EA029164B1

EA029164B1 - Лечение рака tor киназными ингибиторами

Info

Publication number: EA029164B1
Application number: EA201590744A
Authority: EA
Inventors: Дебора МОРТЕНСЕН; Хитер Рэймон; Рама К. НАРЛА; Кристен Мей Хедж; Кимберли Элизабет Фулц; Тосия Цудзи
Original assignee: СИГНАЛ ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ЭлЭлСи
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2018-02-28
Also published as: IL238326A0; AU2013202768B2; MX368407B; ES2777936T3; SG11201502999YA; KR102157914B1; MX2015004874A; EP2908814B1; KR102267927B1; IL238326B; WO2014062878A9; US20140113904A1; CN105050601A; SG10201810575WA; JP2021050213A; PH12015500867A1; JP7162543B2; PH12015500867B1; EP2908814A2; KR20200108923A

Abstract

Изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-b]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, имеющему рак предстательной железы.

Description

Изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ы]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, имеющему рак предстательной железы.

029164 Β1

029164

По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 61/715510, поданной 18 октября 2012 г., полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы.

Уровень техники

Связь между аномальным фосфорилированием белков и причиной или следствием заболеваний известна в течение более 20 лет. Соответственно, протеинкиназы стали очень важной группой мишеней лекарственных средств. См. СоНсп. БаШгс. 1:309-315 (2002). Различные ингибиторы протеинкиназ применяют клинически в лечении большого спектра заболеваний, таких как рак и хронические воспалительные заболевания, включая диабет и инсульт. См. СоНсп Еиг. 1. ВюсНет., 268:5001-5010 (2001), Рго1еш Ките ΙηΗίΗίΐοτδ Гог (Не Тгеа(теп( о£ ЭБеа^е: ТНе Ртот18е апб (Не РтоЫетк, НапбЬоок о£ Р\рептеп(а1 РНагтасо1оду, Бргшдег ВетНп Не1Йе1Ьег§, 167 (2005).

Протеинкиназы представляют собой большое и разнообразное семейство ферментов, которые катализируют фосфорилирование белков и играют важную роль в передаче клеточного сигнала. Протеинкиназы могут проявлять положительные или отрицательные регуляторные эффекты, в зависимости от их белковой мишени. Протеинкиназы вовлечены в специфические сигнальные пути, которые регулируют клеточные функции, такие как, но не ограничиваясь этим, метаболизм, развитие клеточного цикла, клеточная адгезия, функция сосудов, апоптоз и ангиогенез. Нарушения функционирования передачи клеточного сигнала связаны со многими заболеваниями, самыми охарактеризованными из которых являются рак и диабет. Регуляция передачи сигнала цитокинами и связь сигнальных молекул с протоонкогенами и генами-супрессорами опухолевого роста хорошо задокументированы. Аналогично, продемонстрирована связь между диабетом и родственными заболеваниями и разрегулированными количествами протеинкиназ. См., например, ЗпбНаг е( а1., РНаттасеиНса1 КекеатсН, 17(11):1345-1353 (2000). Вирусные инфекции и связанные с ними заболевания также связаны с регуляцией протеинкиназ. Рагк е( а1., Се11, 101(7):77-787 (2000).

Поскольку протеинкиназы регулируют практически каждый клеточный процесс, включая метаболизм, пролиферацию клеток, дифференциацию клеток и выживаемость клеток, они являются привлекательными мишенями для терапевтического вмешательства для различных болезненных состояний. Например, контроль клеточного цикла и ангиогенеза, в которых протеинкиназы играют ключевую роль, представляют собой клеточные процессы, связанные со многими болезненными состояниями, таким как, но не ограничиваясь этим, рак, воспалительные заболевания, нарушенный ангиогенез и связанные с ним заболевания, атеросклероз, дегенерация желтого пятна, диабет, ожирение и боль.

Протеинкиназы стали привлекательными мишенями для лечения рака. РаЬЬто е( а1., РНаттасо1оду & ТНетареиНск, 93:79-98 (2002). Предполагают, что участие протеинкиназ в развитии злокачественных опухолей человека может осуществляться (1) геномной перестройкой (например, ВСК-АВЬ при хронической миелогенной лейкемии); (2) мутациями, приводящими к конститутивной активности киназ, такими как при острой миелоцитарной лейкемии и опухолях желудочно-кишечного тракта; (3) нарушенной регуляцией киназной активности посредством активации онкогенов или потери функции онкосупрессоров, такой как при раке с онкогенным КА§; (4) нарушенной регуляцией киназной активности посредством сверхэкспрессии, как в случае ЕОРК; и (5) эктопической экспрессией факторов роста, которые могут способствовать развитию и сохранению неопластического фенотипа. РаЬЬго е( а1., РНаттасо1оду & ТНетареиНск, 93:79-98 (2002).

Выяснение хитросплетения протеинкиназных путей и сложности связи и взаимодействия среди и между различными протеинкиназами и киназными путями выявило важность разработки фармацевтических агентов, способных действовать в качестве модуляторов, регуляторов и ингибиторов протеинкиназ, которые проявляют полезную активность относительно множества киназ или множества киназных путей. Соответственно, сохраняется необходимость в новых киназных модуляторах.

Белок, называемый тТОК (мишень рапамицина в клетках млекопитающих), который также называют РКАР, КАРТ1 или КАРТ1), представляет собой 2549-аминокислотную 8ет/ТНт протеинкиназу, которая, как показано, является одним из наиболее важных белков в тТОК/Р13К/Ак( пути, который регулирует рост и пролиферацию клеток. ОеогдакБ апб Уоипек Е\рег( Кеу. Апйсапсет ТНег. 6(1):131-140 (2006). тТОК существует в виде двух комплексах, тТОКС1 и тТОКС2. Тогда как тТОКС1 является чувствительным к аналогам рапамицина (таким как темсиролимус или эверолимус), тТОКС2 является в значительной мере нечувствительным к рапамицину. Примечательно, что рапамицин не является ТОК киназным ингибитором. Несколько тТОК ингибиторов оценены или оцениваются в клинических испытаниях по лечению рака. Темсиролимус одобрен для применения при почечно-клеточной карциноме в 2007 г., и сиролимус одобрен в 1999 г. для профилактики отторжения почечного трансплантата. Эверолимус одобрен в 2009 г. для пациентов с почечно-клеточной карциномой, у которых развилась резистентность к ингибиторам рецептора сосудистого эндотелиального фактора роста, в 2010 г. для субэпендимальной ги- 1 029164

гантоклеточной астроцитомы (8ЕОА), связанной с туберозным склерозом (Т8), у пациентов, которым требуется терапия, но которые не являются кандидатами для хирургической резекции, и в 2011 г. для прогрессирующих нейроэндокринных опухолей панкреатического происхождения (ΡΝΕΤ) у пациентов с нерезектабельными, местнораспространенными или метастазирующими опухолями. Существует необходимость в дополнительных ТОК киназных ингибиторах.

Цитирование или указание любой ссылки в данном описании не рассматривается как допущение того, что ссылка является предшествующим уровнем техники для настоящего изобретения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора, который представляет собой 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3 Ь]пиразин-2(1Н)-он или его фармацевтически приемлемую соль, стереоизомер или таутомер, пациенту, имеющему рак предстательной железы.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам улучшения критерия рабочей группы 2 по специфическому антигену простаты (Р8А\УС2) для рака предстательной железы пациента, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора, представляющего собой 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3 Ь]пиразин-2(1Н)-он или его фармацевтически приемлемую соль, стереоизомер или таутомер, пациенту, имеющему рак предстательной железы.

Настоящие варианты осуществления можно понять более полно со ссылкой на подробное описание и примеры, которые предполагаются для иллюстрации неограничивающих вариантов осуществления.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает распределение клеточного цикла необработанных НеЬа и РС-3 клеток.

Фиг. 2 показывает эффекты обработки соединением 1 на распределение клеточного цикла в РС-3 клетках.

Фиг. 3 показывает кривые ингибирования роста для РС-3 клеточной линии в ответ на рапамицин или соединение 1.

Фиг. 4 показывает кривую ингибирования фосфобиомаркера для РС-3 клеточной линии в ответ на обработку или рапамицином, или соединением 1.

Фиг. 5А показывает противоопухолевую активность соединения 6 в РС-3 ксенотрансплантатной модели с различными режимами дозирования.

Фиг. 5В показывает противоопухолевую активность соединения 6 в РС-3 ксенотрансплантатной модели с введением дозы один раз в день при различных уровнях доз.

Фиг. 6 показывает РК/РО соотношение соединения 6 у мышей с РС-3 опухолями с однократной пероральной дозой 30 мг/кг. Ингибирование р86 и рАк! коррелировало с концентрацией соединения и в плазме, и в опухолях.

Фиг. 7 показывает кривую ингибирования роста РС-3 в ответ на соединение 2.

Фиг. 8 показывает кривые ингибирования фосфорилирования субстрата в РС-3 в ответ на обработку соединением 2.

Фиг. 9 показывает противоопухолевую активность соединения 1 в РС-3 ксенотрансплантатной модели с введением дозы один раз в день.

Фиг. 10 показывает сравнение концентрации соединения 1 (10 мг/кг) и рапамицина (4 мг/кг) и соотношение концентраций р86 и рАк! в РС-3 ксенотрансплантатной модели после 21 дня дозирования.

Фиг. 11 показывает противоопухолевую активность соединения 1 в РС-3 ксенотрансплантатной модели при периодическом дозировании.

Фиг. 12 показывает противоопухолевую активность соединения 1 в РС-3 ксенотрансплантатной модели с введением дозы дважды в день.

Фиг. 13 показывает РС-3 регрессию опухоли соединением 1 в РС-3 ксенотрансплантатной модели с различными режимами дозирования.

Фиг. 14 показывает концентрацию соединения 1 у мышей, имеющих РС-3 опухоль, после однократной пероральной дозы 25 мг/кг и соотношение концентраций р86 и рАк!.

Фиг. 15 показывает концентрацию соединения 1 у мышей, имеющих РС-3 опухоль, после однократной пероральной дозы 10 мг/кг и соотношение концентраций р86 и рАк!.

Фиг. 16 показывает концентрацию соединения 1 у мышей, имеющих РС-3 опухоль, после однократной пероральной дозы 1 мг/кг и соотношение концентраций р86 и рАк!.

Фиг. 17 показывает количественную оценку окрашивания на апоптоз в РС-3 опухолях в ответ на обработку рапамицином или соединением 1.

Фиг. 18 показывает антипролиферативный и антиангиогенный эффекты, как измерено количественной оценкой Κί-67 и СО-31 окрашивания в РС-3 опухолях в ответ на обработку или рапамицином, или соединением 1.

Фиг. 19 показывает противоопухолевую активность соединения 2 в РС-3 ксенотрансплантатной модели при введении дозы дважды в день.

- 2 029164

Фиг. 20 показывает противоопухолевую активность соединения 2 в РС-3 ксенотрансплантатной модели при введении дозы один раз в день при различных уровнях доз.

Фиг. 21 показывает концентрацию соединения 2 у мышей, имеющих РС-3 опухоль, после однократной пероральной дозы 1 и 10 мг/кг и соотношение концентраций р86 и рАк1.

Фиг. 22 показывает эффект на концентрацию ρΏΝΑ РК в ответ на соединение 2 у мышей, имеющих РС-3 опухоль, после введения дозы один раз в день при 5 мг/кг в течение 6 дней.

Подробное описание Определения

Как применяют в настоящем изобретении, термин "фармацевтически приемлемая соль(и)" относится к соли, полученной из фармацевтически приемлемой нетоксичной кислоты или основания, включая неорганическую кислоту и основание и органическую кислоту и основание. Подходящие фармацевтически приемлемые соли присоединения основания ТОК киназных ингибиторов включают, но не ограничиваются ими, соли металлов, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или органические соли, полученные из лизина, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, меглумина (Ν-метилглюкамина) и прокаина. Подходящие нетоксичные кислоты включают, но не ограничиваются ими, неорганические и органические кислоты, такие как уксусная, альгиновая, антраниловая, бензолсульфоновая, бензойная, камфорсульфоновая, лимонная, этенсульфоновая, муравьиная, фумаровая, фуранкарбоновая, галактуроновая, глюконовая, глюкуроновая, глутаминовая, гликолевая, бромисто-водородная, хлористо-водородная, изетионовая, молочная, малеиновая, яблочная, миндальная, метансульфоновая, муциновая, азотная, памовая, пантотеновая, фенилуксусная, фосфорная, пропионовая, салициловая, стеариновая, янтарная, сульфаниловая, серная, винная и п-толуолсульфоновая кислоты. Конкретные нетоксичные кислоты включают соляную, бромистоводородную, фосфорную, серную и метансульфоновую кислоты. Таким образом, примеры конкретных солей включают хлористо-водородную и мезилатную соли. Другие соли являются хорошо известными в данной области техники, см., например, КетЫд1оп'з РНаттасеиНса1 8с1епсез, 18* ебз., Маск РиЪНзЫпд, Еаз1оп РА (1990) или КеттцЮп: ТЬе Зсчепсе апб РтасНсе о£ РНагтасу, 19^,Н ебз., Маск РиЪНзЫпд, Еаз1оп РА (1995).

Как применяют в настоящем изобретении и если не указано иное, термин "стереоизомер" или "стереоизомерно чистый" обозначает один стереоизомер ТОК киназного ингибитора, который, по существу, не содержит других стереоизомеров данного соединения. Например, стереоизомерно чистое соединение, содержащее один хиральный центр, будет, по существу, не содержать противоположного энантиомера соединения. Стереоизомерно чистое соединение, содержащее два хиральных центра, будет, по существу, свободно от других диастереомеров соединения. Типичное стереоизомерно чистое соединение содержит более чем приблизительно 80 мас.% одного стереоизомера соединения и менее чем приблизительно 20 мас.% других стереоизомеров соединения, более чем приблизительно 90 мас.% одного стереоизомера соединения и менее чем приблизительно 10 мас.% других стереоизомеров соединения, более чем приблизительно 95 мас.% одного стереоизомера соединения и менее чем приблизительно 5 мас.% других стереоизомеров соединения или более чем приблизительно 97 мас.% одного стереоизомера соединения и менее чем приблизительно 3 мас.% других стереоизомеров соединения. ТОК киназные ингибиторы могут содержать хиральные центры и могут существовать в виде рацематов, отдельных энантиомеров или диастеремеров и их смесей. Все данные изомерные формы включены в варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, включая их смеси. Применение стереоизомерно чистых форм такого ТОК киназного ингибитора, а также применение смесей таких форм охвачено вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Например, смеси, содержащие равные или неравные количества энантиомеров конкретного ТОК киназного ингибитора, можно применять в способах и композициях, описанных в настоящем описании. Такие изомеры можно асимметрически получить или разделить, применяя стандартные способы, такие как хиральные колонки или хиральные агенты для разделения. См., например, 1асциез, 1., е! а1., ЕпапНотетз, Касета1ез апб КезоЫНопз (%11еу-1п1егзс1епсе, \е\\- Уотк, 1981); А'Пеп, 8.Н., е1 а1., ТеНаНебтоп, 33:2725 (1977); ЕНе1, Е.Б., 81етеосНет1з1ту о£ СагЪоп Сотроипбз (МсОта\-НШ, ΝΥ, 1962) и А'Пеп, 8.Н., ТаЪ1ез о£ КезоЫЫд Адеп1з апб ОрНса1 КезоЫНопз р. 268 (Е.Б. ЕНе1, Еб., υπΐν. о£ ΝθΗό Сате Ргезз, ΝθΗό Сате, ΙΝ, 1972).

"Таутомеры" относятся к изомерным формам соединения, которые находятся в равновесии друг с другом. Концентрации изомерных форм будут зависеть от окружения, в котором находится соединение, и могут быть различными, в зависимости, например, от того, является ли соединение твердым или находится в органическом или водном растворе. Например, в водном растворе пиразолы могут иметь следующие изомерные формы, которые называют таутомерами друг друга:

Как ясно специалисту в данной области техники, широкий ряд функциональных групп и других структур может обладать таутомерией, и все таутомеры ТОК киназных ингибиторов включены в объем

- 3 029164

настоящего изобретения.

"Лечение", как применяют в настоящем изобретении, обозначает облегчение, в целом или частично, рака предстательной железы или его симптома или замедление или остановку последующего развития или ухудшения рака предстательной железы.

"Предотвращение", как применяют в настоящем изобретении, обозначает предотвращение возникновения, рецидива или распространения, в целом или частично, рака предстательной железы или его симптома.

В вариантах осуществления рак предстательной железы не является ЕТ8 сверхэкспрессирующим раком предстательной железы.

Термин "эффективное количество" в связи с ТОК киназным ингибитором 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она обозначает количество, способное облегчать, в целом или частично, симптомы, связанные с раком предстательной железы, или замедлять или останавливать последующее развитие или ухудшение данных симптомов, или лечить или предотвращать рак предстательной железы. Эффективное количество ТОК киназного ингибитора 1-этил7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она, например, в фармацевтической композиции может составлять количество, которое будет проявлять требуемый эффект; например от приблизительно 0,005 до приблизительно 100 мг/кг массы тела пациента в виде единичной дозы и для перорального и для парентерального введения. Как ясно специалисту в данной области техники, ожидают, что эффективное количество ТОК киназного ингибитора, описанного в настоящем изобретении, может изменяться в зависимости от тяжести заболевания, которое лечат.

В отношении рака предстательной железы, лечение можно оценить ингибированием развития заболевания, ингибированием роста опухоли, уменьшением первичной и/или вторичной опухоли(ей), облегчением связанных с опухолью симптомов, улучшением качестве жизни, ингибированием факторов, секретируемых опухолью (включая специфический антиген простаты или Р8А), снижением циркуляции опухолевых клеток, задержанным появлением первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедленным развитием первичной и/или вторичной опухоли(ей), сниженной частотой возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедленной или сниженной тяжестью вторичных эффектов заболевания, задержанным ростом опухоли и/или ремиссией опухолей, среди прочих.

Термины "пациент" и "субъект", как применяют в настоящем изобретении, включают животное, включая, но не ограничиваясь ими, животное, такое как корова, обезьяна, лошадь, овца, свинья, курица, индейка, перепелка, кошка, собака, мышь, крыса, кролик или морская свинка, в одном варианте осуществления млекопитающее, в другом варианте осуществления человека. В одном варианте осуществления "пациент" или "субъект" представляет собой человека, имеющего рак предстательной железы. В одном варианте осуществления пациент представляет собой человека, имеющего рак предстательной железы, включая субъектов, у которых развилась устойчивость (или они не переносят) к стандартной противораковой терапии или для которых не существует стандартной противораковой терапии.

В отношении рака предстательной железы, лечение можно оценить ингибированием развития заболевания, ингибированием роста опухоли, уменьшением первичной и/или вторичной опухоли(ей), облегчением связанных с опухолью симптомов, улучшением качестве жизни, ингибированием факторов, секретируемых опухолью (включая специфический антиген простаты или Р8А), снижением циркуляции опухолевых клеток, задержанным появлением первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедленным развитием первичной и/или вторичной опухоли(ей), сниженной частотой возникновения первичной и/или вторичной опухоли(ей), замедленной или сниженной тяжестью вторичных эффектов заболевания, задержанным ростом опухоли и/или ремиссией опухолей, среди прочих. В определенных вариантах осуществления лечение рака предстательной железы можно оценить ингибированием фосфорилирования 86КР, 4Е-ВР1 и/или Ак! в циркулирующей крови и/или опухолевых клетках и/или биопсии кожи или биопсии/аспиратах опухоли перед, во время и/или после лечения ТОК киназным ингибитором 1-этил-7(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она. В других вариантах осуществления лечение рака предстательной железы можно оценить ингибированием активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΑ-РК) в образцах кожи и/или биопсии/аспиратах опухоли, таким как оценкой количества ρΌΝΑ-РК 82056 в качестве биомаркера путей повреждения ДНК перед, во время и/или после лечения ТОК киназным ингибитором. В одном варианте осуществления образец кожи облучают УФ-светом. В пределе, под полным ингибированием в настоящем описании понимают предотвращение или химиопрофилактику. В данном контексте термин "предотвращение" включает или предотвращение возникновения клинически выраженного рака предстательной железы в целом, или предотвращение возникновения преклинически выраженной стадии рака предстательной железы. Также предполагается, что данное определение охватывает предотвращение перерождения в злокачественные клетки или купирование или регресс предраковых клеток в злокачественные клетки. Это включает профилактическое лечение субъектов с риском развития рака предстательной железы.

- 4 029164

Способы получения ТОК киназного ингибитора.

ТОК киназный ингибитор может быть получен стандартным, хорошо известным способом синтеза, см., например, Магсй, 1. Абуапсеб Огдашс Сйеш181гу; Кеасйопз Месйашзтз, апб §1гис!иге, 4'¹' еб., 1992. Исходные вещества, пригодные в получении соединения, и, следовательно, промежуточные соединения, являются коммерчески доступными или его можно получить из коммерчески доступных веществ, используя известные способы синтеза и реагенты.

Конкретные способы получения соединения, раскрытого в настоящем описании, можно найти, например, в патентах США № 7981893, поданном 18 октября 2007 г., 7968556, поданном 18 октября 2007 г., и 8110578, поданном 26 октября 2009 г., каждый из которых включен в настоящее описание путем ссылки во всей своей полноте.

Способы применения

Настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы. В определенных вариантах осуществления ТОК киназный ингибитор вводят пациенту, который имеет местно распространенный, рецидивирующий или метастатический рак предстательной железы, не поддающийся радикальной хирургической резекции. В другом варианте осуществления ТОК киназный ингибитор вводят пациенту, который подвергался по меньшей мере одной химиотерапии предшествующей линии на основе платины. В некоторых вариантах осуществления ТОК киназный ингибитор вводят пациенту, который имеет опухоль, проявляющую сверхэкспрессию ΌΝΑ-ΡΚ.

В определенных вариантах осуществления рак предстательной железы не является ЕТ§ сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы. В определенных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой кастрационно-резистентный рак предстательной железы.

В определенных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой чувствительный к рапамицину рак предстательной железы. В определенных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой нечувствительный к рапамицину рак предстательной железы.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы, где ТОК киназный ингибитор ингибирует пролиферацию опухолевых клеток.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы, где ТОК киназный ингибитор вызывает апоптоз в опухолевых клетках.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы, где ТОК киназный ингибитор ингибирует ангиогенез в опухолевых клетках.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы, где ТОК киназный ингибитор ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, вызывает апоптоз опухолевых клеток и ингибирует ангиогенез.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам улучшения критерия рабочей группы 2 по специфическому антигену простаты (Р§А\УО2) для рака предстательной железы (см. §сйег. Н., На1аЬ, §., Таппоск, §., Мотз, М., §!егпЬегд, ΟΝ., е! а1., Ие51дп апб епб рош!5 оГ сйшса1 1па15 Гог раОепД \\ЙН ргодге551уе ргоз1а1е сапсег апб са5!га!е 1еуе1з οί 1ез1о51егопе: Кесоттепбайопз οί Иге Рго5!а!е Сапсег Сйшса1 Тпа15 ХУогктд Огоир. 1 С1ш Опсо1. 2008; (26) 1148-1159) у пациента, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора пациенту, имеющему рак предстательной железы.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак! у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту. В некоторых данных вариантах осуществления ингибирование фосфорилирования оценивают в биологическом образце пациента, таком как в циркулирующей крови и/или опухолевых клетках, биопсии кожи и/или биопсии или аспирате опухоли. В данных вариантах осуществления степень ингибирования фосфорилирования оценивают сравнением количества фосфо-§6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак! перед и после введения ТОК киназного ингибитора. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам измерения ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 или Ак! у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту, измерение количества фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак! у указанного пациента и сравнение указанного количества фосфорилированных §6КР, 4Е ВР1 и/или Ак! с количест- 5 029164

вом у указанного пациента перед введением эффективного количества ТОК киназного ингибитора.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования фосфорилирования 86ΚΡ, 4Е-ВР1 и/или Лк1 в биологическом образце пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированных 86ΚΡ, 4Е-ВР1 и/или Лк! в биологическом образце пациента, полученного перед и после введения указанного ТОК киназного ингибитора, где меньшее количество фосфорилированных 86ΚΡ, 4Е-ВР1 и/или Ак! в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного ТОК киназного ингибитора, относительно количества фосфорилированных 86ΚΡ, 4Е-ВР1 и/или Ак! в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного ТОК киназного ингибитора, показывает ингибирование.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΑ-ΡΚ) у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту. В некоторых вариантах осуществления ингибирование ΌΝΑ-ΡΚ оценивают в коже пациента, имеющего рак предстательной железы, в одном примере в образце кожи, облученной УФ-светом, указанного пациента. В другом варианте осуществления ингибирование ΌΝΑ-ΡΚ оценивают в биопсии или аспирате опухоли пациента, имеющего рак предстательной железы. В одном варианте осуществления ингибирование оценивают измерением количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ 82056 (также известной как ρΌΝΑ-ΡΚ 82056) перед и после введения ТОК киназного ингибитора. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам измерения ингибирования фосфорилирования ΌΝΑ-ΡΚ 82056 в образце кожи пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ 82056, присутствующей в образце кожи, и сравнение указанного количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ 82056 с количеством в образце кожи указанного пациента перед введением эффективного количества ТОК киназного ингибитора. В одном варианте осуществления образец кожи облучают УФ-светом.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΑ-ΡΚ) в образце кожи пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в биологическом образце пациента, полученном перед и после введения указанного ТОК киназного ингибитора, где сниженное количество фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного ТОК киназного ингибитора, относительно количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного ТОК киназного ингибитора, показывает ингибирование.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования остановки 01 у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования остановки 01 в биологическом образце пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования ρ86 у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования ρ86 в биологическом образце пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования ρΑ1<1 на по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам ингибирования ρΑ1<1 по меньшей мере на 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% или по меньшей мере 80% в биологическом образце пациента, имеющего рак предстательной железы, включающим введение эффективного количества ТОК киназного ингибитора указанному пациенту.

В вариантах осуществления ТОК киназный ингибитор представляет собой соединение 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-он, описанное в настоящем изобретении.

ТОК киназный ингибитор можно комбинировать с лучевой терапией и/или хирургической операцией. В определенных вариантах осуществления ТОК киназный ингибитор вводят пациенту, который подвергается лучевой терапии, ранее подвергался лучевой терапии или будет подвергаться лучевой терапии. В определенных вариантах осуществления ТОК киназный ингибитор вводят пациенту, который подвер- 6 029164

гался хирургическому удалению опухоли.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов, которые ранее подвергались лечению рака предстательной железы, но являются нечувствительными к стандартной терапии, а также пациентов, которые ранее не подвергались лечению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов, которые подвергались хирургической операции в попытке вылечить соответствующее заболевание, а также пациентов, которые не подвергались хирургической операции. Поскольку пациенты с раком предстательной железы могут иметь гетерогенные клинические проявления и варьирующиеся клинические результаты, лечение, оказываемое пациенту, может изменяться, в зависимости от прогноза пациента/пациентки. Врач-клиницист будет способен легко определить без чрезмерного экспериментирования конкретные вторичные агенты, типы хирургических операций и типы стандартной терапии, на основе нелекарственных средств, которые можно эффективно применять для лечения конкретного пациента с раком предстательной железы.

В одном варианте осуществления рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован Р13К/тТОК путь. В определенных вариантах осуществления рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором Р13К/тТОК путь активирован в результате потери ΡΤΕΝ, мутации Р1К3Са или сверхэкспрессии ЕОРК, или их комбинации.

Пути введения.

ТОК киназные ингибиторы можно вводить пациенту перорально или парентерально в стандартной форме препаратов, такой как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, порошок, пастилки, пилюли, суппозитории, инъекции, суспензии и сиропы. Подходящие составы можно получить обычно применяемыми способами, используя стандартные, органические или неорганические добавки, такие как эксципиент (например, сахароза, крахмал, маннит, сорбит, лактоза, глюкоза, целлюлоза, тальк, фосфат кальция или карбонат кальция), связующее (например, целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, полипропилпирролидон, поливинилпирролидон, желатин, гуммиарабик, полиэтиленгликоль, сахароза или крахмал), разрыхлитель (например, крахмал, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилкрахмал, низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, бикарбонат натрия, фосфат кальция или цитрат кальция), смазывающее вещество (например, стеарат магния, легкая безводная кремниевая кислота, тальк или лаурилсульфат натрия), ароматизатор (например, лимонная кислота, ментол, глицин или апельсиновый порошок), консервант (например, бензоат натрия, бисульфит натрия, метилпарабен или пропилпарабен), стабилизатор (например, лимонная кислота, цитрат натрия или уксусная кислота), суспендирующий агент (например, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или стеарат алюминия), диспергатор (например, гидроксипропилметилцеллюлоза), разбавитель (например, вода) и восковая основа (например, масло какао, белый вазелин или полиэтиленгликоль). Эффективное количество ТОК киназного ингибитора в фармацевтической композиции может находиться на уровне, который будет вызывать требуемый эффект; например, от приблизительно 0,005 до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента в виде единичной дозы и для перорального и для парентерального введения.

Доза ТОК киназного ингибитора, которую будут вводить пациенту, изменяется в достаточно широких пределах и может быть подобрана на усмотрение лечащего врача. В общем, ТОК киназные ингибиторы можно вводить от одного до четырех раз в день при дозе от приблизительно 0,005 до приблизительно 10 мг/кг массы тела пациента пациенту, но вышеуказанная доза может подходящим образом изменена, в зависимости от возраста, массы тела и медицинского состояния пациента и пути введения. В одном варианте осуществления доза составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,05 до приблизительно 1 мг/кг массы тела пациента, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,75 мг/кг массы тела пациента или от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,5 мг/кг массы тела пациента. В одном варианте осуществления в день вводят одну дозу. В другом варианте осуществления в день вводят две дозы. В любом указанном случае вводимое количество ТОК киназного ингибитора будет зависеть от таких факторов, как растворимость активного компонента, применяемый состав и путь введения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения заболевания или расстройства, включающим введение от приблизительно 0,375 до приблизительно 750 мг/день, от приблизительно 0,75 до приблизительно 375 мг/день, от приблизительно 3,75 до приблизительно 75 мг/день, от приблизительно 7,5 до приблизительно 55 мг/день или от приблизительно 18 до приблизительно 37 мг/день ТОК киназного ингибитора нуждающемуся в лечении пациенту. В конкретном варианте осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, включают введение 15, 30, 45 или 60 мг/день ТОК киназного ингибитора нуждающемуся в лечении пациенту. В другом варианте осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, включают введение 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 20, 25, 30 или 40 мг/день ТОК киназного ингибитора нуждающемуся в лечении пациенту.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения или предотвращения заболевания или расстройства, включающим введение от приблизительно 0,1 до приблизительно 1200 мг/день, от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг/день, от приблизительно 10 до приблизительно 1200 мг/день, от приблизительно 10 до приблизительно 100 мг/день, от приблизительно 100 до приблизительно 1200 мг/день, от приблизительно 400 до приблизительно 1200 мг/день, от приблизи- 7 029164

тельно 600 до приблизительно 1200 мг/день, от приблизительно 400 до приблизительно 800 мг/день или от приблизительно 600 до приблизительно 800 мг/день ТОК киназного ингибитора нуждающемуся в лечении пациенту. В конкретном варианте осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, включают введение 0,1, 0,5, 1, 10, 15, 20, 30, 40, 45, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 600 или 800 мг/день ТОК киназного ингибитора нуждающемуся в лечении пациенту.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к стандартным лекарственным формам, которые содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 2000 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 200 мг, от приблизительно 35 до приблизительно 1400 мг, от приблизительно 125 до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 250 до приблизительно 1000 мг или от приблизительно 500 и до приблизительно 1000 мг ТОК киназного ингибитора.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к стандартной лекарственной форме, содержащей приблизительно 0,1, 0,25, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 600 или 800 мг ТОК киназного ингибитора.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к стандартным лекарственным формам, которые содержат 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 50, 70, 100, 125, 140, 175, 200, 250, 280, 350, 500, 560, 700, 750, 1000 или 1400 мг ТОК киназного ингибитора. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к стандартным лекарственным формам, которые содержат 10, 15, 20, 30, 45 или 60 мг ТОК киназного ингибитора.

ТОК киназный ингибитор можно вводить один, два, три, четыре или более раз в день.

ТОК киназный ингибитор можно вводить перорально для удобства. В одном варианте осуществления при введении перорально ТОК киназный ингибитор вводят с едой и водой. В другом варианте осуществления ТОК киназный ингибитор растворяют в воде или соке (например, яблочном соке или апельсиновом соке) и вводят перорально в виде суспензии. В другом варианте осуществления при введении перорально ТОК киназный ингибитор вводят натощак.

ТОК киназный ингибитор можно также вводить внутрикожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, чрескожно, внутривенно, подкожно, интраназально, эпидурально, сублингвально, интрацеребрально, интравагинально, трансдермально, ректально, мукозально, путем ингаляции или местно в уши, нос, глаза или кожу. Способ введения оставляют на усмотрение практикующего врача, и он может зависеть отчасти от места патологии.

Действие ТОК киназного ингибитора можно отсрочить или продлить подходящим формулированием. Например, медленно растворяемые гранулы ТОК киназного ингибитора можно получить и вводить в таблетку или капсулу, или в виде имплантируемого устройства с медленным высвобождением. Способ также включает получение пеллет, имеющих различные скорости растворения, и заполнение капсул смесью данных пеллет. Таблетки или капсулы можно покрывать пленкой, которая препятствует растворению в течение прогнозируемого периода времени. Даже парентеральные препараты можно получить долгодействующими, путем растворения или суспендирования ТОК киназного ингибитора в масляных или эмульгированных средах, которые обеспечивают их медленное распределение в сыворотке.

Примеры

Исследования ίη νίίτο.

РС-3 и НеЬа клеточные линии, описанные в настоящем изобретении, получали из американской коллекции тканевых культур (АТСС). Клетки выращивали в среде для выращивания культур, как рекомендовано поставщиком.

РС-3 опухолевые клетки высевали 250000 клеток/лунку в 6-луночный планшет и уравновешивали в течение ночи в 5% СО₂ при 37°С. Для обработки среду отсасывали, удаляя мертвые/плавающие клетки перед добавлением 3 мл среды с или без соединения. Клетки выдерживали в присутствии контрольного плацебо (ЭМ§О, 0,2%) или соединения 1 (0,5, 1 или 5 мкМ) в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали для анализа клеточного цикла. Среду переносили в 15 мл пробирку. Клетки трипсинизировали и переносили в ту же пробирку. Затем клетки центрифугировали при 12000 об/мин, повторно суспендировали в 500 мкл буфера для окрашивания, содержащего пропидиййодид (Р1), и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Затем образец анализировали на приборе РАСЗСайЪег. Эксперименты по исследования клеточного цикла проводили в двух независимых экземплярах.

Исходные данные, собранные ΒΌ РАС8 СайЪиг, анализировали программным обеспечением для исследования клеточного цикла ΜοάΡίί ЬТ (УегПу 5>оП\уаге Ноше, 1пс). Гистограмму получали, применяя параметры автоматического анализа. Все цифры, полученные ΜοάΡίί ЬТ, переносили в Мюгокой Ехсе1 и строили по ним график.

Эффекты соединения 1 на распределение клеточного цикла оценивали, применяя окрашивание Р1 на основе проточной цитометрии. Как показано на фиг. 1, показано сравнение ДНК гистограмм для необработанных НеЬа и РС-3 клеток. РС-3 клетки показывают анеуплоидный фенотип, который является очевидным в сравнении с НеЬа клетками.

Перераспределение РС-3 клеток по клеточному циклу в ответ на воздействие соединения 1 при 0,5 и 5 мкМ по сравнению с ИМ§О контролем показано на фиг. 2. В данном эксперименте, по-видимому, нет пика суб-01, указывающего на апоптоз при обеих концентрациях соединения 1. Обе концентрации со- 8 029164

единения 1 обладали заметным эффектом на клеточный цикл, показывая остановку 04. Количественная оценка данных экспериментов показана в табл. 1.

Таблица 1

	Концентрация (мкМ)	%С1	N	% ΟΙ а.	N
ϋΜ5Ο		59, 9	2	63	2
Соединение 1	0,5	81,1	2	79	2
Соединение 1	1	88,6	2	84, 8	2
Соединение 1	5	89,2	2	83, 9	2

Соединение 1 оценивали на его влияние на распределение клеточного цикла РС-3 клеток. При концентрациях, соответствующих концентрациям, требуемым для того, чтобы вызвать ингибирование роста данной клеточной линии, соединение 1 было способно вызывать остановку О1. Это, по-видимому, не вызвано активацией апоптоза.

Определение клеточного профиля соединения 1 в чувствительных и нечувствительных к рапамицину клеточных линиях.

План исследования.

Антипролиферативную активность соединения 1 оценивали в клеточной линии опухоли простаты. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и после уравновешивания в течение ночи подвергали воздействию в течение 3 дней 0,05, 0,15, 0,5, 1,5 и 5 мкМ концентраций соединения 1. При необходимости, концентрации соединения 1 повышали до 20 мкМ. Ингибирование роста рапамицином определяли в тех же условиях в диапазоне концентраций 0,01-1 мкМ или 0,1-10 мкМ, в зависимости от клеточной линии. Все испытуемые лунки были в трех экземплярах на планшете и в конечном объеме 200 мкл. Конечная концентрация ИМ8О во всех лунках составляла 0,2%. Ингибирование роста определяли путем сравнения соединения 1 с ИМ8О контролем и степенью клеточной пролиферации, измеренной Ш8Т-1. Все эксперименты по ингибированию роста повторяли в различных случаях по меньшей мере дважды. Эффективность определяли из расчета 1С₅₀ величины из данных, описывающих кривую ингибирования роста. Эталонное соединение включали в каждый планшетный анализ, отслеживая изменения в анализе, и 1С₅₀ эталона применяли как часть критерия приемлемости для данного анализа.

Внутриклеточное ингибирование тТОК пути или соединением 1, или рапамицином в диапазоне концентраций отслеживали по прямым и последующим в цепи субстратам ТОКС1 и ТОКС2 комплексов, которые обладают тТОК киназной активностью. Клетки высевали, как для анализа на пролиферацию, и подвергали воздействию или соединения 1 или рапамицина в течение 1 ч перед анализом на различные фосфобелки. Прямой субстрат для ТОКС1 представлял собой 4Е-ВР1 (Т46), и опосредованный последующий в цепи субстрат представлял собой 86КР (8235/8236). Прямой субстрат для ТОКС2 представлял собой Лк! (8473), и измеренные опосредованные последующие в цепи субстраты представляли собой Ο8Κ3β (89) и РКА840 (Т246). Кроме того, отслеживали статус фосфорилирования А1<1 (Т308), сайт фосфорилирования ΡΌΚ1.

Анализ клеточной пролиферации.

Ингибирующий рост эффект соединения 1 и рапамицина определяли следующим способом: клетки высевали в 180 мкл ростовой среды в 96-луночном плоскодонном планшете (Соз1аг Са1а1од ^итЪег 33595; оптимальную густоту посева определяли заранее) и уравновешивали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи. На следующий день разбавления соединения 1 или рапамицина получали из 10 мМ исходного раствора первым разбавлением до подходящей концентрации в 100% ИМ8О, и затем разбавлением 1:50 в ростовой среде. Затем соединение добавляли к обозначенной лунке при разбавлении 1:10 (т.е., 20 мкл разбавленного соединения добавляли к 180 мкл культуральной среды в каждой лунке). Конечное разбавление соединения составляло 1:500, которое давало конечную концентрацию в ИМ8О 0,2% в каждой лунке. Все концентрации получали в трех экземплярах. Кроме того, каждый испытуемый планшет содержал клетки, обработанные эталонным соединением для того, чтобы оценить коэффициент вариации для серии анализов, и полученную 1С₅₀ применяли в качестве критерия принятия испытуемых данных. Коэффициент вариаций для анализа пролиферации клеток с эталонным соединением на РС-3 клетки составлял 21,5% (п=100). Стандартные испытуемые концентрации для соединения 1 составляли 5, 1,5, 0,5, 0,15, 0,05 и 0,015 мкМ и для рапамицина составляли 1,5, 0,5, 0,15, 0,05, 0,015 и 0,005 мкМ. Клетки подвергали воздействию испытуемых соединений в течение 3 дней в 5% СО₂ при 37°С. Ш8Т-1 анализ применяли для измерения пролиферации клеток, исходя из измерения метаболической активности посредством восстановления тетразолиевой соли до формазановых солей. ^8Т-1 анализ представляет собой одностадийный анализ, не требующий стадий промывки. В конце 3-дневного инкубирования 20 мкл Ш8Т-1 добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 1 ч при 5% СО₂ при 37°С. Поглощение измеряли при 450 нм на многофункциональном сканирующем спектрофотометре для прочтения планшетов У!С- 9 029164

ТОК™ х2 (Регк1пЕ1тег).

Исходные данные сохраняли в виде текстового файла и затем вводили в Άοΐίνίίγ Ваке (8АК на основе клеток; РгоШ-МТТ, МТТ-6р1-5р1а1ек ипПхеб й!.Уегк1оп2). Программное обеспечение (ХЬй! от ГОВ8) рассчитывало ингибирование в процентах при каждой концентрации соединения путем нормализации к величинам ΌΜ8Ο контроля для каждого набора лунок в трех экземплярах.

Строили кривые ингибирования в процентах, и рассчитывали 1С₅₀ величины.

Определение фосфо-Ак! (8473), фосфо-Ак! (Т308) и фосфо-86КР (8235/8236) из клеточных лизатов и эффект соединения 1 или рапамицина.

Μ8Ό® анализы на обнаружение биомаркеров обеспечивают быстрый и удобный способ измерения суммарного и фосфорилированного количества белковых мишеней в одном образце небольшого объема. Данные анализы имеются в наличии и в одноплексном и мультиплексном форматах. В одноплексном анализе антитело для конкретной белковой мишени наносят в качестве покрытия на один электрод (или область) на лунку. В мультиплексном анализе, матрицу иммобилизованных антител относительно различных мишеней наносят в различные области в одной лунке. Одноплексный анализ или для фосфо-Ак!, или для фосфо-86КР представляет собой сэндвичевый иммуноанализ. Μ8Ό обеспечивает планшет, который предварительно покрыт иммобилизованным антителом. Образцы (клеточные лизаты) добавляют к каждой лунке с раствором, содержащим меченное для детекции антитело, меченное электрохемилюминесцентным (ЕСЬ) соединением, меткой Μ8Ό 8иЬРО-ТАО™, в течение одного или более периодов выдерживания. Суммарный Ак! или 86КР, присутствующий в образце, связывается с иммобилизованными антителами, иммобилизованными на поверхности рабочего электрода; прирост меченого антитела для детекции связанным фосфо-Ак! или фосфо-86КР укомплектовывает сэндвич. Добавляют Μ8Ό буфер считывания, который обеспечивает подходящее химическое окружение для ЕСЬ, и планшет считывают, применяя формирователь изображения Μ8Ό 8ЕСТОК™. Снаружи формирователя изображения 8ЕСТОК, к электродам планшета прикладывают напряжение, что вызывает связывание меток с электродной поверхностью, излучая свет. Прибор измеряет интенсивность излучаемого света, обеспечивая количественную величину фосфорилированных Ак! или 86КР, присутствующих в образце.

Клетки высевали при требуемой плотности и обрабатывали или соединением 1, или рапамицином в диапазоне концентраций в течение 1 ч в 5% СО₂ при 37°С. Соединение 1 применяли при тех же концентрациях, как для анализа на пролиферацию. Рапамицин применяли при концентрациях от 0,001 до 100 нМ в анализе для р-86КР (8235/8236) из-за его высокой активности в данном конкретном анализе. После периода инкубирования культуральную среду аккуратно удаляли отсасывающим устройством. Планшет помещали на лед и добавляли к каждой лунке 50 мкл 1х Тйк лизирующего буфера. Планшет помещали в встряхиватель при 4°С в течение 1 ч, лизируя клетки. На данном этапе планшет или замораживали при 80°С для последующего применения или анализировали на фосфобелки. Как для анализа на пролиферацию клеток, стандартный образец включали в данный анализ для РС-3 клеток, и коэффициент вариаций для анализа р-86КР (8235/8236) составлял 9,3% (п=50) и для анализа на р-Ак! (8473) составлял 28,6% (п=50).

Аналитический планшет выдерживали с 150 мкл Μ8Ό блокирующего раствора в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза Тйк промывочным буфером. Затем 35 мкл клеточного лизата добавляли к лункам и инкубировали в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре. Раствор удаляли из лунок и планшет промывали три раза промывочным буфером. Затем добавляли к каждой лунке 150 мкл 1х Μ8Ό буфера считывания Т. Планшет считывали на сканирующем спектрофотометре для прочтения планшетов 8ЕСТОК. Ехсе1 данные переносили в базу активностей и рассчитывали 1С₅₀ величины.

Определение фосфо-О8К33 (89), фосфо-РКА840 (Т246) и фосфо-4Е-ВР1 (Т46) и эффекта соединения 1 или рапамицина.

Мультиплексный формат анализа Ьитшех отличается от общепринятого твердофазного иммуносорбентного анализа (ЕЬ18А) тем, что мультиплексное иммобилизованное антитело присоединено к полистирольным шарикам, тогда как ЕЬ18А иммобилизованное антитело присоединено к лунке микропланшета. Применение технологии на основе суспензии шариков обеспечивает мультиплексные возможности анализов Ьиттех. В технологии хМАР® применяют 5,6-микронные полистирольные микросферы, которые окрашены внутри красными и инфракрасными флуорофорами различающихся интенсивностей. Каждому шарику дается уникальный номер или область шарика, обеспечивая различение одного шарика от другого. Шарики, ковалентно присоединенные к различным специфическим антителам, можно смешивать в одном анализе, применяя формат 96-луночного микропланшета. После завершения сэндвичевого иммуноанализа шарики можно считывать, применяя систему детекции Ьиттех 100™ или Ьцт1пех 200, по одному двойными лазерами для классификации и получения количественных величин для каждого анализируемого образца. Применяемый фосфо 5-плексный набор для Ак!-пути позволяет одновременно измерять несколько маркеров, включая р-О8К33 (89), р-РКА840 (Т246) и р-4Е-ВР1 (Т46).

Клетки высевали при требуемой плотности и обрабатывали или соединением 1. или рапамицином в диапазоне концентраций в течение 1 ч в 5% СО₂ при 37°С. Соединение 1 и рапамицин применяли при тех

- 10 029164

же концентрациях, что и для анализа на пролиферацию. Как для анализа на пролиферацию клеток, стандартный образец включали в анализ для РС-3 клеток, и коэффициент вариаций для анализа ρ-Ο§Κ3β(§9) составлял 37,8% (п=30), р-РРА§40 (Т246) составлял 27,8% (п=30) и для р4Е-ВР1 (Т46) составлял 13,5% (п=4). Среду отсасывали из лунок и планшет помещали на лед. Затем 35 мкл лизирующего буфера добавляли к каждой лунке и инкубировали на льду в течение по меньшей мере 30 мин. В процессе инкубирования получали стандартную кривую для каждого фосфобелка. Полученные стандарты растворяли и получали серийные разбавления согласно инструкциям производителя. В конце стадии лизирования клеток 36 мкл лизата переносили в планшет с У-дном и центрифугировали при 4°С при 2000 об/мин в течение 5 мин. В процессе этого получали растворы и 1х Ьит1пех шарика и 1х детекторного антитела. Раствор 1х шариков встряхивали и 25 мкл добавляли к каждой лунке черного круглодонного планшета. Затем 50 мкл 1х детекторного антитела добавляли к каждой лунке. 50 мкл полученных растворов добавляли к обозначенным лункам. Затем 25 мкл разбавителя для анализа добавляли к каждой лунке, обозначенной для клеточных лизатов, обработанных соединением. В конце центрифугирования 25 мкл клеточного лизата добавляли к соответствующим лункам черного аналитического планшета. Аналитический планшет накрывали белой крышкой для планшетов и инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре на орбитальном встряхивателе.

Приблизительно за 10-15 мин до конца первого инкубирования получали раствор вторичного антитела согласно протоколу разработчика. Козий антикроличий Р-фикоэритриновый красный флуоресцентный белок (РРЕ), поставляемый в виде 10х концентрата, разбавляли, получая 1х исходный раствор козьего антикроличьего РРЕ. 96-луночном фильтр-планшет предварительно смачивали 200 мкл 1х рабочего раствора для промывки. В конце 3-часового инкубирования многоканальную пипетку использовали для переноса всех компонентов из каждой лунки для анализа в лунки фильтра-планшета. Жидкость из лунок удаляли аспирацией вакуумным коллектором. Затем 200 мкл 1 х рабочего раствора для промывки добавляли к каждой лунке. Раствор для промывки отсасывали, применяя вакуумный коллектор, через 15-30 с. Данную стадию промывки повторяли один раз. Дно планшета промокали чистыми бумажными салфетками, удаляя остаточную жидкость. 100 мкл разбавленного антикроличьего РРЕ добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре на орбитальном встряхивателе. Затем жидкость отсасывали вакуумным коллектором. Затем добавляли к каждой лунке 200 мкл 1 х рабочего раствора для промывки. Планшеты промывали три раза раствором для промывки. Планшет промокали чистыми бумажными салфетками, удаляя оставшуюся жидкость. Затем 100 мкл 1х рабочего раствора для промывки добавляли к каждой лунке для повторного суспендирования шариков. Затем планшеты считывали на системе для детекции Ьит1пех 200. Данные Ехсе1 переносили в базу активностей и рассчитывали 1С₅₀ величины.

Все данные анализировали, используя ХЬй! от ГОВ§.

Формула, применяемая для определения 1С₅₀ в ХЬй1, представляла собой модельное число 205, которое применяет логистическую модель с 4 параметрами или сигмоидальную модель зависимости эффекта от дозы, рассчитывая 1С₅₀ величины. 1С₅₀ величины приводят в виде среднего, за исключением анализов, которые осуществляли только один раз. 1С₅₀ величины, полученные для нескольких экспериментов, должны быть в 2,5-кратных пределах друг друга, для того чтобы быть принятыми (для п=2), или в 2,5-кратных пределах среднего (для п>2), для того чтобы быть принятыми в качестве допустимой 1С₅₀.

Результаты.

Эффективность ингибирования роста или соединением 1, или рапамицином определяли для РС-3 клеточной линии. В пределах диапазона концентраций, применяемого для рапамицина, наблюдали относительно постоянный эффект "плато". Поскольку настоящие данные не облегчали определение 1С₅₀ величины из кривой ингибирования роста, относительные чувствительности, исходя из активности рапамицина, определяли в виде 0-45% остатка = чувствительная, 46-69% остатка = частичная и 70-100% остатка = устойчивая.

Активность ТОРС1 комплекса можно оценить на основе статуса фосфорилирования 4Е-ВР1 (Т46), прямого субстрата тТОР киназы и §6РР (§235/8236), последующего в цепи субстрата тТОР. Активность ТОРС2 комплекса можно оценить непосредственно из статуса фосфорилирования Лк1 (§473) и опосредованно из статуса фосфорилирования Лк1 субстратов, 0§Κ3β (§9) и РРА§40 (Т246). Эффективности ингибирования соединением 1 молекулярных фосфобиомаркеров тТОР пути, анализируемых при молекулярной концентрации в РС-3 клетках рака предстательной железы, показаны в таблице 2. Эффективность ингибирования соединением 1 конкретных биомаркеров 4Е-ВР1 (Т46), §6РР (§235/8236) и Ак1 (§473) для тТОР пути сравнивали с рапамицином. Данные, показанные на фиг. 4, иллюстрируют стандартные кривые зависимости эффекта от дозы для соединения 1 и рапамицина для 4ЕВР1. Рапамицин показывал заметную эффективность в пикомолярном диапазоне для ингибирования опосредованного субстрата, §6РР (§235/§236), субстрата р70§6 киназы, который непосредственно активируется ТОРС1 комплексом. 1С₅₀ величины для рапамицина составляли 19 и 29 пМ для ингибирования фосфорилирования §6РР (§235/§236) в РС-3 клетках. Однако один из прямых ТОРС1 субстратов 4Е-ВР1 (Т46) не был ингибирован рапамицином вплоть до концентрации 10 мкМ. Соединение 1 ингибировало фосфорилиро- 11 029164

вание и прямого субстрата, и последующего в цепи субстрата при субмикромолярных концентрациях. Как ожидалось, рапамицин не ингибировал фосфорилирование Ак! (8473) (данные не показаны), прямой субстрат ТОКС2 комплекса, для которого известно, что рапамицин не действует. Как показано в табл. 2, соединение 1 было способно давать субмикромолярные 1С₅₀ величины для ингибирования и ТОКС1, и ТОКС2 прямого и опосредованного субстратов и показывало субмикромолярную 1С₅₀ величину для ингибирования роста в РС-3 клеточной линии рака предстательной железы.

Таблица 2

	РСЗ
Р-4Е-ВР1(Т4б)	0,41 (п=2)
р-56КР(5235/5236)	0, 02 (п=3)
р-Акб (5473)	0, 01 (п=2)
ρ-65Κ3β (59)	0,23 (п=3)
Р-РНА540 (Т246)	0, 14 (п=4)
р-Акк(Т308)	0, 13 (п=2)
1С₅о ингибирования роста соединением 1	0, 11

Опосредованные маркеры ингибирования ТОКС2, Θ8Κ3β (89) и РКА840 (Т246) менее эффективно были ингибированы в результате обработки соединением 1, по сравнению с эффектом на Ак! (8473). Полная активация Ак! требует дополнительного фосфорилирования Т308, которое осуществляют ΡΏΚ1, и предполагают, что она является созависимой с ТОКС2 фосфорилированием Ак! (8473). Указание на это предполагается данными, но требуется дополнительно подтверждение.

Выводы.

Потенциал ингибирования роста определяли для соединения 1 в РС-3 клетках. Применяя специфические молекулярные фосфобиомаркеры ТОКС1 активности (4Е-ВР1 (Т46) непосредственно и опосредованно 86РР (8235/8236)) и ТОКС2 (Ак! (8473) непосредственно и опосредованно Θ8Κ3β (89) и РКА840 (Т246)), было показано, что соединение 1 ингибирует тТОК киназную мишень в клетке в обоих указанных комплексах. Интересно, что рапамицин был способен ингибировать только опосредованный маркер ТОКС1 активности и не влиял на фосфорилирование прямого субстрата 4Е-ВР1 (Т46), и рапамицин не ингибировал киназную активность ТОКС2 комплекса, в подтверждение предыдущим отчетам. По сравнению с ингибирующей рост активностью рапамицина, соединение 1 обладает способностью давать, в зависимости от формы кривых зависимости эффекта от дозы, различный тип антипролиферативной активности ίη νότο.

Ιη νί!ίο исследование соединений формулы (III).

Соединения формулы (III) давали аналогичную эффективность относительно соединений формулы (I) (табл. 3). Эти аналоги сохраняли селективность относительно тТОК по сравнению с родственной липидной киназой ΡΒΚ-α, сохраняя от 65 до >500-кратную селективность относительно тТОК. Оказалось, что в РС-3 клеточных линиях рака предстательной железы, соединения являются ингибиторами обоих тТОК комплексов, как измерено путем ингибирования р86 (тТОКС1) и рАк!8473 (тТОКС2). Также наблюдали ингибирование клеточной пролиферации в виде функционального эффекта ингибирования пути тТОК в данных клетках.

- 12 029164

Таблица 3

Аналог	Структура	тТОК 1С50 (мкМ)^ь	ΡΙ3Κα 1С50 (мкМ)^ь	РСЗ клеточная активность
рЗ б 1С50 (мкМ)^ь	рАкк 1С50 (мкМ)^ь	Пролиф. 1С50 (мкМ)^ь
Соединение 3	О Τχ ( ^Ν гЭ /	0, 002	1,38	0, 040	0, 018	0,224
Соединение 4	0 ΗΝ-Ν V 4 к ί ^Ν ΙίΑ ’ Η	0, 008	0,526	0, 046	0, 034	0, 148
Соединение 5	а» Ц ^Η0 иьи ΙΧ>°	0, 176	>30^с	2,41	2,55	4, 18^е
Соединение б	ΛΑ Ύ Σ 1 Η	0, 106	>30^с	0,386	0,315	1,55

^ь: Среднее 2 или более экспериментов.

Несмотря на то что аналоги, такие как соединение 3 и соединение 4, показали низкую наномолярную целевую эффективность и соответствующую клеточную эффективность, они в основном имели недостатком низкую пероральную биодоступность. Сравнение подобранной пары соединения 5 и соединения 6 показывает, что увеличенное кольцевое ядро дает повышенную клеточную эффективность, как оценено и анализами на биомаркеры, и анализами на пролиферацию, относительно исходного имидазо[4,5-Ь]пиразин-2-она. Соединение 6 также показало превосходную пероральную биодоступность на грызунах, учитывая исследование тТОК киназы в ιη νίνο системах.

Соединение 6 дополнительно исследовали на суммарную киназную селективность. При испытании в одноточечном анализе относительно 249 киназ, только одна киназа, отличная от тТОК, была ингибирована на >80% при 10 мкМ. Построение кривых зависимости эффекта от концентрации для данной одной киназы, РМ8, давало 1С₅₀ величину 2,70 мкМ. Противоопухолевая активность соединения 6 в РС-3 ксенотрансплантатной модели первоначально определяли, применяя ряд режимов перорального дозирования; один или два раза в день или каждый второй день. Соединение 6 значительно ингибировало рост опухоли РС-3 при данных режимах дозирования (фиг. 5А). Активность дополнительно исследовали, применяя ряд уровней доз с режимом дозирование один раз в день. В данном исследовании, соединение 6 значительно ингибировало рост опухоли зависящим от дозы способом, демонстрируя 18, 63 и 84% ингибирование объема опухоли по сравнению с плацебо в качестве контроля при 10, 25 и 50 мг/кг соответственно (фиг. 5В). Соединение хорошо переносилось при всех уровнях доз и режимах введения после 3 недель обработки.

Для того чтобы определить степень ингибирования тТОК пути и РК/ΡΏ соотношение, мышам с РС-3 опухолью вводили единичную дозу соединения 6 и образцы плазмы и опухоли собирали в различные моменты времени для анализа. Наблюдали значительное ингибирование маркеров тТОК пути, р86 и рАк{8473, что указывало на то, что противоопухолевая активность опосредована ингибированием и тТОКС1 (р86), и тТОКС2 (рАк{8473). При введении дозы 100 мг/кг соединение 6 достигало полного ингибирования биомаркеров в модели опухоли РС-3 в течение 24 ч, и концентрация соединения и в опухоли и в плазме была более чем в 10 раз выше 1С₅₀ величины биомаркера в клетке через 24 ч. При введении 30 мг/кг соединения 6 р86 ингибирование сохранялось равным 87-93% через 2-8 ч, с 43% ингибированием через 24 ч (фиг. 5А). Аналогично, ингибирование рАк{8473 через 2-8 ч составляло 53-77% и падало до 28% через 24 ч (фиг. 5В). Данные степени ингибирования биомаркеров хорошо согласовывались с концентрацией соединения в плазме и опухоли, которое практически полностью выводилось через 24 ч (фиг. 6).

- 13 029164

Ιη νίΐΓΟ исследования соединения 2.

Антипролиферативная активность.

Антипролиферативную активность соединения 2 оценивали в клеточной линии опухоли предстательной железы. Клетки высевали в 96-луночные планшеты, и после периода уравновешивания в течение ночи, подвергали воздействию в течение 3 дней 0,05, 0,15, 0,5, 1,5 и 5 мкМ концентраций соединения 2. Степень клеточной пролиферации измеряли, применяя νδΤ-1 анализ, и ингибирование роста определяли путем сравнения образцов, обработанных соединением 2, с ИМ§О контролем. Все эксперименты ингибирования роста повторяли в различных случаях по меньшей мере дважды. Эффективность определяли расчетом 1С₅₀ величины, применяя данные, описывающие кривую ингибирования роста. Эталонное соединение включали в каждый планшетный анализ, отслеживая вариативность результатов разных анализов, и 1С₅₀ величину для эталонного соединения применяли как часть критерия приемлемости для данного анализа.

Внутриклеточное ингибирование тТОК пути.

Внутриклеточное ингибирование тТОК пути соединением 2 в диапазоне концентраций оценивали в РС-3 клетках отслеживанием прямых и последующих в цепи субстратов комплексов тТОКС1 и тТОКС2, которые оба обладают тТОК киназной активностью. Клетки высевали как для анализа на пролиферацию и подвергали воздействию соединения 2 в течение 1 ч перед анализом на различные фосфобелки. Прямой субстрат для тТОКС1 представлял собой 4Е-ВР1 (Т46), и опосредованный последующий в цепи субстрат представлял собой §6КР (§235/8236). Прямой субстрат для тТОКС2 представлял собой Ак! (§473), и измеренные опосредованные последующие в цепи субстраты представляли собой 0§Κ3β(§9) и РКА§40 (Т246). Кроме того, отслеживали статус фосфорилирования Ак! (Т308), сайт фосфорилирования для ΡΌΚ1. Строили кривые зависимости эффекта от концентрации, и определяли 1С₅₀величины.

Анализ клеточной пролиферации - \У§Т-1.

Ингибирующий рост эффект соединения 2 определяли следующим образом: клетки высевали в 180 мкл ростовой среды в 96-луночном плоскодонном планшете (Сов!ат Са!а1од ИитЬет 33595) при заданной плотности (РС-3: 3000 клетки/лунка) и уравновешивали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи.

На следующий день, разбавления соединения 2 получали из 10 мМ исходного раствора первым разбавлением до подходящей концентрации в 100% ИМ§О и затем разбавляли 1:50 в ростовой среде. Затем соединение добавляли к обозначенной лунке при разбавлении 1:10 (т.е. 20 мкл разбавленного соединения добавляли к 180 мкл культуральной среды в каждой лунке). Конечное разбавление соединения составляло 1:500, которое давало конечную ИМ§О концентрацию 0,2% в каждой лунке. Все концентрации получали в трех экземплярах. Кроме того, каждый испытуемый планшет содержал клетки, обработанные эталонным соединением для того, чтобы оценить вариативность результатов разных анализов, и полученную 1С₅₀ величину применяли в качестве критерия принятия испытуемых данных. Коэффициент вариаций для анализа клеточной пролиферации с эталонным соединением в РС-3 клетках составлял 21,5% (η=100). Стандартные испытуемые концентрации для соединения 2 составляли: 5, 1,5, 0,5, 0,15 и 0,05 мкМ.

Клетки подвергали воздействию испытуемых соединений в течение 3 дней в 5% СО₂ при 37°С. Клеточную пролиферацию оценивали, применяя \У§Т-1 анализ, который основан на измерении метаболической активности посредством восстановления тетразолиевых солей до формазановых солей. \У§Т-1 анализ представляет собой одностадийный анализ, не требующий стадий промывки. В конце 3-дневного инкубирования, 20 мкл ^§Т-1 добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 1 ч при 5% СО₂ при 37°С. Поглощение измеряли при 450 нм на многофункциональном сканирующем спектрофотометре для прочтения планшетов У1СТОК™ х2 (Регк1пЕ1тег). Исходные данные сохраняли в виде текстового файла, и затем вводили в базу активностей (§АК на основе клеток; РгоПГ-МТТ, МТТ-6р!-5р1а!ев ипйхеб й1.Ует5Юп2). Программное обеспечение (ХЬй! от ГОВ§) рассчитывало ингибирование в процентах при каждой концентрации соединения путем нормализации к величинам ИМ§О контроля для каждого набора лунок. Процент ингибирования определяли для каждого повтора и 3 значения усредняли для каждого набора из трех лунок. Строили кривые ингибирования в процентах и рассчитывали 1С₅₀ величины.

Определение фосфо-Ак! (§473), фосфо-Ак! (Т308), фосфо-§6КР (§235/8236), фосфо-О8К3Ье!а (§9) и фосфо-РКА§40 (Т246) в клеточных лизатах.

Клетки высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты при требуемой плотности (РС-3 клетки/лунка) и клетки уравновешивали при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи. На следующий день клетки обрабатывали соединением 2 в диапазоне концентраций в течение 1 ч в 5% СО₂ при 37°С. Соединение 2 испытывали при следующих концентрациях: 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0,01 мкМ. После периода инкубирования культуральную среду аккуратно удаляли отсасывающим устройством. Планшет помещали на лед, и добавляли к каждой лунке 50 мкл 1х Тйв лизирующего буфера. Планшет помещали на встряхиватель при 4°С в течение 1 ч, лизируя клетки. На данном этапе, планшет или замораживали при -80°С для последующего анализа, или непосредственно анализировали на фосфобелки, как описано ниже. Отслеживая вариативность результатов разных анализов, стандартный образец включали в анализ для РС-3 клеток, и

- 14 029164

коэффициент вариаций для анализа р-86КР (8235/8236) составлял 9,3% (п=50), и для анализа ρ-Ак! (8473) составлял 28,6% (п=50).

Аналитический планшет выдерживали с 150 мкл Μ8Ό блокирующего буфера в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза Тгй промывочным буфером. Затем 35 мкл клеточного лизата добавляли к лункам и инкубировали в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре. Раствор удаляли из лунок и планшет промывали 3 раза промывочным буфером. Затем 25 мкл раствора подходящего антитела инкубировали в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре. Раствор удаляли из лунок и планшет промывали 3 раза промывочным буфером. Затем добавляли к каждой лунке 150 мкл 1х Μ8Ό буфера считывания Т. Планшет считывали на сканирующем спектрофотометре для прочтения планшетов 8ЕСТОК.

Определение р-4Е-ВР1 (Т46) в клеточных лизатах.

Клетки высевали при требуемой плотности, как описано в предшествующем параграфе, описывающем мезомасштабные анализы. Клетки обрабатывали соединением 2 в диапазоне концентраций в течение 1 ч в 5% СО₂ при 37°С. Соединение 2 испытывали при следующих концентрациях: 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 и 0,01 мкМ. После выдерживания с соединением культуральную среду удаляли отсасыванием. Затем планшет помещали на лед и добавляли к каждой лунке 35 мкл буфера 1п\т1годсп для экстракции клеток (содержащего свежий РМ8Р и коктейль ингибиторов протеаз). Обработанные клетки подвергали лизису в сумме в течение 30 мин на льду, и затем встряхивали в течение 2 мин при 4°С. На данном этапе планшет можно было или замораживать при -80°С для последующего анализа, или анализировать непосредственно набором для анализа 1пуйгодеп 4Е-ВР1 [рТ46].

Стандарты получали согласно предоставленному протоколу, и 100 мкл каждого стандарта добавляли к соответствующим лункам. Образцы, содержащие только буфер для экстракции клеток или только буферы для разбавления, также включали для фонового контроля. Затем 85 мкл стандартного буфера для разбавления добавляли к каждой лунке для испытуемых лизатов. После завершения лизиса клеток 15 мкл каждого испытуемого лизата добавляли к соответствующим лункам ЕЫ8А планшета для конечного объема 100 мкл. Планшет аккуратно встряхивали, распределяя испытуемые лизаты, и затем выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего содержимое декантировали и промывали 4 раза 1х буфером для промывки. Затем 100 мкл антитела для детекции (анти-4Е-ВР1 [рТ46]) добавляли к каждой лунке и аккуратно встряхивали, распределяя. Выдерживание с антителом для детекции в течение 1 ч осуществляли при комнатной температуре в темноте (без встряхивания). Затем содержимое планшета декантировали, и планшет промывали 4 раза 1х буфером для промывки. Затем 100 мкл антикроличьего 1§О-НКР добавляли к каждой лунке, аккуратно встряхивали для распределения и выдерживали в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте (без встряхивания). Затем содержимое планшета декантировали, и планшет промывали 4 раза 1 х буфером для промывки. Затем 100 мкл стабилизированного хромогена добавляли к каждой лунке, аккуратно встряхивали, и обеспечивали реакцию в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре (без встряхивания). Через 20 мин добавляли 100 мкл стоп-раствора, останавливая реакцию, как подтверждено изменением цвета с голубого на желтый. Поглощение измеряли при 450 нМ на многофункциональном сканирующем спектрофотометре для прочтения планшетов У1СТОК™ х2 (Регкт Е1тег).

Определение фосфо-^NΑ-РК (82056) в клеточных лизатах.

1 млн клеток высевали в каждой лунке 6-луночного планшета. Клетки обрабатывали соединением 2 при следующих концентрациях: 10, 3, 1 и 0,3 мкМ в течение 4 ч в 5% СО₂ при 37°С. После инкубирования с соединением культуральную среду удаляли отсасыванием и клетки промывали РВ8. Затем планшет помещали на лед и добавляли к каждой лунке 100 мкл буфера К1РА (содержащего Р1ю8ТОР и коктейль ингибиторов протеаз). Клетки соскабливали и суспензию переносили в холодные пробирки ЕррепбогГ и подвергали лизису в течение в сумме 30 мин на льду. Затем лизаты центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 мин при 4°С, удаляя клеточный дебрис. Затем очищенный лизат переносили в новую охлажденную пробирку ЕррепбогГ.

Концентрацию белка лизатов определяли белковым анализом Вю-Каб (Вю-Каб: каталожный номер 500-0001). Затем 40 мкг белка из каждого лизата смешивали с БЭ8 загрузочным буфером и восстанавливающим агентом (оба до 1х конечной концентрации) и нагревали в течение 10 мин при 70°С. Затем образцы загружали 3-8% Тгй-ацетатный гель на NиРΑΟЕ №уе\ и прогоняли в 1х Тгй-ацетатном 8Ό8 подвижном буфере в течение 1 ч при 150 В. Антиоксидант (500 мкл) загружали на верхнюю буферную камеру ХСе11 8игеЬоск™ М1ш-Се11, как описано в протоколе для геля. Затем белок переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя раствор 1х NиРΑΟЕ буфера для блоттинга/20% метанола при 4°С (100 В в течение 1,5 ч). Затем мембрану промывали РВ8 и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре в растворе 1:1 блокирующего буфера Обу88еу и РВ8. Затем первичное антитело для детекции фосфорилированной ^NΑ-РК по серину 2056 разбавляли 1:1000 в блокирующем буфере/0,1% Т\уееп-20. βАктин использовали в качестве контроля загрузки и разбавляли 1:20000. Мембрану выдерживали при 4°С в течение ночи при качании. На следующий день мембрану промывали 4 раза РВ8/0,1% Т\уееп-20 в течение 5 мин на промывку. Вторичные антитела (козий антикроличий А1е\аР1иог 680 и козий антимы- 15 029164

шиный 1КОуе 800) разбавляли 1:10000 в блокирующем буфере/0,1% Т^ееп-20/0,01% 8Ό8 и добавляли к мембране в черном блоке для инкубирования. Данное инкубирование осуществляли в течение 1 ч при комнатной температуре при качании. Затем раствор вторичного антитела удаляли и мембрану промывали 4 раза РВ8/0,1% Тшееп-20 в течение 5 мин на промывку. Конечную промывку только РБ8 осуществляли, уменьшая фоновый сигнал. Затем мембраны сканировали, применяя инфракрасную систему формирования изображений Обуззеу (Ы-СОК Вюзтепсез).

Результаты.

Эффективность соединения 2 по ингибированию роста определяли в клеточной линии РС-3 рака. Фиг. 7 показывает типичный пример кривых зависимости эффекта от дозы для соединения 2 в РС-3 клеточной линии. В среднем определяли, что эффективность ингибирования роста соединением 2, как представлено 1С₅₀ величиной в РС-3 клеточной линии, составляет 0,14 ±0,019 мкМ.

Активность тТОКС1 комплекса отслеживали оценкой статуса фосфорилирования 4ЕВР1 (Т46), прямого субстрата тТОК киназы (фиг. 8В) и З6КР (8235/8236), субстрата р70З6 киназы, которая непосредственно активируется ТОКС1 комплексом (фиг. 8А). Активность тТОКС2 комплекса отслеживали непосредственно оценкой статуса фосфорилирования Ак1 (8473) (фиг. 8С) и опосредованно путем оценки статуса фосфорилирования Ак1 субстратов Ο8Κ3β (89) и РКА840 (Т246). Кроме того, отслеживали статус фосфорилирования Ак1 (Т308), сайт фосфорилирования РИК1.

Было показано, что соединение 2 ингибирует тТОК киназную мишень в обоих комплексах в интактных клетках (табл. 4). Типичные кривые зависимости эффекта от дозы для ингибирования соединением 2 указаннных субстратов показаны на фиг. 8. Ингибирование прямых тТОКС1 и тТОКС2 субстратов 4Е-ВР1 и Ак1 было субмикромолярным. Ингибирование последующих в цепи субстратов р-86КР (8235/8236) и р-РКА840 (Т246) было также субмикромолярным. Ингибирование ρ-Ο8Κ3β соединением 2 было менее эффективным, чем ингибирование прямого субстрата, Ак1 (8473), или другого опосредованного субстрата, РКА840 (Т246). Полная активация Ак1 требует дополнительного фосфорилирования Т308 РИК1, и предполагают, что она созависима с тТОКС2 фосфорилированием Ак1 (8473).

Эффективное внутриклеточное ингибирование тТОК пути и мощную антипролиферативную активность демонстрировали с соединением 2 в РС-3.

Таблица 4

	Внутриклеточное ингибирование тТОК пути соединением 2 (1С50, мкМ)
	тТОКС!	тТОКС2	ΡϋΚΙ
Клеточная линия	4ЕВР1 (Т46)	86КР (3235/236)	АКТ (8473)	РКА840 (Т246)	Ο8Κ3β (89)	АКТ (Т308)
РС-3	0,13 (п=2)	0,023± 0,007	0,022± 0,003	0,049 (п=2)	0,017 (п=2)	0,048 (п=2)

Выводы.

Соединение 2 показало эффективное ингибирование роста (1С₅₀ величины: 0,14-1,31 мкМ) в опухолевых клетках предстательной железы. Применяя специфические молекулярные фосфобиомаркеры тТОКС1 активности (4Е-ВР1 (Т46) непосредственно и 86КР (8235/8236) опосредованно) и тТОКС2 активности (Ак1 (8473) непосредственно и Ο8Κ3β (89) и РКА840 (Т246) опосредованно), было показано, что соединение 2 ингибирует тТОК киназную мишень в обоих из данных комплексах в интактной клетке. Субмикромолярное ингибирование прямых тТОКС1 и тТОКС2 субстратов 4Е-ВР1 и Ак1 (8473) и последующих в цепи субстратов.

Противоопухолевая активность соединения 1 в ксенотрансплантатной модели РС-3 рака предстательной железы человека.

Исследование переносимости.

Четырем группам самок 8СГО мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=4 на группу), вводили перорально плацебо или соединение 1 (10, 25 или 50 мг/кг) один раз в день в течение 5 дней. Образцы плазмы и опухоли собирали через 24 ч после последнего введения дозы в каждой группе дозирования.

Исследования эффективности.

Группам самок 8СГО мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=5-10/группа), вводили перорально плацебо или соединение 1 (0,3 мг/кг-50 мг/кг) любым из ВГО, ОО, 02Ό, 03Ό, 05Ό, или 07Ό в течение всего исследования, начиная, когда объемы опухоли достигали приблизительно 100 мм³ или 500 мм³ (исследование регрессии). Группам с ВГО дозированием вводили дозы с 10-часовым перерывом между утренними и вечерними дозами. В группе положительного контроля, рапамицин вводили 03Ό интраперитонеальным (1Р) путем. В конце каждого исследования собирали образцы плазмы и/или опухоли.

План экспериментов показан в табл. 5.

- 16 029164

Т аблица 5

Группа дозирования (П)	Режим дозирования	Продолжительность дозирования	Временые точки отбора образцов после последнего введения дозы
Плацебо (п=9)	<2ϋ	3 недели	24 ч
Рапамицин 4 мг/кг (п=7)	<2ϋ	3 недели	Не собирали
Соединение 1 10 мг/кг (п=9)	<2ϋ	3 недели	2 и 24 ч
Соединение 1 25 мг/кг (п=9)	<2ϋ	2x3 недели	2 и 24 ч
Плацебо (п=9)	<2ϋ	3 недели	24 ч
Плацебо (п=5)	<2ϋ	5 дней	2 ч после 6^ой дозы для МОЛ исследований на 6 день
Рапамицин 4 мг/кг (п=5)	<23ϋ	3 недели	24 ч
Соединение 1 25 мг/кг (п=9)	<2ϋ	3 недели	1, 2, 4, 8и24ч
Соединение 1 25 мг/кг (п=5)	<2ϋ	6 доз, 6 дней	2 ч после 6^ой дозы для МОЛ исследований на 6 день
Соединение 1 25 мг/кг (п=9)	<22ϋ	3 недели	1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч

- 17 029164

Соединение 1 25 мг/кг (п=9)	<23ϋ	3 недели	2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч
Соединение 1 50 мг/кг (п=9)	<23ϋ	3 недели	2, 4, 8, 24, 48 и 72 ч
Соединение 1 50 мг/кг (п=9)	<25ϋ	3 недели	2, 24, 48, 72, 96 и 120 ч
Соединение 1 50 мг/кг (п=9)	<27ϋ	3 недели	48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч
Плацебо (п=10)	ВЮ	3 недели	8 ч
Рапамицин 4 мг/кг (п=б)	<23ϋ	3 недели	24 ч
Соединение 1 5 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1, 2, 4, 6, 8, 10 и 24 ч
Соединение 1 10 мг/кг (п=10)	вю	3 недели	1, 2, 4, 6, 8, 10 и 2 4 ч
Плацебо (п=10)	вю	3 недели	24 ч
Рапамицин 4 мг/кг (п=10)	<23ϋ	3 недели	24 ч
Соединение 1 1 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1, 2, 4, 6, 8, 10 и 2 4 ч
Соединение 1 5 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1, 2, 4, 6, 8, 10 и 2 4 ч
Соединение 1 10 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1, 2, 4, 6, 8, 10 и 2 4 ч
Соединение 1 25 мг/кг (п=10)	<2ϋ	3 недели	нет
Соединение 1 25 мг/кг (п=10)	<22ϋ	3 недели	1, 2, 4, 8, 24 и 48 ч

Фармакокинетические/фармакодинамические исследования.

Группам самок 8СП) мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=4 на группу), вводили перорально единичную дозу плацебо или соединения 1. Образцы плазмы и опухоли собирали в различные временные точки после введения соединения, как описано.

Каждая временная точка отбора образцов плазмы и опухоли представляла собой конечную временную точку для РК-РО исследований.

Соединение 1 через 4, 8 и 24 ч; контроль плацебо через 24 ч.

Соединение 1 через 1, 3, 8, 16, 24, 48 и 72 ч; контроль плацебо через 72 ч.

Соединение 1 через 0,5, 2, 4, 6, 10 и 24 ч; контроль плацебо через 24 ч.

Экспериментальные способы - Исследования переносимости и эффективности.

Клеточная линия и культура.

РС-3 клеточную линию получали из американской коллекции тканевых культур (АТСС) (СаЁЬегзЬегд, ΜΏ) и выращивали в среде для роста, содержащей Р12К среду Хэма с 2 мМ Ь-глютамином, доведенной так, чтобы она содержала 1,5 г/л бикарбоната натрия и 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки отделяли от колб для выращивания тканей, применяя трипсин-КОТА. После цен- 18 029164

трифугирования клеточную массу суспендировали в фосфатно-буферном солевом растворе (ΡΒ8) и подсчитывали, используя гемоцитометр. Матригель добавляли к клеточной суспензии, доводя конечный объем до 2х10⁶ клеток/0,1 мл 1:1 смесью матригель:ΡΒ8.

Инокуляция опухолевых клеток.

Мышей анестезировали ингаляцией изофлурана, и затем инокулировали подкожно ΡΟ-3 опухолевые клетки в правую заднюю ногу 0,1 мл суспензии отдельных клеток в матригеле, используя стерильный

1 мл шприц, оснащенный иглой 26 размера. После инокуляции мышей возвращали в микроизоляторные клетки.

Случайное распределение животных.

После инокуляции опухоли выращивали до приблизительно 100 или 500 мм³ перед случайным распределением. Для исследований эффективности использовали животных с опухолями объемом приблизительно 100 мм³. Обычное количество дней, требуемое для достижения опухолями 100 мм³, составляло 9-11 дней. Опухоль каждого животного измеряли и животных с опухолями в диапазоне 100-200 мм³включали в данное исследование. Для исследований переносимости и регрессии использовали животных с опухолями объемом приблизительно 500 мм³ (диапазон 300-500 мм³). Стандартное количество дней, требуемое для достижения опухолями 500 мм³, составляло 20-22 дней. Затем животных распределяли случайным образом в различные клетки, и клетки случайным образом приписывали к группам с плацебо, положительным контролем или испытуемым препаратом. Всех мышей метили металлическими серьгами на правом ухе. Стандартная группа для исследования эффективности состояла из 8-10 животных. Группа для исследования переносимости состояла из 4-6 животных.

Получение и введение испытуемого препарата.

Суспензии соединения 1 получали в водном 0,5% СМС и 0,25% Тгееп-80. Составы гомогенизировали, используя ступку и пестик Тейоп™ (ΡοΙ^γ-ΕΕόΙ^ιπ гомогенизатор ткани). Между дозами формулированное соединение хранили при непрерывном перемешивании, используя магнитную мешалку при 4°С в темноте. Испытуемый препарат и плацебо вводили пероральным зондовым введением. Положительный контроль (рапамицин) получали в виде раствора в 2% этаноле, 45% полиэтиленгликоле 400 и 53% соляном растворе и вводили интраперитонеальной инъекцией. Стерильные шприцы и иглы для зондового питания использовали для введения соединения. Все способы, включая инъекции, осуществляли в боксах микробиологической безопасности, опрысканные 70% этанолом перед применением.

Исследование переносимости - Мышам вводили дозы плацебо или соединения 1 один раз в день в течение всего периода исследования. У мышей ежедневно отслеживали клинические признаки и изменение массы тела. В конце исследования мышей умерщвляли, и собирали образцы плазмы и опухоли для определения ΡΚ/ΡΌ. ΡΌ маркеры, ρ86 и ρΑΕί. измеряли, применяя Μ8Ό способ.

Измерения опухоли.

Объемы опухолей определяли перед началом обработки и считали исходными объемами. В дальнейшем опухоли измеряли дважды в неделю в течение всего периода исследования. Длинные и короткие оси каждой опухоли измеряли цифровым штангенциркулем в миллиметрах. Объемы опухолей рассчитывали, применяя формулу: ширина² хдлина/2. Объемы опухолей выражали в кубических миллиметрах (мм³).

Измерения массы тела.

Первоначальные массы тел определяли перед началом обработки, используя цифровые весы. Изменение массы тела в процентах в течение всего исследования рассчитывали, применяя измерения первоначальной массы тела. Массу тел каждого животного измеряли дважды в неделю одновременно с измерением опухоли. Массы тел измеряли более часто, если отмечали значительное снижение в течение всего исследования.

Прекращение экспериментов.

После последнего измерения эксперимент прекращали отбором образцов плазмы и опухоли для ΡΚ и ΡΌ измерений. Концентрации соединения в плазме и опухоли определяли ЬС-М8/М8. ΡΌ маркеры, ρ86 и ρΑΕί, измеряли, применяя Μ8Ό способ.

Сбор образцов плазмы.

После введения последней дозы испытуемого препарата образцы крови собирали посредством отбора крови в ретроорбитальной области в заданные временные точки. Образцы плазмы отбирали в период введения доз (например, для Ο2Ό группы дозирования, образцы плазмы отбирали через 48 ч после введения дозы). Образцы крови перерабатывали в плазму, используя пробирки для плазмафереза с гепарином.

Сбор образцов ткани.

После последнего отбора крови животных умерщвляли СО₂ удушением и опухоли вырезали. Небольшую часть опухоли (приблизительно 100 мг) помещали в предварительно взвешенную пробирку и быстро замораживали в жидком азоте для определения соединения. Оставшиеся ткани или быстро замораживали в жидком азоте и/или фиксировали в забуференном формалине для ΡΌ измерений.

- 19 029164

Экспериментальные способы.

Фармакокинетические и фармакодинамические исследования.

Самок §СГО мышей, имеющих РС-3 опухоль в диапазоне 300-500 мм³, объединяли и случайным образом распределяли на группу с обработкой плацебо или соединением 1. В заданные временные точки после введения дозы, мышей умерщвляли и образцы плазмы и опухоли собирали для РК/РЭ определения. Концентрации соединения в плазме и опухоли определяли ЬС-Μδ/Μδ. ΡΌ маркеры, р§6 и рЛк1. измеряли, применяя мезомасштабный способ.

Для анализов на обнаружение в мезомасштабе образцы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз, и центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин при 4°С. Надосадочные жидкости обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при 4°С, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С. Концентрации белка в образцах определяли, используя ВСА набор реактивов для анализа белков (Тйегто δοίοηΙίΠο). Применяли набор для обнаружения в мезомасштабе и протокол для измерения р§6 и набор для рАкк/суммарной Акк. ΜδΏ 96-луночные планшеты, покрытые р86, рАкк/суммарной Акк, блокировали блокирующим раствором в течение 5 мин с последующей промывкой промывочным буфером. 25 мг лизатов опухолей добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 2 ч с последующей 4х промывкой буфером для промывки. Антитело для детекции добавляли к каждой лунке и инкубировали в темноте в течение 1 ч при 4°С. Затем планшеты промывали и регистрировали связанный антиген, используя прибор ΜδΏ §ЕСТОК™.

Экспериментальные способы - Исследования механизма действия.

Для определения механизма действия соединения 1 мышам, имеющим РС-3 опухоли, вводили перорально дозы плацебо или соединения 1 в количестве 25 мг/кг ОЭ в течение 6 дней. Положительный контроль, рапамицин, вводили интраперитонеально в количестве 4 мг/кг О3Э в течение 6 дней. Через 2 ч после последнего введения дозы плацебо соединения 1 или рапамицина, мышей умерщвляли и опухоли вырезали. Опухоли быстро замораживали в жидком азоте и обрабатывали для иммуногистохимии (1НС) и ТиИЕЬ.

Иммуногистохимия.

Криостатные срезы толщиной от 5 до 10 мкм образцов опухолей применяли для 1НС. Экспрессию маркера клеточной пролиферации Κί-67 оценивали 1НС, применяя анти-К1-67 антитело. Анти-СО-31 антитело использовали для определения плотности кровеносных сосудов, и оно представляет собой меру ангиогенеза опухоли. Замороженные срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали РВ§, блокировали и пермеабилизировали нормальной козьей сывороткой и ТгПоп Х-100. Затем срезы инкубировали с первичным антителом (в течение ночи) с последующим инкубированием со вторичным антителом (60 мин). Срезы промывали, проводили контрокрашивание Хехстом и оснащали реагентом против обесцвечивания. Что касается способов двойного мечения (Κί-67 и СО-31), смеси первичных и вторичных антител применяли для инкубирования. Положительные и отрицательные контроли включали в каждый анализ. Положительные контроли включали срезы, о которых известно, что они реагируют с антителом. Отрицательные контроли включали отсутствие первичного или вторичного антитела. Срезы визуализировали микроскопом №коп Е800, снабженным оборудованием для детекции флуоресценции и цифровой камерой, присоединенной к компьютеру.

Исследование апоптоза ТиИЕЬ.

Для обнаружения апоптозных клеток применяли набор для определения гибели клеток ίη 81кн по флуоресценции (Коске Вюзтепсез). Криостатные срезы толщиной от 5 до 10 мкм фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре, промывали, пермеабилизировали 0,3% ТгПоп Х-100 и 0,1% цитратом натрия в РВ§ в течение 10 мин. Затем срезы промывали РВ§ и инкубировали с раствором для мечения, содержащим ТкТ фермент, в течение 1 ч при 37°С в темноте. Срезы промывали РВ§, проводили контр-окрашивание Хехстом (0,4 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 10 мин и снабжали реагентом против обесцвечивания Рго1оп§ Со1<Т

Количественная оценка иммуногистохимии.

Срезы тканей, обработанных для апоптоза, или иммуноокрашенные для пролиферирующих клеток (Κί-67) или кровеносных сосудов, количественно измеряли, применяя Мекатогрк программное обеспечение. Используя 20х объектив, 5 различных областей для каждого среза, 2-4 среза для каждой опухоли и 3-4 опухоли для каждой группы обработки или контроля использовали для количественной оценки. Представляющую интерес область выражали в виде процента пороговой величины суммарной площади.

Результаты.

Переносимость соединения 1 мышами, имеющими РС-3 опухоль. При подготовке к исследованиям с ксенотрансплантатами, проводили 5-дневное исследование переносимости. Соединение 1 вводили ОЭ перорально при 10, 25 или 50 мг/кг §СГО мышам, имеющим РС-3 опухоль. Животные в группе с дозой 50 мг/кг теряли >17% первоначальной массы тела к 5 дню (через 24 ч после 4-й дозы). Животных в данной группе умерщвляли. К 6 дню (через 24 ч после 5-й дозы) животные в группах с 25 и 10 мг/кг теряли 9 и 4% соответственно исходной массы тела. На основе этих данных 10 и 25 мг/кг дозы выбирали для исследования с ксенотрансплантатом.

- 20 029164

В конце исследования переносимости образцы плазмы и опухоли собирали и обрабатывали для ΡΚ/ΡΌ анализа. Высокую концентрацию соединения 1 наблюдали в плазме (7,3±2,4 мкМ) и опухоли (4,7±1,3 мкМ) мышей, которым вводили 50 мг/кг на 5 день по сравнению с группами 10 и 25 мг/кг (концентрация в плазме: 0,08±0,06 и 0,84±0,41 мкМ соответственно). Указанная, большая, чем ожидалось, концентрация соединения 1 в плазме и опухоли, вероятно, является результатом накопления соединения по мере повторения введения дозы. При уровне дозы 10 мг/кг имеется умеренное ингибирование р86 (22%) и рЛк! (28%) в опухолях, собранных через 24 ч после последней дозы; однако оба ΡΌ маркера были значительно ингибированы в опухолях животных, которым вводили 25 и 50 мг/кг (данные не показаны), через 24 ч.

Результаты.

Противоопухолевая активность соединения 1 в РС-3 ксенотрансплантатной модели. Противоопухолевую активность соединения 1 первоначально исследовали при 10 и 25 мг/кг в режиме дозирования один раз в день. Введение доз начинали на 11 день, когда объемы опухолей находились в диапазоне 158172 мм³. К 31 дню опухоли в группе, обрабатываемой плацебо, имели размер 712±68 мм³. Все животные в группе положительного контроля (рапамицин 4 мг/кг Ο3Ό) показали значительно (р<0,001) меньшие опухоли по сравнению с группой плацебо на 31 день. Ингибирование опухоли в %, показанное на фиг. 9 для каждой группы обработки, представляет собой уменьшение объема опухоли на 31 день при сравнении с группой с контролем плацебо. Группы, обрабатываемые соединением 1, показали зависящее от дозы ингибирование опухоли (фиг. 9). Регрессия опухоли соединением 1 при 25 мг/кг подтверждалась меньшим средним объемом опухоли на 31 день по сравнению со средним исходным объемом опухоли на 11 день (123 мм³ на день 31 относительно 158 мм³ на 11 день). На 31 день объемы опухолей животных, обрабатываемых 10 и 25 мг/кг соединения 1, снижались на 46,1% и 86,7%, соответственно, по сравнению с группой с контролем плацебо. Оба уровня доз значительно отличались (р<0,001) от контроля (712 мм³относительно 383 мм³, 10 мг/кг и 123 мм³, 25 мг/кг).

На 31 день животных всех исследуемых групп умерщвляли, за исключением группы с 25 мг/кг соединения 1. Животных в группе с 25 мг/кг соединения 1 оставляли живыми без введения доз в течение дополнительных 3 недель (полосы на фиг. 9 показывают продолжительность обработки соединением). При отсутствии введения доз, рост опухоли возобновлялся. На 52 день, когда средний рост опухоли достигал приблизительно 427 мм³, осуществляли второй ежедневный цикл введения соединения 1 (25 мг/кг) в течение дополнительных 3 недель. В течение второго цикла введения доз, остановку роста опухоли наблюдали в течение приблизительно 11 дней. Средние объемы опухолей оставались между 427 и 397 мм³. В дальнейшем наблюдали повторный рост опухолей. В конце второго цикла объемы опухолей составляли приблизительно 729 мм³.

Не наблюдали значительного изменения массы тела в группах, в которых вводили плацебо, соединение 1 при 10 мг/кг или положительный контроль (данные не показаны). Мыши в группе дозирования 25 мг/кг теряли приблизительно 10% своей первоначальной массы тела к концу первого цикла. Сразу после прекращения введения доз животные сразу набирали вес. В течение второго цикла введения доз изменение массы тела составляло приблизительно 5%.

В конце первого цикла введения доз, образцы плазмы и опухоли собирали через 2 и 24 ч после последней дозы в 10 мг/кг группе и анализировали на концентрацию соединения и ΡΌ маркеров. Приблизительно 2 мкМ соединения 1 обнаруживали через 2 ч после введения последней дозы, тогда как через 24 ч количество соединения в плазме было незначительным. Параллельно оба ΡΌ маркера, р86 и рЛк1. были ингибированы через 2 ч, но повышались до уровня контроля через 24 ч (фиг. 10).

Другие исследование планировали для определения противоопухолевой активности соединения 1 в Ρ^3 ксенотрансплантатной модели при дробном дозировании (т.е., Ο2Ό, Ο3Ό, Ο5Ό и Ο7Ό) при уровнях доз 25 и 50 мг/кг (фиг. 11). Введение доз начинали на 10 день, когда средний объемы опухолей был в диапазоне от 116 до 146 мм³. К концу 3-недельного периода введения доз на 31 день, опухоли, обрабатываемыми плацебо, достигали среднего объема 813±60 мм³. Положительный контроль рапамицином значительно ингибировал опухоли (р<0,001) на 31 день. Ингибирование опухоли в %, показанное на фиг. 11 для каждой группы обработки, представляет собой снижение объема опухоли на 31 день при сравнении с контролем плацебо. При уровне дозы 50 мг/кг, достигалась большая эффективность (82% ингибирование) в группе с режимом Ο3Ό, тогда как менее частое введение дозы в группах с режимами Ο5Ό и Ο7Ό давало менее сильное (61 и 49% соответственно), но статистически значительное (р<0,001) ингибирование опухоли при сравнении с контролем плацебо. Уровень дозы 25 мг/кг испытывали в группах с режимами ΟΌ, Ο2Ό и Ο3Ό введения доз. Регрессию опухоли наблюдали при введении соединения 1 при 25 мг/кг ΟΌ.

Значительное (р<0,001) ингибирование опухоли 72 и 61% наблюдали с Ο2Ό и Ο3Ό введением доз соответственно.

За исключением группы введения соединения 1 при 25 мг/кг ΟΌ, не наблюдали значительного изменения массы тела в любой из групп обработки. Животные в группе с введением дозы при 25 мг/кг ΟΌ теряли приблизительно 10% массы тела в течение периода исследования (данные не показаны).

- 21 029164

После последнего введения соединения 1 образцы плазмы собирали в различные временные точки и анализировали на соединение. Рассчитанные АиС величины для плазмы для каждой группы дозирования составляли:

25 мг/кг ΡΏ: 122 мкМ-ч (АиС_{0-24 ч}),

25 мг/кг Ρ2Ώ: 99 мкМ-ч (АиС_{0-48 ч}),

25 мг/кг Ρ3Ώ: 77 мкМ-ч (АиС_{0-72 ч}),

50 мг/кг Ρ3Ώ: 228 мкМ-ч (АиС_{0-72 ч}),

50 мг/кг Ρ5Ώ: 359 мкМ-ч (АиС_{0-120 ч}).

Другое исследование планировали для определения противоопухолевой активности соединения 1 при ΒΙΏ введении доз при 5 и 10 мг/кг в РС-3 ксенотрансплантатной модели (фиг. 12). Введение доз начинали на 10 день, когда средний объем опухоли был в диапазоне от 123 до 131 мм³. К концу 3недельного периода введения доз на 31 день, опухоли, обрабатываемые плацебо, достигали среднего объема 875±80 мм³. Значительное (р<0,001) ингибирование роста опухоли наблюдали с рапамицином. Зависящее от дозы ингибирование опухоли наблюдали при обработке соединением 1. Снижение объема опухоли в группах, обрабатываемых соединением 1 при 5 и 10 мг/кг, составляло 64,9% и 79,9%, соответственно, при сравнении с контролем плацебо (фиг. 12). Наименьшую эффективную дозу, как определено 65% ингибированием объема опухоли, наблюдали при уровне дозы 5 мг/кг соединения 1.

Не наблюдали статистически значимого изменения массы тела в любой группе в данном исследовании (данные не показаны).

После введения последней дозы соединения 1, образцы плазмы собирали в различные временные точки и анализировали на количество соединения. Концентрация соединения была приблизительно пропорциональна дозе. Суммарные АиС_0-1_{0 ч} величины для плазмы для уровней доз 5 и 10 мг/кг составляли 8,6 и 23,7 мкМ-ч соответственно, как показано в табл. 6. Рассчитанные АиС_0-1_{0 ч} величины для фракции свободного соединения в плазме для 5 и 10 мг/кг составляли 1,0 и 2,8 мкМ-ч соответственно (связывание с белками в плазме мышей соединения 1 составляло 88%).

Таблица 6

Другое исследование планировали для определения противоопухолевой активности соединения 1 для большой, стабильной РС-3 опухоли, определяя, вызывает ли соединение регрессию опухоли (фиг. 13). Введение доз начинали на 20 день, когда средние объемы опухолей были в диапазоне от 450 до 486 мм³. К концу периода введения доз на 43 день, опухоли, обрабатываемые плацебо, достигали среднего объема 1773±113 мм³. Положительный контроль рапамицином вызывал остановку роста опухоли. Объемы опухолей группы, обрабатываемой рапамицином, были значительно (р<0,001) меньшими, чем для группы с контролем плацебо.

Соединение 1 испытывали при 3 уровнях доз (1, 5 и 10 мг/кг) ΒΙΏ. % ингибирования опухоли, показанный на фиг. 13 для каждой группы обработки, представляет собой снижение объема опухоли на 43 день при сравнении с контролем плацебо. При 10 мг/кг ΒΙΏ ингибирование опухоли было лучшим, чем для положительного контроля. При данном уровне дозы соединение 1 вызывало регрессию РС-3 опухоли. Средний объем опухоли к концу периода введения доз на 43 день был значительно (р<0,01) меньшим, чем средний исходный объем на 20 день в начале введения доз (343,6±32,6 мм³ на 43 день относительно 482,2±12,6 мм³ на 20 день). Соединение 1 при 5 мг/кг ΒΙΏ вызывало остановку роста опухоли, тогда как

1 мг/кг ΒΙΏ значительно (р<0,01) замедлял рост опухоли при сравнении с животными, обработанными плацебо. Соединение 1 при 25 мг/кг О2О вызывало регрессию опухоли, первоначально в течение первых

2 недель введения доз. К концу периода введения доз на 43 день, объемы опухолей были аналогичны исходным объемам на 20 день (549,4±45,7 мм³ на 43 день относительно 475,1±19,6 мм³ на 20 день). Животных в группе с введением 25 мг/кг С)1) соединения 1 умерщвляли на 26 день из-за чрезмерной потери веса (фиг. 13).

- 22 029164

За исключением группы с введением доз соединения 1 25 мг/кг РЭ, не наблюдали статистически значимого изменения массы тела в любой из групп в данном исследовании (фиг. 9). Животные в 25 мг/кг РЭ группе теряли более 19% их первоначальной массы тела к 26 дню, и их умерщвляли.

После введения последней дозы соединения 1, образцы плазмы собирали в различные временные точки и анализировали на концентрацию соединения. Приблизительно пропорциональную дозе концентрацию соединения наблюдали в плазме в группах дозирования при 1 и 5 мг/кг, но более чем пропорциональное дозе увеличение наблюдали при обработке 10 мг/кг. Рассчитанные суммарные АИС_0-1_{0 ч} величины для плазмы при ВГО введении доз для 1, 5 и 10 мг/кг групп составляли 1,5, 8,7 и 26 мкМ-ч соответственно. Рассчитанные АИС_0-1_{0 ч} для свободной фракции в плазме составляли 0,18, 1,0 и 3,1 мкМ-ч соответственно (связывание с белками плазмы соединения 1 у мышей составляло 88%). Рассчитанная суммарная АИС_{0-48 ч} величина для плазмы в группе с введением дозы 25 мг/кг Ц2Р составляла 112 мкМ-ч. Рассчитанная АИС_{0-48 ч} величина для свободной фракции в плазме для группы с введением дозы 25 мг/кг Ρ2Ω составляла 13,4 мкМ-ч.

Результаты - Фармакокинетические/фармакодинамические параметры соединения 1 у мышей, имеющих РС-3 опухоль.

РК/РЭ соотношение между концентрацией соединения 1 в плазме и опухоли и ингибированием опухолевых РЭ маркеров, связанных с тТОК путем, определяли после введения единичной дозы соединения. Концентрации р§6 (РЭ маркер для тТОКС1) и рА1<1 (РЭ маркер для тТОКС2) измеряли в опухоли, и они коррелировали с концентрацией соединения в плазме и/или опухоли. РК/РЭ соотношение исследовали при различных уровнях доз (0,3, 1, 10, 25, 30, 50 и 100 мг/кг). При 30 и 100 мг/кг образцы плазмы и опухоли собирали через 4, 8 и 24 ч после введения дозы. Имелось зависящее от дозы и времени соотношение между концентрациями соединения в плазме и опухоли и концентрациями р§6 и рЛк1 в опухоли (данные не показаны). При обоих уровнях доз, р86 и рАк значительно (р<0,001) ингибировались в течение 24 ч (р§6: 78 и 91% ингибирование при 30 и 100 мг/кг соответственно; рАкк 78 и 86% ингибирование при 30 и 100 мг/кг соответственно). При обоих уровнях доз >1 мкМ соединения 1 детектировали в плазме через 24 ч после введения дозы (1,15±0,62 и 2,55±0,60 мкМ для 30 и 100 мг/кг соответственно).

В другом исследовании временные точки расширяли дополнительно до 72 ч после введения соединения 1 при 25 и 50 мг/кг. Концентрация соединения в опухолях отражала концентрации в плазме в максимальные временные точки. Зависящее от дозы и времени РК/РЭ соотношение наблюдали при 25 (фиг. 14 и табл. 7) и 50 мг/кг (данные не показаны). При 25 мг/кг >80% ингибирование концентрации р§6 сохранялось вплоть до 24 ч, тогда как >60% ингибирование рАк наблюдали вплоть до 16 ч. К 48 и 72 ч, когда концентрация соединения в плазме и опухолях была значительно меньше (<0,03 мкМ и в плазме и в опухоле через 48 и 72 ч), ингибирование РР маркера ослаблялось.

- 23 029164

Таблица 7

Ингибирование Ρϋ маркера (%)

Доза	Время отбора образца (ч)	рЗб	рАкб
25 мг/кг	1	87,9	89, 1
	3	95, 1	73, 6
	8	92,3	71, 6
	16	92,1	71,7
	24	83,7	34,5
	48	47,2	40,5
	72	68,3	44,1
10 мг/кг	1	79, 5	88, 6
	3	91,9	79, 2
10 мг/кг	8	91,2	64,1
	16	32,4	41,7
	24	32,7	46, 1
	48	39,5	41,4
	72	47,9	38, б
1 мг/кг	0,5	80, 8	72,1
	2	82,8	66, 7
	4	78, 6	66, 5
	б	53, 1	39, 2
	10	14,4	52,3
	24	20, 6	55, 9

Пояснение: ВИф = ниже пределов количественной оценки.

ΡΚ/ΡΌ соотношение дополнительно определяли при 10 мг/кг (фиг. 15; табл. 6). Значительное (р<0,001) ингибирование р86 (>80%) и рЛк1 (>60%) наблюдали вплоть до 8 ч после введения соединения 1 при концентрации в плазме более чем 1 мкМ. После 8 ч, когда концентрации соединения в плазме и опухоли были меньшими (0,17 мкМ концентрация в плазме), ингибирование ΡΌ маркера ослаблялось, но все еще было значительно (р<0,01) меньшим, чем для контролей плацебо.

ΡΚ/ΡΌ соотношение исследовали при меньших дозах 1 мг/кг (фиг. 16) и 0,3 мг/кг (табл. 8). Приблизительно 80% ингибирование р86 наблюдали вплоть до 2 ч (данные не показаны) и 4 ч при 0,3 и 1 мг/кг соответственно. Значительное (р<0,01) ингибирование рЛк1 наблюдали только при 1 мг/кг. Концентрация в плазме, связанная с >80% ингибированием р86 и >60% ингибированием рЛк1 составляла 0,19±0,1 мкМ при 1 мг/кг уровне дозы. При уровне дозы 0,3 мг/кг максимальная концентрация соединения 1 в плазме составляла 0,23±0,03 мкМ через 0,5 ч. В этот момент времени наблюдали 81% ингибирование р86, но не ингибирование рЛк1 (данные не показаны).

Данные исследований ΡΚ/ΡΌ для соединения 1 показывают, что концентрации в плазме >0,2 мкМ необходимы для ингибирования >80% р86 и >60% рЛк1. Концентрации в плазме при уровне дозы 5 мг/кг ΒΙΌ (минимальная эффективная доза) сохранялись выше 0,2 мкМ в течение 8 ч, и это приводило к 65% снижению объема опухоли в исследовании на эффективность и остановку роста опухоли в исследовании регрессии. На основе ΡΚ/ΡΌ соотношения для концентрации в плазме соединения 1 и ингибирования ΡΌ биомаркеров, а также соотношения концентрации соединения 1 в плазме и данных по снижению объема опухоли в ДС-3 ксентотрансплантатах, сохранение данной концентрации и степени ингибирования биомаркеров в течение 8 ч дважды в день подтверждает хорошую противоопухолевую активность в ДС-3 опухолях.

- 24 029164

Результаты - Исследования механизма действия в РС-3 опухолях.

Для определения того, вызывает ли соединение 1 апоптоз в РС-3 ксенотрансплантатах, опухоли животных, обрабатываемых плацебо (перорально, ОИ в течение 6 дней), соединением 1 (25 мг/кг, перорально, ОИ в течение 6 дней) и рапамицином (4 мг/кг, 1Р, 03И в течение 6 дней), собирали через 2 ч после последнего введения дозы на 6 день и обрабатывали для ТЦЫЕЬ, который метил апоптозные клетки. В данном исследовании, терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТбТ) вводит Р1ТС меченные нуклеозиды в концы разрывов нитей ДНК ίη 5ί(ιι. Р1ТС меченые нуклеотиды (представляющие клетки с разрывами нитей ДНК, характерная особенность апоптоза) можно детектировать, используя микроскоп, снабженный приставкой для измерения флуоресценции. Относительно мало (0,2%) ТЦЫЕЬположительных клеток наблюдали в РС-3 опухолях, обработанных плацебо (фиг. 17). Количества ТЦЫЕЬ-положительных клеток в опухолях, обработанных соединением 1 и рапамицином, были сравнимыми (фиг. 17). Они представляли собой приблизительно двукратное увеличение ТиМЕЬположительных клеток, наблюдаемых для опухолей, обработанных соединением 1 и рапамицином, по сравнению с контролем плацебо. Настоящие данные позволяют предположить, что апоптоз, повидимому, вносит некоторый вклад в наблюдаемую противоопухолевую активность соединения 1 ίη νίνο.

Опухоли животных, обрабатываемых плацебо (перорально, ОИ в течение 6 дней), соединением 1 (25 мг/кг, перорально, ОИ в течение 6 дней) или рапамицином (4 мг/кг, 1Р, О3И в течение 6 дней), собирали через 2 ч после введения последней дозы на 6 день и обрабатывали для иммуногистохимии. Иммуногистохимию с анти-К1-67 антителом применяли для определения того, ингибирует ли соединение 1 рост опухоли путем блокирования пролиферации опухолевых клеток ίη νίνο. Κί-67 представляет собой ядерный антиген, экспрессируемый в клетках. Была показана сильная корреляция между фракцией пролиферирующих клеток в δ-фазе и показателем Κί67. Срезы опухолей совместно окрашивали анти-СИ-31 антителом, определяя антиангиогенную активность соединения. СИ-31 (также называемое РЕСАМ-1) антитело распознает СИ-31 молекулу, экспрессируемую на мембранах эндотелиальных клеток, и оно участвует в их адгезионных взаимодействиях. Ядра контрокрашивали Хехстом. Пролиферирующие клетки и микрососуды оценивали количественно, применяя программное обеспечение Ме(атогрН, и выражали в виде процента пороговой величины.

В РС-3 опухолях, обработанных плацебо, было значительное количество пролиферирующих клеток (приблизительно 8,5%, выраженные в виде Κί-67 положительной пороговой величины) (фиг. 18). Имелось 84% снижение (р<0,001) количества пролиферирующих клеток в опухолях, обработанных соединением 1, по сравнению с опухолями, обработанными плацебо. Приблизительно 3% пороговой величины включало СИ-31-положительные сосуды в срезах РС-3 опухоли с контролем плацебо, как определено СИ-31 иммуногистохимией. Имелось значительно (р<0,01) меньше СИ-31 положительных кровеносных сосудов в РС-3 опухолях, обработанных соединением 1, по сравнению с опухолями, обработанными плацебо (фиг. 18). Настоящие данные позволяют предположить, что антипролиферативная активность, апоптозная активность и антиангиогенная активность соединения 1 представляют собой потенциальные механизмы, лежащие в основе противоопухолевой активности соединения 1.

Выводы.

Данные исследования показывают следующее.

Обработка тТОК киназным ингибитором, соединением 1, значительно ингибирует рост РС-3 опухоли предстательной железы способом, зависящим от дозы и режима введения.

Минимальная эффективная доза, требуемая для ингибирования РС-3 роста опухоли, составляла 5 мг/кг В1И. Суммарная АИС(0-10 ч) для плазмы при минимальной эффективной дозе составляла 8,6 мкМ-ч. АИС(0-10 ч) свободной фракции в плазме при минимальной эффективной дозе составляла 1,0 мкМ-ч.

Значительное ингибирование маркеров р§6 и рАк( пути тТОК в РС-3 опухолях, обработанных соединением 1, показывает, что наблюдаемая противоопухолевая активность соединения 1 опосредована ингибированием обоих тТОКС1 и тТОКС2 комплексов тТОК пути.

В РС-3 опухолях РК-РИ соотношение показывает, что >80% ингибирование р86 и >60% ингибирование рАк( получали для суммарной концентрации лекарственного средства в плазме более чем 0,2 мкМ. Поддержание концентрации в плазме >0,2 мкМ и данная степень ингибирования биомаркеров в течение 8 ч дважды в день подтверждают хорошую противоопухолевую активность в РС-3 опухолях.

Иммуногистохимические данные показывают, что наблюдаемая противоопухолевая активность соединения 1 являлась не только результатом ингибирования пролиферации опухолевых клеток, но также результатом повышенных апоптозной и антиангиогенной активностей соединения 1 ίη νίνο.

Противоопухолевая активность соединения 2 в РС-3 ксенотрансплантатной модели рака предстательной железы человека.

Суспензии соединения 2 получали в водной 0,5% СМС и 0,25% Т\уссп-80. Плацебо и испытуемый препарат вводили в объеме 5 мл/кг. Положительный контроль, рапамицин, вводили в объеме 10 мл/кг.

- 25 029164

Эффективность и исследование механизма действия.

Группам самок 8СГО мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=8-10/группа), вводили перорально дозы плацебо или соединения 2 (дозы в диапазоне 0,25-5 мг/кг) в течение всего исследования, начиная, когда объемы опухолей достигали приблизительно 150 мм³. Группам с введением доз дважды в день (ВЮ) вводили дозы при 10-часовом разделении между утренней и вечерней дозами. В группе положительного контроля рапамицин вводили 03Ό (на каждый третий день) интраперитонеальным (1Р) путем. В конце каждого исследования собирали образцы плазмы и/или опухоли.

Схема экспериментов показана в табл. 8.

Таблица 8

Группа дозирования (и)	Режим введения ДОЗ	Продолжительность введения доз	Временные точки отбора образцов в последний день введения доз
Плацебо (п=10)	ВЮ	3 недели	24 ч
Рапамицин 4 мг/кг (п=5)	03Ό	3 недели	24 ч
Соединение 2 0,25 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 0,5 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 1 мг/кг (п=10)	ВЮ	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 1 мг/кг (и =10)	ОО	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Плацебо (п=9)	ОО	3 недели	24 ч
Рапамицин 4 мг/кг (п=5)	03Ό	3 недели	24 ч
Соединение 2 0,25 мг/кг (п=9)	ОО	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 1 мг/кг (п=9)	ОО	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 2 мг/кг (п=9)	ОО	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч
Соединение 2 5 мг/кг (п=9)	ОО	3 недели	1,3,6, 10 и 24 ч

Группам самок 8СГО мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=4 на группу), вводили перорально единичную дозу плацебо или соединения 2. Образцы плазмы и опухоли собирали в различные временные точки после введения соединения, как описано.

Каждая временная точка отбора образцов плазмы и опухоли представляла собой конечную временную точку РК/РЭ исследований.

Соединение 2 (1 и 10 мг/кг) через 1, 3, 6, 10 и 24 ч; контроль плацебо через 24 ч.

Соединение 2 (0,1 и 0,3 мг/кг) через 0,5, 1, 3, 6, 10 и 24 ч; контроль плацебо через 24 ч.

Кинетика ингибирования ОХА-РК.

Группам 8СЮ мышей, имеющих РС-3 опухоли (п=4 на группу), вводили перорально дозы 5 мг/кг соединения 2 или плацебо ежедневно в течение 6 дней (0Όχ6). Опухоли собирали через 3, 6, 10, 24, 36 и 48 ч после последнего введения дозы и обрабатывали для иммуногистохимии.

Экспериментальные способы.

РС-3 клеточную линию получали из американской коллекции тканевых культур (АТСС) (СайНегзЪигд, ΜΌ) и выращивали в среде для роста, содержащей Р12К среду Хэма с 2 мМ Ь-глютамина, доведенную так, чтобы она содержала 1,5 г/л бикарбоната натрия и 10% фетальную бычью сыворотку. Клетки отделяли от колбы для выращивания тканей, применяя трипсин-ЕЭТА. После центрифугирования клеточный дебрис суспендировали в РВ8 и клетки подсчитывали, используя гемоцитометр. Матригель добавляли к каждой клеточной суспензии, доводя конечный объем до 2χ10⁶ клеток/0,1 мл 1:1 смеси матригель:РВ8.

Мышей анестезировали ингаляцией изофлурана, а затем инокулировали подкожно РС-3 опухолевыми клетками выше правой задней ноги 0,1 мл суспензии отдельных клеток в матригеле, используя стерильный 1 мл шприц, оснащенный иглой 26 размера.

После инокуляции мышей возвращали в микроизоляторные клетки.

- 26 029164

После инокуляции животных опухоли выращивали до приблизительно 150 мм³ перед случайным распределением мышей. Стандартное количество дней, требуемое для достижения опухолями 150 мм³, составляло 8-9 дней. Опухоль каждого животного измеряли и животных с опухолями в диапазоне от 130 до 155 мм³ включали в данное исследование. Затем животных из группы распределяли случайным образом в различные клетки и клетки случайным образом приписывали группам, обрабатываемым плацебо, положительным контролем или испытуемым препаратом. Всех мышей метили металлическими серьгами на правом ухе. Стандартная группа состояла из 9-10 животных.

Соединение 2 формулировали при 5 мг/кг в 0,5% СМС и 0,25% Т\уееп 80 в воде (в виде суспензии). Составы гомогенизировали, используя ступку и пестик Тейоп™ (Ро!!ег-Е1уей)ет гомогенизатор ткани). Разбавления для получения меньших доз осуществляли непосредственно из 5 мг/кг (1 мг/мл) исходного раствора. Между дозами формулированное соединение хранили в темноте при постоянном перемешивании, используя магнитную мешалку при 4°С. Соединение формулировали каждые 3 дня. Испытуемый препарат и плацебо вводили пероральным зондовым введением. Положительный контроль (рапамицин) получали в виде раствора в 2% этаноле, 45% полиэтиленгликоле 400 и 53% соляном растворе и вводили интраперитонеальной инъекцией. Стерильные шприцы и иглы для зондового питания использовали для введения соединения. Все способы, включающие инъекции, проводили в боксах микробиологической безопасности, опрысканных 70% этанолом перед применением.

Объемы опухолей определяли перед началом обработки и считали исходными объемами. В дальнейшем, опухоли измеряли дважды в неделю в течение всего периода исследования. Длинную и короткую оси каждой опухоли измеряли цифровым штангенциркулем в миллиметрах. Объемы опухолей рассчитывали, применяя формулу: ширина² хдлина/2. Объемы опухолей выражали в кубических миллиметрах (мм³).

После последнего измерения эксперимент прекращали отбором образцов плазмы и опухоли для ΡΚ и ΡΌ измерений. Концентрации соединения в плазме определяли ЬС-М§/М§ способом. ΡΌ маркеры, р§6КР и рАк! (§473) измеряли, применяя М§И способ.

После введения последней дозы испытуемого препарата, образцы крови собирали посредством отбора крови в ретроорбитальной области в заданные временные точки в течение 24 ч. Образцы крови перерабатывали в плазму, используя пробирки для плазмофореза, содержащие гепарин.

После последнего отбора крови животных умерщвляли СО₂ удушением и опухоли вырезали. Небольшую часть опухоли (приблизительно 100 мг) помещали в предварительно взвешенную пробирку и быстро замораживали в жидком азоте для определения соединения. Оставшиеся ткани или быстро замораживали в жидком азоте, и/или фиксировали в забуференном формалине для ΡΌ измерений.

Самок §СГО мышей, имеющих Ρ^3 опухоли в диапазоне 300-500 мм³, объединяли и случайным образом распределяли на группы обработки плацебо или соединением 2. В заданные временные точки после введения доз мышей умерщвляли и образцы плазмы и опухоли собирали для определения ΡΚ/ΡΌ. Концентрации соединения в плазме и опухоли определяли ЬС-М§/М§. ΡΌ маркеры, р§6КГ и рАк! (§473), измеряли, применяя М§И способ. Изменения концентрации суммарных ^NΑ-ΡΚ и фосфо-^NΑΡΚ (ρ^NΑ-ΡΚ (§2056)) измеряли, применяя 1НС.

Анализ на обнаружение в мезомасштабе. Образцы ткани гомогенизировали в лизирующем буфере (0,5 г/мл), содержащем паранитрофенилфосфат φΝΡΡ), метаванадат натрия ЩаУО₃), дитиотреитол (ЭТТ) и ингибиторы протеаз и фосфатаз, и центрифугировали в течение 10 мин при 1200 об/мин при 4°С. Надосадочные жидкости обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин при 4°С, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.

Концентрации белка в образцах определяли, используя ВСА набор реактивов для анализа белков.

М§И набор и протокол для электрохемилюминесцентного иммуноанализа применяли для измерения р§6КБ и рАк! (§473)/суммарной Ак!. М§И 96-луночные планшеты, покрытые антителами к р§6КГ (§235/236), рАк! (§473) и суммарной Ак!, блокировали блокирующим раствором в течение 5-60 мин с последующей промывкой промывочным буфером. Затем 25 мкг лизатов опухолей добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 2 ч с последующей промывкой 4 раза промывочным буфером. Антитело для детекции добавляли к каждой лунке и инкубировали в темноте в течение 1 ч при 4°С. Затем планшеты промывали и считывали связанный антиген, применяя прибор М§И §ЕСТОК™.

Исследования механизма действия.

Для определения потенциального механизма действия соединения 2 мышам, имеющим Ρ^3 опухоли, вводили перорально дозы плацебо или соединения 2 при 5 мг/кг ΟΌ в течение 6 дней. Положительный контроль, рапамицин, вводили интраперитонеально при 4 мг/кг на 1, 4 и 6 день. Через 2 ч после введения последней дозы плацебо, соединения 2 или рапамицина, мышей умерщвляли, и опухоли вырезали.

- 27 029164

Опухоли быстро замораживали в жидком азоте и обрабатывали для иммуногистохимии (1НС) и ТиХЕБ.

Иммуногистохимия - Криостатные срезы толщиной от 5 до 10 мкм применяли для 1НС. Изменение концентраций суммарных ΌΝΑ-ΡΚ и фосфо-ΌΝΑ-ΡΚ (ρΌΝΑ-ΡΚ (82056)) оценивали, применяя соответствующие антитела, специфические к суммарному белку или сайту фосфорилирования по 82056. Маркер клеточной пролиферации Κί67 оценивали 1НС, применяя анти-1<л67 антитело. Анти-СЭ31 антитело использовали для определения плотности кровеносных сосудов, которая представляет собой меру ангиогенеза опухоли. Замороженные срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали РВ8, блокировали и пермеабилизировали 5% нормальной козьей сывороткой и 0,3% Ттйоп-Х 100. Затем срезы инкубировали с первичным антителом (анти-ΌΝΑ-ΡΚ и антиρΌΝΑ-ΡΚ (82056) [1 мкг/мл для обоих] в течение 2 ч и в течение ночи для анти-1<л67 [0,8 мкг/мл] и антиСЭ31 [15,6 мкг/мл]), с последующим инкубированием с 1:500 разбавлением вторичных антител (60 мин). Срезы промывали, проводили контр-окрашивание Хехстом (0,4 мкг/мл) и снабжали реагентом против обесцвечивания. Способ двойного мечения применяли для обнаружения ΌΝΑ-ΡΚ и ρΌΝΑ-ΡΚ (82056) или Κί67 и СЭ31 в том же срезе опухоли. Что касается способов двойного мечения, коктейли первичных антител, затем коктейли вторичных антител, применяли для инкубирования. Положительные и отрицательные контроли включали в каждое исследование. Положительные контроли включали срезы, о которых известно, что они реагируют с антителом. Отрицательные контроли включали отсутствие первичных или вторичных антител.

Следующие контроли специфичности проводили для ρΌΝΑ-ΡΚ (82056) антител: отсутствие первичного или вторичного антитела;

контроль блокирующим пептидом: ρΌΝΑ-ΡΚ (82056) первичное антитело предварительно инкубировали с 50-кратным избытком блокирующего пептида перед добавлением срезов опухолей;

расщепление фосфатазой: для определения специфичности ρΌΝΑ-ΡΚ (82056) фосфоантитела, срезы тканей выдерживали с 1000 единицами λ протеинфосфатазы (отщепляя фосфатные группы в белках в срезе ткани) перед добавлением первичного антитела.

Срезы визуализировали микроскопом №коп Е800, снабженным прибором для обнаружения флуоресценции и цифровой камерой, присоединенной к компьютеру.

Исследование апоптоза ТИХЕЬ.

Для обнаружения апоптозных клеток применяли набор для определения гибели клеток ίη 5Йи по флуоресценции (Коске Вюкшепсек). Криостатные срезы толщиной от 5 до 10 мкм фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре, промывали, пермеабилизировали 0,3% Ттйоп Х-100 и 0,1% цитратом натрия в ΡΒ8 в течение 10 мин. Затем срезы промывали ΡΒ8 и инкубировали с раствором для мечения, содержащим ТбТ фермент, в течение 1 ч при 37°С в темноте. Срезы промывали ΡΒ8, проводили контр-окрашивание Хехстом (0,4 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 10 мин и снабжали реагентом против обесцвечивания Гго1опд Со1б.

Количественная оценка иммуногистохимии - Срезы тканей, обработанные для апоптоза или иммуноокрашенные для ΌΝΑ-ΡΚ, пролиферирующие клетки (Κί67) или кровеносные сосуды оценивали количественно, применяя программное обеспечение МеЕиподэк. Применяя 20х объектив, 5 различных областей для каждого среза, 1-2 среза для каждой опухоли и 3-4 опухоли для каждой группы обработки или группы контроля использовали для количественной оценки. Представляющую интерес область выражали в виде процента пороговой величины суммарной площади. Данные для каждого отдельного животного объединяли и рассчитывали среднее ± 8ЕМ для каждой группы. Для исследования кинетики ингибирования ΌΝΑ-ΡΚ экспрессию ρΌΝΑ-ΡΚ (82056) нормализовали к ΌΝΑ-ΡΚ.

Результаты.

Противоопухолевая активность, изменение массы тела и фармакокинетические свойства при введении доз два раза в день и один раз в день.

Противоопухолевая активность.

Противоопухолевую активность соединения 2 испытывали с дозами ΒΙΌ (0,25, 0,5 и 1 мг/кг) и ΟΌ (1 мг/кг) (фиг. 19). Введение доз начинали на 9 день, когда объемы опухолей были в диапазоне 140-155 мм³ и продолжали до 30 дня. К 30 дню размер опухолей в группе, обрабатываемой плацебо, составлял 947,6±75,4 мм³. Все животные в группе положительного контроля, которые получали рапамицин (4 мг/кг, Ο3Ό). имели значительно (р<0,001) меньшие опухоли по сравнению с группой с введением плацебо на 30 день. Ингибирование опухоли показано в процентах на фиг. 1 для каждой группы обработки и представляет собой разницу среднего объема опухоли между мышами, обработанными соединением 2, и мышами, обработанными плацебо, на 30 день. Зависящее от дозы ингибирование опухоли достигали с соединением 2 при ΒΙΌ дозировании (46, 57 и 66% снижение объема опухоли при 0,25, 0,5 и 1 мг/кг ΒΙΌ соответственно). Средние объемы опухолей всех групп, обрабатываемых соединением 2, были значительно меньшими (р<0,001), чем у контрольных мышей, обрабатываемых плацебо, на 30 день. Наименьшая эффективная доза, как определено приблизительно 65% ингибированием объема опухоли, составляла ΒΙΌ уровень дозы 1 мг/кг. В данном исследовании соединение 2 также испытывали с ΟΌ дозированием при 1 мг/кг. Средние объемы опухолей групп с 1 мг/кг ΟΌ дозированием были значительно меньши- 28 029164

ми (р<0,001), чем у контрольных мышей, обрабатываемых плацебо, на 30 день. Ингибирование опухоли, наблюдаемое с соединением 2, вводимым при дозе 1 мг/кг ОО. было таким же, как для 0,5 мг/кг ВЮ.

Фармакокинетические свойства.

Для определения концентраций соединения 2 в плазме при эффективной дозе образцы плазмы собирали через 1, 3, 6, 10 и 24 ч после введения последней дозы и анализировали (табл. 9). Наблюдали приблизительно пропорциональную дозе концентрацию соединения. Рассчитанные суммарные АиС0-10 ч величины в плазме для каждой группы с ВГО дозированием составляли 0,60, 1,42 и 3,27 мкМ-ч для 0,25, 0,5 и 1 мг/кг соответственно. Рассчитанная суммарная АиС_{0-24 ч} величина в плазме для 1 мг/кг 0)0 составляла 2,95 мкМ-ч. Рассчитанные АиС0-10 ч величины в плазме несвязанных фракций для каждой группы ВГО дозирования составляли 0,2, 0,48 и 1,1 мкМ-ч для 0,25, 0,5 и 1 мг/кг соответственно (связывание белками плазмы соединения 2 у мышей составляло 66% (ΡΏ1604)). Рассчитанная АиС_{0-24 ч} величина несвязанной фракции в плазме при 1 мг/кг ()□ составляла 1,0 мкМ-ч.

Противоопухолевая активность, изменение массы тела и фармакокинетические свойства при введении дозы один раз в день.

Противоопухолевая активность.

Исследование планировали для определения зависящей от дозы противоопухолевой активности соединения 2 при С)О введении доз в ксенотрансплантатной модели РС-3 опухоли. Введение доз начинали на 8 день, когда средние объемы опухолей были в диапазоне от 130 до 140 мм³. К концу 3-недельного периода введения доз на 30 день опухоли, обрабатываемые плацебо, достигали среднего объема 919,7±32,4 мм³. Положительный контроль, рапамицин, значительно ингибировал опухоли (р<0,001) на 30 день. Зависящие от дозы ингибирования опухоли достигали с соединением 2 (45, 55, 63 и 76% снижение объема опухоли при 0,25, 1, 2 и 5 мг/кг соответственно; фиг. 20). Средние объемы опухолей всех групп, обрабатываемых соединением 2, были значительно меньшими (р<0,001), чем для контрольных мышей, обрабатываемых плацебо, на 30 день. Наименьшая эффективная доза, как определено приблизительно 65% ингибированием объема опухоли, была на уровне дозы 2 мг/кг ΡΏ.

Фармакокинетические параметры.

Для определения концентраций соединения 2 в плазме при эффективной дозе образцы плазмы собирали через 1, 3, 6, 10 и 24 ч в последний день и анализировали (табл. 11). Наблюдали приблизительно пропорциональную дозе концентрацию соединения. Рассчитанные суммарные АиС_{0-24 ч} величины в плазме для каждой группы дозирования составляли 0,88, 2,33, 5,93 и 17,0 мкМ-ч для 0,25, 1, 2 и 5 мг/кг соответственно. Рассчитанные АиС_{0-24 ч} величины несвязанных фракций в плазме для каждой группы дозирования составляли 0,30, 0,79, 2,0 и 5,7 мкМ-ч для 0,25, 1, 2 и 5 мг/кг соответственно (связывание белками плазмы соединения 2 у мышей составляло 66%).

Таблица 9

Доза и режим введения	Время (ч)	Концентрация в плазме (мкМ) Среднее±5ЕМ
1 мг/кг ВЮ	1	0,73±0,14
1 мг/кг ВЮ	3	0,48±0,04
1 мг/кг ВЮ	б	0,22±0,04
1 мг/кг ВЮ	10	0,11±0,01
1 мг/кг ВЮ	24	0,02±0,00
2 мг/кг φϋ	1	1,02±0,20
2 мг/кг φϋ	3	0,59±0,08
2 мг/кг φϋ	6	0,27±0,08
2 мг/кг φϋ	10	0,21±0,05
2 мг/кг φϋ	24	0,02±0,01

Фармакокинетические/фармакодинамические свойства соединения 2 у мышей, имеющих РС-3 опухоль.

РО маркеры, связанные с тТОК путем.

РИ-РО соотношение между концентрациями соединения 2 в плазме и ингибированием опухолевых РО маркеров, связанных с тТОК путем, определяли после введения единичной дозы соединения. Концентрации р86КР (РО маркер для тТОКС1) и рАк! (8473) (РО маркер для тТОКС2) измеряли в опухоли,

- 29 029164

и они коррелировали с концентрацией соединения в плазме. РК/Р1) соотношение исследовали при различных уровнях доз (0,1, 0,3, 1 и 10 мг/кг). В данном исследовании РК/РО соотношение исследовали при 1 и 10 мг/кг. Имелось зависящее от дозы и времени соотношение между концентрацией соединения 2 в плазме и концентрациями р§6РР и рАк! (§473) в опухоли (фиг. 21). При уровне дозы 1 мг/кг р§6РР и рАк! (§473) были значительно (р<0,001) ингибированы в течение 10 ч (приблизительно 80 и 65% ингибирование для р§6РР и рАк! (§473) соответственно) при концентрации в плазме 0,12±0,003 мкМ. При уровне дозы 10 мг/кг, >80% ингибирование обоих РИ маркеров сохранялось в течение 24 ч (фиг. 21; табл. 10).

Таблица 10

Доза	Время отбора образца (ч)	Концентрация соединения 2 в плазме (мкМ) Среднее±ЗЕМ	Ингибирование Ρϋ маркеров (%)
рЗбНР	рАКТ (3473)
10 мг/кг	1	6,78±1,16	85, 3	87, б
3	5,69±0,96	91,3	88,3
6	2,10±0,22	93,5	86,9
10	1,18±0,20	93,7	86,0
24	0,80±0,09	93,2	79, 8
1 мг/кг	1	0,53±0,02	84, б	79, б
3	0,34±0,01	89, 5	65, 1
6	0,13±0,01	82,8	69,9
10	0,12±0,00	78,7	65, 5
24	0,005±0,00	0, 0	19, 0
0,3 мг/кг	0,5	0,16±0,03	69, 8	77,2
1	0,16±0,01	79, б	70,7
3	0,07±0,01	73,5	52,9
6	0,07±0,01	67,3	42,2
10	0,04±0,01	57,9	23, 0
24	0,00±0,00	33,3	9, б
0,1 мг/кг	0,5	0,05±0,00	45, 7	50, 0
1	0,04±0,00	38,2	25, 1
3	0,02±0,00	27,2	15, 3
6	0,02±0,00	23,3	14,2
10	0,01±0,00	17, б	2,5
24	вь<2	00, 0	0, 0

В данном исследовании исследовали РК/РО соотношение при низких дозах 0,3 и 0,1 мг/кг (табл. 10). При 0,3 мг/кг значительное ингибирование р§6РР (р<0,001) и рАк! (§473) (р<0,05) наблюдали вплоть до 10 и 6 ч соответственно; однако значительное ингибирование (р<0,05) обоих РИ маркеров наблюдали только через 0,5 ч для уровня дозы 0,1 мг/кг.

Данные исследований РК/РО соединения 2 показывают, что в общем концентрации в плазме >0,12 мкМ необходимы для ингибирования >80% р§6РР и >65% рАк! (§473). При уровне дозы 1 мг/кг ВГО (минимальная эффективная доза) концентрации в плазме выше 0,12 мкМ сохранялись в течение 6 ч дважды в день, и это приводило к 65% снижению объема опухоли. При 0)0 дозировании концентрации в плазме >0,12 мкМ сохранялись в течение по меньшей мере 10 ч (0,21 мкМ через 10 ч) при 2 мг/кг, что приводило приблизительно к 65% снижению объема опухоли. На основе РК/РО соотношения между концентрацией соединения 2 в плазме и ингибированием РИ биомаркеров, а также соотношения между концентрацией соединения 2 в плазме и данными о снижении объема опухоли в РС-3 ксенотрансплантатах сохранение концентрации (>0,12 мкМ) и степени ингибирования биомаркеров в течение 10 ч с введением дозы один раз в день или по меньшей мере в течение 6 ч дважды в день (ВГО дозирование) под- 30 029164

тверждает хорошую противоопухолевую эффективность в РС-3 опухолях. рРХА-РК (82056).

Данное исследование планировали для демонстрации ингибирования рОЫА-РК (82056) в РС-3 опухолях, обработанных соединением 2. Для определения степени ингибирования рОЬА-РК (82056) в РС-3 опухолях мышам с опухолями вводили плацебо или соединение 2 при 5 мг/кг (РР в течение 6 дней); опухоли собирали через 2 ч после введения последней дозы на 6 день и обрабатывали для иммуногистохимии, определяя суммарные (ОЫА-РК) и фосфо (рЭЬА-РК (82056)) белки. В РС-3 опухолях, обрабатываемых плацебо, имелось много клеток, которые показывали сильный иммунофлуоресцентный сигнал для ΌΝΆ-РК и рЭЬА-РК (82056). Имелось 98% снижение (р<0,0001) пороговой величины, которое было положительным для р^NΆ-РК (82056) в опухолях, обрабатываемых соединением 2, по сравнению с опухолями, обрабатываемыми плацебо. Отсутствовала значительная разница положительной пороговой величины, окрашенной антителом к ^NΆ-РК, в опухолях, обрабатываемых плацебо и соединением 2. Настоящие данные позволяют предположить, что соединение 2 ингибирует р^NΆ-РК (82056) в РС-3 опухолях.

Для определения кинетики ингибирования для р^NΆ-РК (82056) после обработки соединением 2 РС-3 опухолей мышам, имеющим опухоли, вводили дозы плацебо или соединения 2 (5 мг/кг, РР) в течение 6 дней и опухоли собирали через 3, 6, 10, 24, 36 и 48 ч после введения последней дозы и обрабатывали для иммуногистохимии, определяя ^NΆ-РК и р^NΆ-РК (82056). Экспрессию р^NΆ-РК (82056) нормализовали к экспрессии суммарных ^NΆ-РК (фиг. 22). Значительное (р<0,001) ингибирование р^NΆ-РК (82056) (приблизительно 90%) наблюдали в течение 24 ч после введения последней дозы соединения 2. В дальнейшем, р^NΆ-РК (82056) иммунофлуоресценция постепенно возвращалась к уровню контроля через 48 ч (фиг. 22). Поскольку образцы плазмы не собирали в данном исследовании, непосредственное РК/РР соотношение между ингибированием р^NΆ-РК (82056) и концентрацией соединения 2 в плазме нельзя было определить. Однако данные о содержании в плазме из предыдущего исследования эффективности с дозой 5 мг/кг показали, что содержалось 0,13 мкМ соединения 2 в плазме через 24 ч после введения последней дозы. Вместе, настоящие данные показывают, что приблизительно 90% ингибирование р^NΆ-РК (82056) может быть достигнуто при концентрациях соединения 2 в плазме >0,13 мкМ.

Исследования механизма действия.

Антипролиферативная и антиангиогенная активность соединения 2.

Для определения потенциального механизма действия соединения 2 опухоли животных, обрабатываемых плацебо (перорально, РР в течение 6 дней) или соединением 2 (перорально 5 мг/кг, РР в течение 6 дней), собирали через 2 ч после введения последней дозы на 6 день и обрабатывали для иммуногистохимии. Иммуногистохимию с анти-Кг67 антителом применяли для определения того, ингибирует ли соединение 2 рост опухоли путем блокирования пролиферации опухолевых клеток ίη νίνο. К167 представляет собой ядерный антиген, экспрессируемый в клетках. Была показана сильная корреляция между фракцией пролиферирующих клеток в 8-фазе и показателем К167. Срезы опухолей совместно окрашивали анти-СР-31 антителом, определяя антиангиогенную активность соединения. СР-31 (также называемое РЕСАМ-1), антитело распознает СР-31 молекулу, экспрессируемую на мембранах эндотелиальных клеток, и оно участвует в их адгезионных взаимодействиях. Ядра контрокрашивали Хехстом. Пролиферирующие клетки и микрососуды оценивали количественно, применяя программное обеспечение Μе!атогрН и выражали в виде процента пороговой величины.

В РС-3 опухолях, обрабатываемых плацебо, приблизительно 35% пороговой величины было положительными для К167. Имелось 93% снижение (р<0,001) количества пролиферирующих клеток в опухолях, обрабатываемых соединением 2, по сравнению с опухолями, обрабатываемыми плацебо. Более 3% пороговой величины включало СР31-положительные сосуды в срезах РС-3 опухолей с контролем плацебо, как определено СР31 иммуногистохимией. Имелось значительно (50% снижение, р<0,05) меньше СР31 положительных кровеносных сосудов в РС-3 опухолях, обрабатываемых соединением 2, по сравнению с опухолями, обрабатываемыми плацебо. Настоящие данные позволяют предположить, что антипролиферативная активность и антиангиогенная активность соединения 2 представляют собой потенциальные механизмы, лежащие в основе противоопухолевой активности соединения 2.

Апоптозная активность соединения 2.

Для определения, вызывает ли соединение 2 апоптоз в РС-3 ксенотрансплантатах, опухоли животных, обрабатываемых плацебо (перорально, РР в течение 6 дней) и соединением 2 (5 мг/кг, перорально, РР в течение 6 дней), собирали через 2 ч после введения последней дозы на 6 день и обрабатывали для ТРАТТ. который метил апоптозные клетки. В данном исследовании терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТбТ) вводит Р1ТС меченые нуклеотиды в концы разрывов нитей ДНК ίη кйи (Оаупей, 1992). Р1ТС меченые нуклеотиды (представляющие клетки с разрывами нитей ДНК, отличительный признак апоптоза) можно детектировать, используя микроскоп, снабженный приставкой для определения флуоресценции. Относительно мало (0,2%) ТЦХЕЬ-положительных клеток наблюдали в РС-3 опухолях, обрабатываемых плацебо. Не наблюдали значительного изменения количества ТЦХЕЬположительных клеток между опухолями, обрабатываемыми плацебо и соединением 2, при уровне дозы

- 31 029164

5 мг/кг (данные не показаны).

Выводы.

Данные исследования показывают следующее.

Обработка соединением 2, двойным ^NА-ΡΚ^/ΤОКΚ^, значительно ингибировало рост РС-3 опухоли предстательной железы зависящим от дозы способом.

Минимальная эффективная доза, требуемая для ингибирования роста РС-3 опухоли, составляла 2 мг/кг 0Ό. Суммарная АИС_{0-24 ч} величина в плазме при минимальной эффективной дозе составляла 5,93 мкМ-ч. АИС_{0-24 ч} свободной фракции в плазме при минимальной эффективной дозе составляла 2,0 мкМ-ч.

Значительное ингибирование маркеров тТОК пути, р§6КР и рАк! (§473), в опухолях, обрабатываемых соединением 2, показывает, что наблюдаемая противоопухолевая активность соединения 2 опосредована ингибированием и тТОКС1 и тТОКС2. Значительное ингибирование р^NА-ΡΚ (§2056) также наблюдали в РС-3 опухолях, обрабатываемых соединением 2. Поскольку РС-3 ксенотрансплантатная модель является чувствительной к тТОК ингибированию, вклад ингибирования р^NА-ΡΚ (§2056) соединением 2 в наблюдаемую противоопухолевую активность нельзя определить в данной модели.

В РС-3 опухолях РК/РЭ соотношение показывает, что >80% ингибирование р§6КР и >65% ингибирование рАк! (§473) получали для суммарной концентрации лекарственного средства в плазме более чем 0,12 мкМ. Сохранение концентрации в плазме >0,12 мкМ и данной степени ингибирования биомаркеров в течение 10 ч с введением дозы один раз в день или в течение 6 ч дважды в день (ВГО дозирование) подтверждает хорошую противоопухолевую активность в РС-3 опухолях.

Иммуногистохимические данные показывают, что наблюдаемая противоопухолевая активность соединения 2 является не только результатом ингибирования пролиферации опухолевых клеток, но также результатом антиангиогенной активности соединения 2 ίη νίνο.

Противоопухолевая активность соединения 1 в модели кастрационно-резистентного Б-ЖАР ЕЖ'.’аР-НК) рака предстательной железы.

Исследование с применением ксенотрансплантата проводят на мышах, имеющих кастрационнорезистентную Б-ЖчР-НК опухоль. Кастрированным особям §СГО мышей инокулировали подкожно БЖ'.'аР-НК клетки в боковую область выше правой задней ноги. После инокуляции животных опухоли выращивали приблизительно до 300 мм³ перед случайным распределением на группы. Через три недели после инокулирования опухолевых клеток мышей, имеющих ^NСаΡ-НК опухоли в диапазоне 100 и 400 мм³, объединяли и распределяли случайным образом по различным группам обработки. Соединение 1 формулировали в 0,5% СМС и 0,25% Т\\ееп 80 в воде (в виде суспензии). Животным перорально вводили плацебо (СМС-Т\уееп) или соединение 1 один раз в день (Οϋ) в течение вплоть до 15 дней. Дозы соединения 1 были в диапазоне 5-20 мг/кг. Положительный контроль МЭУ-3100 (50 мг/кг, Ο4Ό) вводили пероральным путем. МОУ-3100 формулировали в 1% СМС, 0,1% Т\\ееп 80 и 5% диметилсульфоксиде (ОМ§О) в воде (в виде суспензии). Опухоли измеряли дважды в неделю, используя штангенциркуль, и рассчитывали объемы опухолей, применяя формулу А2/Б/2. Проводили статистический анализ, применяя однофакторный дисперсионный анализ (АNОУА), с последующим сравнением полученных результатов, применяя тест Даннета, с контрольной группой, обрабатываемой плацебо.

Был процетирован ряд ссылок, описание которых включено в настоящее описание путем ссылки во всей своей полноте. Варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, не ограничиваются по объему конкретными вариантами осуществления, описанными в примерах, которые предполагаются для иллюстрации некоторых аспектов раскрытых вариантов осуществления, и любые варианты осуществления, которые являются функционально эквивалентными, включены в настоящее раскрытие. Действительно, различные модификации вариантов осуществления, раскрытых в настоящем описании в дополнение к вариантам, показанным и описанным в настоящем изобретении, будут очевидны специалисту в данной области техники, и предполагается, что они попадают в пределы объема прилагаемой формулы изобретения.

- 32 029164

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения рака предстательной железы, включающий введение эффективного количества 1этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, имеющему рак предстательной железы, где рак предстательной железы не является ЕТ§ сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы и где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
2. Способ по п.1, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован Р13К/тТОК путь.
3. Способ по п.2, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован Р13К/тТОК путь в результате потери РТЕЫ, мутации Р1К3Са или сверхэкспрессии ЕСРК или их комбинации.
4. Способ по п.1, где указанному пациенту вводят единичную лекарственную форму, содержащую около 10, около 15, около 20 или около 30 мг 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
5. Способ улучшения состояния согласно критерию рабочей группы 2 по специфическому антигену

простаты (Р§А^С2) для рака предстательной железы пациента, включающий введение эффективного количества 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера пациенту, имеющему рак предстательной железы, где рак предстательной железы не является ЕТ§ сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы и где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино [2,3 Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера.
6. Способ по п.5, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован Р13К/тТОК путь.
7. Способ по п.6, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором Р13К/тТОК путь активирован в результате потери РТЕЫ, Р1К3Са мутации или ЕСРК сверхэкспрессии или их комбинации.
8. Способ ингибирования фосфорилирования §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак1 в биологическом образце пациента, имеющего рак предстательной железы, включающий введение эффективного количества 1-этил7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту и сравнение количества фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак в биологическом образце пациента, полученном перед и после введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где меньшее количество фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, относительно количества фосфорилированных §6КР, 4Е-ВР1 и/или Ак в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного 1-этил-7-(2-метил-6(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, показывает ингибирование, где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера и где рак предстательной железы не является ЕТ§ сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
9. Способ по п.8, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован Р13К/тТОК путь.
10. Способ по п.9, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором Р13К/тТОК путь активирован в результате потери РТЕЫ, мутации Р1К3Са или сверхэкспрессии ЕСРК или их комбинации.
11. Способ ингибирования активности ДНК-зависимой протеинкиназы (ΌΝΆ-ΓΕ) в образце кожи пациента, имеющего рак предстательной железы, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3 -ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ъ]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту и срав- 33 029164

нение количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в биологическом образце пациента, полученном перед и после введения указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где меньшее количество фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в указанном биологическом образце, полученном после введения указанного, относительно количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ в указанном биологическом образце, полученном перед введением указанного 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, показывает ингибирование, где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1-этил-7-(2-метил-6-(4Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера и где рак предстательной железы не является ЕТ8 сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
12. Способ по п.11, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован ΡI3Κ/тТОК путь.
13. Способ по п.12, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором ΡI3Κ/тТОК путь активирован в результате потери ΡТЕN, мутации ΡIΚ3Са или сверхэкспрессии Е0РК или их комбинации.
14. Способ измерения ингибирования фосфорилирования 86ΚΡ, 4Е-ВР1 или ΑΚΙ у пациента, имеющего рак предстательной железы, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированных 86ΚΡ, 4Е-ВР1 или ΑΚΙ у указанного пациента и сравнение указанного количества фосфорилированных 86ΚΡ, 4Е-ВР1 или ΑΚΙ с количествами у указанного пациента перед введением эффективного количества 1 -этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3 -ил)пиридин-3 -ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера и где рак предстательной железы не является ЕТ8 сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
15. Способ по п.14, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован ΡI3Κ/тТОК путь.
16. Способ по п.15, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором ΡI3Κ/тТОК путь активирован в результате потери ΡТЕN, мутации ΡIΚ3Са или сверхэкспрессии Е0РК или их комбинации.
17. Способ измерения ингибирования фосфорилирования ΌΝΑ-ΡΚ 82056 в образце кожи пациента, имеющего рак предстательной железы, включающий введение эффективного количества 1-этил-7-(2метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера указанному пациенту, измерение количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ 82056, присутствующего в образце кожи, и сравнение указанного количества фосфорилированной ΌΝΑ-ΡΚ 82056 с количеством в образце кожи указанного пациента перед введением эффективного количества 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин-3-ил)-3,4дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где указанному пациенту вводят около 0,5, около 1, около 2, около 4, около 8, около 16, около 20, около 25, около 30 или около 40 мг/день 1-этил-7-(2-метил-6-(1Н-1,2,4-триазол-3-ил)пиридин3-ил)-3,4-дигидропиразино[2,3-Ь]пиразин-2(1Н)-она или его фармацевтически приемлемой соли, стереоизомера или таутомера, где рак предстательной железы не является ЕТ8 сверхэкспрессирующим кастрационно-резистентным раком предстательной железы.
18. Способ по п.17, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован ΡI3Κ/тТОК путь.
19. Способ по п.18, где рак предстательной железы представляет собой рак предстательной железы, в котором активирован ΡI3Κ/тТОК путь в результате потери ΡТЕN, мутации ΡIΚ3Са или сверхэкспрессии Е0РК или их комбинации.

- 34 029164