Очень быстро накапливается достаточное количество активированных тромбоцитов с соответствующими комплексами для создания большого количества тромбина, которого достаточно для получения достаточного количества фибрина из фибриногена для формирования сгустка фибрина. Фибриноген представляет собой растворимый в плазме димер, который при расщеплении тромбином высвобождает фибринопептид А и фибринопептид В. Фибринопептид В затем расщепляется тромбином, и полученные в результате второго протеолитического расщепления мономеры фибрина спонтанно формируют нерастворимый гель. Полимеризованный фибрин удерживается нековалентными и электростатическими силами и стабилизируется трансамидирующим ферментом фактором ХШа (РХШа), образованным при расщеплении РХШ тромбином. Тромбин также активирует ТАИ, который ингибирует фибринолиз за счет уменьшения образования плазмина на поверхности сгустка. Кроме того, тромбин сам включается в структуру сгустка для дальнейшей стабилизации. Описанные нерастворимые агрегаты фибрина (сгустки) вместе с агрегированными тромбоцитами (тромбы) блокируют поврежденный кровеносный сосуд и предотвращают дальнейшее кровотечение.
3. Регуляция свертывания.
Во время свертывания каскад регулируется конститутивными и стимулированными процессами, ингибирующими дальнейшее формирование сгустка. Для наличия таких регулирующих механизмов существует несколько причин. Во-первых, регуляция необходима для ограничения ишемии тканей при формирования сгустка фибрина. Во-вторых, регуляция предотвращает распространение тромбоза, ограничивая образование сгустка только местом повреждения тканей.
Регуляция достигается за счет нескольких ингибиторных молекул. Например, антитромбин III (АТIII) и ингибитор пути тканевого фактора (ТРРО конститутивно ингибируют факторы каскада свертывания. АТ-Ш ингибирует тромбин, ИХа и РХа, в то время как ТΡРI ингибирует РХа и РМПа/ТФ комплекс.
- 36 020818
Дополнительный фактор белок С, который стимулируется активацией тромбоцитов, регулирует коагуляцию путем протеолитического расщепления и инактивации РУа и РУШа. Белок 8 повышает активность белка С. Кроме того, еще одним фактором, который способствует ингибированию коагуляции, является интегральный мембранный белок тромбомодулин, который образуют эндотелиальные клетки сосудов и который служит в качестве рецептора для тромбина. Связывание тромбина с тромбомодулином ингибирует прокоагулянтную активность тромбина, а также способствует активации белка С.
Фибринолиз, разрушение фибринового сгустка, также представляет собой механизм регуляции свертывания. Сшитые мультимеры фибрина в сгустке разрушаются до растворимых полипептидов плазмином, сериновой протеазой. Плазмин может быть получен из его неактивного предшественника плазминогена и привлечен к фибриновому сгустку двумя способами: за счет взаимодействия с тканевым активатором плазминогена (1РА) на поверхности фибринового сгустка и за счет взаимодействия с урокиназным активатором плазминогена (УАП) на клеточной поверхности. Полагают, что первый механизм является основным механизмом, ответственным за растворение тромбов в кровеносных сосудах. Второй механизм, способный опосредовать растворение сгустка, может также играть важную роль в перестройке ткани, миграции клеток и воспалении.
Растворение сгустка также регулируется двумя путями. Во-первых, эффективная активация плазмина и фибринолиз происходят только в комплексах, образованных на поверхности сгустка или на клеточной мембране, в то время как свободные белки в крови являются неэффективными катализаторами и быстро инактивируются. Во-вторых, активаторы плазминогена и плазмин инактивируются такими молекулами, как ингибитор активатора плазминогена 1 типа (РА^1) и РАЬ2, которые действуют на активаторы плазминогена, и такими как а2-антиплазмин и а2-макроглобулин, которые инактивируют плазмин. При нормальных обстоятельствах временной баланс между коагуляцией и фибринолизом приводит к эффективному формированию и растворению сгустков после повреждения сосудов, одновременно предотвращая нежелательные случаи тромбообразования или кровотечения.
Краткое описание примеров факторов свертывания крови, кофакторов и регуляторных белков и их активности приведены в табл. 4 ниже.
Таблица 4
Зимогены факторов свертывания и кофакторы
Название фактора Активность
Зимогены сериновых протеиназ
Фактор XII Связывает экспонированный коллаген в месте повреждения стенки сосуда, активируется кининогеном высокой молекулярной массы и калликреином.
Фактор XI Активируется фактором ХПа
Фактор IX Активируется фактором Х1а + Са2+
Фактор VII Активируется тромбином, фактором X, фактором 1Ха, ХПа + Са2+ или автоактивацией.
Фактор X Активируется на поверхности тромбоцитов теназным комплексом (РГХа/РУШа); также активируется фактором УПа + тканевый фактор + Са2+ или УПа + Са2+
Фактор II Активируется на поверхности тромбоцитов протромбиназным комплексом (РХа/РУа)
Кофакторы
Фактор VIII Активируется тромбином, РУШа служит кофактором фактора 1Ха при активации фактора X
Фактор V Активируется тромбином, фактор Уа служит кофактором фактора Ха при активации протромбина
Фактор III (тканевый фактор) Служит кофактором фактора УПа
Фибриноген
Фактор I (фибриноген) Расщепляется тромбином с образованием фибрина
Т ранет лутаминаза
Фактор XIII Активируется тромбином + Са2+; осуществляет ковалентное поперечное сшивание фибрина
Регуляторные и другие белки
Фактор фон Виллебранда (νΨΡ) Служит мостом между ОР1Ь-У-1Х комплексом и коллагеном
Белок С Активируется при связывании тромбина с тромбомодулином, Са расщепляет факторы УШа и Уа
Белок 8 Служит кофактором фактора С
Тромбомодулин Белок поверхности эндотелиальных клеток, связывает тромбин, что активирует белок С
- 37 020818
Антитромбин III Ингибирует свертывание, прежде всего тромбин и фактор Ха, но также факторы 1Ха, Х1а и УНа, и УИа в комплексе с ТФ
Ингибитор пути тканевого фактора (ΤΡΡΙ) Связывает фактор Ха и образует четвертичную структуру с ТФ/РУПа для ингибирования ТФ/РУПа
* Таблица адаптирована из М.У. Кшд (2006) тед.итькл1/~МагсЬек1/Ыоод.Ь1т1
С. Фактор VII
Фактор VII представляет собой витамин К-зависимую сериновую протеазу, гликопротеин, который синтезируется у животных, включая млекопитающих, в виде одноцепочечного зимогена в печени и выделяется в кровь. Как описано выше, РVII является протеазой, участвующей в свертывании крови, ответственной за инициирование каскада протеолитических событий, которые приводят к образованию тромбина и фибрина. Фактор VII является частью внешнего пути, хотя продукты его активности также в значительной степени влияют на внутренний путь. Его интегральная роль в формировании сгустка привлекла значительный интерес к РVII в качестве мишени для клинической антикоагулянтной и гемостатической терапии. Например, рекомбинантный активированный РVII (^РVIIа) был разработан как гемостатический агент для лечения гемофилических субъектов и субъектов с другими состояниями, связанными с кровотечением. В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РVII, которые обладают увеличенной коагулянтной активностью после активации и которые могут служить улучшенным лекарственным средством для лечения заболеваний и состояний, поддающихся лечению фактором VII.
1. Структура и организация РVII.
Человеческий ген РVII (Р7) находится на хромосоме 13 в 13ς34 и составляет 12,8 тпн в длину с 9 экзонами. Ген РVII обладает значительным сходством организации с генами, кодирующими другие витамин К-зависимые белки, такие как протромбин, фактор ГХ, фактор Х и белок С. мРНК РVII претерпевает альтернативный сплайсинг с образованием двух транскриптов: вариант 1 (последовательность Оепьапк № NМ_000131, приведенная в 8Ε^ ГО N0: 81) и вариант 2 (последовательность Оепьапк NМ_019616, приведенная в 8Ε^ ГО N0: 82). Вариант 2 транскрипта, который является более распространенной формой в печени, не включает экзон 1ь и, таким образом, кодирует короткий предшественник полипептида из 444 аминокислот (изоформа предшественника РVII В; 8Ε^ ГО N0: 2) по сравнению с полипептидом-предшественником, включающим 466 аминокислот, кодируемым вариантом 1 транскрипта (изоформа предшественника РVII А; 8Ε^ ГО N0: 1). Аминокислоты, которые не представлены в изоформе В предшественника полипептида РVII, соответствуют аминокислотным позициям с 22 по 43 изоформы А предшественника РVII. Эти аминокислоты являются частью пропептидной последовательности, что приводит к усеченному пропептиду в изоформе В РVII. Полипептиды-предшественники состоят из следующих сегментов и доменов: гидрофобного сигнального пептида (аминокислоты 1-20 из 8Ε^ ГО N0: 1 и 2), пропептида (аминокислоты 21-60 из 8Ε^ ГО N0: 1, аминокислоты 21-38 из 8Ε^ ГО N0: 2), домена О1а (аминокислоты 39-83 из 8Ε^ ГО N0: 2, аминокислоты 61-105 из 8Ε^ ГО N0: 1), домена эпидермального фактора роста типа В (ЕОР-подобный домен 1, аминокислоты 84-120 из 8Ε^ ГО N0: 2, аминокислоты 106-142 из 8Ε^ ГО N0: 1), домена эпидермального фактора роста типа А (ЕОР-подобный домен 2, аминокислоты 125-166 из 8Ε^ ГО N0: 2, аминокислоты 147-188 из 8Ε^ ГО N0: 1) и домена сериновой протеазы (аминокислоты 191-430 из 8Ε^ ГО N0: 2, аминокислоты 213-452 из 8Ε^ ГО N0: 1). Включающая 406 аминокислот зрелая форма полипептида РVII (8Ε^ ГО N0: 3) не включает сигнальный пептид и пропептидную последовательность и является идентичной по длине и последовательности независимо от изоформы предшественника, из которой возникла зрелая форма. В зрелой форме полипептида РVII вышеупомянутым доменам соответствуют следующие аминокислотные позиции: домен О1а (аминокислоты 1-45 из 8Ε^ ГО N0: 3), ЕОР-подобный домен 1 (аминокислоты 46-82 из 8Ε^ ГО N0: 3), ЕОР-подобный домен 2 (аминокислоты 87-128 из 8Ε^ ГО N0: 3) и домен сериновой протеазы (аминокислоты 153-392 из 8Ε^ ГО N0: 3).
Домен О1а из РVII является связывающим мембрану мотивом, который в присутствии ионов кальция взаимодействует с фосфолипидами мембраны, которые включают фосфатидилсерин. Домен О1а также играет роль в связывании кофактора РVIIа, тканевого фактора (ТФ). В комплексе с ТФ домен О1а из РVIIа связывает семь ионов Са2+, выпускает три гидрофобных боковых цепи в направлении клеточной мембраны для взаимодействия с фосфолипидами на поверхности клеток и образует значительный контакт с С-концевым доменом ТФ. О1а домены консервативны среди витамин К-зависимых белков, таких как протромбин, факторы свертывания крови VII, К и Х, белки С, 8 и Ζ. Этим белкам требуется витамин К для пост-трансляционного синтеза γ-карбоксиглутаминовой кислоты, сосредоточенной в ^концевом домене О1а этих белков. Все остатки глутаминовой кислоты в этом домене являются потенциальными сайтами карбоксилирования, и многие из них являются модифицированными путем карбоксилирования.
В дополнение к домену О1а зрелый белок РVII также содержит два ЕОР-подобных домена. Первый ЕОР-подобный домен (ЕОР-подобный домен 1 или ЕОР1) является связывающим кальций доменом ЕОР, в котором шесть консервативных цистеинов кора образуют три дисульфидных моста. Домен ЕОР1 из
- 38 020818
РУН связывает только один ион Са2+, но со значительно более высокой аффинностью, чем домен 01а (Ваппег и др., (1996) №1иге 380:41-46). Связывание иона Са2+ способствует сильному взаимодействию между доменом Е0Р1 из РУП и ТФ (0к!ег1ипй и др., (2000) Еиг. I. ВюсНет. 267:6204-6211). Второй Е0Рподобный домен (Е0Р-подобный домен 2 или Е0Р2) не является связывающим кальций доменом, но также образует 3 дисульфидных моста. Как и другие домены РУН Е0Р2, домен взаимодействует с ТФ. Е0Р2 домен также образует дисульфидную связь с протеазным доменом, с которым он обладает большой поверхностью контакта. Наконец, домен сериновой протеазы РУП является доменом, ответственным за протеолитическую активность РУПа. Последовательность аминокислот каталитического домена РУП обладает высокой идентичностью последовательности и сходством третичной структуры с другими сериновыми протеазами, такими как трипсин и химотрипсин (Пп и др., (2001) I. Мо1. Вю1., 307: 15031517). Например, указанные сериновые протеазы обладают общей каталитической триадой Н57, Ό102, 8195 по нумерации химотрипсина. В отличие от других сериновых протеаз, однако, расщепления РУПа не достаточно для полного преобразования зимогена в полностью активный фермент. Вместо этого, как указано ниже, РУПа аллостерически активируется при связывании с ТФ рецептором на поверхности клетки, который индуцирует конформационные изменения в протеазном домене РУПа, переводя его из зимогеноподобного неактивного состояния в каталитически активный фермент. Район, включающий спираль и петлю, расположенный между сайтом связывания кофактора и активным сайтом РУПа (т.е. аминокислотные остатки 305-321, соответствующие аминокислотным остаткам 163-170 по нумерации химотрипсина), важен для аллостерической регуляции и зимогенности РУПа (Регккоп и др. (2004) ВюсНет. I., 379: 497-503). Указанный район состоит из короткой α-спирали (аминокислотные остатки с 307 по 312) и следующей за ней петли. ^концевая часть спирали формирует часть поверхности контакта между протеазным доменом и ТФ и содержит множество остатков, которые важны для протеазной активности и связывания ТФ. Сравнение кристаллической структуры РУПа и РУПа в комплексе с ТФ указывает, что α-спираль претерпевает значительные конформационные изменения при связывании РУПа с ТФ. α-Спираль РУПа без ТФ деформирована, укорочена и иначе ориентирована. Напротив, α-спираль РУПа в комплексе с ТФ стабилизирована, и соседние петли расположены ближе к активному центру. В указанной стабилизации участвует, по меньшей мере, метионин в позиции 306 РУП (аминокислотный остаток Ме!164 по нумерации химотрипсина) (Р1ке и др. (1999) РNА8 8925-8930).
2. Пост-трансляционные модификации.
Полипептид-предшественник РУП (либо изоформа гена фактора УП) направляется по секреторному клеточному пути за счет гидрофобного сигнального пептида, который проникает в эндоплазматический ретикулум (ЭР), чтобы начать перемещение через мембрану. В процессе перемещения белка через мембрану ЭР включающий 20 аминокислот сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой в просвете ЭР, после чего полипептид подвергается дальнейшим пост-трансляционным модификациям, в том числе N и О-гликозилированию, витамин К- зависимому карбоксилированию ^концевых остатков глутаминовой кислоты в γ-карбоксиглутаминовую кислоту и гидроксилированию аспарагиновой кислоты в β-гидроксиаспарагиновую кислоту.
Пропептид содержит сайт связывания витамин К-зависимой карбоксилазы, которая распознает амфипатическую α-спираль в пропептиде РУП из 10 остатков. После связывания карбоксилаза γкарбоксилирует 10 остатков глутаминовой кислоты в домене 01а полипептида РУП с образованием γкарбоксиглутамильных остатков в положениях Е66, Е67, Е74, Е76, Е79, Е80, Е85, Е86, Е89 и Е95 аминокислотной последовательности предшественника РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 2. Эти положения соответствуют положениям Е6, Е7, Е14, Е19, Е20, Е25, Е26, Е29 и Е35 последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3. Для оптимальной активности молекулам РУП требуется кальций, который связывается полипептидом и облегчает конформационные изменения, необходимые для связывания РУПа с ТФ и липидами. γ-Карбоксилированный домен 01а связывает семь ионов Са с различной аффинностью, что индуцирует конформационные изменения, позволяющие домену 01а взаимодействовать с С-концевым доменом ТФ, а также фосфатидилсеринами или другими отрицательно заряженными фосфолипидами на мембране тромбоцитов.
^гликозилирование осуществляется путем переноса фрагмента 01сзМаη9(01сNАс) на два остатка аспарагина в полипептиде РУП в позициях, которые соответствуют аминокислотным остаткам 145 и 322 зрелого белка (8ЕЦ ГО N0: 3). О-гликозилирование претерпевают аминокислотные остатки 52 и 60 зрелого полипептида и гидроксилированная в β-гидроксиаспарагиновая кислота, находящаяся в положении остатка аспарагиновой кислоты 63. Указанные О-гликозилированные сериновые остатки и остаток βгидроксилированной аспарагиновой кислоты находятся в Е0Р-1 домене РУП. Указанные модификации осуществляются в ЭР и комплексе Гольджи перед окончательным процессингом полипептида в его зрелую форму.
3. Процессинг РУП.
Модифицированный про-РУП полипептид транспортируется через просвет Гольджи к трансГольджи компартменту, где пропептид отщепляется пропептидазой непосредственно перед секрецией белка из клетки. РАСЕ/фурин (где РАСЕ является аббревиатурой от термина фермент, расщепляющий
- 39 020818 пары основных аминокислот) является эндопептидазой, локализованной в мембране Гольджи, которая расщепляет многие белки с карбоксиконцевой стороны последовательности Агд-[любой остаток]-(Ьу8 или Лгд)-Лгд. Эта пропептидаза расщепляет витамин К-зависимые гликопротеины, такие как полипептиды профактора IX и про-у\УЕ (Н1тте1красй и др., (2000) ТйготЬ Кекеагсй 97; 51-67), отделяя пропептид от зрелого белка. Включение соответствующего сайта распознавания РАСЕ/фурина в предшественника рекомбинантного фактора УП способствует правильному процессингу и секреции рекомбинантного полипептида (Магдагйак и др., (2004) С1ш. НуекЬ 113(7): 1025-1031). РАСЕ/фурин или другая субтилизинподобная пропептидаза, вероятно, ответственна за протеолитическое превращение про-РУИ в РУН. Пропептидаза может распознавать и связывать -Лгд-Лгд-Лгд-Лгд- консенсусный мотив, соответствующий аминокислотным позициям 35-38 в последовательности, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 1, и позициям 57-60 в последовательности, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 2, и, отщепляя пропептид, освобождать зрелый белок для секреции.
4. Активация РУН
Большая часть РУН в крови находится в виде неактивированного одноцепочечного зимогена, хотя его небольшое количество присутствует в двухцепочечной активированной форме. Активация РУН происходит за счет протеолитического расщепления связи Лгд152-Не153 (позиции в последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 3), что приводит к двухцепочечному полипептиду, содержащему 152 аминокислоты в легкой цепи (примерно 20 кДа), связанной дисульфидным мостом с тяжелой цепью из 254 аминокислот (примерно 30 кДа). Легкая цепь РУНа содержит домен 01а и ЕОРподобный домен, в то время как тяжелая цепь содержит каталитический домен или домен сериновой протеазы. Превращение одноцепочечного РУН в двухцепочечный РУНа происходит за счет расщепления РКа, РXа, РXIIа, тромбином или автокаталитически эндогенным РУНа (Ви1еиак и др., (1996) Вюсйет 35:1904-1910;. №кадак1 и др., (1991) Вюсйет 30:10819-10824). Небольшое количество РУНа, которое присутствует в кровотоке, вероятно, возникает под действием РXа и РКа.
Как уже говорилось выше, расщепление зимогенной формы РУН с образованием РУНа не является достаточным для полноценной активности. РУНа требует наличия ТФ для полноценной активности (Ηίдакй1 и др., (1996) 1. ΒίοΙ. Сйет. 271:26569-26574). Из-за этого РУНа без ТФ приписывали зимогеноподобные черты, включая зимогенные фолдинг и форму и относительно низкую активность. Указанные зимогеноподобные свойства РУНа в отсутствие его связи с ТФ делают его относительно устойчивым к антитромбину III (ЛТ-Ш) и другим серпинам, которые обычно действуют в основном на активные формы сериновых протеаз, а не на зимогенные формы. Кроме того, ТРИ, главный ингибитор ТФ/РУНа активности, также эффективно не связывает неактивную форму РУНа, не образовавшую комплекс с ТФ.
При образовании комплекса с ТФ РУНа претерпевает конформационные изменения, что приводит к молекуле с полной активностью. Все домены РУН участвуют во взаимодействии с ТФ, но конформационные изменения происходят в протеазном домене РУНа. Например, конформационные изменения, которые происходят при аллостерическом взаимодействии РУНа с ТФ, включают создание протяженного экзосайта связывания высокомолекулярного субстрата. Указанный протяженный сайт связывания значительно усиливает протеолитическую активацию фактора X белком РУН. Активность РУНа дополнительно увеличивается (в тысячу раз) при взаимодействии РУНа с поверхностью экспрессирующей ТФ клетки. Это происходит за счет того, что фосфолипиды мембран, включающие отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин, являются местом взаимодействия других витамин Кзависимых факторов свертывания крови, таких как РК и РX, которые связываются с мембраной с помощью своих доменов 01а. Это приводит к высокой локальной концентрация указанных витамин Кзависимых белков на поверхности клеток, способствуя их взаимодействию с комплексом ТФ/РУНа.
5. Активность РУН.
Хотя РУНа проявляет увеличенную активность после аллостерической активации фактором ТФ, есть доказательства того, что существуют механизмы, в которых свободный РУНа может инициировать коагуляцию. Следовательно, РУН может функционировать как ТФ-зависимо, так и ТФ-независимо. Последний путь может играть значительно меньшую роль в нормальном гемостазе, хотя его значение может возрасти в контексте нарушений свертываемости крови и их лечения.
a. Зависимая от тканевого фактора активность РУНа.
Циркулирующий в крови РУН связывает ТФ на поверхности клетки и активирует РКа, РXа, тромбин или автокаталитически активирует эндогенный РУНа, как описано выше. Кроме того, очень небольшое количество циркулирующего РУНа может непосредственно связать ТФ. ТФ/РУНа комплекс затем связывает небольшую часть РX плазмы, и каталитический домен РУНа расщепляет РX с образованием РXа. Таким образом, тромбин формируется во внешнем пути на поверхности несущих ТФ клеток, когда РXа образует комплекс с РУа и активирует протромбин в тромбин (фиг. 3). РК также активируется ТФ/РУНа комплексом, что обеспечивает связь с внутренним путем, который действует на поверхности активированных тромбоцитов. Положительная обратная связь в описанном выше каскаде свертывания представляет собой средство, с помощью которого производится большое количество тромбина, который расщепляет фибриноген в фибрин с формированием сгустка.
b. Не зависимая от тканевого фактора активность РУНа.
- 40 020818
В дополнение к ТФ-зависимому механизму активации РХ в РХа существуют доказательства того, что РУПа также может активировать РХ в отсутствие ТФ. Активированные тромбоциты перемещают фосфатидилсерины и другие отрицательно заряженные фосфолипиды на внешнюю, обращенную к плазме поверхность мембраны (Неткег и др., (1983) Β1οοά Се1к 9:303-317). Это обеспечивает альтернативные рецепторы, через которые может связаться РУПа, хотя и с относительно низкой аффинностью, которая в 1000 раз меньше, чем аффинность РУПа к ТФ (Мопгое и др., (1997) Вг. 1. Наеша1о1. 99:542-7). Это взаимодействие опосредовано остатками в домене О1а (Нагуеу и др., (2003). 278:8363-8369). РУПа может превращать РХ в РХа и Р1Х в Р1Ха на поверхности активированных тромбоцитов (Нойшап и др., (1998) Βίοοά Соади1 Р1Ъгшо1у818 9:861-865). РХа остается связанным с поверхностью тромбоцитов, где он может связаться с РУа для образования достаточного количества тромбина из протромбина, а вновь образованный Р1Ха соединяется с РУШа и стимулирует активацию большего количества РХ в РХа (фиг. 3). Гемостаз в отсутствие ТФ может быть достигнут за счет положительной обратной связи и механизмов распространения свертывания, описанных выше. Однако следует отметить, что, хотя РУШа вносит вклад в процесс коагуляции на активированных тромбоцитах, его наличие не требуется для образования тромбина в ТФ-независимом механизме (фиг. 3). Таким образом, есть доказательства того, что в отсутствие фактора VIII, например, у больных гемофилией, РУПа может инициировать и/или усиливать образование тромбина через этот вторичный механизм и может привести к формированию сгустка.
6. РУ11 как лекарственный препарат.
РУ11 инициирует свертывание крови. Рекомбинантный РУПа (Иоуозеуеп®; гРУПа) предназначен для лечения кровотечений или профилактики кровотечений при хирургических или инвазивных процедурах у пациентов с гемофилией А или В с ингибиторами фактора УШ или фактора 1Х, а также у пациентов с врожденным дефицитом фактора У11. Ыоуозеуеп® является генно-инженерным фактором УПа, который производится в системе экспрессии клеток млекопитающих с использованием клеток почки детеныша хомяка (ВНК).
Агент почти идентичен фактору У11а плазмы по структуре и функциям (Ка1ко и др., (2004), Р & Т, 29: 712-720).
Было показано, что введение рекомбинантного РУПа (гРУПа) приводит к свертыванию крови у пациентов, страдающих гемофилией, и что лечение введением РУПа безопасно и хорошо переносится человеком. Как правило, гРУПа использовали для лечения пациентов, которые вырабатывают ингибиторы (т.е. аллоантитела) к фактору УШ или фактору 1Х. Использование гРУПа в качестве коагулянта в дальнейшем было использовано для лечения других связанных с кровоточивостью расстройств, например тромбастении Гланцманна, других состояний, связанных с обширным кровотечением, например, возникшим в результате травмы или хирургического вмешательства, включая, но не ограничиваясь пересадкой печени, операцией на простате и геморрагической травмой; гРУПа в качестве коагулянта был использован для лечения коагулопатии новорожденных, тяжелых заболеваний печени; при трансплантации костного мозга, при тромбоцитопении и нарушениях функции тромбоцитов; при срочной отмене оральных антикоагулянтов; врожденном недостатке факторов У, У11, Х и Х1 и болезни Виллебранда с ингибиторами фактора фон Виллебранда. Для достижения терапевтического эффекта требуется высокая доза гРУП. Дозы и режим дозирования для введения гРУП варьируют в зависимости от клинических показаний. Например, типичная доза гРУП для эпизодов кровотечения у больных гемофилией А или гемофилией В, имеющих аллоантитела, составляет 90 мкг/кг при внутривенной (ВВ) инъекции. Так как гРУП имеет период полураспада 2 ч, требуется повторное введение. Дополнительное введение может осуществляться через каждые 2 ч до остановки кровотечения. Диапазон доз может быть изменен в зависимости от тяжести состояния. Например, были эффективны дозы 35-120 мкг/кг. Кроме того, дозы и режим дозирования может меняться в зависимости от других признаков. Например, пациентам с гемофилией А или гемофилией В, перенесшим операцию, можно вводить начальную дозу 90 мкг/кг непосредственно перед операцией с повторными введениями каждые 2 ч во время и после операции. В зависимости от тяжести операции и эпизода кровотечения ВВ болюсная инфузия может продолжаться от 2 до 6 ч до достижения желаемого эффекта. У пациентов с врожденным недостатком РУЛ, как правило, гРУП вводят для предотвращения кровотечения при операции или других инвазивных процедурах в дозе 15-30 мкг/кг каждые 4-6 ч до остановки кровотечения.
Механизм инициирования гемостаза фактором гРУПа объясняет потребность в высоких дозах. Пациенты с гемофилией обладают нормальной фазой начала коагуляции, где ТФ/РУПа комплекс активирует РХ в РХа и приводит к образованию тромбина на несущей ТФ клетке. Впоследствии, однако, процесс коагуляции нарушается, так как у больных гемофилией отсутствует фактор УШ (гемофилия А) или Р1Х (гемофилия В), и поэтому у пациентов не происходит образование РУ111а/Р1Ха комплексов на поверхности активированных тромбоцитов, которые обычно служат для активации большого количества РХ в РХа в фазах усиления и распространения, описанных выше. В связи с наличием ингибиторов, таких как ТРР1 и АТ-Ш, фактор РХа, образованный на несущей ТФ клетке в результате расщепления ТФ/РУПа комплексом, не способен легко диффундировать между поверхности клеток. В результате образования большого количества тромбина на поверхности активированных тромбоцитов не происходит, и сгусток не образуется.
- 41 020818
Существует доказательство того, что кровоостанавливающее действие высоких доз гРУПа может быть достигнуто за счет ТФ-зависимого и/или ТФ-независимого образования РХа фактором гРУПа на активированных тромбоцитах (фиг. 3). ТФ-зависимое образование тромбина может быстро достичь максимальной скорости при насыщении молекул ТФ эндогенным РУПа и гРУПа. В некоторых случаях гРУ11а в высокой дозе может связывать активированные тромбоциты и превращать РХ в РХа. Связанный с поверхностью РХа активирует РУа с образованием достаточного количества тромбина для гемостаза. Так как гРУП связывается с поверхностью тромбоцитов с низкой аффинностью, для образования тромбина может быть необходима высокая доза гРУП. Активация РХа на активированных тромбоцитах гарантирует, что гРУПа-опосредованной гемостаз происходит в месте повреждения.
Способ снижения дозы гРУП может улучшить полезность и эффективность гРУП в качестве лекарственного средства. В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН. К ним относятся модифицированные РУН полипептиды, обладающие повышенной устойчивостью к АТ-111 и увеличенной каталитической активностью в присутствии и/или в отсутствие ТФ. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также могут обладать повышенной устойчивостью к ТРР1, повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη2+ , улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как увеличенное время полураспада в сыворотке, увеличенным связыванием и/или аффинностью к активированным тромбоцитам, увеличенным связыванием и/или аффинностью к сывороточному альбумину и/или увеличенным связыванием и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов апьРз· Указанные модифицированные полипептиды РУ11 могут проявлять увеличенную коагулянтную активность. Полипептиды РУ11, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения, инициируя гемостаз по ТФ-зависимому и/или ТФ-независимому механизму, что приводит к образованию РХа и образованию тромбина.
Ό. Модифицированные полипептиды РУ11.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ. Полипептиды РУЛ проявляют изменения в одном или более видах активности или свойствах по сравнению с полипептидом РУН, который не был модифицирован или был модифицирован иначе. Активности или свойства, которые могут быть изменены в результате модификации, включают, но не ограничиваются, коагулянтной активностью; прокоагулянтной активностью; протеолитической или каталитической активностью, такой как активация фактора X (РХ) или активация фактора IX (Р1Х); антигенностью (способностью связываться с анти-РУП антителом или конкурировать с полипептидом за связывание с анти-РУП антителом); способностью связывать тканевый фактор, фактор Х или фактор 1Х; способностью связывать фосфолипиды; периодом полураспада; трехмерной структурой; р1 и/или конформацией. Как правило, модифицированные полипептиды РУН проявляют прокоагулянтную активность. В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, которые обладают повышенной коагулянтной активностью при активации их зимогенной одноцепочечной формы. Такие модифицированные полипептиды РУ11 могут быть использованы для лечении нарушений свертываемости крови или состояний, таких как гемофилии или травмы, где полипептиды РУН могут содействовать свертыванию крови. Модифицированные полипептиды РУН включают полипептиды, которые обладают повышенной устойчивостью к ингибиторам, таким как антитромбин III (ΑΤ-ΙΙΙ) и ингибитор пути тканевого фактора (ТРР1), полипептиды, которые обладают повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη2+, полипептиды, которые обладают увеличенной каталитической активностью в присутствии и/или в отсутствие ТФ, полипептиды, которые обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как увеличенный период полураспада, полипептиды, которые обладают увеличенным связыванием и/или аффинностью к поверхности тромбоцитов, полипептиды, которые обладают увеличенным связыванием и/или аффинностью к сывороточному альбумину, и полипептиды, которые обладают увеличенным связыванием и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов апьв3. В частности, такие модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы при заболеваниях или состояниях для обеспечения коагулянтной активности в обход потребности в РУШа и РКа. В одном примере модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения пациентов с гемофилией, имеющих антитела к РУШа и РКа. Следовательно, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, обладают преимуществами, включая уменьшение количества вводимого РУН, которое требуется для поддержания достаточной для гемостаза концентрации активного РУН в сыворотке крови. Это может привести, например, к более низким дозам и/или меньшей частоте введения, необходимым для достижения сопоставимого биологического эффекта, к повышению комфортности лечения и одобрения лечения субъектами и к ослаблению побочных эффектов. Модификации полипептида РУН могут быть введены в любую форму полипептида РУН, в том числе в аллельные и видовые варианты полипептида, варианты сплайсинга, в известные в уровне техники варианты или в гибридные или химерные молекулы РУН. Например, предусмотренные в настоящем документе модификации могут быть введены в полипептид-предшественник РУН, приведенный в 8ЕД ГО N0: 1 или 2, в зрелый полипептид РУН, приведенный в 8ЕД ГО N0: 3, или в любой видовой, аллельный или модифицированный вариант полипептида и в их активные фрагменты, которые имеют 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
- 42 020818 или 99% идентичности последовательности с любым из полипептидов РУН, приведенных в 8ЕЦ ГО N0: 1-3. Аллельные варианты РУН включают, но не ограничиваются, любыми полипептидамипредшественниками, обладающими последовательностью аминокислот, приведенной в любой из 8ЕЦ ГО N0: 18-74. Примеры видовых вариантов, которые могут быть модифицированы по настоящему документу, включают, но не ограничиваются, человеческими и не человеческими полипептидами, включая полипептиды РУН коровы, мыши, карликового шимпанзе, шимпанзе, кролика, крысы, макаки резус, свиньи, собаки, рыбы-зебры, рыбы фугу, курицы, орангутанга и гориллы, последовательности которых приведены в 8ЕЦ ГО N0: 4-17 соответственно. Модификации в полипептиде РУН могут быть введены в полипептид РУН, который также содержит другие модификации, как описано в уровне техники, включая модификации первичной последовательности и модификации не в первичной последовательности полипептида.
Модификации полипептидов РУН также включают модификации полипептидов, которые являются гибридами различных полипептидов РУН, а также синтетических полипептидов РУН, полученных рекомбинантно или синтезированных или построенных другими способами, известными в уровне техники, на основании последовательности известных полипептидов. Например, при выравнивании РУН с другими членами семейства факторов свертывания, такими как фактор IX (Р1Х) или фактор X (РХ), среди членов семейства могут быть легко идентифицированы гомологичные домены. Могут быть сконструированы химерные варианты полипептидов РУН, в которых одна или более аминокислот или целые домены в аминокислотной последовательности РУН заменены с использованием аминокислотной последовательности соответствующего члена семейства. Кроме того, химерные полипептиды РУН включают полипептиды, в которых одна или более аминокислот или целые домены в аминокислотной последовательности человеческого РУН заменены с использованием аминокислотной последовательности различных видов (см., например, ^бШаткоп и др., (2005) б. ТЬготЬ. Наетокб. 3: 1250-6). Такие химерные белки могут быть использованы в качестве начального, немодифицированного полипептида РУН в настоящем документе.
Предусмотренные в настоящем документе модификации начального, немодифицированного полипептида включают аминокислотные замены, вставки или удаления или любые их комбинации. Например, модифицированные полипептиды РУН включают полипептиды с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более модифицированными позициями. Также в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН с двумя или более модификациями по сравнению с начальным полипептидом РУН. Модифицированные полипептиды РУН относятся к полипептидам с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более модифицированными позициями. Любые модификации, предусмотренные в настоящем документе, могут быть объединены с любыми другими модификациями, известными специалисту в данной области техники, если полученный модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную коагулянтную активность, когда он находится в двухцепочечной форме. Как правило, модифицированные полипептиды РУН обладают повышенной коагулянтной активностью. Активности или свойства, которые могут быть изменены в результате модификации, включают, но не ограничиваются, коагулянтной активностью; прокоагулянтной активностью; протеолитической или каталитической активностью, включая активацию фактора X XX) или активацию фактора IX (РIX); антигенностью (способностью связывать анти-РУП антитела или конкурировать с полипептидом за связывание с анти-РУН антителами); способностью связывать тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора (ТРИ), антитромбин III, фактор X или фактор IX; способностью связывать фосфолипиды, сывороточный альбумин или интегрин тромбоцитов α^β3; периодом полураспада в сыворотке; трехмерной структурой; рI и/или конформацией. Модифицированные полипептиды РУН по настоящему документу включают полипептиды, которые имеют повышенную устойчивость к антитромбину III (ЛТ-Ш), увеличенную каталитическую активность в присутствии и/или в отсутствие ТФ, повышенную устойчивость к ингибитору пути тканевого фактора (ТРИ), повышенную устойчивость к ингибиторному эффекту Ζη2+, улучшенные фармакокинетические свойства, такие как увеличенное время полураспада в сыворотке, увеличенную собственную активность, измененное гликозилирование, повышенную аффинность и/или связывание с сывороточным альбумином, повышенную аффинность и/или связывание с интегрином тромбоцитов и/или повышенную аффинность и/или связывание с активированными тромбоцитами.
В некоторых примерах модификация может повлиять на два или более свойств или активностей полипептида РУН. Например, модификация может привести к увеличению устойчивости к АТ-Ш и увеличенной каталитической активности модифицированного полипептида РУН по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Для определения спектра эффектов модификации могут быть определены свойства и активности модифицированных полипептидов РУН, предусмотренных в настоящем документе. Такие анализы известны и описаны ниже. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также включают полипептиды РУН, которые дополнительно модифицированы клеточными механизмами, и включают, например, гликозилированные, γ-карбоксилированные и βгидроксилированные полипептиды.
Модификации полипептида РУН, предусмотренные в настоящем документе, предназначены для увеличения устойчивости к АТ-Ш, увеличения устойчивости к ТРИ, увеличения устойчивости к ингиби- 43 020818 торному действию Ζη2+, предназначены для улучшения фармакокинетических свойств, таких как увеличение времени полураспада в сыворотке, увеличения каталитической активности в присутствии и/или в отсутствие ТФ, повышения связывания активированных тромбоцитов, изменения гликозилирования, увеличения аффинности и/или связывания с интегрином тромбоцитов απ,β3, увеличения аффинности и/или связывания с сывороточным альбумином и/или увеличения аффинности и/или связывания с активированными тромбоцитами. Например, полипептид РУН может включать модификацию (модификации), которая увеличивает каталитическую активность или связывание с тромбоцитами или оба указанных свойства. В других примерах любые модификации, предусмотренные в настоящем документе, могут быть комбинированы с любой другой модификацией, известной специалисту в данной области, если полученный модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную коагулянтную активность, когда присутствует в двухцепочечной форме. Как правило, такая повышенная коагулянтная активность связана с повышенной устойчивостью к АТ-Ш, увеличенной каталитической активностью, повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη2'. улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как увеличенное время полураспада в сыворотке, повышенной устойчивостью к ТРР1, измененным гликозилированием, увеличенным связыванием и/или аффинностью к фосфолипидам, увеличенным связыванием и/или аффинностью к сывороточному альбумину и/или увеличенным связыванием и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов а11Ьв3.
В некоторых примерах модификации, которые были введены в полипептид РУН для изменения конкретной активности или свойства также могут влиять на другую активность или свойство или вместо конкретной активности или свойства влиять только на другую активность или свойство. Таким образом, предусмотренные в настоящем документе модификации могут влиять на свойства или активности, на которые модификации были направлены, и на одно или более других свойств или активностей. Например, модификации, введенные в полипептид РУН для увеличения каталитической активности, также могут увеличить устойчивость к АТ-Ш. В некоторых примерах одна модификация, такая как замена одной аминокислоты, изменяет 2, 3, 4 или более свойств или активностей полипептида РУЛ. Для определения спектра эффектов модификации может быть проанализировано каждое свойство и активность модифицированного полипептида РУЛ, предусмотренного в настоящем документе. Такие анализы известны и описаны ниже. Модифицированные полипептиды РУЛ, предусмотренные в настоящем документе, также включают полипептиды РУЛ, которые дополнительно модифицированы клеточными механизмами, и включают, например, гликозилированные, γ-карбоксилированные и β-гидроксилированные полипептиды.
Предусмотренные в настоящем документе модификации могут быть введены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Может быть использован любой известный в уровне техники способ мутирования одной или нескольких аминокислот в целевом белке. Способы включают стандартный сайт-направленный мутагенез (с использованием, например, набора, такого как набор ЦшкСЬапде от §1га1адепе) кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты или метод твердофазного синтеза полипептидов. Кроме того, модифицированные химерные белки, предусмотренные в настоящем документе (т.е. белки с заменой домена О1а), могут быть получены обычными методами рекомбинантной ДНК. Например, химерные полипептиды могут быть получены с помощью ферментов рестрикции и методик клонирования для рутинного субклонирования желаемых компонентов химерного полипептида.
Другие модификации, которые представляют собой модификации первичной последовательности полипептида или не представляют собой модификации первичной последовательности, также могут быть введены в модифицированный полипептид РУЛ или его конъюгат, включая, но не ограничиваясь, добавлением углеводного фрагмента, добавлением фрагмента полиэтиленгликоля (ПЭГ), добавлением домена Рс и т.д. Например, такие дополнительные модификации могут быть введены для повышения стабильности или времени полураспада белка.
Полученные модифицированные полипептиды РУЛ включают полипептиды, которые являются одноцепочечными зимогенами, или полипептиды, которые являются двухцепочечными зимогеноподобными полипептидами. Например, любые модифицированные полипептиды, предусмотренные в настоящем документе, которые представляют собой одноцепочечные полипептиды, могут быть автоактивированы или активированы другими факторами свертывания крови с образованием модифицированных РУЛ в двухцепочечной форме (т.е. РУЛа). Модифицированные полипептиды РУЛ, как правило, проявляют активность в двухцепочечной форме.
Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУЛ могут проявлять повышенную устойчивость к антитромбину III (АТ-Ш), увеличенную каталитическую активность в присутствии и/или в отсутствие ТФ, повышенную устойчивость к ингибиторному эффекту Ζη2'. повышенную устойчивость к ингибитору пути тканевого фактора (ТРР^, улучшенные фармакокинетические свойства, такие как увеличенное время полураспада в сыворотке, могут обладать измененным гликозилированием, проявлять повышенную аффинность и/или связывание с фосфолипидами, повышенную аффинность и/или связывание с сывороточным альбумином, повышенную аффинность и/или связывание с интегрином тромбоцитов απ,β3. Как правило, предусмотренные здесь модифицированные полипептиды
- 44 020818
РУЛ проявляют такие свойства и/или активности при сохранении других видов активности или свойств РУЛ, включая, но не ограничиваясь, связывание ТФ и/или связывание и активацию РХ. Следовательно, модифицированные полипептиды РУЛ, предусмотренные в настоящем документе, сохраняют способность связывать ТФ и/или связывать и активировать РХ по сравнению с начальным полипептидом РУЛ или полипептидом РУЛ дикого типа. Как правило, такая активность остается в значительной степени неизменной (измененной менее чем на 1, 5 или 10%) по сравнению с исходным белком или белком дикого типа. В других примерах активность модифицированного полипептида РУ11 увеличивается или уменьшается по сравнению с полипептидом РУЛ дикого типа или исходным полипептидом РУЛ. Активность может быть оценена ίη νίίΓΟ или ίη νίνο и может быть сравнена с активностью немодифицированного полипептида РУЛ, такого как, например, зрелый нативный полипептид РУЛ дикого типа (8ЕО ГО N0: 3), предшественник полипептида РУ11 дикого типа (8Е0 ГО N0: 1 или 2) или любой другой полипептид РУЛ, известный специалисту в данной области, который использовался в качестве исходного полипептида.
Следовательно, в силу предусмотренных в настоящем документе модификаций, модифицированные полипептиды РУЛ могут обладать повышенной коагулянтной активностью, увеличенной продолжительностью коагулянтной активности и/или повышенным терапевтическим индексом. Указанные изменения можно наблюдать ТФ-зависимо и/или ТФ-независимо. Как правило, повышенную коагулянтную активность, увеличенную продолжительность коагулянтной активности и/или повышенный терапевтический индекс модифицированных полипептидов РУЛ, предусмотренных в настоящем документе, можно наблюдать ίη νίίΓΟ или ех νίνο с помощью соответствующих анализов или можно наблюдать ίη νίνο, например, при введении субъекту, например человеку или не человеку. Активность модифицированных полипептидов РУЛ может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с активностью исходного или немодифицированного полипептида РУЛа.
1. Увеличение каталитической активности.
РУЛ содержит остаток серина (положение 195 по стандартной нумерации химотрипсина (химотрипсиногена)) в активном центре, который действует как нуклеофил в реакции расщепления. Каталитическая триада сериновых протеаз также включает в себя два дополнительных остатка: Н57 и Ό102 (по нумерации химотрипсина). Каталитическая триада человеческого РУЛа соответствует положениям Н193, Ό242 и 8344 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3. Каждая из трех указанных ключевых аминокислот играет существенную роль в каталитической активности протеазы. Сериновые протеазы гидролизуют пептидные связи через образование тетраэдрического переходного состояния и ацил-ферментного интермедиата. Реакция начинается с нековалентного связывания субстрата в углублении на поверхности протеазы (т.е. в активном центре), которое содержит Н57 и 8195, с образованием комплекса Михаэлиса-Ментен. Прохождение реакции требует последующей нуклеофильной атаки Р1 карбонильного остатка субстрата О-гамма атомом серина активного центра (т.е. серином 195) фермента с образованием тетраэдрического переходного состояния, которое быстро превращается в ацил-ферментный интермедиат. Структура в активном центре, которая включает остатки глицина 193 и серина 195 (соответствующие С342 и 8344 последовательности зрелого полипептида РУЛ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3), известная как оксианионная впадина, способствует эффективному катализу за счет стабилизации переходного состояния. В частности, амидные атомы водорода основной цепи этих двух остатков формируют стабилизирующие водородные связи с оксианионом (т.е. карбонильным кислородом остатка Р1), который образуется в тетраэдрическом переходном состоянии. В дополнение к стабилизации связывание субстрата в оксианионной впадине располагает расщепляющуюся связь должным образом для продуктивного ацилирования и деацилирования, которые приводят к разрыву связи. Важность оксианионной впадины в активности РУЛ подтверждается тем наблюдением, что мутации в аминокислотной позиции 342 (соответствующей позиции 193 по нумерации химотрипсина) могут привести к дефектному РУЛ (см., например, ВетагФ и др., (1994) Вг. I. Наета1о1 . 86:610-618 и ВетагФ и др., (1996) Нитаη МиЕ 8:108-115).
а. Примеры модификаций, увеличивающих каталитическую активность.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, которые обладают повышенной коагулянтной активностью. Такие полипептиды РУЛ могут быть получены за счет аминокислотной замены одного или нескольких остатков, где замена может повлиять на конформацию оксианионной впадины. Внедрение различных аминокислотных остатков в конкретные положения (например, в положение 143 по нумерации химотрипсина или 286 по нумерации зрелого РУЛ) может изменить конформацию модифицированного полипептида РУЛ, что приведет к увеличению эффективности катализа оксианионной впадиной. Это может привести к модифицированным полипептидам РУЛ с повышенной каталитической активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РУЛ. Изменения в каталитической активности из-за мутации, влияющей на оксианионную впадину, могут проявляться как увеличение коагулянтной активности. Увеличение каталитической и коагулянтной активности модифицированных полипептидов РУЛ, предусмотренных в настоящем документе, можно наблюдать в присутствии и/или в отсутствие тканевого фактора (т.е. увеличение активности может быть ТФ-зависимым
- 45 020818 и/или ТФ-независимым). Таким образом, при оценке в соответствующем ίη ν^ι^о. ίη νί\Ό, или ех νί\Ό анализе, таком как введение полипептида субъекту в качестве прокоагулянтной терапии, модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ могут проявлять увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ.
Конформация оксианионной впадины может быть изменена для образования более эффективной конформации путем модификации одного или более аминокислотных остатков, которые участвуют в образовании оксианионной впадины или находятся в непосредственной близости от оксианионной впадины. Как предусмотрено в настоящем документе, примером такого аминокислотного остатка является остаток 0286 (нумерация соответствует последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3), который соответствует остатку 0143 по нумерации химотрипсина. 0286 может быть изменен, например, путем аминокислотной замены, удаления или вставки. Если модификация представляет собой аминокислотную замену, остаток глутамина в положении 286 может быть заменен на остаток любой другой аминокислоты.
0286 находится рядом и контактирует с остатками, которые формируют районы активного центра и расщелины активного центра полипептида ΡΥΙΙ. Таким образом, было предположено, что модификации в этом положении должны привести к снижению каталитической активности (см., например, патент США № 6806063). Это было продемонстрировано в предыдущих исследованиях (см., например, Α0 2007031559), где глутаминовый остаток заменен на остаток аланина (О286Л). Полученный модифицированный полипептид ΡΥΙΙα проявлял сниженную способностью к активации фактора X по сравнению с полипептидом дикого типа. В других исследованиях та же мутация практически не влияла на каталитическую активность мутанта ΡΥΙΙα по отношению к фактору X (Эккшкоп и др., (1996) Ргос. №!. Асай. 8ск И8Л 93:14379-14384) или по отношению к синтетическому субстрату (Α0 2007031559).
Однако как показано здесь (см. пример 4 ниже), модификация полипептида ΡΥΙΙ в положении 286 (нумерация соответствует последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3; соответствует положению 143 по нумерации химотрипсина), в частности замена на основный остаток, такой как аргинин (Агд, К), приводит к модифицированному полипептиду ΡΥΙΙ с повышенной каталитической и коагулянтной активностью.
Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие модификации, такие как замена аминокислоты основной аминокислотой в положении, соответствующем положению 286 последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3 (положение 143 по нумерации химотрипсина). Предусмотренные в настоящем документе модификации в положении 286 могут быть введены в любой полипептид ΡΥΙΙ, в том числе полипептидпредшественник ΡΥΙΙ, приведенный в 8Е0 ГО N0: 1 или 2, в зрелый полипептид ΡΥΙΙ, приведенный в 8Е0 ГО N0: 3, или могут быть введены в любой видовой, аллельный или модифицированный вариант и их активный фрагмент, который обладает 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с любым из полипептидов ΡΥΙΙ, приведенных в 8Е0 ГО N0: 1-3.
Модификация полипептида ΡΥΙΙ в положении 286 по нумерации зрелого ΡΥΙΙ (соответствует положению 143 по нумерации химотрипсина) может изменить конформацию оксианионной впадины таким образом, что измененная конформация способствует более эффективному катализу превращения субстрата. Увеличение каталитической активности таких модифицированных полипептидов ΡΥΙΙ может проявляться в присутствии и/или в отсутствие тканевого фактора и может быть оценено с использованием ίη νίίΐΌ тестов, как описано в примерах 4 и 7 ниже. В дополнение к проявлению увеличенной каталитической активности полипептиды ΡΥΙΙ, которые были модифицированы в положении 286 по нумерации зрелого ΡΥΙΙ, также могут обладать повышенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ. Это может быть связано, например, с уменьшением связывания модифицированного полипептида ΡΥΙΙ с АТ-ΙΙΙ при определенных условиях (например, после инъекции пациенту) или с пониженной скоростью инактивации АТ-ΙΙΙ (т.е. уменьшенной константой скорости второго порядка для ингибирования), что может проявляться как увеличение коагулянтной активности в присутствии АТ-ΙΙΙ по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ. Повышенная устойчивость к АТ-ΙΙΙ может быть оценена с использованием ίη νίΙΐΌ тестов, как описано в примере 5.
Аминокислотный остаток 0286 по нумерации зрелого ΡΥΙΙ (соответствующий остатку 0143 по нумерации химотрипсина) может быть модифицирован удалением, заменой или замещением аминокислоты любой другой аминокислотой. Альтернативно, аминокислота может быть вставлена непосредственно перед аминокислотным остатком 0286 или после остатка, изменяя конформацию в непосредственной близости от аминокислотного остатка 0286. Кроме того, полипептид ΡΥΙΙ с модификацией 0286 также может содержать одну или несколько других модификаций, в том числе вставки, удаления, замены или замещения аминокислот, полипептид также может содержать модификации, не затрагивающие первичную последовательность полипептида, такие как добавление углеводного фрагмента, добавление фрагмента полиэтиленгликоля (ПЭГ), добавление домена Ρс и т.д. или любую их комбинацию. Таким образом, полипептид ΡΥΙΙ, содержащий модификацию в положении 286 по нумерации зрелого ΡΥΙΙ, может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более модифицированных положений. Такие полипептиды сохраняют по меньшей мере один вид активности немодифициро- 46 020818 ванного полипептида РУН. Как правило, модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную коагулянтную активность.
Указанные изменения в активности могут проявляться как увеличение коагулянтной активности, увеличение продолжительности коагулянтной активности, ускорение наступления терапевтического эффекта, ускорение наступления коагулянтной активности и/или повышение терапевтического индекса. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, включающие модификацию в положении 286 по нумерации зрелого РУН, которые обладают повышенной коагулянтной активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Такие модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы для лечения нарушений свертываемости крови, таких как гемофилии, или при операциях, травмах, повреждениях, где полипептиды РУН помогут содействию свертыванию крови. Из-за повышенной коагулянтной активности модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, содержащие модификацию в положении 286 по нумерации зрелого РУН, обладают преимуществами при лечении перед полипептидом РУН дикого типа, таким как фактор УН Nονοкеνеη®, включая уменьшение количества вводимого РУН, которое требуется для поддержания достаточной для гемостаза концентрации активного РУН в сыворотке крови. Это может привести, например, к более низким дозам и/или частоте введения, необходимым для достижения сопоставимого биологического эффекта, может привести к быстрому наступлению терапевтического эффекта, более длительному действию, повышенной комфортности лечения и одобрению лечения субъектами и/или к ослаблению нежелательных побочных эффектов.
I. Основные аминокислотные замены в положении 286.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, в которых глутамин в положении 286 (нумерация соответствует последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3; соответствует положению 143 по нумерации химотрипсина) заменен остатком основной аминокислоты, такой как любая аминокислота, выбранная из аргинина (Агд, К), гистидина (Ηϊκ, Н) или лизина (Ьук, К). В частности, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, в которых глутамин в положении 286 заменен на аргинин (т.е. произошла замена О286К, соответствующая замене О143К по нумерации химотрипсина). Моделирование показывает, что замена глутамина на аргинин приводит к потере двух ключевых взаимодействий, которые стабилизируют неактивную конформацию оксианионной впадины в РУНа дикого типа или в немодифицированном РУН. Дестабилизирующие взаимодействия в РУН дикого типа или немодифицированном РУН включают взаимодействие между боковой цепью остатка 0286 (соответствующего 0143 по нумерации химотрипсина) и амидной группой 0342 основной цепи (соответствующего 0193 по нумерации химотрипсина), и взаимодействие между карбонильной группой главной цепи К341 (соответствующего К1 по нумерации химотрипсина) и амидной группой главной цепи 8195 (соответствующего 8344 по нумерации химотрипсина). Замена глутамина в белке дикого типа на аргинин в положении 286, однако, не только нарушает указанные взаимодействия, но и создает два новых важных взаимодействия. Они включают создание солевого моста между основной боковой цепью модифицированной аминокислоты К286 (К143 по нумерации химотрипсина) и кислой боковой цепью нативного остатка Ό289 (Ό146 по нумерации химотрипсина), и взаимодействие амидной группы основной цепи модифицированной аминокислоты К286 и карбонильной группы основной цепи К341, которые стабилизируют активную конформацию модифицированного полипептида РУНа. Кроме того, новый солевой мост между модифицированной аминокислотой К286 и Ό289, как ожидается, изменяет конформацию и/или гибкость петли автолиза, которая является частью расщелины активного центра. Петля автолиза вовлечена в распознавание высокомолекулярного субстрата и ингибиторную специфичность протеаз свертывания. Таким образом, изменение конформации и/или гибкости этой петли может привести, например, к увеличению каталитической активности по отношению к субстрату (например, фактору Х и/или фактору 1Х) и повышению устойчивости к ингибиторам (например ТРР1 и/или АТ-ΙΙΙ). Таким образом, замена глутамина в положении 286 на основную аминокислоту, такую как аргинин (Агд, К), гистидин (Ηίκ, Н) или лизин (Ьук, К), может привести к увеличению каталитической и коагулянтной активности по сравнению с полипептидом РУН дикого типа. Таким образом, предусмотренные здесь полипептиды РУН содержат мутации О286К, О286К или О286Н по нумерации зрелого РУН (соответствующие мутациям О143К, О143К или О143Н, соответственно, по нумерации химотрипсина). Примеры таких полипептидов представляют собой полипептиды с последовательностями аминокислот, приведенными в 8Е0 ГО N0: 118, 119 и 129 соответственно.
Аминокислотная замена глутамина (0ш, О) на основный аминокислотный остаток, в частности аргинин (Агд, К), в положении 286 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, может быть введена в любой полипептид РУН, в том числе полипептид-предшественник РУН с последовательностью, приведенной в 8Е0 ГО N0: 1 или 2, введена в зрелый полипептид РУН, приведенный в 8Е0 ГО N0: 3, или в любой видовой, аллельный и модифицированный вариант, такой как описано в уровне техники, и в их активные фрагменты, которые обладают 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с любым из полипептидов РУН, приведенных в 8Е0 ГО N0: 1-3. Например, мутация О286К может быть введена в любой модифицированный полипептид РУН, описанный в уровне техники, включая любые полипептиды, описанные в настоящем докумен- 47 020818 те. Такие модифицированные полипептиды РУН включают, но не ограничиваются, модифицированные полипептиды РУН, содержащие мутацию (мутации) М298Ц (δΕΟ ГО NΟ: 158), см., например, Гег55оп и др., (2001) Ρι-ос. №1. Αсаа. 8ά. υδΑ 98:13583-13588), Ε296ΥΛ1298Ο (δΕΟ ГО ΝΌ: 343), У158Ε (δΕΟ ГО ΝΌ: 344), Ε296Κ/Μ298Κ (δΕΟ ГО ΝΌ: 345), Κ337Α (δΕΟ ГО ΝΌ: 346), У158^/Ε296У/Μ298^ (δΕΟ ГО ΝΌ: 98; ΝΝ1 731; см., например, Ρе^55οη и др., (2007) ΑγΕ ТЬготЬ. Уазе. Вю1. 27 (3): 683-689), У158^/Ε296У/Μ298^/Κ337Α (δΕΟ ГО NΟ: 347, см., например, Ызтап и др., (2003) I. ТЬготЬ. Нает. 1: 2175-2178), У253N (δΕΟ ГО ΝΌ: 348, см., например, υδ 7427592), ΊΊ06Ν (δΕΟ ГО ΝΌ: 349; см., например, υδ 7427592), Т106N/У253N (δΕΟ ГО ΝΌ: 350; см., например, υδ 7427592), Κ143N/N145Т (δΕΟ ГО ΝΌ: 351; υδ 7442524), К315К/У317Т (δΕΟ ГО ΝΌ: 352; υδ 7442524) или ^43^14517^315^3171 (δΕΟ ГО ΝΌ: 353; υδ 7442524).
Мутация О286Р также может быть введена в химерные полипептиды РУЛ, или гибридные полипептиды РУН, или в полипептиды РУН, которые были модифицированы иным образом, например путем гликопегилирования (см., например, АО 2007022512; ОЬозЬ и др., (2007), текст презентации на Αт. δοС1е1у. Нета1о1. МееНпд 10 декабря 2007 г.). В одном примере аминокислотная замена глутамина на аргинин в положении, соответствующем положению 286 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в δΕΟ ГО NΟ: 3, приводит к полипептиду РУН с аминокислотной последовательностью, приведенной в δΕΟ ГО NΟ: 118.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие аминокислотную замену О286Р по нумерации зрелого РУН (соответствующую О143Р по нумерации химотрипсина), где модифицированные полипептиды РУН обладают повышенной коагулянтной активностью. Такие модифицированные полипептиды РУЛ могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или более модифицированных положений, в которых одно из модифицированных положений представляет собой положение 286. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие две или более модификаций, при этом одна модификация представляет собой аминокислотную замену О286Р (по нумерации зрелого РУН) и модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Мутацию О286Р можно комбинировать с любыми другими мутациями, описанными в настоящем документе или известными в уровне техники. Как правило, полученный модифицированный полипептид проявляет увеличенную коагулянтную активность. Специалист в уровне техники может определить коагулянтную активность полипептида РУН, содержащего модификацию О286Р, с использованием ίη \Ьго и ίη νί\Ό анализов, известных в уровне техники и описанных здесь. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, включают полипептиды, которые содержат мутацию О286Р, а также одну или несколько мутаций, которые, например, повышают устойчивость к антитромбину-Ш, повышают способность активировать РХ, повышают способность активировать РК, увеличивают связывание и/или аффинность к фосфолипидам, увеличивают аффинность к тканевому фактору, увеличивают собственную активность, увеличивают ТФзависимую активность, изменяют конформацию полипептида для изменения зимогенности, увеличивают каталитическую или коагулянтную активность, например, сдвигая равновесие между высокоактивной и менее активной конформацией РУНа в пользу высокоактивной конформации, повышают устойчивость к протеазам, уменьшают гликозилирование, увеличивают гликозилирование, уменьшают иммуногенность, повышают стабильность и/или содействуют химическому связыванию групп.
Увеличенная коагулянтная активность модифицированных полипептидов РУН, содержащих аминокислотную замену О286Р, может быть результатом увеличенной каталитической активности. Увеличенную каталитическую активность можно наблюдать в присутствии и/или в отсутствие тканевого фактора (ТФ). Таким образом, увеличенная каталитическая активность может быть ТФ-зависимой и/или ТФнезависимой. Каталитическая активность модифицированного полипептида РУН, содержащего мутацию О286Р, может быть оценена с использованием ίη \Ьго тестов, таких как тесты, описанные в примерах 4 и 7. С помощью таких анализов можно определить каталитическую активность модифицированных полипептидов РУН по отношению к субстрату, такому как фактор X, в присутствии или в отсутствие тканевого фактора. Модифицированные полипептиды РУН, содержащие мутацию О286Р, могут обладать каталитической активностью, повышенной приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более в присутствии и/или в отсутствие тканевого фактора по сравнению с каталитической активностью немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа ίη νί\Ό или ίη νίΙΐΌ. Например, как показано в примере 4, полипептид РУНа с мутацией О286Р (О143Р по нумерации химотрипсина) в качестве единственной модификации может обладать каталитической активностью по отношению к РХ в присутствии или в отсутствие ТФ, которая приблизительно в два-четыре раза больше, чем каталитическая активность РУН дикого типа. В других примерах полипептид РУНа с мутациями О286Р и М298О может обладать каталитической активностью по отношению к РХ в присутствии ТФ, которая приблизительно в три-четыре раза больше, чем каталитическая активность РУН дикого типа, и может обладать каталитической активностью по отношению к РХ в отсутствие ТФ, которая приблизительно в семь-двадцать шесть раз больше, чем каталитическая активность РУН дикого типа.
- 48 020818
Неограничивающие примеры модифицированных полипептидов РУН, содержащих две или более модификации, где одна модификация представляет собой замещение аминокислоты Р286К (по нумерации зрелого РУН), а модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную каталитическую активность по отношению к РХ в присутствии и/или в отсутствие тканевого фактора по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, приведены в табл. 5 и в примере 4 ниже.
В настоящем документе приведен идентификатор последовательностей (8Ер ГО N0), в рамках которого приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУН. Как описано более подробно в разделе Ό.6 ниже, модификация замена О1а из РГХ включает удаление эндогенного домена О1а белка РУН, т.е. удаление аминокислотных остатков с А1 по Υ44 (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Ер ГО N0: 3), и вставку 45 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ45 домена О1а белка НХ. приведенным в 8Ер ГО N0: 83. В некоторых примерах гетерологичный домен О1а НХ в модифицированных заменой О1а из РГХ полипептидах РУН содержит одну или несколько аминокислотных замен в положениях, соответствующих М9, Е40, Κ43 и/или Р44 в последовательности домена О1а белка ΕΙΧ, приведенной в 8Ер ГО N0: 83. Τакие замены обозначаются фигурными скобками (например, {замена О1а из ΕΙΧ/Ρ448}). В случаях, когда модифицированные аминокислотные позиции не имеют соответствующего номера по химотрипсину (т.е. если позиция не относится к аминокислотным позициям с 153 до 406 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Ер ГО N0: 3, и не указана в табл. 1 выше), позиция обозначается в скобках с использованием нумерации зрелого РУН. Например, Τ158N не имеет соответствующего номера по химотрипсину и приводится в виде Т[158]^ когда речь идет о нумерации химотрипсина.
_ _ Τаблица 5
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<2 ГО ΝΟ
Замена 01а из Р1Х/р286К. Замена 01а из Р1Х/(2143К. 131
(2286К/Н257А Н117А/(Л43К. 132
8222А/(}286К 382А/(}143К 133
(2286К/3222А/Н257А 382А/Н117А/(Л43К. 134
Замена О1а из ΡΙΧ /3222А/(2286К. 882А/Замена 01а из Р1Х/<Л 43К. 135
Замена 01а из Р1Х/Н257А/()286К Н117А/Замена 01а из Р1Х/(}143К. 136
Замена О1а из ΡΙΧ /3222А/Н257А/(}286К. (5143К/382А/Н117А/Замена О1а из ΡΙΧ 137
О286К/М298Р (5143К/М156Р 138
(2286К/М298(3/К341(2 (}143К/М156(УК192Р 139
О286К/М298Р/К199Е (Л43К/М156р/К60еЕ 140
3222А/Н257А/(}286К/М298Р 382А/Н117А/(2143К/М156р 150
А1753/(2286К/р366У А393/(Л43КУР217У 144
8222А/Р286К/(}366У 382А/(Л43К/р217У 145
Н2573/(2286К. Н1178/С>143К 146
Н2573/(2286К/р366У Н1173/(Л43К/(5217У 147
3222А/Н257А/(3286К/р366У 382А/Н117А/(2143К/р217У 148
(}286К/Н373А (2143К/Н224А 149
(2286К/К34ГО (2143К/К192О 151
(}286К/р366О <3143Κ/ζ)217ϋ 152
(2286Κ/Ρ366Ν (}143Κ/ρ217Ν 153
(3286Κ/Μ298(5/ρ366Ν ζ)143Κ/Μ156(3/ζ)217Ν 155
(2286К/Н373Р (3143К/Н224Р 156
(3286К/М298Р/Н373Р (Л43К/М156р/Н224Р 157
(}286К/М298Р (Л43К/М156(2 138
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ 279
Замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/ 3222А/(2286К Замена 01а из ΡΙΧ/ Τ[128]Ν/Ρ[ 129]А/ 382А/(3143К 285
Замена 01а из Р1Х/ 852А/860А/8222А/О286К Замена 01а из Р1Х/ 3[52]А/3[60]А/382А/О143К 292
Замена 01а из Р1Х/ (}286К/М298р Замена О1а из РГХ/ (}143К/М156р 141
Τ128Ν/Ρ129Α/ζ)286Κ7 М298(} Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/(}143Κ/ М156(} 280
Замена О1а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129А/(3286К/М298(2 Замена О1а из ΡΙΧ/Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ζ)143Κ/ М156(} 286
{Замена 01а из ΡΙΧ/Ε40Σ}/ (2286К/М2989 {Замена 01а из Р1Х/Е[40]Ь}/ О143К/М156Р 274
{Замена О1а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ (2286К/М298(2 {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ (Л43К/М156Р 275
{Замена 01а из ΡΙΧ/Ρ448}/ О286КУМ298О {Замена 01а из Р1Х/<2[44]8}/ О143К/М156О 276
- 49 020818
{Замена 01а из ΡΙΧ/Μ19Κ}/ О286К/М298О {Замена 01а из ΡΙΧ/Μ[19]Κ}/ О143К/М156О 277
352А/360А/О286К/М298О 8 [52] А/8[60] АЛ} 143К/М1560 293
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/Η257Α/Ο286Κ/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α/Η117А/О143К. /М156О 287
352А/360А/3222А/Н257А/О286К/ М298О 8[52]Α/δ[60]Α/882Α/Η117А/О143К /М156О 298
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Η224Ρ 281
852А/360А/ О286К/Н373Р 3[52]Α/3[60]Α/0143Κ/Η224Ρ 296
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο/ Η224Ρ 288
352А/360А/О286К/М298О/Н373Р 8 [52] Α/8 [60] Α/0143Κ/Μ156Ο/Η224Ρ 297
У2Ю/О143К/Р154У/М156О У2Ю/О143К/Р154У/М156О 282
Замена 01а из ΡΙΧ /8222А/Т239У/0286К. Замена О1а из ΡΙΧ /882А/Т99У/ Ο143Κ. 301
Т239У/О286К/М298О Т99У/О143К/М156О 302
Замена 01а из Р1Х/ Т239У/О286К/М298О Замена 01а из Р1Х/ Т99У/О143К/ М156О 304
3222А/Т239У/Н257А/О286К/М298О 882А/Т99У/Н117А/О143К/М156О 303
Т239У/О286К/Н373Р Т99У/О143К/Н224Р 305
Т239У/О286К/М298О/Н373Р Т99 У/0143К/М15 60/Н224Р 306
Τ239Ι/Ο286Κ. Τ99Ι/Ο143Κ. 308
О1а8\уарР1Х/8222А/Т2391/0286И Замена 01а из ΡΙΧ /882А/Т991/0143К 310
Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο Τ99Ι/Ο143Κ/Μ156Ο 311
Замена 01а из ΡΙΧ /Т2391/О286К/М298О Замена О1а из ΡΙΧ /Т991/0143К? М156О 313
3222Α/Τ239Ι/Η257Α/Ο286Κ/Μ298Ο 882Α/Τ99Ι/Η117А/О143К/М156О 312
Τ239Ι/Ο286Κ/Η373Ρ Τ99Ι/0143Κ/Η224Ρ 314
Т239У/О286К. Т99У/О143К 299
Т2391/О286К/М298О/ Н373Р Τ99Ι/Ο143ΚΜ156Ο/Η224Ρ 315
Н2573/О286К/М298О Н1178/0143Р/М1560 322
Замена 01а из ΡΙΧ /О286К/8222А/Н2578 Замена 01а из ΡΙΧ /О143К/882А/ Н1178 321
8222А/Н2578/О286К/ М298О 882А/Н1178/0143К/М1560 324
Н2578/О286К/М298О/ Н373Р Η1178/0143К/М1560/Н224Р 325
3222А/О286К/М298О/ Н373Р 882А/0143К/М1560/Н224Р 326
Замена О1а из Р1Х/3222А/О286К/М298О/ Н373Р Замена 01а из ΡΙΧ 882А/0143К/М1560/Н224Р 318
8222А/О286К/М298О 882А/О143К/М156О 328
Замена 01а из ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ/Μ298Ο Замена 01а из ΡΙΧ 882А/О143К/М156О 317
Замена О1а из Р1Х/ 3222А/О286К/Н373Р Замена 01а из Р1Х/ 382А/О143К/Н224Р 316
Н257А/О286К/М298О Н117А/О143К/М156О 321
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/Ο286Κ/Μ298Ο Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/Ο143Κ/Μ15 60 337
А122Ν/01248/А175 3/0286К/М2980 Α[122]Ν/Ο[124]8/Α39δ/0143Κ/Μ15 60 338
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/8222Α/Η257Α/ О286К/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/882Α/Η117 А/О143К/М156О 339
А122Ν/01248/А 175 8/8222А/Н25 7А/Ц28 6К/ М298О Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α39δ/882Α/Η117 Α/Ο143Κ/Μ156Ο 340
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/Ο286Κ/Μ298Ο/Η37 ЗР Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/Ο143Κ/Μ15 60/Η224Ρ 341
А122Ν/01248/А 175 3/Ο286Κ/Μ298Ο/Η3 7 ЗР Α[ 122]Ν/Ο[ 124] 8/Α398/0143Κ/Μ1 56Ο/Η224Ρ 342
У158О/0286К/Р296У/М2980/Н373Р У2Ю/О143К/Р154У/М156О/Н224Р 320
{Замена О1а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο {Замена 01а из ΡΙΧ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο 355
ΤΙ 28Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο/ 0217Ν 356
{Замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν {Замена 01а из ΡΙΧ /Κ[43]Ι}/Ο143Ρ/Μ156ΟΟ217Ν 357
{Замена 01а из ΡΙΧ /К431}/ Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν {Замена О1а из ΡΙΧ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Ε/Μ156ΟΟ2 17Ν 358
У158Э/О286К/Р296У/М298О У2Ю/О143К/Р154У/М156О 360
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν/Η3 73Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο/Ο 217Ν/Η224Ρ 364
Τ239ν/(2286Κ/Μ298<3/ρ366Ν Т99 У/0143Κ/Μ1560/0217Ν 365
Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν Τ99Ι/Ο143Κ/Μ156Ο/Ο217Ν 366
- 50 020818
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/()286Κ/Μ298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν/()143Κ/Μ1 56() 367
Τ128Ν/Ρ129Α/5222Α/Τ239ν/Η257Α/()28 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α/Τ99ν/Η117 368
6К/М298О Α/()143Κ/Μ156()
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/Т239У/()286К/М298()/Н37 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν/()143Κ/Μ1 369
ЗР 56Ο/Η224Ρ
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/ζ)286Κ/Μ298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/()143Κ/Μ15 6Ω 370
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/()286Κ/Μ298()/Η37 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/()143Κ/Μ15 371
3Ρ 6Ο/Η224Ρ
Полипептид ΡУII, содержащий мутацию Р286К по нумерации зрелого ΡУII, также может обладать повышенной устойчивостью к АТ-Ш. Повышенная устойчивость к АТ-Ш может быть результатом уменьшенной скорости ингибирования АТ-Ш или уменьшенным связыванием с АТ-Ш при определенных условиях, например после инъекции животному или пациенту. Устойчивость к АТ-Ш может быть продемонстрирована путем измерения константы скорости ингибирования второго порядка полипептида ΤУIIа дикого типа и варианта полипептида ΤУIIа. Другие ίη νίίΓο методы, такие как анализы с помощью В^^ге®, также могут быть использованы. Модифицированные полипептиды ΤУII могут обладать повышенной устойчивостью к ингибиторному действию АТ-Ш по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡУII, устойчивость может быть оценена ίη νίίΓο с помощью таких анализов, как описано в примере 5.
Модифицированные полипептиды ΡУII, содержащие мутацию Р286К, могут обладать устойчивостью к АТ-Ш, повышенной приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с устойчивостью к АТ-Ш немодифицированного полипептида ΡУII или полипептида ΡУII дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓο. Например, как показано в примере 5 ниже, полипептид ΡУIIа, содержащий мутацию Р286К (Р143К по нумерации химотрипсина), может обладать каталитической активностью по отношению к РХ в присутствии АТ-Ш и в отсутствие ТФ, которая повышена в два-четыре и более раз по сравнению с каталитической активности ΡУII дикого типа. Таким образом, модифицированный Р286К полипептид ΡУII может проявлять устойчивость к АТ-Ш, повышенную приблизительно на 200-400% по сравнению с устойчивостью немодифицированного полипептида ΡУII.
Увеличенная каталитическая активность и повышенная устойчивость к АТ-Ш могут проявляться как увеличенная коагулянтная активности в присутствии и/или в отсутствие ТФ. Такая активность может быть оценена ίη νίίΓο, ех νίνο или ίη νίνο, например, при введении человеку или животному. Коагулянтная активность модифицированного полипептида ΡУII, содержащего мутацию Р286К, может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида ΡУII или полипептида ΡУII дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓο. Например, в примере 6.В.2 показано, что полипептид ΡУIIа с мутацией Р286К (Р143К по нумерации химотрипсина) проявляет большую (примерно в 2 раза) коагулянтную активность в модели кровотечения на мыши, чем коагулянтная активность полипептида ΡУII дикого типа (например, ΡУII Nονοзеνеη®). Полипептид ΡУIIа, содержащий мутации Р286К и М298Р (Р143К и М156Р, соответственно, по нумерации химотрипсина) обладает еще большей коагулянтной активностью.
II. Другие мутации в положении 286.
Глутамин в положении, соответствующем положению 286 последовательности полипептида ΡУII, приведенной в 8ЕР ГО N0: 3, может быть заменен другой аминокислотой, не относящейся к основным аминокислотам (т.е. отличной от аргинина, гистидина и лизина). Такие замены могут изменить конформацию оксианионной впадины и, например, привести к конформации, которая увеличит каталитическую активность модифицированного полипептида ΡУII по сравнению с полипептидом ΡУII дикого типа. Модифицированные полипептиды ΡУII с измененной конформацией оксианионной впадины могут обладать каталитической активностью, повышенной приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с каталитической активностью немодифицированного полипептида ΡУII или полипептида ΡУII дикого типа, измеренной ίη νίνο, ех νίνο, или ίη νίίΓο.
В табл. 6 представлены не ограничивающие примеры аминокислотных замен в положении Р286, кроме замены на аргинин, соответствующие аминокислотным позициям последовательности зрелого полипептида ΡУII, приведенной в 8ЕР ГО N0: 3. Как уже отмечалось, такие полипептиды ΡУII обладают измененной конформацией оксианионной впадины на более эффективную конформацию и, следовательно, обладают увеличенной коагулянтной активностью. При описании таких мутаций первая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует аминокислоте, которая заменяется, ее номер соответствует положению аминокислоты в последовательности зрелого полипептида ΡУII, приведенной в 8Ер ГО N0: 3, а вторая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует выбранной аминокислоте, которая заменяет первую аминокислоту в этом положении. Положения аминокислот для мутаций также обозначаются по нумерации химотрипсина. В табл. 6 ниже приведены номера по идентификатору после- 51 020818 довательностей (8Е^ ΙΌ N0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированного полипептида РУН.
Таблица 6
Модифицированные полипептиды РУН с измененной конформацией оксианионной впадины могут обладать каталитической активностью, повышенной приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с каталитической активностью немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа, измеренной ш у1уо, ех у1уо, или ш Уйго. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН с измененной конформацией оксианионной впадины также могут обладать повышенной устойчивостью к эндогенным ингибиторам протеаз (т.е. сниженной скоростью ингибирования или уменьшенной аффинностью к ингибиторам), таким как ТРРI или АТ-Ш, примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со скоростью ингибирования или аффинностью к эндогенным ингибиторам немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа ш у1уо, ех у1уо, или т уЛго. Увеличенная каталитическая активность и/или устойчивость к эндогенным ингибиторам, такая как устойчивость к АТ-ΙΙΙ, модифицированного полипептида РУН также может проявляться как повышенная коагулянтная активность, повышенная продолжительность коагулянтной активности, ускоренное наступление коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс. Например, коагулянтная активность модифицированного полипептида РУН может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа ш у1уо, ех у1уо, или ш Уйго.
2. Повышенная устойчивость к АТ-ΙΙΙ.
Антитромбин ΙΙΙ (также известный как антитромбин или АТ-ΙΙΙ) является важным антикоагулянтомсерпином (ингибитор сериновой протеазы). АТ-ΙΙΙ синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего 464 аминокислотных остатка (8Е^ ΙΌ N0: 122). В ходе секреции сигнальный пептид из 32 остатков отщепляется с образованием зрелого антитромбина человека из 432 аминокислот (8Е^ ΙΌ N0: 123). Гликопротеин АТ-ΙΙΙ с молекулярной массой 58 кДа циркулирует в крови и функционирует как ингибитор сериновых протеаз (серпин) и ингибирует большое число сериновых протеаз системы коагуляции. Основными мишенями АТ-ΙΙΙ являются тромбин и фактор Ха, хотя было показано, что АТ-ΙΙΙ также подавляет активность НХа, РХЫ, РХНа и, в меньшей степени, РУПа. Действие АТ-ΙΙΙ значительно усиливается гликозаминогликанами, такими как природный гепаран сульфат или различные полученные из ткани гепарины, которые широко используются в качестве антикоагулянтов в клинической практике. АТ-ΙΙΙ определенным образом связывает уникальную пентасахаридную последовательность в гепарине, что индуцирует конформационные изменения в петле реакционного центра. В такой конформации петля реакционного центра АТ-ΙΙΙ может более эффективно взаимодействовать с реакционном центром сериновых протеаз и приводить к ингибированию. АТ-ΙΙΙ, как правило, не ингибирует свободный РУПа плазмы даже в присутствии гепарина, вероятно, из-за зимогеноподобной конформации РУПа, которая препятствует эффективному взаимодействию с АТ-ΙΙΙ. Однако ингибирующее действие АТ-ΙΙΙ увеличивается при образовании комплекса РУПа с ТФ. Связывание АТ-ΙΙΙ с комплексом ТФ/РУПа может привести к отделению РУПа от ТФ, при этом РУПа остается в неактивном состоянии в комплексе с АТ-ΙΙΙ. Повышенная аффинность АТ-ΙΙΙ к связавшему ТФ белку РУПа по сравнению со свободным РУПа предположительно отражает созревание активного центра РУПа при образовании комплекса с ТФ, что делает его восприимчивым к связыванию АТ-ΙΙΙ (Као и др., (1993) В1оой 81: 2600-2607). Таким образом, влияние АТ-ΙΙΙ на РУПа пропорционально собственной активности молекулы РУПа, если в полипептид РУПа не
- 52 020818 были введены мутации, опосредующие устойчивость к АТ-ΙΙΙ. Если РУПа сохраняет свою зимогеноподобную конформацию, АТ-ΙΙΙ не оказывает на него большого эффекта. Если, однако, РУПа изменяет конформацию на более активную, например, путем связывания ТФ или за счет специфичных изменений ίη νίίτο, ингибирование АТ-ΙΙΙ значительно увеличивается. РУПа полипептиды, которые были модифицированы для увеличения собственной активности, часто демонстрируют одновременное увеличение восприимчивости к ингибированию АТ-ΙΙΙ. Например, модификация одной или нескольких аминокислот в активационном кармане РУПа, например, путем аминокислотных замен К337А, Ь305У, М298О, У158Э и Е296У (по последовательности зрелого РУЛ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3), приводит к увеличению чувствительности полипептида РУПа к АТ-ΙΙΙ, тем самым подавляя активность РУПа на 90% (Рег88оп и др., (2001) ΡΝΆ8 98:13583-13588). В другом примере индукция более зимогеноподобной конформации модификацией аминокислот в α-спирали РУПа при повышении активности модифицированного белка РУПа также увеличивает его восприимчивость к АТ-ΙΙΙ (Рег88оп и др., ( 2004) ВюсЬет. 1. 379:497-503).
Примеры модификаций для повышения устойчивости к АТ-ΙΙΙ.
В полипептид РУЛ могут быть введены модификации, которые увеличивают его устойчивость к АТ-ΙΙΙ. Как правило, такие модифицированные полипептиды РУЛ сохраняют по меньшей мере одну активность полипептида РУЛ. Как правило, такие модификации включают одну или несколько аминокислотных замен в любом положении полипептида РУЛ, которые участвуют во взаимодействии РУПа с АТΙΙΙ. Такие модификации могут, например, привести к снижению связывания модифицированного РУЛ с АТ-ΙΙΙ. Модифицированные полипептиды РУЛ устойчивы к естественному ингибиторному действию АТ-ΙΙΙ в отношении инициации коагуляции. При оценке в соответствующем анализе ίη νίίτο или ίη νίνο, например, при введении РУЛ субъекту в качестве прокоагулянта, модифицированные устойчивые к АТΙΙΙ полипептиды РУЛ проявляют увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированными полипептидами РУЛ. Как описано здесь ниже, специалист в области техники может эмпирически или рационально сконструировать модифицированные полипептиды РУЛ, проявляющие повышенную устойчивость к АТ-ΙΙΙ. Такие модифицированные полипептиды РУЛ могут быть исследованы с помощью известных специалисту в области техники подходов на предмет проявления указанными модифицированными полипептидами РУЛ повышенной устойчивости АТ-ΙΙΙ. Например, такие модифицированные полипептиды могут быть проверены на связывание с АТ-ΙΙΙ. Как правило, модифицированные полипептиды РУЛ, которые обладают повышенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ, проявляют уменьшенное связывание и/или уменьшенную аффинность к АТ-ΙΙΙ. Как правило, указанные исследования проводят на двухцепочечной форме РУП, такой как активированная форма РУЛ (РУПа). Кроме того, анализы для определения эффектов АТ-ΙΙΙ, как правило, проводят в присутствии гепарина и в присутствии тканевого фактора, хотя такие тесты также могут быть выполнены в отсутствие одного или обоих кофакторов.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, обладающие повышенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ. Важна устойчивость к ингибированию АТ-ΙΙΙ как в присутствии, так и в отсутствие ТФ. Предусмотренные в настоящем документе варианты полипептида РУЛ включают модификации одной или нескольких аминокислот в позициях 239, 931, 366 и 373 (соответствующих аминокислотным позициям 99, 170ΐ, 217 и 224, соответственно, по нумерации химотрипсина). Эти аминокислотные остатки могут быть модифицированы заменой, удалением или замещением аминокислот. Указанные остатки могут быть заменены или замещены любой другой аминокислотой. Альтернативно, для изменения конформации целевых аминокислотных остатков или структуры белка в непосредственной близости от целевых аминокислотных остатков могут быть использованы вставки аминокислот. Любой аминокислотный остаток может быть заменен на эндогенный аминокислотный остаток в конкретной позиции. Как правило, заменяющую аминокислоту выбирают так, что она препятствует взаимодействию между РУП и АТ-ΙΙΙ. В некоторых примерах остаток треонина в положении 239 (соответствует положению 99 по нумерации химотрипсина) заменяют на остаток серина (Зег, 8), аспарагина (Άδη, Ν), глутамина (О1п, О), валина (Уа1, У), лейцина (Ьеи, Ь), гистидина (Ήίδ, Н) или изолейцина (Пе, Ι). В других примерах, пролин в позиции 321 (соответствует положению 170ί по нумерации химотрипсина) заменяют на лизин (Ьуз, К), глутаминовую кислоту (О1и, Е), серин (Зег, 8) или тирозина (Туг, Υ). В дополнительных примерах глутамин в положении 366 (соответствует положению 217 по нумерации химотрипсина) заменяют на аспарагин (Αδη, Ν), аспарагиновую кислоту (Αδρ, Ό), глутаминовую кислоту (О1и, Е), серин (Зег, 8), треонин (ТЬг, Т), лизин (Ьуз, К) или валин (Уа1, У). В других примерах гистидин в положении 373 (соответствует положению 224 по нумерации химотрипсина) заменяют на остаток аспарагиновой кислоты (Αδρ, Ό), глутаминовой кислоты (О1и, Е), серина (8ег, 8), фенилаланина (РЬе, Р) или аланина (А1а, А). В другом варианте могут быть получены комбинации мутаций. Среди таких комбинаций мутаций есть комбинации, включающие две или более мутаций остатков Т239, Р321, 0366 и Н373 (которые соответствуют остаткам Т99, Р1701, 0217 и Н224, соответственно, по нумерации химотрипсина). Например, модифицированный полипептид РУЛ может обладать аминокислотными заменами в 2, 3, 4 или 5 указанных позициях. Следовательно, модифицированный полипептид может обладать 1, 2, 3, 4 или 5 мутациями, которые могут привести к увеличению устойчивости модифицированного полипептида РУЛ к ингибиторному действию АТ-ΙΙΙ. Например, полипептид РУЛ может быть модифицирован в положении 366 и положении 373. В некоторых примерах модификация представляет собой замену аминокислоты, напри- 53 020818 мер замену глутамина в положении 366 на аспарагиновую кислоту и замену гистидина в положении 373 на глутаминовую кислоту. В табл. 7 приведены неограничивающие примеры аминокислотных замен в указанных остатках согласно положениям аминокислот в последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Ер ГО N0: 3. В приведенные примеры включены примеры комбинаций мутаций. Как уже отмечалось, такие полипептиды РУН сконструированы для повышенной устойчивости к АТ-Ш и, следовательно, увеличенной коагулянтной активности. При описании указанных мутаций первая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует аминокислоте, которую заменяют, ее номер соответствует положению в последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Ер ГО N0: 3, а вторая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует выбранной аминокислоте, которая заменяет первую аминокислоту в этом положении. Аминокислотные позиции для мутирования также обозначаются по нумерации химотрипсина. В табл. 7 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8Ер ГО N0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУН.
Таблица 7
Модификации по нумерации зрелого ГУН Модификации по нумерации химотрипсина ЗЕ<2 ГО ΝΟ
Т2398 Т998 159
Τ239Ν Τ99Ν 160
Т239(2 Т99(2 161
Т239У Т99У 162
Т239Ь Т239Н Τ239Ι Р321К Р321Е Ρ321Υ Р3218 (}366О ζ)366Ε (2366Ν (2366Т (23663 (2366У (23661 ζ)366Ε (2366М Η373ϋ Н373Е Н3738 Н373Р Τ99ί Т99Н Τ99Ι Ρ170ΪΚ Ρ170ΪΕ Ρ170ΪΥ Ρ170Ϊ8 (22170 (2217Е (2217Ν (2217Т (22173 (2217У (22171 (2217Ь (2217М Н224Э Н224Е Н2248 Н224Р 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182
Н373А Н224А 183
(2366ϋ/Η373Ε (22170/ Н224Е 184
(2366У/Н373У (2217У/ Н224У 185
(2366У/Н373Е (2217У/ Н224Е 186
(2366У/Н3731 (2217У/ Η224Ι 187
Модифицированные полипептиды РУН с повышенной устойчивостью к АТ-Ш могут проявлять уменьшенную степень ингибирования при определенных условиях или уменьшенную константу скорости второго порядка для ингибирования АТ-Ш по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со степенью ингибирования или константой скорости второго порядка для ингибирования немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа ΐη У1уо или ΐη \ч1го. Таким образом, модифицированные полипептиды РУН могут обладать устойчивостью к АТ-Ш, повышенной по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с устойчивостью, проявляемой немодифицированным полипептидом РУН. Повышенная устойчивость к АТ-Ш таких модифицированных полипептидов РУН также может проявляться в виде повышенной коагулянтной активности, увеличенной продолжительности коагулянтной активности и/или увеличенного терапевтического индекса в присутствии АТ-Ш. Коагулянтная активность АТ-Ш-модифицированных полипептидов РУН может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированных полипептидов РУН или полипептидов РУН дикого типа ΐη У1уо или ΐη \л1го.
3. Повышенная устойчивость к ингибированию Ζη2+.
Амидолитическая активность РУНа регулируется аллостерическими изменениями, индуцируемыми связыванием ионов кальция и тканевого фактора (ТФ). Свободный РУН обычно существует в неактив- 54 020818 ной конформации. Связывание с Са2' и ТФ индуцирует изменения конформации и увеличение амидолитической активности (Ребегкоп и др., (1990) I. ΒίοΙ. СЬет. 265: 16786-16793). Напротив, было показано, что связывания ионов цинка с РУПа ингибирует активность. Связывание Ζη2' с РУПа приводит к снижению амидолитической активности и снижению аффинности к ТФ. Исследования показывают, что Са2' и Ζη2' конкурируют за связывание с РУПа, поэтому в присутствии Са2' ингибиторное действие Ζη2' уменьшается. Кроме того, связавшийся с ТФ белок РУПа менее восприимчив к ингибированию цинком.
В дополнение к сайтам связывания Ζη2+ в домене О1а, связывание Ζη2+ с которыми не влияет на амидолитическую активность РУПа, были найдены два сайта связывания Ζη2+ на протеазном домене РУЛ ^ΐΌΐ^η и др., (2000) Рго1еш 8с1. 9: 859-866, Ва)а и др., (2006) 1. Βίο1. СЬет. 281: 24873-24888). Первый сайт связывания Ζη2' включает в себя боковые цепи аминокислотных остатков Н216, Е220 и 8222 (Н76, Е80 и 882 по нумерации химотрипсина), а второй сайт связывания Ζη2+ включает в себя боковые цепи аминокислотных остатков Н257, Ό219 и К161 (Н117, Ό79 и К24 по нумерации химотрипсина).
Ζη2', следовательно, может иметь физиологическую роль в регуляции гомеостаза в качестве ингибитора РУН. Высказывалось предположение, что ингибиторный эффект возникает в результате увеличения концентрации Ζη2+ в месте образования сгустка после активации тромбоцитов (Ва_)а_) и др., (2006) 1. Βίο1. СЬет. 281:24873-24888). В тромбоцитах в цитоплазме и в α-гранулах, которые высвобождаются при активации тромбоцитов, хранится большое количество Ζη2'. Это может привести к увеличению локальной концентрации Ζη2', который, в свою очередь, может ингибировать активность РУПа и связывание РУПа с ТФ.
Примеры модификаций для повышения устойчивости к ингибированию Ζη2'.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, проявляющие повышенную устойчивость к ингибиторному эффекту Ζη2'. Это может быть достигнуто, например, за счет мутации одного или нескольких остатков в РУЛ, вовлеченных во взаимодействие и связывание с Ζη2', что уменьшит или предотвратит такое связывание, что сделает модифицированные полипептиды РУН устойчивыми к ингибированию каталитической активности и связывания ТФ ионами Ζη2'. При оценке в соответствующем анализе ίη νίίτο или ίη νίνο, например, при введении субъекту в качестве прокоагулянта модифицированные полипептиды РУН могут проявлять повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУЛ.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, обладающие одной или несколькими мутациями остатков, которые могут быть вовлечены в связывание Ζη2' протеазным доменом. Такие остатки включают, но не ограничиваются К161, Н216, Ό219, Е220, 8222 и Н257 по нумерации аминокислотной последовательности зрелого полипептида РУЛ, приведенной в 8ЕД ГО N0: 3 (соответствуют К24, Н76, Ό79, Е80, 882 и Н117, соответственно, по нумерации химотрипсина). В некоторых примерах один или более аминокислотных остатков Н216, Н257 и 8222 (соответствуют Н76, 882 и Н117 по нумерации химотрипсина) были модифицированы, например, путем замены или удаления аминокислот. Любой аминокислотный остаток может быть использован для замены эндогенного остатка в указанном положении. Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, в которых остаток гистидина в положении 216 заменен на остаток серина, аланина, лизина и аргинина. В другом примере серин в положении 222 заменен на остаток аланина или лизина или гистидин в положении 257 заменен на остаток аланина или серина. В дополнительном варианте лизин в положении 161 заменен на остаток серина, аланина и валина. Модификации также включают вставки амино2' кислот в положения, которые вовлечены в связывание Ζη , или вставки аминокислот рядом с указанными положениями. Такие вставки могут нарушить сайт связывания Ζη2', в результате чего модифицированные полипептиды РУЛ будут обладать сниженным связыванием с Ζη2'.
Также могут быть созданы комбинации мутаций, в которых аминокислотные замены затронули более чем один из вышеуказанных остатков в полипептиде РУЛ. Среди таких комбинаций мутаций присутствуют комбинации, включающие две или более мутации остатков из К161, Н216, Ό219, Е220, 8222 и Н257 (соответствующих остаткам К24, Н76, Ό79, Е80, 882 и Н117, соответственно, по нумерации химотрипсина). Например, модифицированные полипептиды РУЛ могут обладать аминокислотными заменами по 2, 3, 4, 5 или 6 указанным позициям. Следовательно, модифицированный полипептид может включать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 мутаций, которые могут привести к снижению способности модифицированного полипептида РУЛ связывать Ζη2+. Например, полипептид РУЛ может быть модифицирован заменой аминокислоты серина в положении 222 на лизин и заменой гистидина в положении 257 на аланин.
Модифицированные полипептиды РУЛ с повышенной устойчивостью к ингибиторному эффекту Ζη2+ могут проявлять устойчивость, повышенную по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с устойчивостью немодифицированного полипептида РУЛ или полипептида РУЛ дикого типа ίη νίνο или ίη νίίτο. Уменьшение связывания с Ζη2' и, следовательно, повышенная устойчивость к ингибиторному эффекту Ζη2' также может проявляться такими модифицированными полипептидами РУН, как повышенная коагулянтная активность в присутствии Ζη2+. Коагулянтная активность модифицированных полипептидов РУЛ может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного
- 55 020818 полипептида РУП или полипептида РУП дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓο.
В табл. 8 приведены не ограничивающие примеры аминокислотных замен в указанных остатках согласно положениям в последовательности аминокислот зрелого полипептида РУП, приведенной в 8Е^ ГО Ν0: 3. Среди них приведены примеры комбинаций мутаций. Как уже отмечалось, такие полипептиды РУП проявляют пониженную способность связывать Ζη2+ и, следовательно, проявляют повышенную устойчивость к ингибиторному эффекту Ζη2+. Таким образом, модифицированные полипептиды РУП могут проявлять увеличенную коагулянтную активность. При описании таких мутаций первая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует аминокислоте, которая заменяется, ее номер соответствует положению аминокислоты в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8Е^ ГО Ν0: 3, а вторая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует выбранной аминокислоте, которая заменяет первую аминокислоту в этом положении. Аминокислотные позиции для мутирования также обозначаются по нумерации химотрипсина. В табл. 8 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8Е^ ГО Ν0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУП.
Таблица 8
4. Измененное гликозилирование.
Свойства и активности белка могут быть изменены путем изменения степени, уровня и/или типа гликозилирования. Например, гликозилирование может увеличить время полураспада полипептидов в сыворотке за счет повышения стабильности, растворимости и снижения иммуногенности белков. Гликозилирование может увеличить стабильность белков за счет уменьшения протеолиза белка и может защитить белок от термической деструкции, воздействия денатурирующих агентов, ущерба от свободных радикалов кислорода, а также изменения рН. Гликозилирование также может позволить целевому белку избежать клиренса, который может включать связывание с другими белками, в том числе рецепторами клеточной поверхности. Углеводные фрагменты, которые содержат остатки сиаловой кислоты, могут повлиять на растворимость белка. Остатки сиаловой кислоты высоко гидрофильны и могут защитить гидрофобные остатки целевого белка. Это уменьшает агрегацию и осаждение целевого белка. Снижение агрегации также помогает предотвратить иммунный ответ против целевого белка. Кроме того, углеводы могут экранировать иммуногенные последовательности от иммунной системы. Объем пространства, занимаемый углеводным фрагментом, может уменьшить площадь поверхности, доступной для иммунной системы. Эти свойства ведут к уменьшению иммуногенности целевого белка.
Сайты гликозилирования представляют собой место прикрепления моносахаридов и олигосахаридов к полипептиду через гликозидную связь так, что, если полипептид производится в эукариотической клетке, способной к гликозилированию, он гликозилируется. Два основных типа гликозилирования представляют собой Ν-гликозилирование, где сахара крепятся через амидный азот остатка аспарагина, и О-гликозилирование, где сахара крепятся через гидроксильные группы остатков серина, треонина, гидроксилизина или гидроксипролина. Другие, минорные формы гликозилирования включают δ-связь с цистеином и С-связь с триптофаном. Ν-гликозилирование происходит по остатку аспарагина в консенсус- 56 020818 ной последовательности ^51-1^1:-1^^04/6+-5. где Хаа не представляет собой пролин. Для Огликозилирования не существует известных мотивов, хотя О-гликозилирование более вероятно для последовательности с высоким содержанием остатков серина, треонина и пролина. Наличие потенциального сайта гликозилирования, однако, не гарантирует, что сайт будет гликозилирован во время посттрансляционной модификации в ЭР. Кроме того, уровень гликозилирования в данном сайте может варьировать, и один сайт может иметь много различных структур гликана. В РУН существуют четыре естественных сайта гликозилирования, два сайта ^гликозилирования в N145 и N322 и два сайта Огликозилирования в З52 и З60 согласно положениям аминокислотной последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 3.
Примеры модификаций для изменения гликозилирования.
В настоящем документе предусмотрены полипептиды РУН, которые были модифицированы путем изменения уровня и/или типа гликозилирования по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Гликозилирование может быть увеличено или уменьшено по сравнению с немодифицированным РУН. В некоторых случаях уровень гликозилирования увеличивается, в результате чего образуется гипергликозилированный полипептид РУН. Это может быть достигнуто, например, введением по меньшей мере одного ненативного сайта гликозилирования, не присутствующего в немодифицированном полипептиде, к которому присоединен углеводный фрагмент. Гипергликозилированный полипептид РУН также может быть получен присоединением углеводного фрагмента по меньшей мере к одному нативному сайту гликозилирования, который присутствует в немодифицированном полипептиде РУН, но не гликозилирован. В других примерах уровень гликозилирования в модифицированном полипептиде РУН уменьшается по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Это может быть достигнуто путем устранения одного или более нативных сайтов гликозилирования, например, путем замены или удаления аминокислот. Один или несколько аминокислотных остатков в положениях 52, 60, 145 и 322 по нумерации последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 3, могут быть удалены или могут быть заменены на аминокислоты, которые не могут быть связаны с углеводным фрагментом. Например, остаток серина в положении 52 и/или 60 может быть заменен на остаток аланина, устранив тем самым один или оба нативных сайта О-гликозилирования. Таким образом, сайты гликозилирования в полипептиде РУН могут быть введены, изменены, устранены или перемещены.
Полипептид РУН может быть модифицирован по одному или нескольким положениям для изменения гликозилирования полипептида. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, обладающие измененным гликозилированием по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, могут не иметь гликозилирования, могут иметь О-гликозилирование, N гликозилирование и/или их сочетание. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН включают 1, 2, 3, 4, 5 или больше углеводных фрагментов, каждый из которых связан со своим сайтом гликозилирования.
Сайты гликозилирования могут быть нативными сайтами гликозилирования и/или ненативными сайтами гликозилирования. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РУН гликозилированы более чем по одному ненативному сайту гликозилирования. Например, модифицированные полипептиды РУН могут быть модифицированы введением 1, 2, 3, 4, 5 или более ненативных сайтов гликозилирования. Ненативные сайты гликозилирования могут быть введены с помощью аминокислотных замен.
Сайты О-гликозилирования могут быть созданы, например, путем замены нативной аминокислоты на остатки серина или треонина. Сайты ^гликозилирования могут быть созданы введением мотива АкпXаа-Зе^/ТЬ^/Сук, где Хаа не представляет собой пролин. Создание указанной консенсусной последовательности аминокислот модификацией аминокислот может включать замену нативного аминокислотного остатка на аспарагин, замену нативного аминокислотного остатка на серин, треонин и цистеин, или замену нативного аминокислотного остатка на аспарагин и замену нативного аминокислотного остатка на серии, треонин и цистеин. Например, для создания нового мотива АкпКаа-Зет в домене Е0Р1 и нового сайта ^гликозилирования в положении 109 лизин в положении 109 (по нумерации последовательности зрелого РУН, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 3) может быть заменен на аспарагин. В еще одном примере для создания нового мотива АкпКаа-Зет и нового сайта ^гликозилирования в положении 292 аланин в положении 292 заменяют на аспарагин и аланин в положении 294 заменяют на серии. В другом примере для создания нового мотива АкпКаа-Зет в аминокислотных позициях 173-175 (по нумерации последовательности зрелого РУН, приведенной в ЗЕЦ ГО N0: 3) и нового сайта ^гликозилирования в положении 173 аланин в положении 175 заменяют на серин. Ненативный сайт гликозилирования может быть создан в любом районе полипептида РУН. Например, один или несколько сайтов гликозилирования могут быть введены в домен Е0Р1, который соответствует аминокислотным позициям 46-82 зрелого полипептида РУН в ЗЕЦ ГО N0: 3. В других примерах ненативный сайт гликозилирования вводят в протеазный домен полипептида РУН или в позиции, которые связываются с протеазным доменом после сворачивания белка.
Нативные сайты гликозилирования могут быть модифицированы для предотвращения гликозилирования или повышения или уменьшения гликозилирования, в то время как другие позиции в полипептиде РУН могут быть изменены для введения ненативного сайта гликозилирования. В некоторых примерах может быть изменен состав углеводов полипептида РУН. Например, могут быть изменены номер
- 57 020818 положения, прочность связи, структура и состав углеводных связей (т.е. структура углевода на основе природы гликозидных связей или ветвей углевода) углеводных фрагментов, добавленных к полипептидну РУН.
Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУН с измененным гликозилированием сохраняют по меньшей мере одну активность РVII. Как правило, модифицированные полипептиды РVII с измененным гликозилированием, предусмотренные в настоящем документе, обладают повышенной коагулянтной активностью по сравнению с немодифицированным РVII. В некоторых примерах уровень гликозилирования полипептида РVII увеличен. Уровень гликозилирования может быть увеличен по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с уровнем гликозилирования немодифицированного полипептида РVII или полипептида РVII дикого типа. В других примерах уровень гликозилирования уменьшен. Уровень гликозилирования может быть уменьшен по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с уровнем гликозилирования немодифицированного полипептида РVII или полипептида РVII дикого типа. Измененный уровень гликозилирования или измененный тип гликозилирования модифицированного полипептида РVII по сравнению с немодифицированным полипептидом РVII может проявляться как повышенная коагулянтная активность. Коагулянтная активность модифицированного полипептида РVII с измененным гликозилированием может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РVII или полипептида РVII дикого типа ш νί\Ό или ш уНго.
В табл. 9 приведены не ограничивающие примеры аминокислотных замен (согласно положениям аминокислот последовательности зрелого полипептида РУII, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3), введенных в модифицированный полипептид РVII для изменения уровня гликозилирования путем добавления или устранения сайтов гликозилирования. Аминокислотные замены, приведенные в качестве примеров, могут привести к созданию ненативного сайта гликозилирования или устранению нативного сайта гликозилирования. В некоторых случаях для создания нового сайта гликозилирования необходимы две аминокислотные замены. Кроме того, в табл. 9 приведены примеры комбинаций мутаций, которые приводят более чем к одному новому ненативному сайту гликозилирования в полипептиде РVII. Как отмечалось выше, изменение уровня гликозилирования может привести, например, к увеличению периода полураспада. Таким образом, модифицированные полипептиды РVII могут обладать увеличенной коагулянтной активностью. При описании таких мутаций первая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует аминокислоте, которая заменяется, ее номер соответствует положению аминокислоты в последовательности зрелого полипептида РVII, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3, а вторая аминокислота (однобуквенная аббревиатура) соответствует выбранной аминокислоте, которая заменяет первую аминокислоту в этом положении. Аминокислотные позиции для мутирования также обозначаются по нумерации химотрипсина, где это необходимо. В случае, если положение модифицируемой аминокислоты не имеет соответствующего номера по химотрипсину (т.е. положение не относится к положениям с 153 по 406 последовательности зрелого полипептида РVII, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3, и не указано в табл. 1 выше), положение обозначается в скобках с использованием нумерации зрелого РVII. Например, А5 Ш не имеет соответствующего номера по химотрипсину и приводится в виде А[51|Х в контексте нумерации химотрипсина. В табл. 9 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8ЕЦ ГО N0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУII. Также в табл. 9 приведены все новые ненативные сайты гликозилирования (сайт гликозилирования), полученные в результате модификаций (модификации).
- 58 020818
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина Ненативный сайт гликозилиро -вания (нумерация зрелого РУН) Ненативный сайт гликозили- рования (нумерация химотрип- сина) 8ЕЦ ГО ΝΟ
352А 3[52]А ничего ничего 206
860А 3[60]А ничего ничего 207
Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968 Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2478 N394 N245 208
К2028 К.623 N200 Ν60ά 209
Α292Ν/Α2943 Α150Ν/Α1523 N292 N150 210
Ο318Ν Ο1701Ν N318 Ν170Γ 211
А1758 А393 N173 N37 212
Κ109Ν Κ[109]Ν N109 N[109] 213
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]8 N122 N[122] 214
Α51Ν Α[51]Ν N51 N[51] 215
Τ130Ν/Ε1328 Τ[130]Ν/Ε[132]8 N130 N[130] 216
Α122Ν/Ο1248/ Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3963 Α[122]Ν/Ο[124]8/ Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2478 N122 и N394 N[122] и N245 217
Α122Ν/Ο1243/ Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3968/ Ο318Ν Α[122]Ν/Ο[124]δ/ Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2478/ Ο1701Ν N122, N394 и N318 N[122], N245 и N318 218
852А/360А 8[52] Α/δ[60] Α ничего ничего 219
852Ν/Ρ548 8[52]Ν/Ρ[54]8 N52 N[52] 220
8119Ν/Π218 8[119]И/Ь[121]8 N119 N[119] 221
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α N128 N[128] 222
(366Ν/Υ683 Ο[66]Ν/Υ[68]3 N66 N[66] 223
352Ν/Ρ543/Α122Ν/Ο1 248/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ39 68 3[52]Ν/Ρ[54]8/Α[122] Ν/Ο[124]δ/Ε245Ν/Ρ24 6Α/Κ2478 N52, N122 и N397 N[52], N[122] и N245 224
Κ109Ν/Α292Ν/Α2948 Κ[109]Ν/Α150Ν/Α152 8 N109 и N292 N[109] и N150 225
Κ109Ν/Α1755 Κ[109]Ν/Α393 N109 и N173 N[109] и N37 226
8119К/Ы218/А1758 8[119]Н/Ь[121]8/А398 Ν119Η N173 N[119] и N37 271
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1755 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39 Α N128 и N173 N[128] и N37 272
Α122Ν/Ο1248/Α1758 Α[122]Ν/Ο[124]8/Α39 8 N122 и N173 N[122] и N37 273
Таблица 9
5. Увеличение связывания сывороточного альбумина и/или интегрина тромбоцитов аПъвз·
Рекомбинантный немодифицированный РУН обладает периодом полураспада в сыворотке человека всего 1,5-3 ч. Увеличение периода полураспада полипептида РУН в сыворотке может уменьшить количество и частоту введения, необходимые для терапевтического эффекта. Для увеличения периода полураспада в сыворотке могут быть использованы несколько стратегий, включая, но не ограничиваясь увеличением гликозилирования, увеличением устойчивости к протеазам, пегилированием и конъюгированием или слиянием с более крупными белками, такими как сывороточный альбумин и Рс-фрагмент Такие изменения могут привести, например, к снижению деградации полипептида РУН протеазами сыворотки, снижению почечного клиренса, снижению печеночного клиренса и снижению нейтрализации или клиренса иммунной системой. Другая стратегия, которая может быть использована для увеличения периода полураспада полипептида РУН в сыворотке, включает перенос связывающей последовательности в немодифицированный полипептид РУН для создания новых или улучшенных белок-белковых взаимодействий, которые не наблюдаются в немодифицированном полипептиде РУН.
Связывающие последовательности, которые могут быть вставлены в немодифицированный полипептид РУН, могут содержать приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 или более аминокислотных остатков и обеспечивать взаимодействие с другими белками. Связывающие последовательности могут соответствовать связывающим последовательностям, естественным образом присутствующим в нативном белке, или связывающие последовательности могут представлять собой синтетические связывающие последовательности с малой корреляцией или отсутствием корреляции последовательно- 59 020818 сти со связывающей последовательностью, естественным образом присутствующей в нативном белке. Связывающие последовательности, использованные здесь для модификации полипептидов ΡΥΙΙ, специфически взаимодействуют с сайтом связывания на другом белке с образованием нековалентных белокбелковых взаимодействий. В некоторых примерах белок, к которому специфична связывающая последовательность, представляет собой сывороточный белок, такой как, например, сывороточный альбумин. Такие последовательности хорошо известны в уровне техники (см., например, И8 20030069395, И8 20040009534 и И8 20070202045). В других примерах распознаваемый связывающей последовательностью белок представляет собой рецептор клеточной поверхности или лиганд, такой как, например, интегрин тромбоцитов αΙ№β3 (8ιηίί1ι и др., (1995) I. Вю1. СЬет. 270:30486-30490). Аффинность связывания модифицированного полипептида ΡΥΙΙ с белком сыворотки или рецептором клеточной поверхности, как правило, характеризуется константой диссоциации, Κά, составляющей 1 мкМ, 100, 10, 1 нМ, 100, 10, 1 пМ или меньше. Связывание модифицированного полипептида ΡΥΙΙ с белком сыворотки или рецептором клеточной поверхности через связывающую последовательность может уменьшить, например, почечный клиренс или печеночный клиренс модифицированного полипептида ΡΥΙΙ по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ. В некоторых примерах связывание модифицированного полипептида ΡΥΙΙ с рецептором клеточной поверхности также может направлять модифицированный полипептид ΡΥΙΙ к нужной клетке, типу ткани или району в организме, тем самым концентрируя полипептид ΡΥΙΙ в определенном месте, например в месте образования сгустка крови. Таким образом, модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие вставленную связывающую последовательность, могут обладать увеличенным периодом полураспада по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ.
а. Примеры полипептидов ΡΥΙΙ со связывающей сывороточный альбумин последовательностью.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие связывающую сывороточный альбумин последовательность. Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ могут связывать сывороточный альбумин ίη νίΙΐΌ или ίη νί\Ό, в результате чего увеличивается период полураспада белка. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ с увеличенным периодом полураспада по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ. При оценке в соответствующем анализе ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό, например при введении ΡΥΙΙ субъекту в качестве прокоагулянта, модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ могут проявлять увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡΥΙΙ.
Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать связывающую сывороточный альбумин последовательность. Связывающая сывороточный альбумин последовательность может быть вставлена в немодифицированный полипептид ΡΥΙΙ или может быть связана с С-концом или ^концом полипептида ΡΥΙΙ. Например, связывающая сывороточный альбумин последовательность может начинаться от остатка пролина в положении 406 на С-конце полипептида ΡΥΙΙ (согласно последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3). Если связывающая последовательность вставлена в полипептид ΡΥΙΙ, вставка осуществляется в такое положение, что полученный модифицированный ΡΥΙΙ полипептид сохраняет по меньшей мере один вид активности немодифицированного полипептида ΡΥΙΙ. Связывающая последовательность может быть вставлена в полипептид ΡΥΙΙ без удаления каких-либо аминокислотных остатков в полипептиде ΡΥΙΙ или может заменить один или более аминокислотных остатков в полипептиде ΡΥΙΙ. В некоторых примерах для создания модифицированного полипептида ΡΥΙΙ связывающая сывороточный альбумин последовательность заменяет аминокислотные остатки с 8103 до 8111 (согласно последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3). В других примерах связывающая сывороточный альбумин последовательность заменяет аминокислотные остатки с Н115 до 8126 или с Т128 до Р134 (согласно последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3). Примеры связывающих сывороточный альбумин последовательностей приведены в 8ЕО ГО N0: 206-212.
В табл. 10 приведены не ограничивающие примеры модификаций, которые могут быть введены, чтобы вставить в полипептид ΡΥΙΙ связывающую сывороточный альбумин последовательность. Как отмечалось выше, введение связывающей сывороточный альбумин последовательности может увеличить период полураспада полипептида ΡΥΙΙ. Таким образом, модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ могут обладать увеличенной коагулянтной активностью. Аминокислотные остатки, по которым вставляют связывающую сывороточный альбумин последовательность в полипептид ΡΥΙΙ, и последовательность связывающей последовательности представлены в табл. 10. Например, 81038111 удаление/вставка ^К^МЕ^IС^РΡ\VСС^\VЕ^^Ρ указывает, что аминокислотные остатки с 8103 до 8111 по нумерации немодифицированного полноразмерного полипептида ΡΥΙΙ (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3) были удалены и заменены связывающей сывороточный альбумин последовательностью аминокислот ^К^МЕ^IС^РΡ\VСС^\VЕ^^Ρ (8Е0 ГО N0: 206). Указание только одной аминокислоты, такой как Р406, означает, что связывающая сывороточный альбумин последовательность вставлена после Р406 и что из полипептида ΡΥΙΙ не удаляли аминокислотные остатки. Аминокислоты для мутирования также обозначаются по нумерации химотрипсина, где это необходимо. Если модифицированные аминокислотные положения не имеют соответствующего номера по химотрипсину (т.е. положение не соответствует положениям с 153 до 406 последовательности зрелого
- 60 020818 полипептида РУН, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3, и не указано в табл. 1 выше), положение обозначается в скобках с использованием нумерации зрелого РУЛ. Например, 8103 не имеет соответствующего номера по химотрипсину и приводится в виде 8[103] в контексте нумерации химотрипсина. В табл. 10 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8Е^ ГО N0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУН.
_ _ _ _ _ Таблица 10
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина ЗЕ<2 го ΝΟ
81038111 удаление/вставкаСЩЬМЕВ1 СЕРКАУОСЬХУЕООР 8 [103]8 [111 ]удаление/вставкарКЬМ ЕОГСЕРКХУССЕХУЕООР 227
Η1158126удаление/вставкарКЬМЕО 1СЬРК\УСгСЕ\УЕООР Η [ 115 ] 3 [ 126] удал ение/вставка(2КЕМ ЕОГСЬРЮУСЮЕАУЕООР 228
ΤΙ 28Р134удаление/вставка()КЕМЕО1 СЕРКЛУ ОСЬХУЕООР Т[ 128]Р[ 134]удаление/вставка<2КЕМ ЕОГСЕРГСУОСЕ\УЕООР 229
810381111удаление/вставка1ЕО1СЬР КАУОСЬХУЕ 8 [ 103]3[ 111]удаление/вставка1ЕО1СЬ РЮУОСЬАУЕ 230
Η115 8126удаление/вставка1ЕО1СЬРК ХУОСЬАУЕ Η [ 115 ] 8 [ 12 6] удал ение/вставка1ЕОГС ЬРЮУОСЬ^Е 231
Т128Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРК \УОСЬ\УЕ Т[128]Р[134] удаление/вставка1ЕО 1СЬ РК\УОСЬ\УЕ 232
81038111 удаление/вставкаОГСЬРЮУ ОСЬХУЕО 3[103]8[11Рудаление/вставкаОГСЬР К\УОСЬ\УЕО 233
Н1153126удаление/вставкаО1СЕРЮУ ОСЬАУЕО Н[ 115] 8 [ 126] удаление/вставкаОГСЬР К\УОСЬ\УЕР 234
Т128Р134удаление/вставкаО1СЬРЮУ ОСЬАУЕО Т[ 12 8] Р [ 134]удаление/вставкаО1СЕР ЮУОСЬХУЕО 235
Р406вставка1ЕО1СЬРК\УОСЕ\У Р257вставка1ЕО1СЬРК\УОСЕ\У 236
Р406вставкаООС81ЕО1СЕРЮУОСЕ \У Р257вставкаСГСгО31ЕО1СЕРК\У(ГСЕ \У 237
Р406вставкаО1СЕРК\УОСЬАУЕО Р257вставкаО1СЕРЮУОСЕ\УЕО 238
Р406вставка000801СЕРЮУССЕ\УЕ ϋ Р257вставкаООО8О1СЕРЮУОСЕУУЕ ϋ 239
Модифицированные полипептиды РУ11, содержащие связывающую сывороточный альбумин последовательность, могут обладать способностью связывать сывороточный альбумин, повышенной по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со связыванием сывороточного альбумина немодифицированным полипептидом РУ11 или полипептидом РУ11 дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓΟ. Модифицированные полипептиды РУ11, которые могут связывать сывороточный альбумин, могут обладать увеличенным периодом полураспада в сыворотке по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с периодом полураспада в сыворотке немодифицированного полипептида РУ11 или полипептида РУ11 дикого типа ίη νίνο или ίη νότο. Увеличенное связывание сывороточного альбумина и/или увеличенный период полураспада в сыворотке таких модифицированных полипептидов РУН также может проявляться как повышенная коагулянтная активность, повышенная продолжительность коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс. Коагулянтная активность модифицированных полипептидов РУ11 может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУ11 дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΐΌ.
Ь. Примеры полипептидов РУ11 со связывающей интегрин тромбоцитов аПьвз последовательностью.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие связывающую интегрин тромбоцитов а11Ьвз последовательность. Интегрин тромбоцитов а11Ьвз (также называемый гликопротеином (СР) ПЬ/Ша) является наиболее распространенным рецептором адгезии тромбоцитов. Он представляет собой кальцийзависимый гетеродимер, который служит рецептором для белков, включающих, но не ограничивающихся, фибриноген, фибронектин, витронектин, фактор Виллебранда и тромбоспондин. Связывание с белком-лигандом может активировать а11Ьвз и индуцировать передачу
- 61 020818 сигнала в цитоплазму через внутриклеточный домен белка.
Модифицированные полипептиды РУН, содержащие связывающую интегрин тромбоцитов а11Ьв3 последовательность, следовательно, могут связываться с тромбоцитами. Модифицированные полипептиды РУН могут связывать интегрин тромбоцитов αΙΙ6β3 (в активированной и/или не активированной форме) ш уйго или ш νί\Ό, что приводит к увеличению периода полураспада. Те варианты РУНа, которые избирательно связывают активированный αΙΙ5β3, могут быть, следовательно, нацелены на активированные тромбоциты и, таким образом, сконцентрированы в месте образования сгустка крови. При избирательном нацеливании РУНа на образующиеся сгустки крови можно было бы ожидать улучшения терапевтической полезности варианта РУНа путем повышения эффективности и терапевтического индекса. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН с увеличенным периодом полураспада по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, и варианты полипептида, которые, кроме того, селективно связывают активированные тромбоциты. При оценке в соответствующих анализах ш уйго или ш νί\Ό, например, при введении субъекту в качестве прокоагулянта, модифицированные полипептиды РУН могут проявлять увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, содержат связывающую интегрин тромбоцитов апьв3 последовательность. Связывающая интегрин тромбоцитов апьв3 последовательность может быть вставлена в немодифицированный полипептид РУН или может быть связана с С-концом или ^концом полипептида РУН. Например, связывающая α,,μβ 3 последовательность может начинаться от остатка пролина в положении 406 на С-конце полипептида РУН (согласно последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3). Если связывающая последовательность вставлена в полипептид РУН, вставка осуществляется в такое положение, что полученный модифицированный РУН полипептид сохраняет, по меньшей мере, один вид активности немодифицированного полипептида РУН. Связывающая последовательность может быть вставлена в полипептид РУН без удаления каких-либо аминокислотных остатков в полипептиде РУН или может заменить один или более аминокислотных остатков в полипептиде РУН. В некоторых примерах для создания модифицированного полипептида РУН связывающая интегрин тромбоцитов αΙΙ5β3 последовательность заменяет аминокислотные остатки с 8103 до 8111 (согласно последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3). В других примерах связывающая интегрин тромбоцитов αΙΙ5β3 последовательность заменяет аминокислотные остатки с Н115 до 8126 или с Т128 до Р134 (согласно последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3). Примеры связывающих интегрин тромбоцитов αΠ5β3 последовательностей приведены в 8Е0 ГО N0: 213-215.
В табл. 11 приведены не ограничивающие примеры модификаций, которые могут быть введены, чтобы вставить в полипептид РУН связывающую интегрин тромбоцитов απ1,β3 последовательность. Как отмечалось выше, введение связывающей интегрин тромбоцитов αΠ5β3 последовательности может увеличить период полураспада полипептида РУН в сыворотке и/или нацелить белок на образующийся сгусток крови. Таким образом, модифицированные полипептиды РУН могут проявлять увеличенную коагулянтную активность. Аминокислотные остатки, по которым вставляют связывающую интегрин тромбоцитов αΠ5β3 последовательность в полипептид РУН, и последовательность связывающей последовательности представлены в табл. 11.
Например, Η1158126удаление/вставка8Р0К0^IКNУ указывает, что аминокислотные остатки с Н115 до 8126 по нумерации немодифицированного полноразмерного полипептида РУН (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3) были удалены и заменены связывающей интегрин тромбоцитов αΠ5β3 последовательностью аминокислот 8Р0К0^IКNУ (8Е0 ГО N0: 213). Указание только одной аминокислоты, такой как Р406, означает, что связывающая интегрин тромбоцитов αΠ5β3 последовательность вставлена после Р406 и что из полипептида РУН не удаляли аминокислотные остатки. Аминокислоты для мутирования также обозначаются по нумерации химотрипсина, где это необходимо. Если модифицированные аминокислотные положения не имеют соответствующего номера по химотрипсину (т.е. положение не соответствует положениям с 153 до 406 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3, и не указано в табл. 1 выше), положение обозначается в скобках с использованием нумерации зрелого РУН. Например, 8103 не имеет соответствующего номера по химотрипсину и приводится в виде 8[103] в контексте нумерации химотрипсина. В табл. 11 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8Е0 ГО N0), в котором приведены примеры аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов РУН.
- 62 020818
Таблица 11
Модификации по нумерации зрелого РУИ
Модификации по нумерации химотрипсина
8ЕО Ιϋ ΝΟ
81038111 удаление/вставка8РОК.ОО1 ΚΝΥ [103] 8[111]удаление/вставкаЗРОК.О ϋΙΚΝΥ
240
Н1158126удаление/вставка8РОКСЮ1 ΚΝΥ
Η [ 115 ] 8 [ 126] удал ение/вставкаЗРОК. ΟϋΙΚΝΥ
241
Τ128Р134удаление/вставка8РОК.ОИ1 ΚΝΥ
Т[128] Ρ [ 134]удаление/вставка8РОК.О ϋΙΚΝΥ
242
Р406вставкаС8РОК.ОО1Ю4УС
Р257вставкаС8РОКОО1Ю4УС
243
Р406вставкаООО5СЗРОКОО1ККУС
Р257вставкаОСЮЗСЗРОКОО11ШУС
244
Модифицированные полипептиды ТУП, содержащие связывающую интегрин тромбоцитов απ,β3 последовательность, могут обладать повышенным связыванием с интегрином тромбоцитов απ,β3 по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со связыванием с интегрином тромбоцитов απ,β3 ^модифицированного полипептида ТУП или полипептида ТУП дикого типа ίη νίνο. Модифицированные полипептиды ТУП, которые могут связываться с тромбоцитами через интегрин тромбоцитов απ,β3, могут обладать увеличенным периодом полураспада по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с периодом полураспада немодифицированного полипептида ТУИ или полипептида ТУИ дикого типа ίη νΐΐΐΌ, ίη νίνο или ех νίνο. Увеличение периода полураспада таких модифицированных полипептидов ТУИ также может проявляться как повышенная коагулянтная активность, увеличенная продолжительность коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс. Например, коагулянтная активность модифицированных полипептидов ТУИ может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида ТУИ или полипептида ТУИ дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓο.
6. Модификация введением гетерологичного домена С1а.
Взаимодействие остатков в γ-карбоксилированном домене С1а витамин К-зависимых белков плазмы, таких как ТУИ, ИХ, РХ, протромбин, белок С и белок δ, и отрицательно заряженных фосфолипидов на поверхности мембраны имеет важное значение для гемостаза. Домен С1а витамин К-зависимых белков плазмы обычно содержит около 45 аминокислот, из которых от 9 до 12 остатков глутаминовой кислоты посттрансляционно модифицированы витамин К-зависимым карбоксилированием с образованием γ-карбоксиглутамата (С1а). Аминокислоты домена С1а расположены сразу после аминокислот сигнального пептида и пропептидной последовательности белков и, следовательно, находятся на Ν-конце зрелых белков после процессинга и расщепления полипептидов-предшественников. Например, аминокислоты, образующие домен С1а в РУН, находятся в положениях 39-83 последовательности полипептидапредшественника, приведенной в 8Е0 ГО Ν0: 1, положениях 61-105 последовательности полипептидапредшественника, приведенной в 8Е0 ГО Ν0: 2, и положениях 1-45 последовательности зрелого полипептида, приведенной в 8Е0 ГО Ν0:3. Из них 10 остатков глутаминовой кислоты в положениях Е6, Е7, Е14, Е19, Е20, Е25, Е26, Е29 и Е35 последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8Е0 ГО Ν0: 3, модифицируются карбоксилированием с образования остатков γ-карбоксиглутамата (С1а). Изза относительно низкой аффинности к активированным тромбоцитам домен С1а из РУН является мишенью для модификации с целью усиления взаимодействия между модифицированным РУН и фосфолипидами мембраны и увеличения коагулянтной активности. Модификация может быть осуществлена путем замещения конкретных аминокислот, которые участвуют в этом взаимодействии (см., например, 8НаН и др., РNΑδ 95: 4429-4234, Нагееу и др., (2003) I. ΒίοΙ. СНет. 278:8363-8369). Кроме того, модификация может быть осуществлена заменой всего домена С1а на домен С1а другого витамин К-зависимого белка, т.е. заменой С1а. Этот тип модификации приводит к химерным белкам, таким как белок, который был получен в результате заменены домена С1а белка С доменом С1а из РУН (Селу и др., (1997) ТНготЬ Наетοзί 77:926-933). Как правило, такая модификация включает введение, например, путем вставки или замещения гетерологичного домена С1а или его достаточной для осуществления связывания фосфолипидов части в домен полипептида РУН с образованием химерного модифицированного полипептида РУН. Как правило, такой химерный полипептид РУН сохраняет хотя бы одну активность РУН. Связывание и/или аффинность С1а-модифицированного полипептида РУН к активированным тромбоцитам может быть увеличено по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению со связыванием и/или аффинностью немодифицированного полипептида РУН или полипептида РУН дикого типа ίη νίνο или ίη νίίΓο. Связывание и/или аффинность модифицированного полипептида РУН к активированным тромбоцитам также может проявляться как повышение коагулянтной активности. Коагулянтная активность С1а-модифицированных по- 63 020818 липептидов РУН может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РУП или полипептида РУН дикого типа ш νί\Ό или ш уйго. Домен 01а или его достаточная для осуществления связывания фосфолипидов часть, включающая, например, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% гетерологичного домена 01а или более, содержащаяся в любом полипептиде, может быть использована как источник гетерологичного домена 01а для вставки или замены домена в полипептиде РУН. Как правило, такие гетерологичные домены 01а проявляют аффинность к фосфолипидам, например фосфолипидам, присутствующим на поверхности активированных тромбоцитов. Как правило, выбранный гетерологичный домен 01а проявляет более высокую аффинность к фосфолипидам по сравнению с аффинностью домена 01а из РУН. Конкретный домен 01а или его достаточная часть, используемые в качестве гетерологичного домена для модификации полипептида РУН, могут быть выбраны рационально или эмпирически. Примеры других 01а-содержащих полипептидов включают, но не ограничиваются, ИХ, РХ, протромбин, белок С, белок 8, остеокальцин, белок 01а, Сго\\1й-аггек1-крес1Пс белок 6 (0ак6) и белок Ζ. Домены 01а этих белков приведены в качестве примеров в любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 83-91. Например, в полипептид РУП может быть введена непрерывная последовательность из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 или более аминокислот, или целый домен 01а, или гетерологичный домен 01а. Кроме того, введение домена 01а в полипептид РУП также может включать введение дополнительных аминокислот, не входящих в домен 01а гетерологичного полипептида, если дополнительные аминокислоты значительно не ослабляют способность введенного домена 01а связывать фосфолипиды.
В некоторых примерах домен 01а вводят в полипептид РУП, причем гетерологичный домен 01а вставляют в эндогенный домен 01а или в другой район или домен полипептида РУП, если модифицированный полипептид РУП сохраняет по меньшей мере одну активность РУП. В таких примерах нативный домен 01а полипептида РУЛ сохраняется в полипептиде, хотя в некоторых случаях последовательность аминокислот, которая составляет нативный домен 01а, прерывается. В других примерах гетерологичный домен 01а или его достаточную часть вставляют в непосредственной близости от нативного домена 01а на Оконце или С-конце так, что нативный домен 01а не прерывается. В дополнительном примере гетерологичный домен 01а или его достаточную часть вставляют в другой домен полипептида РУП. Кроме того, в настоящем документе предусмотрены полипептиды РУП с модифицированным доменом 01а, в которых весь эндогенный домен 01а из РУП или его непрерывную часть удаляют и заменяют на гетерологичный домен 01а или его достаточную для осуществления связывания фосфолипидов часть, если модифицированный полипептид РУП сохраняет хотя бы одну активность РУП. Такие модификации также называют заменой 01а. Примеры модификаций заменой 01а включают модификации, в которых эндогенный домен 01а заменен доменом 01а или частью домена 01а из РЕХ (8ЕЦ ГО N0: 83), РХ (8ЕЦ ГО N0: 84), тромбина (8ЕЦ ГО N0: 85), белка С (8ЕЦ ГО N0: 86) и белка 8 (8ЕЦ ГО N0: 87). Такие модификации называются замена 01а из РЕХ, замена 01а из РХ, замена 01а из тромбина, замена 01а из белка С и замена 01а из белка 8 соответственно. Такие модифицированные полипептиды РУП обладают повышенным связыванием с активированными тромбоцитами, в результате чего увеличивается их коагулянтная активность. Модификация замена 01а из РЕX включает удаление эндогенного домена 01а из РУП, т.е. удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3), и вставку 45 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ45 домена 01а из РIX, приведенного в 8Е0 ГО N0: 83. Модификация замена 01а из РХ включает удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3), и вставку 44 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с А1 до Υ44 домена 01а из РХ, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 84. Модификация замена 01а из тромбина включает удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3) и вставку 44 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ44 из 01а домена тромбина, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 85. Модификация замена 01а из белка С включает удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3) и вставку 44 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с А1 до Н44 из домена 01а белка С, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 86. Модификация замена 01а из белка 8 включает удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУП, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3) и вставку 44 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ44 из домена 01а белка 8, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 87. В некоторых примерах в гетерологичный домен 01а, который вводят в полипептид РУП, введены модификации, включая, но не ограничиваясь аминокислотными заменами или замещениями, вставками и/или удалениями. Такие модификации могут привести, например, к повышению связывания с активированными тромбоцитами из-за увеличения связывания с фосфолипидами по сравнению со связыванием, проявляемым гетерологичным доменом 01а дикого типа. Например, если 01а домен фактора !Х или его связывающую фосфолипиды часть вводят в
- 64 020818 полипептид РУН для создания модифицированного полипептида РУЛ, домен О1а фактора !Х может содержать аминокислотные мутации, которые приводят к увеличенному связыванию фосфолипидов по сравнению с О1а доменом фактора !Х дикого типа. Гетерологичный домен О1а, содержащийся в модифицированных полипептидах РУЛ по настоящему документу, может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более модификаций, таких как аминокислотные замены или замещения, вставки и/или удаления.
В некоторых примерах модификация (модификации) в гетерологичном домене О1а увеличивают связывание фосфолипидов. В других примерах гетерологичный домен О1а может содержать одну или несколько мутаций по сравнению с гетерологичным доменом О1а дикого типа, которые придают гетерологичному домену О1а РУП-подобные функции. Например, как отмечалось выше, остаток К36 домена О1а фактора РУЛ, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 119, может быть вовлечен во взаимодействие с РХ. Следовательно, гетерологичный домен О1а может содержать дополнительные модификации, такие как модификации, необходимые для поддержания функции аргинина в положении 36 последовательности зрелого полипептида РУЛ, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3, или любые другие модификации, необходимые для поддержания способности модифицированного полипептида РУПа активировать РХ (КиТ и др., (1999) ВюсЬет 38:1957-1966). Таким образом, в некоторых примерах в гетерологичный домен О1а может быть введена соответствующая мутация К36. Соответствующее положение может быть определено специалистом в данной области, например, путем выравнивания аминокислотных последовательностей. В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, содержащие модификацию заменой О1а, где домен вводят в полипептид РУЛ путем замены некоторой части или всего эндогенного домена РУЛ О1а, где гетерологичный домен О1а или его связывающая фосфолипиды часть содержит одну или несколько мутаций по сравнению с гетерологичным доменом О1а дикого типа. В одном примере модифицированные полипептиды РУЛ, предусмотренные в настоящем документе, содержат модификацию замена О1а из ИХ, которая, как описано выше, включает в себя удаление эндогенного домена О1а фактора РУЛ, т.е. удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют положениям в последовательности зрелого полипептида РУЛ, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3) и вставку 45 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ45 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83. Домен О1а белка ИХ, используемый для модификации заменой О1а, может содержать одну или несколько мутаций по сравнению с доменом О1а белка ИХ дикого типа, приведенным в 8ЕЦ ГО N0: 83, например, домен О1а может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или более мутаций, таких как замены, удаления или вставки аминокислот. Например, гетерологичный домен О1а белка ИХ в модифицированных заменой О1а из ИХ полипептидах РУЛ может содержать одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям М19, Е40, К43 и/или Ц44 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83.
В одном примере домен О1а белка ИХ содержит аминокислотную замену М19К. Такая модификация обозначается {замена О1а из НХМ19К}, т.е. метионин в положении, соответствующем положению 19 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83, заменен на лизин. В другом примере модифицированный гетерологичный домен О1а белка ИХ в модифицированном полипептиде РУЛ содержит аминокислотную замену Е40Л, что обозначается как {замена О1а из ИХ/Е40Л}, т.е. остаток глутаминовой кислоты в положении, соответствующем положению 40 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83, заменен на лейцин. Кроме того, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУЛ, содержащие замену К43Т (обозначается {замена О1а из ИХКИТ}), где лизин в положении, соответствующем положению 43 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83, заменен на изолейцин. В другом примере модифицированный гетерологичный домен О1а белка ИХ в модифицированном полипептиде РУЛ содержит аминокислотную замену 0448, обозначаемую {замена О1а из НХ/0448!· где глутамин в положении, соответствующем положению 44 в домене О1а белка ИХ, приведенном в 8ЕЦ ГО N0: 83, заменен на серин. В одном примере гетерологичный домен О1а белка ИХ содержит аминокислотные замены М19К/Е40Е/К43!/О448.
Модифицированные полипептиды РУЛ, содержащие гетерологичные домены О1а, такие как модифицированные гетерологичные домены О1а, могут обладать повышенной коагулянтной активностью при более низких дозах по сравнению с молекулой РУЛ дикого типа, такой как Хоуокеуеп®, что обусловлено увеличенным связыванием и/или аффинностью к активированным тромбоцитам. Коагулянтная активность О1а-модифицированных полипептидов РУЛ может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с коагулянтной активностью немодифицированного полипептида РУЛ или полипептида РУЛ дикого типа ш νί\Ό, ех νί\Ό или ш У11го.
7. Комбинации и дополнительные модификации.
Любая одна или нескольких модификаций, описанных выше, могут быть объединены с любой другой модификацией (модификациями), описанными выше или описанными в уровне техники. Таким образом, в дополнение к модификациям полипептидов РУЛ для повышения устойчивости к АТ-Ш, увеличения каталитической активности, повышения устойчивости к ингибированию Ζιι, изменения гликозилирования, улучшения фармакокинетических свойств, например увеличения периода полураспада, для увеличения связывания и/или аффинности к сывороточному альбумину, увеличения связывания и/или аф- 65 020818 финности к фосфолипидам или увеличения связывания и/или аффинности к интегрину тромбоцитов апьв3, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также включают модификации, которые приводят более чем к одному из отмеченных выше свойств. Как правило, такие дополнительные модификации включают модификации, которые приводят к повышению коагулянтной активности модифицированного полипептида и/или повышению стабильности полипептида. Соответственно, полученные модифицированные полипептиды РУН проявляют повышенную коагулянтную активность. Дополнительные модификации могут включать, например, любую аминокислотную замену, удаление или вставку, известную в уровне техники, обычно, такая замена увеличивает коагулянтную активность и/или стабильность полипептида РУН. Любые модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более дополнительных модификаций аминокислот, если полученный модифицированный полипептид РУН сохраняет активность РУН дикого типа или активность немодифицированного полипептида РУН. В одном примере в последовательность полипептида РУН могут быть введены такие дополнительные модификации, что ее взаимодействия с другими факторами, молекулами и белками изменяются. Например, аминокислотные остатки, которые участвуют во взаимодействии с ингибитором пути тканевого фактора (ТРΡI) можно заменить такими остатками, что аффинность и/или связывание модифицированного полипептида РУН с ТФ уменьшится. Другие модификации включают, но не ограничиваются, модификациями аминокислот, которые участвуют во взаимодействии с фактором Х, фактором РХ, тканевым фактором (ТФ) и фосфолипидами.
В некоторых примерах, модификации, введенные в последовательность полипептида РУН, включают вставки аминокислот, которые образуют связывающие последовательности, такие как, например, связывающую сывороточный альбумин последовательность или связывающую гликопротеин НЬ-Ша последовательность.
В полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также можно ввести дополнительные модификации, которые изменяют конформацию или фолдинг полипептида. К указанным модификациям относится, например, замена одной или нескольких аминокислот на цистеин, что приводит к образованию новой дисульфидной связи, или к ним относятся модификации, которые стабилизируют конформацию α-спирали, тем самым придавая повышенную активность модифицированному полипептиду РУН. Дополнительные модификации также могут быть введены для изменения посттрансляционных модификаций полипептида РУН. Например, полипептид может быть модифицирован введением дополнительных сайтов гликозилирования, что приводит к модифицированному полипептиду РУН с увеличенным гликозилированием по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Также в полипептид могут быть введены модификации, например, введением аминокислотных остатков, которые могут быть впоследствии связаны с химическим фрагментом, который, например, увеличивает стабильность модифицированного полипептида РУН.
Стабильность полипептидов РУН также может быть изменена модификацией потенциальных протеолитических сайтов, что увеличивает устойчивость модифицированных полипептидов РУН к протеазам.
Кроме того, для увеличения связывания и/или аффинности модифицированных полипептидов РУН к фосфолипидам мембран в эндогенный домен О1а могут быть введены аминокислотные замены, удаления или вставки. Такие модификации могут включать одну аминокислотную замену, удаление и/или вставку или могут включать замену, удаление или вставку нескольких аминокислот. Например, эндогенный домен 01а или его часть можно заменить на гетерологичный домен 01а или часть гетерологичного домена 01а. В других примерах модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут включать делеции или замены в эндогенном домене 01а в положениях, которые в нормальных условиях γ-карбоксилируются (υδ 20070037746).
В следующих разделах описаны не ограничивающие примеры модификаций, описанных в уровне техники, которые повышают стабильность и/или коагулянтную активность полипептида РУН. Как уже говорилось выше, такие модификации также могут быть дополнительно включены в любой предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РУН. Аминокислотные позиции, приведенные ниже, соответствуют последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в δΕΟ ГО NΟ: 3. Соответствующие мутации могут быть введены и в другие полипептиды РУН, такие как аллельные, видовые варианты или варианты сплайсинга зрелого полипептида РУН, приведенного в δΕΟ ГО NΟ: 3.
а. Модификации, повышающие устойчивость к ТРΡI.
В одном примере в модифицированный полипептид РУН, который содержит модификацию в положении 286 по нумерации зрелого РУН, могут быть введены дополнительные модификации, которые приводят к повышенной устойчивости к ТРΡI. Такая устойчивость к ТРИ может быть достигнута, например, в результате мутирования одного или нескольких остатков в РУН, вовлеченных во взаимодействие и связывание ТРИ, что уменьшит или предотвратит такое связывание, что приведет к модифицированным полипептидам РУН, устойчивым к естественному ингибиторному эффекту ТРΡI по отношению к инициации коагуляции. Например, модификации могут быть введены в аминокислотные остатки, вовлечен- 66 020818 ные в контакт РУП/ТРРф или в остатки, находящиеся в непосредственной близости от поверхности контакта.
Примеры дополнительных модификаций, которые могут быть введены в предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУП для повышения устойчивости к ТРРф включают, но не ограничиваются, модификации, описанные в \0 2004/083361, описанные NеиеηδсЬ\γаηύе^ и др., (1995) ВюсЬепизПу 34: 8701-8707, СЬип§ и др., (1999) ВюсЬепизПу 38: 10940-10948, ЕЫиаеу и др., (2001) ТЬготЪ. НаетозЬ 85:458-463 и описанные в близкой заявке США 12/082662. Не ограничивающие примеры описанных в уровне техники аминокислотных модификаций, которые могут привести к повышенной устойчивости модифицированного полипептида РУП к ТРРф включают одну или более модификаций из 0176, Ό196Κ, Ό196Κ, Ό196Α, Ό196Υ, П196Р, Ό196\, Ό196Ε, Ό196Ι, Κ197Υ, К197А, К197Е, Κ197Ό, К197Ь, К197М, Μ97Ι, К197У, К197Р, К197\, К199А К199П, К199Е, О237\, О237Т, Ο237Ι, О237У, Т239А, Κ290Α, К290Е, Κ290Ό, Κ290Ν, К290О, К290К, К290М, К290У, К341Е, К341К, К341О, К34Ш, К341М, К34ГО, О237Т238вставкаА, О237Т238вставка8, О237Т238вставкаУ, Ο237Т238вставкаΑ8, Ο237Т238вставка8Α, О196К197вставкаК, О196К197вставкаК, О196К197вставкаУ, О196К197вставка\, О196К197вставкаА, О196К197вставкаМ, К197П98вставкаЕ, К197П98вставкаУ, К197П98вставкаА и К197П98вставка8 (где, например, Ο237Т238вставкаΑ8 обозначает модификацию, в которой аланин (А) и серин (8) были вставлены между глицином в положении 237 (О237) и треонином в положении 238).
Ъ. Модификации, увеличивающие собственную активность.
В одном примере в модифицированный полипептид фактора УП, предусмотренный в настоящем документе, могут быть введены дополнительные модификации, которые могут привести к увеличению каталитической активности по отношению к фактору Х. Например, могут быть модифицированы аминокислоты, которые участвуют во взаимодействии с кофактором ТФ, в результате чего полученный полипептид РУП обладает повышенной аффинностью к ТФ и проявляет повышенную активность по отношению к РХ. Также могут быть введены модификации в активационный карман полипептида РУП, так что собственная активность модифицированного полипептида РУП к РХ увеличивается по сравнению с активностью немодифицированного полипептида. Другая стратегия модификации, которая приводит к увеличению активности, предполагает введение модификаций в полипептид РУП, которые изменяют фолдинг и конформацию белка в более активную форму. Например, могут быть введены такие аминокислотные замены, что район с α-спиралью и петлей (соответствующий положениям с 305 до 321 зрелой последовательности, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3) протеазного домена стабилизируется и более плотно укладывается с протеазным доменом, что придает более зимогенподобную форму модифицированному полипептиду РУП. Более активный полипептид также может быть получен модификацией аминокислот, содержащихся в β-тяжах полипептида РУП. Например, могут быть введены аминокислотные замены для введения новых цистеиновых пар, которые могут образовывать новые дисульфидные связи, фиксирующие модифицированный полипептид РУП в более активной форме.
Примеры дополнительных модификаций, которые могут быть введены в предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУП для увеличения собственной активности модифицированных полипептидов РУП, включают, но не ограничиваются модификациями, описанными Регззом и др., (2004) ВюсЬет 1. 379:497-503, Маиη и др., (2005) Рго1 8с1 14:1171-1180, Регззом и др., (2001) Р^8 98:13583-13588, Регззоп и др., (2002) Еиг. 1. ВюсЬет. 269:5950-5955, 8оерта и др., (2001) 1. Вю1. СЬет. 276:17229-17235, 8оерта и др., (2002) 1. Вю1. СЬет. 277:49027-49035, \\'0 200183725, \\'0 2002022776, \\'0 2002038162, \\'0 2003027147, \\'0 200338162, \\'0 2004029090, \\'0 2004029091, \\'0 2004108763 и \0 2004111242. Не ограничивающие примеры описанных в уровне техники аминокислотных модификаций, которые могут привести к увеличению собственной активности модифицированного полипептида РУП, включают одну или более модификаций из 8279С/У302С, Ε280Ε/Ν301Ε, У281С/У302С, 8282С/У299С, 8314Е, Ь39Е, Ь39О, Ь39Н, Ι42Κ, 8430, 853Ν, К62Е, К62К, К621Е К62Н К62О, К62Т, Ь65О, Ь658, Р7ГО, Р71У, Р71Е, Р71О, Ε71Ν, Р748, Р74А, А75Е, Α75Ό, Е77А, Е82О, Е82Н Т83К, Е116Б, К157У, К157Ь, К157ф К157М, К157Р, К157\, К157Р, К157О, К1578, К157Т, К157С, К157У, К157^ К157Е, К157К, К157Н, К157П, К157О, У158Ь, Υ158Ι, У158М, У158Р, У158\, У158Р, У158О, У1588 , У158Т, У158С, У158У, У158Н У158Е, У158К, У158К, У158Н, У158П, У158О, А274М, Α274Ε, Α274^ Α274Κ, Α274Ό, Α274Υ, Α274Ι, Α274Р, Α274\, А274Р, Α274Ο, А274Т, А274С, Α274Υ, Α274Ν , А274Е, А274Н, Α2748, Α274Ο, Р275Н, Е296У, Е296Ь, β296Ι, Е296М, Е296Р, Е296\, Е296Р, Е296О, Е2968, Е296Т, Е296С, Β296Υ, Ξ296Ν, Е296К, Е296К, Е296Н, Е296П, Е296О, М298О, М298У, М298Е М298Р М298Р, М298\, М298Р, М298О, М2988, М298Т, М298С, М298У М298Н М298К, М298К, М298Н, М298Е, М298П, Κ304Υ, К304Р, К304Ь, К304М, Ь305У, Ε305Υ, Ε305Ι, Б305Р, Ε305Α, Ь305М, Ь305\, Ь305Р, Ь305О, Ь3058, Ь305Т, Ь305С, Ε305Ν, Ь305Е, Ь305К, Ь305К, Ь305Н, Ε305Ό, Ь305О, М306П, М306^ Ό3098, П309Т, 8314Α, 8314У, 83141, 8314М, 8314Р, 8314\, 8314Р, 8314О, 8314Ь, 8314Т, 8314С, 8314Υ, 8314Ν, 8314Е, 8314К, 8314К, 8314Н, 8314Ό, 83140, П334О, П334Е, Ό334Α, О334У, Ό334Ι, П334М, П334Р, Ό334\, П334Р, Ό334Ε, П334Т, П334С, Ό334Υ, Ό334Ν, П334К, Ό334Κ, О334Н, Ό3348, Ό334Ο, 8336О, 8336Е, 8336Α, 8336У, 8336Ι, 8336М, 8336Р, 8336\, 8336Р,
- 67 020818
З336Ь, З336Т, З336С, 3336Υ, З336К, З336К, З336К, 3336Η, 3336Ό, З336Ц, К337Й, К337У, К337Е К337М, К337Р, К337№, К337Р, К3370, К3373, К337Т, К337С, К337У К337Ц, К337Е, К337К, К337Н, К337Ц, К337Ц, Р374Р, Р374А, Р374У, Р374ф Р374Ь, Р374М, Р374№, Р3740, Р3743, Р374Т, Р374С, Р374Υ, Р374К, Р374Е, Р374К, Р374К, Р374Н, Р374О, Р374Ц, а также замену положений 300-322, 305-322, 300-312, или 305-312 соответствующими аминокислотами из трипсина, тромбина или РX и замену положений 310-329, 311-322 или 233-329 соответствующими аминокислотами из трипсина.
с. Модификации, повышающие устойчивость к протеазам.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также могут содержать дополнительные модификации, которые приводят к увеличению устойчивости полипептида к протеазам. Например, в белок могут быть введены аминокислотные замены, которые приводят к удалению одного или нескольких потенциальных сайтов протеолитического расщепления. Таким образом, модифицированный полипептид РУН можно сделать более устойчивым к протеазам, увеличивая тем самым стабильность и период полураспада модифицированного полипептида.
Примеры дополнительных модификаций, которые могут быть введены в предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РУН для повышения устойчивости к протеазам, включают, но не ограничиваются модификациями, описанными патенте США ИЗ5580560 или заявках \70 1988010295 и \70 2002038162. Не ограничивающие примеры описанных в уровне техники модификаций включают модификации, которые могут привести к увеличению устойчивости модифицированного полипептида РУН к ингибиторам и/или протеазам, и включают одну или более модификаций из К32Ц, К32Е, К320, К32Н, К32Т, К32А, К323, К38Т, К38О, К38Ь, К380, К38А, К383, К38Н К38Н, N2^ N23, Ν2Λ, N29, Υ44Κ, Υ443, Υ44Α Υ449, Р2783, Р278А, Р278Н Р2789, Р2780, К2900, К290А, К290З, К290Т, К290К, К3040, К304Т, К304А, К304З, К304^ К3150, К315А, К315З, К315Т, К3159, Υ3323, Υ332А, Υ332Κ, Υ3329, Υ3320, К341Е, К3419, К3410, К341Т, К341А и К3413.
ά. Модификации, повышающие аффинность к фосфолипидам.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, также могут содержать одну или несколько дополнительных модификаций для увеличения аффинности к фосфолипидам.
Коагулянтная активность РУН может быть повышена за счет увеличения связывания и/или аффинности полипептида к фосфолипидам, таким как экспонированные на поверхности активированных тромбоцитов фосфолипиды. Это может быть достигнуто, например, модификацией эндогенного домена 01а белка РУН.
Модификация может быть осуществлена аминокислотной заменой по одной или нескольким позициям в домене 01а полипептида РУН, в результате чего модифицированный полипептид РУН приобретает повышенную способность связывать фосфатидилсерин и другие отрицательно заряженные фосфолипиды. Примеры дополнительных модификаций для увеличения связывания и/или аффинности к фосфолипидам, которые могут быть введены в модифицированный полипептид РУН, предусмотренный в настоящем документе и содержащий эндогенный домен 01а, включают, но не ограничиваются, модификации, описанные Нагуеу и др., (2003) 1. ΒίοΙ. Сйет. 278:8363-8369, ИЗ 20030100506, ИЗ 20040220106, ИЗ 20060240526, ИЗ 6017882, ИЗ 6693075, ИЗ 6762286, \\'0 200393465 и \\'0 2004111242. Примеры таких модификаций включают одну или несколько модификаций, выбранных из вставки тирозина в положение 4 или одной или нескольких из модификаций Р109, Р10Е, Ρ10Ό, Р10^ К28Р, К28Е, К32Е, К32Ц, Ц33Р, Ц33Е, О33К А34Е, А34О, А3П, А34Ь, А34М, А34У, А34Р, А34№, А34У, Κ36Ό, К36Е, К38Е и К38О.
е. Модификации, изменяющие гликозилирование.
Модификация степени, уровня и/или типа гликозилирования белка описаны в уровне техники как средство уменьшения иммуногенности, повышения стабильности белка, средство для уменьшения частоты введения и/или уменьшения неблагоприятных побочных эффектов, таких как воспаление. Как правило, указанные цели достигают путем увеличения уровня гликозилирования. Сайт гликозилирования представляет собой место прикрепления углеводного фрагмента к полипептиду, такое, что при продукции полипептида в эукариотических клетках, способных к гликозилированию, оно гликозилируется.
В РУН присутствуют четыре нативных сайта гликозилирования, два сайта ^гликозилирования, N145 и N322, и два сайта О-гликозилирования, З52 и З60, согласно положениям в последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в ЗЕ9 ГО N0: 3. В одном варианте в предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РУН могут быть введены дополнительные модификации, приводящие к нарушению гликозилирования этих сайтов. Это может привести к модифицированному полипептиду РУН с повышенной коагулянтной активностью (см., например, \70 2005123916). Не ограничивающие примеры описанных в уровне техники модификаций, которые могут привести к снижению гликозилирования и повышению активности модифицированных полипептидом РУН по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, включают, но не ограничиваются, З52А, З60А, N145Υ, N1450, N1450 Ш45М, Ы145З, N145^ М45Ь, М45Т, М45У, Ы145Р, М45К, М45Н, N1459, М45Е, N1450, N145^, N1450, М45С, №22Υ, N3220, №22Р, №22М, №22З, N322^ N3220, №22Т, №22У, №22Р, Ш221<, N3220 N3229, Ц322Е, \322К N322^ и N3220
В другом варианте в аминокислотную последовательность модифицированного полипептида РУН,
- 68 020818 предусмотренного в настоящем документе, могут быть введены дополнительные модификации, такие как введение дополнительных сайтов гликозилирования, что повышает уровень гликозилирования модифицированного полипептида РУН по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Сайт гликозилирования может представлять собой сайт ^гликозилирования или сайт О-гликозилирования. Примеры модификаций, которые могут быть введены в полипептид РУН для создания одного или нескольких новых сайтов гликозилирования включают, но не ограничиваются, модификации, которые описаны в и8 6806063 и \0 200393465. Не ограничивающие примеры описанных в уровне техники модификаций, которые могут привести к увеличению гликозилирования модифицированного полипептида РУП по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, включают, но не ограничиваются, Р48, Р4Т, Р10Н Д2Ш, \4Ш, 843^ А5Ш, 058^ Ь65Н 0598, О59Т, Е828, Е82Т, N958, Ж5Т, 0978, О97Т, У10Ш, 0104^ Т106^ К109^ 011Ж, 0124^ 8126^ Т128Н А1758, А175Т, 0179^ П868, П86Т, У188^ К2028, К202Т, П058, Е05Т, Ό212Η Е220Н Е30^ Р23Ш, Р236Н 023Ж, У253Н Е265Н Т267^ Е270Ц К277^ Ь280Н 029Ш, Р3038, Р3038Т, Ь305Н Д312Н 0318^ 033Ш, Ό334Η К33Ж, О342N , Н348^ К353Н У357Ц, Р36Ш, У376Н К379Н М39Ш, К32МА348, К32МА34Т, Р3Ш/О338, Р3Ш/О33Т, 00№/К328, 00№/К32Т, А34№/К368, А34№/К36Т, К38Ж408 , К38№Ф40Т, Т37№Е398, Т37№Ъ39Т, К36№/К388, Κ36N/К38Τ, Ι.39ΧΛΥ418. 1.39\Л\'41Т. Р40Ж428, Р40Ж42Т, Р^/У448, I42N/Υ44Τ, ¥44№/П468, У44№/П46Т, П46№/О488, П46№/П48Т, 047МД498, 047МД49Т, 852№Ф548, Д66ЖГ688, 8119№Ь1218, А122М01248, Т128№Ф129А, Т130№Е1328, К143№№458, К143М№45Т, Е142№/К1448, Е142N/Κ144Τ, Ы4Ш/К1438, Ы4Ш/К143Т, П40МЕ1428/, I140N/Е142Τ, К144МА1468, К144^А146Т, А146№/К1488, А146№/К148Т, 8147№Ф1498/, 8147№Ф149Т, К290МА2928, К290МА292Т, А292^А2948, В289М02918, В289М0291Т, Ь288МК2908, Ь288№/К290Т, Ь287№/О2898, Ь287№/О289Т, А292^А2948, А292МА294Т, Т293№Ь2958, Т293№Ь295Т, К315МУ3178, Е315МУ317Т, 8314МК3168, 8314№/К316Т, Д313№/К3158, Д313№/К315Т, К316М03188, К316М0318Т, У317№/О3198, У317№ГО19Т, К34Ш/О3438, К34Ш/О343Т, 8339МК3418, 8339МК341Т, В343М03458, В343М0345Т, К392МЕ3948, К392№/Е394Т, Ь390№/К3928, Ь390№/К392Т, К389НМ3918, К389№М391Т, 8393НФ3958, 8393№Г395Т, Е394№/К3968, Е394N/Κ396Τ, Е394№Ф395А/К3968, Р395НФ3978, Р395НФ397Т, К396М03988,
К.396У/0398Т, Р397^У3998, Р397N/У399Τ, 0398№Е4008, 0398№Е400Т, У399№Ь4018, У399№Е401Т, ^400N/Κ4028, 1.4004/1/4021/ Ь40Ш/А4038, Ь40Ш/А403Т, К402№Ф4048, Н402\/Р404Т\ А403Ж4058, А403№/Р405Т, Р404№Ф4068 и Р404№Ф406Т.
£. Модификации, содействующие связыванию химических групп.
В предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РУН также можно ввести дополнительные модификации, содействующие последующему связыванию химических групп. В полипептид могут быть введены одна или несколько аминокислотных замен или вставок, вследствие чего химические группы могут быть связаны с модифицированным полипептидом РУН через замещенные аминокислоты. Например, в модифицированный полипептид РУН может быть введен цистеин, к которому для повышения стабильности и периода полураспада в сыворотке может быть присоединен фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Другие остатки, по которым может быть осуществлено присоединение химических групп, включают лизин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В некоторых вариантах аминокислотные остатки заменяют для уменьшения числа потенциальных сайтов присоединения групп. Например, может быть уменьшено количество лизина. Примеры модификаций, которые могут быть введены в аминокислотную последовательность полипептида РУН и которые могут способствовать последующему связыванию химических групп, включают, но не ограничиваются, модификации, описанные в И8 20030096338, И8 20060019336, И8 6806063, \0 200158935 и \0 2002077218. Не ограничивающие примеры модификаций полипептидов РУН, которые могут способствовать последующему связыванию химических групп, включают, но не ограничиваются, О250С. К396С, Р406С, И2К, У44К, Ь288К, Э289К. К290К, 0291К, А292К, Т293К, Д313К, 8314К, К315К, У317К, Ь390К, М391К, К392К, 8393К, Е394К, Р395К, К396К, Р397К, 0398К, У399К, Ь400К, Ь401К, К402К, А403К, Р404К, Р405К, Р30С, К32С, П33С, А34С, Т37С, К38С, \41С, У44С, 845С, Ό46Ο Ь141С, Е142С, К143С, К144С, Ь288С, Ό289Ο К290С, 0291С, А292С, 8314С, К315С, К316С, У317С, Ь390С, М391С, К392С, 8393С, Е394С, Р395С, К396С, Р397С, 0398С, У399С, Ь401С, К402С, А403С, Р404С, Ρ30Ό, К32П, А34П, Т37П, К38П, \41ϋ, Υ44Ό, 845Ό, Ό46Ο Ь14ГО, Е142П, К143П, Κ144Ό, Ε288Ό, Κ290Ό, 0291Ό, Ά292Ό, φ313Ό, 8314Ό, Κ315Ό, К316П, У317О, Ε390Ό, Μ391Ό, Κ392Ό, 8393Ό, Р395П, Κ396Ό, Р397П, 0398Ό, У399П, Ь40ГО, Κ402Ό, А403П, Р404О, 130Е, К32Е, А34Е, Т37Е, К38Е, \41Е, Υ44Е, 845Е, Ό46Ο Ь141Е, Е142Е, К143Е, К144Е, Ь288Е, К290Е, 0291Е, А292Е, Д313Е, 8314Е, К315Е, К316Е, У317Е, Ь390Е, М391Е, К392Е, 8393Е, Р395Е, К396Е, Р397Е, 0398Е, У399Е, Ь401Е, К402Е, А403Е, Р404Е, К18К, К32К, К38К, К62К, К85К, К109К, К137К, К143К, К148К, К157К, К161К, К197К, К199К, К316К, К337К, К341К, К389К, К18Д, К32Д, К38Д, К62Д, К85Д, К109Д, К137Д, К143Д, К148Д, К157Д, К161Д, К197Д, К199Д, К316Д, К337Д, К341Д, К389Д, К18Н К32Н К38Н К62Н К85Н К109Н К137Ц, К143Н К148Н К157Ц К16Ш, К197^ К199^ К316Н К337Ц, К34Ш, К389Н К18Н, К32Н, К38Н, К62Н, К85Н, К109Н, К137Н, К143Н, К148Н, К157Н, К161Н, К197Н, К199Н, К316Н, К337Н, К341Н и К389Н.
д. Примеры комбинаций мутаций.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, включающие две
- 69 020818 или более модификаций, которые должны влиять на одно или более свойств или активностей немодифицированного полипептида РУН. В некоторых примерах две или более модификации изменяют два или более свойств или активностей полипептида РУЛ. В полипептиды РУН могут быть введены модификации, изменяющие одно или несколько свойств, выбранных из каталитической активности, устойчивости к АТ-Ш, устойчивости к ТРИ, устойчивости к ингибированию Ζη2+, собственной активности, амидолитической активности, связывания и/или аффинности к фосфолипидам, гликозилирования, устойчивости к протеазам, периода полураспада и взаимодействия с другими факторами или молекулами, такими как РX, РК, сывороточный альбумин и интегрин тромбоцитов апьв3. Как правило, две или более модификаций комбинируют таким образом, что полученный модифицированный полипептид РУН проявляет увеличенную коагулянтную активность, увеличенную продолжительность коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН. Модификации могут включать аминокислотные замены, вставки или удаления. Увеличенная коагулянтная активность, увеличенная продолжительность коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс модифицированного полипептида РУН, содержащего две или более модификаций, могут быть увеличены по меньшей мере приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с активностью начального или немодифицированного полипептида РУНа.
В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РУН, содержащие две или более модификаций, которые вводят в немодифицированный полипептид РУН для изменения двух или более видов активности или свойств. Модифицированные полипептиды РУН могут содержать 2, 3, 4, 5, 6 или более модификаций. Кроме того, каждая модификация может затрагивать один или более аминокислотных остатков. Например, модифицированный полипептид РУН может содержать две модификации, каждая из которых представляет собой замену одной аминокислоты. В другом примере модифицированный полипептид РУН может содержать две модификации, одна из которых представляет собой замену одной аминокислоты, а другая модификация представляет собой удаление более чем одного аминокислотного остатка и последующую вставку более чем одного аминокислотного остатка. Например, модифицированный полипептид РУН, предусмотренный в настоящем документе, может включать замену аминокислоты 8222А (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8ЕО ГО N0: 3), нарушающую связывание Ζη2+, и модификацию заменой О1а из РК, которая включает удаление эндогенного домена О1а белка РУН, т.е. удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3) и вставку 45 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ45 домена О1а из РК, приведенного в 8ЕЦ ГО N0: 83.
В одном примере модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут включать две или более модификаций, выбранных исключительно из модификаций, приведенных в табл. с 5 до 13. В других примерах модифицированные полипептиды РУН содержат две или более модификаций, где одна или более модификаций выбраны из приведенных в табл. с 5 до 13 модификаций, а одна или нескольких модификаций представляют собой дополнительные модификации, не указанные в табл. с 5 до 13, например, модификации, описанные в уровне техники. В некоторых примерах одна или несколько дополнительных модификаций могут быть выбраны из модификаций, приведенных в разделах Э.6.а-е выше. Например, модифицированные полипептиды РУН могут содержать модификации одного или нескольких аминокислотных остатков из Ό196, К197, К199, О237, Т239, К290 или К341 по нумерации зрелого РУН, приведенного в 8ЕЦ ГО N0:3 (соответствуют Ό60, К60а, К60с, О97, Т99, КТ47 и К192, соответственно, по нумерации химотрипсина), что может повысить устойчивость к ТРИ, и модификации одного или нескольких аминокислотных остатков, которые влияют на собственную активность, например остатков У158 и М298 (У21 и М156, соответственно, по нумерации химотрипсина). Например, модифицированный полипептид РУН может содержать две аминокислотные замены, которые повышают устойчивость к ТРИ, такие как К197Е и О237У, и одну аминокислотную замену, которая увеличивает собственную активность, такую как М298Ц, что приводит к полипептиду РУН с повышенной коагулянтной активностью.
Примеры комбинаций модификаций, предусмотренных в настоящем документе, представляют собой комбинации, которые включают мутацию Ц286К (нумерация соответствует последовательности зрелого полипептида РУН, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3; соответствует Ц143К по нумерации химотрипсина). Модифицированные полипептиды РУН, содержащие модификацию О286Е. могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более дополнительных модификаций. Эти дополнительные модификации могут быть включены, например, для изменения каталитической активности, устойчивости к АТ-Ш, устойчивости к ТРИ, устойчивости к ингибированию Ζη2+, собственной активности, амидолитической активности, связывания и/или аффинности к фосфолипидам, гликозилирования, устойчивости к протеазам, периода полураспада и взаимодействия с другими факторами или молекулами, такими как РX, РК, сывороточный альбумин и интегрин тромбоцитов α^β3. Обычно модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, содержащие две или более модификаций, одна из которых представляет собой ами- 70 020818 нокислотную замену О286К, обладают повышенной коагулянтной активностью по сравнению с полипептидом ΡΥΙΙ дикого типа.
В некоторых примерах модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие две или более модификаций, из которых одна представляет собой О286К, обладают повышенной каталитической активностью и коагулянтной активностью по сравнению с полипептидом дикого типа, а также по сравнению с полипептидом ΡΥΙΙ, содержащим любую из мутаций по отдельности. Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие обе аминокислотные замены О286К и М289О (О286К/М298О по нумерации зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенного в 8ЕО ГО N0: 3; соответствует О143К/М156О по нумерации химотрипсина). ΡΥΙΙ с комбинацией мутаций О286К/М298О проявляет увеличенную каталитическую активность по отношению к его субстрату, фактору X, по сравнению с ΡΥΙΙ дикого типа, по сравнению с ΡΥΙΙ с одной мутацией О286К и ΡΥΙΙ с одной мутацией М298О (см. пример 4 ниже). Например, мутант М298О в присутствии ТФ проявлял по отношению к ΡX каталитическую активность, которая была в 1,8-2 раза выше, чем активность полипептида дикого типа, каталитическая активность мутанта О286К была приблизительно в 2,1 раза выше, чем активность полипептида ΡΥΙΙ дикого типа, а мутант О286К/М298О проявлял по отношению к ΡX каталитическую активность, которая была приблизительно в 3,6-4,4 раза выше, чем каталитическая активность полипептида дикого типа по отношению к ΡX (см. табл. 15 ниже). Не ограничивающие примеры комбинаций модификаций приведены в табл. 12.
Примеры комбинаций модификаций включают две и более модификаций, которые предназначены для изменения двух или более видов активности или свойств полипептида ΡΥΙΙ, включая, но не ограничиваясь, устойчивость к ТРИ, устойчивость к АТ-ΙΙΙ, собственную активность, амидолитическую активность, каталитическую активность, связывание Ζη2', связывание и/или аффинность к фосфолипидам, гликозилированием, устойчивостью к протеазам, периодом полураспада и взаимодействием с другими факторами или молекулами, такими как ΡX и ΡΚ. Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие такие комбинации модификаций, могут проявлять увеличенную коагулянтную активность, увеличенную продолжительность коагулянтной активности и/или увеличенный терапевтический индекс. При описании модификаций, приведенных в табл. 12 ниже, используют ту же номенклатуру и системы нумерации, что и в табл. 5-11 выше. Например, модификация замена 01а из ΡIX включает удаление эндогенного домена 01а из ΡΥΙΙ, т.е. удаление аминокислотных остатков с А1 до Υ44 (остатки соответствуют последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3), и вставку 45 аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам с Υ1 до Υ45 домена 01а белка ΡΚ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 83, как описано выше. В некоторых примерах модификация замена 01а из ΡIX также подразумевает наличие одной или нескольких аминокислотных замен в домене 01а из ΡΚ по сравнению с доменом 01а из ΡΚ дикого типа, как описано выше. Например, модификация замена 01а из ΡΙΚ также может включает аминокислотную замену М19К (нумерация соответствует последовательности домена 01а из ΡΚ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 83). Такая модификация обозначается {замена 01а из ΡΚ/Μ19Κ}, т.е. модифицированный полипептид ΡΥΙΙ содержит гетерологичный домен 01а из ΡΚ, в котором метионин в положении, соответствующем положению 19 в домене 01а из ΡΚ, приведенном в 8Е0 ГО N0: 83, заменен на лизин. Таким образом, модификации, введенные в гетерологичные части домена 01а из ΡΚ, приведены с указанием аминокислотных положений, соответствующих аминокислотным положениям последовательности зрелого полипептида ΡΚ дикого типа или последовательности домена 01а из ΡΚ дикого типа, приведенного в 8Е0 ГО N0: 83. Модификации, введенные в аминокислотные позиции в полипептиде ΡΥΙΙ, приводят с указанием аминокислотных позиций, соответствующих аминокислотным позициям в зрелом полипептиде ΡΥΙΙ, приведенном в 8Е0 ГО N0: 3, а также обозначают по нумерации химотрипсина. Например, модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, содержащие модификацию О286К (нумерация соответствует последовательности зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенной в 8Е0 ГО N0: 3) и замену домена 01а из ΡΚ, где домен 01а из ΡΚ содержит аминокислотную замену М19К (нумерация соответствует аминокислотным позициям в домене 01а из ΡΚ, приведенном в 8Е0 ГО N0: 83), обозначают как {замена 01а из ΡIX/Μ19Κ}/^286К. Аналогично, модификация {замена 01а из ΡIX/^448}/^286К/Μ298^ означает, что полипептид ΡΥΙΙ содержит модификацию замена 01а из ЕК, где глутамин в положении, соответствующем положению 44 в домене 01а из ΡΚ, приведенном в 8Е0 ГО N0: 83, заменен на серин, а полипептид также содержит аминокислотные замены О286К и М298О по нумерации зрелого полипептида ΡΥΙΙ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 3. В табл. 12 ниже приведены номера по идентификатору последовательностей (8Е0 ГО N0), в котором приведены примера аминокислотных последовательностей модифицированных полипептидов ΡΥΙΙ.
- 71 020818
Таблица 12
Модификации по нумерации зрелого РУП Модификации по нумерации химотрипсина ЗЕ<2 ГО ΝΟ
Замена О1а из ИХЛ2286К. Замена 01а из ИХ/(2143К. 131
(2286К/Н257А Н117АЛ2143К 132
5222А/(2286К. 882А/(2143К. 133
(2286К/5222А/Н257А 882А/Н117А/(2143К 134
Замена 01а из ИХ /5222А/(2286К. 882А/Замена 01а из ИХ/(2143К 135
Модификации по нумерации зрелого ГУП Модификации по нумерации химотрипсина 5Е<2 ГО ΝΟ
Замена 01а из ИХ /Н257АА2286К Н117А/Замена 01а из ИХЛ2143К. 136
Замена 01а из ИХ /3222А/Н257А/()286К. (2143К/882А/Н117А/Замена 01а из ИХ 137
(2286К/М298(2 (2143К/М156(2 138
О286К/М298(2/К341(2 (2143К/М156(2/К192(2 139
К199Е/(2286К/М298(2 К60сЕ/(3143К/М 156(} 140
Замена 01а из ИХ /(2286К/М298<2 Замена О1а из ИХ/<2143К/М156<2 141
О286К/(2366У (2143К/(2217У 142
(2286К/А292Ы/А2948/(2366У (2143Κ/Α150Ν/Α1523/(2217У 143
А1758/(2286К/(2366У А395/(2143К/(2217У 144
8222А/<2286К/(}366У 582А/(2143К/О217У 145
Н2573/()286К Н1178/(2143К 146
Н2578/(2286К/<2366У Н1175/(2143К/(2217У 147
8222А/Н257А/(2286К/(2366У 582А/Н117А/(2 143КА2217У 148
(2286К/Н373А О143К/Н224А 149
8222А/Н257А/<2286К/М298(2 582А/Н117 А/(2143К/М156(2 150
(2286К/К34Ю (2143К/К192О 151
(2286К/(2366О Ο143Κ/(2217ϋ 152
(2286ΚΛ2366Ν (2143ΚΛ2217Ν 153
ρ286Κ/Μ298ρ/ς366ϋ (2143К/М156(2/(2217ϋ 154
(2286Κ/Μ298(2/Ο366Ν (2143Κ/Μ156(2/(2217Ν 155
О286К/Н373Р (2143К/Н224Р 156
(2286К/М298(2/Н373Р (2143К/М156(2/Н224Р 157
Замена 01а из ΡΙΧ/8222Α Замена 01а из ΡΙΧ/882Α 245
Замена 01а из ΡΙΧ/Η257Α Замена 01а из ΡΙΧ/Η117Α 246
Замена 01а из ΡΙΧ/3222Α/Η257Α Замена 01а из Р1Х/582А/Ш17А 247
- 72 020818
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<5 ГО ΝΟ
3222А/М298(5 382А/М156(5 248
Н257А/М298(5 Н117А/М156(5 249
3222А/Н257А/М298(5 382А/Н117А/М156О 250
3222Α/Α292Ν/Α2943/(5366ν 382А/А150Ν/Α1523/(5217У 251
А1753/3222А/(5366У А398/882А/О217У 252
8222А/()366У 382А/(5217У 253
Н2573/(5366У Н1173/(5217У 254
8222А/Н373А 382А/Н224А 255
У158Т/Ь287Т/М298К У21Т/Ы44Т/М156К 256
У158О/Ь287Т/М298К У2Ю/Ы44Т/М156К 257
81038111удаление/вставка1ЕВ1СЬРК. \УОСЬ\УЕ/О237У 3[103] 8 [ 111]удаление/вставка1ЕО1СР РКЛУОСЬ\УЕ/О97У 258
81038111удаление/вставкаВ1СЬРКЛУ ОСЬАУЕО/О237У 8 [103]8[ 111]удаление/вставкаО1СЬР КЛУОСЬ\УЕО/О97У 259
Η1158126удаление/вставкаОРЬМЕО 1СЬРК\УОСЬ\УЕООР/О237V Η [ 115 ] 8 [ 126] удал ение/вставкаОКЬМ ЕО1СРРКЖ}СР9/ЕООР/О97У 260
Η115 8126удаление/вставка1ЕВ1СЬРК \УОСЬ\УЕ/О237У Η [ 115 ] 8 [ 126] удаление/вставка1ЕВ1С ΡΡΚ.\ν0(3Ρ\νΡ/097ν 261
Η115 8126удаление/вставкаО1СРРКЛ^ ОСЬ\УЕО/О237У Н[115]8[126]удаление/вставкаВ1СЬР КЛУОСЬАЕО/О97У 262
Т128Р134удаление/вставка<ЗК.ЬМЕВ1 СРРК\УОСЬАУЕООР/О237У Т[128]Р[134]удаление/вставка(5К.ЬМ ЕО1СЬРК\УОСР\УЕООР/О97У 263
ΤΙ 28Р134удаление/вставка1ЕО1СЬРК. АУОСЬ\УЕ/О237У Т[ 128] Р [ 134]удаление/вставка1ЕО1СЬ РКЛУОСЬ\УЕ/О97У 264
81038111удаление/вставкарКЕМЕО1 СЬРК?УОС1А/ЕООР/О237У 8 [103]8[ 111]удаление/вставка(5К.ЬМ ЕО1СРРКЛ¥ОСР\УЕООР/О97У 265
Т128Р134удаление/вставкаО1СЬРКЛУ ОСЬ\УЕО/О237У Т[ 128]Р[ 134]О1СРРКЛУОСЬ\УЕО/О9 7У 266
81038111удаление/вставкаЗРОКОО1 Ю4У/О237У 8[103]8[111]удаление/вставкаЗРОКО ϋΙΡΝν/Ο97ν 267
Η115 8126удаление/вставкаЗРОКОЭ1 КМУ/О237У Η [ 115 ] 8 [ 126] удал ение/вставкаЗРОК. ΟϋΙΚΝν/Ο97ν 268
Модификации по нумерации зрелого ГУП Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<5 ГО N0
Т128Р134удаление/вставка8РОК.ОО1 КИУ/О237У Т[128]Р[134]удаление/вставка8РОКО ΌΙΚΝν/Ο97ν 269
М298(}/Н373Р М156(5/Н224Р 270
3119КГ/Ы213/А1753 8[119]К/Ь[121]8/А398 271
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ 272
Α122Ν/Ο1248/Α1758 Α[122]Ν/Ο[124]8/Α398 273
{Замена О1а из ΡΙΧ /Е40Ь}/(5286К/М298(5 {Замена 01а из ΡΙΧ /Е[40]Ь}/(5143К/М156(5 274
{Замена О1а из ΡΙΧ /К431}/(5286К?М298<5 {Замена 01а из ΡΙΧ /К[43]1}/(5143К/М156(5 275
{Замена О1а из ΡΙΧ /(5443}/(5286К/М298(5 {Замена 01а из ΡΙΧ /(5[44]3}/(5143К/М156(5 276
{Замена О1а из ΡΙΧ /М19К}/(5286К/М298(5 {Замена 01а из ΡΙΧ /М[19]К}/()143К/М156(5 277
{Замена О1а из ΡΙΧ /М19К/Е40Ь/К431 /()443 }/ζ)286Κ/Μ298<3 {Замена 01а из Р1Х/М[19]К/Е[40]Ь/К [43]1/(5[44]3}/(5143К/М156(5 278
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ζ)143Κ. 279
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298(2 Т[ 128]Ν/Ρ [ 129] А/(5143К/М15 6(5 280
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Η373Ρ Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/0143БСН224Р 281
VI 58О/(2286К/Е296У/М298(5 У21 ϋ/(5143К/Е154 У/М156(5 282
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/У158О/Е296У/М298(5 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ν21ϋ/Ε154ν/ М156С) 283
Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α 284
Замена О1а из ΡΙΧ/128Ν/Ρ129Α/822 2А/()286К. Замена О1а из ΡΙΧ/Τ[128]Ν/Ρ[129]Α /382А/(5143К 285
Замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/(528 6К/М298О Замена 01а из ΡΙΧ/Τ[128]Ν/Ρ[129]Α /(5143К/М156(5 286
ΤΙ 28Ν/Ρ129 А/3222А/Н257А/()286К /М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α/Η117ΑΛ5143Κ /М156(5 287
Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/(5143Κ/Μ156(5/ Н224Р 288
852А/360А/У158О/Е296У/М298(5 3[52]А/8[60]А/У2Ю/Е154У/М156(5 289
- 73 020818
Модификации по нумерации зрелого РУП Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<2 ГО ΝΟ
852А/360А/(}286К. 3[52]А/8[60]А/<3143К. 290
352А/360А/3222А 8[52]А/3[60]А/882А 291
Замена О1а из ΡΙΧ/352Α/360Α/3222Α /<3286К. Замена 01а из Р1Х/3[52]А/3[60]А/382 А/(}143К 292
δ52Α/δ60Α/ρ286Κ/Μ298(2 3[52]А/3[60]А/<2143К/М156(2 293
Замена О1а из Р1Х/352А/360А/р286К /М298(} Замена 01а из Р1Х/3[52]А/3[60]А/014 ЗК/М156О 294
352А/360А/3222А/Н257А/(3286К/ М298<3 3[52]А/3[60]А/382А/Н117А/р143К/ М156(} 298
352А/360А/(2286К/Н373Р 3[52]А/3[60]А/(3143К/Е1224Р 296
352А/360А/р286К/М298(}/Н373Р 3[52]Α/3[60]Α/ρΐ43Κ/Μ156(3/Η224Ρ 297
У158Э/Т239У/Е296У/М298р У2Ю/Т99У/Е154У/М156(3 298
Т239У/(}286К. Т99У/(}143К 299
3222А/Т239У 382А/Т99У 300
Замена 01а из ΡΙΧ /3222А/Т239У/(}286К Замена 01а из ΡΙΧ /882А/Т99У/()143К. 301
Τ239ν/ζ)286Κ/Μ298(3 Т99У/р143К/М156(2 302
3222А/Т239У/Н257А/р286К/М298О 382А/Т99У/Н117А/р143К/М156(2 303
Замена 01а из ΡΙΧ /Т239У/(2286К/ М298(} Замена 01а из Р1Х/Т99У/(5143К/ Μ156ζ) 304
Т239У/(3286К/Н373Р Т99У/0143К/Н224Р 305
Т239У/(2286К/М298р/Н373Р Т99У/<3143К/М156(УН224Р 306
νΐ58ϋ/Τ239Ι/Ε296ν/Μ298(3 У2Ю/Т991/Е154У/М156<3 307
Т2391/(3286К Т991/(2143К. 308
3222Α/Τ239Ι 382Α/Τ99Ι 309
Замена 01а из Р1Х/3222А/Т2391/(228 6К Замена 01а из Р1Х/382А/Т991/(5143К. 310
Т2391/(2286К/М298(2 Т991/(2143К/М 156(2 311
3222А/Т2391/Н257А/(2286К/М298<3 382Α/Τ99Ι/Η117А/(2143К/М156(2 312
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина 5Е<2 ГО ΝΟ
Замена 01а из Р1Х/Т2391/<3286К/М2989 Замена 01а изР1Х/Т991/(2143К/М15 6<2 313
Т2391/(2286К/Н373Р Т991/(2143К/Н224Р 314
Τ239Ι/ζ)286Κ/Μ298Ο/Η373Ρ Т991/(2143К/М156(}/Н224Р 315
Замена 01а из Р1Х/3222А/(}286К/ Н373Р Замена 01а из Р1Х/382А/<2143К/ Н224Р 316
Замена 01а из ΡΙΧ/δ222Α/ρ286Κ/Μ298(3 Замена 01а из Р1Х/882А/<2143К/ М156(2 317
Замена 01а изР1Х/8222А/р286К/М29 8<^)/Н373Р Замена 01а из Р1Х/382А/(2143К/М156 (2/Н224Р 318
У158О/Е296У/М298<3/Н373Р У2Ю/Е154У/М156<2/Н224Р 319
У158О/(5286К/Е296У/М298(2/Н373Р У21 ϋ/(2143 К/Е154 ν/Μ 156О/Н224Р 320
Н257А/р286К/М298(2 Н117А/(2143К/М156О 321
Η257δ/ζ)286Κ/Μ298(3 Н1173/(2143К/М 156(2 322
Замена О1а из Р1Х/3222А/Р12578/(3286К. Замена 01а из ΡΙΧ/382Α/Η1178/ (2143К. 323
δ222Α/Η257δ/ρ286Κ/Μ298(2 382А/Н1173/(2143К/М 156(2 324
Н2578/<5286К/М298<3/Н373Р Н1178/(3143 К/М15 6О/Н224Р 325
8222А/О286К/М298<Ж373Р 882А/(2143К/М156(2/Н224Р 326
Замена 01а из Р1Х/(2366У Замена 01а из Р1Х/(2217У 327
3222А/р286К/М298<2 882А/(2143К/М 156(2 328
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/(}366ν Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/А398/(2217У 329
Α122Ν/Ο1248/Α1758/(}366ν А[ 122]Ν/Ο[ 12418/АЗ98/(2217V 330
Τ128Ν/Ρ129 А/А175 8/8222А Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/882Α 331
Α122Ν/Ο1248/Α1758/8222Α Α[122]Ν/Ο[124]8/Α393/882Α 332
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ζ)286Κ. Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/(2143Κ 333
Α122Ν/Ο1243/Α175δ/(2286Κ А[ 122]Ν/Ο[ 124] 8/АЗ93/(2143К 334
Замена О1а из ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/Α17 58/3222А/О286К. Замена О1а из ΡΙΧ/Τ[128]Ν/Ρ[129]А/ А393/382АЛ2143К. 335
- 74 020818
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<) ГО ΝΟ
Замена О1а из ΡΙΧ/Α122Ν/Ο1248/ А1758/8222А/О286К Замена 01а из ΡΙΧ/Α[122]Ν/Ο[124]8/ А398/882А/О143К 336
Т128Ν/Ρ129А/А175 8/()286К/М298() Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/А398Л) 143К/ М156() 337
Α122Ν/Ο1243/Α1758/()286Κ/Μ298() Α[122]Ν/Ο[124]8/Α393/()143Κ/ М156() 338
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1755/3222Α/Η257Α /()286К/М298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α393/382Α/Η117А/ О143К/М156О 339
А122Ν/01248/А175 8/8222А/Н257А /()286К/М298() Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α398/882Α/Η117А/ ()143К/М156() 340
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/()286Κ/Μ298()/ Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α393/()143Κ/Μ156 0/Н224Р 341
А122Ν/01248/А175 3/()286К/М298 ()/Н373Р Α[122]Ν/Ο[124]8/Α398/()143Κ/ Μ156Ο/Η224Ρ 342
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ο Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Μ156() 354
{Замена 01а из ΡΙΧ /К431} /Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298() {Замена 01а из ΡΙΧ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/()143Κ/Μ156() 355
Т128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/()143Κ/Μ156()/ 0217Ν 356
{Замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/()286Κ/Μ298()/()366Ν {Замена 01а из ΡΙΧ /К[43]1}/()143К/М156()()217Ν 357
{Замена О1а из ΡΙΧ /К431}/ Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν {Замена О1а из ΡΙΧ /К[43]1}/Т[128]Ν/ Р [ 129] А/() 143К/М15 6()()217Ν 358
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298()/Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Μ156()/Η224Ρ 359
У158О/()286К/Е296У/М298() У2ГО/()143К/Е154У/М156() 360
Μ298()/()366Ν/Η373Ρ М156()/()217Ν/Η224Ρ 361
Т239У/М298О/Н373Р Т99У/М156()/Н224Р 362
Τ239Ι/Μ298()/Η373Ρ Т991/М156()/Н224Р 363
ΤΙ 28Ν/Ρ129 Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν/ Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/()143Κ/Μ156()/ ()217Ν/Η224Ρ 364
Τ239ν/()286Κ/Μ298()/()366Ν Т99У/() 143К/М156()/()217Ν 365
Τ239Ι/()286Κ/Μ298()/()366Ν Τ99Ι/() 143К/М156()/()217Ν 366
Модификации по нумерации зрелого РУН Модификации по нумерации химотрипсина 8Е<) ГО N0
Т128Ν/Ρ129А/Т239У/()286К/М298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν/()143Κ/Μ156 Ω 367
ΤΙ 28Ν/Ρ129 А/3222А/Т239У/Н257А /()286К/М298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882/νΤ99ν/Η117 А/ ()143К/М156() 368
Т128Ы/Р129А/Т239У/()286К/М298()/ Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν/()143Κ7Μ156 0/Н224Р 369
Т128Ν/Ρ129А/Т2391/О286К/М298() Т[ 128]Ν/Ρ [ 129] Α/Τ99ΙΛ) 143К/М156() 370
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/()286Κ/Μ298() /Н373Р Т[ 12 8 ]Ν/Ρ [ 129] Α/Τ99Ι/0143 К/М15 6 <3 /Н224Р 371
Е. Получение полипептидов ΡVII.
Полипептиды ΡVII, в том числе модифицированные полипептиды ΡVII или их домены или домены других витамин К-зависимых полипептидов, могут быть получены хорошо известными в уровне техники способами очистки белков и экспрессии рекомбинантных белков. Могут быть использованы любые известные специалистам в данной области способы выявления нуклеиновых кислот, которые кодируют желаемые гены. Для получения полноразмерного (т.е. охватывающего весь кодирующий район) клона кДНК или геномной ДНК, кодирующего полипептид ΡVII или другой витамин К-зависимый полипептид, например, из клеток или ткани, например ткани печени, может быть использован любой способ, доступный в уровне техники. Модифицированные полипептиды ΡVII могут быть сконструированы, как описано в настоящем документе, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза.
ΡVII можно клонировать или выделить с помощью любых доступных известных в уровне техники способов клонирования и выделения молекул нуклеиновых кислот. Такие способы включают ПЦРамплификацию нуклеиновых кислот и скрининг библиотек, в том числе скрининг гибридизацией нуклеиновых кислот, скрининг антителами и скрининг по активности.
Для выделения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид ΡVII, могут быть использованы различные способы амплификации нуклеиновых кислот, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Содержащий нуклеиновые кислоты материал может быть использован в качестве исходного материала, из которого могут быть выделены кодирующие ΡVII молекулы нуклеиновой кислоты. Например, в методах амплификации могут быть использованы препараты ДНК и РНК, клеточные экстракты, экстракты ткани (например, печени), образцы жидкости (например, образцы крови, сыворот- 75 020818 ки, слюны), образцы, взятые у здоровых и/или больных субъектов. Библиотеки нуклеиновых кислот также могут быть использованы как источник исходного материала. Для амплификации кодирующих РУН молекул могут быть разработаны праймеры. Например, праймеры могут быть сконструированы на основе экспрессируемых последовательностей, из которых образуется РУН. Праймеры могут быть сконструированы с помощью обратной трансляции аминокислотной последовательности РУН. Молекулы нуклеиновых кислот, полученные в результате амплификации, могут быть секвенированы, что подтвердит кодирование указанными молекулами полипептида РУН.
С кодирующей РУН молекулой нуклеиновой кислоты могут быть соединены дополнительные нуклеотидные последовательности, в том числе линкерные последовательности, содержащие сайты рестрикции для клонирования синтетического гена в вектор, например вектор экспрессии или вектор, предназначенный для амплификации кодирующей коровый белок последовательности ДНК. Кроме того, с кодирующей РУН молекулой нуклеиновой кислоты могут быть функционально связаны дополнительные нуклеотидные последовательности, представляющие собой функциональные элементы ДНК. Примеры таких последовательностей включают, но не ограничиваются промоторными последовательностями, предназначенными для обеспечения внутриклеточной экспрессии белка, и сигнальными последовательностями, предназначенными для обеспечения секреции белка. Дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как последовательности, представляющие собой районы связывания белков, также могут быть связаны с кодирующей РУН молекулой нуклеиновой кислоты. Такие районы, включают, но не ограничиваются, последовательности, содействующие поглощению РУН конкретными клеткамимишенями или, напротив, повышающие фармакокинетику синтетического гена.
Выявленные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в соответствующий вектор клонирования. Может быть использовано большое количество известных в уровне техники систем вектор-хозяин. Возможные векторы при условии совместимости векторной системы с используемой клеткой-хозяином включают, но не ограничиваются, плазмиды или модифицированные вирусы. Такие векторы включают, но не ограничиваются, бактериофаги, такие как производные бактериофага лямбда, или плазмиды, такие как рВК322, рИС плазмиды или производные вектора В1иексг1р1 (8!га!адепе, Ьа 1о11а, Калифорния). Вставки в вектор клонирования могут быть введены, например, путем лигирования фрагмента ДНК в вектор клонирования, который имеет комплементарные липкие концы. Вставка может быть введена с использованием векторов клонирования ТОРО Дпуйгодеп, СаНкьаб, Калифорния). Если для фрагментации ДНК были использованы комплементарные сайты рестрикции, которых нет в векторе клонирования, концы молекулы ДНК могут быть ферментативно модифицированы. Кроме того, любой желаемый сайт может быть получен путем лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК, лигированые линкеры могут содержать специфичные химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательности, распознаваемые эндонуклеазами рестрикции. В альтернативном методе расщепленный вектор и ген белка РУН могут быть модифицированы присоединением гомополимерного концевого фрагмента. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клеткухозяина, например, с помощью трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации и сонопорации, в результате чего образуется множество копий последовательности гена. В конкретных вариантах трансформация клетки-хозяина рекомбинантными молекулами ДНК, которые включают выделенный ген белка РУН, кДНК или синтезированную последовательность ДНК, позволяет получить множество копий гена. Таким образом, ген может быть получен в больших количествах с помощью выращивания трансформантов, выделения рекомбинантных молекул ДНК из трансформантов и, при необходимости, получения вставленного гена из выделенной рекомбинантной ДНК.
1. Векторы и клетки.
Для рекомбинантной экспрессии одного или нескольких белков РУН, нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок РУН, или ее часть, могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции кодирующей последовательности вставленного белка. Примером такого вектора может быть любой вектор экспрессии млекопитающих, такой как, например, рСМУ. Необходимые сигналы транскрипции и трансляции также могут содержаться в нативном промоторе гена РУН и/или его фланкирующих районах.
Кроме того, в настоящем документе предусмотрены векторы, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие РУН или модифицированный РУН. Также предусмотрены клетки, содержащие вектор. Клетки включают эукариотические и прокариотические клетки, а векторы представляют собой любые подходящие для использования в настоящем документе векторы.
Предусмотрены прокариотические и эукариотические клетки, в том числе клетки эндотелия, содержащие векторы. Такие клетки включают бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки грибов, археи, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных. Для получения полипептида РУН или модифицированных полипептидов РУН клетки выращивают в соответствующих условиях, при которых закодированные белки РУН экспрессируются в клетках, после чего извлекают экспрессированный белок РУН. Для целей настоящего изобретения РУН может быть секретирован в среду.
В одном варианте предусмотрен вектор, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирую- 76 020818 щую полипептид, обладающий активностью РУН и включающий полипептид РУН или его часть, или несколько копий указанной последовательности. Могут быть выбраны векторы для экспрессии полипептида РУН или модифицированных полипептидов РУН в клетке или для секреции экспрессированного белка РУН. Нуклеиновая кислота, с которой экспрессируют РУН, может быть связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал секреции, такой как сигнальная последовательность фактора α-спаривания Бассйатотусез сегеу131ае или его часть, или нативная сигнальная последовательность.
Для экспрессии кодирующей последовательности белка могут быть использованы различные системы хозяин-вектор. Они включают, но не ограничиваются системами клеток млекопитающих, инфицированных вирусом (например, вирусом осповакцины, аденовирусом и другими вирусами); системами клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмами, такими как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы, или бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Экспрессионные элементы векторов варьируют по силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин-вектор может быть использован любой подходящий транскрипционный и трансляционный элемент.
Для конструирования векторов экспрессии, содержащих химерный ген, включающий соответствующие сигналы контроля транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности, могут быть использованы любые методы вставки фрагментов ДНК в вектор, известные специалистам в данной области. Эти методы могут включать рекомбинацию и синтез ДНК ίη νίίΓο или рекомбинацию ίη νίνο (генетическую рекомбинацию). Экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид РУН, модифицированный полипептид РУН или его домен, производное, фрагмент или гомолог, можно регулировать с использованием второй последовательности нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии генов или их фрагментов в трансформированном молекулой (молекулами) рекомбинантной ДНК хозяине. Например, экспрессией белков можно управлять с помощью любого промотора/энхансера, известного в уровне техники. В одном варианте промотор не является нативным для генов белка РУН. Промоторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ранним промотором §У40 (Βе^ηο^зί и СЬатЬοη, №1иге 290: 304-310 (1981)), промотором, содержащимся в 3'длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Υататοίο и др., Се11 22:781-791 (1980)), промотором тимидинкиназы герпеса (ХУадиег и др., Ргос. №й1. Асак. 8с1 И8А 75:1441-1445 (1981)), регуляторными последовательностями гена металлотионеина (Вгвставка!ег и др., №1иге 296:39-42 (1982)); промоторами прокариотических векторов экспрессии, включающими промотор β-лактамазы (1ау и др., (1981). Ргос. №11. Асак. δα И8А 75: 5543) или ТАС промотор (^еΒοе^ и др., Ргос. №11. Асак. δά И8А 80:21-25 (1983)), см. также изеГи1 Рго1евставка Ггот КесοтЬ^ηаηί Вас1епа в журнале δс^еηι^Γ^с Атепсаи 242:7994 (1980); векторы экспрессии растений включают промотор нопалин-синтетазы (Неггаг-Ез1ге11а и др., №1иге 305:209-213 (1984)), промотор 35δ РНК вируса мозаики цветной капусты (Сагкег и др., №с1ею Аакз Кез. 9:2871 (1981)) и промотор фермента фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы (НеггегаЕз1ге11а и др., №1иге 310: 115-120 (1984)); промоторные элементы дрожжей и других грибов включают промотор Са14, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицеролкиназы, промотор щелочной фосфатазы; районы контроля транскрипции животных, которые проявляют тканеспецифичность и которые были использованы в трансгенных животных, включают контролирующий район гена эластазы I, который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы (δ\νίΠ и др., Се11 35:639-646 (1984); 0ιηίίζ и др., С.о1к δρήη§ Ηηγ,ογ δутр. Оиай Βίο1 50:399-409 (1986); Мас^οпа1к. НераФШду 7:425-515 (1987)); контролирующий район гена инсулина, активный в β-клетках поджелудочной железы (Ηаηайаη и др., №1иге 315: 115-122 (1985)), контролирующий район генов иммуноглобулинов, который активен в лимфоидных клетках (Сгоззсйек1 и др., Се11 35:647-658 (1984); Акатз и др., №1иге 318:533-538 (1985);. А1ехапкег и др., Μο1. Се11 Βίο1. 7:1436-1444 (1987)), контролирующий район вируса опухоли молочной железы мыши, активный в яичках, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Ьекег и др., Се11 45:485-495 (1986)), контролирующий район гена альбумина (Ршскей и др., Сепез апк Эете1 7:268-276 (1987)), активный в печени, контролирующий район гена α-фетобелка, активный в печени (Кгит1аиГ и др., Μο1. Се11 Βίο1. 5: 1639-1648 (1985); Наттег и др., δοοοο 235: 53-58 1987)), контролирующий район гена α-1антитрипсина, активный в печени (Ке1зеу и др., Сепез анк Эете1 7: 161-171 (1987)), контролирующий район гена β-глобина, активный в миелоидных клетках (Μο§π·ιιη и др., №1иге 375:338-340 (1985); КтоШаз и др., Се11 46:89-94 (1986)), контролирующий район гена основного белка миелина, активный в олигодендроцитах мозга (КеакНеак и др., Се11 45:703-712 (1987)), контролирующий район гена легкой цепи-2 миозина, активный в скелетных мышцах (δίκ-ιηί, №1иге 374:283-286 (1985)) и контролирующий район гена гонадотропного рилизинг-гормона, активный в гонадотропоцитах гипоталамуса (Мазοη и др., δαепсе 234: 1372-1378 (1986)).
В конкретном варианте используют вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид РУН или модифицированный полипептид РУН, или его домен, фрагмент, производное или гомолог, вектор также содержит одну или несколько точек начала репликации и, по желанию, один или более селективных маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику). Векторы и системы экспрессии полипептидов РУН включают известные векторы РюЫа
- 77 020818 (доступные, например, от [ηγΗΓοβοη. §аη Ωίοβο. Калифорния), в частности векторы, предназначенные для секреции закодированных белков. Примеры плазмидных векторов для экспрессии в клетках млекопитающих включают, например, рСМУ. Примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е.^Н включают, например, векторы экспрессия рОЕ (доступные от Οίη^η, Уа1с1'1С1а, Калифорния, см. также литературу, опубликованную Οίη^η для описания системы). рОЕ вектор включает промотор фага Т5 (распознается РНК полимеразой Е^й), двойной участок репрессии в Ьас-операторе для жестко регулируемой высокой экспрессии рекомбинантных белков в Ε·сο1^. синтетический сайт связывания рибосом (КБ8 II) для эффективной трансляции, последовательность, кодирующую 6χΗίδ метку, ίο и Т1 терминаторы транскрипции, точку начала репликации ^ΓΕ1 и ген β-лактамазы для устойчивости к ампициллину. рОЕ вектор позволяет присоединять 6χΗίδ метку на Оконце или С-конце рекомбинантного белка. Такие плазмиды включают рОЕ 32, рОЕ 30 и 31 рОЕ, которые включают сайты множественного клонирования для всех трех рамок считывания и обеспечивают экспрессию белков с ^концевой 6χΗίδ меткой. Другие примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е^той включают, например, векторы экспрессии рЕТ (см., патент США 4952496; вектор доступен Nονадеη, МаФюц Висконсин, см., также опубликованную №\'а8С1'1 литературу с описанием системы). Такие плазмиды включают рЕТ11а, которая содержит промотор Т71ас, Т7 терминатор, индуцируемый 1ас-оператор Ε·сο1^. и ген 1ас-репрессора; рЕТ12а-с содержит промотор Т7, терминатор Т7 и сигнал секреции οтрТ из Е.той; рЕТ15Ь и рЕТ19Ь (Nονадеη, Μπάίδοη, Висконсин) содержат лидерную последовательность Ηίδ-Тад™ для очистки на Ηίδ колонке и сайт расщепления тромбином, который позволяет осуществить расщепление после очистки на колонке, Т7-1ас промоторный район и Т7 терминатор.
2. Системы экспрессии.
Полипептиды РУН (модифицированные и немодифицированные) могут быть получены любыми известными в уровне техники способами получения белка, включая ίη νίίτο и ίη νίνο способы, такие как, например, введение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих РУН, в клетку-хозяина, животноехозяина, и экспрессию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих РУН, ίη νίίτο. РУН и модифицированные полипептиды РУН могут быть экспрессированы в любом организме, подходящем для получения необходимого количества полипептида РУН и необходимой формы РУН, требуемых для введения и лечения. Хозяева в системах экспрессии включают прокариотические и эукариотические организмы, такие как Е. тоП, дрожжи, растения, клетки насекомых, клетки млекопитающих, в том числе клеточные линии человека, и трансгенные животные. Хозяева систем экспрессии могут отличаться уровнями экспрессии белка, а также типом пост-трансляционных модификаций, которые присутствуют на экспрессированных белках. Выбор хозяина системы экспрессии может быть сделан на основе перечисленных и других факторов, таких как нормативные ограничения и соображения безопасности, издержки производства и необходимость очистки, и способы очистки.
Экспрессия в эукариотических хозяевах может включать экспрессию в дрожжах, таких как 8ассйаготусез се^еν^8^ае и РюЫа разЮпа, клетках насекомых, таких как клетки дрозофилы и клетки чешуекрылых, экспрессию в растениях и растительных клетках, таких как табак, кукуруза, рис, водоросли и ряска. Эукариотические клетки для экспрессии также включают линии клеток млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки почки детеныша хомяка (ВНК).
Эукариотические хозяева экспрессии также включают трансгенных животных, например, включая получение трансгена в сыворотке крови, молоке и яйцах. Трансгенные животные для получения полипептидов РУН дикого типа известны в уровне техники (патентные публикации США №№ 20020166130 и 20040133930) и могут быть адаптированы для получения предусмотренных модифицированных полипептидов РУН.
Для экспрессии РУН доступно и известно специалистам в данной области множество векторов экспрессии. Выбор вектора экспрессии зависит от выбора хозяина системы экспрессии. Такой выбор находится в сфере компетенции специалиста. В общем, вектор экспрессии может включать транскрипционный промотор и, необязательно, энхансер, сигналы трансляции и сигналы терминации транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии, которые используются для стабильной трансформации, обычно обладают селективным маркером, который позволяет отобрать и поддерживать трансформированные клетки. В некоторых случаях ориджин репликации может быть использован для амплификации числа копий вектора в клетках. Полипептиды РУН или модифицированные полипептиды РУН также могут быть использованы или экспрессированы как гибридные белки. Например, гибридный белок может быть получен добавлением дополнительного функционального полипептида. Примеры гибридных белков включают гибридные белки с сигнальной последовательностью, такой как метка для локализации, например, Ηίδ6 метка или тус метка, или такой как метка для очистки, например, слитая последовательность С8Т, примеры также включают белки, слитые с последовательностью для направления секреции белков и/или ассоциации с мембраной, но не ограничиваются указанными примерами.
В одном из вариантов полипептид РУН или модифицированные полипептиды РУН могут быть экспрессированы в активной форме, где активация достигается за счет самоактивации полипептида после секреции. В другом варианте протеазы экспрессируются в неактивной, зимогенной форме. Способы по- 78 020818 лучения полипептидов РУН могут включать коэкспрессию одного или нескольких дополнительных гетерологичных полипептидов, которые могут помочь в получении полипептидов РУН. Например, такие полипептиды могут способствовать посттрансляционной модификации полипептидов РУН. Примеры полипептидов включают, но не ограничиваются, пептидазы, которые помогают отщеплять последовательности от предшественника РУН, такие как пропептидная последовательность, и ферменты, которые участвуют в модификации полипептида РУН, например, путем гликозилирования, гидроксилирования, карбоксилирования или фосфорилирования. Пример пептидазы, которая может быть коэкспрессирована с РУН, представляет собой РАСЕ/фурин (или РАСЕ-80Ь), которая способствует отщеплению пропептидной последовательности РУН. Пример белка, который способствует карбоксилированию полипептида РУН, представляет собой варфарин-чувствительный фермент витамин-К-2,3-эпоксидредуктазу (УК0К), который восстанавливает витамин К для использования в качестве кофактора в витамин К-зависимом γкарбоксилировании (АУарН и др., б. Вбо1. СНет. 280 (36) 31603-31607). Субъединица этого фермента, УК0КС1, может быть коэкспрессирована с модифицированным полипептидом РУН для усиления γкарбоксилирования. Один или несколько дополнительных полипептидов могут быть экспрессированы с того же вектора экспрессии, что и полипептид РУН, или с другого вектора.
a. Экспрессия в прокариотах.
Прокариоты, особенно Е. соН, представляют собой системы для получения большого количества РУН (см., например, Р1аббк и др., (2003) Рго1ет Ехр. РигбГ. 31(2): 222-30; и КНаШ/абеН и др., (2004) б. кб МбсгоЬбо1 Вю1ес1то1 31 (2): 63-69). Трансформация Е. соН представляет собой простой и быстрый метод, хорошо известный специалистам в данной области. Векторы экспрессии Е. соН могут содержать индуцибельный промотор, полезный для стимулирования высоких уровней экспрессии белка и для экспрессии белков, которые проявляют токсичность для клеток-хозяев. Примеры индуцибельных промоторов включают 1ас-промотор, бгр-промотор, гибридный бас-промотор, Т7 и 8Р6 РНК промоторы и термочувствительный ХРЪ промотор.
РУН может быть экспрессирован в цитоплазматической среде Е. со1б. Цитоплазма представляет собой восстановительную среду, и для некоторых молекул это может привести к образованию нерастворимых телец включения. Для ресолюбилизации белков могут быть использованы восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол и β-меркаптоэтанол и денатурирующие агенты (например, гуанидин-НС1 и мочевина). Альтернативный подход состоит в экспрессии РУН в периплазматическом пространстве бактерий, которое предоставляет окислительную среду, шаперонинподобные белки и дисульфидизомеразы, что приводит к образованию растворимого белка. Как правило, с экспрессируемым белком сливают лидерную последовательность, которая направляет белок в периплазму. Затем лидерная последовательность удаляется сигнальной пептидазой внутри периплазмы. Примеры лидерных последовательностей, направляющих белки в периплазму, включают лидерную последовательность ре1В гена пектатлиазы и лидерную последовательность гена щелочной фосфатазы. В некоторых случаях периплазматическая экспрессия приводит к утечке экспрессированного белка в культуральную среду. Секреция белков позволяет быстро и просто очистить белки от культурального супернатанта. Не секретируемые белки могут быть получены из периплазмы с помощью осмотического лизиса. Как и при цитоплазматической экспрессии, в некоторых случаях белки могут стать нерастворимыми и для облегчения растворения и рефолдинга белков могут быть использованы денатурирующие агенты и восстановители. Температуры индукции и культивирования также могут влиять на уровень экспрессии и растворимость белков. Как правило, используются температуры между 25 и 37°С. Для увеличения растворимости экспрессированного белка также могут быть использованы мутации. Как правило, бактерии производят агликозилированные белки. Таким образом, если для функционирования белки требуют гликозилирования, то гликозилирование может быть осуществлено ίη уббго после очистки из клетки-хозяина.
b. Дрожжи.
Дрожжи, такие как 8ассНаготусек сегеубкбае, 8ск/окассНаготусек ротЬе, Уагго\\ба 1бро1уббса, К1иууеготусек 1асббк и РбсНба ракбогбк, являются полезными хозяевами систем экспрессии для РУН (см., например, 8коко и др., (2003) В|о1есНно1. Арр1. ВбосНет. 38 (Рб3):257-65). Дрожжи могут быть трансформированы эписомными репликативными векторами или путем стабильной интеграции в хромосомы гомологичной рекомбинацией. Как правило, для регулирования экспрессии генов используются индуцируемые промоторы. Примеры таких промоторов включают промоторы ОАЬ1, ОАЬ7, ОАЬ5 и металлотионеиновые промоторы, такие как СИР1. Для отбора и поддержания трансформированной ДНК векторы экспрессии часто включают селективные маркеры, такие как ЬЕи2, ТКР1, Ш83 и ИКА3. Экспрессируемые в дрожжах белки часто являются растворимыми, а коэкспрессия с шаперонинами, такими как Вбр и протеиндисульфидизомераза, может повысить уровень экспрессии и растворимость белка. Кроме того, экспрессируемые в дрожжах белки могут быть направлены для секреции с использованием слитого сигнального пептида секреции, такого как сигнал секреции фактора альфа-типа спаривания дрожжей из 8ассНаготусек сегеубкбае, и слитого сигнального пептида белков поверхности клетки дрожжей, таких как адгезивный рецептор спаривания Ада2р или глюкоамилаза Агхи1а абетшуогаик. Для удаления слитой последовательности из полипептидов после секреции может быть введен сайт расщепления протеазой
- 79 020818 (например, протеазой Кех-2). Дрожжи также способны к гликозилированию мотива Акη-X-8е^/ΤЬ^.
с. Насекомые и клетки насекомых.
Насекомые и клетки насекомых, в частности, при использовании системы бакуловирусной экспрессии полезны для экспрессии полипептидов, таких как ΡΥΙΙ или его модифицированные формы (см., например, Миге!а и др., (2003) I. ¥еЬ Мей. 8ск 65 (2):219-23). Клетки насекомых и личинки насекомых экспрессируют высокие уровни белка, в том числе экспрессируют в гемолимфе, и способны осуществлять большинство посттрансляционных модификаций высших эукариот. Бакуловирусы имеют ограниченный диапазон хозяев, что повышает безопасность и снижает нормативные ограничения, присущие системам эукариотической экспрессии. Как правило, в векторах экспрессии для высокого уровня экспрессии белка используют промотор полиэдрина бакуловируса. Обычно используемые бакуловирусные системы включают такие бакуловирусы, как вирус ядерного полиэдроза АнЮдгарЬа саПГописа (АсNРΥ) и вирус ядерного полиэдроза ВотЪух топ (ВтNРΥ), и линии клеток насекомых, такие как 8Г9, полученные из 8ройор!ега Ггидрегйа, Ркеийа1еЬа итрите1а (А78) и □аш-шк р1ех1ррик (Юр^1). Для достижения высокого уровня экспрессии нуклеотидную последовательность молекулы, которая будет экспрессирована, сливают непосредственно после инициаторного кодона полиэдрина вируса.
Сигналы секреции млекопитающих точно процессируются в клетках насекомых и могут быть использованы для секреции экспрессированного белка в культуральную среду. Кроме того, клеточные линии Ркеийа1еЬа ишрите1а (А78) и □аш-шк р1ех1ррик (ЭрМ) производят белки, гликозилирование которых похоже на гликозилирование в клеточных системах млекопитающих. Альтернативной системой экспрессии в клетках насекомых является использование стабильно трансформированных клеток. Для экспрессии могут быть использованы такие клеточные линии, как 8сЬтейег 2 (82) и Кс клетки (ЭгокорНПа те1агюдак1ег) и С7 клетки (Аейек а1Ъорю1ик). Для достижения высокого уровня экспрессии в присутствии тяжелых металлов может быть использован промотор металлотионеина дрозофилы с индукцией кадмием и медью. Векторы экспрессии, как правило, поддерживают за счет использования селективных маркеров, таких как неомицин и гигромицин.
ά. Клетки млекопитающих.
Для экспрессии полипептидов ΡΥΙΙ могут быть использованы системы экспрессии млекопитающих. Экспрессионные конструкции могут быть введены в клетки млекопитающих посредством вирусной инфекции, например, с помощью аденовируса, или путем прямого переноса ДНК, например, с помощью липосом, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана и физических методов, таких как электропорация и микроинъекция. Векторы экспрессии для клеток млекопитающих обычно включают сайт кэпирования мРНК, ТАТА-бокс, последовательность инициации трансляции (консенсусную последовательность Козака) и элементы полиаденилирования. Такие векторы для достижения высокого уровня экспрессии часто включают промоторы и энхансеры транскрипции, например промотор-энхансер 8Υ40, промотор цитомегаловируса человека (СМ¥) и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (Κ8Υ). Указанные промоторы-энхансеры действуют во многих типах клеток. Также для экспрессии могут быть использованы тканеспецифичные и специфичные к определенным типам клеток промоторные и энхансерные районы. Примеры промоторных/энхансерных районов включают, но не ограничиваются, районы из таких генов, как ген эластазы Ι, ген инсулина, гены иммуноглобулинов, промоторный/энхансерный район вируса опухоли молочной железы мыши, геном альбумина, геном α-фетобелка, α-1-антитрипсина, β-глобина, основного белка миелина, легкой цепи-2 миозина и гонадотропного рилизинг-гормона. Для отбора и поддержания клеток с экспрессионными конструкциями могут быть использованы селективные маркеры. Примеры селективных маркеров включают, но не ограничиваются, гены гигромицинфосфотрансферазы, аденозиндезаминазы, ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы, аминогликозидфосфотрансферазы, дигидрофолатредуктазы и тимидинкиназы. Гибридные белки с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как ТСК-ζ и Ρ^ΚΙ-γ, могут непосредственно экспрессироваться в активном состоянии на поверхность клеток.
Для экспрессии в млекопитающих доступны многие клеточные линии, включая клетки мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомяка. Примеры линий клеток включают, но не ограничиваются ВНК (т.е. клетками ВНК-21), 293-Ρ, СНО, Ва1Ъ/3Т3, НеЬа, МТ2, мышиными N80 (не секретирующие) и другими клеточными линиями миеломы, гибридомными и гетерогибридомными клеточными линиями, лимфоцитами, фибробластами, 8Р2/0, С08, №Н3Т3, НЕК293, 2938, 293Т, 2В8 и НКВ клетками. Также доступны адаптированные к бессывороточной среде клеточные линии, что облегчает очистку секретируемых белков из культуральной среды. Одним из таких примеров является бессывороточная линия клеток ЕВNА-I (РЬат и др., (2003) Вю1ес1то1 Вюе^. 84:332-42).
Экспрессия рекомбинантных полипептидов ΡΥΙΙ, имеющих одинаковую структуру и посттрансляционные модификации с ΡΥΙΙ плазмы, известна в уровне техники (см., например, .Би'ктйег и др., (2003) 8етт ТЬгот Неток1). Также известны способы оптимизации экспрессии витамин К-зависимых белков. Например, добавление витамина К в культуральную среду или коэкспрессия витамин К-зависимой γкарбоксилазы (АарН и др., I. Вю1. СЬет. 280 (36) 31603-31607) могут способствовать посттрансляционным модификациям витамин К-зависимых белков, таких как полипептиды ΡΥΙΙ.
- 80 020818
е. Растения.
Трансгенные клетки растений и растения могут быть использованы для экспрессии РУН. Экспрессионные конструкции, как правило, переносят в растения с использованием прямого переноса ДНК, такого как бомбардировка микрочастицами и РЕ0-опосредованный перенос в протопласты, или с использованием агробактериальной трансформации. Векторы экспрессии могут включать промоторные и энхансерные последовательности, элементы терминации транскрипции и элементы контроля трансляции. Векторы экспрессии и методы трансформации, как правило, отличаются для двудольных хозяев, таких как арабидопсис и табак, и однодольных хозяев, таких как кукуруза и рис. Примеры промоторов растений, используемых для экспрессии, включают промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор нопалинсинтазы, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы и промотор убиквитина и ЫВ93. Для облегчения отбора и поддержания трансформированных клеток часто используют селективные маркеры, такие как гигромицин, фосфоманнозоизомераза и неомицинфосфотрансфераза. Трансформированные клетки растений можно поддерживать в культуре в виде клеток, агрегатов (каллусной ткани) или регенерировать в целые растения. Поскольку растения обладают другими формами гликозилирования, чем клетки млекопитающих, это может повлиять на выбор этих хозяев для производства РУН. Трансгенные клетки растений также могут включать генетически модифицированные водоросли, предназначенные для производства белков (см., например, МауНеЫ и др., (2003) ΡNА3 100:438-442).
2. Способы очистки.
Способы очистки полипептидов РУН из клетки-хозяина зависят от выбранной клетки-хозяина и системы экспрессии. В случае секреции белки, в общем, являются очищенными из культуральной среды после удаления клеток. В случае внутриклеточной экспрессии клетки могут быть лизированы, и белки очищают из экстракта. Если для экспрессии используют трансгенные организмы, такие как трансгенные растения и животные, в качестве исходного материала для получения экстракта лизированных клеток могут быть использованы ткани или органы. Кроме того, получение белков в трансгенных животных может включать получение полипептидов в молоке или яйцах, которые могут быть собраны, и затем при необходимости белки могут быть выделены и очищены с использованием стандартных способов, известных в уровне техники.
РУН может быть очищен с использованием стандартных способов очистки белков, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь ЗОЗ-РАОЕ, эксклюзионной хроматографией и хроматографией по размеру, осаждением сульфатом аммония, хелатной хроматографией и ионообменной хроматографией. Например, полипептиды РУН могут быть очищены анионообменной хроматографией. Примером способа очистки полипептида РУН является использование ионообменной колонки, которая позволяет связать любой полипептид, который имеет функциональный домен 01а, и последующее элюирование в присутствии кальция (см., пример 2). Для повышения выхода и чистоты препаратов также могут быть использованы методы аффинной очистки. Например, для аффинной очистки могут быть использованы антитела, рецепторы и другие молекулы, которые связывают РУН. В другом примере очистка также может быть улучшена при использовании аффинной колонки с растворимым ТФ (рТФ) (Маип и др., (2005). Рго!. Зск 14:1171-1180). В экспрессионных конструкциях к белку может быть добавлена аффинная метка, такая как тус эпитоп, слитая последовательность 0ЗТ или Н1к6, и аффинная очистка может быть проведена с помощью тус антител, смолы с глутатионом и №-смолы соответственно. Чистота может быть оценена любым способом, известным в уровне техники, включая гель-электрофорез, окрашивание и спектрофотометрические методы.
Протеаза РУН может быть экспрессирована и очищена в неактивной форме (зимогенной форме) либо экспрессированная протеаза может быть очищена в активной форме, например, после автокатализа. Например, ш νίίτο могут быть получены полипептиды РУН, которые были активированы через протеолитическое расщепление Агд152-Не153 (т.е. РУНа, двухцепочечная форма). Полипептиды РУН могут быть получены по любому из способов, описанных в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь получением в клетках млекопитающих с последующей очисткой. Расщепление полипептидов РУН с образованием активной формы протеазы РУНа может быть выполнено несколькими способами. Например, при инкубации с фосфолипидными везикулами в присутствии кальция в течение 45 мин может быть достигнута самоактивация (№1кек!иеп и др., (2001) 1. ΒίοΙ. Сйет. 276:39825-31). Полипептиды РУН также могут быть полностью активированы посредством инкубации с фактором Ха, фактором ХНа или ТФ в присутствии кальция, в присутствии или в отсутствие фосфолипидов (см. пример 2 и Вго/е и др., (1980)
1. Вю1. Сйет. 255:1242-1247, ШдакЫ и др., (1996) 1. Вю1. Сйет. 271:26569-26574, Науеу и др., 1. Вю1. Сйет. 278:8363-8369).
3. Гибридные белки.
Также предусмотрены гибридные белки, содержащие модифицированный полипептид РУН и один или нескольких других полипептидов. Предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие такие гибридные белки, составленные для введения подходящим путем. Гибридные белки получают соединением в любом порядке модифицированного полипептида РУН и агента, такого как антитело или его фрагмент, фактор роста, рецептор, лиганд и другие подобные агенты для облегчения очистки полипептида РУН, изменения фармакодинамических свойств полипептида РУН, для направления полипепти- 81 020818 да РУП, например, направления полипептида в целевые клетки или ткани и/или для увеличения экспрессии или секреции полипептида РУЛ. Как правило, любой гибридный белок РУЛ сохраняет по меньшей мере приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% коагулянтной активности по сравнению с не гибридным полипептидом РУЛ, в том числе 96, 97, 98, 99% или более коагулянтной активности по сравнению с не гибридным полипептидом.
Связь полипептида РУЛ с другим полипептидом может быть осуществлена непосредственно или через линкер. В одном примере связь может представлять собой химическую связь, например связь через гетеробифункциональный агент, тиоловую связь или другую такую связь. Гибридные белки также могут быть получены с помощью рекомбинантной методики. Слитый с полипептидом РУЛ другой полипептид может быть присоединен на Хконце или С-конце полипептида РУЛ. Не ограничивающие примеры полипептидов, которые могут быть использованы для получения гибридных белков с полипептидом РУЛ по настоящему изобретению, включают, например, полипептид С8Т (глутатион 8-трансферазу), Рс домен иммуноглобулина С или гетерологичную сигнальную последовательность. Гибридные белки могут содержать дополнительные компоненты, такие как связывающий мальтозу белок Е. тоП (МВР), которые способствуют поглощению белка клетками (см., международную заявку РСТ \У0 01/32711).
Гибридный белок может быть получен стандартными рекомбинантными методами. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные последовательности полипептидов, могут быть лигированы друг с другом с совпадением рамки считывания в соответствии с обычными способами, например с использованием тупых или липких концов для лигирования, расщепления эндонуклеазой рестрикции для обеспечения соответствующих концов, заполнения липких концов в соответствующих случаях, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного лигирования и ферментативного лигирования. В другом варианте гибридные гены могут быть синтезированы обычными способами, включая автоматизированный синтез ДНК. Кроме того, ПЦР-амплификация фрагментов генов может осуществляться с использованием праймеров, которые приводят к комплементарным одноцепочечным участкам между двумя последовательными фрагментами гена, которые затем могут быть отожжены и реамплифицированы для создания последовательности химерного гена (см., например, Ли8иЬе1 и др., СнггеШ Ρτοΐο^ΐδ Ιη Μο^υ^ί Βίοίοβν. (изд.) ΐοΐιη \УПеу & 8οηδ, 1992). Кроме того, доступны многие векторы экспрессии, которые уже кодируют гибридный фрагмент (например, полипептид С8Т). Кодирующая РУЛ нуклеиновая кислота может быть клонирована в таком векторе экспрессии, причем гибридный фрагмент может быть связан с протеазой с совпадением рамки считывания.
4. Модификации полипептидов.
Модифицированные полипептиды РУЛ могут быть получены в виде посттрансляционно немодифицированных полипептидных цепей или в виде комплекса. Для некоторых целей может быть предпочтительным получение модифицированного РУЛ в посттрансляционно немодифицированном виде без посттрансляционных или других химических модификаций. Немодифицированные посттрансляционно полипептидные цепи могут быть получены в подходящих хозяевах, которые не осуществляют посттрансляционную модификацию РУЛ. Такие полипептиды также могут быть получены в ίη νίΐτο системах и с использованием химического синтеза полипептидов. Для других целей могут быть желательны специфические модификации, включая пегилирование, альбуминирование, гликозилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, фосфорилирование или другие известные модификации. Модификации могут быть введены ίη νίΐτο или, например, при получении модифицированных РУЛ в подходящем хозяине, который производит такие модификации.
5. Нуклеотидные последовательности.
В настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие РУЛ или модифицированные полипептиды РУЛ. Молекулы нуклеиновых кислот включают аллельные варианты или варианты сплайсинга любого закодированного полипептида РУЛ. Примеры предусмотренных здесь молекул нуклеиновых кислот включают любые молекулы, которые кодируют модифицированные полипептиды РУЛ по настоящему документу, такие как любые молекулы, кодирующие полипептиды, приведенные в любой из 8ЕС ГО N0: 113-273. В одном из вариантов, молекулы нуклеиновой кислоты, предусмотренные в настоящем документе, по меньшей мере на 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 или 99% идентичны по последовательности любой нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид РУЛ, предусмотренный в настоящем документе, или гибридизуются в условиях средней или высокой жесткости по меньшей мере на 70% полной длины с любой нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид РУЛ, предусмотренный в настоящем документе. В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты могут включать молекулы с вырожденными кодонами, кодирующие любой из предусмотренных полипептидов РУЛ.
Р. Оценка активности модифицированных полипептидов РУЛ.
Активности и свойства полипептидов РУЛ можно оценить ίη νίΐτο и/или ίη νίνο. Анализы для такой оценки известны специалистам в данной области, а также известна корреляция измеренной активности и терапевтического результата и ίη νίνο активности. В одном примере варианты РУ11 могут быть оценены по сравнению с немодифицированным РУЛ и/или РУЛ дикого типа. В другом примере активность модифицированного полипептида РУЛ может быть оценена после экспозиции ίη νίΐτο или ίη νίνο с АТ-ΙΙΙ и
- 82 020818 сравнена с активностью модифицированного полипептида РУП, который не был подвержен действию АТ-ΙΙΙ. Такие анализы могут быть выполнены в присутствии или в отсутствие ТФ. Ιη νίίΓο анализы включают любые лабораторные анализы, известные специалистам в данной области, такие как, например, анализы с использованием клеток, в том числе анализы на коагуляцию, анализы на связывание, белковые анализы и молекулярно-биологические анализы. Ιη νίνο анализы включают тестирование РУП на животных моделях, а также введение РУП человеку. В некоторых случаях активность РУП ίη νίνο может быть определена на основе оценки крови, сыворотки или других жидкостей организма. Варианты РУП также могут быть исследованы ίη νίνο для оценки их активности или свойств, таких как терапевтический эффект.
Как правило, анализы, описанные здесь, проводят на двухцепочечной активированной форме РУП, т.е. РУПа. Такие анализы также могут быть выполнены на одноцепоченой форме в качестве отрицательного контроля, поскольку такая форма, как правило, не обладает протеолитической или каталитической активностью, необходимой для коагулянтной активности РУП. Кроме того, такие анализы также могут быть выполнены в присутствии кофакторов, таких как ТФ, которые в некоторых случаях увеличивают активность РУП.
1. Ιη νίίΓο анализы.
Примеры ίη νίίΓο анализов включают анализы для оценки модификаций и активности полипептидов. Модификации могут быть оценены с помощью ίη νίίτο анализов для оценки γ-карбоксилирования и других посттрансляционных модификаций, белковых анализов и конформационных анализов, известных в уровне техники. Анализы для определения активности включают, но не ограничиваются оценкой взаимодействия РУЛ с другими факторами свертывания, такими как ТФ, фактор Х и фактор ЕХ, протеолитическими анализами для определения протеолитической активности полипептидов РУП, анализами для определения связывания и/или аффинности полипептидов РУП к фосфатидилсерину и другим фосфолипидам и анализами с использованием клеток для определения влияния полипептидов РУП на коагуляцию.
Концентрации модифицированных полипептидов РУП могут быть оценены хорошо известными в уровне техники способами, включая, но не ограничиваясь, иммуноферментный анализ (ИФА), 8Ό8ΡΑΟЕ, методы Брэдфорда, Лоури, ВСА (бицинхониновая кислота); измерение УФ-поглощения, а также другие методы количественного мечения белка, включая, но не ограничиваясь, иммунологические методы, связанные с радиоактивностью методы, флуоресцентные и связанные с ними методы.
Оценка продуктов расщепления протеолитических реакций, в том числе оценка расщепления полипептидов РУП или оценка содержания продуктов протеолитической активности РУП, может быть выполнена с использованием способов, включающих, но не ограничивающихся расщеплением хромогенного субстрата, ВЭЖХ, 8П8-анализом, ИФА, иммуноблоттингом, иммуногистохимическим анализом, иммунопреципитацией, определением последовательности с ИН2-конца и мечением белка. Также могут быть оценены структурные свойства модифицированных полипептидов РУП. Например, для оценки трехмерной структуры полипептидов РУП и/или других свойств полипептидов РУП, таких как связывание Са2+ или кофактора, могут быть использованы рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) модифицированных полипептидов РУП. Кроме того, наличие и степень деградации РУП может быть измерена с помощью стандартных способов, таких как электрофорез полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8^8-ΡΑΟЕ) и иммуноблоттинг подвергнутых электрофорезу РУП-содержащих образцов. В полипептидах РУП, которые подверглись воздействию протеазы, может быть также определена последовательность с Ν-конца для определения местонахождения сайтов расщепления или изменения в сайтах расщепления в модифицированных полипептидах РУП.
а. Посттрансляционные модификации.
Полипептиды РУП также могут быть оценены на наличие посттрансляционных модификаций. Такие анализы известны в уровне техники и включают анализы для оценки гликозилирования, гидроксилирования и карбоксилирования. Например, для анализа гликозилирования может быть выполнен анализ углеводов, например, совместно с 8^8-ΡΑΟЕ анализом полипептидов РУП, подвергнутых гидразинолизу или обработанных эндогликозидазой. Гидразинолиз при инкубации белка с безводным гидразином приводит к отделению Ν- и О-связанных гликанов от гликопротеина, а обработка эндогликозидазой ПНГазой Р приводит к отделению большей части Ν-гликанов из гликопротеина. Г идразинолиз или обработка эндогликозидазой полипептидов РУП приводит к образованию восстанавливающего конца, который может быть помечен флуорофорной или хромофорной меткой. Меченые полипептиды РУП могут быть проанализированы флуорофорным электрофорезом углеводов (РΑСЕ). Флуоресцентное мечение гликанов также может быть использовано при анализе моносахаридов, профилировании или анализе особенностей структуры сложных паттернов гликозилирования с помощью ВЭЖХ. Примеры ВЭЖХ включают гидрофильную хроматографию, хроматографию электронного взаимодействия, ионообменную, гидрофобную хроматографию и гель-хроматографию. Примеры меток для гликанов включают, но не ограничиваются 3-(ацетиламино)-6-аминоакридином (АА-АС) и 2-аминобензойной кислотой (2-АА). Углеводные фрагменты также могут быть обнаружены с использованием специфических антител, которые рас- 83 020818 познают гликозилированный полипептид РУН.
Пример анализа для оценки β-гидроксилирования включает обратнофазный ВЭЖХ анализ полипептидов РУН, которые были подвергнуты щелочному гидролизу (Рг/у51еск| и др., (1987) 84:7856-7860 Р^8).
Карбоксилирование и γ-карбоксилирование полипептидов РУН может быть оценено с использованием масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбционной ионизацией и определением времени пролета (МАЬОПТОР), как описано в уровне техники (см., например, Натуеу и др., ί. Вю1. СНет. 278: 8363-8369, Маип и др., Рто! 80 14:1171-0 1180). Τакже может быть оценено взаимодействие полипептидов РУН, содержащих пропептидную последовательность (про-РУН), с карбоксилазой, ответственной за посттрансляционное γ-карбоксилирование. Константа диссоциации (Кг) может быть измерена после инкубации карбоксилазы с флуоресцеин-меченым про-РУН полипептидом путем определения количества связанной карбоксилазы по анизотропии (Ьш и др. (2004) ί. Вю1. СНет. 279: 6560-6566).
b. Протеолитическая активность.
Модифицированные полипептиды РУН могут быть оценены на протеолитическую активность. Протеолитическая активность РУН может быть измерена с помощью хромогенных субстратов, таких как СНгопю/лт 1-РА (Ме802-О-Рйе-О1у-Атд-рт), 8-2288 (Н-О-Пе-Рто-Атд-рт), 8-2266 (Н-О-Уа1-Ьеи-АгдрNА), 8-2765 (Ζ-^-А^д-О1у-А^д-рNА), 8рес1го/уте РХа и 8рес1го/уте РУПа (СН3802-0-СНА-Ви1-АгдрNА). Полипептиды РУН в присутствии ΤΦ или в отсутствие ΤΦ инкубировали с различными концентрациями хромогенного субстрата. Расщепление субстрата можно контролировать по оптическому поглощению, а скорость гидролиза субстрата можно определить линейной регрессией с использованием доступного программного обеспечения. Активация полипептидом РУН субстратов факторов свертывания, таких как РХ, также может быть оценена. РУН полипептиды, предварительно инкубированные с ΤΦ или не инкубированные с ΤΦ, инкубировали с очищенным РХ (коммерчески доступен). Количество активного РХа, полученного в результате инкубации с полипептидом РУН, определяется как активность РХа по отношению к хромогенному субстрату, такому как 8-2222 или 8рес!таНиог РХа (СН3802-0-СНАО1у-АТд-АМС.Ас0Н), которую измеряли по изменению абсорбции (Натуеу и др., ί. Вю1. СНет. 278:8363-8369, см. также пример 4 ниже). Τакже при инкубации РУН и РХ может быть включен источник фосфолипидов (№15е5!иеп и др., (2001) ί. Вю1. СНет. 276:39825-31).
c. Коагулянтная активность.
Коагулянтная активность полипептидов РУН может быть оценена с помощью известных в уровне техники анализов. Примеры анализов включают, но не ограничиваются двухэтапным анализом свертывания (ЫеЪтап и др., (1985) 82:3879-3883 ΡNА8); анализом протромбинового времени (ПВ, которое может быть показателем ΤΦ-зависимой активности РУПа во внешнем пути); модификациями анализа ПВ; активированным частичным тромбопластиновым временем (ΑЧΤВ, которое может быть показателем ΤΦ-независимой активности РУПа); активированным временем свертывания (АВС); рекальцифицированным активированным временем свертывания; временем свертывания Ли-Уайта или тромбоэластографией (НЭГ) (Рн5а1ег1 и др., (2005) Стйса1 Саге 9: 815-824.). Например, коагулянтная активность модифицированного полипептида РУН может быть определена с помощью анализа ПВ, в котором РУН разводят в РУП-дефицитной плазме и смешивают с реагентом для определения протромбинового времени (рекомбинантный ΤΦ с фосфолипидами и кальцием), например, доступным под названием Iηηоν^η™ от Эайе ВеНппд. Образование сгустка определяют оптически, находят требующееся для образования сгустка время и сравнивают его с временем для РУП-дефицитной плазмы.
Г. Связывание и/или ингибирование другими белками и молекулами.
Для измерения устойчивости модифицированных полипептидов РУН к ингибиторам РУН, таким как, например, ΑΤ-ΙΙΙ и ТРРЕ или молекулам, таким как Ζη2', могут быть использованы анализы ингибирования. Τакже может быть проведена оценка ингибирования другими ингибиторами, которые включают, но не ограничиваются другими ингибиторами сериновых протеаз и РУП-специфическими антителами. Ингибирование может быть оценено, например, после инкубации ΑΤ-ΙΙΙ, ΤРΡI или Ζη2' с полипептидами РУЛ, которые предварительно инкубировали с ΤΦ и/или без ΤΦ. Активность РУН может быть измерена с помощью одного или нескольких анализов активности или анализов коагуляции, описанных выше, и ингибирование ΑΤ-ΙΙΙ, ТРРН или Ζη2+ можно оценить путем сравнения активности полипептидов РУН, которые инкубировали с ингибитором, с активностью полипептидов РУН, которые не инкубировали с ингибитором.
Полипептиды РУН могут быть оценены на связывание с другими факторами коагуляции и ингибиторами. Например, прямое и непрямое взаимодействие РУН с кофакторами, такими как ΤΦ, субстратами, такими как РХ и РРХ, и ингибиторами, такими как антитромбин ΙΙΙ, ΤРΡI и гепарин, может быть оценено с использованием каких-либо анализов связывания, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь иммунопреципитацией, колоночной очисткой, невосстанавливающим 808-РАСЕ, анализами Высоте®, поверхностным плазмонным резонансом (8РН), флуоресцентным резонансным переносом энергии (РКЕТ), поляризацией флуоресценции (РР), изотермическим калориметрическим титрованием ОТС), круговым дихроизмом (КД), анализом на комплементацию фрагментов белка (РСА), ядерным
- 84 020818 магнитным резонансом (ЯМР), рассеянием света, седиментационным равновесием, гель-фильтрацией с малыми зонами, торможением в геле, фар-вестерн блоттингом, поляризацией флуоресценции, гидроксилрадикальным футпринтингом белка, фаговым дисплеем, а также различными двухгибридными системами. В одном примере связывание Ζη оценивают с помощью равновесного анализа (Ре!егкеп и др., (2000) Рго! 8с1 9:859-866).
е. Аффинность к фосфолипидам.
Связывание и/или аффинность модифицированных полипептидов РУН к фосфатидилсерину (ФС) и другим фосфолипидам могут быть определены с помощью хорошо известных в уровне техники анализов. Высокочистые фосфолипиды (например, ФС крупного рогатого скота в известной концентрации и яичный фосфатидилхолин (ФХ)), которые являются коммерчески доступными, например, от 81дта, и растворены в органическом растворителе, могут быть использованы для получения малых однослойных фосфолипидных везикул. Связывание полипептида РУН с этими ФС/ФХ везикулами может быть оценено по относительному рассеянию света под углом 90° к падающему свету. Для определения константы диссоциации измеряют интенсивности рассеяния света на ФС/ФХ везикулах и на ФС/ФХ/РУП везикулах (Нагуеу и др., 1 Вю1. СНет. 278:8363-8369). Поверхностный плазмонный резонанс, например, измеренный на биосенсоре ВТАсоге, также может быть использован для измерения сродства полипептидов РУН к фосфолипидам мембран (8ип и др., В1оо6 101: 2277-2284).
2. Модели на животных, не включающих человека.
Модели на животных, не включающих человека, могут быть использованы для оценки активности, эффективности и безопасности модифицированных полипептидов РУН. Например, животные, не включающие человека, могут быть использованы для моделирования заболевания или состояния. Животные, не включающие человека, могут быть инъецированы веществом, вызывающим заболевание и/или индуцирующим фенотип, затем животному может быть введен вариант РУН, такой как любой вариант РУН, приведенный в любом из 8ЕЦ ГО N0: 113-273, и может быть проведен мониторинг воздействия полипептида на развитие заболевания. Генетические модели также являются полезными. Могут быть получены животные, такие как мыши, которые в результате гиперэкспрессии, недостаточной экспрессии или нокаута одного или нескольких генов имитируют заболевания или состояния, например, могут быть получены мыши с нокаутом фактора УШ, которые проявляют гемофилию А (Βΐ и др., (1995) Оеп 10: 119-121). Такие животные могут быть получены согласно технологии получения трансгенных животных, хорошо известной в уровне техники, или с использованием природных или индуцированных мутантных штаммов. Примеры полезных моделей заболеваний, связанных с РУН, на животных, не включающих человека, включают, но не ограничиваются моделями нарушений свертываемости крови, в частности, моделями гемофилии или тромбоза. Модели травмы на животных, не включающих человека, также могут быть использованы для оценки активности полипептидов РУН, такой как коагулянтная активность. Указанные модели на животных, не включающих человека, могут быть использованы для мониторинга активности вариантов РУН по сравнению с полипептидом РУН дикого типа. Модели на животных также могут быть использованы для мониторинга стабильности, периода полураспада и клиренса модифицированных полипептидов РУН. Такие анализы полезны для сравнения модифицированных полипептидов РУН и для расчета доз и режима дозирования для дальнейших исследований на животных и человеке. Например, модифицированный полипептид РУН, такой как любой вариант РУН, предусмотренный в настоящем документе, в том числе, например, любой полипептид, приведенный в любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 113-273, может быть введен в хвостовую вену мыши. Затем через определенные интервалы времени после инъекции могут быть отобраны образцы крови (например, через минуты, часы и дни после введения), и в образцах, включающих, но не ограничивающихся сывороткой или плазмой, через определенные интервалы времени после введения может быть определен уровень модифицированных полипептидов РУН, например, с помощью ИФА или радиоиммуноанализа. Образцы крови, отобранные через определенные интервалы времени после инъекции полипептидов РУН, также могут быть исследованы на коагулянтную активность с использованием различных способов, таких как описанные в примере 9. Указанные фармакокинетические исследования могут предоставить информацию о полураспаде, клиренсе и стабильности полипептидов РУН, которая может помочь в определении подходящих доз для введения прокоагулянта.
Модифицированный полипептид РУН, такой как любой полипептид, приведенный в любой из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 113-273, может быть проверен на терапевтическую эффективность в моделях на животных для гемофилии. В одном не ограничивающем примере могут быть использованы модели на животных, таких как мыши. Мышиные модели гемофилии, имеющиеся в уровне техники, могут быть использованы для тестирования модифицированных полипептидов РУН. Например, мышиная модель гемофилии, получаемая путем инъекции анти-РУШ антител, может быть использована для оценки коагулянтной активности полипептида РУН (см. пример 6 и ТгапНо1т и др., В1оо6 (2003) 102:3615-3620). Мышиная модель гемофилии В также может быть использована для тестирования полипептидов РУН (МагдагШк и др., (2004). 1 С1ш. Шуей 113:1025-1031). Также существуют не мышиные модели нарушений свертываемости крови. Активность полипептида РУН может быть оценена на крысах с индуцированным варфарином кровотечением или индуцированным мелатраном кровотечением (Этекк и др.,
- 85 020818 (1992) ТНготЬ Кек 67:233-241, Е1§ и др., (2001) ТНготЬ Кек 101:145-157) и на кроликах с индуцированным гепарином кровотечением (СНсп и др., (2003) 1. ТНготЬ. Ηаетοкΐ 1: 760-765). Инбредные собаки с гемофилией А, гемофилией В и болезнью Виллебранда, которые проявляют сильные кровотечения, также могут быть использованы в исследованиях полипептида РУЛ (ΒπηΚΙιοιικ и др., (1989) 86:1382-1386 РNΑ§)· Активность полипептидов РУН также может быть оценена в модели кровотечения на кролике с тромбоцитопенией, индуцированной сочетанием γ-облучения и использования антител против тромбоцитов (ΓΐΉηΗο^ и др., (2003) ТНготЬ Кек 109: 217-223).
В дополнение к животным с генерализованными нарушениями свертываемости крови для оценки активности полипептидов РУН, их безопасности и эффективности в качестве терапевтических коагулянтов также могут быть использованы модели ранения и травмы. Не ограничивающие примеры таких моделей включают модель коронарного стеноза на кролике (Έ;·ιΙοπιΠο и др., (2004). Сам. 1. АиаекШ 51: 672679), модель травмы печени У класса у свиней (Ьуии и др., (2002) 1. Тгаита 52:703-707), модель травмы печени У класса у свиней (ΜηΓίίηο^ίΙζ и др., (2001) 1. Тгаита 50: 721-729) и модель аортотомии у свиней ^иНсси и др., (2004) 81юск 22: 163-168).
3. Клинические анализы.
Для оценки активности РУН для клинического использования доступно множество анализов. Такие анализы могут включать оценку коагуляции, стабильности белков и периода полураспада ίη νίνο и фенотипические анализы. Фенотипические анализы и тесты для оценки терапевтического эффекта лечения фактором РУН включают оценку уровня РУН в крови (например, измерение уровня РУН в сыворотке до введения и через определенные интервалы времени после введения, в том числе после первого введения, непосредственно после последнего введения и в определенные моменты времени между ними с поправкой на индекс массы тела (ИМТ)), оценку свертывания крови после лечения РУН ίη νίίτο с использованием способов, описанных выше (например, ПВ анализ), и фенотипический ответ на лечение РУН, включая улучшение симптомов во времени по сравнению с субъектами, которым вводили немодифицированный РУН и/или РУН дикого типа или плацебо. У пациентов, получавших полипептид РУН, можно оценить потерю крови, потребность в переливании и уровень гемоглобина. Пациенты могут наблюдаться регулярно в течение определенного периода времени при регулярных или повторных введениях или после введения в ответ на острую необходимость, такую как кровотечение, травма или хирургическое вмешательство.
О. Композиции и введение.
В настоящем документе предусмотрены композиции для использования в лечении нарушений свертываемости крови. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество полипептида фактора УН, как описано здесь. Эффективные концентрации полипептида РУН или его фармацевтически приемлемого производного смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или средой для системного, местного или локального введения.
Количество соединения эффективно для лечения выбранного расстройства. Концентрация активного вещества в композиции зависит от поглощения, инактивации, экскреции активного соединения, графика дозирования и количества ведений, а также от других факторов, известных специалистам в данной области. Фармацевтические носители или среды, пригодные для применения соединений, предусмотренных в настоящем документе, включают носители, известные специалистам в данной области, подходящие для определенного способа введения. Фармацевтические композиции, которые включают терапевтически эффективное количество полипептида РУН, описанного в настоящем документе, также могут быть предусмотрены в виде лиофилизированного порошка, который может быть восстановлен, например, стерильной водой, непосредственно перед введением.
1. Композиции.
Фармацевтические композиции, содержащие модифицированный РУН, могут быть составлены любым обычным способом путем смешивания выбранного количества полипептида с одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями или наполнителями. Выбор носителя или наполнителя находится в пределах компетенции специалиста в данной области и может зависеть от целого ряда параметров. К ним относятся, например, способ введения (например, системный, оральный, назальный, легочный, местный, локальный или любой другой способ) и подвергаемое лечению расстройство. Фармацевтические композиции, предусмотренные в настоящем документе, могут быть составлены для введения одной дозой (непосредственно) или для разведения или других модификаций. Концентрации соединений в композиции являются эффективными для доставки такого количества соединения, которое после введения является эффективным для предусмотренного лечения. Как правило, композиции составлены для введения одной дозой. Для получения композиции навеску, рассчитанную как массовая доля соединений или их смеси, растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают в выбранном носителе в эффективной концентрации, такой, что подвергающееся лечению состояние улучшается или уменьшается. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть включены в композицию для введения субъекту в виде двухцепочечного белка РУНа. Модифицированные полипептиды РУН могут быть активированы до включения в композицию любым способом, известным в уровне техники. Например, РУН может пройти самоактивацию в процессе очистки с
- 86 020818 помощью ионообменной хроматографии ОигЬтйег и др., (2001) 8етт ТЬготЪ Неток! 27:373-384). Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ также могут быть активированы путем инкубации с иммобилизованным на шариках ΡXа (КетЪа11-Соок и др., (1998) I. Вю1. СЬет. 273:8516-8521) или любыми другими способами, известными в уровне техники (см. также пример 2 ниже). Введение кальция в среду при этих процессах обеспечивает полную активацию и правильный фолдинг модифицированного белка ΡΥΙΙ-. Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, предусмотренные в настоящем документе, также могут быть введены в композицию для введения в виде одноцепоченого белка. Одноцепочечные полипептиды ΡΥΙΙ могут быть очищены таким образом, чтобы предотвратить расщепление (см., например, И86677440). Модифицированные полипептиды ΡΥΙΙ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть введены в композицию с соответствующей селективной средой, предотвращающей или контролирующей самоактивацию, так что одноцепоченая и двухцепочечная формы содержатся в фармацевтической композиции в любом соотношении. Соединение может быть суспендировано в микронизированной или другой подходящей форме или может быть изменено для получения более растворимого активного продукта. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе предусмотренного способа введения и растворимости соединения в выбранном носителе или среде. Полученные смеси представляют собой растворы, суспензии, эмульсии и другие подобные смеси, а также могут быть получены в виде неводной или водной смеси, крема, геля, мази, эмульсии, раствора, эликсира, лосьона, суспензии, настойки, пасты, пены, аэрозоля, состава для промывания, спрея, свечей, бинтов или любой другой композиции, подходящей для системного, местного или локального введения. Для местного внутреннего введения, такого как внутримышечное, парентеральное или внутрисуставное введение, полипептиды могут быть введены в композицию в виде раствора, суспензии в среде на водной основе, такой как изотоничный буферный раствор, или введены в композицию в сочетании с биосовместимым носителем или биоадгезивным материалом, предназначенным для внутреннего введения. Эффективная концентрация достаточна для улучшения состояния, на которое направлено лечение, и может быть определена эмпирически. Для составления композиции навеску соединения растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают с выбранным носителем с достижением эффективной концентрации, такой, что выбранное состояние улучшается или уменьшается.
Как правило, фармацевтически приемлемые композиции получают в соответствии с требованиями регулирующего органа или получают в соответствии с общепризнанной фармакопеей для использования на животных и для человека. Фармацевтические композиции могут включать в себя вспомогательные вещества, такие как разбавитель, адъювант, наполнитель или носитель, с которыми вводят изоформу. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильную жидкость, такую как вода и масло, в том числе масло нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такое как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Вода является типичным носителем, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидкого носителя, особенно в качестве раствора для инъекций. Композиции наряду с активным ингредиентом могут содержать разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальция фосфат или карбоксиметилцеллюлоза; смазку, такую как стеарат магния, стеарат кальция, тальк и связующее, такое как крахмал, натуральные смолы, такие как камедь, гуммиарабик, желатин, глюкоза, патока, поливинилпирролидон, целлюлоза и ее производные, повидон, кроссповидоны и другие подобные связующие, известные специалистам в данной области. Подходящие фармацевтические наполнители представляют собой крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен гликоль, воду и этанол. Композиция, по желанию, также может содержать небольшие количества смачивателя или эмульгатора, или буферных агентов, например, ацетата, цитрата натрия, производных циклодекстрина, сорбитанмонолаурата, ацетата натрия, триэтаноламина, триэтаноламинолеата и других подобных агентов. Эти композиции могут быть в форме раствора, суспензии, эмульсии, таблетки, пилюли, капсулы, порошка и в форме с устойчивым высвобождением препарата. Могут быть изготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошок, представляющий собой смесь терапевтического соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал. Композиция может быть приготовлена в виде свечей с обычными связующим и носителем, такими как триглицериды. Оральная композиция может включать стандартные носители, такие как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтической чистоты и другие подобные агенты. Рецептура для орального введения также может содержать ингибиторы протеаз, такие как ингибитор Боумена-Бирка, конъюгированный ингибитор Боумена-Бирка, апротинин и камостат. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в РЬагтасеиЬса1 8с1ег1сек
Е.А. Майт. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, обычно, в очищенном виде вместе с подходящим количеством носителя для обеспечения надлежащей формы введения субъекту или пациенту.
Композиция должна соответствовать способу введения. Например, модифицированные ΡΥΙΙ могут быть введены в композицию для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной
- 87 020818 инъекции или непрерывной инфузии). Инъекционные составы могут иметь форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе. Стерильные инъекционные рецептуры также могут представлять собой стерильные инъекционные растворы или суспензии в нетоксичном парентеральноприемлемом разбавителе или растворителе, например могут представлять собой раствор в 1,4бутандиоле. Стерильные жирные масла обычно применяют в качестве растворителя или среды суспендирования. Для этой цели может быть использовано любое мягкое жирное масло, включая, но не ограничиваясь, синтетические моно- или диглицериды, жирные кислоты (в том числе олеиновая кислота), естественные растительные масла, например кунжутное масло, кокосовое масло, арахисовое масло, хлопковое масло и другие масла, или синтетические жирные носители, такие как этилолеат. Буферы, консерванты, антиоксиданты и подходящие ингредиенты могут быть включены в композицию, если это необходимо, или, наоборот, могут содержать композицию.
Полипептиды могут представлять собой единственный фармацевтически активный ингредиент в композиции или могут быть объединены с другими активными ингредиентами. Доставка полипептидов может быть направленной, например, при конъюгировании с нацеливающим агентом, таким как антитело. Суспензии липосом, в том числе нацеленных на определенную ткань липосом, также могут быть пригодны в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Например, липосомные композиции могут быть получены, как описано в патенте США № 4522811. Липосомная доставка также может включать композиции с медленным высвобождением, в том числе фармацевтические матрицы, такие как коллагеновые гели и липосомы, модифицированные фибронектином (см., например, \Уетег и др., (1985) ΐ. РНагт. 8с1. 74 (9): 922-5). Композиции, предусмотренные в настоящем документе, дополнительно могут содержать один или несколько адъювантов, которые облегчают доставку, включая, но не ограничиваясь инертными носителями или коллоидными дисперсионными системами. Не ограничивающие примеры таких инертных носителей могут быть выбраны из воды, изопропилового спирта, газообразных фторуглеродов, этилового спирта, поливинилпирролидона, пропиленгликоля, продуцирующих гель материалов, стеарилового спирта, стеариновой кислоты, спермацета, сорбитанмоноолеата, метилцеллюлозы, а также из подходящих комбинаций двух или более из них. Активное соединение включено в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для оказания терапевтического эффекта в отсутствие нежелательных побочных эффектов у субъекта, подвергающегося лечению. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически путем тестирования соединений в известных ίη νίΐτο системах и естественных системах, например, предусмотренных в настоящем документе.
а. Дозировки.
Точное количество или доза вводимого лекарственного средства зависит от конкретного полипептида РУН, пути введения и других соображений, таких как тяжесть заболевания, вес и общее состояние субъекта. Местное введение терапевтического агента, как правило, требует меньших доз, чем любой режим системного введения, хотя локальная концентрация терапевтического агента может, в некоторых случаях, быть выше после местного введения, чем концентрация, которая может быть достигнута при безопасном системном введении. При необходимости конкретная дозировка, протокол и продолжительность лечения могут быть эмпирически определены или экстраполированы. Примеры доз рекомбинантных полипептидов и нативного РУН могут быть использованы в качестве отправной точки для определения нужных дозировок. Например, рекомбинантный полипептид РУН (гРУПа), который был активирован с образованием гРУПа, Nονο8еνеη®, вводили пациентам с гемофилией А или гемофилией В при кровотечении в дозе 90 мкг/кг болюсной инфузией от 2 до 5 мин, достигая эффективного уровня в крови не менее 2 мкг/мл. Введение повторяли каждые 2 ч до достижения гемостаза. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть эффективны при меньшем количестве и/или частоте введений по сравнению с указанным рекомбинантным РУ11. Например, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, можно вводить в дозе 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15 мкг/кг или менее. В некоторых вариантах дозы могут быть выше и составлять, например, 100, 110, 120 мкг/кг или более. Длительность лечения и интервал между инъекциями может меняться в зависимости от тяжести кровотечения и реакции пациента на лечение и может быть скорректирован соответствующим образом. При определении доз могут быть приняты во внимание такие факторы как уровень активности и период полураспада модифицированного РУН по сравнению с немодифицированным РУН. Конкретные дозы и режимы введения могут быть определены эмпирически.
В другом примере, рекомбинантный полипептид РУН (гРУПа), который был активирован с образованием гРУПа, Nονο8еνеη®, вводили пациентам с врожденным дефицитом РУН при кровотечении в дозе 15-30 мкг/кг болюсной инфузией от 2 до 5 мин. Введение повторяли каждые 4-6 ч до достижения гемостаза. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть эффективны при пониженных дозах и/или частоте введений по сравнению с указанным рекомбинантным РУП. Например, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, можно вводить в дозе 20, 15, 10, 5, 3 мкг/кг или менее. В некоторых примерах дозы могут быть выше и составлять, например, 35, 40, 45 мкг/кг или более. Длительность лечения и интервал между инъекциями
- 88 020818 может меняться в зависимости от тяжести кровотечения и реакции пациента на лечение и может быть скорректирован соответствующим образом. При определении доз могут быть приняты во внимание такие факторы как уровень активности и период полураспада модифицированного РУН по сравнению с немодифицированным РУН. Например, модифицированный полипептид РУН, который обладает более длительным периодом полураспада, чем немодифицированный полипептид РУН, может вводиться в более низких дозах и/или менее часто, чем немодифицированный полипептид РУН. Аналогично, необходимый для достижения терапевтического эффекта модифицированный полипептид РУН, который проявляет увеличенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН, могут вводиться реже и в меньшем количестве. Конкретные дозы и режимы введения могут быть определены эмпирически специалистом в области техники.
Ь. Дозированные формы.
Фармацевтические терапевтически активные соединения и их производные, как правило, включают в композиции и вводят в единичных дозированных формах или множественных дозированных формах. Могут быть предусмотрены композиции для введения людям и животным в лекарственных формах, которые включают, но не ограничиваются таблетками, капсулами, пилюлями, порошками, гранулами, стерильными парентеральными растворами или суспензиями, пероральными растворами или суспензиями и водно-масляными эмульсиями, содержащими приемлемые количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Каждая единичная доза содержит определенное количество терапевтически активного соединения, достаточное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем, средой или растворителем. Примеры единичных дозированных форм включают ампулы и шприцы, и индивидуально упакованные таблетки или капсулы. В некоторых примерах единичные дозы предусмотрены в виде лиофилизированного порошка, который восстанавливают до введения. Например, полипептид РУН может быть предусмотрен в виде лиофилизированного порошка, который восстанавливают подходящим раствором и получают раствор единичной дозы для инъекций. В некоторых вариантах лиофилизированный порошок может содержать полипептид РУН и дополнительные компоненты, такие как соли, такие что восстановление стерильной дистиллированной водой приводит к раствору полипептида РУН в буфере или физиологическом растворе. Единичные дозированные формы могут быть введены частями, или может быть введено сразу несколько единичных дозированных форм. Множественная дозированная форма представляет собой множество одинаковых единичных дозированных форм, упакованных в один контейнер, которые вводят по отдельности единичными дозированными формами.
Примеры множественных дозированных форм включают флаконы, бутылки с таблетками или капсулами или бутылки с пинтами или галлонами жидкости. Таким образом, множественная дозированная форма представляет собой множество единичных дозированных форм, которые упакованы вместе.
2. Введение модифицированных полипептидов РУН.
Полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе (т.е. активные соединения), могут быть применены ш νίίτο, ех νίνο или ш νίνο, т.е. смесь, такая как жидкость тела или другой образец ткани, может быть введена в контакт с полипептидом РУН. Например, при применении соединения ех νίνο жидкость тела или образец ткани субъекта может быть введен в контакт с полипептидом РУН, который покрывает трубку или фильтр, например трубку или фильтр аппарата искусственного кровообращения. При применении ш νίνο активные соединения могут быть введены любым приемлемым путем, например орально, назально, легочно, парентерально, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутрисуставно, интрацистернально, интраокулярно, интравентрикулярно, интратекально, внутримышечно, внутрибрюшинно, интратрахеально или местно, а также любой комбинацией любых двух или более путей в жидкой, полужидкой или твердой форме, подходящей для каждого пути введения. Модифицированные полипептиды РУН можно вводить один или более раз, например два раза, три раза, четыре раза или любое количество раз, если это необходимо для достижения терапевтического эффекта. Множественные введения можно осуществить любым путем или комбинацией путей введения, введения можно проводить каждый час, каждые два часа, каждые три часа, каждые четыре часа и более. Наиболее подходящий путь введения будет варьировать в зависимости от подвергающегося лечению состояния, например от места кровотечения. Как правило, полипептиды РУН вводят внутривенным болюсом при времени введения (инфузии) около 2-5 мин. В других примерах желательный уровень РУН в крови, оцениваемый по плазме крови, может поддерживаться непрерывной инфузией активного вещества. Следует отметить, что решение о том, когда следует прекратить, прервать или изменить лечение для снижения дозы из-за токсичности или дисфункции костного мозга, печени или почек, находится в сфере компетенции лечащего врача. Решение о том, как и когда, напротив, следует усилить лечение, если клинический ответ не является адекватным (исключая токсичные побочные эффекты) находится в сфере компетенции лечащего врача. В других примерах местоположение кровотечения может указывать, что композицию РУН необходимо вводить альтернативным путем. Например, может быть осуществлено местное введение, включая введение в мозг (например, интравентрикулярно), если пациент испытывает кровотечения в этом районе. Аналогично, для лечения кровотечения в суставах может быть использовано местное введение путем введения терапевтических агентов в сустав (т.е. внутрисуставно, внутривенно или подкожно). В других при- 89 020818 мерах местное введение лекарственного средства на кожу, например, в виде крема, геля или мази или введение в легкие ингаляцией или интратрахеально может быть целесообразно, если кровотечение локализовано в этих областях. Если модифицированные полипептиды РУН включены в композицию в виде депо, композиции длительного действия могут быть введены с помощью имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или в виде внутримышечной инъекции. Так, например, терапевтические соединения могут быть включены в композицию с подходящим полимерным или гидрофобным материалом (например, в виде эмульсии в приемлемом масле), или ионообменной смолой, или в виде умеренно растворимых производных, например умеренно растворимых солей.
Композиции, при желании, могут быть предусмотрены в упаковке, в комплекте или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько единичных дозированных форм с активным ингредиентом. Упаковка, например, содержит металлические или пластиковые пленки, например блистерную упаковку. Упаковка или дозирующее устройство может сопровождаться инструкцией для введения. Композиции, содержащие активные вещества, могут быть упакованы в виде изделия, содержащего упаковочный материал, агент по настоящему изобретению и этикетку, в которой указано расстройство, для лечения которого агент предназначен.
3. Введение нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные полипептиды РУН (генная терапия).
Также в настоящем документе предусмотрены композиции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные полипептиды РУН, и векторов экспрессии, кодирующих модифицированные полипептиды РУН, подходящие для генной терапии. Вместо введения белков могут быть введены нуклеиновые кислоты, например, ίη νίνο, системно или другим путем, или ех νίνο, например, путем изъятия клеток, в том числе лимфоцитов, введения в них нуклеиновых кислот и реинтродукции клеток в хозяина или совместимого реципиента. Модифицированные полипептиды РУН могут быть доставлены в клетки и ткани путем экспрессии молекул нуклеиновых кислот. Модифицированные полипептиды РУН могут быть введены как молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды РУН, включая ех νίνο методику и прямую ίη νίνο экспрессию. Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в клетки и ткани любым способом, известным специалистам в данной области. Выделенные последовательности нуклеиновых кислот могут быть включены в векторы для дальнейших манипуляций. В настоящем документе вектор (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии или репликации. Выбор и использование таких средств находится в пределах компетенции специалистов в данной области.
Способы введения модифицированных полипептидов РУН экспрессией кодирующих молекул нуклеиновой кислоты включают введение рекомбинантных векторов. Вектор может быть сконструирован для сохранения в эписомном состоянии, например, путем включения точки начала репликации, или может быть предназначен для интеграции в хромосому клетки. Модифицированные полипептиды РУН также могут быть использованы в ех νίνο терапии при экспрессии генов с использованием невирусных векторов. Например, могут быть созданы клетки, которые экспрессируют модифицированный полипептид РУН, например, путем интеграции кодирующей модифицированный полипептид РУН нуклеиновой кислоты в геном, причем кодирующая последовательность функционально связана с регуляторной последовательностью или помещена под контроль регуляторных последовательностей в геноме. Затем такие клетки могут быть введены локально или системно субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в лечении. Для генной терапии могут быть использованы вирусные векторы, включающие, например, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (ААУ), поксвирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и другие вирусы. Векторы могут оставаться эписомными или могут интегрироваться в хромосомы субъекта. Модифицированные полипептиды РУН могут быть экспрессированы с помощью вируса, который вводят субъекту, нуждающемуся в лечении. Подходящие для генной терапии вирусные векторы включают аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы (ААУ), ретровирусы, лентивирусы, вирус осповакцины и другие вирусы, указанные выше. Например, технология экспрессии с помощью аденовируса известна в уровне техники, и получение аденовируса и способы его введения также хорошо известны. Серотипы аденовируса доступны, например, из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Кэс^Ше, Мэриленд). Аденовирус может быть использован ех νίνο, например, при выделении клеток из пациентов, нуждающихся в лечении, и их трансдукции экспрессирующим модифицированный полипептид РУН аденовирусным вектором. После соответствующего периода культивирования трансдуцированные клетки вводят субъекту локально и/или системно. Альтернативно, экспрессирующие модифицированные полипептиды РУН аденовирусные частицы выделяют и смешивают с фармацевтически приемлемым носителем для доставки терапевтически эффективного количества для профилактики, лечения или улучшения симптомов заболевания или состояния у субъекта. Как правило, аденовирусные частицы вводят в дозе от 1 до 1014 частиц на 1 кг веса субъекта, как правило, от 106 или 108 частиц до 1012 частиц на 1 кг веса субъекта. В некоторых ситуациях предпочтителен источник нуклеиновой кислоты с нацеливающим на определенные клетки агентом, таким как антитело, специфичное к поверхностному белку клеточной мембраны клетки-мишени, или таким как лиганд рецептора клетки-мишени. РУН также может быть нацелен на доставку в специфические типы клеток. Например, аденовирусные векторы, кодирующие поли- 90 020818 пептиды РУН, могут быть использованы для стабильной экспрессии в неделящихся клетках, таких как клетки печени (Магдагбббк и др., (2004). б. С1ш. куекб 1 13:1025-1031). В другом примере вирусный или невирусный вектор, кодирующий полипептиды РУН, может быть трансдуцирован в выделенные клетки для последующей доставки. Дополнительные типы клеток для экспрессии и доставки РУН включают, но не ограничиваются, фибробласты и эндотелиальные клетки.
Молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в искусственные хромосомы и другие не вирусные векторы. Искусственные хромосомы, такие как АСЕ8 (см. ЫпбепЬаит и др., (2004) №с1ебс Асбб Кек. 32 (21):е172) могут быть сконструированы для кодирования и экспрессии изоформы белка. Искусственные хромосомы млекопитающих (МАС) представляют собой средство введения большого количества полезной генетической информации в клетку при автономной репликации и отсутствии интеграции. В отличие от других МАС система экспрессии с помощью искусственных хромосом млекопитающих на основе сателлитной ДНК (АСЕ) может быть получена бе поуо в клеточных линиях различных видов и искусственные хромосомы могут быть легко очищены от хромосом клеток хозяина. Очищенные АСЕ млекопитающих могут быть вновь введены в различные реципиентные клеточные линии, где они стабильно поддерживаются в течение длительного периода в отсутствие селективного давления. С использованием этого подхода в ЬМТК(-) и СНО клетки были введены один или два целевых гена. Другой способ введения кодирующей модифицированные полипептиды РУН нуклеиновой кислоты представляет собой двухстадийную технологию замены генов в дрожжах, требующей полный геном аденовируса (Аб2; Кекег и др., (1994) РNА8 91: 6186-6190), клонированный в искусственной хромосоме дрожжей (УАС), и плазмиду, содержащую аденовирусные последовательности, нацеленные на конкретной район в клоне УАС, экспрессионную кассету для интересующего гена и положительные и отрицательные селективные маркеры. УАС представляют особый интерес, поскольку они позволяют включать в себя большие гены. Этот подход может быть использован для конструирования аденовирусных векторов, несущих нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из описанных модифицированных полипептидов РУН, предназначенных для переноса генов в клетки млекопитающих или переноса в животных.
Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы в переносчик, такой как липосому, или включены в клетки, такие как бактериальные клетки, особенно ослабленные бактерии, или введены в вирусный вектор. Например, при использовании липосом для нацеливания и/или для облегчения захвата могут быть использованы белки, которые связываются с белками клеточной мембраны, и белки, связанные с эндоцитозом, например, капсидные белки или их фрагменты, связывающиеся с определенным типом клеток, антитела к белкам, подвергающимся интернализации, и белки, которые определяют внутриклеточную локализацию и увеличивают период полураспада внутри клеток.
В ех убуо и ίη убуо методах молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированные полипептиды РУН вводят в клетки, взятые от подходящего донора или от субъекта, подлежащего лечению. Клетки, в которые для терапевтических целей могут быть введены нуклеиновые кислоты, включают, например, любой доступный предпочтительный тип клеток, подходящий для подлежащего лечению заболевания или состояния, включая, но не ограничиваясь, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты, клетки крови, такие как Т-лимфоциты, Влимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты, различные стволовые клетки или клетки-предшественники, включая гемопоэтические стволовые клеткипредшественники или, например, стволовые клетки, полученные из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, печени плода, а также других их источников.
Для лечения ех убуо выделяют клетки донора, совместимого с подлежащим лечению субъектом, или клетки самого подлежащего лечению субъекта, в указанные выделенные клетки вводят нуклеиновые кислоты, и модифицированные клетки вводят субъекту.
Лечение включает прямое введение клеток, например, инкапсулированных в пористые мембраны, которые имплантируют в организм пациента (см., например, патенты США №№ 4892538 и 5283187, каждый из которых приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме). Способы, пригодные для ίη уббго переноса нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, включают использование липосом и катионных липидов (например, Э0ТМА, 00РЕ и ОС-СНоб), электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, использование ДЭАЭ-декстрана и осаждения с фосфатом кальция. Способы доставки ДНК могут быть использованы для экспрессии модифицированных полипептидов РУН ίη убуо. Такие способы включают доставку нуклеиновых кислот в липосомах и доставку голой ДНК, в том числе местную и системную доставку, например, при использовании электропорации, ультразвука и кальций-фосфатной доставки. Другие способы включают микроинъекцию, слияние клеток, перенос генов в хромосомах, перенос генов в микроклетках и слияние сферопластов.
бп убуо экспрессия модифицированных полипептидов РУН может быть связана с экспрессией дополнительных молекул. Например, экспрессии модифицированных полипептидов РУН может быть связана с экспрессией цитотоксического продукта, такого как модифицированный вирус, или полипептид может экспрессироваться в составе цитотоксического вируса. Такие вирусы могут быть ориентированы на конкретный тип клеток, который является мишенью для терапевтического воздействия. Экспрессия модифицированных полипептидов РУН может быть использована для повышения цитотоксичности вируса.
- 91 020818
Ιη νίνο экспрессия модифицированных полипептидов РУП может включать функциональное связывание кодирующей модифицированный полипептид РУП молекулы нуклеиновой кислоты со специфичной регуляторной последовательностью, такой как специфичный для клеток или тканеспецифичный промотор. Модифицированные полипептиды РУП также могут быть экспрессированы в векторах, которые специфически заражают и/или реплицируются в клетках-мишенях и/или тканях. Для селективной регуляции экспрессии модифицированного полипептида РУП можно использовать индуцибельный промотор. Пример системы регулируемой экспрессии представляет собой доксициклин-индуцибельная система экспрессии генов, которая была использована для регулируемой экспрессии рекомбинантного РУЛ (8гоиг и др., (2003) ТЬготЪ Наетοδί 90 (3):398-405). Молекулы нуклеиновой кислоты, такие как голые нуклеиновые кислоты или векторы, искусственные хромосомы, липосомы и другие переносчики, могут быть введены субъекту путем системного введения, локального, местного и других способов введения. При системном введении ίη νίνο молекулы нуклеиновой кислоты или переносчик, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть нацелены на определенные клетки.
Введение также может быть прямым, таким как введение вектора или клеток, которые обычно нацелены на клетки или ткани. Например, опухолевые клетки и пролиферирующие клетки могут представлять собой клетки-мишени для ίη νίνο экспрессии модифицированных полипептидов РУП. Используемые для ίη νίνο экспрессии модифицированных полипептидов РУП клетки также включают клетки, аутологичные для пациента. Такие клетки могут быть изъяты у пациента, в них могут быть введены нуклеиновые кислоты для экспрессии модифицированных полипептидов РУП, а затем клетки могут быть введены пациенту, например, путем инъекции или пересадки.
Н. Терапевтическое применение.
Модифицированные полипептиды РУП, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения любых состояний, для которых может применяться рекомбинантный РУП. Как правило, такое лечение усиливает коагуляцию, например, усиливает гемостатический ответ. Модифицированные полипептиды РУП обладают терапевтической активностью отдельно или в комбинации с другими агентами. Модифицированные полипептиды, предусмотренные в настоящем документе, при сохранении терапевтической активности проявляют модифицированные свойства, в частности, повышенную устойчивость к АТ-ΙΙΙ и увеличенную каталитическую активность. Модифицированные полипептиды, предусмотренные в настоящем документе, также могут обладать повышенной устойчивостью к ТРРф повышенной устойчивостью к ингибиторному действию Ζη2+, улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как период полураспада в сыворотке, увеличенным связыванием и/или аффинностью к активированным тромбоцитам, увеличенным связыванием и/или аффинностью к сывороточному альбумину и/или увеличенным связыванием и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов αΙΛβ3. Такое изменение свойств, например, может повысить терапевтическую эффективность полипептидов вследствие увеличения коагулянтной активности модифицированных полипептидов РУП. В этом разделе приведены примеры применения и способы введения полипептидов. Описание способов лечения приведено в качестве примера и не ограничивает применение модифицированных полипептидов РУП.
Модифицированные полипептиды РУП, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в различных способах лечения, а также диагностики, в которых может быть применен РУП. Такие способы включают, но не ограничиваются, способы лечения физиологических и медицинских состояний, описанных и перечисленные ниже. Модифицированные полипептиды РУП, предусмотренные в настоящем документе, могут проявлять увеличенную активность ίη νίνο и увеличенный терапевтический эффект по сравнению с РУП дикого типа, например для достижения того же эффекта могут требоваться более низкие дозы, модифицированные полипептиды РУП могут проявлять другие улучшения для введения и лечения, например, может требоваться введение меньших количеств и/или более редкое введение, могут быть уменьшены побочные эффекты и повышен терапевтический эффект. Хотя модифицированные полипептиды РУП могут быть введены в виде зимогена РУП (т.е. в одноцепочечной форме), как правило, предусмотренные здесь модифицированные полипептиды РУП вводят в активированной двухцепочечной форме, например, после самоактивации или активации другими факторами свертывания крови, например, во время очистки. В частности, модифицированные полипептиды РУП предназначены для использования в способах лечения, в которых для лечения используют РУП. Такие способы включают, но не ограничиваются способами лечения заболеваний и расстройств, включающих, но не ограничивающихся нарушениями свертывания крови, гематологическими расстройствами, геморрагическими расстройствами, гемофилиями, такими как гемофилия А, гемофилия В и дефицит фактора УП, и приобретенными заболеваниями крови, такими как приобретенный дефицит фактора УП, вызванный заболеваниями печени. Модифицированные полипептиды РУП также могут быть использованы для лечения других заболеваний и нарушений свертывания крови, включая, но не ограничиваясь тромбоцитопенией (например, связанной с химиотерапией тромбоцитопенией), болезнью Виллебранда, наследственными нарушениями функций тромбоцитов (например, заболеваниями дефицита хранения, такими как синдром Чедиака-Хигаси и синдром Германски-Пудлака, дисфункция тромбоксана А2, тромбастения Гланцманна и синдром Бернар-Сулье), гемолитическим уремическим синдромом, наследственной геморрагической телеангиоэкстазией, также известной как синдром Ренду-Ослера-Вебера, аллергической пурпурой (пур- 92 020818 пура Шенлейна-Генох) и диссеминированным внутрисосудистым свертыванием.
В некоторых вариантах подвергающиеся лечению полипептидами РУН кровотечения происходят в таких органах как мозг, внутреннее ухо, глаз, печень, легкие, опухолевая ткань, желудочно-кишечный тракт. В других вариантах кровотечение является диффузным, таким как геморрагический гастрит и обильное маточное кровотечение. Пациенты с нарушениями свертываемости крови, например с гемофилией А и В, часто подвергаются риску кровотечения во время операции или травмы. Такие кровотечения могут проявляться в виде острого гемартроза (кровотечения в суставе), хронической гемофильной артропатии, гематом, (например, мышечной, забрюшинной, сублингвальной и заглоточной), гематурии (кровотечение из почечного тракта), кровотечения в центральной нервной системе, желудочнокишечных кровотечений (например, кровотечения в верхнем пищеварительном тракте) и кровоизлияния в мозг, которые также можно лечить с помощью модифицированных полипептидов РУН. Кроме того, любые кровотечения, связанные с хирургическим вмешательством (например, резекцией печени) или удалением зубов, можно лечить с помощью модифицированных полипептидов РУН. В одном из вариантов, модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы для лечения кровотечений у субъекта, вызванных травмой или операцией, или снижением количества или активности тромбоцитов. Примеры способов лечения пациентов, перенесших операцию, включают лечение для предотвращения кровотечения и другие процедуры до, во время или после операции, включая, но не ограничиваясь операцией на сердце, ангиопластикой, операцией на легких, абдоминальной операцией, операцией на позвоночнике, операцией на головном мозге, операцией на сосудах, стоматологической операцией или трансплантацией органов, в том числе трансплантацией костного мозга, сердца, легких, поджелудочной железы или печени. Лечение заболеваний и состояний модифицированными полипептидами РУН может быть осуществлено с помощью любого подходящего способа введения с использованием подходящей композиции, как описано в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь инъекцией, легочным, оральным и трансдермальным введением. Лечение обычно осуществляют путем внутривенного болюсного введения. При необходимости конкретная дозировка, продолжительность и протокол лечения могут быть эмпирически определены или экстраполированы. Примеры доз рекомбинантного полипептида и нативного РУН могут быть использованы в качестве отправной точки для определения нужных дозировок. Например, рекомбинантный полипептид РУН (гРУНа), который был активирован с образованием гРУНа, Nονοкеνеη®, вводили пациентам с гемофилией А или гемофилией В при кровотечении в дозе 90 мкг/кг болюсной инфузией в течение от 2 до 5 мин, достигая эффективного уровня в крови не менее 2 мкг/мл со средним периодом полураспада 2,7 ч. Введение повторяли каждые 2 ч до достижения гемостаза. Модифицированные полипептиды РУН, которые обладают повышенной коагулянтной активностью, вследствие, например, повышенной устойчивости к АТ-ΙΙΙ, увеличенной каталитической активностью, повышенной устойчивостью к ингибиторному действию Ζ^*, повышенной устойчивостью к ТРРЕ улучшенных фармакокинетических свойств, таких как увеличенный период полураспада в сыворотке, увеличенного связывания и/или аффинности к активированным тромбоцитам, увеличенного связывания и/или аффинности к сывороточному альбумину и/или увеличенного связывания и/или аффинности к интегрину тромбоцитов αΙΙ5β3, могут быть эффективны при уменьшенных дозах и/или уменьшенной частоте введения по сравнению с рекомбинантным РУН. Дозы РУН дикого типа или немодифицированного полипептида РУН могут быть использованы в качестве ориентиров для определения доз модифицированных полипептидов РУН. Такие факторы, как уровень активности и период полураспада модифицированного РУН по сравнению с немодифицированным РУН, могут быть использованы при принятии таких решений. Конкретные дозы и режимы введения могут быть определены эмпирически.
Дозировки и режимы введения могут быть определены, исходя из известных дозировок и режимов, и, при необходимости, могут быть экстраполированы на основе изменений свойств модифицированных полипептидов и/или могут быть определены эмпирически на основе целого ряда факторов. К таким факторам относятся масса тела человека, общее состояния здоровья, возраст, активность конкретного используемого соединения, пол, диета, время введения, скорость выделения, комбинация лекарств, тяжесть и течение заболевания, предрасположение пациента к заболеванию и решение лечащего врача. Активный ингредиент, полипептид, как правило, комбинирован с фармацевтически эффективным носителем. Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с носителем для получения единичной дозированной формы или множественной дозированной формы может варьировать в зависимости от принимающего лечение субъекта и способа введения.
Влияние полипептидов РУН на время свертывания крови можно контролировать с помощью любого из анализов коагуляции, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь полным протромбиновым временем крови (ПВ), активированным частичным тромбопластиновым временем (АЧТВ), активированным временем свертывания (АВС), рекальсифицированным активированным временем свертывания крови или временем свертывания крови Ли-Уайта.
После улучшения состояния пациента, если это необходимо, может быть введена поддерживающая доза соединения или композиции; и дозировка, дозированная форма или частота приема или их сочетание могут быть изменены. В некоторых случаях субъекту может потребоваться долгосрочное прерыви- 93 020818 стое лечение при повторении симптомов заболевания или на основе запланированных введений. В других случаях дополнительные введения могут быть необходимы в ответ на острую потребность, такую как кровотечение, травма или хирургическое вмешательство.
Ниже приведены некоторые примеры состояний, при которых РУН (вводили в виде РУНа) был использован в качестве терапевтического агента отдельно или в комбинации с другими агентами.
1. Врожденные нарушения, связанные с кровотечениями.
а. Гемофилия.
Врожденная гемофилия представляет собой рецессивное заболевание крови, при котором наблюдается снижение уровня факторов свертывания в плазме, что приводит к нарушению свертывания и увеличению времени свертывания. Гемофилия А, на долю которой приходится около 85% всех случаев гемофилии, является результатом мутации (мутаций) в гене фактора УШ в Х-хромосоме, что приводит к недостаточности или дисфункции белка РУШ. Гемофилия В вызвана недостаточностью или дисфункцией фактора свертывания РК, как правило, в результате точечных мутаций или делеции в гене РК в Ххромосоме. Заболеваемость гемофилией А в мире составляет примерно 1 случай на 5000 мужчин и заболеваемость гемофилией В - 1 случай на 25000 мужчин. Гемофилия А и В классифицируется на легкую, среднюю и тяжелую гемофилию. Уровень 5-25% нормально функционирующего фактора УШ или IX в плазме крови классифицируют как легкую, 1-5% как умеренную и менее 1% как тяжелую гемофилию. Гемофилия С, часто называемая дефицитом РК, является относительно мягким и редким заболеванием, затрагивающим приблизительно 1 из 100000 человек и наследующимся по аутосомно-рецессивному типу.
Гемофилии А и В клинически проявляются различными путями. Малые порезы и ссадины не приводят к чрезмерному кровотечению, в отличие от травм и операций. У пациента также будут наблюдаться многочисленные кровотечения в суставах и мышцах и легкие кровоподтеки. Гемартроз или кровотечение в суставах является одним из серьезных осложнений при гемофилии и может происходить спонтанно или в ответ на травму. Чаще всего страдают блоковидные суставы, такие как колено, локоть и лодыжка. Бедреный и плечевой суставы страдают гораздо реже, так как вокруг шарового и шарнирного сустава находится больше мышц, что больше защищает их от травмы. Кровотечение может привести к тяжелой острой боли, ограничить движение и привести к вторичным осложнениям, включая синовиальную гипертрофию. Кроме того, повторяющиеся кровоизлияния в суставы могут вызвать хронический синовит, который может вызвать повреждения суставов, разрушение синовиальной оболочки, хрящей и кости. Субъекты с гемофилией также страдают опасными для жизни кровотечениями, например внутричерепными кровоизлияниями и кровотечениями в центральной нервной системе. Внутричерепные кровоизлияния происходят приблизительно у 10% пациентов с гемофилией, что приводит к 30% смертности. Напротив, гемофилия С является более мягкой. Спонтанные кровотечения редки, и кровоизлияния в суставы, мягкие ткани и мышцы также происходят редко. Кровотечение обычно лечат переливанием свежезамороженной плазмы (СЗП), заместительной терапией РXI, или, для местного лечения, например, лечения внешних ран или при удалении зубов, фибриновым клеем.
Наиболее распространенным способом лечения гемофилии А или В является заместительная терапия, при которой пациенту вводят РУШ или РК. Коммерчески доступны композиции с очищенными из плазмы или рекомбинантными продуктами, рекомбинантные белки в настоящее время являются самым популярным лекарственным средством у ранее не леченных пациентов. Хотя эти способы могут быть очень успешными, если у пациента образуются ингибиторы к вводимым фактору УШ или фактору IX, то возникают осложнения. Ингибиторы представляют собой антитела ЦС, в основном подкласса ЦС4, которые взаимодействуют с РУШ или РК и ингибируют прокоагулянтную активность. Ингибиторы присутствуют приблизительно у 1 из 5 больных с тяжелой формой гемофилии А. У большинства субъектов ингибиторы появляются вскоре после первой инфузии фактора УШ, которая зачастую происходит в раннем детстве, хотя субъекты вырабатывают ингибиторы позже. Ингибиторы также присутствуют приблизительно у 1 из 15 человек с легкой или умеренной гемофилией А. Ингибиторы обычно вырабатываются во взрослом возрасте и разрушают не только введенный экзогенный фактор УШ, но и эндогенный фактор УШ. В результате этого легкая и средняя гемофилии становятся тяжелой гемофилией. Клинически пациентов с гемофилией, вырабатывающих ингибиторы, делят на пациентов с высокой и низкой реакцией в соответствии с силой их анамнестического ответа при повторном применении РУШ. Ингибиторы присутствуют приблизительно у 1 из 100 пациентов с гемофилией В. У большинства субъектов ингибиторы появляются после первых инфузий фактора IX и могут сопровождаться аллергическими реакциями.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения больных гемофилией, в частности больных гемофилией с ингибиторами. Рекомбинантный продукт РУНа (Nονοδеνеη, Ново Нордиск) был одобрен и лицензирован для лечения кровотечений при гемофилии А и В у пациентов с ингибиторами фактора УШ или РК и для профилактики кровотечений при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у пациентов с гемофилией А или В с ингибиторами фактора УШ или РК. Лечение гРУНа усиливает образование тромбина в обход потребности в РУШа и/или РКа. Коагуляция начинается в месте повреждения в результате взаимодействия гРУНа с ТФ, что приводит к начальной активации РX, образованию тромбина и активации тромбоцитов. Полная коагуляция с помощью гРУНа может быть достигнута по ТФ-зависимому и ТФ- 94 020818 независимому механизму, в котором часть образовавшегося тромбина может быть образована фактором РХ, напрямую активированным гРУНа на активированных тромбоцитах, который сам связывает активированные тромбоциты за счет низкоаффинных взаимодействий с фосфолипидами мембран.
Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения гемофилии, в том числе для лечения кровотечений и профилактики кровотечений при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах. Модифицированные полипептиды РУН по настоящему документу могут обладать повышенной устойчивостью к АТ-Ш, увеличенной каталитической активностью, повышенной устойчивостью к ингибиторному действию Ζ^', повышенной устойчивостью к ТЕРН улучшенными фармакокинетическими свойствами, такими как период полураспада в сыворотке, увеличенным связыванием и/или аффинностью к активированным тромбоцитам, увеличенным связыванием и/или аффинностью к сывороточному альбумину и/или увеличенным связыванием и/или аффинностью к интегрину тромбоцитов апьв3. Поэтому полипептиды РУН проявляют повышенную коагулянтную активность в присутствии ТФ (например, вследствие повышения устойчивости к ТРРЦ и/или в отсутствие ТФ (например, вследствие увеличения связывания и/или аффинности к активированным тромбоцитам). Таким образом, модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы для более активной терапии гемофилии. Примеры улучшений при лечении с использованием модифицированных полипептидов РУН включают, но не ограничиваются, например, более низкие дозы, меньшее и/или более редкое введение, уменьшение побочных эффектов и повышение терапевтического эффекта.
Модифицированные полипептиды РУН, обычно, вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа). Модифицированные полипептиды РУН могут быть проверены на терапевтическую эффективность, например, с использованием моделей на животных. Например, модифицированные полипептиды РУН можно применять к мышам с индуцированной антителами гемофилией или испытывать на любой другой известной модели гемофилии. Для оценки последствий модификации полипептидов РУН можно оценивать прогрессирование симптомов заболевания и фенотипы. Модифицированные полипептиды РУН также могут быть введены субъектам при клинических исследованиях для оценки эффективности ш угуо по сравнению с контролем плацебо и/или введением немодифицированных РУН.
b. Дефицит фактора РУН.
Дефицит фактора VII представляет собой аутосомно-рецессивное нарушения свертывания крови, которое встречается приблизительно у 1 из 500000 человек. Дефицит РУН может проявляться в клинически легкой, средней или тяжелой форме, причем мягкая и умеренная недостаточность характеризуется повышенной кровоточивостью при операциях и травмах. Пациенты с тяжелой недостаточностью РУН (менее 1% активности РУН) проявляют аналогичные гемофилии симптомы. Например, РУП-дефицитные субъекты склонны к кровоизлияниям в суставы, спонтанным кровотечениям из носа, желудочнокишечным кровотечениям, кровотечениям из мочевых путей. Также наблюдаются внутримозговые кровоизлияния и кровотечения в мышцах, в то время как женщины могут столкнуться с тяжелой меноррагией (тяжелые менструальные кровотечения). Лечение может быть осуществлено путем заместительной терапии. Рекомбинантный продукт РУПа (Шуокеуеп®, Ново Нордиск) был одобрен и лицензирован для лечения кровотечений у больных с врожденным дефицитом РУН и для профилактики кровотечений при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у пациентов с врожденным дефицитом РУН. Следовательно, предусмотренные здесь модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы аналогичным образом. Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения кровотечений и профилактики кровотечений при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у РУП-дефицитных пациентов. Например, новорожденному пациенту с тяжелой недостаточностью РУН с внутричерепным кровоизлиянием для стимулирования коагуляции и поддержания гемостаза могут быть введены модифицированные полипептиды РУН внутривенным болюсом. Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа).
c. Другое.
Другие нарушения свертываемости крови можно лечить с помощью полипептидов РУН, предусмотренных в настоящем документе для содействия коагуляции. Врожденные недостатки факторов У и Х также приводят к увеличенному времени свертывания крови и могут подвергаться лечению введением терапевтических доз РУН. Например, пациенту с дефицитом фактора Х для остановки кровотечения, связанного со спленэктомией, может быть введен гРУНа (Воддю и др., (2001) Вг. I Наета!о1. 112:10741075). Спонтанные и вызванные операцией кровотечения при болезни Виллебранда (БВ) также можно лечить с помощью предусмотренных в настоящем документе модифицированных полипептидов РУН. БВ является нарушением свертывания крови, вызванным дефектом или дефицитом белка свертывания крови, фактора Виллебранда (у^Р), которое, по оценкам, встречается у 1-2% населения. У пациентов с болезнью Виллебранда легко появляются гематомы, имеют место периодические кровотечения из носа, кровотечения после удаления зубов, тонзиллэктомии или других операций, у женщин-пациентов могут увеличиваться менструальные кровотечения. Модифицированные полипептиды РУН могут быть исполь- 95 020818 зованы для облегчения спонтанных и связанных с операцией кровотечений у пациентов с БВ (νοη Эерка и др., (2006) Β1οοά ^адШ Р1Ьгш 17:311-316). Другие связанные с тромбоцитами нарушения свертывания крови, такие как, например, тромбастения Гланцманна и синдром Германски-Пудлака, также связаны со снижением эндогенной коагулянтной активности. Случаи спонтанного или связанного с операцией кровотечения у пациентов со связанными с тромбоцитами нарушения свертывания крови также можно лечить с помощью терапевтических доз модифицированных полипептидов РУН. Например, пациенту с тромбастенией Гланцманна, перенесшему операцию, для предотвращения большой потери крови можно вводить модифицированные полипептиды РУН до, во время и/или после операции (Уаη ΒιιιιΐΌη и др., (2002) Όί§ Όίκ 8с1 47:2134-2136). Обычно, модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа).
2. Приобретенные нарушения свертываемости крови.
a. Тромбоцитопения вследствие химиотерапии.
Нарушения свертываемости крови также могут быть приобретенными, а не врожденными. Например, химиотерапия при лейкемии и других раковых заболеваниях может привести к тромбоцитопении. Тромбоцитопения, вероятно, развивается из-за потери тромбоцитов в костном мозге больных, получающих химиотерапию, и обычно наступает через 6-10 дней после лечения. Лечение приобретенной тромбоцитопении, как правило, состоит в переливании тромбоцитов, эритроцитов или плазмы, что служит для предотвращения любых ненормальных спонтанных кровотечений, которые могут быть результатом дефицита тромбоцитов. Кровотечения у пациентов с вызванной химиотерапией тромбоцитопенией или у пациентов с любой другой приобретенной или врожденной тромбоцитопенией также можно лечить введением терапевтических количеств модифицированных полипептидов РУН, предусмотренных в настоящем документе. Например, пациенту с тромбоцитопенией при неконтролируемом кровотечении, например, в желудочно-кишечном тракте для остановки кровотечения может быть введен внутривенный болюс терапевтического количества полипептида РУН (0егоШа£ак и др., (2002) Ат.. ί. НетаЮк 69: 219222). Обычно, модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа).
b. Другие коагулопатии.
Другие приобретенные коагулопатии также можно лечить с помощью модифицированных полипептидов РУН, предусмотренных в настоящем документе. Коагулопатии могут быть следствием состояний, включающих, но не ограничивающихся молниеносной печеночной недостаточностью (РНР, например, вызванной гепатотоксичными лекарствами, токсинами, нарушениями метаболизма, инфекционными заболеваниями и ишемией), другими заболеваниями печени, включая цирроз и заболевания, связанные с болезнью Вильсона, дефицитом витамина К (например, вызванным лечением антибиотиками или диетой), гемолитическим уремическим синдромом, тромботической тромбоцитопенией (ТТЦ) и диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС). Обычные методы лечения, как правило, включают переливание плазмы, красных кровяных телец (эритроцитов) или тромбоцитов, но могут быть неудачными. В одном из вариантов модифицированные полипептиды РУН для предотвращения кровотечения можно вводить пациенту с РНР, перенесшему инвазивную процедуру. Обычное лечение свежезамороженной плазмой (СЗП) часто не приносит эффекта и может потребовать большого количества плазмы, что приведет к перегрузке и анасарке (генерализованной инфильтрации подкожной соединительной ткани отечной жидкостью). Лечение терапевтическими количествами модифицированных полипептидов РУН внутривенным болюсом во время, до и/или после хирургического вмешательства, такого как, например, биопсия печени или трансплантация печени, может предотвратить кровотечение и установить гемостаз у больных с РНР. Для определения эффективности лечения у пациента может контролироваться ПВ крови (8Ьат1 и др., (2003) Ыуег Тгащр! 9:138-143). В другом варианте РУН можно вводить пациенту с тяжелым кровотечением при коагулопатии, таким как, например, тяжелое внутрибрюшное кровотечение после кесарева сечения, связанное с нарушением функции печени и ДВС, которое не поддается лечению обычными переливаниями (Μο5са^άο и др., (2001) Βγ. ί. НаетаФк 113: 174-176). Кроме того, модифицированные полипептиды РУН могут быть использованы для лечения коагулопатии у новорожденных и детей. В конкретном варианте новорожденные и дети не реагируют на традиционное лечение, такое как вливание красных кровяных телец и тромбоцитов. Например, новорожденным с тяжелым легочным кровотечением с увеличенным ПВ, которые не отвечают на переливание красных кровяных телец и тромбоцитов, для уменьшения ПВ и установления гемостаза могут быть введены модифицированные полипептиды РУН (01οιηιι и др., (2002) ί. РегшаЮ 22:672-674). Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, проявляют повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированными полипептидами РУН и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшим количеством побочных эффектов. Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа).
c. Кровотечения при трансплантации.
Тяжелые кровотечения после трансплантации костного мозга (ТКМ) и трансплантации стволовых клеток (ТСК) являются относительно распространенными и опасными для жизни осложнениями, связанными с этими процедурами, возникающими из-за уменьшения количества тромбоцитов. Например, диф- 96 020818 фузное альвеолярное кровотечение (ДАГ) является легочным осложнением ТКМ, затрагивающим 1-21% пациентов при трансплантации, при этом смертность достигает 60-100%. Обычное лечение таких кровотечений включает лечение кортикостероидами и переливание плазмы, тромбоцитов и/или эритроцитов, хотя такое лечение является в значительной степени неудачным с общей смертностью примерно 50% (Шскк и др., (2002) Βοικ Магго\у Тгаикр1 30:975-978). Для лечения ДАГ и установления гемостаза может быть выполнено введение РУН внутривенным болюсом при одновременном лечении кортикостероидами и/или инфузии тромбоцитов или без них (Шскк и др., (2002) Βοι^ Магго\у Тгаикр1 30:975-978). Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, проявляют повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированными полипептидами РУН и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже, при более коротком сроке лечения и с меньшим количеством побочных реакций при той же биологической активности и эффективности. Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУНа).
Н Кровотечения, вызванные антикоагулянтной терапией.
У пациентов, проходящих антикоагулянтную терапию для лечения таких состояний, как тромбоэмболия, могут проявляться кровотечения при остром введении антикоагулянтов, таких как варфарин, гепарин и фондапаринукс, или развиваться геморрагические нарушения в результате долгосрочного использования таких способов лечения. Лечение кровотечений обычно включает введение прокоагулянтов, таких как витамин К, плазмы, экзогенного РК и протаминов для нейтрализации гепарина. Для нейтрализации действия антикоагулянтов, повышения ПВ, АЧТВ, и/или других маркеров коагуляции и установления гемостаза также может быть введен экзогенный РУН (^еνе^ак и др., (2002) Апи Шеи МеН 137:884888). Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в терапии для остановки кровотечений у пациентов с приобретенными в связи с антикоагулянтой терапией нарушениями свертываемости крови. Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУНа).
е. Приобретенная гемофилия.
Ингибиторы фактора УШ могут спонтанно образоваться у здоровых субъектов, что приводит к состоянию, известному как приобретенная гемофилия. Приобретенная гемофилия представляет собой редкое состояние с ежегодной встречаемостью 0,2-1,0 случаев на миллион населения. Аутоантитела в основном представляют собой ^04 антитела, которые при связывании с РУШ ингибируют его активность, препятствуя расщеплению тромбина, взаимодействию с фактором Виллебранда и/или связыванию фосфолипидов. Это приводит к опасным для жизни кровоизлияниям у приблизительно 87% пациентов. Обычные места кровотечения включают кожу, слизистые оболочки, мышцы и забрюшинное пространство в отличие от пациентов с наследственной гемофилией, у которых кровотечения локализованы преимущественно в суставах и мышцах. Приобретенную гемофилию можно лечить с помощью концентрата активированного протромбинового комплекса или рекомбинантного активированного фактора УН (№νοкеνеη®, Ново Нордиск). Модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, проявляют повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированными полипептидами РУТ, и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже, при более коротком сроке лечения и с меньшим количеством побочных реакций при той же биологической активности и эффективности. Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУНа).
3. Кровотечение при травмах и хирургическом вмешательстве.
Полипептиды РУН могут быть использованы в качестве терапии для лечения кровотечений, связанных с периоперационной и травматической потерей крови у субъектов с нормальной системой коагуляции. Например, полипептиды РУН можно вводить пациенту для содействия свертыванию крови и уменьшения потерь, связанных с операцией и, кроме того, для уменьшения потребности в переливании крови. В одном из вариантов, полипептиды РУН могут быть введены субъекту, подвергающемуся позадилонной простатэктомии. Позадилонная простатэктомия часто сопровождается большой потерей крови и последующей необходимостью в переливании. Субъектам, подвергающимся такой или подобной операции, для уменьшения периоперационной кровопотери путем повышения свертывания в месте операции можно ввести внутривенный болюс с терапевтическим количеством РУН на раннем этапе операции. Достигнутое уменьшение потери крови устраняет необходимость в переливании крови у этих больных (ГпейпсН и др., (2003) каисе! 361: 201-205). Полипептиды РУН могут быть введены пациентам с нормальной коагуляцией для достижения быстрого гемостаза и предотвращения потери крови при других видах хирургии. Не ограничивающие примеры хирургических процедур, при которых для уменьшения периоперационного кровотечения может быть введен РУН, как правило, в активированной форме (т.е. РУНа), включают, но не ограничиваются, операции на сердечных клапанах (А1 Ωουτί и др., (2000), Β1οοΗ С.оад НЬгикН 11: 121-127), замену аортального клапана (КакТгир и др., (2002) Аии Т1югас 8игд 74:910912), резекцию периодической гемангиоперицитомы (Оег1асй и др., (2002). I №игокиг§ 96:946-948), резекцию рака груди (8а]Нак и др., (2002). Еиг. к Оуиае^ 0η^1. 23: 325-326) и операциями на двенадцатиперстной кишке (Υ1οΙ и др., (2000) Ат. I МеН. 108:421-423). Лечение РУН может способствовать установлению гемостаза в месте операции и уменьшить или предотвратить потерю крови, тем самым умень- 97 020818 шая или упраздняя необходимость переливания крови. Предусмотренные здесь модифицированные полипептиды РУН проявляют повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУН и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшим количеством побочных реакций.
Обычно модифицированные полипептиды РУН вводят в виде активированных полипептидов РУН (РУПа).
Полипептиды фактора УЛ также могут быть использованы для содействия коагуляции и предотвращения потери крови у пациентов с травмами. Τравма определяется как повреждение живой ткани внешним агентом и является четвертой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Τравмы классифицируют на тупую травму (приводит к внутреннему сжатию, повреждению органов и внутреннему кровотечению) и проникающую травму (является следствием проникновения агента в тело и уничтожения тканей, сосудов и органов, приводит к наружному кровотечению). Τравма может быть вызвана несколькими событиями, включая, но не ограничиваясь дорожно-транспортными происшествиями (причинение тупой и/или проникающей травмы), огнестрельными ранениями (причинение проникающее травмы), колющими ранениями (причинение проникающей травмы), несчастными случаями при работе с механизмами (причинение проникающей и/или тупой травмы) и падением со значительной высоты (причинение проникающей и/или тупой травмы). Неконтролируемое кровотечение, возникшее вследствие травмы, ответственно за большую часть связанных с травмой смертельных случаев. Диффузная коагулопатия является относительно частым осложнением, связанным с травмой, встречающимся у 25-36% пациентов с травмой. Коагулопатия может развиваться вскоре после травмы в результате различных факторов, таких как разведение и потребление факторов свертывания крови и тромбоцитов, фибринолиз, ацидоз и гипотермия. Обычное лечение включает заместительную терапию при переливании свежезамороженной плазмы (СЗП), тромбоцитов, эритроцитов и/или криопреципитата, коррекцию ацидоза и лечения гипотермии. Эти меры часто являются недостаточными для остановки кровотечения и предотвращения смертельного исхода. Лечение введением терапевтического количества РУН может способствовать коагуляции и уменьшить потерю крови у пациента с травмой. Например, пациенту с огнестрельным ранением и большой кровопотерей, в дополнение к хирургическому вмешательству для контроля коагулопатии и кровотечения может быть введен РУП (Кене! и др., (1999) Ьапсе! 354:1879). Коагулянтная терапия РУН может эффективно уменьшить потерю крови и кровотечение у пациентов с тупой и проникающей травмой (Κΐζϋ1ΐ и др., (2006) СгП Саге 10:К178). Предусмотренные здесь модифицированные полипептиды РУП проявляют повышенную коагулянтную активность по сравнению с немодифицированным полипептидом РУП и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшим количеством побочных реакций. Обычно модифицированные полипептиды РУП вводят в виде активированных полипептидов РУП (РУПа).
Ι. Комбинированная терапия.
Любые модифицированные полипептиды РУН, описанные здесь, могут быть введены в комбинации с другим терапевтическим агентом или процедурой одновременно, периодически или последовательно, где агент или процедура включает, но не ограничивается другим биологическим агентом, низкомолекулярным соединением и хирургией. Для любого заболевания или состояния, включая все приведенные в качестве примеров выше заболевания и состояния, для которых РУН (в том числе РУПа и тРУНа) показан или был использован и для которых доступны другие агенты и лечение, РУН может быть использован в комбинации. Следовательно, модифицированные полипептиды РУН, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы аналогично. В зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению, примеры комбинаций включают, но не ограничиваются комбинациями с другими очищенными из плазмы или рекомбинантными факторами свертывания, прокоагулянтами, такими как витамин К, производные витамина К и ингибиторы белка С, плазмой, тромбоцитами, эритроцитами и кортикостероидами.
ί. Изделия и комплекты.
Модифицированные полипептиды РУН или нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды РУН, их производные или их биологически активные части могут быть упакованы в виде изделия, содержащего упаковочный материал, фармацевтическую композицию, которая является эффективной для лечения заболевания или нарушения свертывания крови, и этикетку, которая указывает, что модифицированные полипептиды РУН или молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для лечения заболевания или нарушения свертывания крови. В настоящем документе предусмотрены изделия, содержащие упаковочный материал. Упаковочные материалы, используемые для упаковки фармацевтических препаратов, хорошо известны специалистам в данной области. См., например, патенты США №№ 5323907, 5052558 и 5033352, каждый из которых включен здесь в полном объеме. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются блистерной упаковкой, бутылкой, тюбиком, ингалятором, насосом, пакетом, флаконом, контейнером, шприцем и любым упаковочным материалом, подходящим для выбранной композиции, способа введения и лечения. Широкий спектр предусмотренных здесь рецептур и композиций с соединениями по изобретению предназначен для разнообразных методов лечения любого заболевания или нарушения свертывания крови.
- 98 020818
Модифицированные полипептиды РУН и молекулы нуклеиновых кислот также могут быть предусмотрены в виде комплектов. Комплекты могут включать фармацевтическую композицию, описанную здесь, и устройство для введения. Например, модифицированные полипептиды РУН могут поставляться с устройством для введения, таким как шприц, ингалятор, дозировочный колпачок, пипетка или аппликатор. Комплект, при необходимости, может включать инструкции для применения с указанием дозы, режима дозирования и инструкции по способу введения. Комплекты также могут включать фармацевтическую композицию, описанную здесь, и устройство для диагностики. Например, такие комплекты могут включать устройство для измерения концентрации, количества или активности РУН или регулируемой РУН системы у субъекта.
Следующие примеры приведены в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема изобретения.
К. Примеры.
Пример 1. Клонирование и экспрессия РУН.
A. Клонирование РУН.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид предшественник изоформы человеческого РУН из 466 аминокислот (Р08709, приведен в ЗЕ9 ГО N0: 1), клонированы в вектор экспрессии млекопитающих рСМУ Зсг1р1 (З1га1адепе; ЗЕ9 ГО N0: 99), который содержит промотор цитомегаловируса (ЦМВ). Олигонуклеотиды СВО-125 (ЗЕ9 ГО N0 100) и СВО-126 (ЗЕ9 ГО N0: 101) были использованы в качестве прямого и обратного праймеров, соответственно, для амплификации последовательности РУН с помощью ПЦР с использованием кДНК человеческого РУН (Iην^ί^οдеη) в качестве матрицы. Праймер СВО-125 содержал сайт рестрикции ВатШ (выделен жирным шрифтом), последовательность Козака (двойное подчеркивание) и 18 нуклеотидов, гомологичных 5'-концу последовательности кДНК РУН (подчеркнуты), включая стартовый кодон АТ0. Праймер СВО-126 содержал сайт рестрикции Е^К! (выделен жирным шрифтом), стоп-кодон (двойное подчеркивание) и 21 нуклеотид, гомологичные 3'концу последовательности кДНК РУН (подчеркнут).
СВО-125 прямой праймер 5'дса1са1дасд1дасдда1ссдссасса1дд1с1сссаддссс1с3'
СВО-126 обратный праймер 5'да1сд1асда1асд1даа11сс1адддааа1ддддс1сдсаддад3'
Была использована стандартная реакция ПЦР и условия термоциклирования в сочетании с комплектом для ПЦР Ι<οΩ Н1Р1 РСК ΚίΙ (ЕМО Вюкаепсек) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР-продукт расщепляли ферментами рестрикции ВатШ и ЕтоИ и лигировали по сайтам рестрикции ВатШ и ЕтоИ в рСМУ Зсг1р1 вектор с использованием стандартных молекулярных методик. Вектором была трансформирована ЕксйепсЫа той. Были выращены выбранные колонии и были получены бактериальные клетки для очистки плазмид с помощью обычных методов молекулярной биологии.
B. Получение вариантов РУН.
Варианты РУН были получены с помощью комплекта для сайт-направленного мутагенеза ΟιιίΕСйапде II УБ ЗйеГОиеЫей МЫадепеык кН (З1га1адепе) в соответствии с инструкциями производителя с использованием специально разработанных олигонуклеотидов, которые служили в качестве праймеров для включения конкретных мутаций во вновь синтезированные молекулы ДНК. Метод ОЫкСйапде предполагает линейную амплификацию матрицы ДНК с помощью высокоточной ДНК-полимеразы РГиИЙга. Комплементарные праймеры, включающие желаемые мутации, удлинились в процессе реакции с использованием очищенного двухцепочечного суперспирального рСМУ Зспр1 вектора, содержащего клонированную кДНК РУН в качестве матрицы. Удлинение праймеров привело к включению желаемой мутации во вновь синтезированные цепи, что привело к мутированной плазмиде с расположенными уступом никами. После амплификации нуклеиновые кислоты обрабатывали ЭрЫ, которая расщепляла Оат-метилированные родительские нити полученного в Е. той рСМУ Зсг1р1 вектора. Это привело к отбору новосинтезированных мутированных плазмид, которые не были метилированы. Векторной ДНК, содержащей желаемую мутацию (мутации), трансформировали ультракомпетентные клетки Е.той X^100ο1ά, в которых бактериальная лигаза подвергла ники репарации, что позволило произойти нормальной репликации. В табл. 13 ниже приведены полученные варианты РУН.
Были получены варианты РУН, в которых в различные районы полипептида РУН была вставлена связывающая интегрин тромбоцитов α^β3 последовательность. В полипептид вставляли одну из трех различных связывающих интегрин α^β3 последовательностей: ЗЕОКОЭГОХУ (ЗЕ9 ГО N0: 110); СЗЕС.КС.1)1К\\Г (ЗЕС) ГО N0: 111) или С.С.С.ЗСЗЕС.КС.1)1К\УС (ЗЕС) ГО N0: 112). Связывающую интегрин α^β3 последовательность вставляли в С-конец полипептида РУН после аминокислотного остатка Р406 по нумерации зрелого РУН или последовательность вставляли, удаляя и заменяя аминокислотные остатки РУН с З103 до З111, с Н115 до З126 или с Т127 до Р134 по нумерации зрелого РУН. Также были получены другие варианты РУН, в которых была вставлена связывающая сывороточный альбумин последовательность. Эти варианты РУН содержали одну из семи различных связывающих сывороточный альбумин последовательностей: С)КС\1Е1)1ССРК\\'С.СС\\'Е1ГОЕ (ЗЕ9 ГО N0: 103), 1Е1)1СЕРК\\'С.СЕ\\'Е (ЗЕС) ГО N0: 104), ОГСЕРК^ОСЕ^ЕП (ЗЕС) ГО N0: 105), ШОГСЕРК^ССЕ^ (ЗЕС) ГО N0: 106), ОООЗШОЮЕРК^ОСЬ^ (ЗЕС) ГО N0: 107), 1)1СЕРР\\'С.СЕ\\'Е1) (ЗЕС) ГО N0: 108) или
- 99 020818
(.(.(^υΐα.ΡΚΧΥϋίΊΛΥΕΙ) (8Ер ΙΌ N0: 109).
Связывающую сывороточный альбумин последовательность вставляли в С-конец полипептида РУН после аминокислотного остатка Р406 по нумерации зрелого РУН или последовательность вставляли, удаляя и заменяя аминокислотные остатки РУН с 8103 до 8111, с Н115 до 8126 или с Т128 до Р134 по нумерации зрелого РУН.
Варианты РУН с заменой С1а из ИХ (т.е. полипептиды РУН, в которых эндогенный домен С1а был заменен на домен С1а из ИХ) содержат аминокислотные остатки с Υ1 до Υ45 из 8ЕР ΙΌ N0: 83 на Оконце. В некоторых примерах, варианты с заменой С1а из ИХ содержат одну или несколько замен аминокислот в домене С1а из ИХ. Мутации, которые находятся в домене С1а из ИХ, приведены в фигурных скобках и указаны с использованием аминокислотных позиций, соответствующих аминокислотным позициям в зрелом полипептиде ИХ дикого типа, или в домене С1а дикого типа из ИХ, приведенном в 8ЕР ΙΌ N0: 83. Например, {замена С1а из ИХ/М19К} означает, что модифицированный полипептид РУН содержит гетерологичный С1а домен из ИХ, в которой метионин в положении 19 домена С1а из ИХ, приведенном в 8ЕР ΙΌ N0: 83, заменен на лизин. В табл. 13 ниже приведены аминокислотные остатки, по которым в полипептид РУН тромбоцитов вставлены связывающие интегрин αΙ№β 3 или сывороточный альбумин последовательности, и последовательности аминокислот связывающих последовательностей. Например, Н1158126удаление/вставкад 0ΡΕΜΙ4)ΚΥΡΡΥ(ΚΎΥΙ4)Ι)Ι; означает, что аминокислотные остатки с Н115 до 8126 были удалены и заменены связывающей сывороточный альбумин последовательностью ΟΡΙ .ΜΙ4)Κ4.ΡΡ\Υ( ΚΤ\Υί4)Ι)Ι; (8Ер ΙΌ N0: 103).
Таблица 13
Варианты фактора УН
Вариант (по нумерации зрелого ЕУП) Вариант (по нумерации химотрипсина) ЗЕ<2 го ΝΟ полипептида РУП
Дикий тип Дикий тип 3
(2286Ν (2143Ν 113
(2286Е <2143Е 114
(2286ϋ <2143ϋ 115
<22868 <21433 116
Вариант (по нумерации зрелого РУН) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8Е<2 ГО N0 полипептида ГУН
(2286Т <2143Т 117
<2286К (2143К 118
(2286К <2143К 119
(2286А (2143А 120
(2286У (2143У 121
(2286М (2143М 122
<2286Ь (2143Ь 123
(2286Υ (2143Υ 124
Замена 01а Р1Х/<2286К Замена 01а Р1Х/<2143К 131
Н257АЛ2286К Н117АЛ2143К 132
8222А/(2286К 382АЛ2143К. 133
8222А/Н257АЛ2286К. 382А/Н117А/<2143К 134
Замена 01а Р1Х/ 8222АЛ2286К Замена 01а Р1Х/382А/(2143К 135
Замена 01а Р1Х/Н257А/<2286К Замена 01а ΡΙΧ/Η117АЛ2143К. 136
Замена 01а ΡΙΧ /8222А/Н257А/ (2286К Замена 01а ΡΙΧ /382А/Н117 А/ <2143К 137
<2286К/М298<2 <2143К/М156<2 138
<2286К/М298<2/К341<2 К192<2/<2143К/М156<2 139
К199Е/(2286К/М298(2 К60сЕ/<2143К/М 156(2 140
Замена 01а Р1Х/<2286К/М298(2 Замена 01а Р1Х/<2143К/М 156(2 141
<2286К/(2366У (2143КЛ2217У 142
φ286Κ/Α292Ν/Α2948^366ν (2143К/А150Ν/Α1523/(2217У 143
А1753/(2286К/(2366У АЗ 98/(2143К/(2217У 144
3222А/(2286К/(2366У 382А/(2143К/(2217У 145
Н2573/(2286К Н1178/0143К 146
Н2573/(2286КЛ2366У Н1173/(2143КЛ2217У 147
3222А/Н257АЛ2286К/(2366У 382А/Н117А/(2143К/(2217У 148
(2286К/Н373А (2143К/Н224А 149
3222А/Н257А/(2286К/М298(2 882А/Н117А/(2143К/М156(2 150
У158О/Е296У/М298(2 У158О/Е296У/М298(2 158
- 100 020818
Вариант (по нумерации зрелого РУН) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8ЕЦ Π) ΝΟ полипептида ГУП
9286К/К34ГО 9143К/К192О 151
9286Κ/9366Ώ 9143К/9217О 152
9286Κ79366Ν 9143Κ/9217Ν 153
9286Κ/Μ2989/9366Ώ 9143Κ/Μ1569/9217ϋ 154
9286Κ/Μ2989/9366Ν 9143К/М156(2/(2217Ν 155
9286К/Н373Р 9143К/Н224Р 156
9286К/М2989/Н373Р 9143К/М1569/Н224Р 157
Т2398 Т998 159
Τ239Ν Τ99Ν 160
Т2399 Т999 161
Т239У Т99У 162
Т239Ь Т99Ь 163
Т239Н Т99Н 164
Τ239Ι Τ99Ι 165
Р321К Р1701К 166
Р321Е Ρ170ΪΕ 167
Ρ321Υ Ρ170ΪΥ 168
Р3213 Ρ170Ϊ8 169
9366ϋ 9217ϋ 170
9366Е 9217Е 171
9366Ν 9217Ν 172
9366Т 9217Т 173
93668 92178 174
9366У 9217У 175
(^3661 92171 176
9366Ъ 9217Ъ 177
9366М 9217М 178
Η373ϋ Η224ϋ 179
Н373Е Н224Е 180
Вариант (по нумерации зрелого ГУН) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8Е<2 ГО ΝΟ полипептида РУН
Н3738 Н2248 181
Н373Р Н224Р 182
Н373А Н224А 183
9366ϋ/Η373Ε 9217Э/Н224Е 184
9366У/Н373У 9217У/Н224У 185
9366У/Н373Ь 9217У/Н224Ь 186
9366У/Н3731 9217У/Н2241 187
К1613 К243 188
К161А К24А 189
К161У К24У 190
Н2163 Н763 191
Н216А Н76А 192
Н216К Н76К 193
Н216К Н76К 194
8222А 382А 195
3222К 582К 196
8222У 882У 197
82220 882ϋ 200
3222Ν 582Ν 198
3222Е 882Е 199
Н257А Н117А 201
Н2573 Н1178 202
5222К/Н257А 382К/Н117А 203
Н216А/Н257А Н76А/Н117А 204
Н216А/3222А Н76А/882А 205
852А 3[52]А 206
860А 8 [60] А 207
Ε394Ν/Ρ395Α/Κ3963 Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2478 208
- 101 020818
Вариант (по нумерации зрелого РУП) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8ЕО ГО ΝΟ полипептида РУН
К2028 К.628 209
Α292Ν/Α2948 Α150Ν/Α1528 210
Ο318Ν Ο1701Ν 211
А1753 А393 212
Κ109Ν Κ-26Ν 213
Α122Ν/Ο1243 Α[122]Ν/Ο[124]8 214
Α51Ν Α-84Ν 215
Τ130Ν/Ε1328 Τ[130]Ν/Ε[132]8 216
850А/362А 8[50]Α/δ[62]Α 217
А122Ν/Ο1248/ЕЗ 94Ν/Ρ395А/К39 68 Α[ 122]Ν/Ο[ 124] 8/Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2478 218
Α122Ν/Ο1243/Ε394Ν/Ρ395Α/Κ39 68/ Ο318Ν А [ 122]Ν/Ο[ 124] 3/Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2473/Ο 170ίΝ 219
352Ν/Ρ543 δ[52]Ν/Ρ[54]δ 220
8119Ν/Ε1218 8[119]Ν/Ε[121]8 221
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 222
066Ν/Υ683 ζ)[66]Ν/Υ[68]δ 223
352Ν/Ρ543/Α122Ν/Ο1248/ЕЗ 94Ν /Р395А/К3963 δ [52]Ν/Ρ[54] 8/Α[ 122]Ν/Ο[ 124] 8 /Ε245Ν/Ρ246Α/Κ2473 224
Κ109Ν/Α292Ν/Α2948 [Κ109Ν] /Α150Ν/Α1528 225
Κ109Ν/Α1753 [Κ109Ν] /А398 226
У158Т/Ь287Т/М298К У21Т/Ы44Т/М156К 256
У158О/Ь287Т/М298К У2Ю/Е144Т/М156К 257
81038111 уд аление/вставкаОКЬ ΜΕϋΙΟΕΡΚΨΟΟΕν/ΕϋϋΡ δ [ 103] δ[ 111]удаление/вставка0КЬМЕО1 ΟΕΡΚΨΟΟΕΨΕϋϋΡ 227
Н115 8126удаление/вставкаОКЬ МЕОГСЕРКАУОСЬАУЕООР Η[115]8[126]удаление/вставка0КЬМЕО1 ΟΕΡΚΨΟΟΕΨΕϋϋΡ 228
Т12 8Р13 4удаление/вставкаОКЕ ΜΕϋΙΟΕΡΚΆΌΟΕΑΈϋϋΡ Т[128]Р[134]удаление/вставка0КЕМЕО1 ΟΕΡΚΨΟΟΕΨΕϋϋΡ 229
81038111удаление/вставка1ЕО1С ЬРК\УОСЬ\УЕ 8[103]8[111]удаление/вставка1ЕО1СЕРК ЖЗСЬХУЕ 230
Вариант (по нумерации зрелого РУП)
Вариант (по нумерации химотрипсина)
8ЕО Ю ΝΟ полипептида
РУП
Η1158126удаление/вставка1ЕО1 СЬРКТОСЬАУЕ Н[ 115] 8 [ 126]удаление/вставка1ЕО1СЬРК \УОСЬ\УЕ 231
Т128Р134удаление/вставка1ЕО1С ЬРКУ/ОСЬ^Е Т[128]Р[134] удал ение/вставка1ЕО1СЕРК \УОСЬАУЕ 232
81038111удаление/вставкаВ1СЬ РКУУОСЬУУЕО 8 [103]3[11 Вудаление/вставкаОЮЬРКХ^ ΟΟΕΨΕϋ 233
Н1158126удаление/вставкаО1СЬ РК\УОСЬАУЕО Н[ 115] 8 [ 126] удаление/вставкаОГСЬРКУУ ОСЬХУЕО 234
Т128Р134удаление/вставкаО1СЬ РКЖЗСЬХУЕО Т[128]Р[134]удаление/вставкаО1СЬРК\У ОСЬУУЕО 235
Р406вставка1ЕО1СЬРК9/ОСЕ\У Р257вставка1ЕО1СЕРК\УОСЬАУ 236
Р406вставкаООО31ЕО1СЬРК\УО СЬ\У Р257вставкаООО31ЕО1СЕРК\УОСЕ\У 237
Р406вставкаО1СЕРКАУОСЬАУЕО Р257вставкаО1СЬРК\УОСЕ\УЕО 238
Р406вставкаОООЗО1СЕРКАУОС ίΥ/Εϋ Р257вставкаОООЗО1СЕРК\УОСЕ\УЕО 239
81038111удаление/вставка8РОК ΟϋΙΚΝν 8 [ 103]8[111]удаление/вставкаЗРОКОО1К Νν 240
Н1158126удаление/вставкаЗРОК ΟϋΙΚΝν Η [ 115 ] 8 [ 126] удал ение/вставка8Р ΟΚΟϋΙ ΚΝν 241
Т127Р13 4удаление/вставкаЗ РОК ΟϋΙΚΝν Т[ 128]Р[ 134]удаление/вставка8РОКОО1К Νν 242
Р406вставкаСЗРОКОО1Ю4УС Р257вставкаС8РОКОО1Ю4УС 243
Р406вставкаООО8С8РОКОО1К ЙУС Р257вставкаОООЗСЗРОКООПШУС 244
Замена О1а ΡΙΧ/8222Α Замена О1а ΡΙΧ/882Α 245
Замена О1а ΡΙΧ/Η257Α Замена О1а ΡΙΧ/Η117Α 246
Замена О1а ΡΙΧ/3222Α/Η257Α Замена О1а ΡΙΧ/382Α/Η117А 247
3222А/М298С) 882А/М156С) 248
Н257А/М298С) Н117А/М156(2 249
3222А/Н257А/М298(5 382А/Н117А/М156С) 250
3222Α/Α292Ν/Α2943/(3366ν 882Α/Α150Ν/Α1523/ζ)217ν 251
А1753/3222А/(2366У АЗ98/882А/0217У 252
3222А/С)366У 382А/(}217У 253
Н2575/(}366У Н1178/(2217У 254
8222А/Н373А 882А/Н224А 255
- 102 020818
Вариант (по нумерации зрелого ГУН) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8Ε0 ГО ΝΟ полипептида РУН
81038111 удаление/вставка1ЕО1С ΕΡΚΛν00Ε\νΕ/Ο237ν 8 [103] 8[111]удаление/вставка1ЕО1СЕРР \УОСЕ\УЕ/О97У 258
81038111удаление/вставкаО1СЕ РКЛУОСЕЖГО/О237У 8 [ 103]8[111]удаление/вставкаО1СЕРКЛУ ОСЕАУЕО/О97У 259
Η115 8126удаление/вставка(2КЕ МЕО1СЕРКЛУОСЕАУЕООР/О237 V Н[ 115 ] 8 [ 126]удаление/вставка0КЕМЕО1 СЕРКЛУОСЕ9/ЕООР/О97У 260
Η115 8126удаление/вставка1ЕО1 СЕРКЛУОСЕ1УЕ/О237У Н[ 115] 8 [ 126]удал ение/вставка1ЕШСЬРК УУОСЕ1УЕ/О97У 261
Н1158126удаление/вставкаО1СЕ РКАУОСБ ν/Εϋ/0237V Η [ 115] 8 [ 126]удаление/вставкаО1СЕРКЛУ ОСЕ\УЕО/О97У 262
Т128Р13 4удаление/вставка(2КЕ МЕО1СЕРКЛУОСЕАУЕООР/О237 V Т[ 12 8] Р [ 134]удаление/вставка0КЕМЕО1 СЕРК\УОСЕ\УЕООР/097У 263
Т12 8Р13 4удаление/вставка1ЕО1С ЕРКЛУОСЕ\УЕ/О237У Т[ 12 8]Р [ 134]удаление/вставка1ЕО1СЕРК. \УОСЬ№Е/О97У 264
8103 8111 удаление/вставкаОКЕ МЕО1СЕРЮУОСЬ\УЕООР/О237 V 8[ 103]8[111]удаление/вставка0КЕМЕО1 СЕРР\¥ОСЕ\¥ЕООР/О97У 265
Т128Р134удаление/вставкаО1СЕ РК\УОСЕ\УЕО/О237У Т[12 8 ]Р [ 134]удаление/вставкаО1СЕРКЛУ Ο0ΕΨΕϋ/Ο97ν 266
81038111удаление/вставка8РОК. ΟϋΙΚΝν/Ο237ν 8 [ 103]8[ 111]удаление/вставка8Р0КО01К. Νν/Ο97ν 267
ЕЛ 158126удаление/вставкаЗРОК ΟϋΙΚΝν/Ο237ν Η [ 115 ] 8 [ 126] удал ение/вставкаЗР ΟΚΟϋΙ КЫУ/О97У 268
Т128Р134удаление/вставка8РОК ΟϋΙΚΝν/Ο237ν Τ[128]Р[ 134]удаление/вставкаЗРОКОО1К. Νν/Ο97ν 269
М298О/Н373Р М1560/Н224Р 270
8119Ν/Ε1218/Α1758 8[119]Ν/Ε[121]8/Α398 271
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398 272
Α122Ν/Ο1243/Α1753 Α[122]Ν/Ο[124]8/Α393 273
{Замена 01а Р1Х/Е40Е}/(2286К/М298(2 {Замена 01а Р1Х/Е[40]Ь}/О143К/М156О 274
{Замена О1а Р1Х/К431}/(2286К/М298(2 {Замена 01а Р1Х/К[43]1}/О143К/М156О 275
{Замена О1а ΡΙΧ/0443 }/(}286К/М298(2 {Замена 01а Р1Х/О[44]8}/О143К/М156О 276
{Замена О1а {Замена 01а Р1Х/М[19]К}/О143К/М156О 277
Вариант (по нумерации зрелого ГУН) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8Е0 ГО ΝΟ полипептида РУН
ΡΙΧ/Μ19К}/(2286К/М298(2
{Замена О1а НХ/М19К/Е40Е/К431/(2443}/02 86К/М298О {Замена 01а Р1Х/М[19]К/Е[40]Е/К[43]1/0[44]8}/0143 К/М156О 278
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ 279
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο 280
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/О286К/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Η224Ρ 281
У158О/0286К/Е296У/М2980 У21 ϋ/0143К/Е154У/М15 60 282
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/У158О/Е296У/М2 980 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ν21ϋ/Ε154ν/Μ156Ο 283
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/382Α 284
Замена О1а ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129А/8222А/О286К Замена 01а ΡΙΧ/Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α/Ο143Κ 285
Замена О1а Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο Замена 01а Р1Х/ Т[ 12 8 ]Ν/Ρ [ 129] А/0143К/М1560 286
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/Η257Α/Ο28 6Р/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/382Α/Η117А/О143К/М1 560 287
ΤΙ 28Ν/Ρ129 А/О286К/М298О/НЗ 73Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ/Μ156Ο/Η224Ρ 288
852А/860А/У158О/Е296У/М298 0 8 [52] А/8 [60] А/У21 ϋ/Ε 154У/М1560 289
352А/360А/О286К 8[52]Α/δ[60]Α/0143Κ. 290
852А/860А/8222А 8[52]Α/8[60]Α/882Α 291
Замена О1а Р1Х/ 352А/360А/3222А/0286К Замена О1а ΡΙΧ/δ[52]Α/δ[60]Α/882Α/0143Κ 292
852А/860А/О286К/М298О 8[52]А/3[60]А/О143Р/М156О 293
852А/860А/8222А/Н257А/О286 К/М298О 8[52]Α/δ[60]Α/882Α/Η117Α/Ο143Κ/Μ156 0 298
852А/860А/О286К7Н373Р 8[52]Α/8[60]Α/Ο143Κ/Η224Ρ 296
352А/360А/ О286К/М298О/Н373Р 8[52]Α/8[60]Α/Ο143Κ7Μ156Ο/Η224Ρ 297
V15 8ϋ/Τ239У/Е296У/М2980 У2ГО/Т99У/Е154У/М156О 298
Т239У/О286К Т99У/О143К. 299
8222А/Т239У 882А/Т99У 300
Замена О1а Р1Х/8222А/Т239У/О286К Замена О1а Р1Х/382А/Т99У/О143К 301
- 103 020818
Вариант (по нумерации зрелого РУП) Вариант (по нумерации химотрипсина) 5Е<2 ГО ΝΟ полипептида РУП
Т239У/(2286К/М298(2 Т99У/(2143К/М156(2 302
5222А/Т239У/Н257А/(2286К/М2 98(2 582А/Т99У/Н117А/(2143К/М156(2 303
Замена О1а Р1Х/Т239У/(2286К/М298(2 Замена 01а Р1Х/Т99У/(2143 К/М 156(2 304
Т239У/(2286К/Н373Р Т99У/(2143К/Н224Р 305
Т239У/(2286К/М298(2/Н373Р Т99У/(2143К/М156(2/Н224Р 306
VI 58О/Т2391/Е296У/М298(2 У21 ϋ/Τ99Ι/Ε 154 У/М156(2 307
Т2391/(2286К. Τ99ΙΛ2143Κ. 308
8222Α/Τ239Ι 882Α/Τ99Ι 309
Замена О1а Р1Х/5222А/Т2391/(2286К Замена 01а Р1Х/582А/Т991/(2143К 310
Т2391/(2286К/М298(2 Т991/(2143К/М 156(2 311
8222Α/Τ239Ι/Η257ΑΛ2286Κ/Μ29 8(2 582Α/Τ99Ι/Η117 А/(2143К/М156(2 312
Замена О1а Р1Х/ Т2391/(2286К/М298(2 Замена 01а ΡΙΧ/Τ99Ι/(2143К/М156(2 313
Τ239ΙΛ2286Κ/Η373Ρ Τ99ΙΛ2143Κ/Η224Ρ 314
Т2391/(2286К/М298(2/Н373Р Τ99ΙΛ2143Κ/Μ156(2/Н224Р 315
Замена О1а Р1Х/ 8222А/(2286К/Н373Р Замена 01а Р1Х/582А/(2143К/Н224Р 316
Замена О1а Р1Х/5222А/(2286К/М298(2 Замена 01а Р1Х/582А/(2143К/М156(2 317
Замена О1а Р1Х/ 8222А/(2286К/М298(2/Н373Р Замена О1а ΡΙΧ/582Α/(2143К/М15 6(2/Н224Р 318
У158О/Е296У/М298(2/Н373Р У2Ю/Е154У/М156(2/Н224Р 319
VI 58ϋ/(2286Κ/Ε296ν/Μ298(2/Η3 73Р У21 ϋ/(2143 К/Е154У/М15 6(2/Н224Р 320
Н257А/(2286К/М298(2 Р1117А/(2143К/М156(2 321
Р12575/(2286К/М298(2 Н1178/(2143К/М156(2 322
Замена О1а Р1Х/ 5222А/Н2575/(2286К Замена 01а ΡΙΧ/582Α/Η1178/(2143К 323
5222А/Н2575/(2286К/М298(2 582А/Н1175/(2143К/М156(2 324
Н2575/(2286К/М298(2/Н373Р Н1175/(2143К/М156(2/Н224Р 325
5222А/(2286К/М298(2/Р1373Р 582А/(2143К/М156(2/Н224Р 326
Вариант (по нумерации зрелого РУП) Вариант (по нумерации химотрипсина) ЗЕ<2 ГО ΝΟ полипептида РУП
Замена О1а Р1Х/(2366У Замена 01а Р1Х/()217У 327
5222А/(2286К/М298(2 582А/(2143К/М156(2 328
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1755/(2366ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/(2217ν 329
А122Ν/01248/А175 8/(2366V А[ 122]Ν/Ο[ 124] З/АЗ93/(2217V 330
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/8222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/882Α 331
А122Ν/01248/А 175 8/8222А А[ 122]Ν/Ο[ 124] 8/А398/882А 332
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/(2286Κ. Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/А393Л2143К 333
Α122Ν/Ο1248/Α1753/(2286Κ А[ 122]Ν/Ο[ 124] З/АЗ93/(2143К 334
Замена 01а ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129А/А1758/8222А/ (2286К Замена 01а Р1Х/Т[ 128]Ν/Ρ [ 129] А/ АЗ98/882А/(2143 К 335
Замена 01а ΡΙΧ/Α122Ν/Ο1248/А1753/8222А /(2286К Замена 01а Р1Х/А[ 122]Ν/Ο[ 124]5/А395/382А/(2143 К 336
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/А175 ЗЛ2286К/М2 98(2 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α393/(2143Κ/Μ156(2 337
А122Ν/01243/А175 3/(2286К/М2 98(2 Α[122]Ν/Ο[124]3/Α393/(2143Κ/Μ156(2 338
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/8222Α/Η25 7А/(2286К/М298(2 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α393/382Α/Η117АЛ214 ЗК/М156(2 339
А122Ν/01248/А 175 8/8222А/Н25 7А/(2286К/М298(2 А[ 122]Ν/Ο[ 124] 8/АЗ98/882А/Н 117 А/(214 ЗК/М156(2 340
Т128Ν/Ρ129 А/А175 8Л2286К/М2 98ф/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398/(2143Κ/Μ156(2/Η2 24Р 341
Α122Ν/Ο1248/Α1758/(2286Κ/Μ2 98(2/Н373Р А[ 122]Ν/Ο[ 124] З/АЗ93/(2143К/М156(2/Н 224Р 342
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298(2 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Μ156(2 354
(Замена О1а ΡΙΧ /К431} /Т128Ν/Ρ129АЛ2286К/М2 98(2 (Замена 01а ΡΙΧ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/(2143Κ/Μ156(2 355
Т128Ν/Ρ129 А/(2286К/М298(2/(23 66Ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/(2143Κ/Μ156(2/(2217Ν 356
(Замена 01а ΡΙΧ /Κ43Ι}/(2286Κ/Μ298(2/(2366Ν (Замена 01а ΡΙΧ /Κ[43]Ι}/(2143Κ/Μ156(2(2217Ν 357
(Замена О1а ΡΙΧ /К431}/ Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Μ298<2/<23 66Ν (Замена 01а ΡΙΧ /К[43]1}/ Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/(2143К/М156(2(2217Ν 358
- 104 020818
Вариант (по нумерации зрелого ГУП) Вариант (по нумерации химотрипсина) 8ЕО Ιϋ ΝΟ полипептида ГУН
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ο/Η373Ρ Т[ 128]Ν/Ρ [ 129] А/М15 6О/Н224Р 359
У158О/0286К/Е296У/М2980 У2Ю/О143К/Е154У/М156О 360
Μ298Ο/Ο366Ν/Η373Ρ М1560/0217Ν/Η224Ρ 361
Т239У/М298О/Н373Р Т99У/М1560/Н224Р 362
Τ239Ι/Μ298Ο/Η373Ρ Τ99Ι/Μ1560/Η224Ρ 363
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο3 66Ν/Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Ο143Κ7Μ156Ο/Ο217Ν/ Н224Р 364
Τ239ν/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν Т99У/0143К7М1560/0217Ν 365
Τ239Ι/(2286Κ/Μ298<Χ)366Ν Τ99Ι/0143 К/М1560/0217Ν 366
Τ128Ν/Ρ129А/Т239У/О286К/М2 980 Т[128]Я/Р[129]А/Т99У/О143К/М156О 367
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/8222А/Т239У/Н25 7Α/Ο286Κ/Μ298Ο Т[ 128]Ν/Ρ[ 129] А/882А/Т99У/Н117 А/014 ЗР/М156О 368
Τ128Ν/Ρ129А/Т239У/О286К/М2 98Ο/Η373Ρ Т[ 128]Ν/Ρ [ 129] А/Т99У/0143 К/М 156О/Н2 24Р 369
ΤΙ 28Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/Ο143Κ/Μ156Ο 370
ΤΙ 28Ν/Ρ129А/Т2391/О286К/М298О/ Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/Ο143Κ/Μ156Ο/ Н224Р 371
С. Экспрессия полипептидов РУН.
Для первичного анализа экспрессии с помощью ИФА и Вестерн-блоттинга полипептиды РУН экспрессировали в ВНК-21 клетках. Для биохимических анализов, таких как описано ниже, полипептиды РУН экспрессировали в Р^ееδίу1е™ 293-Р клетках (Ιηνΐίτο^η). Полипептид фактора УН дикого типа (8ЕР ГО Ν0: 3) и варианты полипептида РУН первоначально экспрессировали в линии клеток почки детеныша хомяка ВНК-21 (АТСС СКР 1632). ВНК-21 клетки культивировали в минимальной среде Игла (ЕМЕМ, Ιηνΐίτο^η) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в 100 мм культуральных чашках при 37°С и 5% СО2. После роста примерно до 90% покрытия клетки трансфицировали 24 мкг плазмидной ДНК РУН с использованием набора ЫроГе^атте 2000 Кй (ΙηνίΐΐΌ^η) в соответствии с инструкциями производителя. Среду сменили через 6 ч после трансфекции на ЕМЕМ среду без сыворотки, содержащую 1 мкг/мл витамина К1 (81§та), и инкубировали еще 72 ч. Экспрессию РУН в культуральную среду определяли методом ИФА или Вестерн-блоттинга.
Для последующего анализа с помощью биохимических методов, полипептид фактора УН дикого типа (8ЕР ГО Ν0: 3) и варианты полипептида РУН экспрессировали в Р^ееδίу1е™ 293-Р клетках (Ιηνΐίτοцен). Клетки культивировали в Р^ееδίу1е™ 293 среде (Ιηνΐίτο^η) при 37°С и 8% СО2 в колбах Эрленмейера с вентилируемыми крышками. Клетки трансфецировали по протоколу производителя. После роста до плотности 1x10 клеток/мл клетки центрифугировали и меняли среду. Затем клетки трансфецировали 240 мкг плазмидной ДНК РУН на каждые 240 мл клеток с использованием 293ί^ίΐη (ΙηνίΐΐΌ^η). Кроме того, на каждые 240 мл клеток было добавлено 50 мкл 1 мг/мл раствора витамина К1 (8щта) в этаноле. Клетки выращивали в течение 5 дней, после чего собирали культуральный супернатант. Экспрессию РУН в культуральную среду определяли методом ИФА.
В некоторых примерах варианты полипептида РУН и РУН дикого типа экспрессировали в СН0Ехргезз (СНОХ) клетках ^хсей^е^). СН0 Ехргезз (СНОХ) клетки держали в полной среде ОМ202 (8ΑРС Β^ο8с^еηсеδ) и использовали в качестве культуры для инокуляции продуцирующих культур. Культуры для инокуляции выращивали до плотности 5х106 жизнеспособных клеток/мл и около 60 мл культуры использовали инокуляции приблизительно 0,6 л полной среды ОМ202 (плотность инокуляции составляла 0,4х106 жизнеспособных клеток/мл) для получения продуцирующей культуры. Продуцирующую культуру выращивали в течение 4 дней для достижения плотности 8-12х106 жизнеспособных клеток/мл в день трансфекции. Комплекс для трансфекции формировали с помощью плазмидной ДНК фактора УН (6 мг) и 23,1 мг полиэтиленимина (РЕ^. Трансфекционный комплекс затем разводили в 0,5 л среды для трансфекции 0рй-МЕМ без сыворотки (Ιηνΐίτο^η) и добавляли в 0,6 л продуцирующей культуры. Спустя 5 ч после трансфекции культуру дополнительно разбавляли ~1 л РгоСН05 среды (Ροη/а) с добавлением 8 мМ Ь-глутамина и 4 мг/л витамина К1. Экспрессия белка в 2,2 л культуры во встряхиваемой колбе происходила в течение 5-7 дней до выделения сырого фактора УН. Затем с помощью фильтрации собирали культуральный супернатант и очищали РУН. Экспрессию одного из вариантов РУН (Р286К/М298Р) проводили в стабильной клеточной линии. Указанную линию получили в Еxсе11§еηе (МоиФеу, Уа1а13, Швейцария) путем трансфекции клеток СНОХ. Клетки, выращенные в присутствии метотрексата, высевали предельными разведениями по 1 клетке на лунку в 96-луночные планшеты. Клоны, продуцирующие высокие уровни варианта РУН, определяли методом ИФА. Один клон (клон 52) затем субклонировали с помощью второго предельного разведения и высеяли в 96-луночные планшеты. Колонии выращивали при 37°С в среде ^М204Α (8ΑРС В^^е^ез), дополненной 8 мМ Ь-глутамина, 1 мМ цистеина, 1 мг/л витамина К1. Методом ИФА были обнаружены 24 клона с более высокими уровнями экспрессии Р286К/М298Р по сравнению с исходным клоном 52. Эти 24 клона пересеяли в 6- 105 020818 луночные планшеты и выращивали в течение 6 дней, затем выращивали в 40 мл колбах при встряхивании в течение четырех дней. Каждую стадию роста проводили при 37°С в среде ЭМ204А, дополненной, как описано выше. После четырех дней роста клоны были заморожены при концентрации 1х107 жизнеспособных клеток/мл. Уровни продукции О286К/М298О каждого клона были определены методом ИФА. Клон 5Р7 обладал самой высокой производительностью, как правило, продуцируя 25-35 мг/л Р286К/М298Р.
1. ИФА.
Иммуноанализ был использован для количественного определения человеческого РУН и РУНа в образце. Поликлональные антитела к человеческому РУН были использованы для захвата и обнаружения протеазы в растворе. Иммуноанализ может быть использован для определения концентрации белка в кондиционированной среде или очищенном исходном растворе или для определения концентрации РУН в другом образце, например в образце плазмы человека или мыши. Базовый уровень РУН в крови человека составляет около 50 нМ, а концентрация ферментативно активной формы РУНа составляет около 1 нм.
Для определения количества человеческого РУН или РУНа белков в образцах был выполнен двойной ИФА. 96-луночные плоскодонные иммунопланшеты Мах15огр (Ыипс) покрыли 100 мкл 5 нг/мкл авидина на лунку (№иПАу1бш, Иегсе Вю1есЬ.). Планшеты покрыли и инкубировали при встряхивании в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) с последующей четырехкратной промывкой РВ8 с 0,01% твин-20 (РВ8Т). Планшеты блокировали в течение как минимум 1 ч при комнатной температуре при встряхивании путем инкубации с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (мас./об.) в РВ8 по 200 мкл на лунку. Блокированные планшеты хранили при -40°С до использования (до 2 недель). Перед использованием планшеты промывали четыре раза в РВ8Т для удаления БСА и в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку 1 нг/мкл раствора биотинилированных антифактор УН антител (К&Э БуЛепъ), планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин при встряхивании для образования комплекса с авидином. Избыток несвязанных антител отмыли с планшетов РВ8Т (четыре раза).
В планшеты добавили по 100 мкл/лунку последовательных двукратных разведений стандарта РУН (Атепсаг! □1ад1ТО5Пса; разводили в РВ8Т) от 50 до 0,8 нг/мкл. Лунка, содержащая РВ8Т без РУН, была использована в качестве контроля. Для анализа очищенных образцов РУН или РУНа (до и после активации, см. пример 3) образец сначала разводили 1:25 в РВ8Т, а затем последовательно разводили в два раза, получая 25-кратное, 50-кратное, 100-кратное и 200-кратное разведение. Разбавленные образцы добавляли в лунки по 100 мкл/лунку в двух повторностях. Для анализа образцов плазмы, содержащих РУН или РУНа, образец плазмы разводили 1:100 и 1:400 в РВ8Т и добавляли в лунки в двух повторностях по 100 мкл/лунку. Образцы плазмы без РУН или РУНа также были использованы для определения фонового уровня. Затем планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании для образования комплекса РУН или РУНа в образце с анти-РУП антителами.
После инкубации с образцом планшеты промывали 4 раза РВ8Т. Вторичные антитела, лошадиные античеловеческий РУЛ антитела или моноклональные античеловеческий РУН антитела (Αте^^саη Э1адгюЮса) разбавляли 1:5000 в РВ8Т и добавляли в каждую лунку в объеме 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании для образования комплекса добавленных антител со связанным РУН или РУН на планшете. Для удаления избытка вторичных антител планшеты промывали РВ8Т (4 раза). Для обнаружения связанных вторичных антител в каждую лунку добавляли 100 мкл коза антилошадь антител, сопряженных с НКР, разбавленных 1:5000 в РВ8Т, или 100 мкл коза антимышь антител, сопряженных с НКР, разведенных 1:20000 в РВ8Т. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании планшеты промывали четыре раза РВ8Т и добавляли 100 мкл/лунку раствора, содержащего 1:1 смесь субстрата ТМВ и пероксида водорода (Р1егсе Вю1есЬ.). Планшеты встряхивали в течение приблизительно 1 мин при комнатной температуре перед добавлением 100 мкл/лунку 2М Н2804 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью планшетного спектрофотометра Мо1еси1аг Оезасе М5 и фоновое значение для планшета (измеряли в лунке только с РВ8Т) вычитали из измеренных значений для каждой лунки. Стандартную кривую строили, откладывая значения поглощения против концентраций стандартов РУН. При указанных выше условиях диапазон стандартной кривой составлял приблизительно 0,2-50 нг/мл. Концентрацию каждого образца затем определяли с помощью калибровочной кривой и умножения на коэффициент разбавления, вычисляя среднее значение и стандартное отклонение.
2. Вестерн-блоттинг.
Экспрессия РУН в культуральную среду также определяли с помощью Вестерн-блоттинга. Аликвоты, содержащие неразбавленный образец или два последовательных разведения в два раза культуральной среды от трансфецированных РУЛ клеток в РВ8 (ВНК-21 или СНОХ клеток), обозначали Сопс. 1 (неразбавленный), Сопс. 2 (2-кратное разведение) и Сопс. 3 (4-кратное разведение). Образцы загрузили на полиакриламидный гель с 8Ό8 рядом с 10, 25 и 50 нг очищенного из плазмы гРУН в качестве контроля (Атепсаг1 □1адг1О511са). Белок РУН, вырабатываемый в ВНК-21 или СНОХ клетках, обнаруживали иммуноблоттингом с использованием первичных поликлональных лошадиных анти-РУН антител (Αте^^саη Охад^я!^, использовали в предложенной производителем концентрации) и НКР-конъюгированных антилошадь !дС вторичных антител (разведение 1:2000 1 мг/мл раствора от 2утеб ЬаЬогаЮНек). В некото- 106 020818 рых примерах РУН обнаруживали Вестерн-блоттингом с использованием первичных антител кролика против человеческого фактора УНа (Нета!о1од1с ТесЬпо1од1ек) и НКР-конъюгированных вторичных антител против ]дО кролика (!пу11годеп). Уровень экспрессии определяли по сравнению с очищенным из плазмы контрольным гРУН. Результаты показывают, что в аликвотах культуральной среды РУН присутствует в концентрации от 20 до более чем 50 нг.
Пример 2. Очистка и активация полипептидов РУН.
Полипептиды РУН очищали с использованием О 8ерЬагоке Рак! Р1о\у или СарЮЦ колонок (ОЕ НеаНЬсаге), на которых адсорбируются полипептиды РУН с функциональными доменами О1а, и последующей элюцией кальцием. Как правило, культуральный супернатант от трансфецированных клеток разбавляли в 2 раза раствором, содержащим 20 мМ Трис рН 8,0 и 0,01% Твин-20, а затем в разбавленный образец добавляли 500 мМ ЭДТА рН 8,0 до конечной концентрации 1,5 мМ. Образцы фильтровали перед нанесением на О 8ерЬагоке Рак! Р1о\у или Сар!оЦ колонки, которые были предварительно уравновешены сначала буфером В (20 мМ Трис рН 8,0,1М №С1, 0,01% твин 20), затем буфером А (20 мМ Трис рН 8,0, 0,15М №С1, 0,01% твин 20). После нанесения образца колонку промывали буфером до выхода значений поглощения элюата при 280 нм на базовый уровень. Буфер А заменяли на буфер С (20 мМ Трис рН 8,0, 0,15М №С1, 0,01% Твин-20, 5 мМ СаС12) и для полной замены буфера в трубках систему промыли насосом. После завершения промывания насосом буфер С пропускали через колонку при 8 мл/мин для элюирования полипептидов РУН, которые собирали во фракции. После элюирования колонку промывали буфером В, продолжая сбор фракций, до смывания розового пигмента (из культуральной среды) с колонки. Затем колонку промывали буфером для повторного уравновешивания его ее повторного использования.
Элюированные фракции затем очищали с использованием МопоЦ или ЦНГГгар колонки (ОЕ Неа1!Ьсаге), которая была предварительно уравновешена сначала буфером В, а затем буфером А. Фракции, собранные в буфере С выше, в которых содержится РУН, были объединены и разбавлены в 2 раза буфером А, затем к ним добавили ЭДТА, рН 8,0 до конечной концентрации 40 мМ. На данном этапе для анализа, например, методом ИФА были дополнительно отобраны малые аликвоты (например, 100 мкл). Объединенный образец нанесли на МопоЦ (или ЦШТгар) колонку, которую затем промыли буфером А. Для элюирования связанных полипептидов РУН через колонку пропускали градиент от 0% до 30% буфера В, собирая при этом фракции. Затем колонку промывали буфером В и буфером А для повторного уравновешивания его ее повторного использования.
В некоторых примерах, после первой колонки Сар!о О в объединенных фракциях производили замену буфера с помощью диафильтрации в буфер Ό (20 мМ МЕ8, рН 6,0, 10 мМ СаС12, 0,1М №С1, 0,01% твин 20) и последующего нанесения на колонку 8Р-НР, предварительно уравновешенную буфером Ό. После промывания буфером Ό колонку промыли градиентом от 0,1М №С1 до 1,0М №С1, собирая при этом фракции. Фракции, содержащие РУН, затем доводили до рН 8,0, разбавляли в 2 раза буфером Е (20 мМ Трис, рН 8,0, 10 мМ СаС12, 0,01% твин 20) и наносили на колонку О Н-НР, предварительно уравновешенную буфером Е. Колонку промывали буфером Е и РУН элюировали градиентом 0-1М №С1 в буфере Е.
Очищенные полипептиды РУН активировали с образованием РУПа с использованием биотинилированного фактора Ха из набора для расщепления фактором Ха и его удаления КекНтсНоп Рго!еаке Рас!ог Ха С1еауаде апб Кетоуа1 КН (КосЬе). Как правило, 7 фракций, полученных после очистки на МопоЦ, объединяли в 15 мл коническую пробирку и к ним добавляли 388 мкл 500 мМ СаС12, 38,9 мкл 10% БСА в дистиллированной воде и 3,2 мкг биотинилированного фактора Ха. После инкубации в течение 14-16 ч при температуре 37°С к смеси добавляли 250 мкл иммобилизованного авидина (Р1егсе) и образец перемешивали при 4°С в течение 30 мин. Полученный раствор фильтровали на Есопо-Рак колонке (Вю-Каб), фильтрат дополнительно смешивали с 250 мкл иммобилизованного авидина на 30 мин. Раствор снова фильтровали и фильтрат концентрировали до приблизительно 300-500 мкл с использованием Атюоп И1!га-410 кДа фильтра для центрифугирования (МННроге). Концентрацию РУПа затем определяли с помощью ИФА (как описано в примере 1.С.1) и уровень активации фактора VII контролировали методом Вестерн-блоттинга. Иммуноблоттинг проводили, как описано в примере 1.С.2, но с использованием антител кролика против человеческого фактора УНа (Наета!о1одю ТесНпо1од1ек, Шс) при разведении 1:2000 в течение 1 ч в качестве первичных антител, а затем с использованием НКР-коза антикроликНдО (Н ' Ь) антител (ШуНгодеп) при разведении 1:5000 в течение 30 мин.
Пример 3. Определение концентрации каталитически активной протеазы в растворе.
Концентрацию каталитически активной РУПа в неразбавленном растворе определяли титрованием комплекса фактора УНа и растворимого тканевого фактора (рТФ) необратимым ингибитором пептида РУПа, РНе-РНе-Агд-хлорметилкетоном (РРК-СМК). Ингибитор связывается с РУПа, но не с РУН. Продолжительная инкубация при высокой концентрации РУПа (50 нМ) обеспечивает полное титрование протеазы. Для определения концентрации каталитически активной РУПа в неразбавленном растворе определяли остаточную активность РУНа/ТФ комплекса после инкубации с РРК-СМК.
96-луночный прозрачный планшет формата На1Т агеа для анализа (Шпс) предварительно обрабатывали добавлением 150 мкл/лунку 1 х планшетного буфера (100 мМ Трис рН 8,4, 100 мМ №С1, 0,01% БСА, 0,01% твин-20) в каждую лунку и инкубацией планшета при 37°С в течение как минимум 1 ч. Бу- 107 020818 фер полностью удаляли бумажным полотенцем и центрифугировали планшеты вверх дном, чтобы удалить весь оставшийся буфер, планшеты сушили на воздухе в течение 1 ч и хранили закрытыми при комнатной температуре (КТ). Для приготовления РУIIа/рΤΦ/РРΚ-СΜΚ реакционной смеси раствор РУПа (Атепсап О1адпо5Йса; разбавляли до 5 мкМ 50 об.% глицерином и хранили в аликвотах при -20°С) или варианта РУПа сначала разбавляли до 500 нМ 1 х прямым буфером для анализа (100 мМ Τрис рН 8,4, 100 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,01% БСА). РУΠа/рΤΦ смесь готовили путем смешения 90 мкл дистиллированной воды с 36 мкл 5 х прямого буфера для анализа, 18 мкл 500 нМ РУПа и 18 мкл 5 мкм рΤΦ (рекомбинантный человеческий фактор свертывания ΙΙΙ/растворимый тканевый фактор, Κ&Ό 8у51ет5; неразбавленный раствор 19,6 мкМ в 50% глицерине разбавляли до 5 мкМ в 1 х прямом буфере для анализа и хранили до двух недель при температуре 4°С). Компоненты инкубировали для образования комплекса в течение 5 мин при комнатной температуре.
Исходный раствор 10 мМ РРК-СМК (ВаСНет) в ДМСО (хранили при температуре -20°С) разводили в воде до 3,5 мкМ. В одном ряду в 11 лунках непрозрачного 96-луночного полипропиленового планшета (Со5!аг) были приготовлены последовательные двукратные разведения РРК-СМК в воде, в последнюю лунку ряда внесли только воду в качестве контроля. Τаким образом, получили серию 10 х РРКСМК растворов ингибитора. В каждую лунку ряда предварительно обработанного прозрачного 96луночного планшета формата На1Н агеа для анализа добавили 10,8 мкл смеси РУΠа/рΤΦ, а затем 1,2 мкл 10 х РРК-СМК серийного раствора ингибитора. Растворы хорошо перемешивали и планшеты центрифугировали при <3000 об/мин в течение 5 мин для удаления каплей из лунок. Планшет закрыли и инкубировали в течение 8 ч при 37°С.
Для анализа остаточной активности РУПа/ΤΦ комплекса была приготовлена смесь субстрата 8ресΙΐΌζ\Ίΐκ РУПа (Атепсап 01адпо5Иса, # 217Ь; восстановленный исходный раствор, приготовленный растворением 50 мкмоль субстрата из флакона в 5 мл дистиллированной воды с получением 10 мМ раствора, хранили при 4°С) и 5-кратного прямого буфера (500 мМ Τрис рН 8,4, 500 мМ №С1, 25 мМ СаС12 и 0,05% БСА) путем смешивания 360 мкл 5 х прямого буфера для анализа с 180 мкл 10 мМ раствора 8ресΙΐΌζ.νιικ РУПа и 1080 мкл воды. В каждую лунку планшета для анализа добавляли 108 мкл приготовленного раствора субстрата. Содержимое лунок перемешали и планшеты инкубировали при 37°С. Увеличение абсорбции при 405 нм измеряли каждые 30 с в течение 1 ч при 37°С на планшетном спектрофотометре 8рес!гатах Оет1т М5 от Мо1еси1аг Ое\асе5.
С использованием 8ойМах Рго программного обеспечения (Мо1еси1аг Эеу1се5) были измерены величины абсорбции и определены относительные значения активности протеаз после инкубации с ингибитором путем деления измеренной скорости на скорость реакции, катализируемой не ингибированной протеазой. Относительную активность отложили против концентрации РРК-СМК и точки, которые составляли более 90% или менее 10% от не ингибированной активности, отбросили. Затем через остальные точки была проведена прямая и определена величина отрезка, отсекаемого прямой на оси Х, которая представляет собой концентрацию активной протеазы в растворе. Были измерены и усреднены величины из нескольких анализов, и было определено стандартное отклонение.
Пример 4. Определение каталитической активности РΥΠа для его субстрата фактора Х.
Каталитическую активность вариантов РУПа для его субстрата фактора Х (РХ) оценивали косвенно во флуоресцентном анализе путем анализа активности РХа, образованного при активации фактором РУЮ, активность РХа определяли с помощью синтетического субстрата 8рес!гаПиог РХа.
А. ΤΦ-зависимая каталитическая активность РУПа дикого типа для его субстрата фактора Х.
ΤΦ-зависимая каталитическая активность РУПа дикого типа оценивали с помощью флуоресцентного анализа, в который для обеспечения оптимальной активности РУПа была включена связанная с липидами форма очищенного тканевого фактора (ΤΦ). Активность фермента РХа для 8рес!гаПиог РХа (СН3802-Э-СНА-О1у-АТд-АМС.Ас0Н) определяли путем измерения увеличения абсорбции свободного флуорофора, АМС (7-амино-4-метилкумарин), как функции от времени. Полипептид РУПа дикого типа сначала разбавляли до 0,5 мкМ 1 х буфером для анализа (100 мМ Τрис рН 8,4, 100 мМ №С1, 5 мМ СаС12, и 0,01% БСА), а затем разбавляли до 0,1 нМ буфером для анализа. Связанный с липидами полноразмерный ΤΦ Оппоуш; Эабе ВеНппд) восстановили в 20 мл воды, получили 3 нМ раствор и разбавили его до 0,2 нМ в 1 х буфере для анализа. Четыреста мкл 0,1 нМ РУПа смешивали с 400 мкл 0,2 нМ ΤΦ и выдерживали при комнатной температуре в течение 5 мин. Раствор дополнительно два раза последовательно разбавляли в 2 раза в 1 * буфере с 0,2 нМ ΤΦ с получением в общей сложности трех разведений РУПа с концентрациями РУПа 0,05 нМ, 0,025 нМ или 0,0125 нМ, каждая из которых содержит 0,2 нМ ΤΦ (растворы РУПа/ΤΦ).
Субстрат фактор Х (РХ; Атепсап О1адпо5Нса, 80 мкг) восстанавливали в 135,6 мкл дистиллированной воды с получением 10 мкМ исходного раствора, который хранили в аликвотах при -80°С. Аликвоты не замораживали и оттаивали более одного раза. Исходный раствор РХ разбавляли до 800 нМ в прямом буфере для анализа, затем последовательно разводили в 2 раза с получением растворов с концентрацией РХ от 800 до 50 нМ.
8рес!гоПиог Ха (Атепсап О1адпо5Нса, 10 мкмоль) восстанавливали в дистиллированной воде до 5
- 108 020818 мМ и хранили при 4°С. В каждую лунку 96-луночного черного планшета для анализа формата Ьа1Г агеа (СоЫаг) добавляли 5 мкл 8ресί^οГ1иο^ Ха (Ате^^саη 0ί;·^ηο5ΐκ;·ι). Затем в каждую лунку добавили 25 мкл раствора РХ. Последний ряд лунок планшета служил отрицательным контролем без добавления РХ. В лунки соответствующих столбцов планшета в двух повторностях были добавлены растворы ТФ/РУПа трех концентраций по 20 мкл, так что каждое разведение ТФ/РУПа исследовали с каждым разведением РХ, при этом один набор столбцов не содержал добавленного ТФ/РУПа (т.е. только РХ). Содержимое планшета перемешали встряхиванием. Флуоресценцию измеряли во времени на спектрофлуориметре каждые 30 с в течение 1 ч при температуре 37°С (возбуждение: 380 нм, излучение: 450 нм, граница пропускания фильтра: 435 нм), время откладывали в единицах квадрата времени. После анализа на том же планшетном сканере была построена стандартная кривая флуоресценции АМС для перевода единиц флуоресценции в мкМ высвобожденного в процессе анализа субстрата. 1 мМ АМС в ДМСО (Iην^ί^οдеη) разбавляли до 0,02 мМ в 1 х буфере для анализа. Приготовили шесть последовательных двукратных разведений АМС в пределах от 20 нМ до 0,625 нМ в 1 х буфере. Флуоресценцию АМС измеряли при тех же условиях анализа, как описано выше, после чего строили зависимость флуоресценции от концентрации АМС. Был рассчитан наклон линии, который служил коэффициентом преобразования относительных единиц флуоресценции в мкМ в дальнейших расчетах.
Кинетические константы для активации РХ белком РУПа были рассчитаны с помощью линейной регрессии зависимости обратной концентрации субстрата от обратной скорости расщепления субстрата (в с2); Утах РУПа рассчитывали как величину, обратную отсекаемому на оси Υ отрезку, Кт РУПа рассчитывали как наклон прямой у отсекаемого на оси Υ отрезка, и Утах/Кт РУПа как обратный наклон. Величину Ккат получали с использованием уравнения
Ккат/КМ, руж = Утах/КМ, РУпа х 1/(0,5 х к2 х [РУПа, мкМ] х РРИ (единицы флуоресценции/коэффициент преобразования единиц флуоресценции, мкМ)), где к2 = ([8] х Ккат, РХа)/(КМ, РХа ' [8]), где Ккат, РХа и КМ, РХа являются константами для расщепления РХа субстрата 8ресί^οГ1иο^Xа, определяемыми экспериментально с помощью стандартов как Ккат, РХа = 117 с-1 и Км, РХа = 164 мкМ.
В указанных выше условиях анализа величина кинетической константы к2 составила 88,1 с-1.
Для оценки каталитической активности ккат/КМ (М-1с-1) каждого из вариантов РУПа для субстрата РХ были определены КМ и ккат (табл. 14). Протеаза РУПа дикого типа обладала активностью 1,8х 107 М-1с-1. Активация фактора Х фактором УПа, измеренная К^^5Ьηа5№ату и др., (ί. Βίο1. СЬет. (1998) 273:8 437886), составляла 2,9х107 М-1с-1.
В. Анализ каталитической активности вариантов РУПа для его субстрата фактора Х.
Каталитическую активность вариантов РУПа для субстрата фактора Х (РХ) оценивали косвенно с помощью двух типов хромогенного анализа путем анализа активности РХа, образованного при активации фактором РУПа, с помощью синтетического субстрата 8ресί^аГ1иο^ РХа. Для оценки ТФ-зависимой и ТФ-независимой активности анализы проводили в присутствии или в отсутствие связанного с липидами тканевого фактора. Варианты РУЛ были экспрессированы, очищены и активированы с образованием РУПа, как описано выше в примерах 1 и 2. Хотя большинство вариантов РУЛ были экспрессированы только в РгееЫу1е™ 293-Р клетках, некоторые из вариантов также были экспрессированы в ΒΠΠ-21 клетках.
Непрямой анализ в присутствии связанного с липидами тканевого фактора.
Каталитическую активность вариантов РУПа в присутствии тканевого фактора оценивали с помощью анализа, описанного в разделе А примера 4 выше, с незначительными изменениями. Одним из таких изменений было использование субстрата фактора Х, который были обработан ЕК0-СМК и РРК-СМК для уменьшения фоновой активности (Μο^υ^ί Iηηονаί^οη5)· Были использованы два типа анализа данных с использованием двух отдельных анализов: линейный анализ и гиперболический анализ. Для обеспечения точного измерения кинетических констант в линейном диапазоне кривой для линейного анализа использовали диапазон концентраций фактора Х между 0 и 150 нМ. Напротив, для обеспечения точного измерения кинетических констант в насыщающей (гиперболической) кривой использовали гиперболический анализ при концентрациях фактора Х между 0 и 1,44 мкм.
Непрямой анализ в линейном диапазоне в присутствии связанного с липидами тканевого фактора проводили, как описано в разделе А примера 4 выше, со следующими изменениями. Растворы варианта РУПа/ТФ приготовили в виде 0,1 нМ РУПа, 0,4 нМ ТФ растворов и инкубировали в течение 30 мин до разбавления в два раза 0,4 нМ ТФ с получением 1,5625 пМ РУПа/0,4 нМ ТФ раствора. 25 мкл раствора РУПа/ТФ смешивали с 25 мкл раствора субстрата, содержащего 1,0 мМ 8ресί^οГ1иο^ РХа (Ате^^саη ЭгадηοκίΚ;·!) и 300, 200, 133,3, 88,9, 59,3, 39,5, 36,3 или 0 нМ фактора Х (Μο^^^ Iηηονаί^οη5)· Таким образом, конечные концентрации для анализа составляли 0,8 пМ РУПа, 0,2 нМ ТФ, 0,5 мМ 8ресί^οГ1иο^ РХа и 150, 100, 66,7, 44,4, 29,6, 19,8, 13,2 или 0 нМ фактора Х (ΜοΚ^^ι· Iηηονаί^οη5) в 50 мкл/лунку. Стандартную кривую АМС, которая служила для преобразования единиц флуоресценции в мкМ в последующих расчетах, расширили за счет включения диапазон доз, который покрывал от 0 до 100 мкМ АМС.
Непрямой анализ в гиперболическом диапазоне в присутствии связанного с липидами тканевого фактора проводили, как описано в разделе А примера 4 выше, со следующими изменениями. Были при- 109 020818 готовлены растворы варианта ΡУIIа/ТФ в виде 0,1 нМ ΡУIIа/0,4 нМ ТФ раствора, их инкубировали в течение 30 минут, затем разбавили в два раза 0,4 нМ ТФ до 1,5625 пМ (или до 0,78 пМ в случае высокоактивной протеазы) ΡУIIа/0,4 нМ ТФ раствора. Двадцать пять мкл раствора ΡУIIа/ТФ смешивали с 25 мкл раствора субстрата, содержащего 1,0 мМ Зресΐ^οйиο^ РХа (Атепсаа ^^адηο5ί^са) и 1440, 720, 360, 180, 90, 45, 22,5 или 0 нМ фактора Х (Μο^ώ^ Iηηονаί^οη5). Таким образом, конечные концентрации для анализа составляли: 0,8 (или 0,39) пМ РМИа, 0,2 нМ ТФ, 0,5 мМ Зрес^И^! РХа и 7, 720, 360, 180, 90, 45, 22,5, 11,25 или 0 нМ фактора Х (ΜοΡ^Ιο· Iηηονаί^οη5) в 50 мкл/лунку. Параметры Ккат и КМ рассчитывали с использованием гиперболического уравнения Михаэлис Ментон вида ^^/(1+(^^))), Стандартную кривую АМС, которая служила для преобразования единиц флуоресценции в мкМ в последующих расчетах, расширили за счет включения диапазон доз, который покрывал от 0 до 100 мкМ АМС.
Для определения кинетических констант для активации РХ фактором РАНа или вариантом РАНа необработанные данные, полученные с помощью приложения δοΠΜηχ Ργο (\'1οΙοωΙ;ΐΓ Ое\асе5). экспортировали в ХМЬ-файлы. Дальнейшие линейные и нелинейные анализы данных проводили с помощью пакета программного обеспечения ХЬй14 для автоматизированного аппроксимирования кривых и статистического анализа в интерфейсе таблиц МюгоюП Ехсе1 (ШВЗ 3οΠ\υ3ιό).
При обработке данных с помощью линейного анализа кинетическую константу ккат/КМ (М-1с-1) вычисляли непосредственно из наклона прямой, полученной линейной регрессией зависимости концентрации РХ от скорости расщепления флуорогенного субстрата (в мкМ/с2), где ккат/КМ - наклон/[ΡVIIа]х0,5х к2. Значение поправочного коэффициента к2 было определено как 45, как описано в разделе А примера 4, значения экспериментально определенных кинетических констант составили ккат, Рха = 56 с-1 и КМ, РХа = 126 нМ для активированного РХ (РХа), в котором ранее оттитровали активные центры АТ-Ш/гепарином. При использовании обычных методов аппроксимации для обеспечения линейности исключили данные, которые приводили к значениям К2 менее 0,98.
Обработку данных, полученных из анализа гиперболического диапазона, проводили нелинейным регрессионным анализом зависимости концентрации РХ от скорости расщепления флуорогенного субстрата (в мкМ/с2). Отдельных параметры ккат и КМ рассчитывали как параметры аппроксимации с помощью гиперболического уравнения Михаэлиса-Ментон вида (^^/(1+(^^))), где ккат = ^^/^^^] х 0,5 хк2. Кинетическую константу ккат и КМ рассчитывали из параметров аппроксимации ккат и КМ.
Непрямой анализ без тканевого фактора.
Каталитическую активность вариантов ΡУIIа в присутствии тканевого фактора определяли в непрямом анализе, аналогичном описанному выше, за тем исключением, что тканевой фактор не был включен в анализ. Таким образом, анализ для оценки ТФ-независимой активности проводили, как описано выше, но с некоторыми изменениями. Растворы вариантов ΡУIIа разбавляли до 50 нМ (или 5 нМ для вариантов с ожидаемой высокой ТФ-независимой активностью). 25 мкл каждого раствора ΡУIIа смешивали с 25 мкл раствора субстрата, содержащего 1,0 мМ Зресΐ^οйиο^ РХа (Атепсаи ^^адηο5ί^са), и 1050, 700, 466,7, 311,1, 207,4, 138,3, 92,2 или 0 нМ фактора Х ^ο^π^ Iииονайοи5). Таким образом, конечные концентрации для анализа составляли: 25 нМ ΡУIIа (или 2,5 нМ для высокоактивных вариантов), 0,5 мМ Зрес^И^! РХа и 525, 350, 233,3, 155,6, 103,7, 69,1, 46,1 или 0 нМ фактора Х (Μο1еси1а^ Iииονаί^οη5) в 50 мкл/лунку. Анализ данных проводили, как описано для анализа линейного диапазона выше без изменений.
В табл. 14 приведена каталитическая активность вариантов ΡУIIа, измеренная непрямым ТФзависимым методом с использованием полипептидов ΡУIIа, экспрессированных в 293-Р клетках и ВНК21 клетках, и каталитическая активность, измеренная ТФ-независимым непрямым методом с использованием полипептидов ΡУIIа, экспрессированных в 293-Р клетках и/или ВНК-21 клетках. Результаты представлены в виде кинетической константы каталитической активности ккат/КМ (М-1с-1), а также выражены в процентах от активности ΡУIIа дикого типа, где активность представляет собой каталитическую активность кКАТ/КМ (М-1с-1) каждого варианта РМИа для его субстрата РХ. Для представленных в таблице данных указано использование линейного или гиперболического диапазона для анализа. Не все варианты ΡУIIа исследовали в каждом анализе. Несколько вариантов ΡУIIа проявляли увеличенную каталитическую активность по сравнению с молекулой ΡУIIа дикого типа. Например, полипептид ΡУIIа, содержащий только мутацию О286К (^286К-ΡУIIа), обладает в 2-3 раза более высокой каталитической активностью, чем ΡАΊIа дикого типа, а полипептид РМИа с мутацией О286К и мутацией М298О (О286К/М298ОΡУIIа) обладает каталитической активностью в 3 раза большей, чем активность ΡУIIа дикого типа.
- 110 020818
Таблица 14
Каталитическая активность вариантов РУНа
ТФ-зависимый непрямой анализ с полипептидами РУНа, полученными в 293-Р клетках
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Формат анализа Ккат/Км (М^сек'1) Ккат/Км (%от величины для дикого типа)
()286Ν ()143Ν гиперболический 4.88 х 107 100
Ц286Е ()143Е гиперболический 1.14 х 107 23
Ц286И ()143ϋ гиперболический 6.04 х 106 12
()2865 ()1435 гиперболический 4.64 х 107 95
()286Т ()143Т гиперболический 2.44 х 107 50
()286К. ()143К. линейный 1.11 х 108 323
()286К ()143К гиперболический 5.44 х 107 112
Ц286А ()143А гиперболический 8.55 х 107 175
()286У Ц143У гиперболический 1.65 х 107 34
Н2168 Н768 линейный 4.74 х 107 138
Н216А Н76А линейный 5.98 х 107 175
Н216К Н76К гиперболический 6.51 х 107 133
Н216К Н76К гиперболический 9.44 х 107 193
8222А 582А линейный 5.73 х 107 167
5222К 882К линейный 8.02 х 107 234
Н257А Н117А линейный 3.90 х 107 114
Н2578 Н1178 линейный 5.90 х 107 172
К1618 К248 гиперболический 5.99 х 107 123
К161А К24А линейный 4.22 х 107 123
К161У К24У гиперболический 5.45 х 107 112
Н373И Н224И линейный 1.79 х 107 52
Н373Е Н224Е линейный 2.79 х 107 81
Н3738 Н2245 линейный 2.75 х 107 80
Н373Р Н224Р линейный 5.11 х 107 149
Н373А Н224А линейный 3.11 х 107 91
552А 8[52]А линейный 4.66 х 107 136
560А 5[60]А линейный 5.15 х 107 150
()3660 ()217ϋ линейный 1.88 х 107 55
()366Е Ц217Е линейный 4.77 х 107 139
0366Ν ()217Ν линейный 5.64 х 107 165
()366Т ()217Т линейный 3.42 х 107 100
()3665 ()2175 линейный 2.70 х 107 79
О366У Ц217У линейный 6.59 х 107 192
Ε394Ν/Ρ395Α/Κ396 8 Ε245Ν/Ρ246Α/ К2478 линейный 5.32 х 107 155
К2025 К.625 линейный 2.57 х 107 75
Α292Ν/Α2948 Α150Ν/Α1525 линейный 0 0
Ο318Ν Ο1701Ν линейный 5.50 х 107 161
А1755 А398 линейный 3.32 х 107 97
Κ109Ν Κ[109]Ν линейный 5.97 х 107 174
- 111 020818
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]8 линейный 5.27 х 107 154
Τ130Ν/Ε1323 Τ[130]Ν/Ε[132]8 линейный 6.35 х 107 185
Α122Ν/Ο1248/ Ε394Ν/Ρ395Α/ КЗ 968 Α[122]Ν/Ο[124]8/ Ε245Ν/Ρ246Α/ К2473 линейный 4.88 х 107 142
У158Т/Р287Т/ М298К У21Т/Р144Т/М15 6К линейный 4.50 х 106 13
У158О/Р287Т/ Μ298Κ У2Ю/Р144Т/ М156К линейный 4.48 х 106 13
81038111удаление/ вставкаЗР ΟΚΟϋΙΚ Νν 8[103]8[111] удаление/вставка δΡΟΚΟϋΙΚΝν линейный 4.83 х 107 141
Р406тзС8РОКОШ ΚΝνΟ Р257тзС8РОКО ϋΙΚΝνΟ линейный 6.16 х 107 180
Р406тзООО8С8РО ΚΟϋΙΚΝνΟ Р257тзООО8С8 ΡΟΚΟϋΙΚΝνΟ линейный 7.47 х 107 218
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α линейный 5.96 х 107 174
8222А/ замена О1а ΡΙΧ 882А/замена 01а ΡΙΧ линейный 6.55 х 107 189
Н257А/ замена 01а ΡΙΧ Н117А/замена О1а ΡΙΧ линейный 6.45 х 107 186
8222А/Н257А/ замена О1а ΡΙΧ 382А/Н117А/ замена О1а ΡΙΧ линейный 5.77 х 107 168
<3286К/ замена О1а ΡΙΧ (3143К/замена 01а ΡΙΧ линейный 1.11 х 108 323
(3286К/Н257А (3143К/Н117А линейный 1.27 х 108 371
ζ)286Κ/3222Α (3143К/382А линейный 1.42 х 108 415
(3286К/3222А/ Н257А (3143К/382А/ Н117А линейный 9.51 х 107 278
(3286К/3222А/ замена 01а ΡΙΧ (3143К/382А/ замена 01а ΡΙΧ линейный 1.61 х 108 470
(3286К/Н257А/ замена 01а ΡΙΧ (3143К/Н117А/ замена 01а ΡΙΧ линейный 8.09 х 107 234
(3286К/3222А/Н257 А/замена О1а ΡΙΧ (3143К/382А/Н11 7 А/замена 01а ΡΙΧ линейный 7.75 х 107 226
ζ)286Κ/Μ298<3/ К341(2 ζ)143Κ/Μ156(^/ К192С2 линейный 3.93 х 107 115
(2286К/М298(3/ К199Е Р143К/М156(}/ КбОсЕ линейный 7.74x107 226
Т2398 Т993 линейный 1.74 х 107 51
Т239<3 Т99<2 линейный 1.74 х 107 51
Т239У Т99У линейный 9.57 х 107 279
Т239Ь Т99Р линейный 3.77 х 107 110
Т239Н Т99Н линейный 9.90 х 106 29
Τ239Ι Τ99Ι линейный 3.50 х 107 102
8222А/Н257А/ М298<2 882А/Н117А/ М156(} линейный 7.75 х 107 224
8222А/Н257А/ (}286К/М298(3 882А/Н117А/ (}143К/М156Р линейный 2.00x108 583
3222А/Н257А 882А/Н117А линейный 5.02 х 107 147
А1753/(2286К/ (}366У А393/(3143К/ (}217У линейный 8.08 х 107 236
А1758/8222А/ (}366У А398/882А/ (}217У линейный 3.78 х 107 109
Κ109Ν/Α1758 Κ[109]Ν/Α398 линейный 3.67 х 107 107
3222А/(}286К/ О366У 382А/(2143К/ 0217У линейный 1.27 х 108 369
(3286М О143М линейный 5.25 х 107 153
<3286Р р143Ь линейный 2.02 х 107 59
(3286Υ (2143Υ линейный 1.61 х 107 47
<23661 <22171 линейный 9.37 х 107 274
<2366Ь (2217Р линейный 6.87 х 107 201
(}366М ()217М линейный 6.61 х 107 193
8222У 382У линейный 6.04 х 107 176
8222Ό 382ϋ линейный 5.34 х 107 156
8222Ν 882Ν линейный 6.82 х 107 199
8222Е 882Е линейный 5.48 х 107 160
- 112 020818
Н216А/Н257А Н76А/Н117А линейный 6.62x107 193
Н216А/3222А Н76А/382А линейный 5.46 х 107 159
Н2578/О286К. Н1173/()143К. линейный 3.93 χ 107 115
Н2578/()366У Н1173/()217У линейный 6.71 χ 107 194
Н2573/()286К/ ()366У Н1178/О143К/ ()217У линейный 1.58 χ 108 457
3222А/Н257А/ ()286К7()366У 382А/Н117А/ ()143К/()217У линейный 1.86 χ 108 538
()366У/Н373У ()217У/Н224У линейный 1.84 χ 107 53
()366У/Н373Ь ()217У/Н224Ь линейный 3.07 χ 107 89
()286К/Н373А ()143К/Н224А линейный 5.89 χ 107 172
3222А/Н373А 382А/Н224А линейный 3.64 χ 107 106
()286К/М298()/ К34Ю ()143К/М156() /Κ192Ώ линейный 1.18 χ 107 34
(2286К/К34Ю <)143К/К192Э линейный 1.11 χ 107 32
()286К/()366О ()143КЛ)217О линейный 1.53 χ 107 45
()286Κ/()366Ν ()143Κ/()217Ν линейный 5.42 χ 107 158
()286К/М298()/ ()366ϋ ()143К/М156()/ ()217ϋ линейный 1.91 χ 107 56
()286К/М298()/ Ο366Ν () 143 К/М 156()/ ()217Ν линейный 1.04 χ 108 305
()286К/Н373Р ()143К/Н224Р линейный 9.08 χ 107 265
()286К/М298()/ Н373Р ()143К/М 156()/ Н224Р линейный 1.51 χ 108 440
М298()/Н373Р М156()/Н224Р линейный 8.49 χ 107 248
8119Н/Ы218/ А1755 8[119]К/Ь[121]8/ А393 линейный 2.92 х 107 85
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ А398 линейный 2.98 χ 107 87
Α122Ν/Ο1248/ А1758 Α[122]Ν/Ο[124]8/ А398 линейный 2.79 х 107 81
М298() М156() линейный 1.4 χ 108 409
ТФ-зависимый непрям Мутация (по нумерации зрелого РУН) Дикий тип ()286К. Н216А 3222А Н257А Н2573 Н373Р 852А 860А ()366ϋ Ο366Ν ()366У Ο318Ν А1758 Α122Ν/Ο1248 Α51Ν 352А/360А Р406вставкаООО8С8РО κουικΝνο 8119Н/Ь1218 Τ128Ν/Ρ129Α ()286К/3222А эй анализ с полип клез Мутация (по нумерации химотрипсина) Дикий тип ()143К Н76А 882А Н117А Н1178 Н224Р 8[52]А 8 [60] А <)217ϋ ()217Ν <)217У Ο1701Ν А393 Α[122]Ν/Ο[124]δ Α[51]Ν δ[52]Α/8[60]Α Р257вставкаООО δΟδΡΟΚΟϋΙΚΝν С 8[119]Н/Ь[121]8 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α ()143К/382А ептидами ГУП гках Формат анализа линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный линейный а, получени Ккат/Км (М’сек1) 5.42 х 107 1.01 χ 108 5.98 х 107 6.42 х 107 4.96x107 7.65 х 107 4.82 χ 107 3.50 χ 107 3.22 х 107 9.80 χ 106 3.44 χ 107 1.86 χ 108 5.46 х 107 2.12 χ 107 8.05 χ 107 1.02 χ 108 1.05 χ 108 9.54 х 107 5.75 χ 107 8.76 х 107 1.24 χ 108 ыми в ВНК-21 Ккат/Км (% от величины для дикого типа) 100 187 110 118 91 141 89 65 59 18 63 342 101 39 148 188 193 176 106 161 229
(2286К/3222А/Н257А ()143К/382А/ Н117А линейный 1.06 χ 108 196
()286К/8222А/ замена О1а ИХ ()143К/382А/ замена О1а ИХ линейный 8.52 χ 107 157
()286К/М298() ()143К/М156() линейный 1.85 χ 108 341
- 113 020818
О286К/М298О/К341О О143К/М156О/ К1920 линейный 3.11 х 107 57
О286К/М298О/К199Е (5143К/М156О/ КбОсЕ линейный 9.18 х 107 169
Р321К Ρ170ΪΚ линейный 3.43 х 107 63
Р321Е Ρ170ΪΕ линейный 5.59 х 107 103
Ρ321Υ Ρ170ΪΥ линейный 4.48 х 107 83
Р3218 Ρ170Ϊ8 линейный 5.53 х 107 102
Τ239Ν Τ99Ν линейный 1.64 х 107 30
Т239О Т99(5 линейный 1.70 х 107 31
Т239У Т99У линейный 9.81 х 107 181
Т239Ь Т99Ь линейный 5.24 х 107 97
Т239Н Т99Н линейный 1.25 х 107 23
Τ239Ι Τ99Ι линейный 4.67 х 107 86
8222А/М2980 882А/М156О линейный 7.13 х 107 131
Н257А/М298О Н117А/М156О линейный 1.28 х 108 236
8222А/Н257А/О286К/ М298О 882А/Н117А/ О143К/М156О линейный 1.94 х 108 358
О286К/М298О/замена О1а ΡΙΧ О143К/М156О/ замена 01а ΡΙΧ линейный 2.64 х 108 487
О286К/О366У О143КЛ5217У линейный 7.92 х 107 146
А1753/<5286К/<5366У А398/О143К/ 0217У линейный 7.63 х 107 141
Κ109Ν/Α1753 Κ[109]Ν/Α39δ линейный 2.45 х 107 45
3222А/О286КЛ5366У 382А/С5143К/ О217У линейный 1.44 х 108 265
О286К/М298О/К34Ю О143К/М156О/ К192Э линейный 1.35 х 107 25
О286К/Н373Р О143К/Н224Р линейный 1.18 х 108 218
О286К/М298О/Н373Р О143К/М156О/ Н224Р линейный 2.01 х 108 371
М298(}/Н373Р М1560/Н224Р линейный 8.69 х 107 160
Α122Ν/Ο1248/Α1758 Α[122]Ν/Ο[124]8/ линейный 1.93 х 107 36
А398
М298(} М156(5 линейный 9.34x107 172
ТФ-независимый непрямой анализ
Мутация (по нумерации зрелого КУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) 293-Р к ккат/км (М’сек1) летки Ккат/Км (% от величины для дикого типа) ВНК-2 Ккат/Км (М^сек1) 1 клетки Ккат/Км (% от величины для дикого типа)
\УТ \УТ 2.26х 101 100 1.58х 101 100
Ο286Ν Ο143Ν З.ОЗх 10' 134
О286Е О143Е 4.80 21
0286ϋ О143Э 3.50х 10’1 2
02868 01438 2.66х 101 118
О286Т О143Т 1.51х 10* 67
0286К. О143К 4.87х 10* 215 4.08х 10’ 259
О286К О143К 3.95х 101 175
О286А О143А 2.11х 10’ 93
О286У О143У 2.35 10
8222А 882А 7.36х 101 326 З.ГОх ГО1 197
Н257А Н117А 2.02х 10’ 89 1.18х ГО1 75
Н2578 Н1178 1.75х 101 77 1.33х ГО1 84
Ο366ϋ Ο217Ω 6.30 28 2.30 15
О366Е О217Е 2.38х 101 105
Ο366Ν Ο217Ν 2.26х 101 100 1.36х ГО1 86
О366Т О217Т 2.48х 101 110
03668 02178 1.02х 101 45
О366У О217У 2.90х 101 128 8.36х 10’ 530
Α51Ν Α[51]Ν 2.07х 10* 91
У158Т/Ь287Т/ М298К У21Т/Ы44Т/М15 6К 4.65 21
У158О/Ь287Т/ М298К У2Ю/Ы44Т/М15 6К 2.50 11
852А/860А 8[52]А/8[60]А 1.68х ГО1 106
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 1.43х 10' 91
О286Р/ замена 0143К/замена 4.37х 10’ 193
- 114 020818
В других экспериментах, каталитическую активность полипептидов РУНа, полученных в ВНК-21 клетках, исследовали с использованием ТФ-независимого и ТФ-зависимого непрямых анализов, как описано выше, с незначительными изменениями. Несколько вариантов были получены в клетках СНОХ в дополнение к ВНК-21 клеткам или исключительно в СНОХ клетках. Варианты были проанализированы в одинаковых условиях, независимо от использованной линии клеток. Для ТФ-зависимого каталитического анализа (с использованием линейного анализа) активные центры полипептидов РУНа сначала оттитровали с 4-метилумбеллиферил-р'-гуанидинобензоатом (МИОВ) для определения концентрации РУН Ы, как описано в примере 12 ниже. Для максимального увеличения количества точек в линейном диапазоне максимальная концентрация РX в анализе составляла 25 нМ (т.е. диапазон составлял 0-25 нМ вместо 0-150 нМ). РX, использованный в анализе, был активирован (т.е. РXа) и титрован флуоресцеин-монор'-гуанидинобензоатом (РМОВ), как описано в примере 15 ниже. Кинетические константы для расщепления субстрата 8рее1гаИиог РXа были определены с использованием РXа с оттитрованными активными центрами и составили КМ 190,2 мкМ и ккат 340 с-1. Основные различия затронули ккат и были обусловлены в основном улучшенным определением активных центров. Эти параметры привели к пересмотренному поправочному коэффициенту к2, значение которого составило 246,4, который использовали в линейном анализе для определения каталитической активности полипептидов РУНа в присутствии ТФ.
Для ТФ-независимого каталитического анализа активные центры полипептидов РУНа сначала оттитровали с 4-метилумбеллиферил-р'-гуанидинобензоатом (МИОВ) для определения концентрации РУН Ы, как описано в примере 12 ниже. Использованные для анализа РX были активированы (т.е. РXа) и оттитрованы флуоресцеин-моно-р'-гуанидинобензоатом (РМОВ), как описано в примере 15. Кинетические константы для расщепления субстрата 8рее1гаИиог РXа были определены с использованием РXа с оттитрованными активными центрами и составили КМ 190,2 мкМ и ккат 340 с-1. Эти параметры привели к пересмотренному поправочному коэффициенту к2, значение которого составило 246,4, который использовали в анализе для определения каталитической активности полипептидов РУНа в отсутствие ТФ. В табл. 15
- 115 020818 приведены каталитические активности каждого из проанализированных вариантов полипептидов ΡΥΙΙ-. Результаты представлены в виде кинетической константы каталитической активности ккат/КМ (М-1с-1), а также выражены в процентах от активности ΡΥΙΙ- дикого типа, где активность представляет собой каталитическую активность ккат/КМ (М-1 с-1) каждого варианта ΡΥΙΙ- для его субстрата ΡX. Также приведены стандартное отклонение (8Ώ), коэффициент вариации (% СΥ; в %) и число исследованных проб (М). Некоторые из вариантов проявляли заметное увеличение каталитической активности по сравнению с полипептидом ΡΥΙΙ дикого типа. Например, вариант с заменой 01а из ΡIX/^286Κ/Μ298^ проявлял ТФзависимую каталитическую активность, которая в 6 раз больше, чем активность полипептида ΡΥΙΙ дикого типа. Увеличенная каталитическая активность вариантов ΡΥΙΙ- была более выражена при ТФнезависимом анализе. Например, активность варианта с заменой 01а из ΡIX/^366Υ была более чем в 9 раз больше, чем каталитическая активность ΡΥΙΙ- дикого типа, активность вариантов с заменой 01а из ΡIX/^286Κ/Μ298^, заменой 01а из ΡIX/Ε40^^/^286Κ/Μ298^, заменой 01а из ΡIX/Κ43I/^286Κ/Μ298^ и заменой 01а из ΡIX/^448/^286Κ/Μ298^ была в 70-80 раз больше, чем каталитическая активность ΡΥΙΙдикого типа, а вариант 852А/860А/Υ158^/Ε296Υ/Μ1298^ был в 220 раза более каталитически активен, чем ΡΥΙΙ- дикого типа.
Таблица 15
Каталитическая активность вариантов ΡΥΙΙ-
ТФ-зависимый анализ
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) ккат/Км (М’сек1) Стандарт -ное отклоне- ние Коэф- фициент вариации ккат/Км (% от величины ДЛЯ дикого типа) N
Дикий тип (Νονοδενβη®) Дикий тип (Νονοδενβη®) 3.98Ε+07 1.02Е+07 26% 106% 30
Дикий тип (Νονοδβνεη-ΚΤ®) Дикий тип (Νονοδβνβη-ΚΤ®) 3.48Ε+07 8.33Е+06 24% 93% 10
Дикий тип Дикий тип 3.75Ε+07 5.44Е+06 15% 100% 13
Дикий тип £ Дикий тип £ 3.76Ε+07 7.09Е+06 19% 100% 10
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 4.65Ε+07 1.09Е+07 23% 124% 5
Замена 01а из ΡΙΧ Замена 01а из ΡΙΧ 5.38Ε+07 9.08Е+05 2% 144% 2
Κ109Ν Κ[109]Ν 5.54Ε+07 8.57Е+06 15% 148% 2
Α122Ν/Ο1243 Α[122]Ν/Ο[124]δ 3.87Ε+07 4.96Е+06 13% 103% 2
352А/360А δ[52]Α/δ[60]Α 3.56Ε+07 4.63Е+06 13% 95% 2
М298О М156О 6.76Ε+07 7.38Е+06 11% 180% 6
М298О ΐ ΜΙ 56(2 ΐ 7.46Ε+07 9.42Е+06 13% 198% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ο £ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Μ156(3ΐ 6.29Ε+07 1.28Е+07 20% 167% 4
У158О/Е296У/М2989 У2ГО/Е154У/М156() 1.81Ε+08 4.43Е+07 25% 482% 8
У158О/Е296У/М2989 ΐ У2Ю/Е154У/М156О1· 1.65Ε+08 4.08Е+07 25% 441% 10
Τ128Ν/Ρ129Α/νΐ58ϋ/ Е296У/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ν21ϋ /Е154У/М156О 2.01Ε+08 1.54Е+07 8% 537% 4
δ52Α/δ60Α/νΐ58ϋ/ Е296У/М 1298(2 3[52]А/3[60]А/У2ГО /Е154/М 156() 2.00Ε+08 4.31Е+05 0% 532% 2
Ο286Κ Ο143Κ 8.06Ε+07 1.43Е+07 18% 215% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Ο143Κ 8.45Ε+07 1.90Е+07 22% 226% 6
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ £ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ ()143Μ 6.20Ε+07 165% 1
352Α/360Α/Ο286Κ. δ[52]Α/δ[60]Α/Ο143Κ 4.10Ε+07 6.71Е+06 16% 109% 4
3222Α 382Α 4.07Ε+07 1.17Е+07 29% 109% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/δ82Α 6.25Ε+07 6.78Е+06 11% 167% 4
352Α/360Α/3222Α δ[52]Α/δ[60]Α/382Α 3.91Ε+07 8.75Е+06 22% 104% 3
Η2573 Η1173 1.18Ε+08 2.02Е+07 17% 316% 2
Η373Ρ Η224Ρ 5.58Ε+07 2.05Е+07 37% 149% 2
()366У 0217У 5.48Ε+07 2.69Е+06 5% 146% 2
Замена О1а из ΡΙΧ/ О366У Замена 01а из ΡΙΧ/ 0217У 9.11Ε+07 2.50Е+07 27% 243% 3
Α1753 Α39δ 2.11Ε+07 6.10Е+06 29% 56% 3
Κ.109Ν/Α1753 Κ[109]Ν/Α39δ 1.74Ε+07 4.29Е+06 25% 46% 5
δΐ 19Ы/Ы213/А1753 δ[119]Ν/Ε[121]δ/Α39δ 1.73Ε+07 1.28Е+06 7% 46% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ 8.59Ε+06 1.82Е+06 21% 23% 2
Α122Ν/Ο1243/Α1753 Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α39δ 1.05Ε+07 1.12Е+06 11% 28% 2
Ο286Κ/Η257Α Ο143Κ/Η117Α 9.91Ε+07 1.74Е+07 18% 264% 2
Ο286Κ/Η257Α ΐ Ο143Κ/Η117Α ΐ 3.08Ε+07 1.52Е+07 49% 82% 4
(3286Κ/3222Α ()143Κ/382Α 1.11Ε+08 3.21Е+07 29% 296% 4
- 116 020818
Замена 01а из РГХ/ Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А/О286К Замена 01а из Р1Х/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 882А/О143К 1.47Е+08 2.53Е+07 17% 393% 3
Замена 01а из Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/ 5222А/О286К | Замена 01а из Р1Х/ Τ[128]Ν/Ρ[Ι29]Α/ 882А/О143К. Г 1.43Е+08 1.63Е+07 11% 379% 2
Замена 01а из Р1Х/ 552А/860А/8222А/ О286К Замена 01а из Р1Х/ 8[52]А/8[60]А/882А/ О143К 7.24Е+07 2.36Е+06 3% 193% 2
О286К/8222А/Н257А О143Р/882А/Н117А 6.98Е+07 1.64Е+07 23% 186% 3
О286К/М298О О143К/М156О 1.66Е+08 3.86Е+07 23% 442% 14
О286К/М298О Г О143К/М156О | 1.34Е+08 2.37Е+07 18% 356% 15
О286К/М298О § О143К/М156О § 1.54Е+08 3.86Е+07 25% 408% 6
Замена 01а из Р1Х/ О286К/М298О Замена 01а из Р1Х/ О143К/М156О 2.55Е+08 6.16Е+07 24% 680% 6
Замена 01а из Р1Х/ О286К/М298О Г Замена 01а из Р1Х/ О143К/М156ОТ 2.30Е+08 5.10Е+07 22% 613% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Ρ/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О 1.86Е+08 2.64Е+07 14% 497% 6
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Т Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143КУ М156О Τ 1.50Е+08 4.16Е+07 28% 398% 4
Замена 01а из ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Замена 01а из ΡΙΧ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О 2.11Е+08 4.41Е+07 21% 562% 3
Замена 01а из ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Г Замена 01а из ΡΙΧ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О1· 1.99Е+08 6.79Е+07 34% 529% 5
{Замена 01а из Р1Х/Е40Ц/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/Е[40]Ь}/ 0143 К/М1560 2.08Е+08 4.39Е+07 21% 556% 4
{Замена О1а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ О143К/М156О 2.73Е+08 5.21Е+07 19% 727% 5
{Замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ О286К/М298О Г {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ О143К/М156О | 2.91Е+08 4.30Е+07 15% 774% 5
{Замена 01а из ΡΙΧ/0448}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/О[44]8}/ О143К/М156О 1.98Е+08 2.75Е+07 14% 529% 3
{Замена 01а из ΡΙΧ/Μ19Κ}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/М[19]К}/ О143К/М156О 1.41Е+08 5.22Е+06 4% 375% 2
852А/860А/ 8[52]А/8[60]А/О143К/ 1.25Е+08 1.14Е+07 9% 333% 4
- 117 020818
О286К/М298О/Н373Р 9143К/М156О/Н224Р 1.36Ε+08 1.92Ε+07 14% 364% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/(3286Κ/ Μ298Ο/Η373Ρ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Р143К/М156О/Н224Р 1.33Ε+08 4.77Ε+07 36% 354% 17
852А/860А/р286К/ Μ298(])/Η373Ρ 8[52]А/8[60]А/(2143К/ М156С2/Н224Р 1.77Ε+08 3.63Ε+07 21% 472% 3
М298(}/Н373Р М156(}/Н224Р 7.21Ε+07 1.76Ε+07 24% 192% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298Ρ/ Н373Р ΐ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ М156<3/Н224Р Г 6.07Ε+07 1.29Ε+07 21% 161% 2
νΐ58ϋ/Ο286Κ/Ε296ν/ М298О У2т/(}143К/Е154У/ М 156<3 1.49Ε+08 3.59Ε+07 24% 397% 11
5222А/Т239У 882А/Т99У 7.49Ε+07 2.57Ε+06 3% 200% 3
Замена 01а из ΡΙΧ /3222Α/Τ239ν/ζ)286Κ Замена 01а из ΡΙΧ /382А/Т99У/(3143К 2.03Ε+08 3.16Ε+07 16% 541% 3
Замена 01а из ΡΙΧ /8222А/Т239У/О286К ΐ Замена 01а из ΡΙΧ /882А/Т99У/О143К Г 9.94Ε+07 1.83Ε+07 18% 264% 3
Т239У/р286К/М298(2 Т99У/(3143К/М156(2 1.72Ε+08 4.92Ε+07 29% 459% 5
Замена 01а из Р1Х/ Т239У/О286К/М298О Замена 01а из Р1Х/ Т99У/(}143К/М 156(3 2.53Ε+08 4.78Ε+07 19% 675% 3
Замена 01а из Р1Х/ Т239У/(}286К/М298(3 ΐ Замена 01а из Р1Х/ Т99УЛ3143К/М1560 Т 1.79Ε+08 3.81Ε+07 21% 477% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/ Р286К/М298(]) Г Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν /О143К/М 156(3 Г 1.04Ε+08 2.43Ε+07 23% 276% 4
8222А/Т239У/Н257А/ О286К/М298() 882А/Т99У/Н117А/ ζ)143Κ/Μ156() 2.14Ε+08 4.48Ε+07 21% 571% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/ Т239У/Н257А/ (}286Κ/Μ298ζ) ΐ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/382Α /Т99У/Н117А/(3143К/ М156С2Т 1.21Ε+08 5.58Ε+06 5% 323% 3
Т239У/О286К/Н373Р Т99УЛ3143К/Н224Р 1.06Ε+08 1.34Ε+07 13% 283% 2
Т239У/р286К/М298(}/ Н373Р Т99У/(3143К/М156(3/ Н224Р 1.70Ε+08 1.13Ε+07 7% 454% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/(2 286К/М298СУН373Р Г Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99ν /(3143К/М156(3/Н224Р ΐ 2.36Ε+08 2.77Ε+07 12% 627% 3
У158О/Т2391/Е296У/ М298(} У2Ю/Т991/Е154У/ М156(3 1.45Ε+08 1.18Ε+07 8% 387% 4
Τ239Ι/Ο286Κ. Т991/(3143К 5.79Ε+07 1.39Ε+07 24% 155% 3
8222Α/Τ239Ι 382Α/Τ99Ι 3.05Ε+07 9.26Ε+06 30% 81% 4
Замена 01а из ΡΙΧ /5222А/Т2391/(}286К Замена 01а из ΡΙΧ /382А/Т991/(3143К 6.77Ε+07 4.44Ε+06 7% 181% 2
Τ239Ι/ζ)286Κ/Μ298(]) Т991/(3143К/М 156(3 1.13Ε+08 3.68Ε+06 3% 301% 2
Замена 01а из Р1Х/ Т2391/(2286К/М298(3 Замена 01а из ΡΙΧ /Т991/(3143К/М 156(3 1.25Ε+08 2.13Ε+07 17% 334% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ23 91/(2 286К/М298<3 ΐ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/ (3143Κ/Μ156(3ΐ 8.17Ε+07 8.17Ε+06 10% 217% 3
8222А/Т2391/Н257А/ О286К/М2989 582Α/Τ99Ι/Η117А/ (3143К/М 156(3 1.14Ε+08 2.22Ε+07 19% 304% 3
Τ239Ι/Ο286Κ/Η373Ρ Τ99Ι/(3143Κ/Η224Ρ 6.18Ε+07 9.27Ε+06 15% 165% 3
VI58Э/Т239У/Е296У/ М298<3 У2Ю/Т99У/Е154У/ Μ 156(3 2.22Ε+08 1.39Ε+07 6% 591% 2
У158О/Т239У/Е296У/ М298(2 ί У2Ю/Т99У/Е154У/М1 560-Г 1.65Ε+08 2.12Ε+06 1% 438% 2
Т239У/(3286К. Т99У/(3143К 8.84Ε+07 7.16Ε+05 1% 236% 2
Т2391/()286К/М298(2/ Н237Р Т991/(3143К/М156(3/ Н224Р 1.08Ε+08 2.32Ε+07 21% 289% 7
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/Ο 286К/М298(3/ Н237Р Г Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Τ99Ι/ (3143К/М156(3/Р1224Р ΐ 1.30Ε+08 2.51Ε+07 19% 345% 5
Н2578/(2286К/М298() Н1173/<3143К/М156(3 1.40Ε+08 8.97Ε+06 6% 372% 4
Замена 01а из ΡΙΧ /О286К/8222А/Н2578 Замена 01а из ΡΙΧ /(3143К/582А/Н1175 8.53Ε+07 1.66Ε+07 20% 227% 3
3222А/Н2575/О286К/ М298() 382А/Н1173/О143К/ М156(3 1.58Ε+08 1.76Ε+07 11% 420% 2
Н2573/(3286К/М298(3/ Н373Р НИ 73/(3143К/М156(3/ Н224Р 1.52Ε+08 3.35Ε+07 22% 407% 7
8222А/О286К/М298О/ Н373Р 882А/(3143К/М 156(3/ Н224Р 1.48Ε+08 2.23 Ε+06 2% 395% 2
Замена 01а из Р1Х/8222А/ О286К/М298Р/Н373Р Замена 01а из ΡΙΧ 882А/(3143К/М156(3/ Н224Р 2.84Ε+08 4.85Ε+07 17% 758% 3
8222А/(2286К/М298() 882А/(3143К/М156(3 1.29Ε+08 1.86Ε+07 14% 343% 3
Замена 01а из Р1Х/ 3222А/(3286К/М298О Замена 01а из ΡΙΧ 882АЛ3143К/М 156(3 2.10Ε+08 4.28Ε+07 20% 559% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ О366У Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398 /(3217У 3.38Ε+07 3.06Ε+06 9% 90% 2
Α122Ν/Ο1243/Α1753/ (3366У А[ 122]Ν/Ο[ 124]8/А398 /(3217У 3.02Ε+07 7.05Ε+06 23% 80% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ 3222А Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α398 /382А 1.72Ε+07 3.18Ε+06 18% 46% 3
Α122Ν/Ο1243/Α1753/ А[ 122]Ν/Ο[ 124]8/А398 /382А 2.08Ε+07 5.05Ε+06 24% 56% 5
- 118 020818
8222А
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ О286К Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ /О143К 3.33 Ε+07 1.46Ε+06 4% 89% 3
Α122Ν/Ο1248/Α1758/ О286К Α[122]Ν/Ο[124]8/Α398 /О143К 4.11 Ε+07 5.27Ε+06 13% 110% 5
Замена 01а из Р1Х/ 3222А/О286К/Н373Р Замена 01а из ΡΙΧ/ 382Α/Ο143Κ/Η224Ρ 1.22Ε+08 3.17Ε+07 26% 327% 8
У158О/Е296У/М2980/ Н373Р У2ГО/Е154У/М156(^/ Η224Ρ 1.51Ε+08 8.39Ε+06 6% 402% 3
Н257А/О286К/М298О Η] 17Α/Ο143Κ/Μ156Ο 1.13Ε+Ο8 1.55Ε+07 14% 301% 3
Замена 01а из Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ 3222А/О286К Замена 01а из Р1Х/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ /882А/О143К 3.88Ε+07 2.74Ε+06 7% 104% 3
Замена 01а из Р1Х/ Α122Ν/Ο1243/Α1753/ 3222А/О286К Замена 01а из Р1Х/ Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α39δ /382А/О143К 4.13Ε+07 8.99Ε+06 22% 110% 6
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ О286К/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ /О143К/М156О 7.21 Ε+07 1.14Ε+07 16% 192% 3
Α122Ν/Ο1243/Α1753/ О286К/М298О Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α39δ /О143К/М156О 7.43 Ε+07 1.10Ε+07 15% 198% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/ 3222А/Н257А/О286К/ М298О Т[ 128]Ν/Ρ[129] А/А398 /882А/Н117А/О143К/ Μ156Ο 6.89Ε+07 3.36Ε+06 5% 184% 3
Α122Ν/Ο1243/Α1753/ 5222А/Н257А/О286К/ М298О Α[122]Ν/Ο[124]8/Α39δ /882А/Н117А/О143К/ ΜΙ 560 8.40Ε+07 5.72Ε+06 7% 224% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/ О286К/М298О/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ /О143К/М156О/Н224Р 5.72Ε+07 3.36Ε+06 6% 153% 3
Α122Ν/Ο1243/Α1758/ О286К/М298О/Н373Р Α[122]Ν/Ο[124]δ/Α39δ /О143К/М156О/Н224Р 8.39Ε+07 9.99Ε+06 12% 224% 3
У158О/0286К/Е296У/ М298О/Н373Р У2Ш/(Д43К/Е154У/ Μ156Ο/Η224Ρ 2.39Ε+08 3.82Ε+07 16% 638% 5
Μ298Ο/Ο366Ν/Η373Ρ Т ΜΙ 560/0217Ν/Η224Ρ ΐ 7.05Ε+07 1.78Ε+07 25% 188% 3
Т239У/М298О/Н373Р ΐ Т99У/М156О/Н224Р | 4.43Ε+07 1.10Ε+07 25% 118% 3
Τ239Ι/Μ298Ο/Η373Ρ | Τ99Ι/Μ1560/Η224Ρ | 3.47Ε+07 4.57Ε+06 13% 92% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/0286Κ/ Μ298Ο/Ο366Ν/Η373Ρ Τ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Ο143Κ/Μ156Ο/Ο217Ν/ Η224Ρ I 1.33Ε+08 1.81 Ε+07 14% 355% 2
Т239У/О286К/М298О/ Ο366Ν ΐ Т99У/О143К/М156О/ ζ)217Ν ΐ 1.85Ε+08 5.96Ε+07 32% 491% 4
Τ239Ι/ζ)286Κ/Μ298ζ)/ Ο366Ν ΐ Т991/О143К/М156О/ 0217Ν ΐ 7.40Ε+07 1.40Ε+07 19% 197% 4
ТФ-зависимый анализ
Мутация (по нумерации зрелого ГУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) (М^сек'1) Стандарт -ное отклоне- ние Коэф- фициент вариации ккау/Км (% ОТ величи ины для дикого типа) N
Дикий тип (Νονοδβνβη®) Дикий тип (Νονοδβνβη®) 9.8 3.0 30% 88% 14
Дикий тип (Νονοδβνβη-Κ,Τ®) Дикий тип (Νονοδβνβη-ΚΤ®) 12.4 4.3 35% 112% 12
Дикий тип Дикий тип 11.1 2.7 25% 100% 5
Дикий тип | Дикий тип ΐ 6.9 2.2 31% 100% 7
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 17.0 5.2 31% 153% 3
Замена 01а из ΡΙΧ Замена 01а из ΡΙΧ 41.3 3.0 7% 373% 2
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]8 3.4 0.6 16% 31% 2
852А/860А 8[52]А/8[60]А 3.8 34% 1
М298О ΐ М 156()1 69.9 49.4 71% 1013% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ156ΟΪ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Μ156 ОТ 90.8 70.8 78% 1316% 5
У158О/Е296У/М2980 У2Ю/Е154У/М156О 1221.7 307.0 25% 11025% 4
У158О/Е296У/М2980 ί У2Ю/Е154У/М156ОТ 984.5 308.4 31% 14265% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/νΐ58ϋ/ Е296У/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ У2Ю/Е154У/М156О 1375.8 140.3 10% 12415% 3
852Α/δ60Α/νΐ58ϋ/ Е296У/М12980 8[52]А/8[60]А/У2Ю/ Е154У/М156О 1760.1 575.0 33% 15883% 3
Ο286Κ О143К 10.3 0.7 7% 93% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К 8.7 4.3 50% 78% 5
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ·)· Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К)· 10.5 5.6 53% 152% 6
352Α/860Α/882Α δ[52]Α/δ[60]Α/882Α 10.2 4.7 47% 92% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α 4.8 43% 1
352Α/860Α/8222Α δ[52]Α/8[60]Α/882Α 19.6 177% 1
Η2578 Η1178 3.1 1.1 35% 28% 7
- 119 020818
()366У О217У 4.3 0.6 14% 39% 2
Замена 01а из ΡΙΧ /О366У Замена 01а из ΡΙΧ /О217У 90.0 17.7 20% 812% 2
О286К/Н257А О143К/Н117А 4.3 2.1 49% 39% 3
О286К/Н257А | О143К/Н117А ] 2.5 0.0 0% 36% 2
Замена 01а из Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А/О286К Замена 01а из Р1Х/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 582А/()143К 15.5 2.9 18% 140% 4
Замена 01а из Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А/О286К ΐ Замена 01а из Р1Х/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 582А/()143К ΐ 21.3 6.5 31% 309% 5
Замена 01а из Р1Х/ 552А/360А/8222А/ О286К Замена 01а из Р1Х/ 8[52]А/8[60]А/882А/ О143К 2.9 26% 1
О286К/3222А/Н257А О143К/882А/Н117А 21.3 6.5 31% 193% 5
О286К/М298О О143К/М156О 79.9 18.9 24% 721% 5
О286К/М298О 1 О143Я/М156ОТ 162.4 79.9 49% 2353% 12
О286К/М298О § О143К/М156О§ 135.1 7.3 5% 1957% 2
Замена 01а из Р1Х/ О286К/М298О Замена О1а из Р1Х/ 0143 К/М 1560 672.7 79.1 12% 6070% 4
Замена 01а из Р1Х/ О286К/М298О ΐ Замена 01а из Р1Х/ О143К/М156О ΐ 678.2 249.0 37% 9826% 11
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О 81.6 13.4 16% 736% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О ί Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156ОТ 212.5 135.4 64% 3079% 10
Замена 01а из ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Замена 01а из ΡΙΧ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ ()143 К/М 1560 83.8 35.3 42% 756% 6
Замена О1а из ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О ΐ Замена 01а из ΡΙΧ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156ОТ 751.9 305.3 41% 10895% 6
{Замена 01а из Р1Х/Е40Ь}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/Е[40]Ь}/ О143К/М156О 814.1 89.0 11% 7346% 2
{Замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ 0143 К/М 1560 902.4 360.6 40% 8144% 11
{Замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ О286К/М298О ΐ {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ О143К/М156О ΐ 794.2 178.7 23% 11508% 6
{Замена 01а из {Замена 01а из 729.0 4.5 1% 6578% 2
ΡΙΧ/0443}/ О286К/М298О ΡΙΧ/()[44]δ}/ О143К/М156О
{Замена О1а из ΡΙΧ/Μ19Κ}/ О286К/М298О {Замена 01а из Р1Х/М[19]К}/ О143К/М156О 512.0 51.4 10% 4620% 2
852А/360А/ О286Р/М298О 8[52]А/5[60]А/()143К/ М156О 216.8 1.6 1% 1956% 2
Замена 01а из Р1Х/852А/360А/ О286К/М298О Замена 01а из Р1Х/8[52]А/ 8[60]А/О143К/М156О 988.7 207.5 21% 14327% 2
{Замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι} /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ М298О Т {Замена 01а из Р1Х/К[43]1}/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М1560 ф 389.4 34.3 9% 5642% 2
3222А/Н257А/()286К/ М298О 882А/Н117А/О143К/ М156О 345.3 99.9 29% 3116% 3
Τ128Ν/Ρ129Α/5222Α/ Н257А/О286К/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α /Н117А/() 143 К/М 156() 24.8 17.2 69% 224% 4
Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α/ Н257А/О286К/М298О ΐ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/882Α /Н117А/()143К/М156() ΐ 82.6 40.2 49% 1196% 3
352А/360А/8222А/ Н257А/О286К/М298О 3[52] А/3[60] А/382А/ Η117А/()143К/М156() 115.6 62.9 54% 1043% 2
Н2578/()286К/()366У Н1178/()143 К/()217У 7.7 1.8 23% 69% 2
5222А/Н257А/()286К/ О366У 882А/Н117А/()143К/ О217У 12.5 2.8 23% 113% 2
Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν 0143 К/М 156()/()217Ν 65.9 33.4 51% 595% 5
Τ129Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ Μ298Ο/Ο366Ν ΐ Τ[129]Ν/Ρ[129]Α/ 0143 К/М 1560/0217Ν ΐ 64.6 28.7 44% 936% 4
{Замена 01а из Р1Х/ К43Ц/О286К/М298О/ 0217ΝΪ {Замена 01а из Р1Х/ К[43 ]1}/()143 К/М 15 6() /0217ΝΪ 84.9 76.5 90% 1230% 4
{Замена 01а из ΡΙΧ/Κ.43Ι} /Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ Μ298Ο/Ο366Ν ΐ {Замена 01а из Р1Х/ Κ[43]Ι}/Τ[128]Ν/ Р[129]А/О143К/М156 0/0217ΝΊ 218.5 137.8 63% 3166% 3
О286К/Н373Р О143К/Н224Р 81.6 123.7 152% 736% 9
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/Н224Р 6.6 0.9 13% 59% 2
852А/860А/О286К/Н37 ЗР 8[52]А/8[60]А/()143К/ Н224Р 30.1 272% 1
О286К/М298О/Н373Р О143К/М156О/Н224Р 114.8 24.7 22% 1036% 5
- 120 020818
- 121 020818
Замена О1а из Р1Х/ 8222А/О286К/Н373Р Замена О1а из ΡΙΧ/ 582А/О143К/Н224Р 81.2 66.7 82% 732% 2
У158О/Е296У/М2980/ Н373Р У2Ю/Е154У/М156О/Н 224Ρ 1297.2 486.1 37% 11706% 4
Н257А/О286К/М298О ΗΙ 17Α/Ο143Κ/Μ156Ο 61.5 43.8 71% 555% 2
Замена О1а из Р1Х/ Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/8 222А/О286К. Замена О1а из ΡΙΧ/ Τ[128]Ν/Ρ[ 129]Α/Α39δ /582А/О143К 30.5 276% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/ 8222А/Н257А/О286К/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Α39δ /882А/Н117А/О143К/ Μ156Ο 20.3 3.8 19% 183% 2
У158О/0286К/Е296У/ М298О/Н373Р У2Ю/О143К/Е154У /М156О/Н224Р 573.6 100.4 18% 5176% 6
М2980/0366Ν/Η3 73Р ΐ ΜΙ 560/0217Ν/Η224Ρ ΐ 125.9 75.2 60% 1825% 4
Т239У/М298О/Н373Р ΐ Т99У/М156О/Н224Р | 319.5 125.0 39% 4629% 6
Τ239Ι/Μ298Ο/Η373Ρ ΐ Τ99Ι/Μ156Ο/Η224Ρ ΐ 138.2 101.9 74% 2003% 7
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/ Μ298Ο/Ο366Ν/Η373Ρ ί Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Ο143Κ/Μ1560/0217Ν/ Η224Ρ ΐ 160.9 43.3 27% 2331% 4
Т239У/О286К/М298О/ Ο366Ν ΐ Т99У/О143К/М156О/ Ο217Ν ΐ 64.2 36.3 57% 931% 3
Т2391/О286К/М298О/ Ο366Ν ΐ Т991/О143К/М156О/ Ο217ΝΤ 88.8 23.5 26% 1287% 5
| полученные в клетках СНОХ § полученные в стабильном клоне 52-5Р7 клеточной линии СНОХ
Пример 5. Определение ингибирования РУПа/ТФ или РУНа АТ-Ш/гепарином.
Силу взаимодействия между комплексом АТ-Ш/гепарин и РУНа в присутствии или в отсутствие растворимого тканевого фактора (рТФ), т. е. ТФ-зависимо или ТФ-независимо, оценивали путем измерения уровня ингибирования различными концентрациями АТ-Ш каталитической активности РУНа/рТФ по отношению к субстрату мезил-РРК-АСС. Для каждого исследованного варианта РУПа была определена величина К0,5, которая соответствует молярной концентрации АТ-Ш, которая требуется для 50% ингибирования ^С50) варианта РУПа в анализе в течение 30 мин при комнатной температуре (25°С). Были проведены два отдельных анализа, один в присутствии рТФ, и один в отсутствие рТФ. 2 мкМ раствор АТ-Ш/гепарина (5 мкМ гепарин) приготовили смешиванием 26,4 мкл 151,7 мкМ АТ-Ш (очищенный из плазмы человеческий АТ-Ш; Мо1еси1аг ^поупНо^) с 50 мкл 0,2 мМ РМ^ (низкомолекулярного) гепарина (Са1ВюсЬет), 400 мкл 5х буфера (100 мМ Нерея, 750 мМ ЫаС1, 25 мМ СаС12, 0,05% БСА, 0,5% ПЭГ 8000, рН 7,4) и 1,523 мл химически чистой воды. Этот раствор использовали в качестве раствора ТФ для ТФ-зависимого анализа с самой высокой концентрацией. Раствор, содержащий 4 мкМ АТ-Ш/гепарин (5 мкМ гепарин), для ТФ-независимого анализа готовили смешиванием 52,8 мкл 151,7 мкМ АТ-Ш (Мо1еси1аг ШпоупНопз) с 50 мкл 0,2 мМ РМ^ гепарина (Са1ВюсЬет), 400 мкл 5 х буфера для анализа и 1,497 мл химически чистой воды. Раствор АТ-Ш/гепарина инкубировали в течение 5-10 мин при комнатной температуре, а затем последовательно разводили в два раза в 96-луночном полипропиленовом планшете с глубокими лунками с окончательным объемом 1 мл с содержанием гепарина 5 мкМ, в результате чего получили разведения 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 и 0 нМ или 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125,
62.5 и 0 нМ. Варианты РУНа и РУНа дикого типа разбавляли до 250 нМ 1 х буфером (20 мМ Нерея, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС12, 0,01% БСА, 0,1% ПЭГ 8000, рН 7,4). Для ТФ-зависимого анализа был получен 5 нМ РУНа/50 нМ рТФ комплекс путем смешивания 20 мкл РУПа с 10 мкл 5 мкМ рТФ (К&Э 8у§1ет§, человеческий фактор свертывания III: # 2339-РА), 200 мкл 5 х буфера для анализа и 770 мкл химически чистой воды и инкубации раствора в течение 10-15 мин при комнатной температуре. Для ТФнезависимого анализа 100 мкл РУПа смешивали с 200 мкл 5 х буфера для анализа и 700 мкл химически чистой воды с получением 25 нМ раствора РУПа. Для начала анализа 25 мкл раствора РУПа/ТФ или РУП Ы отдельно смешивали с 25 мкл каждого разведения АТ-Ш/гепарина в лунках 96-луночного черно планшета для анализа формата Ьа1Р агеа (Ыцпс). Окончательные условия ТФ-зависимого анализа составляли
2.5 нМ РУПа/25 нМ рТФ, а концентрация АТ-Ш/гепарина варьировала в пределах от 1000 до 0 нМ. Для ТФ-независимого анализа концентрация РУПа составляла 12,5 нМ, а концентрация АТ-Ш/гепарина колебались от 2000 до 0 нМ. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при встряхивании при комнатной температуре (~25°С).
Исходный раствор субстрата РУПа (Мезил-РРК-АСС) готовили растворением субстрата в ДМСО до 20 мМ, затем получали рабочий 0,5 мМ раствор в 1 х буфере для анализа. После инкубации планшета в каждую лунку планшета для анализа добавляли 50 мкл субстрата РУПа. Реакционную смесь перемешивали и остаточную активность РУПа оценивали после расщепления субстрата в течение 15 мин с помощью планшетного сканера при 30°С.
Для определения степени ингибирования РУПа или вариантов РУПа АТ-Ш/гепарином необработанные данные, полученные с помощью приложения 8ойМах Рго (Мо1еси1аг Пеу1се§), экспортировали в виде АМЬ-файлов. Дальнейшие нелинейный анализ данных проводили с помощью пакета программного обеспечения X^ίϊΐ4 для автоматизированного аппроксимирования кривых и статистического анализа в интерфейсе таблиц М1сго§ой Ехсе1 (ГОВ8 8ой^аге). Для расчета последовательных разведений АТ-Ш,
- 122 020818 соотношения АТ-Ш к РУНа и соотношения Υΐ/Υο для каждого варианта РУНа с каждой экспериментальной концентрацией АТ-Ш были использованы электронные таблицы. Нелинейный регрессионный анализ зависимости остаточной активности РУНа (представленный в виде У^/Уο) от концентрации АТ-Ш обрабатывали с помощью ХЬШ4 и гиперболического уравнения ингибирования в форме ((С + (Атр*(1(Х/(К0.5 + X))))); где С - смещение (устанавливали в 0 для экстраполяции наборов данных, которые не достигают 100% ингибирования в ходе анализа), Атр - амплитуда аппроксимации и К0.5 соответствует концентрации АТ-Ш, необходимой для достижения половины максимального ингибирования в условиях анализа. Для нескольких вариантов РУНа АТ-Ш ингибировал менее 20-25% от общей протеазной активности при самой высокой исследованной концентрации АТ-Ш, которая составляет верхний предел обнаружения для анализа. Поэтому варианты с менее чем 20-25% максимальным ингибированием относятся к вариантам с самым низким К0.5 (5 мкМ в присутствии ТФ и 10 мкМ без ТФ) и в большинстве случаев, ожидается, что указанные варианты обладают большей устойчивостью к АТ-Ш, чем указанная.
В табл. 16 и 17 представлены результаты анализов, которые проводили с использованием вариантов РУНа, экспрессированных в Ргеек4у1е™ 293-Р клетках и/или ΒΗΗ-21 клетках в присутствии и в отсутствие ТФ соответственно. Результаты представлены в виде параметров аппроксимации К0.5 и в виде относительной устойчивости каждого варианта к АТ-Ш по сравнению с РУНа дикого типа, выражаемой как отношение их значений К0.5 (К0.5 варианта/К0.5 дикого типа). Несколько вариантов РУНа проявляли повышенную устойчивость к АТ-Ш по сравнению с РУНа дикого типа. Например, р286К-РУНа (т.е. РУНа, содержащий мутацию Р286К), р286К/8222А-РУНа, Р286К/8222А/замена О1а из РХХ-РУПа,
А1758/р286К/р366У-РУНа, р286М-РУНа, р286Ь-РУНа и р286У-РУНа проявляли устойчивость к АТIII в отсутствие ТФ, которая в 4 раза больше устойчивости РУНа дикого типа.
Таблица 16
Ингибирование вариантов РУНа АТ-Ш/гепарином в присутствии ТФ
- 123 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) ТФ-зависимый анализ на устойчивость к АТ-Ш
293-Р клетки ВНК-21 клетки
Ко.5 (нМ) К().5мутанта ! Ко.5дикого типа К0.5 (нМ) Ко.5мутанта / Ко.5дИКОго типа
Т2398 Т998 254.6 3.5
Т239О Т990 117.2 2.1
Т239У Т99У 42.5 0.8
Т239Ь Т99Ь 81.1 1.4
Т239Н Т99Н 52.0 0.9
Τ239Ι Τ99Ι 125.3 2.2
Н257А/М298О Н117А/М156О 89.1 1.6
3222А/Н257А/ О286К/М298О 382А/Н117А/О143К7 М156О 66.6 0.9
О286К/О366У О143К/О217У 62.0 1.1
А1758/О286К/ О366У А393/О143К/О217У 72.0 1.3
8222А/О286К/ О366У 382А/О143К/О217У 38.5 0.7
О286М О143М 53.1 0.7
О286Ь О143Ь 114.4 1.6
Ο286Υ Ο143Υ 131.3 1.8
03661 02171 23.2 0.3
ОЗббЬ 0217Ь 23.0 0.3
О366М 0217М 35.4 0.5
Таблица 17
Ингибирование вариантов РУПа АТ-Ш/гепарином в отсутствие ТФ
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) ТФ-зависимый анализ на устойчивость к АТ-Ш
293-Р клетки ВНК-21 клетки
Ко.5 (нМ) Ко.5мутанта / Ко.5дикого типа К0.5(нМ) Ко.5мутанта / Ко.5дикого типа
Дикий тип Дикий тип 2265 1.0 2222 1.0
У158И/Е296У/ М298О У2Ю/Е154У/М1560 389 0.2 415 0.2
О286К О143К 10000 >4.4 10000 >4.5
3222А 882А 2338 1.0 2088 0.9
Н2578 Н1178 5884 2.6 5584 2.5
Н373Ц Н224И 10000 >4.4
Н373Е Н224Е 6949 3.1
Н3738 Н2248 9513 4.2
Н373Р Н224Р 1306 0.6
Н373А Н224А 10000 >4.4
О366И О217И 10000 >4.4
О366Е О217Е 6901 3.0
Ο366Ν Ο217Ν 5186 2.3
О366Т О217Т 5885 2.6
03668 02178 10000 >4.4
О366У 0217У 487 0.2 531 0.2
А1758 А393 5785 2.6
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]8 2926 1.3
0286К/8222А О143К/882А 10000 >4.5
0286К/8222А/ замена О1а ΡΙΧ 0143К/382А/замена О1а ΡΙΧ 10000 >4.4
О286К/М298О О143К/М156О 3663 1.6
О286К/М298О/ К3410 О143К/М156О/ К1920 72
О286К/М298О/ К199Е О143К/М156О/ КбОсЕ 5182 2.3
Р321К Ρ170ΪΚ 5274 2.4
Р321Е Ρ170ΪΕ 3666 1.6
Ρ321Υ Ρ1701Υ 705 0.3
Р3218 Ρ170Ϊ8 2689 1.2
Т2398 Т993 10000 >4.4
Т239О Т990 2222 1.0
- 124 020818
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) ТФ-зависимый анализ на устойчивость к АТ-Ш
293-Г клетки ВНК-21 клетки
Ко.5 (нМ) К().5мутанта / К).5дикоготипа Ко.5 (нМ) Ко.5МуТанта / Ко,5дикого типа
Т239У Т99У 2644 1.2
Т239Ь Т99Ь 8532 3.8
Т239Н Т99Н 10000 >4.5
Τ239Ι Τ99Ι 10000 >4.5
Н257А/М298(2 Н117А/М156(3 1344 0.6
δ222Α/Η257Α/ (2286К/М298(2 δ82Α/Η117А/<3143К/ М156С2 7742 3.4
(2286К/(2366У (3143К/(3217У 2251 1.0
Α175δ/(2286Κ/ Ο366ν Α39δ/(3143Κ/(3217ν 10000 >4.5
8222А/О286К/ (2366У δ82Α/(3143Κ/(3217ν 3398 1.5
ζ)286Μ (3143М 10000 >4.4
О286Ь (}143Ь 10000 >4.4
(2286Υ (3143Υ 10000 >4.4
<33661 02171 599 0.3
ζ)366Ε О217Ь 1708 0.8
(3366М О217М 914 0.4
Для оценки ингибирования вариантов РУПа АТ-Ш/гепарином в отсутствие ТФ был проведен еще один набор экспериментов, как описано выше, но с незначительными изменениями. Для увеличения скорости реакции ингибирования вместо низкомолекулярного гепарина (ΡΜΥ-гепарина) был использован полноразмерный нефракционированный гепарин (Са1ЬюсНет) (см., например, 01δοη и др., (2004) ТНготЬ Наетοδΐ 92(5), 929-939). Инкубационный период анализа был увеличен до 60 мин, а концентрацию мезил-РРК-ЛСС субстрата, используемого для определения остаточной активности, увеличили до конечной концентрации 0,5 мМ. В табл. 18 приведены результаты анализов, которые проводили в отсутствие ТФ с использованием вариантов РУПа, экспрессированных в ВНК-21 клетках и СНОХ клетках. Результаты представлены в виде параметров аппроксимации К0.5 и в виде относительной устойчивости каждого варианта к АТ-ΙΙΙ по сравнению с РУПа дикого типа, выражаемой как отношение их значений К0.5 (К0.5 варианта/^ 5 дикого типа). Также приведены величины стандартного отклонения (8Ό) и количества проб (Ж
Таблица 18
Ингибирование вариантов РУПа АТ-Ш/гепарином в отсутствие ТФ
Мутация (по нумерации зрелого ГУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Κ«.5 (нМ) Стандар- тное отклоне- ние Коэффициент вариации, °/о Кол мутанта/ Кол дикого N
\УТ (Νονοδενεη®) АУТ (Νονοδενεη®) 424.3 70.9 17% 1.08 33
νΤ (Νονοδενεη-ΚΤ®) νΤ (ΝονοδενεηΚΤ®) 424.2 60.5 14% 1.08 5
ντ ντ 393.8 67.8 17% 1.00 4
ντΐ 503.0 120.0 24% 1.00 4
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 465.3 28.1 6% 1.18 2
замена О1а ΡΙΧ замена О1а ΡΙΧ 298.9 0.76 1
Κ109Ν Κ[109]Ν 330.1 72.3 22% 0.84 2
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]δ 372.5 28.6 8% 0.95 2
852Α/δ60Α δ[52]Α/δ[60]Α 360.6 0.92 1
Μ298() Μ156<2 120.1 14.1 12% 0.31 5
Μ298ζ) | Μ156(2ΐ 130.0 14.3 11% 0.26 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Μ298<2 ί- Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/Μ1 56(2 ΐ 143.9 14.5 10% 0.29 2
νΐ58ϋ/Ε296ν/Μ298(2 У2Ю/Е154У/М156<2 75.5 10.1 13% 0.19 27
νΐ58ϋ/Ε296ν/Μ298(2 ί У2Ю/Е154У/М156<2 I 77.4 18.0 23% 0.15 7
Τ128Ν/Ρ129Α/νΐ58ϋ/ Ε296ν/Μ298() Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ν2 Ю/Е154У/М156(2 81.6 3.8 5% 0.21 2
δ52Α/δ60Α/νΐ58ϋ/Ε2 96У/М 1298() 8[52]А/8[60]А/У2Ю/ Е154У/М156(2 78.8 2.9 4% 0.20 2
<2286Κ ζ)143Κ 1085.1 320.0 29% 2.76 20
Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ. Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/()1 43Κ 1645.2 440.2 27% 4.18 9
Τ128Ν/Ρ129ΑΛ2286Κ. φ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/()1 43Κί 1739.2 467.0 27% 3.46 5
852Α/δ60Α/ζ)143Κ. δ[52]Α/δ[60]Α/()143 К 1318.0 376.8 29% 3.35 2
8222Α 882Α 383.5 84.4 22% 0.97 3
Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/δ82 Α 401.0 1.02 1
Η257δ Η1178 722.8 1.84 1
(2366Υ ζ)217Υ 101.1 24.7 24% 0.26 3
- 125 020818
- 126 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) Κο.5 (нМ) Стандар- тное отклоне- ние Коэффициент вариации, °/о Ко,5 мутанта/ Ко,5 дикого N
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/ ()286К/М298()/Н373Р 1· Τ[128Ν]/Ρ129]Α/ Т99У/()143К/М156()/ Н224Р ΐ 121.2 25.8 21% 0.24 4
νΐ58ϋ/Τ239Ι/Ε296ν /Μ298Ω У2ГО/Т991/Е154У /Μ156Ω 179.5 50.5 28% 0.46 5
Τ239Ι/Ω286Κ Τ99Ι/0143Κ. 5823.0 2185.5 38% 14.79 9
3222Α/Τ239Ι 882Α/Τ99Ι 1149.8 12.8 1% 2.92 2
О1аЗдуарИХ/8222А/Т2 39Ι/Ω286Κ замена 01а ИХ /882Α/Τ99Ι/Ω143Κ 3313.1 130.3 4% 8.41 2
Τ239Ι/Ω286Κ7Μ298Ω Т991/()143К/М156() 1611.4 185.9 12% 4.09 2
замена О1а ИХ / Τ239Ι/Ω286Κ7Μ298Ω замена 01а ИХ /Τ99Ι/Ο143Κ/Μ156Ω 1171.3 104.5 9% 2.97 2
Τ128Ν/Ρ129Α Τ239Ι/Ω286Κ/Μ298Ο | Τ[128Ν]/Ρ129]Α Т991/()143К/М156() ΐ 917.0 60.5 7% 1.82 3
8222А/Т2391/Н257А/ Ω286Κ/Μ298Ω 882А/Т991/Н117А/ Ω143Κ/Μ156Ω 1223.6 18.9 2% 3.11 2
Τ239Ι/Ω286Κ/Η373Ρ Τ99Ι/()143Κ/Η224Ρ 1007.6 29.8 3% 2.56 2
У158О/Т239У/Е296У/ Μ298Ω У2Ю/Т99У/Е154У/ Μ156Ω 67.7 16.6 24% 0.17 4
У158О/Т239У/Е296У/ М298() | У21О/Т99У/Е154У/ Μ156ΩΪ 67.1 0.13 1
Т239У/О286К. Т99У/О143К. 1787.9 106.3 6% 4.54 2
Τ239Ι/()286Κ/Μ298()/ Н237Р Τ99Ι/()Ι43Κ/Μ 156()/ Н224Р 370.4 3.0 1% 0.94 2
Τ128Ν/Ρ129ΑΤ239Ι/Ο 286Κ/Μ298Ω Н237Р | Τ[128]Ν/Ρ[129]ΑΤ99Ι /() 143Κ/Μ156() /Н224Р | 316.6 24.7 8% 0.63 2
3222А/Н2573/()286К/ Μ298Ω 382Α/Η1178/Ω143Κ/ Μ156Ω 526.7 1.34 1
8222Α/Ω286Κ7Μ298Ω/ Η373Ρ 882Α/()143Κ/Μ156()/ Η224Ρ 163.2 46.9 29% 0.41 4
замена О1а ИХ/3222А/ Ω286Κ/Μ298Ω/Η373Ρ замена 01а ΡΙΧ 882Α/()143Κ/Μ156()/ Η224Ρ 163.5 58.2 36% 0.42 4
8222Α/Ω286Κ/Μ298Ω 382Α/()143Κ/Μ156() 308.4 119.9 39% 0.78 4
замена 01а Р1Х/ 8222А/()286К/М298() замена 01а ИХ 382Α/()143Κ/Μ156() 266.3 104.2 39% 0.68 4
- 127 020818
| полученные в клетках СНОХ § полученные в стабильном клоне 52-5Р7 клеточной линии СНОХ
Пример 6. Ιπ У1уо оценка прокоагулянтной активности полипептида РУПа.
Для оценки прокоагулянтной активности полипептидов РУПа была создана мышиная модель гемофилии. Гемофилию вызывали у СЭ-Ι мышей внутрибрюшинным введением анти-РУШ антител, после этого для начала кровотечения хирургически удаляли кончики хвостов. Также были использованы мыши с дефицитом фактора УШ (РУПР мыши), но их не обрабатывали анти-РУШ антителами. Затем мышей обрабатывали полипептидом РУПа и для определения прокоагулянтной активности полипептидов РУПа измеряли количество потерянной за 20 мин крови.
А. Ιπ У1уо оценка прокоагулянтной активности РУПа дикого типа.
Мышиная модель гемофилии была создана с целью оценки прокоагулянтной активности полипептидов РУПа. Г емофилию вызывали у СЭ-Ι мышей введением анти-РУШ антител, после этого для начала кровотечения хирургически удаляли кончики хвостов. Мышей обрабатывали полипептидом РУПа и для определения прокоагулянтной активности полипептидов РУПа измеряли необходимое для остановки кровотечения время и количество потерянной за это время крови.
Самцов СЭ-Ι мышей наркотизировали путем внутрибрюшинного введения тиобарбитала натрия в дозе 100 мг/кг и кетамина в дозе 100 мг/кг. Лидокаин вводили подкожно в вентральную часть шеи для уменьшения чувствительности. Трахею и сонную артерию канюлировали через небольшой разрез кожи в
- 128 020818 области шеи для облегчения дыхания и неограниченного введения антител к фактору УШ, рекомбинантного человеческого фактора УПа (гНРУПа) и/или модифицированных полипептидов РУН.
Канюлированным мышам вводили 3,76 мг овечьих антител против человеческого РУШ (ΛΓΠπίΐγ Вю1од1са1к, 1о! Ι0129Κ4, 612 единиц связывания для мыши/мл) в объеме 40 мкл. Эта доза была определена путем проведения подготовительного эксперимента для определения ответа на дозу антитела (с использованием 0,376, 0,94, 1,88 и 3,76 мг антител против человеческого РУШ) с оценкой кровопотери и времени кровотечения. Через 20 мин хвосты мышей помещали в 15 мл пробирки, содержащие фосфатный буферный раствор (РВ8) при 39°С, на 10 мин. Через 30 мин хвосты быстро удаляли из раствора РВ8 и последние 5 мм хвоста отрезали для инициирования кровотечения. Было отмечено время, через которое началось кровотечение. Затем хвосты помещали в пробирку, содержащую РВ8 при 39°С, и наблюдали кровотечение в течение 5 мин (предварительное кровотечение), чтобы убедиться, что мыши ответили на антитела к РУШ. После предварительного кровотечения мышам вводили полипептиды РУПа или носитель, в котором полипептиды РУПа были растворены и введены. Полипептиды РУПа разводили в РВ8 буфере или буфере, состоящем из 52 мМ хлористого натрия, 10,2 мМ безводного хлорида кальция, 9,84 мМ глицилглицина, 0,01% полисорбата 80 и 165 мМ маннита. Препараты РУПа вводили в дозах 1, 3 или 10 мг/кг в объеме, эквивалентном 3 мл/кг, через канюлированную сонную артерию, хвосты помещали в пробирки, содержащие свежий РВ8 при 39°С. Кровотечение наблюдали в течение 20 мин и отмечали время, за которое кровотечение прекращалось. Общее время кровотечения рассчитывали как сумму длительности предварительного кровотечения и длительности кровотечения после введения полипептидов РУПа, РВ8 или буфера.
Для определения количества потерянной во время кровотечений крови, содержимое 15 мл пробирок анализировали на содержание гемоглобина. Тритон Х-100 разбавляли 1/4 в стерильной воде и 100 мкл полученного раствора добавляли к 1 мл образца для гемолиза. Поглощение образцов измеряли при длине волны 546 нм. Для вычисления количества потерянной крови поглощение сравнивали со стандартной кривой, полученной измерением поглощения при 546 нм известных объемов мышиной крови, разбавленных РВ8 и подвергнутых гемолизу с помощью ТгПоп Х 100, как описано выше.
Эксперимент проводили для сравнения гНРУПа, полученных, как описано выше, с коммерчески доступным рекомбинантным человеческим РУПа (Nоνокеνеη®, Ново-Нордиск), потерю крови оценивали после введения 3 мг/кг каждого белка. Потеря крови в группе, которой вводили только носитель (буфер, N=15), составила 671,9±57,89 мкл за 20 мин. Эта величина была уменьшена введением гНРУПа от Са!а1ук1 Вюктепсек до 264,1±56,59 мкл и до с 273,7±53,93 мкл при введении Шуокеуеп® (N=14). Этот эксперимент показал эквивалентность этих двух белков.
В. Анализ коагулянтной активности вариантов РУПа у СО-Ι мышей с индуцированной гемофилией.
В подготовительном эксперименте были определены дозы и время, необходимые для получения гемофилии у СО-Ι мышей при внутрибрюшинном введении антител против человеческого фактора УШ, и продолжительность такого эффекта. Для первой партии антител против фактора УШ (партия 1; АГйпНу Вю1одюа1к, 1о1 Ι0129Κ4) при определении доз изначально исходили из доз, использованных в экспериментах с канюлированием, описанных выше. Доза, вызывающая гемофилическое состояние (неконтролируемое кровотечение в течение 20-минутного периода анализа), составляла 7,54 мг/мышь (80 мкл 94,25 мг/мл исходного раствора). Данная партия антител обладала нейтрализующей активностью 612 единиц связывания для мыши/мл. Для второй партии антител против человеческого РУШ (партия 2; АГΓίπίΐν Вю1одюа1к, 1о1 Ι01577Κ2, нейтрализующая активность 474 единиц связывания для мышьи/мл) использовали дозу 11,98 мг/мышь (120 мкл 99,8 мг/мл исходного раствора), которую вводили за 6 ч до обрезания хвоста.
Для индуцирования гемофилии самцам мышей СО-Ι (массой 25-35 г) до эксперимента внутрибрюшинно вводили антитела против фактора УШ из партии 1 или партии 2. Самцов СО-Ι и РУШ- мышей наркотизировали путем внутрибрюшинного введения смеси кетамин/ксилазин (45 мг/мл и 3,6 мг/мл, соответственно, в физиологическом растворе) и размещали на платформе с подогревом (39°С) для уверенности в отсутствии падения температуры тела. Температура в процедурной составляла 82°Р (27,8°С). За 10 мин до отрезания хвоста его погрузили на 10 мин в предварительно подогретый РВ8 (15 мл пробирка для центрифугирования; 39°С). 8-10 мышам через хвостовую вену одной инъекцией вводили рекомбинантный человеческий РУПа (Хоуокеуеп®®, Ново Нордиск) или модифицированные полипептиды РУП, разведенные в буфере, состоящем из 52 мМ хлористого натрия, 10,2 мМ безводного хлорида кальция, 9,84 мМ глицилглицина, 0,01% полисорбата 80 и 165 мМ маннита. В качестве контроля группе мышей вводили только носитель. Если инъекция была пропущена, животное исключали из исследования. Инъекции полипептида РУПа или носителя были осуществлены за 5 мин до обрезания хвоста. Хвост обрезали лезвием бритвы за 5 мм от конца хвоста, кровь собирали в РВ8 в течение 20 мин. После сбора крови оценивали полную потерю крови. Содержимое пробирок, в которые собирали кровь, смешали, аликвоты 1 мл каждого образца отобрали и анализировали на содержание гемоглобина. Тритон Х-100 разбавляли 1/4 в стерильной воде и 100 мкл полученного раствора добавляли к 1 мл образца для гемолиза. Поглощение образцов измеряли при длине волны 546 нм. Для вычисления количества потерянной крови погло- 129 020818 щение сравнивали со стандартной кривой, полученной измерением поглощения при 546 нм известных объемов мышиной крови, разбавленных РΒδ и подвергнутых гемолизу с помощью ΤπΙοη X 100, как описано выше.
1. Исследование зависимости ответа от дозы для оценки коагулянтной активности РУЛа дикого типа.
Было проведено исследование зависимости ответа от дозы при 0,3, 1 или 3 мг/кг РУПа дикого типа.
Мыши, которые получили только носитель, потеряли 1002,3±60,71 мкл крови за 20 мин анализа. Кровопотеря у мышей, которым вводили 3 мг/кг РУЛа дикого типа, была существенно меньше и составляла 415,5±90,85 мкл (р <0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 мг/кг привело к потере крови 679,57±83,95 мкл, и кровопотеря при более низкой дозе 0,3 мг/кг составила 852,42±94,46 мкл.
2. Начальный анализ коагулянтной активности вариантов РУЛа.
В качестве контроля вводили только носитель. Мыши, которые получили только носитель, потеряли 915,2±105,6 мкл за 20 мин анализа, кровопотеря уменьшилась до 352±99,86 мкл (среднее ± стандартное отклонение среднего) при введении мышам рекомбинантного человеческого РУЛа. Количество потерянной крови уменьшалось еще сильнее до 165,8±48,41 мкл при введении мышам р286К-РУЛа (т.е. РУЛа, содержащего мутацию Ц286К), до 141,3±43,77 мкл при введении р286К/М298Ц-РУЛа или до 129,5±36,64 мкл при введении У158П/Е296У/М298Ц-РУЛа. При введении мышам δ222Α-РVIIа потеря крови также уменьшилась (до 225,7±62,75 мкл) по сравнению с введением РУЛа дикого типа. Введение (замена С1а из РБХфРУПа, Ц366У-РУЛа или Α122N/С124δ- РУЛа привело к примерно такой же кровопотере, как и при введении мышам рекомбинантного человеческого РУЛа (334,6±54,95 мкл, 321,7±102,6 мкл и 329,8±83,91 мкл соответственно), в то время как кровопотеря у мышей, которым вводили Н257АРУЛа, δ222Α/^286К-РVIIа, Н257А-РУЛа была несколько большей (390±107 мкл, 447,3±127,7 мкл и 443,7±139,5 мкл соответственно).
3. Исследование зависимости ответа от доз для оценки коагулянтной активности варианта РУЛа.
Для исследования зависимости ответа от доз мышам вводили 0,1, 0,3, 1 или 3 мг/кг р286К-РУЛа, δ222-РVIIа, р286К/М298Ц-РУЛа или У158О/Е296У/М298р-РУЛа. Мыши, которые получили только носитель, потеряли 915,2±105,6 мкл крови за 20 мин анализа. Кровопотеря значительно уменьшилась у мышей, которым вводили 3 мг/кг любого из Ц286К-РУЛа (141,3±43,77 мкл), δ222-РVIIа (225,7±62,75 мкл) или р286К/М298Ц-РУПа (129,5±36,64 мкл) (р <0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 мг/кг привело к потере крови 641±96,48 мкл у мышей, которые получили р286К-РУЛа, и 487,92±92,07 мкл у мышей, которые получили δ222Α-РVIIа. Более низкие дозы указанных вариантов РУЛа привели приблизительно к такой же потере крови (817,71±107,94 мкл и 900,34±115,77 мкл для О286К-РУПа и δ222-РVIIа соответственно), как у мышей, которым вводили носитель. Напротив, у мышей, получивших 1 мг/кг р286К/М298р-РУЛа, произошло достоверное снижение потери крови (69,36±15,55 мкл) по сравнению с контрольной группой мышей, которым ввели только носитель. При более низких дозах, 0,3 и 0,1 мг/кг, потеря крови составила 538,3±94,04 и 664±121,6 мкл соответственно. У мышей, получавших 0,3, 1 и 3 мг/кг У158П/Е296У/М298р-РУЛа, кровопотеря составила 754,49±121,6, 481,95±114,22 и 133,25±50,09 мкл соответственно.
Для р286К-РУЛа, О286К/М298О-РУПа и У158О/Е296У/М2980-РУПа были проведены дополнительные исследования зависимости ответа от дозы и полученные данные были совмещены с приведенными выше. В экспериментах для оценки эффекта О286К-ЕУПа получавшая носитель группа потеряла 833,61±73,95 мкл крови. Кровопотеря значительно уменьшилась до 196,71±49,18 мкл у мышей, которые получали 3 мг/кг Ц286К-РУЛа. Уменьшение дозы до 1 мг/кг приводило к потере крови 577,78±66,29 мкл. При введении мышам 0,1 и 0,3 мг/кг О286К-ЕУПа потеря крови была аналогична потере крови при введении носителя (739,58±104,28 и 806,63±65,17 мкл соответственно).
В экспериментах для оценки эффекта Ц286К/М298Ц- РУЛа получавшая носитель группа потеряла 902,42±88,04 мкл крови, кровопотеря значительно уменьшилась до 145,17±38,89 и 140,76±33,36 мкл при введении 1 и 3 мг/кг р286К/М298Ц-РУЛа. Уменьшение дозы до 0,1 и 0,3 мг/кг привело к потере крови 664,03±121,62 и 551,94±67,60 мкл соответственно.
В экспериментах для оценки эффекта У158О/Е296У/М298р-РУЛа получавшая носитель группа потеряла 966,64±57,97 мкл крови, кровопотеря значительно уменьшилась до 128,19±27,73 мкл при введении У158О/Е296У/М298р-РУЛа в дозе 3 мг/кг. Уменьшение дозы до 1 мг/кг привело к кровопотере 565,50±65,78 мкл, а при дальнейшем уменьшении дозы до 0,3 и 0,1 мг/кг потеря крови была аналогична потере крови при введении носителя (811,16±71,87 и 893,62±106,73 мкл).
Был проведен статистический анализ Крускала-Уоллиса, а затем тест Данна, значение считали достоверным при р <0,05.
4. Коагулянтная активность Н216А-РУЛа, Н373Р-РУЛа, Ц366П-РУЛа и О366^ЕУПа в дозе 3 мг/кг.
Была проведена серия экспериментов для исследования Н216А-РУЛа, Н373Р-РУЛа, Ц366П-РУЛа и
О366^ЕУПа в дозе 3 мг/кг. В качестве контроля мышам вводили только носитель. Мыши, которые получили носитель, потеряли 915,2±105,6 мкл крови за 20 мин анализа. Кровопотеря значительно уменьшилась до 211,1±67,70 мкл при введении мышам Н373Р-РУЛа. Потеря крови меньше изменилась при введении Н216А-РУПа, Ц366П-РУПа и Ц366ШРУПа и составила 558,6±66,22, 577,1±151,4 и 477,1±112,6
- 130 020818 мкл соответственно.
4. Коагулянтная активность О286К/М298р/за\1ена 01а из РК-РУПа, 8222А/Н257А/О286К./М158ОРУПа, р286К/М298р/К341Э-РУИа и р286К/М298р/Н373Р-РУПа в дозе 3 мг/кг.
Коагулянтную активность О286К/М298р/за\1ена 01а из РГХ-РУПа, 8222А/Н257А/О286К./М158ОРУПа, О286К./М298О/К34 ГО-РУПа и О286К/М298О/Н373Г-ГУНа в дозе 3 мг/кг оценивали на модели гемофилии на СЭ-Ι мышах. В качестве контроля мышам вводили только носитель. Мыши, которые получали носитель, потеряли 803±92,18 мкл крови за 20 мин анализа. Кровопотеря значительно уменьшилась до 118,6±63,27 мкл при введении 8222А/Н257А/р286К/М158р-РУПа. Обработка О286К./М298О/ замена из 01а РЕХ-РУНа в дозе 3 мг/кг привела к уменьшению потери крови по сравнению с группой, в которой вводили носитель, с 888,89±104,76 до 171,83±62,06 мкл.
При экспериментальной оценке р286К/М298р/К341Э-РУПа и О286К/М298О/Н373Г-ГУНа потеря крови в группе с носителем составила 813,1±82,66 мкл. Кровопотеря уменьшилась до 39,42±5,53 мкл после введения О286К./М298О/Н373Г-ГУПа. р286К/М298р/К341Э-РУПа при анализе оказался менее эффективным, потеря крови составила 636,7±121,6 мкл.
5. Исследование зависимости ответа от дозы для оценки коагулянтной активности 8222А/Н257А/р286К/М158р-РУПа и р286К/М298р/Н373Р-РУНа.
Исследовали ответ на 8222А/Н257А/р286К/М158р-РУПа в дозе 0,3, 0,5, 1 и 3 мг/кг. Мыши, которые получали носитель, потеряли 832,48±71,70 мкл крови за 20 мин анализа. Кровопотеря статистически значимо уменьшилась до 118,63±63,27 мкл при введении 3 мг/кг 8222А/Н257А/р286К/М158р-РУПа, (р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 и 0,5 мг/кг привело к значительному снижению потери крови (202,69±77,60 и 366,52±106,21 мкл), а более низкая доза 0,3 мг/кг привела к потере крови, сравнимой с уровнем для носителя (742,04±112 мкл).
Также в эксперименте оценивали ответ на О286К./М298О/Н373Г-ГУПа в дозе 0,1, 0,3, 1 и 3 мг/кг. Мыши, которые получали носитель, потеряли 813,15±82,66 мкл крови. Кровопотеря статистически значимо уменьшилась до 39,42±5,52 мкл при введении 3 мг/кг О286К/М298О/Н373Г-ГУНа (р <0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 и 0,3 мг/кг привело к потере крови 208,10±105,12 и 508,9±155,8 мкл соответственно. Самая низкая исследованная доза 0,1 мг/кг привела к потере крови, сравнимой с уровнем для носителя (733,5±152,88 мкл).
С. Анализ коагулянта активности РУНа у РУШ- мышей.
Для оценки коагулянтной активности полипептидов РУНа также была использована мышиная модель гемофилии А с использованием мышей с дефицитом фактора УШ (РУШ- мышей), в анализе использовали те же протоколы, как описано выше, за тем исключением, что мышам не вводили анти-РУШ антитела.
1. Исследование зависимости ответа от дозы для оценки коагулянтной активности РУНа дикого типа.
На РУШ- мышах был выполнен анализ зависимости ответа от дозы для оценки коагулянтной активности Шуокеуеп® и гЬРУПа дикого типа в дозе 0,3, 1, 3 и 6 мг/кг. В эксперименте с Шуокеуеп® потеря крови в группе с носителем составила 912,79±38,32 мкл, при введении Шуокеуеп® в дозе 6 и 3 мг/кг кровопотеря статистически значимо уменьшилась до 361,74±55,28 и 586,98±60,56 мкл соответственно (р<0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 мг/кг привело к потере крови 674,84±46,88 мкл, при самой низкой исследованной дозе потеря крови составила 801,08±41,39 мкл.
В эксперименте с гЬРУПа дикого типа потеря крови в группе с носителем составила 904,08±15,38 мкл. Кровопотеря статистически значимо уменьшилась до 451,04±74,17 мкл (р <0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна) при введении гЬРУПа дикого типа в дозе 6 мг/кг. Уменьшение дозы до 3 мг/кг привело к значению кровопотери 695,75±60,50 мкл, при дальнейшем снижении дозы до 1 и 0,3 мг/кг потеря крови была сравнима с потерей крови при введении носителя (846,08±34,17 и 936,43±31,39 мкл соответственно).
2. Исследование зависимости ответа от дозы для определения коагулянтной активности О143КРУЛа, 8222А-РУЛа, р286К/М298р-РУПа и У158Э/Е296У/М298р-РУЛа.
В первой серии экспериментов исследовали рекомбинантный человеческий РУНа (Шуокеуеп®®, Ново Нордиск), У158Э/Е296У/М298р-РУЛа, О286К-РУНа и 8222А-РУЛа в дозе 3 мг/кг. В качестве контроля мышам вводили только носитель. У мышей, получавших только носитель, кровопотеря составила 942,9±27,37 мкл за 20 мин анализа. Введение Шуокеуеп®® РУЛ, У158Э/Е296У/М298р-РУПа, О143КРУПа и 8222А-РУПа привело к уменьшению потери крови до 468±55,9, 302,38±73,12, 697,26±92,22 и 675,07±35,29 мкл соответственно. При исследовании р143К-РУНа на РУШ- мышах в дозе 3 мг/кг снижение потери крови составило 754,84±60,96 мкл по сравнению с контрольной группой, в которой вводили только носитель (935,54±51,96 мкл). В дозе 5 мг/кг р143К-РУНа приводит к дальнейшему уменьшению потери крови до 445,87±79,62 мкл по сравнению с группой, в которой вводили носитель (960,42±24,5 мкл).
Во второй серии экспериментов исследовали зависимость ответа от дозы для У158Э/Е296У/М298ОРУПа и р286К/М298р-РУПа в дозе 0,3, 1 и 3 мг/кг. Введение У158Э/Е296У/М298р-РУПа в дозе 3 мг/кг
- 131 020818 привело к статистически значимому снижению потери крови (375,62±74,22 мкл) по сравнению с введением носителя (960,42±24,5 мкл, р <0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Уменьшение дозы до 1 и 0,3 мг/кг привело к потере крови, близкой к контрольному уровню, 834,76±54,38 и 841,62±68,99 мкл соответственно. Во втором эксперименте оценивали различные партии У158В/Е296У/М298р-РУПа, потеря крови при введении носителя составила 912,79±38,32 мкл, кровопотеря статистически значимо уменьшалась при введении 3 и 1 мг/кг (247,24±35,17 и 628,30±37,36 мкл, р<0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и затем теста Данна). Введение низкой дозы У158В/Е296У/М298р-РУПа приводит к потере крови, близкой контрольным значениям (841,85±19,32 мкл). В эксперименте для оценки влияния р286К/М298Р-РУПа на РУШ- мышах, кровопотеря в группе, в которой вводили носитель, составила 941,39±35,18 мкл. Кровопотеря значительно уменьшалась при введении 3 мг/кг до 258,92±59,82 мкл. При более низких дозах 1 и 0,3 мг/кг уровни потери крови составили 616,82±78.43мкл и 924,9±38,01 мкл соответственно.
Ό. Анализ коагулянтной активности дополнительных вариантов РУНа с использованием моделей индуцированной гемофилии.
Коагулянтную активность нескольких вариантов РУНа оценивали с помощью модели индуцированной гемофилии (ММ) на СБН мышах, описанной в примере 6.В выше. При исследовании использовали тот же протокол, как описано выше, за тем исключением, что для оценки варианта Т128^Р129АРУНа и варианта М156р/Н224Р-РУНа использовали различные партии антител против человеческого РУШ (третья и четвертая партии соответственно). Для третьей партии антител против человеческого РУШ (партия 3; АГЕпйу Вюкдкак, 1ο! Ю1 603К1, нейтрализующая активность 418 единиц связывания для мыши/мл) использовали дозу 12,17 мг/мышь (120 мкл 101,4 мг/мл исходного раствора), которую вводили за 18 ч до обрезания хвоста. Для четвертой партии антител против человеческого РУШ (партия 4; АГЕпйу Вюкдкак, 1ο! Ю 1639К1, нейтрализующая активность 875 единиц связывания для мыши/мл) использовали дозу 8,04 мг/мышь (80 мкл 100,45 мг/мл исходного раствора). Потерю крови измеряли, как описано выше, полученные данные представлены в табл. 19 ниже как процент ингибирования (рассчитывали среднее значение для интересующего варианта и делили на значение для группы, в которой вводили носитель) и значение ЕБ50 (полуэффективная доза) (определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием ОгарйРак Рпзт®, ОгарйРак 3οIί^а^е, ^с.), максимум и минимум кривой ответа ограничены потерей крови в группе с введением носителя и потерей крови у нормальных контрольных животных, соответственно.
Таблица 19
Мутация (по нумерации зрелого РУН)) Мутация (по нумерации химотрипсина) Потеря крови в модели индуцированной гемофилии; % ингибирования (1,5 мг/кг) N Потеря крови в модели индуцированной гемофилии; Εϋ50 (мг/кг) N
Диий тип (Νονοδενεη®) Диий тип Τ128Ν/Ρ129Α замена О1а ΡΙΧ Α122Ν/Ο1248 Диий тип (Νονοδενεη®) Диий тип Τ[128]Ν/Ρ[129]Α замена О1а ΡΙΧ Α[122]Ν/ О[124]8 61 59 78 63 64 1 1 1 1 1 0.7 0.75 0.5 1 1 1
У158О/Е296У/ М298() У2Ю/Е154У/ М156<) 86 3 0.5 3
ζ)286Κ. ()143К. 76 2 0.55 2
3222А 882А 75 1 0.45 1
Н2578 Н1178 50 1
Н373Р Н224Р 78 1
()366У ()217У 64 1
А1753 А398 58 1
Κ109Ν/Α1753 Κ[109]Ν/Α395 60 1
9286К/Н257А ()143К/Н117А 58 1
()286К/3222А (Д43К/382А 50 1
()286К/3222А/ Н257А (Д43К/382А/ Н117А 68 1
()286К/М298() <)143К/М156() 85 2 0.15 2
()286К/М298() ΐ ()143К/М156() ΐ 89 1 0.16 2
Замена О1а ИХ/ ()286К/М298<) Замена О1а Р1Х/ ς>143Κ/Μ156() 83 2 0.13 1
3222А/Н257А/ ()286К/ М298() 882А/Н117А/ ()143К/М156() 85 1 0.2 1
Н2573/()286К/ ()366У Н1173/()143К/ ()217У 46 1
3222А/Н257А/ ()286К/ ()366У 882А/Н117А/ ()143К/()217У 49 1
()286К/М298()/ ()366Ν <)143К/М156()/ ζ)217Ν 88 1
()286К/Н373Р ()143К/Н224Р 75 1
ζ)286Κ/Μ298()/ Н373Р ζ)143Κ/Μ156()/ Н224Р 95 1 0.15 1
М298()/Н373Р М156()/Н224Р 95 1 0.21 1
Замена О1а ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ. Замена О1а Р1Х/382А/ ()143К 85 1 0.4 1
νΐ58ϋ/()286Κ/ Е296У/М298О У2Ш/()143К/ Е154У/М156() 95 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ ()286К/Н373Р Τ[128]Ν/Ρ[129]Α /()143К/Н224Р/ 70 1
+ полипептид РУНа, полученный в клетках СНОХ
Е. Анализ коагулянтной активности дополнительных вариантов РУНа с использованием модели
- 132 020818 индуцированной гемофилии.
Коагулянтную активность нескольких вариантов РУПа оценивали с помощью модели индуцированной гемофилии (ИМ) на СО-Ι мышах, описанной в примере 6.В выше. При исследовании использовали тот же протокол, как описано выше, за тем исключением, что были использованы партии 4-6 антиРУШ антител. Партия 4 описана выше, для пятой партии (Лот 5; АННпйу Вю1о§1са15, 1о! Ю1593К2, нейтрализующая активность 255 единиц связывания для мыши/мл) использовали дозу 12,25 мг/мышь (120 мкл из 102,1 мг/мл исходного раствора), которую вводили за 6 ч до отрезания хвоста. Для шестой партии (партия 6; АННпйу Вю1о§1са15, 1о! Ю1703К2, нейтрализующая активность 685 единиц связывания для мыши/мл) использовали дозу 8,02 мг/мышь (80 мкл 100,2 мг/мл исходного раствора), которую вводили в 4 ч дня в день, предшествующий дню эксперимента. Потерю крови измеряли, как описано выше, результаты представлены ниже в табл. 20 как процент ингибирования (рассчитывали среднее значение для интересующего варианта и делили на значение для группы, в которой вводили носитель) и значение ЕР50 (определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием ОгарНРаГ Рп5т®, ОгарНРаГ 8ой^аге, Ιη^), максимум и минимум кривой ответа ограничены потерей крови в группе с введением носителя и потерей крови у нормальных контрольных животных соответственно. Мгруппу относится к количеству мышей в группе, в то время как ’Ή в отношении расчета ЕР50 относится к количеству экспериментов, выполненных с вариантом.
Τаблица 20
Мутация (по нумерации зрелого РУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) Потеря крови в модели индуцирован-ной гемофилии; % ингибирования при каждой дозе Доза (мг/кг) Ν/ группу Потеря крови в модели индуцирован ной гемофилии; Εϋ50 (мг/кг) N
0.1 0.3 1
Н257А/О286К. Н117А/0143К 53 7-10
М298О М156О 37 81 87 7-10 0.11 1
Μ298Ο/Τ128Ν/ Р129А Μ156Ο/Τ[128]Ν/ Р[129]А 39 79 93 7-9 0.1 1
Ο286Κ/Τ128Ν/ Р129А Ο143Κ/Τ[128]Ν/ Р[129]А 32 42 58 6-8 0.27 1
Замена О1а из ИХ/ Τ128Ν/Ρ129Α /8222А/0286К Замена О1а из ИХ/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α /382А/О143К 27 45 62 6-8 0.27
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Потеря крови в модели индуцирован-ной гемофилии; % ингибирования при каждой дозе Ν/ группу Потеря крови в модели индуцирован ной гемофилии; Εϋ50 (мг/кг) N
Доза (мг/кг)
0.1 0.3 1
О286К/М298О О143К/М156О 33 57 89 9-10 0.15 1
О286Р/М298О О143К/М156О 35 57 94 8-10 0.13 1
О286К/М298О О143К/М156О 32 62 95 8-9 0.14 1
О286К/М298О О143К/М156О 44 65 95 9 0.09 1
Замена О1а из ИХ /О286К/М298О Замена О1а из ИХ /О143К/М156О 35, 57 80 7-10 0.14 1
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286 К/М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О 47, 83 91 9-14 0.1 1
Замена О1а из ИХ /Τ128Ν/Ρ129Α /О286К/М298О Замена О1а из ИХ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α /О143К/М156О 15 71 96 7-9 0.17 1
{Замена О1а из ИХ /К431}/О286Р/ М298О {Замена 01а из ИХ /К[43]1}/О143К/ М156О 49 65 80 7-9 0.08 1
Замена О1а из ИХ / 852А/860А/ О286К/М298О/ Замена 01а из ИХ / 8[52]А/8[60]А/ О143К/М156О/ 38 71 88]· 9-10 0.11 1
{Замена О1а из ИХ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129 А/ О286К/М298О {Замена О1а из ИХ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/ Р[129]А/0143К/ М156О 23 58 84 9 0.17 1
8222А/Н257А/О286 К/М298О/ Τ128Ν/Ρ129Α 882А/Н117А/О143К/ М156О/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 24 71 96 7-8 0.15 1
О286Р/М298О/ Ο366Ν О143К/М156О/ 0217Ν 41 79 96 7-8 ТОЛЬКО носитель п=17 0.1 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К/М298О/ Ο366Ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О/ Ο217Ν 40 53 84 6-8 0.09 1
{Замена О1а из ИХ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129 А/ О286Р/М298О/ Ο366Ν/ {Замена 01а из ИХ /К[43]1}/ Τ[128]Ν/ Р[129]А/О143К/ М156О /ζ)217Ν 39 81 94 8-10 0.1 1
- 133 020818
+ доза 0,6 мг/кг
Пример 7. Определение кинетических параметров Михаэлиса-Ментен для амидолитической активности РУПа для низкомолекулярного субстрата.
Амидолитическая активность вариантов РУН может быть оценена путем измерения кинетических параметров Михаэлиса-Ментен полипептида РУПа для пептидного субстрата 8ресйо/уте РУПа (СН3802-^-СНΑ-Βиί-Α^§-рNΑ.Αс0Н). Такой анализ может быть выполнен следующим образом. Для обеспечения оптимальной активности РУПа в анализ может быть включен связанный с липидами очищенный человеческий тканевый фактор (Ιηηονιη, Эайе ВеЬгтд, У\К Саί # 68100-390). Комплекс ТФРУПа расщепляет 8ресйо/уте РУПа как весьма специфический хромогенный субстрат с высвобождени- 134 020818 ем паранитроанилинового хромофора (ρΝΑ), содержание которого можно определять, измеряя поглощение при 405 нм. Активность ферментов определяли, измеряя абсорбцию свободного ρΝΑ при 405 нм как функциию времени.
Реакцию осуществляли при трех различных концентрациях фермента. Для реакции варианты РУНа сначала разбавляли до 40 нМ в 1 х прямом буфере для анализа (100 мМ Трис рН 8,4, 100 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,01% БСА) в 1,7 мл пробирке (низкоадгезионные пробирки для центрифугирования от КС Вюехрге§5). Затем РУНа разбавляли в присутствии ТФ (!ппоу1п, Байе ВеЬгшд) до 2 нМ в 12-луночном полипропиленовом планшете (Αχγ^η) следующим образом: смешивали 720 мкл 5 х прямого буфера (500 мМ Трис рН 8,4, 500 мМ ЫаС1, 25 мМ СаС12, 0,05% БСА), 180 мкл 40 нМ РУНа и 2700 мкл 2 х ТФ (6 нМ исходный раствор, восстановленный в 10 мл воды). Разбавленную протеазу инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Исходный 2 нМ раствор РУНа далее последовательно разводили в 2 раза также в присутствии ТФ с получением 1 и 0,5 нМ растворов протеазы соответственно. Реакционную среду готовили следующим образом: сначала 1800 мкл 2 нМ исходного раствора РУНа/ТФ разводили в 360 мкл 5 х прямого буфера, 900 мкл 2 х ТФ, и 540 мкл воды. Этот разбавленный раствор снова разбавляли 1:1 в 1800 мкл 1 х ТФ в прямом буфере.
В планшете приготовили разведения субстрата δρесί^οζуте РУНа (Αте^^саη Б1адг1о511са). Исходный раствор δρесί^οζуте РУНа готовили восстановлением 50 мкмоль содержимого флакона в дистиллированной воде до 10 мМ и хранили при 4°С. 80 мкл (10 мМ δρесΐ^οζуте РУНа) и 60 мкл 10 мМ δρесί^οζуте РУНа + 20 мкл воды (7,5 мМ δρесί^οζуте РУНа) добавляли в лунки в двух соседних столбцах 96луночного полипропиленового планшета для анализа (Со§1аг). Содержимое двух лунок последовательно разводили в 2 раза в каждой из 8 лунок соответствующего столбца, что привело к серии из 10х концентраций субстрата от 10 мМ до 78 мкМ субстрата сверху вниз в лунках в первом столбце и от 7,5 мМ до 58,6 мкМ субстрата сверху вниз в лунках во втором столбце. Пять мкл разведения субстрата δρесί^οζуте РУНа добавляли в 96-луночный прозрачный планшет для анализа формата Ьа1Г агеа (Со§1аг). 45 мкл каждого из трех разведений РУНа/ТФ добавляли в три группы столбцов с последовательными разведениями субстрата. На этом этапе принимались меры, чтобы избежать введения пузырьков в лунки для анализа. Если пузырьки были введены, они могут быть удалены покалыванием чистой иглой перед началом каждого анализа. Содержимое планшетов затем перемешали встряхиванием. До начала анализа длину оптического пути в лунках для анализа измеряли с помощью планшетного спектрофотометра δρесί^атаx Оетии М5 (Мо1еси1аг БеУсеЩ, при измерении в конечной точке и использовании функции ΡаΐЬсЬеск из программного обеспечения δοГΐΜаx Ριό (Мо1еси1аг БеУсеЩ. Увеличение абсорбции при 405 нм измеряли каждые 30 с в течение 1 ч при 37°С.
Программное обеспечение δοйΜаx Ριό использовали для преобразования величин абсорбции (единиц оптической плотности/с) в концентрацию отщепленного ρΝΑ (мкМ/с) с помощью величины оптического пути и коэффициента молярной экстинкции уходящей группы ρΝΑ при 405 нм, 9600 М-1см-1. Уравнение для преобразования выглядит следующим образом: скорость х (1/60х 1000)х(1/9600 х длина оптического пути) х 100000. На основании результатов для каждой концентрации протеазы строили график с использованием программного обеспечения ОгарЬ Ρаά Ρπ5ΐη, откладывая концентрацию субстрата на оси Х и измеренные скорости мкМ/с на оси Υ. Величины КМ и Утах определяли с использованием программного обеспечения ОгарЬ Ρаά Ρπδΐη 4, аппроксимируя данные уравнением Михаэлиса-Ментен следующим образом:
Υ = (^1^/1000000) х Х х [Е])/(1 + (Х + Км), где Х представляет собой концентрацию субстрата, мкМ,
Υ представляет собой активность фермента, мкМ/с, ^ΑΙ·ΚΜ представляет собой константу специфичности, М-1с-1,
Км представляет собой константу Михаэлиса, мкМ,
Е представляет собой концентрацию фермента, мкМ.
Были установлены начальные значения Е = 1, Км = Х при 0,5 х Υ^ и к^т Км = 1000.
Пример 8. Оценка активности взаимодействия между вариантами РУНа и ТРΡI.
Активность взаимодействия между полипептидами РУНа, такими как, например, предусмотренные в настоящем документе, и ТРΡI, может быть оценена с использованием одного или более анализов. В одном примере, активность взаимодействия между ТРΡI и РУНа/ТФ комплексом оценивали путем измерения уровня ингибирования каталитической активности РУНа/ТФ для субстрата, δρесί^аζуте УНа, различными концентрациями ТРΡI. В другом примере может быть использован высокопроизводительный поверхностный плазмонный резонанс (δΡΚ).
А. Определение Κ.’30 для ингибирования РУНа/ТФ ТРИ.
Активность взаимодействия между ТРΡI и РУНа/ТФ комплексом была оценена путем измерения уровня ингибирования каталитической активности РУНа/ТФ для субстрата, δρесΐ^аζуте УНа, различными концентрациями ТРΡI. Концентрацию ТРИ, которая требуется для 50% ингибирования (Σί^), рассчитывали для каждого варианта РУН и стандарта РУНа.
В каждую лунку 96-луночного прозрачного планшета для анализа формата Ьа1Г агеа (Νιιικ) предва- 135 020818 рительно обрабатывали 150 мкл/лунку 1 х планшетным буфером (100 мМ Трис рН 8,4, 100 мМ №С1, 0,01% БСА, 0,01% твин-20) и инкубировали планшеты при 37 С в течение как минимум 1 ч. Буфер полностью удаляли встряхиванием и промоканием планшета, для удаления оставшегося буфера планшеты центрифугировали вверх дном. Планшеты сушили на воздухе в течение 1 ч и хранили при комнатной температуре (КТ). В 1,7 мл пробирке (низкоадгезионная пробирка от КС Вюехргекк) готовили смесь РУЛ Ιη/ТФ в общем объеме 450 мкл путем смешивания 9 мкл 250 нм РУПа (Атепсап О1адпокйса, РУПа дикого типа или соответствующий вариант, предназначенный для исследования) с 337,5 мкл 2 х ТФ Дппоут; ЭаТе ВеНппд; лиофилизированный продукт суспендировали в 10 мл дистиллированной воды с получением 2 х ТФ, что примерно эквивалентно 7 нМ связанного с липидами ТФ), 90 мкл 5 х буфера (500 мМ Трис рН 8,4, 500 мМ №С1, 25 мМ СаС12, 0,05% БСА) и 13,5 мкл воды, в результате чего получили раствор, содержащий 5 нМ РУПа и 5,2 нМ ТФ. Для образования компонентами комплекса смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. В каждую лунку 2 колонок в предварительно обработанного 96-луночного прозрачного планшета для анализа формата На1Г агеа добавили 25 мкл соответствующей смеси РУПа/рТФ, планшет закрыли для предотвращения испарения.
Рекомбинантный человеческий ТРРI (Κ&Ό 8ук1етк) сначала растворили в 33 мкл 50% глицерина (об./об.) с получением 10 мкМ исходного раствора для хранения при -20°С. Исходный раствор ТРРI далее разбавляли до 1,5 мкМ в окончательном 1 х буфере (100 мМ Трис рН 8,4, 100 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,01% БСА) в полипропиленовом планшете для хранения следующим образом: для каждой исследуемой протеазы 87,5 мкл 1,5 мкМ раствора ТРРI получали смешиванием 13,1 мкл 10 мкМ ТРРI с 17,5 мкл 5 х буфера для анализа и 56,9 мкл дистиллированной воды. Были приготовлены последовательные 3кратные разведения раствора ТЕЛ в 1х буфере для анализа путем смешивания 27,5 мкл ТРРI с 55 мкл 1х буфера для анализа, так что были получены растворы, содержащие 750, 250, 83,3, 27,8, 9,26, 3,1 и 1,03 нМ ТРРТ Последняя лунка содержала только 1х буфер в качестве контроля.
мкл каждого разведения ТРРI добавляли в 2 лунки (т.е. в двух повторностях) в 2 колонки 96луночного прозрачного планшета для анализа, содержащего РУПа/ТФ смесь, так что смесь с протеазой исследовали в двух повторностях с каждым разбавлением ТРРТ Раствор 1х буфера без ТРРI также добавили в 2 лунки, содержащие РУПа/ТФ смесь, в качестве отрицательного контроля. Планшеты быстро перемешивали, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и инкубировали при 37°С в течение 1,5 ч.
Исходный раствор 8рес1га/уте УПа (Атепсап О1адпокйса) приготовили восстановлением 50 мкмоль субстрата в 5 мл дистиллированной воды до 10 мМ и хранили при 4°С до использования. Непосредственно перед использованием раствор разбавляли до 600 мкМ в дистиллированной воде. После инкубации планшета анализа, описанного выше, в каждую лунку добавляли 10 мкл разбавленного 8рес(га/уте УПа. Реакционную смесь перемешали и планшеты инкубировали при 37°С. Увеличение абсорбции при 405 нм измеряли каждые 30 с в течение 1 ч при 37°С, скорость изменения поглощения рассчитывали с использованием программного обеспечения 8ойМах Рго (Мо1еси1аг Эеуюек).
Для определения степени ингибирования ТРРI скорости изменения абсорбции в протеазной реакции в присутствии ТРРI сначала делили на скорость изменения абсорбции в реакции в отсутствие ТРРI (контрольный образец) и получали относительную активность, также определяли 1о§10 каждой концентрации ТРИ. С использованием программного обеспечения СгарНРай Рпкт 1од10[ТРРГ| откладывали против относительной активности каждой протеазы, таким образом была получена кривая доза-ответ, при аппроксимации прямой предполагали, что максимум и минимум значений активности фиксируются в 1 и 0 соответственно. Для определения ингибирования ТРРI в виде 1о§10С50 (ρΙί'.'50) значения и абсолютного значения Ιί'.'50 (ингибирование ТРРI в нМ) для каждой протеазы, и определения его среднего значения и стандартного отклонения было использовано программное обеспечение.
Уровень ингибирования ТРРI каждого из вариантов РУПа в комплексе со связанном с липидами ТФ Дппоут; Эайе ВеНгшд) был определен и выражен как увеличение устойчивости к ТРРI в некоторое количество раз по сравнению с РУПа дикого типа (табл. 21).
- 136 020818
Таблица 21
Ингибирование вариантов РУПа ТРЛ
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Кратная устойчивость к ΤΡΡΙ
дикий тип дикий тип 1.0
Α292Ν/Α2943 Α150Ν/Α1523 2.4
А1753 А393 1.5
Κ.109Ν Κ[109]Ν 0.7
Α122Ν/Ο1243 Α[122]Ν/Ο[124]δ 1.1
А122Ν/01243/Ε394Ν/Ρ395А/К3963 А[ 122]Ν/Ο[ 124] 3/Ε245Ν/Ρ246А/ К2473 1.0
В. Исследование вариантов РУПа на устойчивость к воздействию ТРΡI методом поверхностного плазмонного резонанса (8РК).
Относительную устойчивость различных вариантов РУПа к ингибированию человеческим рекомбинантным растворимым ТРΡI оценивали с помощью высокоэффективного поверхностного плазмонного резонанса (8РК) на биосенсоре В1асоге Т100. Относительную устойчивость вариантов РУПа к ингибированию ТРΡI оценивали путем измерения относительного количества варианта РУПа, связанного с растворимым ТРРр иммобилизованным на сенсорном чипе СМ5 В1асоге, по сравнению с количеством связанного РУПа дикого типа при стандартизированном времени введения и концентрации протеазы.
Для каждого эксперимента растворимый ТРΡI (Κ&Ό 8узίетз) иммобилизовали на новом сенсорном чипе 4-поточной ячейки В1асоге СМ5 8епез 8 (ОЕ НеаЙЬсаге) с использованием протокола связывания аминогруппы, доступного в программном обеспечении для В1асоге Т-100 (ОЕ НеаЙЬсаге), и реагентов, содержащихся в комплекте для связывания аминогрупп Атте Соир1ш§ КП (ОЕ НеаЙЬсаге). Все четыре доступных проточных ячейки использовали для иммобилизации двух различных плотностей ТРΡI и бычьего сывороточного альбумина (БСА), который служил блокирующим агентом в указанных ячейках. БСА разбавляли до 5 мкг/мл в ацетате натрия (рН 4,0) и иммобилизовали в проточной ячейке до 1 и 3 в 1000 и 2000 единиц ответа (КИ) соответственно. Для иммобилизации ТРΡI лиофилизированный растворимый ТРΡI (10 мкг) ресуспендировали в 100 мкл 1х буфера для иммобилизации (30 мМ Нерез, 135 мм №С1, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Твин-20, рН 7,4) до концентрации 0,1 мг/мл. В общей сложности 20 мкл 0,1 мг/мл ТРΡI разбавляли до 10 мкг/мл в ацетате натрия рН 4,0 для иммобилизации в проточной ячейке до 2 и 4 в 1000 и 2000 Ки соответственно. Буфер для иммобилизации использовали в качестве рабочего буфера во время иммобилизации. Каждый образец РУПа готовили в конечной концентрации 320 нМ в ГС рабочем буфере (20 мМ Нерез, 150 мМ №С1, 5 мМ СаСС, 0,1% ПЭГ 8000, 0,1% БСА, 0,01% Твин-20, рН 7,4), содержащем 620 нМ рТФ (Нитаη Сοа§и1аί^οη РасЩг ΙΙΙ, К & Ό 8узίетз). Как правило, каждый вариант РУПа разбавляли в 10 раз в 1 х рабочем буфере до окончательного разведения 320 нМ. Комплекс РУПа/рТФ готовили в конечном объеме 120 мкл в двух повторностях, что позволяло внести в 96луночный планшет для хранения и исследовать с повторяющимися введениями за один проход до 48 уникальных вариантов РУПа. Комплексы РУПа/рТФ инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин до первого введения образца.
С применением программного обеспечения В1асоге Сопйо1 8о!'1маге (ОЕ НеаЙЬсаге) разработали стандартизированный анализ связывания, в котором каждую повторность РУПа вводят на 180 с для ассоциации с последующими 60 с для диссоциации при скорости потока 10 мкл/мин. Регенерацию сенсорного чипа после фазы диссоциации проводили в течение 30 с 10 мМ глицином, 500 мМ №С1, рН 3,0, после чего следовал 60-секундный период стабилизации при пропускании ГС рабочего буфера при той же скорости потока 10 мкл/мин. При каждом пропускании раствора и последующем анализе данных записывали значения в двух точках, одно за 5 с до завершения фазы ассоциации (связывания), а второе за 5 с до завершения фазы диссоциации. До начала полного анализа сенсорный чип проверяли с помощью одного введения 320 нМ РУПа/рТФ дикого типа на 180 с, которое должно дать ответ приблизительно 400450 КИ и 750-850 Ки в проточных ячейках 2 (1000 КИ) и 4 (200 КИ) соответственно.
Для проверки параметров анализа, включая проверку того, что связывание с указанной ячейкой является минимальным, проверку дрейфа базовой линии и связывания при контрольном введении (рабочего буфера), анализ данных проводили с помощью программного обеспечения В1асоге Т100 Еνа1иаί^οη 8оИмаге (ОЕ НеаЙЬсаге). Для этой цели были составлены таблицы с данными, в которых указывали количество связанного варианта РУПа (в КИ) точке связывания и точке диссоциации. Данные таблицы впоследствии экспортировали для дальнейшего анализа в таблицы Мюгозой Ехсе1. Необработанные данные (связывание в КИ) корректировали с учетом связывания с сенсорным чипом в контроле, затем для каждого параметра было вычислено отношение количества связанного РУПа дикого типа (в КИ) к количеству связанного варианта РУПа (в КИ) и приведено как связывание (дикий тип/вариант) и диссоциация (дикий тип/вариант). В табл. 22 представлены результаты исследования. Устойчивость к ингибированию
- 137 020818
ТРИ отражается как увеличение отношения для одного или обоих оцениваемых параметров. Например, значение 20 для связывания (дикий тип/вариант) или диссоциации (дикий тип/вариант) для конкретного варианта РУПа указывает, что вариант в 20 раза более устойчив к ингибированию ТРРI по сравнению с РУПа дикого типа. Несколько исследованных вариантов проявляли повышенную устойчивостью к ингибированию ТРИ. Например, варианты, содержащие мутацию К34ГО (по нумерации зрелого РУП), такие как р286К/М298р/К34ГО-РУПа, 0286К/К341О-РУПа и М298р/К34ГО-РУПа, обладали отношением, которое указывает на значительную устойчивость ТРРI (большую в 40-150 раз). В некоторых случаях скорость диссоциации была изменена больше, чем скорость ассоциации.
Пример 9. Фармакокинетический анализ полипептидов РУПа.
Фармакокинетические свойства полипептидов РУПа оценивали путем измерения количества человеческого фактора УПа в мышиной плазме. Для количественной оценки РУПа в плазме могут быть использованы два анализа. Для количественной оценки общего содержания РУПа в плазме мыши может быть использован ИФА, а для количественной оценки коагулянтной активности полипептидов РУПа в плазме может быть использован РУПа-зависимый анализ свертывания (РУПаАС).
A. Введение РУПа полипептидов мышам.
В фармакокинетических исследованиях оценивали модифицированные полипептиды РУПа и немодифицированный рекомбинантный человеческий РУПа (гЬРУПа) (Шуоясусп®®, Ново Нордиск). Для каждого исследования 18 самцам СГОД мышей вводили внутривенно болюс (0,1-3,0 мг/кг в зависимости от исследования) с гРУНа. Через 5, 15, 30, 60, 120 и 240 мин после инъекции трех мышей в каждой исследуемой группе умерщвляли удушением СО2, и в 1,0 мл шприц с помощью чрескожной сердечной пункции отбирали около 1,0 мл крови. В каждый шприц предварительно набирали достаточное количество цитрата натрия для достижения конечной концентрации 3,2% в 1 мл крови. Образцы крови затем центрифугировали при 9000 об/мин в течение 8 мин при 4°С. Плазму переливали в отдельные подписанные 1,5 мл пробирки (Эппендорф), быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. Кроме того, в каждом эксперименте одной мыши вводили только носитель, плазму от такой мыши использовали для определения фоновой активности РУПа.
B. ИФА.
Для обнаружения белка РУП в сыворотке крови методом ИФА использовали имеющийся в продаже комплект ^иЬшб® Рас1ог УП ЕЫ8А (Αте^^саη 01а8Г1ояйса). В комплект включен планшет, предварительно покрытый анти-РУП/РУПа антителами для связывания белка, и биотинилированные анти-РУП антитела для обнаружения меченой стрептавидином пероксидазой хрена. Комплект использовали в соответствии с инструкциями производителя со следующими исключениями: во-первых, диапазон стандартной кривой был сужен для уверенности в линейности зависимости во всем диапазоне концентраций и охватывал концентрации от 0,88 нг/мл до 10 нг/мл, во-вторых, для построения стандартной кривой использовали сам очищенный вариант РУПа, а не стандартный РУП, поставляемый в наборе, из-за различий в аффинности к антителам. Эксперименты показали, что комплекс РУПа с антитромбином III (АТШ), мощным ингибитором РУПа в плазме, обнаруживается в 75% от уровня свободной протеазы, что гарантировало, что анализ может обнаружить общий РУПа в образце плазмы в активный и неактивной форме. Образцы плазмы разморозили при комнатной температуре и разбавляли в 10 раз в буфере для образцов (РВ8+0,1% Тритон Х-100+1,0% БСА), затем последовательно разбавляли в 5,5 раз с получением четырех разведений. Четыре разбавленных образца разбавляли в 2 раза в планшете для ИФА для окончательного разведения образца в 20, 110, 605 и 3327,5 раза. Эти четыре разведения мышиной плазмы покрывали диапазон концентраций протеазы от 33000 до 20 нг/мл. Каждый образец измеряли на двух отдельных планшетах для анализа, и измерения, попадающие в диапазон стандартной кривой, были использованы для расчета концентрации вариантов РУПа в образце плазмы.
C. Анализ коагуляции.
Для анализа свертывания был использован коммерчески доступный комплект (8ТАСЬ0Т РУПаКТФ, Охад^я!^ 81адо, Ра^я^ρρаηу, штат Нью-Джерси). Для определения коагулянтной активности активных полипептидов РУПа образцы плазмы анализировали с использованием РУПа-зависимого анализа свертывания (РУПаАС). Анализ проводили с использованием реактивов и инструкций, содержащихся в коммерческом комплекте, время свертывания крови измеряется с помощью электромеханического прибора обнаружения сгустка (8ТАг!4, О1а8гюяйса 8!адо, Ра^δ^ρρаηу, штат Нью-Джерси). Комплект использовали в соответствии с инструкциями производителя со следующими исключениями: во-первых, для построения стандартной кривой использовали сам очищенный вариант РУПа, а не стандартный гЬРУП, поставляемый в наборе, во-вторых, для рутинных фармакокинетических исследований использовали следующие коммерчески доступные реагенты, которые давали сопоставимые результаты: растворимый тканевый фактор (Са1Ыосйет, Ьа НПа, Калифорния), смесь синтетических фосфолипидов (Ахаий Ро1аг Ыр1бя, А1аЬая1ег, Алабама), буфер ТВ8А (Трис-№С1, рН 7,5 с 1% БСА; О|аРНагта, \Уея1 Сйея1ег, штат Огайо) и 25 мкМ раствор хлорида кальция (Шадгюяйса 8!адо, Га^эрат; штат Нью-Джерси).
Анализ коагуляции проводили следующим образом. Замороженные образцы плазмы размораживали при комнатной температуре в течение примерно 45 мин, а затем разводили 1:5000 в буфере. 50 мкл
- 138 020818 разбавленной плазмы смешивали с 50 мкл фактор УН-дефицитной человеческой плазмы и 50 мкл связанного с липидами тканевого фактора и предварительно инкубировали в течение 180 с. После предварительной инкубации для инициации свертывания к смеси добавили 50 мкл раствора хлорида кальция (25 мкМ). Время свертывания крови определяли с помощью электромеханического обнаружения сгустка. Каждый образец плазмы исследовали в двух повторностях. Система была откалибрована с помощью построения стандартной кривой с использованием времени свертывания для последовательных разведений буфера, содержащих известное количество специфического варианта РУНа, подвергающегося анализу. Концентрации РУНа в образцах плазмы мыши рассчитывали по линейной части стандартной кривой зависимости 1о§РУНа от 1од времени свертывания. Способность образцов плазмы вызывать свертывание в фактор УН-дефицитной плазме определяли в нг РУНа/мл плазмы мыши после вычитания фонового уровня эндогенного РУНа дикого типа в плазме у мышей контрольной группы.
Период полураспада каждого белка РУН определяли обычной аппроксимацией натурального логарифма активности прямой линией и измерением времени, необходимого для уменьшения активности белка РУНа на половину. Для белков РУН с мультиэкспоненциальным распадом период полураспада определяли по последней фазе профиля зависимости 1од концентрации в плазме против времени. Дополнительные фармакокинетические параметры рассчитывали следующим образом: плазменную АиС0-шГ/ доза (рассчитывали как [АИС(0-б) + С6/(1п2/Т1/2)], где б представляет собой последний момент времени с измеримой концентрацией полипептида РУНа в плазме, деленный на внутривенную дозу (мг/кг)); период полураспада (период полураспада полипептида РУНа последней фазе профиля зависимости концентрации РУНа в плазме от времени; Т1/2 рассчитывали как -1п2, деленный на отрицательный наклон последней фазы кривой 1од-линейной зависимости концентрации РУНа в плазме от времени); МКТ0-1акб (среднее время нахождения полипептида РУНа в организме; рассчитывали как АЦМС0-1акб/АиС0-1акб, где АиМС0-бакб представляет собой общую площадь под первым моментом кривой зависимости концентрации от времени (кривая зависимости концентрация РУНа против времени), рассчитывали по правилу трапеций); С1 (системный клиренс; рассчитывали как доза/АиС0-шГ) и Уб (объем распределения, на основе последней константы распада (β), рассчитывали как [С1/(1п2/Т6/2)]).
Ό. Фармакокинетические свойства вариантов РУНа.
Фармакокинетические свойства РУНа дикого типа и вариантов РУНа оценивали на основе коагулянтной активности в плазме с использованием описанного выше протокола РУНаАС. Результаты представлены в табл. 23. Несколько вариантов РУНа проявляли улучшенные фармакокинетические параметры по сравнению с РУНа дикого типа.
- 139 020818
Таблица 23
Фармакокинетические параметры вариантов РУЛа в мыши
- 140 020818
- 141 020818
Мутация (по нумерации зрелого РУП) ВВ доза (мг/кг) АиСо-ίηΓ (мкг*мин/ мл)/доза Период полураспада (мин) МКТ„.,а51 (мин) Клиренс (мл/мин/ кг) Объем распре- деления (мл/кг) N
Замена О1а из Р1Х/Т2391/ ()286К/М298() 0.1 1269 54 62 0.8 61 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ Т2391/(}286КУ М298С) 0.1 2105 82 74 0.5 56 1
8222А/Т2391/ Η257Α/ζ)286Κ/ Μ298ζ) 0.1 1212 31 (а), 79(а) 60 0.8 101 1
Т2391/(2286К/ Н373Р 0.1 1841 30(а), 85(а) 69 0.5 62 1
У158О/Т239У/ Е296У/ М296С) 0.1 184 24(а), 134(а) 78 5.4 1053 1
Τ239ν/ζ)286Κ 0.1 1522 29(а), 72(а) 68 0.7 68 1
Т239У/(}286К/ М298О/Н373Р 0.1 950 36 61 1.1 55 1
Т239У/(}286К/ М298(}/Н373Р 0.1 806 32 56 1.3 57 2
Τ239ν/ζ)286Κ/ М298(}/Н373Р 0.1 663 27 52 1.5 59 1
Т239У/(}286К/ М298(}/Н373Р 0.1 1350 53 62 0.7 57 1
8222А/Н2578/ ζ)286Κ/Μ298ζ) 0.1 814 33 31 1.2 59 1
Н2573/(}286К/ Μ298ζ)/Η373Ρ 0.1 297 34 34 3.4 163 1
8222А/(^286К/ М298(5/Н373Р 0.1 106 35 23 9.4 478 1
Замена 01а из ΡΙΧ /8222А/ О286К/М298С)/ Н373Р 0.1 104 9.1(а),17(а) 13 9.7 242 1
3222А/(3286К/ М298(} 0.1 347 24 26 2.9 102 1
Замена 01а из ΡΙΧ /8222А/ О286К/М298С) 0.1 263 11 13 3.8 62 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/О366У 0.1 2196 52(а), 85(а) 78 0.5 56 1
- 142 020818
Мутация (по нумерации зрелого РУН) ΒΒ доза (мг/кг) АиСо.1пг (мкг*мин/ мл)/доза Период полураспада (мин) МКТо-|а81 (мин) Клиренс (мл/мин/ кг) Объем распре- деления (мл/кг) N
Α122Ν/Ο1248/ А1753/()366У 0.1 2148 92 81 0.5 62 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/8222А 0.1 4248 122 88 0.2 41 1
Α122Ν/Ο1248/ А175 8/8222А 0.1 3316 102 83 0.3 44 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/Ц286К 0.1 6160 151 94 0.2 35 1
Α122Ν/Ο1248/ А1758/Ц286К. 0.1 4097 139 93 0.2 49 1
Замена О1а из ИХ /8222А/ Ц286К/Н373Р 0.1 480 26 30 2.1 79 1
У258О/Е296У/ М298()/Н373Р 0.1 90 8.7(а), 20(а) 14 11.1 321 1
Н257А/()286К/ М298Ц 0.1 1029 42 48 1.0 59 1
Замена О1а из ΡΙΧ/Τ128Ν/ Р129А/А1758/ 8222А/()286К. 0.1 2787 38(а), 134(а) 88 0.4 69 1
Замена О1а из ΡΙΧ/Α122Ν/ О1248/А1758/ 8222А/Ц286К 0.1 3492 148 95 0.3 61 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/О286К/ М298() 0.1 5120 171 96 0.2 48 1
Α122Ν/Ο1248/ А1758/()286К/ М298Ц 0.1 3681 154 92 0.3 61 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/8222А/ Н257А/Ц286К/ М298Ц 0.1 3140 113 87 0.3 52 1
Α122Ν/Ο1248/ А1758/8222А/ Н257А/()286К/ М298Ц 0.1 2659 37.(а),130(а) 85 0.4 70 1
Мутация (по нумерации зрелого РУП) ВВ доза (мг/кг) АиСо-ΐηΓ (мкг*мин/ мл)/доза Период полураспада (мин) МК.То-1а81 (мин) Клиренс (мл/мин/ кг) Объем распре- деления (мл/кг) N
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758/()286К/ М298Ц/Н373Р 0.1 3580 118 88 0.3 48 1
Α122Ν/Ο1248/ А1758/()286К /М298Ц/Н373Р 0.1 3148 105 84 0.3 48 1
νΐ58ϋ/()286Κ/ Е296У/М298О/ Н373Р 0.1 124 20 17 8.1 237 1
М298Ц/Н373Р/ Ο366Ν 0.1 169 8 8.2 5.9 69 1
Т239У/М298()/ Н373Р 0.1 110 18 16 9.1 235 1
Τ239Ι/Μ298()/ Н373Р 0.1 562 26 28 1.8 66 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ Ц286К/М298О/ ()366Ν/Η373Ρ 0.1 607 29 30 1.6 69 1
Т239У/О286К/ М298О/ Ο366Ν 0.1 729 29 30 1.4 57 1
Т2391/()286К/ Μ298()/()366Ν 0.1 1548 72 73 0.6 67 1
α - период полураспада α-фазы, измерение полупериода распределения β - период полураспада β-фазы, измерение полупериода распада
В табл. 24 приведены результаты исследования с использованием следующих фармакокинетических параметров: % выхода препарата (ίη νίνο) (измеренная концентрация РУНа в плазме спустя 5 мин после введения (первая временная точка), деленная на теоретическую максимальную концентрацию РУНа в плазме (рассчитанную из введенной массы РУНа и теоретического общего объема крови), умноженная на 100%); % выхода препарата (ίη νίΐτο) (измеренная концентрация РУНа в плазме, в которую добавили известное количество РУНа, деленная на теоретическую максимальную концентрацию РУНа в плазме (рассчитанную из количества добавленного РУНа к известному объему плазмы), умноженная на 100%); величины АИС* Активность/доза (в присутствии ТФ) (отношение АИС/доза в плазме, умноженное на ТФ-зависимую непрямую активность (см. табл. 15 выше); улучшения проявления активности по сравнению с РУНа Nονοкеνеи® (в присутствии ТФ) (рассчитывали как АиС*Активность/доза (в присутствии рУпа/АИС*Лктивность/доза (в присутствии ТФ)мугант РУПа; величины
АиС*Активность/доза (без ТФ) (отношение АИС/доза в плазме, умноженное на ТФ-независимую не- 143 020818 прямую активность (см. табл. 15 выше); улучшения проявления активности по сравнению с РУНа №νокеνеп® (без ТФ) (рассчитывали как АиС*Активность/доза (без ТФ)^^^® РУПа/АиС*Активность/доза (без ТФ)мутант РУНа)·
Таблица 24
- 144 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) % выхода (ίη νίνο) лис * активность / дозу (в присутствии ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в присутствии ТФ) лис * активность / дозу (в отсутствие ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в отсутствие ТФ)
5222А/Т239У/ Н257А/<2286К/ М298<2 15% 3.87Е+10 1.3 2.59Е+04 3.6
Τ128Ν/Ρ129Α/ Т239У/(2286К/ М298<3 60% 9.47Е+10 3.2 2.10Е+05 28.9
(замена О1а ИХ/Т239У/ ()286К/М298(2 34% 9.24Е+10 3.2 1.01Е+05 14.0
Т239У/()286К/ М298(2 21% 6.85Е+10 2.3 1.17Е+04 1.6
замена О1а ИХ/ 8222А/Т239У/ (2286К 33% 9.32Е+10 3.2 7.99Е+03 1.1
8222А/Т239У 10% 9.52Е+09 0.3 3.83Е+02 0.1
У158О/()286К/ Е296У/М298(2 15% 2.56Е+10 0.9 1.76Е+05 24.3
Τ128Ν/Ρ129Α/ ()286К/М298(2/ Н373Р 36% 7.92Е+10 2.7 1.83Е+04 2.5
()286К/М298(2/ Н373Р 66% 1.39Е+11 3.9 1.42Е+05 12.1
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286Р/Н373Р 49% 2.03Е+11 6.9 1.93Е+04 2.7
{замена О1а ИХ Κ[43]Ι}/ Τ128Ν/ Р129А (2286К/М298(2 /(2366Ν 45% 9.88Е+10 3.4 8.58Е+04 11.8
{замена 01а ИХ К[43]1}/()286К/ Μ298()/(2366Ν 36% 4.35Е+10 1.5 2.18Е+04 3.0
()286К/М298(2/ (2366Ν 41% 1.33Е+11 4.5 7.50Е+04 10.3
М298(2/К34Ю 84% 4.26Е+10 1.0 1.02Е+04 0.6
()286К/М298(2/ К34Ю 33% 4.98Е+09 0.1 5.24Е+03 0.3
А1755Л2286К/ ()366У 22% 3.72Е+10 0.9 7.31Е+03 0.4
552А/560А/5222А/ Н257АЛ228К/ М2986(2 45% 1.17Е+11 4.0 5.42Е+04 7.5
- 145 020818
Мутация (по нумерации зрелого РУН) %
выхода (ΐη νίνο) лис* активность/ дозу (в присутствии ТФ)
Τ128Ν/Ρ129Α/8222
А/Н257А/(}286К/
Μ2986(^
3222А/Н257А/
О286КЖ298О
8222А/М298(2 {замена О1а ΡΙΧ/Κ[43]Ι}/Τ128Ν/ Р129АЛ3286К/ М298<3 замена О1а Р1Х/352А/360А/ О286ЮМ298О
352А/360А/
0286К/М2989 {замена О1а Р1Х/М[19]К}/ О286К/М298О {замена О1а
ΡΙΧ/(}[44]3}/
Ο286Κ/Μ298(2 {замена О1а
Р1Х/К[43]1}/
О286К/М298О {замена О1а Р1Х/Е[40]Р}/ О286К/М298О замена 01а ΡΙΧ /Τ128Ν/Ρ129Α/ О286ЮМ298О
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
О286КУМ298О
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
О286К/М298О (3143К/М15бр/заме на О1а ΡΙΧ
О286К/М298О
8222А/Н257А/ (2286К
9%
7%
31%
28%
62%
21%
51%
1.80Е+11
3.04Е+10
8.63Е+09
4.67Е+10
1.20Е+11
4.21Е+11
8.53Е+10
1.08Е+11
Увеличение проявляемой активности по сравнению с
Ново7 (в присутствии ТФ)
6.1
0.9
0.2
1.6
4.1
14.4
2.7
3.2 лис* активность / дозу (в отсутствие ТФ)
5.23Е+04
4.17Е+04
9.51Е+04
8.11Е+04
3.96Е+05
1.84Е+05
2.30Е+05
1.03Е+05
Увеличение проявляемой активности по сравнению с
Ново7 (в отсутствие ТФ)
4.9
5.1
11.2
54.5
25.4
29.9
11.2 замена 01а ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α /8222А/О286К
1.44Е+04
2.0
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) % выхода (ίη νίνο) лис* активность/ дозу (в присутствии ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в присутствии ТФ) лис * активность / дозу (в отсутствие ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в отсутствие ТФ)
замена 01а Р1Х/ 8222А/ Р286К. 32% 5.95Е+10 1.4 2.15Е+04 1.2
3222А/0286К. 51% 1.85Е+11 5.4 4.61Е+04 2.5
Η257Α/ζ)286Κ 63% 3.66Е+11 12.5 1.59Е+04 2.2
Α122Ν/Ο1248/ А1758 82% 8.70Е+10 2.4 2.18Е+04 1.2
Τ128Ν/Ρ129Α/ А1758 80% 6.16Е+10 1.7 Νϋ Νϋ
8119Ν/Ρ1218/ А1758 60% 8.68Е+10 2.5 Νϋ Νϋ
Κ109Ν/Α1758 22% 4.73Е+10 1.3 Νϋ Νϋ
А1758 52% 8.10Е+10 2.4 1.40Е+04 0.8
Ο318Ν 37% 5.22Е+10 1.2 О.ООЕ+ОО 0.0
Α122Ν/Ο1248/ Ε394Ν/Ρ395Α/ КЗ 968 46% 1.07Е+11 2.5 не определяли не определяли
замена 01а Р1Х/ (}366У 26% 1.43Е+10 0.5 1.41Е+04 1.9
(}366У 3% 4.09Е+09 0.1 1.44Е+03 0.1
Н2578 39% 1.67Е+11 5.1 1.30Е+04 0.9
Н257А 36% 4.96Е+10 1.2 1.18Е+04 0.6
852А/860А/8222А 11% 1.05Е+10 0.4 5.28Е+03 0.7
Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А 21% 5.28Е+10 1.8 4.06Е+03 0.6
5222А 10% 1.55Е+10 0.4 8.56Е+03 0.5
К34Ю 98% 4.77Е+10 1.1 не определяли не определяли
552А/360А/(2286К 67% 6.42Е+10 2.2 1.59Е+04 2.2
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К 67% 4.13Е+11 14.1 4.24Е+04 5.8
(}286К 35% 1.31Е+11 3.7 3.52Е+04 2.6
852А/860А/У158О/ Е296У/М298(3 7% 9.34Е+09 0.3 8.24Е+04 11.3
Τ128Ν/Ρ129Α/ У158Э/Е296У/ М298<3 21% 5.03Е+10 1.7 3.44Е+05 47.4
Τ128Ν/Ρ129Α/ М298(2 58% 3.11Е+10 1.1 4.49Е+04 6.2
М286(} 18% 1.33Е+10 0.4 4.93Е+04 3.8
352А/360А 51% 5.36Е+10 1.4 7.76Е+03 0.6
146 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) % выхода (ίη νίνο) лис* активность/ дозу (в присутствии ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в присутствии ТФ) лис* активность / дозу (в отсутствие ТФ) Увеличение проявляемой активности по сравнению с Ново7 (в отсутствие ТФ)
Α51Ν 15% 4.65Е+10 1.1 9.39Е+03 0.5
Α122Ν/Ο1248 45% 5.26Е+10 1.8 4.61Е+03 0.6
Α122Ν/Ο1243 45% 9.20Е+10 2.2 0.00Е+00 0.0
Κ109Ν 52% 1.05Е+11 3.6 Νϋ Νϋ
Κ109Ν 52% 8.43Е+10 2.0 Νϋ Νϋ
352А 37% 3.50Е+10 0.8 0.00Е+00 0.0
замена О1а ΡΙΧ 31% 2.63Е+10 0.7 1.28Е+04 1.4
Τ128Ν/Ρ129Α 88% 8.25Е+10 2.4 25147.5 2.6
Р257вставкаООО8С ЗРОКООИШУС 38% 6.29Е+10 1.5 не определяли не определяли
Пример 10. Определение связывания фактора УПа с растворимым тканевым фактором.
Способность вариантов РУНа, экспрессированных в НЕК 293 или ВНК клетках, связывать растворимый тканевый фактор (рТФ) оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1асоге. Варианты РУНа оценивали путем измерения профиля связывания при трех концентрациях протеазы в двух повторностях, используя два различных уровня рТФ, связанных с чипом В1асоге СМ5.
С новым сенсорным чипом 8епек 8 СМ5 (ОЕ Неа1бНсаге Саб # ВК 1006-68) связали бычий сывороточный альбумин и растворимый тканевый фактор с помощью прибора В1асоге Т100. Соединение было проведено с использованием буфера для соединения В1асоге (30 мМ \а Нерек рН 7,4, 135 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, 0,01% твин-20) с применением комплекта для связывания аминогрупп (ОЕ Неа1бНсаге Саб # ВК1000-50) и протокола в программном обеспечении В1асоге Т100. Для иммобилизации были использованы все четыре ячейки чипа. Ячейки 1 и 3 связали с 500 единицами ответа (Ки) бычьего сывороточного альбумина, указанный белок разводили в ацетатном буфере, рН 4,0, ячейки 2 и 4 связали с 500 и 250 Ки рТФ (К&О 8укбетк), растворенным в ацетатном буфере, рН 4,5.
Каждый вариант РУНа и протеазу РУНа дикого типа исследовали при трех концентрациях и в двух повторностях. Протеазы разбавляли до 60, 30 и 15 нМ в 100 мкл буфера В1асоге (20 мМ \а Нерек, рН 7,4, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,1% ПЭГ 8000, 0,1% БСА, 0,01% Твин-20) в 96-луночном планшете для анализа. Каждый образец анализировали с помощью прибора В1асоге Т100 при времени контакта 120 с и времени диссоциации 180 с при скорости потока 10 мкл/мин. Буфер без растворенных белков также был исследован. Чип регенерировали 50 мМ ЭДТА, рН 7,0 в течение 60 с, затем 30 с. Анализ для определения связывания РУНа дикого типа с рТФ дал три набора кривых, которые дали значение Кб около 8 нМ.
Для анализа данных использовали программное обеспечение В1асоге Т100 ЕуаЬабюш Для аппроксимации был использован анализ связывания кинетика/аффинность 1:1, который аппроксимирует данные изотермой Ленгмюра, данные индивидуально аппроксимировали для двух повторностей для каждого варианта при двух уровнях единиц ответа. Четыре полученных после аппроксимации значения Кб были усреднены и приведены в табл. 25. Варианты РУНа, содержащие мутацию М298Р, как правило, проявляли более низкое значение Кб и, следовательно, более прочно связывали рТФ.
- 147 020818
Таблица 25
Связывание вариантов РУНа с растворимым ТФ
Мутация (по нумерации зрелого ГУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Аффинность Ка (нМ) 293-Г ВНК21 клетки клетки
Дикий тип Дикий тип 7.9 9.0
Ο286Ν Ο143Ν 8.9
О286Е О143Е 3.8
О286И Ο143ϋ 9.8
02868 01438 8.2
О286Т О143Т 10.6
0286К 0143К. 7.6
О286К О143К 8.2
О286А 0143 А 6.3
О286У О143У 11.9
8222А 882А 4.2
Н2578 Н1178 4.2
О366И 0217ϋ 3.2
О366Е О217Е 5.6
Ο366Ν 0217Ν 3.8
О366Т 0217Т 7.1
03668 02178 9.0
О366У О217У 7.9
А1753 А398 6.5
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по Аффинность Ка (нМ)
нумерации химотрипсина) 293-Г клетки ВНК21 клетки
У158Т/Ь287Т/М298К У21Т/Ы44Т/М156К 8.4
У158О/Ь287Т/М298К У2ГО/Ы44Т/М156К 8.5
0286К/8222А О143К/882А 7.3
О286К/8222А/ замена О1а ΡΙΧ О143К/882А/ замена О1а ΡΙΧ 8.4
О286К/М298О О143К/М156О 4.7
О286К/М298О/К341О О143К/М156О/К192О 11.4
О286ЮМ298О/К199Е О143К/М156О/К60сЕ 4.9
8222А/М298О 882А/М156О 5.1
Н257А/М298О Н117А/М156О 3.1
8222А/Н257А /О286К/М298О 382А/Н117А/О143К/ М156О 2.5
О286К/О366У О143К/О217У 29.3
А1753/О286К/О366У А398/О143К/О217У 18.3
8222А/О286К/О366У 882А/О143К/О217У 8.6
О286М О143М 7.1
О286Ь О143Ь 7.1
Ο286Υ Ο143Υ 7.5
03661 02171 6.7
ОЗббЬ О217Ь 5.2
О366М 0217М 4.7
Н216А/Н257А Н76А/Н117А 6.0
Ο286Κ/Κ341Ό Ο143Κ/Κ192ϋ 3.5
М298О/К34Ю Ο143Κ/Ο217ϋ 7.9
0286Κ/0366Ν Ο143Κ/Ο217Ν 8.0
О286К/М298О/О366И О143К/М156О/О217И 4.6
Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν О143К/М1560/0217Ν 3.8
Дополнительную серию экспериментов проводили для оценки связывания вариантов РУНа с растворимым ТФ с использованием того же анализа, как описано выше, но с модифицированным диапазоном доз РУНа 30 нМ, 15 нМ и 7,5 нМ, и для аппроксимации данных δΡΚ была использована модель с двумя состояниями. Этот анализ модели с двумя состояниями проводили с помощью пакета программного обеспечения В1асоге Т100 Ενа1иаί^οη Зой^аге, который приведен ниже. Результаты представлены в табл. 26 ниже.
Зависимое от концентрации связывание 1:1
- 148 020818
Таблица 26
Связывание вариантов Т¥Па с растворимым ТФ
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Аффинность Κά (ηΜ) Стандартное отклонение % Коэффициент вариации Аффинность Κά дикого типа ' мутанта N
Дикий тип (Νονοδενεη®) Дикий тип (Νονοδενεη®) 6.5 1.2 19% 1.2 1 9
Дикий тип (Νονοδενεη-ΚΤ®) Дикий тип (Νονοδενεη-Κ,Τ®) 6.3 85% 13% 1.2 4
Дикий тип Дикий тип 7.6 1.9 24% 1.0 6
Дикий тип | Дикий тип | 3.9 0.6 15% 1.0 6
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 6.8 1.2 18% 1.1 7
замена О1а ΡΙΧ замена О1а ΡΙΧ 36.0 2.6 7% 0.2 3
Κ109Ν Κ[109]Ν 10.8 0.2 2% 0.7 2
δ52Α/δ60Α δ[52]Α/δ[60]Α 23.2 4.0 17% 0.3 2
М298(3 М156(3 5.9 0.7 11% 1.3 4
М298(3 ΐ Μ156ζ)ί 1.9 0.1 7% 2.0 2
Τ128Ν/Ρ129Α/ М298О | Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ М156(И 2.4 0.4 16% 1.6 2
νΐ58ϋ/Ε296ν /М298Ц У2ГО/Е154У/ ΜΙ 56(3 2.0 0.5 26% 3.9 1 0
У158О/Е296У/ М298О ΐ У2ГО/Е154У/ Μ156(3ΐ 1.8 0.5 30% 2.2 4
Τ128Ν/Ρ129Α/ νΐ58ϋ/Ε296ν/ Μ298ζ) Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ У21И/Е154У/ Μ156(3 2.0 0.1 4% 3.9 2
δ52Α/δ60Α/νΐ58ϋ/ Е296У/М1298(3 δ[52]Α/δ[60]Α/ У2Ю/Е154У/ Μ156(3 14.6 1.3 9% 0.5 2
(3286Κ. (3143Κ 6.7 0.4 5% 1.1 2
Τ128Ν/Ρ129Α/ <3286Κ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ (3143Κ 11.1 4.3 39% 0.7 6
Τ128Ν/Ρ129Α/ (3286Κ ί Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Ц143КТ 10.0 1.6 16% 0.4 4
- 149 020818
Мутация (по нумерации зрелого РУИ) Мутация (по нумерации химотрипсина) Аффинность Κά (нМ) Стандартное отклонение % Коэффициент вариации Аффинность Кд ДИКОГО типа ! Кд мутанта N
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286 Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 0 4 8
Κ/Μ298ΟΪ О143К/ М156О ΐ
замена 01а ΡΙΧ замена 01а ΡΙΧ
/Τ128Ν/Ρ129Α/ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 20.8 1.4 7% 0.4 5
О286К/ М298О О143К/М156О
замена 01а ΡΙΧ замена 01а ΡΙΧ
/Τ128Ν/Ρ129Α/ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 37.5 12.3 33% 0.1 8
0286КУ М298О ΐ О143К/ М156О ΐ
{замена 01а {замена 01а
ΡΙΧ/Ε40Ε}/ Р1Х/Е[40]Ь}/ 38.5 7.4 19% 0.2 2
О286К/М298О О143К/М156О
{замена 01а {замена О1а
ΡΙΧ/Κ43Ι}/ Р1Х/К[43]1}/ 35.3 3.4 10% 0.2 2
О286К/М298О О143К/М156О
{замена 01а {замена 01а
ΡΙΧ/Κ43Ι}/ Р1Х/К[43]1}/ 23.7 3.6 15% 0.2 2
О286К/М298О ί О143К/М156О ΐ
{замена 01а {замена 01а
ΡΙΧ/0448}/ Р1Х/0[44]8}/ 40.8 6.4 16% 0.2 3
О286К/М298О О143К/М156О
{замена О1а {замена 01а
ΡΙΧ/Μ19Κ}/ Р1Х/М[19]К}/ 16.7 2.4 14% 0.5 2
О286К/М298О О143К/М156О
352А/360А/ 8[52]А/8[60]А/014 25 1 1 7 7% 0 3 з
О286К/М298О ЗК/М156О
замена 01а ΡΙΧ замена 01а Р1Х/
/852А/860А/0286К/ 3[52]А/3[60]А/ 6.0 0.1 1% 0.6 2
М298О ΐ О143К/М156О ΐ
{замена О1а Р1Х/ {замена 01а Р1Х/
М19К/Е40Ь/К431/ М[19]К/Е[40]Ь/ 0 1 1% 2
0443}/0286К/ К[43]1/О[44]8}
М2980 /О143К/М156О
{замена О1а {замена 01а
ΡΙΧ/Κ43Ι} Р1Х/К[43]1} 10 5 ЕЗ 13% 0 4 9
/Τ128Ν/Ρ129Α/ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
О286К/М298О Т О143К/М156О ΐ
Т239У Т99У 5.2 1.5 1
Τ239Ι Τ99Ι 6.2 1.2 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/8
3222А/Н257А/ 82А/Н117А/О143К 2.6 0.3 11% 3.0 2
О286К/М298О /М156О
Τ128Ν/Ρ129Α/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
8222А/Н257А/О286 882А/Н117А/ 4.0 0.2 4% 1.0 2
К/М2980 ΐ Ο143Κ/Μ156Ο |
Мутация (по нумерации зрелого РУП)
Мутация (по нумерации химотрипсина)
Аффинность Κά (нМ)
Стандартное отклонение %
Коэффициент вариации
Аффинность К. ДИКОГО типа / Ка
352А/860А/3222А/
Н257А/О286К/
М298О
8[52]А/8[60]А/882
А/Н117А/О143К/
М156О
Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К/М298О/ Ο366Ν |
Τ[129]Ν/Ρ[129]Α/
О143К/М156О/
0217ΝΪ {замена О1а Р1Х/К43Ц/О286К/ Μ298Ο/Ο366Ν ΐ {замена О1а Р1Х/К[43]1} /О143К/М156О/ 0217Ν-|0.7
5% {замена О1а ΡΙΧ/Κ43Ι}/Τ[128]Ν/ Р[129]А/О286К/ Μ298Ο/Ο366Ν ΐ {замена О1а Р1Х/К[43]1} /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156О/ 0217Ν-Ι0.3
2%
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286 К/Н373Р
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
О143К/Н224Р
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286
К/М298О/Н373Р
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
О143К/М156О/
Н224Р
3.1
852А/360А/О286К/
М298О/Н373Р
3[52]А/3[60]А/
О143К/М156О/
Н224Р
Τ128Ν/Ρ129Α/ М298О/Н373Р ΐ
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
Μ1560/Η224ΡΤ
У2Ю/Ц143К/
Е154У/М156О
У2Ю/О143К/
Е154У/М156О замена О1а ΡΙΧ /8222А/Т239У/О28 6К замена О1а ΡΙΧ /882А/Т99У/О143 К замена О1а ΡΙΧ /8222А/Т239У/ О286КЛ замена 01а ΡΙΧ /882А/Т99У/ О143КЛ
Т239У/О286К/
М298О
Т99У/О143К/
М156О
0.1
4% замена 01а Р1Х/ Т239У/О286К/М29 80 замена 01а Р1Х/ Т99У/О143Р/М156 О
0.3 замена 01а Р1Х/ Т239У/О286К/ М298О | замена 01а Р1Х/ Т99У/О143К/
Μ156ΟΪ
Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239 У/О286К/М298О ί
Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/
Т99У/О143К/
Μ156ΟΪ
- 150 020818
- 151 020818
+ полученные в клетках СНОХ § полученные в стабильном клоне 52-5Р7 клеточной линии СНОХ
Пример 11. Ингибирование вариантов РУПа Ζη2+.
Варианты РУПа, экспрессированные в клетках НЕК 293 или ВНК, исследовали на устойчивость к ингибированию Ζη2+ в присутствии или в отсутствие растворимого тканевого фактора. ΖηΟ2 (АЫпсЕ) разбавляли до 20 мМ в йН20, затем до 4 мМ в 1 х буфере (50 мМ № Нерез, рН 7,5, 100 мМ №С1, 1,5 мМ СаС12, 0,01% Твин-20 и 0,01% ПЭГ-8000). В 96-луночном планшете последовательным разведением в 2 раза были приготовлены одиннадцать концентраций цинка, вплоть до 3,9 мкМ. Последняя ячейка ряда содержала буфер без цинка для измерения не ингибированной протеолитической активности РУПа. Варианты РУПа и протеазу дикого типа разбавляли до 500 нМ, затем снова разбавляли в 10 раз до 50 нМ. Приготовленный 50 нМ исходный раствор использовали для анализов без растворимого тканевого фактора (рТФ, К&Г) 8уз1етз). При выполнении анализов с растворимым тканевым фактором протеазу снова разбавляли в 1 х буфере для анализа с рТФ до конечной концентрации 12,5 нМ и 125 нМ соответственно. Растворы предварительно инкубировали в течение не менее 5 мин при комнатной температуре.
Для начала реакции ингибирования 20 мкл РУПа/рТФ или раствора РУПа смешивали с 60 мкл разведения цинка в каждом ряду в одной из десяти концентраций. Для ингибирования РУПа смеси готовили с использованием 2 мМ ΖηΟ2, а для РУПа/рТФ - с использованием 4 мМ ΖηΟ2. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Для анализа ингибирования Ζη2+ 20 мкл субстрата РУПа (мезил-йРРК-АСС, растворенный до 20 мМ в ДМСО и разведенный в буфере для анализа) добавили в лунки до конечной концентрации 90 мкМ. Концентрации рТФ и цинка для анализа оставались неизменными вследствие добавления их по мере необходимости в раствор субстрата. Увеличение флуоресценции (возбуждение: 380 нм, излучение: 460 нм) измеряли в течение 60 мин при 30°С на планшетном спектрофотометре 8рес1гатах ОетШ М5 (Мо1еси1аг Оеуюез). Остаточную протеолитическую активность рассчитывали для каждой концентрации цинка путем деления ингибированной скорости реакции на не ингибированную скорость катализируемой протеазой реакции. Концентрацию Ζη2+, необходимую для ингибирования половины протеолитической активности (К0,5), рассчитывали путем построения остаточной активности против концентрации цинка и аппроксимирования гиперболическим уравнением с использованием программного обеспечения ХТРИ4 (ГОВ8). Каждую протеазу исследовали два раза в двух отдельных повторностях для получения среднего значения для К0,5.
Результаты представлены в табл. 27. Мутации Н257 и Н216 повышали устойчивость примерно в 3 раза. Мутация М268Р также повышала устойчивость к цинку в 3 раза. Во всех случаях при комбинации с дополнительными мутациями эффект сохранялся в различной степени. Наиболее устойчивыми вариантами были комбинации приведенных выше мутаций: Н216А/Н257А-РУПа и Н257А/М298Р-РУПа.
Таблица 27
Ингибирование вариантов РУПа Ζη2+
Мутация (по нумерации зрелого РУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Ко,5 (мМ)
НЕК 293 ВНК
Дикий тип Дикий тип 87.0 42.0
М298() М156<3 187.3
О286К О143К 30.1 22.5
Н2168 Н768 231.0
Н216А Н76А 244.5
Н216К Н76К 248.8
Н216К Н76К 316.5
3222А 382А 87.5 63.8
8222К 382К 73.0
Н257А Н117А 217.5 113.0
Н2573 Н1178 149.7 128.0
К1618 К248 51.5
К161А К24А 73.5
К161У К24У 79.5
О286К/3222А 382А/Р143К 24.5
- 152 020818
Р286КУ8222А/ замена 01а из ИХ
8222А/М298(3
Н257А/М298(}
8222А/Н257А/О286К/
М298(3 _8222А/О286К/О36бу_
8222У 8222Р 8222Ν _8222Е
Н216А/Н257А
Н216А/8222А
Н2578/О286К
3222А/Н373А
382А/(}143КУ замена
01а из ΡΙΧ __882А/М156О__
Н117А/М156(}
382А/Н117А/(3143К/
М156<3 _882А/О143К/О217У^
882У
882Р
882Ν
882Е
Н76А/Н117А
Н76А/382А
Н1178/0143К.
882А/Н224А
34.0
138.0
481.0
180.6
40.5 86.8
89.5
94.6
110.5
407.5 226.0
316.5 94.0
Пример 12. Определение концентрации каталитически активных протеаз с использованием титранта активных сайтов 4-метилумбеллиферил-р'-гуанидинобензоата (МиСВ).
В некоторых случаях концентрацию каталитически активного РУПа в исходном растворе определяли титрованием комплекса РУПа с растворимым тканевым фактором (рТФ) 4-метилумбеллиферил-р'гуанидинобензоатом (МиСВ), флуорогенным эфирным субстратом, разработанным для активных центров трипсиноподобных сериновых протеаз. Анализ проводили, как описано в работе Рауше и др., (ВюсИелп181гу (1996) 35: 7100-7106), с небольшими изменениями. МИСВ легко реагирует с РУПа, но не с РУП или неактивной протеазой, с образованием стабильного ацил-ферментного интермедиата при насыщающей концентрации МиСВ и медленном деацилировании, что ограничивает скорость катализа. В этих условиях протеаза РУПа осуществляет один оборот катализа, высвобождая 4метилумбеллифероновый флуорофор (4-МИ). Если первоначальный подъем флуоресценции сопоставить со стандартной кривой зависимости флуоресценции от концентрации 4-МИ, может быть рассчитана концентрация активных центров.
Анализы проводились с 1 или 2 мл реакционной смеси в 0,4 см х 1 см или 1 см х 1 см кварцевых кюветах, соответственно, при постоянном перемешивании. Каждая реакционная смесь содержала 0,5 мкМ рТФ (Κ&Ό 8у8ΐет8 Питан) в буфере, содержащем 50 мМ Нере8, 100 мМ №С1, 5 мМ СаС12 и 0,1% ПЭГ 8000, рН 7,6. Использовали свежеприготовленный стандартный раствор 4-МИ при исходной концентрации 0,5М в ДМСО, концентрации подтверждали измерением абсорбции при 360 нм, используя коэффициент экстинкции 19000 М-1см-1 в 50 мМ Трис-буфер, рН 9,0. МИСВ приготовили в исходной концентрации 0,04М в ДМСО из сухого вещества. Анализы начали добавлением 4 мкл 4 мМ МИСВ (для реакции в 2,0 мл) или 2 мМ МИСВ (для реакции в 1,0 мл) (в каждом случае конечная концентрация составила 8 мкМ) к 0,5 мкМ раствору рТФ (20,2 мкл или 10,1 мкл 49,4 мкМ рТФ) в 1 х буфере для анализа, фоновый гидролиз МИСВ сначала измеряли за -150-200 с до добавления РУПа или варианта РУПа до конечной концентрации 100-200 нМ по данным ЕЫ8А (пример 1.С.1) или титрования активных сайтов РРК-СМК (пример 3). За флуоресценцией высвобожденного 4-МИ в фазе резкого подъема флуоресценции в реакции следовала дополнительная фаза 1000-1200 с. Стандартную кривую свободного 4-МИ получали титрованием 1 х буфера, содержащего 0,5 мкмоль рТФ, 4-МИ с калиброванной абсорбцией концентрацией шагами по 20 нМ до конечной концентрации 260-300 нМ.
Для анализа данных полученные результаты импортировали в пакет программного обеспечения СгарРРаТ Рп8т, вклад фонового гидролиза вычитали из кривой путем экстраполяции начальной скорости спонтанного гидролиза МиСВ, которая, как правило, составляла менее 5% от общего всплеска флуоресценции. Исправленную кривую аппроксимировали одноэкспоненциальным уравнением с линейным компонентом (для описания медленного деацилирования) вида Лфлуоресценции = Атр(1-е-в) + ВТ где Атр = амплитуда фазы всплеска флуоресценции в условиях насыщающего анализа, описанных выше, к представляет собой наблюдаемую константу скорости первого порядка образования ацил-фермента и В представляет собой общую константу скорости, связанную с полным превращением МИСВ. Концентрацию активной протеазы РУПа рассчитывали путем сравнения параметра аппроксимации для амплитуды со стандартной кривой 4-МИ. Значения для нескольких анализов были измерены, усреднены и было определено стандартное отклонение.
Пример 13. Удельная активность вариантов полипептидов РУПа для мезил-ТРРК-АСС.
Для оценки активности вариантов РУПа была определена активность (активность/моль) полипептидов РУПа для расщепления трипептидного субстрата АСС (мезил-ТРРК-АСС) при стандартных условиях анализа. Анализ включал преинкубацию полипептидов РУПа с насыщающим количеством рТФ до разведения субстратом мезил-ТРРК-АСС. В анализе определяли начальные скорости расщепления субстрата и увеличение флуоресценции АСС. Начальные скорости нарастания флуоресценции нормированы на внутреннюю стандартную кривую АСС и данные приводили в виде мкмоль/с/мкмоль РУПа.
Для проведения реакций каждый тестируемый образец РУПа разбавляли в полипропиленовом планшете для хранения до 200 нМ в 1 х буфере (20 мМ Нере8, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,1% БСА, 0,1% ПЭГ-8000, рН 7,5). В случае необходимости готовили разведение исходного раствора РУПа 1:10 таким
- 153 020818 образом, чтобы минимальный отбираемый пипеткой объем составлял 5 мкл. Были приготовлены разведения исходного раствора растворимого тканевого фактора (рТФ) (Κ&Ό δузίетз) в конечной концентрации 1,0 мкМ в соответствующем объеме 1 х буфере для анализа, необходимом для исследования от 8 до 32 протеаз/планшет. Например, при исследовании 8 протеаз требовалось 1,0 мл 1,0 мкМ рТФ/планшет, тогда как для исследования 32 протеаз необходимо 2,5 мл рТФ/планшет. Были получены комплексы образцов РУЛа с рТФ в конечной концентрации 100 нМ РУЛа/500 нМ РТФ в объеме 50 мкл для анализа путем смешивания 25 мкл 200 нМ варианта РУЛа с 25 мкл 1,0 рТФ мкМ в полипропиленовом планшете для хранения. Комплексы РУЛа/рТФ затем инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин для достижения равновесия. После периода уравновешивания 10 мкл каждого комплекса РУЛа/рТФ внесли в соответствующий ряд лунок 96-луночного черного планшета для анализа формата На1Г агеа (Сοз1а^). Варианты РУЛа и контроль исследовали в трех повторностях. Мезил-кРРК-АСС субстрат готовили в 1,1 х конечной концентрации 0,09 мМ с учетом разведения 1:10 полипептида РУЛа субстратом. В 96луночном планшете формата На1Г агеа было приготовлено 20 мл 0,1 мМ раствора мезил-кРРК-АСС субстрата в 1 х буфере для анализа путем разбавления исходного раствора субстрата в безводном ДМСО.
Анализ проводили на автоматизированной рабочей станции ΒίοιικΚ® РХ (Βесктаη Соииег), оснащенной головкой с 96 носиками (МΒР ΒίοΚοόοΙί.\ АКТ® 130 мкл советы). Планшеты для анализа (предварительно заполненные 10 мкл РУЛа/рТФ раствора) помещали на платформу рабочей станции с одноканальным резервуаром, заполненным 1,1 х раствором мезил-кРРК-АСС. Температуру планшетного спектрофотометра установили на 37°С. Станция Βίοιι^Κ® РХ начинала анализ внесением 90 мкл 1,1 х субстрата мезил-кРРК-АСС из одноканального резервуара в каждую лунку черного планшета для анализа, содержащую 10 мкл РУЛа/рТФ.
Конечные концентрации вариантов РУЛа, рТФ и Мезил-кРРК-АСС в анализе составляли 10 нМ, 50 нМ и 0,09 мМ соответственно. Затем рабочая станция перемешивала 100 мкл образца, отбирая и сливая по 70 мкл два раза. Черный планшет для анализа перенесли в планшетный спектрофотометр δρесί^аМаx Сет1т (Мο1еси1а^ Эейсез) и измеряли начальную скорость реакции в течение 10 мин при 37°С.
После завершения анализа на том же планшетном спектрофотометре δρес1^аМаx Сетии была определена флуоресценция в планшете, содержащем пробы для построения стандартной кривой свободного АСС (100 мкл/лунку), данные использовали для обеспечения точного преобразования единиц флуоресценции/с в мкМ/с. Стандартный планшет готовили следующим образом: во все четные лунки (т.е. в каждую вторую лунку) в верхнем ряду 96-луночного черного планшета для анализа формата На1Г агеа 1 мМ образец АСС разбавляли до 25 нМ в 1 х буфере до конечного объема 200 мкл (5 мкл 1 мМ АСС в 195 мкл 1 х буфера для анализа). 100 мкл 1 х буфера вносили пипеткой во все остальные лунки четных колонок. Субстрат АСС серийно разводили 1:1 в лунках сверху вниз в колонке с получением еще 6 концентраций АСС. В последнем ряду лунки содержали только 100 мкл 1 х буфера (т.е. без АСС). Флуоресценцию измеряли с помощью определения конечной точки и строили график зависимости флуоресценции от концентрации АСС. Наклон линии, проходящей через эти точки, дает коэффициент перевода единиц флуоресценции в мкМ.
Для анализа данных, полученных с помощью планшетного спектрофотометра, а также построения стандартной кривой было использовано программное обеспечение δοГ1Маx Рго (Мο1еси1а^ ОеОсез). Файл, содержащий данные, был сохранен и экспортирован в виде ΑδСЛ текстового файла, который был импортирован в программу М^с^οзοй Ехсе1, обработан и проанализирован с использованием электронных таблиц М^с^οзοй Ехсе1. После импорта данных в электронные таблицы М^с^οзοй Ехсе1 было осуществлено преобразование единиц флуоресценции в мкМ с помощью наклона стандартной кривой АСС, обеспечивающего коэффициент преобразования, которое перевело единицы флуоресценции/с в активность, измеряемую в мкМ/с. Все значения в трех повторностях были оценены на промахи, которые были исключены в случае необходимости. Удельную активность каждого варианта РУЛа и контроля дикого типа выражали в мкмоль/с/мкмоль и рассчитывали по следующим выражениям:
среднее значение (единицы флуоресценции/с)*коэффициент преобразования (единицы флуоресценции/мкМ) = активность (в мкМ/с);
удельная активность (в мкмоль/с/мкмоль) = [(мкм/с)*(100 мкл)*(1/1000000)]/[(10 нМ)*(100 мкл)*(1/1000000)*(1/1000)]
В табл. 28 приведена удельная активность проанализированных вариантов РУЛа, а также отношение активности к активности РУЛа дикого типа. Также включены стандартное отклонение (δΌ) и коэффициент вариации (в процентах; % СУ). Несколько вариантов РУЛа проявили повышенную удельную активность для расщепления мезил-кРРК-АСС по сравнению с полипептидом РУЛа дикого типа. Например, Ц366У-РУЛа проявлял удельную активность для расщепления мезил-кРРК-АСС, которая была в 4 раза больше, чем активность варианта РУЛа дикого типа. Варианты РУЛа, содержащие мутацию Н373Р, также обычно обладают повышенной удельной активностью для расщепления мезил-кРРК-АСС по сравнению с полипептидом РУЛа дикого типа.
- 154 020818
Таблица 28
Удельная активность полипептидов РУНа для мезил-бРРК-АСС
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) Активность (мкмоль/ сек/мкмоль) Станда -ртное откло- нение Коэф- фициент вариа- ции Активность (% дикого типа) N
Дикий тип (Νονοδενεη®) Дикий тип (Νονοδενεη®) 2.31 0.34 0.15 100% 3
Дикий тип Дикий тип 2.40 0.15 0.06 104% 4
Τ128Ν/Ρ129Α Τ[128]Ν/Ρ[129]Α 2.50 108% 1
Замена О1а из ИХ Замена О1а из ИХ 1.63 71% 1
Α122Ν/Ο1248 Α[122]Ν/Ο[124]δ 2.24 97% 1
852А/860А 8[52]А/8[60]А 1.95 85% 1
У158О/Е296У/ М298(} У2Ю/Е154У/ М1560 3.28 142% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ У158О/Е296У/ М298С) Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ У2ГО/Е154У/ М156(2 3.26 142% 1
852А/860А/У158О/ Е296У/М1298(2 8[52]А/8[60]А/ У2ГО/Е154У/ М156(} 2.56 111% 1
О286К. О143К 1.24 54% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ ()286К. Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ (Ц43К. 1.21 52% 1
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) Активность (мкмоль/ сек/мкмоль) Станда -ртное откло- нение Коэф- фициент вариа- ции Активность (% дикого типа) N
352А/360А/(3286К 8[52]А/8[60]А/ 0143 К. 0.44 0.11 0.25 19% 2
8222А 882А 2.35 102% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 882А 2.70 117% 1
352А/360А/3222А 8[52]А/8[60]А/ 882А 1.22 53% 1
Н2578 Н1178 2.64 115% 1
Н373Р Н224Р 1.17 51% 1
Ц366У (3217У 9.29 403% 1
Замена О1а из ИХ/Ц366У Замена О1а из ИХ/(}217У 2.82 122% 1
Κ109Ν/Α1758 Κ[109]Ν/Α398 3.38 147% 1
Ц286К/Н257А (2143К/Н117А 1.96 85% 1
Замена О1а из ИХ/ Τ128Ν/Ρ129Α/ 8222А/р286К Замена 01а из ИХ/ Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ 882А/Ц143К 0.53 23% 1
Замена О1а из ИХ/ 352А/360А/3222А/ Ц286К Замена 01а из ИХ/ 8[52]А/8[60]А/ 882А/(3143К 0.44 0.42 0.96 19% 2
Ц286К/М298Р С>143К/М156<2 1.91 0.11 0.06 83% 5
Замена О1а из ИХ/ Ц286К/М298Р Замена О1а из ИХ/ О143КУМ156Р 1.53 66% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286 К/ М298О Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ О143К/М156Р 1.80 78% 1
Замена О1а из ИХ /Τ128Ν/Ρ129Α/ О286К/М298(5 Замена О1а из ИХ /Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Р143К/М156Ц 0.78 34% 1
{Замена О1а из ИХ/Е40Ц/ Ц286К/М2989 {Замена 01а из ИХ/Е[40]Ь}/ (Ц43К/М156Р 1.16 50% 1
{Замена О1а из ΡΙΧ/Κ43Ι}/ Ц286К/М298Р {Замена О1а из ИХ/К[43]1}/ (Ц43К/М156О 1.20 52% 1
{Замена О1а из ИХ/<3448}/ Ц286К/М298(3 {Замена 01а из ИХ/<2[44]8}/ (3143Κ/Μ156ζ) 1.11 48% 1
{Замена О1а из {Замена О1а из 1.26 55% 1
- 155 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУП) Мутация (по нумерации химотрипсина) Активность (мкмоль/ сек/мкмоль) Станда -ртное откло- нение Коэф- фициент вариа- ции Активность (% дикого типа) N
Замена О1а из Р1Х/ Т239У/(}286К/ М298() Замена 01а из Р1Х/ Т99У/(2143К/ М156() 1.13 49% 1
3222А/Т239У/ Н257А/(2286К/ М298О 882А/Т99У/ Н117А/(2143К/ М156О 1.66 72% 1
Т239У/(}286К/ Н373Р Т99У/()143К/ Н224Р 1.53 66% 1
Т239У/0286К/ М298(}/Н373Р Т99У/О143К/ М156О/ Н224Р 3.07 133% 1
У158О/Т2391/ Е296У/М298(2 У2Ю/Т991/Е154У /М 156(2 2.24 97% 1
Т2391/<2286К. Τ99ΙΛ2143Κ. 0.88 38% 1
3222Α/Τ239Ι 582Α/Τ99Ι 1.36 59% 1
Замена 01а из Р1Х/3222А/Т2391/ (2286К Замена 01а из ΡΙΧ /382А/Т991/(2143К 0.25 11% 1
Т2391/(2286КУ М298<2 Т991Л2143К/ М156(2 1.37 60% 1
Замена О1а из ΡΙΧ / Т2391/()286К/ Μ298ζ) Замена 01а из ΡΙΧ /Т991/<3143К/ М156(2 0.67 29% 1
8222Α/Τ239Ι/Η257 А/(}286К/М298(2 882Α/Τ99Ι/Η117А/ (2143К/М156(2 1.41 61% 1
Т2391/<}286К/ Н373Р Т991/(2143К/ Н224Р 1.24 54% 1
У158О/Т239У/Е29 6У/М2980 У2ГО/Т99У/Е154 У/М156(2 2.19 0.15 0.07 95% 3
Т239У/()286К Т99У/(2143К 1.26 0.14 0.11 55% 2
Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298 0/ Н237Р Τ99ΙΛ2143Κ/Μ156 (2/Н224Р 1.59 0.21 0.13 69% 3
Н2573А2286К/ М298(2 Н1178/<2143К/ М156(2 1.85 0.23 0.13 80% 2
Замена О1а из ΡΙΧ /(2286К/8222А/ Н2578 Замена 01а из ΡΙΧ /(2143К/382А/ Н1173 0.49 0.04 0.09 21% 2
8222А/Н2578/ (2286К/ М298(2 882А/Н1173/ (2143К/М156(2 1.77 0.23 0.13 77% 2
- 156 020818
Мутация (по нумерации зрелого ГУН) Мутация (по нумерации химотрипсина) Активность (мкмоль/ сек/мкмоль) Станда -ртное откло- нение Коэф- фициент вариа- ции Активность (% дикого типа) N
Н2575/(2286К/ М298()/ Н373Р Н1173/(^>143К/ М156(3/Н224Р 2.32 0.41 0.18 101% 3
8222А^286К/ М298<3/Н373Р 382А/(5143К/ М156(}/Н224Р 2.79 0.39 0.14 121% 2
Замена О1а из Р1Х/8222А/(2286К/ М298()/Н373Р Замена О1а из ИХ/882А/О143К/ М156(}/Н224Р 1.92 83% 1
3222А/(2286К/ Μ298ζ) 382А/(Л43К/ М156<3 1.90 82% 1
Замена О1а из ИХ/ 3222А/()286К/ М298() Замена 01а из ИХ 382А/(2143К/ М156(} 1.12 49% 1
Τ128Ν/Ρ129Α/Α175 δ/ζ)366ν Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ А393/(2217У 3.40 148% 1
Α122Ν/Ο1243/Α17 53/(2366У Α[122]Ν/Ο[124]8/ А398/ (}217У 2.34 0.22 0.09 101% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Α175 3/3222А Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ А398/ 882Α 3.19 138% 1
Α122Ν/Ο1243/Α17 5 8/8222А Α[122]Ν/Ο[124]8/ А398/ 882Α 2.68 0.30 0.11 116% 2
Τ128Ν/Ρ129Α/Α175 5/()286К. Τ[128]Ν/Ρ[129]Α/ Α393/()143Κ. 1.88 81% 1
Α122Ν/Ο1248/Α17 58Л3286К Α[122]Ν/Ο[124]8/ Α398/(2143Κ. 2.16 0.42 0.20 94% 2
Замена 01а из ИХ/ 3222А/(}286К/ Н373Р Замена 01а из ИХ/ 882А/О143К/ Н224Р 1.37 0.26 0.19 60% 2
У158О/Е296У/М29 8(2/ Н373Р У2Ю/Е154У/М15 60/Н224Р 5.60 243% 1
Н257А/(}286К/ М298<2 Н117А/(Л43К/ М156С) 2.18 95% 1
Замена 01а из ИХ/ Τ128Ν/Ρ129Α/ А1753/3222А/ (}286К Замена 01а из ΡΙΧ/Τ[128]Ν/ Р[129]А/А398/ 382А/(Л43К 0.75 32% 1
Замена О1а из ИХ/ Α122Ν/Ο1248/ А1758/8222А/ <3286К. Замена 01а из ИХ/ Α[122]Ν/Ο[124]8/ А398/882А/р143К 0.89 38% 1
Пример 15. Активация РХ и определение концентрации каталитически активных протеаз с использованием титранта активных сайтов флуоресцеин-моно-р'-гуанидинобензоата (РМОВ).
Концентрацию фактора Х (РХ), который способен стать каталитически активным, определяли в исходном растворе зимогена путем активации образцов РХ ядом гадюки Рассела (КУУ-азой), а затем путем титрования активного фактора Х (РХа) флуоресцеин-моно-р'-гуанидинобензоатом (РМОВ), флуорогенным эфирным субстратом, титрантом активных сайтов для трипсиноподобных сериновых протеаз. После активации титрование активных сайтов было проведено, как описано в работе Воск и др., (АгсЫуе5 оН ВюсНет15!гу апГ ВюрНу51с5 (1989) 273:375-388) с небольшими изменениями. РМОВ легко реагирует с РХа, но не с РХ или неактивной протеазой, с образованием стабильного ацил-ферментного интермедиата при насыщающей концентрации РМОВ и медленном деацилировании, что ограничивает скорость катализа. В этих условиях протеаза РХа осуществляет один оборот катализа, высвобождая флуоресцеиновый флуорофор. Если первоначальный подъем флуоресценции сопоставить со стандартной кривой зависимо- 157 020818 сти флуоресценции от концентрации флуоресцеина, может быть рассчитана концентрация активных центров.
Реакцию активации РХа проводили при конечной концентрации РХ 10 мкМ (по абсорбции А280 с коэффициентом экстинкции 1,16) в конечном объеме 50-100 мкл в реакционном буфере, содержащем 100 мМ Трис, 50 мМ №С1, 5 мМ СаС12, 0,1% ПЭГ 8000, рН 8,1. Активацию инициировали добавлением яда гадюки Рассела в конечной концентрации 5 мкг/мл (5 мкл 98 мкг/мл разведения на 100 мкл реакционной смеси или 2,5 мкл на 50 мкл реакционной смеси) при 37°С в течение 45-60 мин (необходимое для полной активации время ранее определили путем отбора образцов каждые 15 мин и тестирования увеличения расщепления флуорогенного субстрата 8ресί^аГ1иο^ РХа). В реакционную смесь быстро добавили 1/10 объема буфера, содержащего 100 мМ Трис, 50 мМ №С1, 5 мМ, 100 мМ ЭДТА, 0,1% ПЭГ 8000, рН 8,1.
Анализы проводили в реакционном объеме 1 мл в 0,4 см х 1 см кварцевой кювете при постоянном перемешивании. Реакционная смесь содержала 100-400 нМ свежеактивированного РХа и 5 мкМ РΜОΒ в буфере, содержащем 30 мМ Нерек, 135 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 0,1% ПЭГ 8000, рН 7,4. Стандартный раствор флуоресцеина приготовили в исходной концентрации 70 мМ в ДМФА, значение концентрации подтверждали измерением абсорбции в стандартных условиях при 496 нм, используя коэффициент экстинкции 89125 М-1 см-1 в 0,1 н №0Н. РΜОΒ приготовили в исходной концентрации 0,01М в ДМФА из сухого вещества, значение концентрации подтверждали измерением абсорбции в стандартных условиях при 452 нм, используя коэффициент экстинкции 19498 в фосфатно-солевом буфере ^Β8), рН 7,2. Анализы начинали добавлением 5 мкл 1 мМ РΜОΒ (конечная концентрация 5 мкМ) в 1 х буфере и измеряли фоновый гидролиз РΜОΒ в течение ~150-200 с перед добавлением РХа в конечной концентрации 100400 нМ, начальную концентрацию определяли по поглощению до активации КУУ-азой (см. выше). За флуоресценцией высвобожденного флуоресцеина в фазе резкого подъема флуоресценции в реакции следовала дополнительная фаза 3600 с. Стандартную кривую свободного флуоресцеина получали титрованием 1 х буфера стандартным флуоресцеином шагами по 20 нМ до конечной концентрации 260-300 нМ.
Для анализа данных полученные результаты импортировали в пакет программного обеспечения 0гарЬРаб Рпкт, вклад фонового гидролиза вычитали из кривой путем экстраполяции начальной скорости спонтанного гидролиза РΜОΒ, которая, как правило, составляла менее 5% от общего всплеска флуоресценции. Исправленную кривую аппроксимировали одноэкспоненциальным уравнением с линейным компонентом (для описания медленного деацилирования) вида Дфлуоресценции = Атр(1-е-к) ' Βί, где Атр = амплитуда фазы всплеска флуоресценции в условиях насыщающего анализа, описанных выше, к представляет собой наблюдаемую константу скорости первого порядка образования ацил-фермента и В представляет собой общую константу скорости, связанную с полным превращением РΜОΒ· Концентрацию активной протеазы РХа рассчитывали путем сравнения параметра аппроксимации для амплитуды со стандартной кривой флуоресцеина. Значения для нескольких анализов были измерены, усреднены и было определено стандартное отклонение. Поэтому количество активного РХа в пробе непосредственно представляет собой концентрацию РХ в исходном растворе, который может быть активирован фактором РУПа. Значение, полученное титрованием активных сайтов, использовали при расчете концентрации РХ, который использовали в непрямом анализе, таком как ТФ-зависимый и ТФ-независимый анализ, описанный в примере 4.
Если изменения в изобретении очевидны специалистам в данной области, предполагается, что изобретение ограничено только приведенной ниже формулой изобретения.

Claims (44)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Модифицированный полипептид фактора УП (РУН), включающий модификации в полипептиде РУН, где модификации осуществляют в положениях, соответствующих положениям 286 и 298 в полипептиде РУН с последовательностью аминокислот, приведенной в 8ЕЦ ГО N0: 3, или в соответствующих положениях в полипептиде РУН, модификация в положении 286 представляет собой замену аминокислоты на аргинин (Агд, К); модификация в положении 298 представляет собой замену аминокислоты на глютамин (01η, О) и модифицированный полипептид РУН обладает повышенной коагулянтной активностью по сравнению с полипептидом РУН, немодифицированным в положениях 286 и 298.
  2. 2. Модифицированный полипептид РУН по п.1, где модификация в положении 286 представляет собой замену 01η (О) на Агд (К).
  3. 3. Модифицированный полипептид РУН по п.1, где модификация в положении 298 представляет собой замену Ме! (М) на глютамин (01η, О).
  4. 4. Модифицированный полипептид РУН по п.1, содержащий модификации Ц286К и М298Ц.
  5. 5. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.1-4, где немодифицированный полипептид РУН содержит последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕЦ ГО N0: 1-3, 18-74, 98, 158 или 343-353, или представляет собой ее аллельный или видовой вариант, или вариант, обладающий по меньшей мере 60% идентичностью с последовательностью РУН из любой последовательности
    - 158 020818
    8Ρ<2 ΙΌ N0: 1-3, 18-74, 98, 158 или 343-353, или представляет собой активный фрагмент полипептида РУН, который включает последовательность аминокислот, приведенную в любой из последовательностей 8Р0 ΙΌ N0: 1-3, 18-74, 98, 158 или 343-353.
  6. 6. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.1-5, содержащий одну или несколько дополнительных модификаций в другом положении в полипептиде РУН.
  7. 7. Модифицированный полипептид РУН по п.6, где дополнительная модификация представляет собой замену аминокислоты в положении, соответствующем положению, выбранному из 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 286, 287, 290, 292, 294, 296, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 и 396.
  8. 8. Модифицированный полипептид РУН по п.6, в котором дополнительная модификация аминокислоты выбрана из
    Ό196Κ, Ό196Κ, Ό196Α, Ό196Υ, Ό196Ρ, Ό196Ψ,
    О196Ь, Ό196Ι, Κ197Υ, К197А, К197Е, Κ197Ό, К197Ь, К197М, Κ197Ι, К197У, К197Р,
    Κ197λΥ, К199А, Κ199Ό, К199Е, О237ХУ, О237Т, 02371, О237У, Т239А, К290А, К290Е,
    Κ290Ό, Κ290Ν, К290(2, К290К, К290М, К290У, К341Е, К341К, К34Щ, Κ341Ν, К341М,
    Κ341Ό, О237Т238вставкаА, О237Т238вставка8, О237Т238вставкаУ, О237Т238вставкаА8, О237Т238вставка8А, О196К197вставкаК, О196К197вставкаК, О196К197вставкаУ, О196К197вставкаАУ, В196К197вставкаА, О196К197вставкаМ, К197И98вставкаЕ, К1971198вставкаУ, К1971198вставкаА, К1971198вставкаЗ, Т2398, Τ239Ν, Т239(2, Т239У,
    Т239Ь, Т239Н, Τ239Ι, Ь287Т, М298(2, Р321К, Р321Е, Ρ321Υ, Р3218, (2366Ό, (2366Е, (2366Ν, (2366Т, <23668, (2366У, <23661, (2366Ц (2366М, Η373Ό, Н373Е, Н3738, Н373Ь,
    Η373Ι, Н373Р, Н373А, К1618, К161А , К161У, Н2168, Н216А, Н216К, Н216К, 8222А,
    8222К, 8222У, 8222Ν, 8222Е, 8222Ό, Н257А, Н2578, замена О1а из ΡΙΧ, {замена 01а из Р1Х/Е40Ь}, {замена 01а из ΡΙΧ/Κ43Ι}, {замена О1а из Р1Х/<2448}, {замена 01а из ΡΙΧ/Μ19Κ}, {замена О1а из Р1Х/М19К/Е40Ь/К431/(2443}, замена 01а из РХ, замена 01а из белка С, замена О1а из белка 8, замена 01а из тромбина, 852А, 860А, Ε394Ν, Р395А,
    К.3968, К2023, Α292Ν, А2948, Ο318Ν, А1758, Κ109Ν, Α122Ν, 01248, Α51Ν, Τ130Ν,
    Е1328, 852Ν, Р548, 8119Ν, Ы218, Τ128Ν, Р129А, (266Ν, Υ688,
    81038111удаление/вставка(2КЕМЕО1СЕРК\\/ОСЕАУЕООР,
    Η115 8126удаление/вставка(2КЕМЕО1СЕРК’'УОСЕ\У ΕΌΌΡ, Т128Р134удаление/вставка(2КЕМЕО1СЕРКАУОСЕАУЕООР,
    81038111удаление/вставка1ЕО1СЕРК\УОСЕ\УЕ,
    Н1158126удаление /вставкаШШСЬРКАУОСЕХУЕ,
    Т128Р134удаление/ вставка1Е01СЬРК\У0СЬ\УЕ,
    8103811 1 удаление/ вставкаО1СЬРК\УОСЬ\¥ЕО,
    Н1153126удаление/ вставкаО1СЬРК\УОСЕ\УЕО,
    Т128Р134удаление/ вставкаЫСЕРКХУОСЕХУЕО, Р406вставка1ЕО1СЕРК\¥ОСЕ\У, Р406вставкаООО81ЕО1СЕРК\УОСЬАУ, Р406вставкаО1СЕРК\УОСЕАЪО, Р406вставкаООО8О1СЕРК\¥ОСЕ\УЕО, 8103811 Удаление/ ветавкаЗРОКООИШУ,
    Н1158126удаление/ вставка8РОКОО1КМУ, Т127Р134удаление/вставка8РОКОО1КНУ, Р406вставкаСЗРОКОО1КМУС, Р406вставкаООО8С8РОКОО1КХУС, У158Т, νΐ58Ό,
    Ь287Т и Е296У.
  9. 9. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.6-8, включающий модификации, выбранные из <2286К/М298<2/К341 (2, ς>286Κ/Μ298(2/Κ199Е, (2286К/М298<2/Замена О1а из ΡΙΧ, 3222А/Н257А/(2286К/М158(2, ς>286Κ/Μ298(2/(2366Ό,
    - 159 020818
    ()286Κ/Μ298<)/()366Ν, ()286Κ/Μ298()/Η373Ρ, {Замена 01а из Р1Х/Е40Ь}/()286К/М298(), {Замена 01а из Р1Х/К431}/()286К/М298<), {Замена О1а из Р1Х/()443}/()286К/М298(), {Замена 01а из Р1Х/М19К}/()286К/М298(), {Замена 01а из
    Р1Х/М19КУЕ40Ь/К431/()443}/()286К/М298(), Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298<), У158Э/()286К/Е296У/М298(), замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298<),
    ΤΙ28Ν/Ρ129А/8222А/Н257А/()286К/М298<), ΤΙ28Ν/Ρ129Α/ζ)286Κ/Μ298()/Η373Ρ, 352А/860А/()286К/М298(), замена 01а из Р1Х/352А/360А/()286К/М298(), 352А/360А/8222А/Р1257А/()286К/М298(), 352А/860А/()286К/М298()/Н373Р, Т239У/()286К/М298(), 8222АЯ239У/Н257А/()286К/М298(), замена О1а из Р1Х/Т239У/()286К/М298(), Т239У/()286К/М298()/Н373Р, Т2391/()286К/М298(), 3222А/Т2391/Н257АД)286К/М298(), замена 01а из Р1Х/Т2391/()286К/М298(), Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο/Η373Ρ, замена О1а из Р1Х/8222А/()286К/М298(), замена 01а из Р1Х/8222А/()286К/М298()/Н373Р, У158О/()286К/Е296У/М298()/Н373Р, Н257А/()286КУМ298(), Н2578/()286К/М298(), 8222А/Н2578/()286К/М298(), Н2578/()286К/М298()/Н373Р, 8222А/()286К/М298()/Н373Р, 8222А/()286К/М298(), Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/()286Κ/Μ298(), Α122Ν/Ο1248/Α1758/()286Κ/Μ298(),
    ΤΙ 28Ν/Ρ129А/А1758/3222А/Н257А/()286К/М298(),
    Α122Ν/Ο1243/Α1753/3222Α/Η257Α/()286Κ/Μ298(),
    Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/()286Κ/Μ298()/Η373Ρ, Α122Ν/Ο1243/Α1753/()286Κ/Μ298<)/Η373Ρ, {Замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298(),
    Τ128Ν/Ρ129Α/ρ286Κ/Μ298()/()366Ν, {замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/()286Κ/Μ298()/()366Ν, {замена О1а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν, νΐ58ϋ/()286Κ/Ε296ν/Μ298(), Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν/Η373Ρ, Τ239ν/()286Κ/Μ298()/()366Ν, Τ239Ι/()286Κ/Μ298()/Ο366Ν,
    Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/()286Κ/Μ298(), Τ128Ν/Ρ129Α/5222Α/Τ239ν/Η257Α/()286Κ/Μ298(), Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/()286Κ/Μ298()/Η373Ρ, Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/()286ΐνΜ298()Η Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο/ΡΙ373Ρ.
  10. 10. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.6-11, включающий модификации, выбранные из
    Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο,
    Τ239Ι/ρ286Κ/Μ298()/()366Ν, Τ239ν/()286Κ/Μ298ρ/<)366Ν, Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298()/()366Ν/Η373Ρ, νΐ58ϋ/()286Κ/Ε296ν/Μ298()/Η373Ρ, Α122Ν/Ο1243/Α1753/()286Κ/Μ298()/Η373Ρ,
    Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/()286Κ?Μ298()/Η373Ρ,
    Α122Ν/Ο1243/Α1758/8222Α/Η257Α/()286Κ/Μ298(),
    Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/3222Α/Η257Α/()286Κ/Μ298(),
    - 160 020818
    А122Ν/Ο1248/А 1753/()286К/М298р, ΤΙ28Ν/Ρ129А/А1753/()286К/М298(),
    Η257Α/ζ)286Κ/Μ298(), замена 01а из Р1Х/8222А/()286К/М298(),
    8222А/()286К/М298(), замена 01а из ИХ/ 3222А/()286К/М298()/Н373Р, 3222А/()286К/М298()/Н373Р, 3222А/Н2573/()286К/М298(),
    Т2391/()286К/М298()/Н373Р, 3222А/Т2391/Н257А/()286К/М298(), Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/()286Κ/Μ298(), замена 01а из ΡΙΧ /Т2391/()286К/М298(),
    Т2391/()286К/М298(), ()286К/М298(),
    Τ128Ν/Ρ129 А/8222А/Т239У/Н257А/()286К/М298(),
    3222А/Т239У/Н257А/()286К/М2980, ΊΊ28Ν/Ρ129Α/Τ239ν/()286Κ/Μ298ζ), замена 01а из Р1Х/Т239У/()286К/М298(), У158О/()286К/Е296У/М298(),
    ΤΙ28Ν/Ρ129А/()286К/М298()/Н373Р, ()286К/М298()/Н373Р, {замена 01а из ΡΙΧ Κ[43]Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298Ο/()366Ν, {замена 01а из ΡΙΧ Κ[43]Ι}/()286Κ/Μ298()/()366Ν, ()286Κ/Μ298()/()366Ν, 852А/560А/5222А/Н257А/()28К/М2986(),
    Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α/Η257Α/()286Κ/Μ2986(), 3222А/Н257А/()286К/М298(), {замена 01а из ΡΙΧ/Κ[43]Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298(), замена О1а из Р1Х/352А/360А/()286К/М298(), 352А/360А/()286К/М298(), {замена 01а из Р1Х/М[19]К}/()286К/М298(), {замена 01а из Р1Х/()[44]3}/()286К/М298(), {замена 01а из Р1Х/К[43]1}/()286К/М298(), {замена О1а из Р1Х/Е[40]Ь}/<)286К/М298О, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/()286Κ/Μ298() и ()143К/М286()/замена О1а из ΡΙΧ.
  11. 11. Модифицированный двухцепочечный активированный полипептид фактора VII (ΡVIIа), включающий аминокислотные замены, соответствующие положениям 128, 129, 286 и 289 в ЗЕО ГО N0: 3, где аминокислота в положении 128 заменена на аспарагин (Υ, аминокислота в положении 129 заменена на аланин (А), аминокислота в положении 286 заменена на аргинин (К) и аминокислота в положении 298 заменена на глутамин (Р), модифицированный полипептид ΡVIIа включает аминокислотную последовательность, по крайней мере на 85 или 90% идентичную последовательности полипептида, приведенной в ЗЕО ГО N0:3; и модифицированный полипептид ΡVIIа обладает прокоагулянтной активностью.
  12. 12. Модифицированный полипептид фактора VII (ΡVII), состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в ЗРР ГО N0: 280.
  13. 13. Модифицированный двухцепочечный активированный полипептид фактора VII (ΡVIIа), состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в ЗЕО ГО N0: 280, расщепленной между аргинином в положении 152 и изолейцином в положении 153.
  14. 14. Модифицированный полипептид ΡVIIа по п.11, где полипептид включает аминокислотную последовательность, по крайней мере на 95% идентичную последовательности полипептида, приведенной в ЗРР ГО N0:3.
  15. 15. Активированный модифицированный полипептид фактора VII (ΡVIIа) по п.11, в котором аминокислотная последовательность легкой цепи модифицированного ΡVIIа по крайней мере на 95% идентична аминокислотной последовательности на участке 1-152 последовательности, приведенной в ЗЕО ГО N0:280, и включает аминокислотные замены в положениях 128 и 129.
  16. 16. Активированный модифицированный полипептид фактора VII (ΡVIIа) по п.11, в котором аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицированного ΡVIIа по крайней мере на 95% идентична аминокислотной последовательности на участке 153-406 последовательности, приведенной в ЗЕО ГО N0:280, и включает аминокислотные замены в положениях 286 и 298.
  17. 17. Модифицированный полипептид фактора VII (ΡVII), в котором полипептид ΡVII включает только 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 замен аминокислот в полипептиде ΡVII дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность, приведенную в ЗЕО ГО N0: 3 или в его аллельном или видовом варианте, или в полипептиде с последовательностью, приведенной в ЗЕР ГО N0: 3, содержащем гетерологичный О1а домен вместо О1а домена последовательности ЗЕР ГО N0: 3;
    одна замена аминокислоты находится в положении, соответствующем положению 286 в полипептиде ΡVII с аминокислотной последовательностью, приведенной в ЗЕО ГО N0: 3, или в соответствую- 161 020818 щем положении в полипептиде ΡΥΙΙ, и замена в положении 286 представляет собой замену на аргинин (Агд, К), что приводит к модифицированному полипептиду ΡΥΙΙ, обладающему повышенной коагулянтной активностью по сравнению с полипептидом ΡΥΙΙ, немодифицированным в положении 286.
  18. 18. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по любому из пп.1-17, где немодифицированный полипептид ΡΥΙΙ содержит последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕО ΙΌ N0: 1-3 или 18-74, или представляет собой его аллельный или видовой вариант, или представляет собой активный фрагмент полипептида ΡΥΙΙ, включающий последовательность аминокислот, приведенную в любой из последовательностей 8ЕР ΙΌ N0: 1-3 или 18-74.
  19. 19. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по п.18, где модифицированный полипептид ΡΥΙΙ представляет собой активный фрагмент, включающий замену аминокислоты в положении, соответствующем положению 286 в полипептиде ΡΥΙΙ.
  20. 20. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по любому из пп.17-19, в котором замена аминокислоты, в дополнение к замене 286К, находится в положении, соответствующем положению, выбранному из 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 286, 287, 290, 292, 294, 296, 298, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 и 396.
  21. 21. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по любому из пп.17-20, включающий замену аминокислот, выбранную из ϋ196Κ, ϋ196Κ, Ώ196Α, ϋ196Υ, Ώ196Ρ, Ш96\У,
    О196Ь, Ώ196Ι, Κ197Υ, К197А, К197Е, К197Ц К197Ь, К197М, Κ197Ι, К197У, К197Р,
    Κ197λν, К199А, Κ199ϋ, Κ199Ε, Ο2373Υ, Ο237Τ, 02371, О237У, Τ239Α, Κ290Α, Κ290Ε,
    Κ290ϋ, Κ290Ν, Κ290(2, Κ290Κ, Κ290Μ, К290У, Κ341Ε, Κ341Κ, Κ34Κ}, Κ341Ν, Κ341Μ,
    К34Ю, Τ2398, Τ239Ν, Т239Ц, Т239У, Т239Ц Τ239Η, Τ239Ι, Ь287Т, Μ298(}, Ρ321Κ,
    Ρ321Ε, Ρ321Υ, Ρ3213, Ц366О, (}366Е, (3366Ν, (}366Т, (}3663, (2366У, <23661, (ЗЗббЬ,
    Ц366М, Η373ϋ, Η373Ε, Η3738, Н373Ь, Η373Ι, Η373Ρ, Η373Α, Κ1618, Κ161Α, К161У,
    Η2168, Η216Α, Η216Κ, Η216Κ, 8222Α, 8222Κ, 8222У, 8222Ν, 8222Ε, 8222Ώ, Η257Α,
    Η2578, 852Α, 860Α, Ε394Ν, Ρ395Α, Κ3968, Κ2023, Α292Ν, Α2948, Ο318Ν, Α1758, Κ109Ν,
    Α122Ν, 01248, Α51Ν, Τ130Ν, Ε1323, 852Ν, Ρ543, 3119Ν, Ы218, Τ128Ν, Ρ129Α, (266Ν,
    Υ683, У158Т, νΐ58ϋ, Ь287Т, Е296У, Μ298Κ и Μ298(2.
  22. 22. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по п.21, включающий замены аминокислот, выбранные из
    Ц286К/Н257А, Ц286К/8222А, (2286К/3222А/Н257А, (2286К/3222А/замена О1а из ΡΙΧ, <2286К/Н257А/замена О1а из ΡΙΧ, р286К/8222А/Н257А/замена О1аиз ΡΙΧ, (2286К/(2366У, ρ286Κ/Α292Ν/Α294δ/ρ366ν, А1753/(2286К/(3366У, 8222А/(3286К/<3366У, Н2578/9286К, Н2578/р286ВД366У, 8222А/Н257А/(2286К/(2366У, (2286К/Н373А, δ222Α/Η257Α/(2286Κ/Μ158(2, (2286К/К34Ш, (2286Κ/<2366Ο, (2286Κ/(2366Ν, (2286Κ/Η373Ρ, Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ., Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Η373Ρ, 852Α/860Α/(3286Κ, 852Α/360Α/(2286Κ/Η373Ρ/,
    Т239У/(2286К, Т239У/(3286К/Р1373Р, Τ239ΙΑ2286Κ/Η373Ρ, νΐ58Ο/(2286Κ/Ε296ν/Μ298<2/Η373Ρ,Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/(3286Κ,
    Α122Ν/Ο1243/Α1753/(2286Κ,Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/(2286Κ/Μ298(2/Η373Ρ.
  23. 23. Модифицированный полипептид ΡΥΙΙ по любому из пп.1-10, включающий замены аминокислот, выбранные из
    Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Μ298(2,
    Τ239Ι/(2286Κ/Μ298(2/(2366Ν,Τ239ν/<2286Κ/Μ298(2/(2366Ν, Τ128Ν/Ρ129Α/(2286Κ/Μ298(3/(2366Ν/Η373Ρ, Υ158Ο/(2286Κ/Ε296ν/Μ298(3/Η373Ρ,
    - 162 020818
    Α122Ν/Ο1248/Α1758/Ρ286Κ/Μ298Ρ/Η373Ρ,
    Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/Ρ286Κ/Μ298Ρ/Η373Ρ,
    Α122Ν/Ο1243/Α1758/3222Α/Η257Α/ρ286Κ/Μ298(),
    Τ128Ν/Ρ129Α/Α1758/3222Α/Η257Α/ζ)286Κ/Μ298Ρ,
    А122Ν/01243/Α1753/ρ286Κ/Μ298(2, Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/ρ286Κ/Μ298(2,
    Η257Α7ζ)286Κ/Μ298ζ), 3222Α/ρ286Κ/Μ298(2, 3222Α/ρ286Κ/Μ298(2/Η373Ρ, 5222Α/Η2578/ζ)286Κ/Μ298Ρ, Τ239Ι/(2286Κ/Μ298ρ/Η373Ρ,
    8222А/Т2391/Н257А/р286К/М298р, Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239Ι/ρ286Κ/Μ298(2,
    Т2391/р286К/М298(3, Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α/Τ239ν/Η257Α/(3286Κ/Μ298ρ, 5222А/Т239У/Н257А/<3286К/М298Р, Τ128Ν/Ρ129Α/Τ239ν/ρ286Κ/Μ298ζ), νΐ58ϋ/ρ286Κ/Ε296ν/Μ298Ρ,Τ128Ν/Ρ129Α/ρ286Κ/Μ298ρ/Η373Ρ,
    0>286Κ/Μ298ζ)/Η373Ρ, ρ286Κ/Μ298ρ/(2366Ν,
    352Α/360Α/3222Α/Η257Α/ρ28Κ/Μ2986(3,
    Τ128Ν/Ρ129Α/3222Α/Η257Α/ρ286Κ/Μ2986ς>, 322Α/Η257Α/ς>286Κ/Μ298ς).
  24. 24. Модифицированный полипептид РУ11 по любому из пп.1-23, включающий аминокислотную последовательность, приведенную в любой из ЗЕЕ) ГО N08: 118, 131-141-155, 157, 274-282, 285-288, 290, 292-297, 299, 301-306, 308, 310-314, 316-318, 321-326, 328, 334-342, 355-358, 360 или 364-371.
  25. 25. Модифицированный полипептид РУ11, включающий модификацию в полипептиде РУ11, где модификация введена в положение, соответствующее положению, выбранному из 54, 66, 121, 122, 129 и 132 в полипептиде РУ11 с последовательностью аминокислот, приведенной в ЗЕО 10 N0: 3, или в соответствующих остатках в полипептиде РУ11.
  26. 26. Модифицированный полипептид РУ11 по п.25, в котором модификация выбрана из Р54З, О66\, Ь121З, А122Н Р129А и Е132З.
  27. 27. Модифицированный полипептид РУ11, включающий модификацию в полипептиде РУ11, где модификация соответствует модификации, выбранной из Т239З, Т239ф, Т239У, Т239Ь, Т239Н, Т2391, Р321К, Р321Е, Р321У, Р321З, φ366Ώ, φ366Ν, ф366У, ф3661, ф366Ь, ф366М, Н373Ц Н373Е, Н373З, Н373Р, Н373А, К161З, К161У, Н216З, Н216К, Н216К, З222А, З222К, З222У, З222Ц З222Ч З222Е и Н247З в полипептиде РУ11 с последовательностью аминокислот, приведенной в ЗЕО 10 N0: 3, или в соответствующих остатках в полипептиде РУ11.
  28. 28. Модифицированный полипептид РУ11, включающий две или более модификаций в полипептиде РУ11, его аллельном или видовом варианте или его активном фрагменте, в котором две или более модификаций аминокислот выбраны из модификаций, соответствующих Н216А, Н257А, Ξ394Ν, Р395А, К396З, К109Н А292Н А175З, Н257А и замене С1а из Р1Х.
  29. 29. Модифицированный полипептид РУ11 по любому из пп.1-28, который является активным или активированным.
  30. 30. Модифицированный полипептид РУ11 по любому из пп.1-29, включающий гетерологичный домен С1а или его часть, достаточную для осуществления связывания фосфолипидов.
  31. 31. Модифицированный полипептид РУ11 по п.30, в котором гетерологичный домен С1а выбран из домена С1а фактора 1Х (Р1Х), фактора Х (РХ), протромбина, белка С, белка З, остеокальцина, белка С1а матрикса, СгоМЕ-аг^^ресШс белка 6 (Саδ6) и белка Ζ.
  32. 32. Модифицированный полипептид РУ11 по п.30 или 31, в котором гетерологичный домен С1а имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из ЗЕО ГО N0: 83-91, 93 и 94, или ее часть, достаточную для осуществления связывания фосфолипидов.
  33. 33. Модифицированный полипептид РУ11 по любому из пп.30-32, в котором весь нативный домен С1а РУ11 или его непрерывную часть удаляли и заменяли гетерологичным доменом С1а, или его частью, достаточной для осуществления связывания фосфолипидов.
  34. 34. Модифицированный полипептид РУ11 по п.33, в котором нативный домен С1а РУ11 включает аминокислоты 1-45 в полипептиде РУ11 с последовательностью аминокислот, приведенной в ЗЕО ГО N0: 3, или соответствующие остатки в полипептиде РУ11.
  35. 35. Модифицированный полипептид РУ11 по пп.30-34, в котором гетерологичный домен С1а содержит модификации по сравнению с гетерологичным доменом С1а дикого типа.
  36. 36. Модифицированный полипептид РУ11 по п.32, в котором гетерологичный домен С1а представляет собой домен С1а Р1Х и модификация представляет собой замену аминокислоты в положении, соответствующем положению, выбранному из 19, 40, 43 и 44 домена С1а Р1Х, приведенного в ЗЕО ГО N0: 83.
  37. 37. Модифицированный полипептид РУ11 по п.33, в котором модификация выбрана из М19К, Е40Е, К431 и ф44З.
    - 163 020818
  38. 38. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.35-37, в котором гетерологичный домен О1а содержит дополнительные модификации.
  39. 39. Модифицированный полипептид РУН по п.38, в котором гетерологичный домен О1а представляет собой домен О1а РРХ и дополнительная модификация представляет собой замену аминокислоты в положении, соответствующем положению 19, 40, 43 и 44 домена О1а РРХ, приведенного в δΕΟ ГО NΟ: 83.
  40. 40. Модифицированный полипептид РУН по п.38 или 39, в котором дополнительная модификация выбрана из М19К, Ε40Ρ, К43! и 044δ.
  41. 41. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.35-37, в котором модификация представляет собой Μ19Κ/Ε40^/Κ43I/^44δ.
  42. 42. Модифицированный полипептид РУН по любому из пп.30-41, включающий модификации, выбранные из
    0286К/замена (На из ΡΙΧ, 0286К/8222А/замена (На из ΡΙΧ,
    0286К/Н257А/замена О1а из ΡΙΧ, 0286К/8222А/Н257А/замена О1а из ΡΙΧ, О286К/М298(5/замена О1а из ΡΙΧ, {замена 01а из Р1Х/Е40Р}/(5286К/М298(), {замена 01а из Р1Х/К431}/()286К/М298<5, {замена О1а из Р1Х/О443}/(5286К/М298(5, {замена 01а из Р1Х/М19К}/(5286К/М298О, {замена 01а из Р1Х/М19К/Е40Р/К431/(5443}/О286К/М298(5, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/8222Α/0286Κ, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο, замена 01а из ΡΙΧ/852Α/860Α/8222Α/Ο286Κ, замена О1а из ΡΙΧ/852Α/860Α/0286Κ/Μ2980, замена О1а из Р1Х/8222А/Т239У/О286К., замена О1а из Р1Х/Т239У/(5286К/М2980, замена О1а из ΡΙΧ/3222Α/Τ2391/(^286К, замена 01а из ΡΙΧ/Τ239Ι/Ο286Κ/Μ298Ο, замена 01а из ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ/Η373Ρ, замена 01а из ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ/Μ298Ο, замена О1а ΡΙΧ/8222Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Η373Ρ, замена 01а из ΡΙΧ/8222Α/Η2578/0286Κ, замена 01а из ΡΙΧ/Τ128Ν/Ρ129Α/Α1753/5222Α/0286Κ, замена 01а из ΡΙΧ/Α122Ν/Ο1248/Α1758/8222Α/0286Κ, {замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/Τ128Ν/Ρ129Α/(5286Κ/Μ298(5, {замена 01а из ΡΙΧ /Κ43Ι}/(5286Κ/Μ298(5/(5366Ν апс1 {замена О1а из ΡΙΧ /К431}/ Τ128Ν/Ρ129Α/Ο286Κ/Μ298Ο/Ο366Ν.
  43. 43. Модифицированный полипептид РУН по пп.1-42, включающий одну или более дополнительных модификаций аминокислоты (аминокислот), которые повышают устойчивость к антитромбину-Ш, увеличивают связывание и/или аффинность к фосфолипидам, повышают аффинность к тканевому фактору, увеличивают собственную активность, увеличивают ТФ-зависимую активность, увеличивают коагулянтную активность, изменяют конформацию полипептида для изменения зимогенности, увеличивают каталитическую или коагулянтную активность, сдвигая равновесие между высокоактивной и менее активной конформацией РУНа в пользу высокоактивных конформаций, повышают устойчивость к протеазам, уменьшают гликозилирование, увеличивают гликозилирование, снижают иммуногенность, повышают устойчивость и/или способствуют химическому связыванию групп.
  44. 44. Модифицированный полипептид РУН по пп.1-43, включающий одну или более дополнительных модификаций аминокислоты (аминокислот), выбранных из
EA201001628A 2008-04-11 2009-04-10 Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение EA020818B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12402108P 2008-04-11 2008-04-11
PCT/US2009/002248 WO2009126307A2 (en) 2008-04-11 2009-04-10 Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001628A1 EA201001628A1 (ru) 2011-06-30
EA020818B1 true EA020818B1 (ru) 2015-02-27

Family

ID=40872757

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201301350A EA024760B1 (ru) 2008-04-11 2009-04-10 Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение
EA201001628A EA020818B1 (ru) 2008-04-11 2009-04-10 Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201301350A EA024760B1 (ru) 2008-04-11 2009-04-10 Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение

Country Status (23)

Country Link
US (4) US8519103B2 (ru)
EP (4) EP2679678B1 (ru)
JP (3) JP2011517942A (ru)
KR (1) KR101623602B1 (ru)
CN (2) CN105039291A (ru)
AU (1) AU2009234390B2 (ru)
BR (1) BRPI0911060B1 (ru)
CA (1) CA2721038C (ru)
CO (1) CO6331368A2 (ru)
DK (2) DK2281037T3 (ru)
EA (2) EA024760B1 (ru)
ES (3) ES2556596T3 (ru)
HU (1) HUE026937T2 (ru)
IL (2) IL208373A (ru)
MX (2) MX2010011170A (ru)
MY (1) MY161581A (ru)
NZ (1) NZ588322A (ru)
PL (1) PL2281037T3 (ru)
PT (1) PT2281037E (ru)
SG (2) SG193779A1 (ru)
SI (1) SI2281037T1 (ru)
TW (2) TWI538916B (ru)
WO (1) WO2009126307A2 (ru)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7700341B2 (en) 2000-02-03 2010-04-20 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DK1735439T3 (da) 2004-04-12 2012-02-06 Catalyst Biosciences Inc Spaltning af VEGF og VEGF receptor ved hjælp af vild-type og mutant MT-SP1
WO2007031559A2 (en) 2005-09-14 2007-03-22 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
EP2428218A1 (en) * 2005-10-21 2012-03-14 Catalyst Biosciences, Inc. Modified proteases that inhibit complement activation
US8383388B2 (en) * 2006-06-19 2013-02-26 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
KR20140072201A (ko) 2006-07-05 2014-06-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
CA2683443A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides and uses thereof
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
CA2764758C (en) 2009-06-25 2019-02-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric factor vii molecules
TW201217527A (en) 2010-07-09 2012-05-01 Biogen Idec Hemophilia Inc Processable single chain molecules and polypeptides made using same
EP2625264B1 (en) 2010-10-08 2022-12-07 Terumo BCT, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
US20140046277A1 (en) * 2011-04-15 2014-02-13 Gamma Therapeutics, Inc. Fast-clotting wound dressings
WO2012149463A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric factor vii molecules with enhanced half life and methods of use
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
EP2554161A1 (en) 2011-08-02 2013-02-06 LFB Biotechnologies Pharmaceutical composition comprising factor VII encapsulated in micelles
ES2665319T3 (es) * 2012-02-14 2018-04-25 Opko Biologics Ltd. Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos
BR112014025737A2 (pt) 2012-04-16 2017-07-04 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd método para administrar um agente terapêutico, método para prevenir a entrada de um agente terapêutico, método para modular a velocidade de liberação de um agente terapêutico, agente terapêutico, formas de dosagem, método de tratamento de uma doença e kit de partes
NZ703148A (en) 2012-07-25 2016-08-26 Catalyst Biosciences Inc Modified factor x polypeptides and uses thereof
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
CN104661685A (zh) 2012-10-15 2015-05-27 诺和诺德保健Ag（股份有限公司） 因子vii缀合物
PL3572090T3 (pl) 2012-12-24 2023-04-11 Coagulant Therapeutics Corporation Polipeptydy czynnika vii o krótkim działaniu
US10588949B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX polypeptide formulations
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
US9371370B2 (en) * 2013-10-15 2016-06-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Coagulation factor VII polypeptides
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
US10633625B2 (en) 2013-11-16 2020-04-28 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
AR099328A1 (es) * 2014-02-12 2016-07-13 Novo Nordisk As Conjugados de factor vii
JP6783143B2 (ja) 2014-03-25 2020-11-11 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 培地の受動的補充
EA037991B1 (ru) 2014-05-26 2021-06-21 Академиш Зикенхёйс Лейден Прогемостатические белки для лечения кровотечений
WO2016049421A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled feed
JP6744313B2 (ja) 2015-01-02 2020-08-26 ダイアックス コーポレーション 血漿カリクレインおよび第ｘｉｉ因子に対する二重特異性抗体
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
WO2017015431A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Dyax Corp. A monoclonal antibody inhibitor of factor xiia
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
JP2019515904A (ja) * 2016-04-14 2019-06-13 アイコニック セラピューティクス，インコーポレイテッド 新血管新生に関連する障害を治療するための組成物および方法
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US20200317749A1 (en) * 2016-07-01 2020-10-08 Denali Therapeutics Inc. Albumin variants for enhanced serum half-life
US20210284715A1 (en) * 2017-02-06 2021-09-16 Applied Stemcell, Inc. Coagulation factor viii mimetic protein and uses thereof
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
JP7393945B2 (ja) 2017-03-31 2023-12-07 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞増殖
US12234441B2 (en) 2017-03-31 2025-02-25 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
PE20201263A1 (es) * 2017-09-05 2020-11-19 Gladiator Biosciences Inc Suministro de cargas utiles a las celulas madre
BR112020006149A2 (pt) 2017-09-27 2020-10-20 Sigilon Therapeutics, Inc. célula ativa manipulada, elemento implantável, e, composição farmacêutica.
CN111655268B (zh) 2017-10-04 2024-03-26 艾维迪提生物科学公司 核酸-多肽组合物及其用途
MA51583A (fr) * 2018-01-04 2020-11-11 Avidity Biosciences Inc Molécules d'acide nucléique hétéroduplex et leurs utilisations
WO2019195056A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Methods, compositions, and implantable elements comprising stem cells
US12161760B2 (en) 2018-04-04 2024-12-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Implantable particles and related methods
WO2020010189A1 (en) * 2018-07-06 2020-01-09 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for analyzing platelets by mass cytometry
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
WO2020247818A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Avidity Biosciences, Inc. Una amidites and uses thereof
CA3142283A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
EP3833381B1 (en) 2019-08-15 2022-08-03 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration
WO2021136194A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 构建基因突变文库的方法
JP7759719B2 (ja) * 2020-02-27 2025-10-24 オムロン株式会社 流量測定装置
US12043823B2 (en) 2021-03-23 2024-07-23 Terumo Bct, Inc. Cell capture and expansion
US12209689B2 (en) 2022-02-28 2025-01-28 Terumo Kabushiki Kaisha Multiple-tube pinch valve assembly
USD1099116S1 (en) 2022-09-01 2025-10-21 Terumo Bct, Inc. Display screen or portion thereof with a graphical user interface for displaying cell culture process steps and measurements of an associated bioreactor device
EP4602155A1 (en) 2022-10-11 2025-08-20 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease
JP2025534667A (ja) 2022-10-11 2025-10-17 シギロン セラピューティクス， インコーポレイテッド 疾患治療のための改変細胞及び移植可能エレメント
US12385818B2 (en) 2023-02-14 2025-08-12 Saudi Arabian Oil Company Modeling gas desorption in a subsurface reservoir
CN118126161B (zh) * 2024-03-26 2025-10-24 福州大学 一种凝血因子FXIa的多肽抑制剂及其在抗凝治疗方面的应用
CN119372186B (zh) * 2024-12-30 2025-04-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种重组人凝血因子vii的纯化方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001058935A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
WO2007022512A2 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor vii and factor viia
WO2007031559A2 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
US20070117756A1 (en) * 2003-06-19 2007-05-24 Maxygen Holdings, Ltd. FVII or FVIIa Gla domain variants
WO2008090215A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Novo Nordisk Health Care Ag Factor vii polypeptides with increased affinity to platelets

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
DK323587D0 (da) 1987-06-25 1987-06-25 Novo Industri As Protein
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5033252A (en) * 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
US5304482A (en) 1989-03-06 1994-04-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Serine protease mutants of the chymotrypsin superfamily resistant to inhibition by their cognate inhibitors
US5580560A (en) * 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
DE69131292T2 (de) * 1990-01-29 1999-09-30 Zymogenetics, Inc. Antikoagulierende proteine
US5583107A (en) 1990-09-04 1996-12-10 Cor Therapeutics, Inc. Agents affecting thrombosis and hemostasis
US20040087498A1 (en) * 1991-02-28 2004-05-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified factor VII
US5997864A (en) * 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5817788A (en) * 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US5788965A (en) * 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5323907A (en) * 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
ES2340008T3 (es) 1997-02-14 2010-05-27 American Red Cross Expresion de factor ix humano activo en tejido mamario de animales transgenicos.
US20050032690A1 (en) * 1997-09-10 2005-02-10 Rojkjaer Lisa Payne Factor VII polypeptides for preventing formation of inhibitors in subjects with haemophilia
US6693075B1 (en) 1997-10-23 2004-02-17 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6017882A (en) 1997-10-23 2000-01-25 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
DE19937219A1 (de) 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie
WO2001032711A2 (en) 1999-10-21 2001-05-10 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus aav rep78 major regulatory protein, mutants thereof and uses thereof
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US7700341B2 (en) * 2000-02-03 2010-04-20 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon
US6797504B1 (en) 2000-09-08 2004-09-28 Dendreon San Diego Llc Inhibitors of serine protease activity of matriptase or MTSP1
US7220837B1 (en) 2000-04-28 2007-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
EP1282693B1 (en) 2000-05-03 2010-10-20 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii variants
ES2449224T3 (es) 2000-05-03 2014-03-18 Novo Nordisk Health Care Ag Administración subcutánea del Factor de coagulación VII
HUP0301868A3 (en) 2000-05-10 2006-11-28 Novo Nordisk Healthcare Ag Pharmaceutical composition comprising a factor viia and a factor xiii
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
EP2253703A1 (en) 2000-09-13 2010-11-24 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor VII variants
KR100882482B1 (ko) * 2000-09-13 2009-02-06 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 사람 응고 인자 ｖｉｉ 변이체
EP1325127B1 (en) 2000-10-02 2009-03-11 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of vitamin k-dependent proteins
AU2002218029A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-21 The Scripps Research Institute Modified factor viia
HUP0303130A2 (hu) 2001-02-05 2004-01-28 Novo Nordisk Health Care Ag A VII-es faktor és a VIII-as faktor polipeptidek kombinált alkalmazása és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
WO2002076489A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
US20040133930A1 (en) * 2002-03-11 2004-07-08 Cooper Julian D. Production of high levels of transgenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses
WO2002072786A2 (en) 2001-03-13 2002-09-19 Corvas International, Inc. Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 7, the encoded polypeptides and methods based thereon
US7235638B2 (en) * 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
WO2002077263A2 (en) 2001-03-22 2002-10-03 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding serine protease cvsp14, the encoded polypeptides and methods based thereon
EP1373493B1 (en) 2001-03-22 2013-07-31 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii derivative
US7105333B2 (en) 2001-03-27 2006-09-12 Deadreon Corporation Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon
WO2002092841A2 (en) 2001-05-14 2002-11-21 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 10, the encoded polypeptides and methods based thereon
JP2005518332A (ja) 2001-05-23 2005-06-23 デンドレオン コーポレイション 細胞表面のプロテアーゼにより活性化される結合体およびその治療的使用
WO2003004681A2 (en) 2001-07-03 2003-01-16 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon
US7419949B2 (en) * 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
EP1432794B1 (en) 2001-09-27 2011-11-09 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii polypeptides
US7052868B2 (en) * 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
WO2003029442A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Novo Nordisk Health Care Ag Method for production of recombinant proteins in eukaryote cells
US20030143219A1 (en) * 2001-10-09 2003-07-31 Madison Edwin L Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 25, the encoded polypeptides and methods based thereon
JP3862996B2 (ja) 2001-10-31 2006-12-27 帝人ファイバー株式会社 ポリトリメチレンテレフタレートフィラメント糸およびその製造方法
US6960657B2 (en) * 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
EP1451315B1 (en) 2001-11-02 2014-05-21 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii polypeptides
US7291587B2 (en) * 2001-11-09 2007-11-06 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and TAFI polypeptides
AU2002357004A1 (en) * 2001-11-20 2003-06-10 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon
EP1458407A1 (en) 2001-12-21 2004-09-22 Novo Nordisk A/S Liquid composition of modified factor vii polypeptides
PL370652A1 (en) 2001-12-21 2005-05-30 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
NZ536340A (en) 2002-04-30 2006-09-29 Maxygen Holdings Ltd Factor VII or VIIa polypeptide variants with N-glycosylation
EP1361284A1 (en) 2002-05-10 2003-11-12 Direvo Biotech AG Process for generating sequence-specific proteases by directed evolution and use thereof
AU2003269880A1 (en) 2002-05-21 2003-12-22 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 12, the encoded polypeptides and methods based thereon
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
WO2003106493A1 (en) 2002-06-14 2003-12-24 Dyax Corporation Protein analysis
BR0311978A (pt) 2002-06-21 2005-03-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Preparação, método para preparar a mesma, formulação farmacêutica, métodos para tratar de uma sìndrome responsiva ao fator vii, para prevenir hemorragias indesejáveis, para prevenir coagulação sanguìnea indesejável e para prevenir as reações mediadas pelo fator tecidual, e, uso de uma preparação
DE60336555D1 (de) 2002-06-21 2011-05-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylierte glykoformen von faktor vii
AU2003247776A1 (en) 2002-07-02 2004-01-23 Dendreon Corporation Serine protease 16
US6911323B2 (en) * 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
JP4597678B2 (ja) 2002-09-25 2010-12-15 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト ヒト凝固因子ｖｉｉポリペプチド
ATE505487T1 (de) 2002-09-30 2011-04-15 Bayer Healthcare Llc Fvii- oder fviia-varianten mit erhöhter koagulationswirkung
CN104630192A (zh) * 2002-10-02 2015-05-20 催化剂生物科学有限公司 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
US20060024289A1 (en) * 2002-10-02 2006-02-02 Ruggles Sandra W Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
EP1611236A1 (en) 2003-03-18 2006-01-04 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of gla-residue containing serine proteases
ES2327044T3 (es) * 2003-03-20 2009-10-23 Bayer Healthcare Llc Variantes de fvii o fviia.
WO2004108763A2 (en) 2003-06-05 2004-12-16 Canadian Blood Services Mutants of the factor vii epidermal growth factor domain
US20060116324A1 (en) * 2003-06-13 2006-06-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Novel formulations
JP2006527216A (ja) 2003-06-13 2006-11-30 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 新規調合物
WO2004113522A1 (en) 2003-06-18 2004-12-29 Direvo Biotech Ag New biological entities and the pharmaceutical or diagnostic use thereof
EP1633865B1 (en) 2003-06-18 2011-09-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft New biological entities and the use thereof
WO2005023308A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Maxygen Holdings Ltd. Formulations of vitamin k-dependent polypeptides and sulfoalkyl ether cycloextrins
EP1664291B1 (en) 2003-09-09 2012-02-29 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii polypeptides
CN101870729A (zh) * 2003-09-09 2010-10-27 诺和诺德医疗保健公司 凝固因子ⅶ多肽
JP2007509843A (ja) 2003-10-07 2007-04-19 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子活性を有するハイブリッド分子
JP2007511604A (ja) 2003-11-18 2007-05-10 アイコニック セラピューティクス インコーポレイティッド キメラタンパク質の均質製剤
WO2005068620A1 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Novo Nordisk Health Care Ag Method for the production of recombinant proteins
EP1713906A2 (en) 2004-02-03 2006-10-25 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor vii/viia variants lacking functional lipid membrane binding domain
DK1735439T3 (da) * 2004-04-12 2012-02-06 Catalyst Biosciences Inc Spaltning af VEGF og VEGF receptor ved hjælp af vild-type og mutant MT-SP1
WO2005100556A2 (en) 2004-04-12 2005-10-27 Catalyst Biosciences Cleavage of vegf and vegf receptor by wild-type and mutant proteases
ES2339953T5 (es) 2004-05-04 2020-05-06 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformas de factor VII ligadas a O y método de fabricación
US20060029590A1 (en) * 2004-06-10 2006-02-09 Christopher Thanos Administration of neutral endopeptidase to treat inflammatory bowel disease
WO2005123118A1 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Novo Nordisk Health Care Ag Use of factor viia or factor viia equivalents for preventing or attenuating haemorrhage growth, and/or oedema generation following intracerebral haemorrhage (ich)
US20080058255A1 (en) * 2004-06-21 2008-03-06 Novo Nordisk Healthcare A/G Glycosylation-Disrupted Factor VII Variants
US20060019893A1 (en) * 2004-07-02 2006-01-26 Genentech, Inc. Factor VIIa variants
US20090004175A1 (en) 2004-07-16 2009-01-01 Novo Nordick Health Care A/G Methods for Optimizing Forming Vlla-Based Hemostatic Treatment
US20090176967A1 (en) 2004-08-02 2009-07-09 Novo Nordisk Healthcare A/G Conjugation of FVII
DK1781782T3 (da) 2004-08-17 2010-08-23 Csl Behring Gmbh Modificerede vitamin K-afhængige polypeptider
JP2008514215A (ja) 2004-09-29 2008-05-08 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 改変タンパク質
EP1827486A2 (en) 2004-12-22 2007-09-05 Direvo Biotech AG Targeted use of engineered enzymes
EP2360171A1 (en) 2004-12-23 2011-08-24 Novo Nordisk Health Care AG Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin K-dependent protein of interest
WO2006114105A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Maxygen Holdings Ltd. Use of modified factor vii for treating bleeding
EP1877037A2 (en) 2005-04-28 2008-01-16 Novo Nordisk Health Care AG A closed container comprising an activated factor vii polypeptide, processes for the preparation of the same, and a kit and a method for use of the kit
EP1726643A1 (en) 2005-05-27 2006-11-29 Direvo Biotech AG Method for the provision, identification and selection of proteases with altered sensitivity to activity-modulating substances
JP5290753B2 (ja) 2005-06-17 2013-09-18 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 二量体及び多量体ＦＶＩＩａ化合物
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
EP1919498A2 (en) 2005-08-26 2008-05-14 Maxygen Holdings Ltd. Liquid factor vii composition
US20080268521A1 (en) 2005-09-01 2008-10-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Purification of Coagulation Factor VII Polypeptides
WO2007039475A1 (en) 2005-09-21 2007-04-12 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
WO2007044874A2 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Novo Nordisk A/S Use of factor vii polypeptides for neuroprotection
EP2428218A1 (en) 2005-10-21 2012-03-14 Catalyst Biosciences, Inc. Modified proteases that inhibit complement activation
US8383388B2 (en) * 2006-06-19 2013-02-26 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
KR20140072201A (ko) 2006-07-05 2014-06-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
EP2046372A2 (en) 2006-07-17 2009-04-15 Novo Nordisk Health Care AG Factor viia analogues with increased activity for treating thrombocytopenia
WO2008078189A2 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Bayer Healthcare Llc Factor vii and viia compositions
CA2683443A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides and uses thereof
US9102962B2 (en) 2007-10-16 2015-08-11 Shiu Nan Chen Production method for solid cultured active mushroom mycelium and fruit-body metabolites (AMFM) products thereof
GB0800938D0 (en) * 2008-01-18 2008-02-27 Ge Healthcare Uk Ltd Multiplex cell signalling assay
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
US8266208B2 (en) 2008-11-06 2012-09-11 Joseph Mahon Method and system for sharing documents among members of an online community
CA2764758C (en) * 2009-06-25 2019-02-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric factor vii molecules
CN201753815U (zh) 2010-07-27 2011-03-02 江森自控空调冷冻设备(无锡)有限公司 三通结构
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
NZ703148A (en) 2012-07-25 2016-08-26 Catalyst Biosciences Inc Modified factor x polypeptides and uses thereof
US20150307865A1 (en) 2012-10-15 2015-10-29 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii polypeptides
EP3833381B1 (en) 2019-08-15 2022-08-03 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001058935A2 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Maxygen Aps FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES
US20070117756A1 (en) * 2003-06-19 2007-05-24 Maxygen Holdings, Ltd. FVII or FVIIa Gla domain variants
WO2007022512A2 (en) * 2005-08-19 2007-02-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor vii and factor viia
WO2007031559A2 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
WO2008090215A1 (en) * 2007-01-26 2008-07-31 Novo Nordisk Health Care Ag Factor vii polypeptides with increased affinity to platelets

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALLEN GEOFFREY A. ET AL.: "A variant of recombinant factor VIIa with enhanced procoagulant and antifibrinolytic activities in an in vitro model of hemophilia" ARTERIOSCLEROSIS THROMBOSIS AND VASCULAR BIOLOGY, vol. 27, no. 3, March 2007 (2007-03), pages 683-689, XP002538665 ISSN: 1079-5642 the whole document *
BJELKE ET AL.: "A loop of coagulation factor VIIa influencing macromolecular substrate specificity" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 581, no. 1, 23 December 2006 (2006-12-23), pages 71-76, XP005815646 ISSN: 0014-5793 abstract; figure 1 page 73 *
DICKINSON C.D. ET AL.: "Identification of surface residues mediating tissue factor binding and catalytic function of the serine protease factor VIIa" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 93, 1 December 1996 (1996-12-01), pages 14379-14384, XP002267001 ISSN: 0027-8424 abstract; figure 1 *
PERSSON E. ET AL.: "RATIONAL DESIGN OF COAGULATION FACTOR VLLA VARIANTS WITH SUBSTANTIALLY INCREASED INTRINSIC ACTIVITY" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 98, no. 24, 20 November 2001 (2001-11-20), pages 13583-13588, XP002909203 ISSN: 0027-8424 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2577055T3 (es) 2016-07-12
MX2010011170A (es) 2010-11-01
PL2281037T3 (pl) 2016-05-31
CN102083971A (zh) 2011-06-01
BRPI0911060A2 (pt) 2015-10-13
WO2009126307A3 (en) 2009-12-10
EP2281037B1 (en) 2015-11-11
CA2721038A1 (en) 2009-10-15
DK2281037T3 (en) 2016-01-11
BRPI0911060B1 (pt) 2022-04-05
ES2556596T3 (es) 2016-01-19
IL225740A (en) 2015-04-30
MY161581A (en) 2017-04-28
US20090291890A1 (en) 2009-11-26
JP2015017093A (ja) 2015-01-29
US20190055534A1 (en) 2019-02-21
US10160961B2 (en) 2018-12-25
EA201301350A1 (ru) 2014-07-30
EA201001628A1 (ru) 2011-06-30
EP2687596A3 (en) 2014-04-23
TW201431877A (zh) 2014-08-16
EP2679678A1 (en) 2014-01-01
EP2679678B1 (en) 2016-05-18
JP5976021B2 (ja) 2016-08-23
US11203749B2 (en) 2021-12-21
TWI465247B (zh) 2014-12-21
PT2281037E (pt) 2016-01-27
US9476037B2 (en) 2016-10-25
TW200942258A (en) 2009-10-16
EP3064580A1 (en) 2016-09-07
EP2687596B1 (en) 2016-01-06
KR101623602B1 (ko) 2016-06-07
HK1154273A1 (zh) 2012-04-13
IL208373A (en) 2014-07-31
EP2281037A2 (en) 2011-02-09
US8519103B2 (en) 2013-08-27
SI2281037T1 (sl) 2016-02-29
TWI538916B (zh) 2016-06-21
DK2687596T3 (da) 2016-02-29
CN102083971B (zh) 2015-08-05
SG190560A1 (en) 2013-06-28
KR20110008084A (ko) 2011-01-25
MX344220B (es) 2016-12-07
EP2687596A2 (en) 2014-01-22
CO6331368A2 (es) 2011-10-20
EA024760B1 (ru) 2016-10-31
AU2009234390B2 (en) 2013-10-31
CA2721038C (en) 2018-07-31
SG193779A1 (en) 2013-10-30
US20140044701A1 (en) 2014-02-13
IL208373A0 (en) 2010-12-30
JP2011517942A (ja) 2011-06-23
AU2009234390A1 (en) 2009-10-15
WO2009126307A2 (en) 2009-10-15
JP5659312B1 (ja) 2015-01-28
ES2560236T3 (es) 2016-02-18
HK1194096A1 (en) 2014-10-10
HUE026937T2 (en) 2016-07-28
US20160376577A1 (en) 2016-12-29
NZ588322A (en) 2012-03-30
IL225740A0 (en) 2013-06-27
HK1192905A1 (en) 2014-09-05
CN105039291A (zh) 2015-11-11
JP2014113157A (ja) 2014-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020818B1 (ru) Модифицированные полипептиды фактора vii и их применение
RU2571931C2 (ru) Полипептиды на основе модифицированного фактора vii и их применение
EA028865B1 (ru) Модифицированные полипептиды фактора х и их применение
AU2013203608B2 (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
HK1227434A1 (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
HK1227434A (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
AU2015224596A1 (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
HK1192905B (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
HK1194096B (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof
HK1154273B (en) Factor vii polypeptides that are modified and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM