[go: up one dir, main page]

EA009181B1 - Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции - Google Patents

Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции Download PDF

Info

Publication number
EA009181B1
EA009181B1 EA200300708A EA200300708A EA009181B1 EA 009181 B1 EA009181 B1 EA 009181B1 EA 200300708 A EA200300708 A EA 200300708A EA 200300708 A EA200300708 A EA 200300708A EA 009181 B1 EA009181 B1 EA 009181B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
recombinant
thioredoxin
oil
redox
Prior art date
Application number
EA200300708A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300708A1 (ru
Inventor
Гейс Ван Роэйен
Харм Декерз
Петер Бернард Хайфетц
Стивен П. Бриггз
Бипин Кумар Далмиа
Грегг Дель Вал
Стив Заплачински
Морис Молони
Original Assignee
Сембайосиз Джинетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сембайосиз Джинетикс, Инк. filed Critical Сембайосиз Джинетикс, Инк.
Publication of EA200300708A1 publication Critical patent/EA200300708A1/ru
Publication of EA009181B1 publication Critical patent/EA009181B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

Описаны улучшенные способы получения мультимерных белковых комплексов, таких как редокс-белки и иммуноглобулины, связанных с масляными тельцами. Редокс-белок является ферментативно активным при получении в связанном с масляными тельцами виде. Представлены также имеющие к ним отношение нуклеиновые кислоты, белки, клетки, растения и композиции.

Description

Область изобретения
Данное изобретение относится к мультимерным белковым комплексам, редокс-белкам и рекомбинантным полипептидам и улучшенным способам их получения.
Предпосылки
Мультимерные белки (т.е. белки, содержащие множественные полипептидные цепи) являются биологически и коммерчески важным классом белков. Например, антитела являются мультимерными белками, которые используются для лечения большого диапазона патологических состояний. Однако в связи с их сложностью (комплексностью) мультимерные белки часто представляют значительные затруднения с точки зрения их производства.
Редокс-белки являются также коммерчески важным классом белков с применениями во множестве различных отраслей промышленности, в том числе фармацевтической промышленности, промышленности, изготовляющей продукты для личной гигиены, и пищевой промышленности. Например, редоксбелок тиоредоксин может быть использован в изготовлении продуктов для личной гигиены (заявки на патент Японии 1Ρ 9012471 А2, 1Ρ 103743 А2, 1Ρ 1129785 А2), фармацевтических композиций/продуктов (Ао!а е! а1. (1996) 1. Сагбюу. Ρ1ιιγιικκο1. (1996) 27: 727-732), а также для уменьшения белковых аллергенов, присутствующих в пищевых продуктах, таких как молоко (бе1 ναΐ е! а1. (1999) 1. А11егд. νΐίη. Iттипо1. 103: 690-697) и пшеница (Висйапап е! а1. (1997) Егос. №111. Асаб. 8с1. и8А 94: 5372-5377).
Однако в данной области техники существует потребность для дополнительного улучшения способов рекомбинантной экспрессии мультимерных белков, в том числе редокс-белков. Данное изобретение удовлетворяет эту потребность и обеспечивает также дополнительные преимущества.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к новым и улучшенным способам получения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, полипептидных цепей иммуноглобулинов, иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов и/или слитых родственных тиоредоксину белков в ассоциации с масляными тельцами. Таким образом, здесь обеспечены способы получения рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие: (а) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного мультимерного белкового комплекса; и (Ь) связывание указанного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцом через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным первым рекомбинантным полипептидом.
Этот способ предполагает дополнительно выделение масляных телец, связанных с указанным рекомбинантным мультимерным белковым комплексом. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан со вторым нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с масляным тельцем и указанным вторым рекомбинантным полипептидом. Каждый из указанных нацеливающих на масляные тельца белков может быть белком масляного тельца или иммуноглобулином. Нацеливающим на масляные тельца белком может быть олеозин или калеозин. В том случае, когда нацеливающим на масляные тельца белком может быть олеозин или калеозин, первый рекомбинантный полипептид может быть слит с указанным олеозином или калеозином. Подобным образом, второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут быть получены в виде мультимерного слитого белка, содержащего указанные первый и второй полипептиды, и могут образовывать мультимерный белковый комплекс. Этот мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, и этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом в клетке. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксином, в второй рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксинредуктазой. В конкретных вариантах тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 38, 42, 46, 50 и 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 195-313. В другом варианте первый рекомбинант
- 1 009181 ный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. Клетка может быть растительной клеткой, например клеткой сафлора и т. п.
Здесь обеспечен также способ экспрессии рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, в клетке, причем указанный способ включает:
(a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
(ί) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со (й) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид;
(b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
(ί) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную с (ίί) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид;
(c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать мультимерный белковый комплекс; и (б) связывание указанного первого рекомбинантного полипептида с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным первым рекомбинантный полипептидом. Этот способ предполагает дополнительно выделение из клетки-потомка масляных телец, содержащих мультимерный белковый комплекс. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан во вторым нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с масляным тельцем и вторым рекомбинантным полипептидом. Каждый из нацеливающих на масляные тельца белков может быть белком масляного тельца или иммуноглобулином. Нацеливающим на масляное тельце белком может быть олеозин или калеозин. В том случае, когда нацеливающим на масляное тельце белком может быть олеозин или калеозин, первый рекомбинантный полипептид может быть слит с указанным олеозином или калеозином. Подобным образом, второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут быть получены в виде мультимерного слитого белка, содержащего указанные первый и второй полипептиды, и могут образовывать мультимерный белковый комплекс. Мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, и этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом в указанной клеткепотомке с образованием мультимерного белкового комплекса. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксином, в второй рекомбинантный полипептид может быть тиоредоксинредуктазой. В конкретных вариантах тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей 8ЕО Ш N0: 38, 42, 46, 50 и 8Е0 Ш N0: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в 8ЕЭ Ш N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и ЗЕЭ Ш N0: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. Клетка может быть растительной клеткой, например клеткой сафлора и т.п.
Здесь обеспечены также способы продуцирования в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, причем указанный способ включает:
(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;
(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид; и (c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом,
- 2 009181 а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса. Второй рекомбинантный полипептид может быть связан с масляными тельцами через второй нацеливающий на масляные тельца белок во втором растении. Масляные тельца могут быть выделены из растения-потомка, содержащего указанный мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, где белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Первый рекомбинантный полипептид может быть слит с олеозином или калеозином; и второй рекомбинантный полипептид может быть слит со вторым олеозином или вторым калеозином, способным связываться с масляным тельцем. Первый и второй рекомбинантные полипептиды могут образовывать мультимерный белковый комплекс, например, гетеромультимерный белковый комплекс, где этот гетеромультимерный белковый комплекс может быть ферментативно активным редокс-комплексом или иммуноглобулином. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей 8ЕР ΙΌ N0: 38, 42, 46, 50 и 8ЕР ΙΌ N0 : 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в 8ЕР ΙΌ N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и 8ЕР ΙΌ N0: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. Растением может быть растение сафлора.
Здесь обеспечены также химерные нуклеиновые кислоты, кодирующие мультимерный слитый белок, описанный здесь, причем указанные нуклеиновые кислоты содержат:
(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, связанной в рамке считывания с (c) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина. Белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный белковый комплекс может быть гетеромультимерным белковым комплексом, а первый и второй рекомбинантные полипептиды могут образовывать ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей 8ЕР ΙΌ N0: 38, 42, 46, 50 и 8ЕР ΙΌ N0: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в 8ЕР ΙΌ N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и 8ЕР ΙΌ N0: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляное тельце белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. Еще в одном варианте между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, этот слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, которая является также непротеолитическим линкером, и указанной последовательностью, кодирующей первый рекомбинантный полипептид.
Здесь обеспечены также рекомбинантные мультимерные слитые белки, содержащие:
(ί) нацеливающие на масляные тельца белок или его фрагмент, (й) первый рекомбинантный полипептид и (ΐϊϊ) второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца
- 3 009181 может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей ЗЕЭ Ш N0: 38, 42, 46, 50 и ЗЕО Ш N0: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в ЗЕО Ш N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и ЗЕО Ш N0: 195313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. Еще в одном варианте между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей первый рекомбинантный полипептид.
Здесь обеспечены также выделенные масляные тельца, содержащие мультимерный белковый комплекс, содержащий:
(ί) нацеливающий на масляные тельца белок и (й) первый рекомбинантный полипептид, причем указанные масляные тельца содержат дополнительно второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс. Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С.
Здесь обеспечены также выделенные масляные тельца, содержащие:
(a) первый слитый белок, содержащий первый нацеливающий на масляные тельца белок, слитый с первым рекомбинантным полипептидом; и (b) второй слитый белок, содержащий второй нацеливающий на масляные тельца белок, слитый со вторым рекомбинантным полипептидом, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать мультимерный белковый комплекс.
Нацеливающий на масляные тельца белок может быть выбран из белка масляного тельца или иммуноглобулина, и белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин. Мультимерный слитый белок может быть гетеромультимерным слитым белком, где первый и второй рекомбинантные полипептиды образуют ферментативно активный гетеромультимерный редокс-комплекс или иммуноглобулин. В конкретном варианте первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей ЗЕО Ш N0: 38, 42, 46, 50 и ЗЕО Ш N0: 52-194; а тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в ЗЕЭ Ш N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и ЗЕО Ш N0: 195-313. В другом варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С.
Здесь обеспечены также клетки и трансгенные растения, содержащие масляные тельца, мультимер
- 4 009181 ные белковые комплексы и мультимерные слитые комплексы, представленные здесь. В одном варианте первый рекомбинантный полипептид может быть полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С. В вариантах, где указанным первым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксин, а вторым рекомбинантным полипептидом является тиоредоксинредуктаза, способы, описанные здесь, могут быть использованы для получения масляных телец для применения в изготовлении пищевого продукта, продукта для личной гигиены или фармацевтической композиции. Эти формы могут дополнительно содержать добавку НАДФ или НАДФН. Пищевым продуктом может быть молоко или пищевой продукт на основе пшеницы. Продукт для личной гигиены может уменьшать окислительный стресс, оказываемый на площадь поверхности тела человека, или может быть использован для осветления кожи. Фармацевтическая композиция может быть использована для лечения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), катаракты, диабета, интоксикации, обусловленной укусом ядовитого животного, бронхо-легочного заболевания, злокачественных опухолей, псориаза, реперфузионного повреждения, заживления ран, сепсиса, желудочно-кишечного кровотечения, воспалительного заболевания пищеварительного тракта (ΙΒΌ), язв, желудочно-пищеводного рефлюкса (ΟΕΚϋ).
Здесь обеспечены также композиции, содержащие выделенные масляные тельца, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу, где указанный тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей 3ΕΟ ΙΌ N0: 38, 42, 46, 50 и 3Ε0 ΙΌ N0: 52-194; а указанная тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в 3Ε0 ΙΌ N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и 3Ε0 ΙΌ N0: 195-313. Эта композиция может дополнительно содержать НАДФ или НАДФН. В другом варианте эта композиция содержит первый рекомбинантный полипептид, который может быть полипептидной цепью иммуноглобулина, и второй рекомбинантный полипептид. Например, первый рекомбинантный полипептид может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а второй рекомбинантный полипептид может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С.
Обеспечены также мультимерные слитые белки, где такой слитый белок содержит две или более полипептидных цепей, выбранных из группы белков, представленных на фиг. 5. Обеспечены также способы уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающие стадии получения выделенных масляных телец, описанных здесь; и добавления выделенных масляных телец к пищевым продуктам, посредством чего аллергенность этих пищевых продуктов уменьшается. Пищевой продукт может быть выбран из группы, состоящей из пшеничной муки, пшеничного теста, молока, сыра, йогурта и мороженого. Различные способы обработки пищевых продуктов могут дополнительно предусматривать обеспечение НАДН в качестве кофактора, по существу, в отсутствие НАДФН.
Обеспечены также способы лечения или защиты мишени от окислительного стресса, включающие стадии получения рекомбинантного слитого редокс-полипептида, содержащего тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу; и контактирования рекомбинантного слитого полипептида с мишенью, где эта мишень является чувствительной к окислительному стрессу, посредством чего обеспечивается лечение или защита от этого стресса. Мишень может быть выбрана из группы, состоящей из молекулы, молекулярного комплекса, клетки, ткани и органа.
Здесь обеспечены также способы получения ферментативно активного редокс-белка, связанного с масляными тельцами, включающие:
a) получение в клетке слитого редокс-полипептида, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;
b) связывание указанного слитого редокс-полипептида с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-полипептидом и указанными масляными тельцами; и
c) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-полипептидом. Первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза.
Здесь обеспечены также способы получения иммуноглобулина, включающие:
(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первой полипептидной цепи иммуноглобулина и второй полипептидной цепи иммуноглобулина, где указанная первая полипептидная цепь иммуноглобулина способна связываться с указанной второй полипептидной цепью иммуноглобулина с образованием указанного иммуноглобулина; и (b) связывание указанного иммуноглобулина с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанной первой полипептидной цепью иммуноглобулина. Например, первая полипептидная цепь иммуноглобулина может быть легкой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью, а вторая полипептидная
- 5 009181 цепь иммуноглобулина может быть тяжелой цепью иммуноглобулина или ее иммунологически активной частью. В этом варианте нацеливающий на масляные тельца белок может содержать белок А, белок Ь или белок С.
Здесь обеспечены также способы для получения редокс-белка или иммуноглобулина, связанного с масляными тельцами, включающие:
a) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со
2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:
(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную с (ίί) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин, содержащий первую полипептидную цепь иммуноглобулина, связанную со второй полипептидной цепью иммуноглобулина, функционально связанной с
3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке;
b) выращивание указанной клетки в условиях, позволяющих осуществить экспрессию указанного слитого редокс-полипептида или иммуноглобулина, в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; и
c) выделение из указанной клетки-потомка указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин. В некоторых вариантах между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тельца, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин, может быть расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Необязательно, слитый ген дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей первый слитый редокс-полипептид. В этом необязательном варианте рассматривается также введение фермента или химикалия, который отщепляет указанный слитый редокс-полипептид от указанного масляного тельца, посредством чего получают выделенный слитый редокс-полипептид. Первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а указанным вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза. В одном варианте тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза могут быть получены из ЛгаЬИор818. В другом варианте первый редокс-белок является по меньшей мере в 5 раз более активным при получении его в виде слитого редокс-полипептида в сравнении с получением этого первого редокс-белка без второго редокс-белка.
Здесь также обеспечена для применения с различными способами, изложенными здесь, композиция эмульсии масляных телец, связанных со слитым редокс-полипептидом для применения в получении продукта, способного лечить окислительный стресс в мишени, продукта, способного химически восстанавливать мишень, фармацевтической композиции, продукта для личной гигиены или пищевого продукта. Таким образом, обеспечена эмульсионная композиция.
Здесь обеспечена также химерная нуклеиновая кислота, содержащая:
1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в клетке-хозяине, функционально связанную со
2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:
(ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную с (ίί) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с
3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке. Белком масляного тельца может быть олеозин или калеозин, первым редокс-белком может быть тиоредоксин, а указанным вторым редокс-белком может быть тиоредоксинредуктаза. В некоторых вариантах между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тельца, и указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая
- 6 009181 избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. В одном варианте этот слитый ген необязательно дополнительно содержит линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем эта линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и указанной последовательностью, кодирующей слитый редокс-полипептид.
Здесь обеспечены также трансгенные растения, например, растения сафлора, содержащие любую из химерных последовательностей нуклеиновых кислот и конструкций, описанных здесь. Химерные нуклеиновые кислоты могут содержаться в плазмиде. Таким образом, обеспечены выделенные плазмиды, имеющие в них химерные нуклеиновые кислоты. Также обеспечены семена растений, содержащие обеспеченные здесь химерные нуклеиновые кислоты.
Обеспечены также препараты масляных телец, полученные с использованием любого из обеспеченных здесь способов, и пищевые продукты, фармацевтические композиции и продукты для личной гигиены, содержащие препараты масляных телец. Продукты и/или композиции, обеспеченные здесь, способны лечить окислительный стресс в мишени, способны химически восстанавливать мишень. Обеспечена также детергентная композиция, содержащая препарат масляных телец, способная химически восстанавливать мишень, и связанные с ней способы очистки предмета, включающие нанесение такого продукта на предмет в условиях, стимулирующих очистку.
Здесь обеспечены также конструкции нуклеиновых кислот, содержащие слияние генов, содержащее первый участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный со вторым участком, кодирующим по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент. В одном варианте по меньшей мере одним родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксин. Тиоредоксин может быть выбран из группы, состоящей из последовательностей ЗЕО Ш N0: 38, 42, 46, 50 и ЗЕС Ш N0: 52-194. Тиоредоксин может быть получен из ЛгаЫбор818 или из пшеницы.
В другом варианте по меньшей мере одним родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксинредуктаза.
Тиоредоксинредуктаза может быть выбрана из группы, состоящей из последовательностей, представленных в ЗЕС Ш N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48, 50 и ЗЕС Ш N0: 195-313 и/или получена из ЛгаЫбор818 или из пшеницы. Тиоредоксинредуктаза может быть НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазой. Второй участок может кодировать тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу. В одном варианте тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу получают из МусоЬас1егшт 1ергае. В другом варианте по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок может быть сконструированным слитым белком. Первый участок может предшествовать в направлении 5'-3' второму участку. Альтернативно, первый участок следует в направлении 5'-3' за вторым участком. Слияние генов может необязательно дополнительно содержать третий участок, кодирующий второй родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, функционально связанный с первым участком или со вторым участком или с обоими. С этим слиянием генов может быть функционально связан семеноспецифический промотор, например, промотор фазеолина. В одном варианте, по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок получен из вида растения, выбранного из группы, состоящей из ЛгаЬИор818 или пшеницы. В другом варианте по меньшей мере один родственный тиоредоксину белок может быть получен из Е. сой.
В одном варианте это слияние генов дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, где эта линкерная аминокислотная последовательность расположена между первым участком и вторым участком. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Кроме того, это слияние генов может дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между избегающей поверхности масляного тельца линкерной аминокислотной последовательностью и вторым участком.
Здесь обеспечены также трансгенные растения, содержащие конструкцию нуклеиновых кислот, содержащую слияние генов, содержащее участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент. Родственным тиоредоксину белком может быть тиоредоксин. Эта конструкция нуклеиновой кислоты может содержаться в плазмиде. В одном варианте, когда первый родственный тиоредоксину белок является тиоредоксином, конструкция может дополнительно содержать участок, кодирующий тиоредоксинредуктазу. Это слияние генов может необязательно содержать дополнительно третий участок, кодирующий второй родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент,
- 7 009181 функционально связанный с первым участком, или со вторым участком, или с обоими. Это слияние генов может необязательно дополнительно содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, где эта нуклеиновая кислота, кодирующая линкерную аминокислотную последовательность, расположена между участком, кодирующим белок масляного тельца, и участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок. Эта избегающая поверхности масляного тельца линкерная аминокислотная последовательность может быть, по существу, отрицательно заряженной или иметь молекулярную массу по меньшей мере 35 кД. Слияние генов может необязательно дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, причем линкерная последовательность расположена между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность, и участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок.
Обеспечены также трансгенное растение, содержащее конструкцию нуклеиновой кислоты, семеноспецифический промотор, функционально связанный со слиянием генов, где это слияние генов содержит участок, кодирующий белок масляного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, где слитый белок, обладающий активностью олеозина и родственного тиоредоксину белка, продуцируется в семени растения. В другом варианте обеспечен родственный тиоредоксину белок, имеющий концентрацию по меньшей мере 0,5% общего клеточного белка семени. Здесь обеспечен также экстракт, обладающий активностью родственного тиоредоксину белка. Обеспечены также масляные тельца и/или масло, полученное из различных семян.
Здесь обеспечены также способы получения слитого белка, обладающего родственной тиоредоксину активностью, включающие стадии:
a) обеспечения трансгенного растения, содержащего конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую семеноспецифический промотор, функционально связанный со слиянием генов, где это слияние генов обладает участком, кодирующим белок маслянного тельца или его активный фрагмент, функционально связанный с участком, кодирующим первый родственный тиоредоксину участок или его активный фрагмент, причем это слияние генов кодирует слитый белок, обладающий родственной тиоредоксину активностью;
b) получения семян из растения и
c) извлечения слитого белка посредством выделения масляных телец из семян. В одном варианте масляные тельца фракционируют для получения частичной очистки слитого белка. Масляные тельца могут быть связаны со слитым белком. Белок масляных телец может быть отщеплен от родственного тиоредоксину белка после фракционирования масляных телец. В стадии отщепления можно использовать протеазу или химический протеолиз.
Здесь обеспечены также способы уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающие стадии:
a) получения препарата, содержащего масляные тельца, связанные со слитым белком, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активный фрагмент и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент; и
b) добавления этого препарата к пищевому продукту, посредством чего аллергенность этого пищевого продукта уменьшается вследствие активности родственного тиоредоксину белка или фрагмента. Пищевым продуктом может быть пшеничная мука, пшеничное тесто, молоко, сыр, йогурт и мороженое. В одном варианте используют НАДН в качестве кофактора, по существу, в отсутствие НАДФН.
Здесь обеспечены также фармацевтические композиции, содержащие слитый белок, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активную часть и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, в фармацевтически приемлемом носителе. Масляные тельца могут быть связаны со слитым белком. Обеспечена также косметическая композиция, содержащая масляные тельца, связанные со слитым белком, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активную часть и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент, в фармацевтически приемлемом носителе. Обеспечены также способы лечения или защиты мишени от окислительного стресса, включающие стадии:
a) получения препарата, содержащего слитый белок, причем слитый белок содержит белок масляных телец или его активный фрагмент и родственный тиоредоксину белок или его активный фрагмент; и
b) контактирования препарата с мишенью, где эта мишень является чувствительной к окислительному стрессу, и тем самым лечения или защиты от этого стресса. Мишень может быть выбрана из группы, состоящей из молекулы, молекулярного комплекса, клетки, ткани и органа.
Обеспечена также конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая слияние генов, где слияние генов содержит первый участок, кодирующий белок масляных телец или его активный фрагмент, функционально связанный со вторым участком, кодирующим по меньшей мере один полипептид или его фрагмент и избегающий поверхности масляного тельца линкер в рамке считывания между полипептида
- 8 009181 ми первого и второго участков. Обеспечены также способы экспрессии этой конструкции с образованием кодируемой аминокислотной последовательности; и масляные тельца, композиции, эмульсии, клетки и растения, содержащие конструкцию и кодируемую аминокислотную последовательность. Конкретные конструкции, масляные тельца, композиции, эмульсии, клетки и растения могут быть получены в соответствии со способами, описанными здесь. Второй участок может кодировать любой полипептид, например, терапевтически, питательно, промышленно или косметически полезный пептид, описанный здесь. Например, второй участок может кодировать редокс-белок, иммуноглобулин, родственный тиоредоксину белок или любой один или несколько рекомбинантных полипептидов мультимерного белкового комплекса.
Другие признаки и преимущества данного изобретения станут легко понятными из следующего подробного описания. Однако должно быть понятно, что это подробное описание и конкретные примеры, раскрывающие конкретные варианты осуществления данного изобретения, приводятся только в качестве иллюстрации.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с С1и81а1^, известной последовательности нуклеиновой кислоты НАДФН-тиоредоксинредуктазы (8ΕΟ ΙΌ N0: 9) (ΑΤΤΗΙΚΕΌΒЛассцю! с1 а1. 1. Мо1. Βίο1. (1994) 235 (4): 1357-63) с последовательностью, выделенной здесь в примере 1 (ΤΗ; 5ΕΕ) ΙΌ N0: 8).
Фиг. 2 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с С1и51а1\У. расшифрованной аминокислотной последовательности известной последовательности нуклеиновой кислоты НАДФНтиоредоксинредуктазы (8Е0 ΙΌ N0: 12 (ΑΤΤΗΙΚΕΌΒ 1асцио1 с1 а1. 1. Мо1. Βίο1. (1994) 235 (4): 1357-63) с последовательностью, выделенной здесь в примере 1 (ΤΗ; 8Ε0 ΙΌ N0: 13).
Фиг. 3 показывает сопоставление, отформатированное в соответствии с С1и51а1\У. аминокислотной последовательности синтетического слияния тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин АгаЬИоркщ 1Ьа11апа (АгаЬ ΤΒ-1ίηΕ-ΤΓχ1ι; 8Ε0 ΙΌ N0: 37) с природным слиянием тиоредоксинредуктаза-тиоредоксин МусоЬас1егшт 1ергае (М.1ер ΤΚ/ΤγχΗ; 8Ε0 ΙΌ N0: 36). В целом эти белки являются приблизительно на 50% идентичными на уровне аминокислот.
Фиг. 4 представляет диаграмму в виде столбцов, показывающую измерения активности тиоредоксина/тиоредоксинредуктазы для различных фракций трансгенных семян АгаЫборкщ. Относительная удельная активность выражена в виде процента активности тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы Е. со11. Пронумерованные столбцы на диаграмме соответствуют следующему:
1. ^.Τ. + олеозин-тиоредоксин
2. ^.Τ. + тиоредоксин-олеозин
3. ^.Τ. + тиоредоксин
4. ^.Τ. + олеозин-тиоредоксинредуктаза
5. ^.Τ. + тиоредоксинредуктаза-олеозин
6. ^.Τ. + тиоредоксинредуктаза
7. тиоредоксин + олеозин-тиоредоксинредуктаза
8. тиоредоксин + тиоредоксинредуктаза-олеозин
9. тиоредоксин + тиоредоксинредуктаза
10. тиоредоксинредуктаза + олеозин-тиоредоксин
11. тиоредоксинредуктаза + тиоредоксин-олеозин
12. олеозин-М.1ер. ΤΒ/ΤγχΕ
13. тиоредоксинредуктаза Е. со11 + тиоредоксин, где ^.Τ. - означает дикий тип.
Фиг. 5 представляет перечень примеров белков для применения в гетеромультимерных слитых белках и гетеромультимерных белковых комплексах, описанных здесь.
Подробное описание
Как упоминалось выше, данное изобретение относится к новым и улучшенным способам получения мультимерных белков, в том числе первого и второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, полипептидных цепей иммуноглобулинов, иммуноглобулинов, слитых редокс-белков и первого и второго родственных тиоредоксину белков; и родственных продуктов. Эти способы обеспечивают возможность получения активных мультимерных белковых комплексов, ассоциированных (связанных) с масляными тельцами. Масляные тельца в ассоциации с мультимерным белковым комплексом могут быть использованы для получения разнообразных полезных эмульсий.
Таким образом, здесь обеспечены способы получения рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, связанного с масляным тельцем, причем указанный способ включает:
(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного мультимерного белкового комплекса; и (b) связывания указанного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцем через нацели
- 9 009181 вающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом.
Определения и термины.
Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, в котором они обычно понимаются специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Где это допускается, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации и последовательности из ОепВапк, ίλνίδδΡίΌ и других баз данных, которые цитируются во всем описании здесь, включены в качестве ссылки в их полном виде.
В применении здесь фраза «мультимерный белковый комплекс» относится к двум или более полипептидным цепям, которые постоянно или периодически взаимодействуют или постоянно или периодически координируются с образованием биологически активного комплекса, содержащего указанные две или более полипептидных цепей. Следует отметить, что полипептиды могут быть независимо биологически активными без взаимодействия или координации с образованием комплекса. Мультимерный белковый комплекс может обеспечивать биологическую структуру, или он может быть способен облегчать химическую или биологическую реакцию. Например, один из участков белка в этом мультимерном белковом комплексе может периодически активировать или периодически инактивировать биологическую или метаболическую активность одного или более других белков, содержащихся в этом мультимерном белковом комплексе. В одном варианте первый и второй рекомбинантные полипептиды, содержащиеся в мультимерном белковом комплексе, могут либо связываться, либо взаимодейтствовать в качестве независимых не непрерывных полипептидных цепей, или мультимерный белковый комплекс может быть приготовлен в виде слитого полипептида (мультимерного слитого белка) между первым и вторым рекомбинантными полипептидами.
Одним из примеров периодического (например, повторяющегося) взаимодействия или периодической (или повторяющейся) ассоциации между двумя или более полипептидами мультимерного белкового комплекса, обеспеченного здесь, является взаимодействие между двумя или более неидентичными редокс-белками с образованием гетеромультимерного белкового комплекса. Примерами редокс-белков для применения в этой связи являются тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза. Следующим примером является взаимодействие между двумя или более полипептидными цепями иммуноглобулина с образованием иммуноглобулина. В данном контексте фраза «гетеромультимерный белковый комплекс» относится к двум или более неидентичным полипептидным цепям, которые постоянно или периодически взаимодействуют или постоянно или периодически координируются с образованием биологически активного комплекса, содержащего указанные две или более полипептидных цепей. Другие примеры мультимерных белковых комплексов, описанных здесь, включают первый и второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, первую и вторую полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редоксполипептиды и первый и второй родственные тиоредоксину белки.
Рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс связан с масляным тельцем. В данном контексте фраза «масляное тельце» или «масляные тельца» относится к любой запасающей масло или жир органелле в любом типе клеток. Таким образом, масляные тельца могут быть получены из любой клетки, содержащей масляные тельца, в том числе из растительных клеток (описанных, например, Ниапд (1982) Апп. Кеу. Р1ап1 Μοί. ΒίοΙ. 43: 177-200), животных клеток (описанных, например, Мшрйу (1990) Ргод Πρίά Кек 29(4): 299-324), включающих адипоциты, гепатоциты, стероидогенные клетки, эпителиальные клетки молочной железы, макрофаги, клетки водорослей (описанные, например, Ро881ег (1988) 1. РЬ.у8ю1. Ьопбоп, 24: 394-400), грибковых клеток, в том числе дрожжевых клеток (описанных, например, ЬеЬег е! а1., (1994) Уеак! 10: 1421-1428), и бактериальных клеток (описанных, например, Р1ерег-Рцг81 е! а1., (1994) 1. Вае1егю1. 176: 4328-4337). Предпочтительно масляные тельца, используемые здесь, являются масляными тельцами, получаемыми из растительных клеток, и более предпочтительно масляными тельцами, получаемыми из клеток семян растений.
В данном контексте фраза «способен связываться с», «связываются» или их грамматические вариации относятся к любому взаимодействию между двумя или более полипептидами, в том числе любым ковалентным взаимодействиям (например, мультимерным слитым белкам), а также нековалентным взаимодействиям. Примерами нековалентных взаимодействий могут быть взаимодействия между нацеливающим на масляные тельца белком и редокс-белком или полипептидной цепью иммуноглобулина, а также между двумя или более различными белками, содержащимися в двух или более отдельных слитых с белком масляного тельца белках (например, редокс-белками в олеозин-тиоредоксине и олеозинтиоредоксинредуктазе).
В применении здесь термин рекомбинантный (также называемый гетерологичным), в контексте с рекомбинантными белками и аминокислотами, означает различного природного происхождения или обозначает неприродное состояние. Например, если клетка-хозяин трансформирована нуклеотидной последовательностью, происходящей из другого организма, в частности, из другого вида, эта нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность являются рекомбинантными (гетерологичными) в отношении этой клетки-хозяина и также в отношении потомков клетки-хозяина,
- 10 009181 которые несут этот ген. Подобным образом, термин рекомбинантный (или гетерологичный) относится к нуклеотидной последовательности, происходящей из того же самого природного, исходного типа клеток (или встроенной в тот же самый природный исходный тип клеток), но присутствующей в неприродном состоянии, например, в отличающейся копийности или под контролем разных регуляторных элементов. Трансформирующая нуклеотидная последовательность может включать рекомбинантную кодирующую последовательность или рекомбинантные регуляторные элементы. Альтернативно, трансформирующая нуклеотидная последовательность может быть полностью гетерологичной или может включать любую возможную комбинацию гетерологичных и эндогенных последовательностей нуклеиновых кислот.
В различных вариантах данного изобретения первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки продуцируются в клетке, содержащей масляные тельца. В применении здесь фразы в некоторой клетке, в данной клетке или их грамматические вариации означают, что первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки могут продуцироваться в любом клеточном компартменте клетки, при условии, что клетка несет в себе масляные тельца. В вариантах данного изобретения, в которых используются растительные клетки, эта фраза включает апопласт растения.
В различных представленных здесь вариантах первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки связываются с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок. В применении здесь фраза нацеливающий на масляные тельца белок относится к любому белку, фрагменту белка или пептиду, способному связываться с масляным тельцем. Примеры нацеливающих на масляные тельца белков для применения здесь включают белки масляных телец, такие как олеозин и калеозин; иммуноглобулины, такие как биспецифические антитела и т. п.
В вариантах, описанных здесь, в которых используется белок масляного тельца, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки предпочтительно слиты с белком масляного тельца. Термин белок масляного тельца относится к любому белку, природно присутствующему в клетках и способному связываться с масляными тельцами, в том числе к любому олеозину или калеозину.
Таким образом, здесь обеспечен способ экспрессии рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, в клетке, включающий:
(a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
(ί) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со (й) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок, полипептидная цепь иммуноглобулина или родственный тиоредоксину белок, слитый с белком масляного тельца;
(b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
(ί) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную с (ίί) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок, вторая полипептидная цепь иммуноглобулина или второй родственный тиоредоксину белок;
(c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать мультимерный белковый комплекс, предпочтительно в указанной клетке-потомке; и (б) связывание указанного первого рекомбинантного полипептида с масляным тельцем через белок масляного тельца.
Термин «нуклеиновая кислота» в данном контексте относится к последовательности нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящих из природно встречающихся оснований, сахаров и межсахарных (скелетных) связей. Этот термин включает также модифицированные или замещенные последовательности, содержащие не встречающиеся в природе мономеры или их части, которые функционируют сходным образом. Эти последовательности нуклеиновых кислот могут быть рибонуклеиновыми кисло- 11 009181 тами (РНК) или дезоксирибонуклеиновыми кислотами (ДНК) и могут содержать природно встречающиеся основания, в том числе аденин, гуанин, цитозин, тимидин и урацил. Эти последовательности могут также включать модифицированные основания, такие как ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 6-азаурацил, 6-азацитозин и 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанины, 8-гидроксилгуанин и другие 8-замещенные гуанины, другие аза- и деаза-урацилы, тимидины, цитозины, аденины или гуанины, 5-трифторметилурацил и 5трифторцитозин.
Мультимерные белковые комплексы.
В соответствии со способами и композициями, обеспеченными здесь, могут быть использованы любые два рекомбинантных полипептида, способные образовывать мультимерный белковый комплекс. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие эти два рекомбинантных полипептида, могут быть получены из любого биологического источника или могут быть получены синтетически. В общем, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белки, известны в данной области и являются легкодоступными. Известные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белковые комплексы, могут быть использованы для сборки и конструирования зондов на основе последовательности нуклеиновой кислоты для обнаружения и идентификации ранее не обнаруженных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих мультимерные белковые комплексы, например, посредством скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек или с использованием 2- или мультигибридных систем. Таким образом, могут быть обнаружены и использованы дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие мультимерные белковые комплексы, как описано здесь.
Первые и/или второй рекомбинантные полипептиды, которые содержатся в обеспеченном здесь мультимерном белковом комплексе, могут сами находиться в форме гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов и/или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, может быть получена из разных источников или может быть получена из одного и того же источника. Однако обычно такую последовательность нуклеиновой кислоты получают из одного и того же биологического источника или из сходных биологических источников. В некоторых вариантах, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый и второй рекомбинантные полипептиды, получают из одного и того же источника, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый рекомбинантный полипептид, и второй рекомбинантный полипептид, могут быть природно слитыми. Согласно конкретному варианту, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй рекомбинантные полипептиды, получают из растительного источника.
Избегающие поверхности масляного тельца линкеры.
Полипептидные спейсеры или линкеры вариабельной длины и/или отрицательного заряда могут быть использованы здесь для отделения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов и/или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков от находящегося в рамке считывания нацеливающего на масляные тельца белка для улучшения активности и/или доступности этого полипептида или комплекса. Например, в одном варианте, представленном здесь, между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей достаточную часть белка масляного тела, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, расположена линкерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая избегающую поверхности масляного тельца линкерную аминокислотную последовательность.
Избегающие поверхности масляного тельца линкеры расположены между нацеливающей на масляное тельце последовательностью и находящимся в рамке считывания представляющим интерес рекомбинантным полипептидом, например, мультимерным белковым комплексом, описанным здесь, они служат для увеличения расстояния и/или уменьшения взаимодействия между отрицательно заряженной поверхностью масляного тельца и представляющим интерес рекомбинантным полипептидом.
Отрицательно заряженный линкер отталкивается отрицательно заряженной поверхностью масляного тельца, в свою очередь, увеличивая расстояние или уменьшая взаимодействие присоединенного к не
- 12 009181 му рекомбинантного полипептида с поверхностью масляного тельца. Вследствие увеличенного расстояния от поверхности масляного тельца, рекомбинантный полипептид будет более доступным, например, для его субстрата-мишени, белкового субстрата, белкового партнера, и на него будет меньше воздействовать заряженная поверхность масляного тельца. Примерами линкерных последовательностей для применения здесь могут быть отрицательно заряженный линкер или линкер, имеющий молекулярную массу по меньшей мере около 35 кД или более.
В применении здесь отрицательно заряженная линкерная последовательность обозначает любой аминокислотный сегмент или нуклеиновую кислоту, кодирующую его, который имеет р1 (изоэлектрическую точку), меньшую или равную р1 масляного тельца. В некоторых вариантах р1 отрицательно заряженного линкера находится на приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30% до приблизительно 25 или более ниже величины р1 масляного тельца в конкретной используемой системе растения или клеток. Могут быть получены примеры отрицательно заряженных линкеров, содержащих любую комбинацию отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Например, в одном варианте отрицательно заряженный линкер содержит либо полиглутаматную, либо полиаспартатную последовательность или любую комбинацию обоих аминокислотных остатков. Отрицательно заряженный линкер обычно имеет длину по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислотных остатков. Отрицательно заряженные линкеры предпочтительно являются непротеолитическими (например, непротеолитическими линкерами), не имеющими сайта для эффективного протеолиза. Когда используют не заряд, а размер линкера для минимизации взаимодействия представляющего интерес рекомбинантного полипептида с поверхностью масляного тельца, этот линкер является непротеолитическим и имеет молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 35 кД до приблизительно 100 кД. Верхнюю границу размера выбирают таким образом, чтобы экспрессия, активность, конформация и/или доступ к мишени представляющего интерес рекомбинантного полипептида не подвергались значимому влиянию линкера.
В некоторых вариантах, описанных здесь, где используют непротеолитическую линкерную аминокислотную последовательность, слияние генов или слитый белок (мультимерный слитый белок) может дополнительно содержать линкерную последовательность нуклеиновой кислоты или линкерную аминокислотную последовательность, кодирующую последовательность, которая является специфически расщепляемой ферментом или химикалием, где эта линкерная последовательность расположена между непротеолитической линкерной последовательностью и последовательностью, кодирующей желаемый участок рекомбинантного белка, такого как, например, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, представленные здесь. Когда используют расщепляемую линкерную последовательность, в конкретном варианте осуществления изобретения она находится ниже непротеолитической линкерной последовательности от участка нацеливающего на масляное тельце белка этого слитого белка. Благодаря расщепляемому линкеру, рекомбинантные слитые полипептиды, описанные здесь, такие как мультимерные слитые белки и слитые редокс-полипептиды, могут быть выделены и очищены введением фермента или химикалия, который отщепляет указанный мультимерный слитый белок и/или слитый редокс-полипептид от указанного масляного тельца с получением и/или выделением посредством этого желаемого белка. Здесь предполагается, что применение расщепляемой линкерной последовательности ниже непротеолитической линкерной/спейсерной последовательности будет улучшать выход извлечения белка при выделении или очистке белков с использованием обеспеченных здесь способов.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый или второй рекомбинантные полипептиды, могут быть изменены для улучшения уровней экспрессии, например, оптимизацией последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с предпочтительно используемым кодоном для конкретного типа клеток, который выбирают для экспрессии первого и второго рекомбинантных полипептидов, или изменением мотивов, которые, как известно, дестабилизируют мРНК (см., например, патентную заявку РСТ 97/02352). Сравнение использования кодонов первого и второго рекомбинантных полипептидов с использованием кодонов хозяина позволит идентифицировать кодоны, которые могут быть изменены. Например, обычно эволюция растений имеет тенденцию в направлении предпочтения обогащенных СО нуклеотидных последовательностей, в то время как бактериальная эволюция привела к смещению в направлении обогащенных АТ нуклеотидных последовательностей. Посредством модификации последовательностей нуклеиновых кислот для включения последовательностей нуклеиновых кислот, предпочитаемых клеткой-хозяином, экспрессия может быть оптимизирована. Конструирование синтетических генов изменением использования кодонов описано, например, в патентной заявке РСТ 93/07278. Первый и второй рекомбинантые полипептиды могут быть изменены с использованием, например, направленного мутагенеза, случайного мутагенеза (8Ыга18Ы е! а1. (1998) Агс11. Вюсйет. Вюрйуз. 358: 104115; Оа1кш е! а1. (1997) Рго!еш Епд. 10: 687-690; Сагидо е! а1. (1997) Рго!еш8 28: 10-28; Ниг1еу е! а1. (1996) ВюсйетМгу 35: 5670-5678), перетасовки генов и/или добавлением органического растворителя (Но1тЬегд е! а1. (1999) Рго!ет Епд. 12: 851-856). Любые полипептидные спейсеры, которые используют в соот
- 13 009181 ветствии со способами и продуктами, обеспеченными здесь, могут быть изменены аналогичными путями.
В особых вариантах, обеспеченных здесь, рекомбинантные полипептиды или родственные тиоредоксину белки, способные образовывать мультимерный белковый комплекс, способны к образованию гетеромультимерного белкового комплекса. Примеры гетеромультимерных белковых комплексов, которые содержат полипептидные цепи, которые периодически взаимодействуют, для активации, инактивации, окисления, восстановления, стабилизации и т.д., друг с другом, которые могут быть получены в ассоциации с масляными тельцами с использованием обеспеченных здесь способов, включают комплексы, представленные на фиг. 5. Таким образом, примеры белков для применения в гетеромультимерных белковых комплексах, и конструкций нуклеиновых кислот, кодирующих их, обеспеченные здесь, включают, среди прочих, описанных здесь, гетеромультимерные белковые комплексы, представленные на фиг. 5.
Другие полипептидные участки, которые могут быть использованы в первом и/или втором рекомбинантных полипептидах, мультимерных белковых комплексах, гетеромультимерных белковых комплексах, мультимерных слитых белках, гетеромультимерных слитых белках, иммуноглобулинах, полипептидных цепях иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидах или первом и/или втором родственных тиоредоксину белках, обеспеченных здесь, включают комплексы участков иммуноглобулинов, представленные в табл. 1.
Таблица 1
Гетеродимеры антител
Класс или молекула Субъединицы
ЕаЬ Вариабельная область и первая константная область тяжелой цепи и полная легкая цепь
Γν Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител
1дА Тяжелые цепи, легкие цепи и соединительный СГ-пептид
1дС, 1дЭ, 1дЕ Тяжелые и легкие цепи
1дМ Тяжелые цепи, легкие цели и соединительный Ц-пептид
Цепь (цепи) антител и токсин Цепь (цепи) антител и токсин
Аутоантигены, аллергены и антигены трансплантата с адъювантом или толерогеном Аутоантигены, аллергены и антигены трансплантата с адъювантом или толерогеном
Химеры с использованием Есдомена антитела Субъединицы рецептора, слитые с константной областью тяжелых цепей антител
Как представлено выше, в одном варианте примеры гетеромультимерных белковых комплексов и примеры гетеромультимерных слитых белков, обеспеченных здесь, содержат редокс-белки, такие как тиоредоксины и тиоредоксинредуктазы и иммуноглобулины.
Нацеливающие на масляные тельца белки.
Последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нацеливающий на масляные тельца белок, которая может быть использована в способах и композициях данного изобретения, может быть любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеливающий на масляные тельца белок, фрагмент белка или пептид, способный связываться с первым рекомбинантным полипептидом, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редоксполипептидами и/или первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками и масляными тельцами. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая нацеливающий на масляные тельца пептид, может быть синтезирована или получена из любого биологического источника.
Например, в одном варианте нацеливающим на масляные тельца белком является иммуноглобулин или произведенная из иммуноглобулина молекула, например биспецифическое одноцепочечное антитело. Получение одноцепочечных антител и биспецифических одноцепочечных антител известно в данной области (см., например, патенты США ϋ8 5763733, ϋδ 5767260 и ϋδ 5260203). Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие одноцепочечные антитела, функционирующие как нацеливающие на масляные тельца белки, могут быть получены из гибридомных клеточных линий, экспрессирующих моноклональные антитела, индуцированные против олеозина, как описано АШпд-Меез е! а1. (2000) ГВС'з Аппиа1 1п1егпаИопа1 Соп£егепсе оп АпйЬоЦу-Епддпееппд;, Роз1ег #1. Для получения специфичности в отношении первого рекомбинантного полипептида, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая второе одноцепочечное антитело, полученное из моноклональных антител, индуцированных против
- 14 009181 первого рекомбинантного полипептида, может быть получена и связана с одноцепочечным антителом против олеозина. В этом варианте масляное тельце связывается с первым рекомбинантным полипептидом через нековалентные взаимодействия нацеливающего на масляные тельца белка с первым рекомбинантным полипептидом и масляным тельцем. Альтернативно, первый рекомбинантный полипептид может быть получен в виде слитого белка с нацеливающим на масляные тельца белком. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая одноцепочечное антитело, индуцированное против олеозина, может быть слита с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид.
Нацеливающие на масляные тельца белки, не основанные на иммуноглобулине, способные связываться с первым рекомбинантным полипептидом, могут быть обнаружены и получены с использованием, например, способов фагового представления (Рйагтаиа Вю!есй Са!а1одие ЫитЬег 27-9401-001 КесотЫпап! Рйаде АпНЬобу 8ук!ет Ехргеккюп КН).
Нацеливающие на масляные тельца белки могут быть также химически модифицированными. Например, олеозины могут быть модифицированы изменением химической модификации остатков лизина с использованием химических агентов, таких как биотинил-Ы-гидроксисукцинимидный эфир, приводящий к процессу, называемому биотинилированием. Это удобно выполнять биотинилированием ш νίίτο масляных телец. Биотинилирование ш νίνο может выполняться с использованием пептидного домена биотинилирования из биотинкарбокси-белка-носителя ацетил-СоА-карбоксилазы Е. сой (8ιηί11ι е! а1. (1998) Ыис1. Асйк. Кек. 26: 1414-1420). Авидин или стрептавидин могут быть затем использованы для выполнения связывания этого редокс-белка с масляным тельцем.
В конкретном варианте этим нацеливающим на масляные тельца белком является белок масляного тельца, такой как, например, олеозин или калеозин или их достаточная часть, способная нацеливать на масляное тельце. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие олеозины, известны в данной области. Они включают, например, олеозин АгаЫборйк (сап Кооуеп е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю. 18: 11771179); (сап Кооуеп е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю. 18: 1177-1179); олеозин кукурузы (Он апб. Ниапд (1990) 1. Вю1. Сйет. Уо1. 265 4: 2238-2243); олеозин семян рапса (Бее апб Ниапд (1991) Р1ап! РЬукюЕ 96: 13951397); и олеозин моркови (На1хорон1ок е! а1. (1990) Р1ап! Се11 Уо1. 2, 457-467.). Последовательности нуклеиновых кислот калеозина также известны в данной области (Ыаек!еб е! а1. (2000) Р1ап! Мо1 Вю1. 44 (4): 463-476; Сйеп е! а1. (1999) Р1ап! Се11 РЬ.у8ю1. 40 (10): 1079-1086). Белки масляных телец из клеток животных, которые могут также использоваться здесь, включают в себя адофилин (Вгакает1е е! а1. (1997) 1. Ырй Кек., 38: 2249-2263; Ней е! а1. (1998) Се11 Т1ккие Кекеагсй 294: 309-321), перилипин (В1апсйе!!еМасйе е! а1. (1995), 1. ΠΐρΐΠ Кек. 36: 1211-1226; 8епеИиск е! а1. (1995) 1. Вю1. Сйет. 270: 16970-16973), аполипопротеины, такие как Α-Ι, Α-ΙΙ, А-1У, С-Ι, С-11, С-ΙΙΙ (8едгек! е! а1. (1990), Рго!ешк 8: 103-117) и апоВ (Сйайейоп е! а1. (1995) 1. Ырй Кек. 36: 2027-2037; Эау1к. КА ш: Уапсе ΌΕ, Уапсе 1. ебйогк. Ырорго!ет к1гис!иге апб кесге!юп. Тйе Ые1йег1апбк, Е1кеу1ег, 191: 403-426.
В одном варианте первый рекомбинантный полипептид слит с белком масляного тельца. Эта методология описана подробно в патенте США И8 5650554, который включен здесь в качестве ссылки в его полном виде. Первый рекомбинантный полипептид может быть слит с Ν-концом, а также с С-концом белка масляного тельца (как описано в Мо1опеу апб сап Кооуеп (1996) ЮТОКМ 7: 107-113), и могут быть использованы фрагменты белка масляного тельца, такой как, например, центральный домен молекулы олеозина или модифицированные версии белка масляного тельца. В этом варианте второй рекомбинантный полипептид экспрессируется внутриклеточно и затем внутриклеточно связывается с первым рекомбинантным полипептидом с образованием мультимерного белкового комплекса в клетке. Затем масляные тельца, содержащие мультимерный белковый комплекс, подходящим образом выделяют из клеток.
В следующем варианте как первый, так и второй рекомбинантные полипептиды по отдельности связывают с белком масляного тельца. В этом варианте последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй полипептиды, могут быть получены по отдельности и введены в отдельные клеточные линии, или они могут быть введены в одни и те же клеточные линии. Если эти последовательности нуклеиновых кислот введены в одну и ту же клеточную линию, эти последовательности нуклеиновых кислот могут быть получены с использованием двух отдельных экспрессирующих векторов, или они могут быть получены с использованием единственного вектора, содержащего последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый полипептид, слитый с белком масляного тельца, и второй полипептид, слитый с белком масляного тельца. Если используются отдельные клеточные линии, используют последующее скрещивание потомков (например, скрещивание растений) для получения поколения клеток, содержащих масляные тельца, которые содержат первый и второй рекомбинантные полипептиды, слитые с белком масляного тельца.
В другом альтернативном варианте первый и второй рекомбинантные полипептиды сливают с образованием мультимерного слитого белка, содержащего мультимерный белковый комплес. В таком варианте первый и второй полипептиды связаны с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться со слитым белком и с масляным тельцем. В особом варианте слитый белок, содержащий мультимерный белковый комплекс, слит с белком масляного тельца, например, олеозином или калеозином.
- 15 009181
В представленных здесь вариантах, в которых мультимерный белковый комплекс является иммуноглобулином (например, мультимерным иммуноглобулиновым комплексом), особенно предпочтительным нацеливающим на масляные тельца белком является олеозин или калеозин, связанные с иммуноглобулинсвязывающим белком, таким как, например, белок А (патент США 5151350), белок Ь (патент США И8 5965390) и белок С (патент США И8 4954618) или активные фрагменты таких иммуноглобулинсвязывающих белков.
Новые белки масляных телец могут быть обнаружены, например, получением масляных телец (описанным более подробно ниже) и идентификацией белков в этих препаратах с использованием, например, электрофореза в ДСН-ПААГ. Могут быть индуцированы поликлональные антитела против этих белков и использованы для скрининга библиотек кДНК для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец. Эти методологии известны специалисту в данной области (Ниуий с1 а1. (1985) ίη ΌΝΆ С1ошид Уо1. 1. а РгасИса1 ЛрргоасН ей. ΌΜ С1оуег, ШЬ Ргезз, рр 4978). Новые белки масляных телец могут быть также обнаружены с использованием известных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец (например, последовательностей нуклеиновых кислот ЛгаЫйор818, семян рапса, моркови и кукурузы) для зондирования, например, библиотек кДНК или геномных библиотек на присутствие последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки масляных телец.
В одном варианте первый и второй полипептиды являются первым и вторым редокс-белками. Таким образом, один вариант, обеспеченный здесь, относится к новым и усовершенствованным способам для получения редокс-белков. Неожиданно было обнаружено, что редокс-белок при получении в виде слитого белка со вторым редокс-белком является полностью ферментативно активным при получении в связанном с масляным тельцом виде. В противоположность этому при получении редокс-белка без второго редокс-белка он имеет уменьшенную ферментативную активность. В одном варианте первый редокс-белок является по меньшей мере в 5 раз более активным при получении в виде слитого редоксполипептида в сравнении с получением в виде неслитого полипептида.
Таким образом, здесь обеспечены способы получения масляного тельца, связанного с гетеромультимерным редокс-белковым комплексом, включающие:
(a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого редокс-белка и второго редокс-белка, где указанный первый редокс-белок способен взаимодействовать с указанным вторым редокс-белком, предпочтительно в клетке, с образованием указанного гетеромультимерного редокс-белкового комплекса; и (b) связывание указанного гетеромультимерного редокс-белкового комплекса с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и указанным гетеромультимерным редокс-белковым комплексом.
В конкретном варианте первый и второй редокс-белки получают в виде слитого белка с образованием слитого редокс-полипептида. Таким образом, здесь обеспечены способы получения ферментативно активного редокс-белка, связанного с масляными тельцами, включающие:
a) получение в клетке слитого редокс-полипептида, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;
b) связывание указанного слитого редокс-полипептида с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-полипептидом и указанными масляными тельцами; и
c) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-полипептидом. Масляные тельца, связанные с этим редокс-белком могут быть использованы для получения разнообразных полезных эмульсий.
В данном контексте фраза «редокс-белки» или ее грамматические вариации, относится к любому белку или активному фрагменту белка, способному участвовать в переносе электронов.
Например, редокс-белки способны катализировать перенос электрона от донора электрона (также называемого часто восстановителем) к акцептору электрона (также называемому часто окислителем). В процессе переноса электрона восстановитель (донор электрона) окисляется, а окислитель (акцептор электрона) восстанавливается. Примеры используемых здесь редокс-белков включают железосеросодержащие белки, цитохромы, редокс-активные тиол-белки и редокс-активные флавопротеины. Известно, например, что для выполнения их функции в качестве каналов для электронов, редокс-белки, такие как тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза, функционируют посредством взаимодействия или связывания друг с другом в мультимерных белковых комплексах (например, гетеромультимерных белковых комплексах).
Термин слитый редокс-полипептид в данном контексте относится к любому слитому полипептиду, содержащему первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком (например, в виде трансляционного слияния в рамке считывания). Редокс-белки, которые могут быть использованы в способах и композициях данного изобретения, могут быть любым редокс-белком. В одном варианте первый и второй редокс-белки являются парой редокс-белков, которые могли бы в норме оба происходить из одного и того же источника в природе. В конкретном варианте первым редокс-белком является тиоредоксин, а
- 16 009181 вторым редокс-белком является тиоредоксинредуктаза.
Слитый редокс-полипептид может быть получен в любой клетке, содержащей масляные тельца, в том числе в любой клетке животного, растительной клетке, клетке водорослей, грибковой клетке или бактериальной клетке. В некоторых вариантах слитый редокс-белок продуцируется в растительной клетке и в конкретных вариантах слитый редокс-полипептид продуцируется в клетках семян семенного растения.
В специфических вариантах нацеливающий на масляные тельца белок, который используется, является белком масляного тельца. В вариантах данного изобретения, в которых используют белок масляного тельца, первый и второй редокс-белки предпочтительно являются ковалентно слитыми с белком масляного тельца. Таким образом, здесь обеспечены способы получения редокс-белка, связанного с масляным тельцем, включающие:
a) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со
2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:
(ί) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную в рамке считывания со (ίί) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с
3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке;
b) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного слитого редокс-полипептида в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; и
c) выделение указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-полипептид, из указанной клетки-потомка.
Редокс-белки.
В соответствии с различными способами и композициями, описанными здесь, может быть использована любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая редокс-белок. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и/или второй редокс-белки, может быть получена из любого биологического источника или может быть получена синтетически. В общем, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, хорошо известны в данной области и являются легкодоступными. См., например, СпкОапо е! а1. (1993) Сеиотюк 17: (2) 348-354, Ооуата е! а1. (1998) Р1ап! 8с1. 137: 53-62, Ноеоед е! а1. (1984) Вюкск Вер. 4: 917-923; а также последовательности базы данных 8\νίδ5 Рго!еш, приведенные в табл. 5. Известные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, могут быть использованы для сборки и конструирования последовательностей зондов нуклеиновых кислот для обнаружения и идентификации ранее не обнаруженных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих редокс-белки, например, посредством скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек. Таким образом, дополнительные последовательности нуклеиновых кислот могут быть открыты и использованы в соответствии с данным изобретением.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и/или второй редокс-белки, могут быть получены из разных источников или могут быть получены из одного и того же источника. Однако обычно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый редокс-полипептид, содержит последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй редокс-белки, полученные из одного и того же источника или из сходных биологических источников. В некоторых приведенных здесь вариантах, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первый и второй редокс-белки, получена из одного и того же источника, нуклеиновые кислоты, кодирующие первый редокс-белок и второй редокс-белок, могут быть природно слитыми. В соответствии с особым вариантом эти последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и второй редокс-белки, предпочтительно получают из растительного источника.
Как описано выше, полипептидный спейсер или линкер вариабельной длины может отделять первый и второй редокс-белки друг от друга и/или от нацеливающего на масляные тельца белка; и дополнительные редокс-белки (например, один или более) могут быть слиты с первым и/или вторым редоксбелком.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие редокс-белки, могут быть изменены для улучшения уровней экспрессии, например, оптимизацией последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с предпочтительно используемым кодоном для конкретного типа клеток, который выбирают для экспрессии редокс-белков, или изменением мотивов, которые, как известно, дестабилизируют мРНК (см., например, патентную заявку РСТ 97/02352). Сравнение использования кодонов редоксбелков с использованием кодонов хозяина позволит идентифицировать кодоны, которые могут быть изменены. Например, обычно эволюция растений имеет тенденцию в направлении предпочтения обога
- 17 009181 щенных СС нуклеотидных последовательностей, в то время как бактериальная эволюция привела к смещению в направлении обогащенных АТ нуклеотидных последовательностей. Экспрессия может быть оптимизирована модификацией последовательностей нуклеиновых кислот для включения последовательностей нуклеиновых кислот, предпочтительных для клетки-хозяина. Конструирование синтетических генов изменением используемых кодонов описано, например, в патентной заявке РСТ 93/07278. Редокс-белки могут быть изменены с использованием, например, направленного мутагенеза, случайного мутагенеза (8Ыга1§Ы е! а1. (1998) АгсН. ВюсНет. ВюрНуъ. 358: 104-115; Са1кт е! а1. (1997) Рго!ет Епд.10: 687-690; Сагидо е! а1. (1997) Рго!еш8 28: 10-28; Ниг1еу е! а1. (1996) В1осйет18!гу 35: 5670-5678, и/или добавлением органического растворителя (Но1тЬегд е! а1. (1999) Рго!еш Епд. 12: 851-856). Полипептидные спейсеры между первым и вторым редокс-белками могут быть изменены аналогичными путями.
Первый и второй редокс-белки могут быть выбраны для развития двухмерного матрикса и определения, какая комбинация первого и второго редокс-белков является наиболее эффективной в переносе электронов, с использованием, например, колориметрического анализа восстановления (ЗоНпюп е! а1. (1984) 1. о£ Вас!. Уо1. 158 3: 1061-1069, ЬШЬтап е! а1. (1982) ВюсКептПх Уо1. 21 26: 6628-2233). Комбинации тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы могут тестироваться определением восстановления запасных белков пшеницы и запасного белка молока бета-лактоглобулина ίη νίΙΐΌ (Эе1 Уа1 е! а1. (1999) 1. А11егд. Сйп. 1ттипо1. 103: 690-697). С использованием той же самой стратегии полипептидные спейсеры между первым и вторым редокс-белками могут быть оценены на их эффективность.
Первый и второй редокс-белки, которые могут быть использованы здесь, включают, без ограничения, любой первый редокс-белок и второй редокс-белок, выбранные из группы редокс-белков, состоящей из цитохромов, таких как цитохром а, цитохром Ь и цитохром с; порфиринсодержащих белков, например, гемоглобина; железо-серосодержащих белков, таких как ферредоксин; флавопротеинов, таких как тиоредоксинредуктаза, НАДФ-дегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, дигидролипоилдегидрогенза, ацил-СоА-дегидрогеназа, оксидаза Ό-аминокислот, ксантиноксидаза, оротатредуктаза и альдегидоксидаза; связанных с пиридином дегидрогеназ, например лактатдегидрогеназы, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и бета-гидроксибутиратдегидрогеназы; и содержащих активный тиол редокс-белков, таких как тиоредоксин.
В конкретных вариантах обеспеченными здесь белками являются тиоредоксин и восстанавливающая его тиоредоксинредуктаза (которые вместе называют здесь также «родственными тиоредоксину» белками)). В данном контексте термин «тиоредоксин» относится к относительно малым белкам (обычно приблизительно 12 кДа), которые принадлежат к семейству тиолтрансфераз, катализирующих окисление-восстановление через образование или гидролиз дисульфидных связей, и распределены широко, если ни повсеместно, во всем царстве животных, растений и бактерий. Восстановленная форма тиоредоксина является превосходным катализатором для восстановления даже наиболее неподатливых дисульфидных связей. Для восстановления окисленного тиоредоксина, два клеточных восстановителя обеспечивают восстановительные эквиваленты: восстановленный ферредоксин и НАДФН. Эти восстановительные эквиваленты поставляются тиоредоксину через взаимодействие или ассоциацию с различными тиоредоксинредуктазами, в том числе НАДФН-тиоредоксинредуктазой и ферредоксин-тиоредоксинредуктазой.
Подача этих восстановительных эквивалентов требует образования гетеромультимерного белкового комплекса, содержащего тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу. Ферредоксин-тиоредоксинредуктаза участвует в восстановлении растительных тиоредоксинов, обозначаемых Тгх£ и Тгхт, которые участвуют в регуляции фотосинтетических процессов в хлоропласте.
НАДФН/тиоредоксин, активный в семенах растений, обозначают ТгхН (также называемый здесь тиоредоксином Ιι-типа). и он способен восстанавливать широкий диапазон белков, функционируя в качестве важного клеточного окислительно-восстановительного (редокс) буфера. Обычно, в бактериальных клетках и клетках животных обнаруживается только один тип тиоредоксина, который аналогичен растительному типу Тгх11. Тиоредоксины Ιι-типа способны восстанавливаться НАДФН и НАДФНтиоредоксинредуктазой. Приводимые в качестве примеров тиоредоксины дополнительно характеризуются как белок, имеющий центральную часть из 5 β-складок, окруженных 4-6-а-спиралями. Приводимые в качестве примеров тиоредоксины дополнительно характеризуются наличием активного центра, содержащего консенсусную аминокислотную последовательность: X С Υ Υ С Ζ, где Υ является любой аминокислотой, такой как гидрофобные или неполярные аминокислоты, где X может быть любой из 20 аминокислот, предпочтительно гидрофобной аминокислотой, такой как триптофан, и Ζ может быть любой аминокислотой, предпочтительно полярными аминокислотами. В некоторых вариантах тиоредоксины для применения здесь содержат активный центр, имеющий аминокислотную последовательность X С С Р С Ζ. Когда цистеины в активном центре тиоредоксина или подобных тиоредоксину белков являются окисленными, они образуют внутримолекулярную дисульфидную связь. В восстановленном состоянии те же самые активные центры способны участвовать в окислительно-восстановительных (редокс) реакциях через обратимое окисление дитиола его активного центра до дисульфида и катализировать реакции дитиолсульфидного обмена.
Примеры тиоредоксинов хорошо известны в данной области и могут быть получены из нескольких
- 18 009181 организмов, в том числе АгаЬ1бор818 !йайапа (ВВена Мабпб е! а1. (1995) Ргос. №111. Асаб. 8с1. 92: 56205624), пшеницы (Саийег е! а1. (1998) Еиг. I. Вюсйет. 252: 314-324); ЕзсйейсЫа сой (Ноеоед е! а1. (1984) В1овс1. Вер. 4: 917-923) и термофильных микроорганизмов, таких как Ме1йапососси5 )аппа5с1ш и АгсНаео§1оЬи8 Ги1д1бик (патентная заявка РСТ 00/36126). Тиоредоксины были также рекомбинантно экспрессированы в нескольких системах-хозяевах, в том числе бактериях (СанОег е! а1. (1998) Еиг 1. В1осйет. 252: 314-324) и растениях (патентная заявка РСТ \У0 00/58453). Коммерческие препараты тиоредоксинов из Е. сой являются легкодоступными, например, из 81дта, Са!. Ыо. Т 0910 Тйюгебохш (Е. сой, рекомбинантный; экспрессируемый в Е. сой).
Примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды тиоредоксина, для применения в данном изобретении являются легкодоступными из множества различных биологических источников, в том числе Е. Сой (Ноеоед е! а1. (1984) ВюзсЕ Вер.: 4 917-923); МеИапососсиз )аппа5с1ш и Агсйаеод1оЬи8 ШдИиз (патентная заявка РСТ 00/36126); АгаЬ1бор818 Найапа (ВАега-Мабпб (1995) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8сЕ 92: 5620-5624); пшеницы (Саийег е! а1. (1998) Еиг. I. Вюсйет. 252(2): 314-324); табака (Мабу е! а1. (1991) Р1ап! Мо1. Вю1. 17: 143-148); ячменя (патентная заявка РСТ 00/58352); риса (1вЫтеа1аг1 е! а1. (1995) Р1ап!а 195: 456-463); сои (8й1 е! а1. (1996) Р1ап! Мо1. Вю1. 32: 653-662); семян рапса (Во^ег е! а1., Р1ап! Се11 8: 1641-1650) и теленка (ТегазЫта е! а1. (1999) ОЫА 8ес.|. 10(3): 203-205) и т.д. В других вариантах примеры нуклеиновых кислот для применения здесь включают нуклеиновые кислоты, кодирующие тиоредоксин и подобные тиоредоксину полипептидные цепи, представленные в 8ЕР Ш N0: 38, 42, 46 и 50; и нуклеиновые кислоты, кодирующие тиоредоксин и подобные тиоредоксину цепи, представленные в табл. 5 в виде 8ЕР Ш N0: 52-194. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты, представленные в 8ЕР Ш N0: 52-194, могут быть легко идентифицированы через идентификационные номера (номера доступа), приведенные в табл. 5 (в скобках).
В данном контексте термин «тиоредоксинредуктаза» откосится к белку, который образует комплексы с флавином, таким как РАО. Соединение флавина служит в качестве донора электрона для активного центра белка тиоредоксинредуктазы.
Тиоредоксинредуктазы имеют окислительно-восстановительно активный центр дисульфидной связи, способный восстанавливать тиоредоксин. Активный центр тиоредоксинредуктазы содержит 2 цистеина. Тип аминокислот, окружающих эти 2 остатка цистеина, образующих активный центр, может варьироваться в виде гидрофобных, неполярных и полярных аминокислот. Примером тиоредоксинредуктазы является НАДФН-тиоредоксинредуктаза (ΝΤΒ), которая является цитозольным гомодимерным ферментом, содержащим обычно 300-500 аминокислот. Были получены кристаллические структуры тиоредоксинредуктазы как Е. сой, так и растений (^акзтап е! а1. (1994) I. Мо1. Вю1. 236: 800-816; Эа1 е! а1. (1996) I. Мо1. В1о1. 264: 1044-1057). НАДФН-тиоредоксинредуктазы были экспрессированы в гетерологичных хозяевах, например, НАДФН-тиоредоксинредуктаза АгаЬ1борз13 была экспрессирована в Е. сой (бассцю! е! а1. (1994) I. Мо1. Вю1. 235: 1357-1363) и пшенице (патентная заявка РСТ 00/58453).
Примеры последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки тиоредоксинредуктазы, могут быть легко получены из различных источников, таких как последовательность, изображенная в табл. 5 в представленном здесь Списке последовательностей, обеспеченном здесь, из АгаЬ1борз13 (ВВейа Мабпб е! а1. (1995) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8οΐ. И8А 92: 5620-5624), Е. сой (Виззе1 е! а1. (1988) I. Вю1. Сйет. 263: 9015-9019); ячменя (патентная заявка РСТ 00/58352) и пшеницы (Саийег е! а1. (1998), Еиг. 1. Вюсйет. 252: 314-324); и т.п. В других вариантах примеры нуклеиновых кислот для применения здесь включают последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи тиоредоксинредуктаз, представленные в виде 8ЕР Ш N0: 8, 9, 10, 40, 44, 48 и 50, и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептидные цепи тиоредоксинредуктаз, представленные в табл. 5 в виде последовательностей 8 Ер Ш N0: 195-313. Соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие аминокислоты, представленные в 8ЕР Ш N0: 195-313, могут быть легко идентифицированы через идентификационные номера (номера доступа) базы данных 8^155 Рго!еш, приведенные в табл. 5 (в скобках).
Предполагается также применение в способах и композициях, обеспеченных здесь, гомологов нуклеиновых кислот и аминокислот, которые являются по существу гомологичными нуклеиновым кислотам и аминокислотам тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, представленным здесь, которые включают полипептиды тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, кодируемые последовательностью нуклеотидов, которая гибридизуется в условиях низкой, умеренной или высокой жесткости с последовательностью нуклеотидов, кодирующей нуклеиновые кислоты и аминокислоты тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, представленные здесь (например, в примерах, списке последовательностей и/или табл. 5). В применении здесь гомолог ДНК или нуклеиновой кислоты обозначает нуклеиновую кислоту, которая включает предварительно выбранную консервативную нуклеотидную последовательность, например, последовательность, кодирующую терапевтический полипептид. Под термином по существу гомологичные имеют в виду обладающие по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% гомологией с ней или более низкий процент гомологии или идентичности с сохранением биологической активности или функции.
Термины гомология или идентичность часто используются взаимозаменяемо. В этом отношении, процент гомологии или идентичности может быть определен, например, сравнением информации
- 19 009181 последовательностей с использованием компьютерной программы САР. Программа САР использует способ сопоставления №еб1етап апб \Уипкс11 (1. Мо1. ΒίοΙ. 48: 443 (1970), пересмотренный 8111Ш1 апб \Уа1егтап (Αάν. Арр1. МаШ. 2: 482 (1981). Вкратце, программа САР определяет сходство как число сопоставляемых символов (т. е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее число символов в более короткой из двух сравниваемых последовательностей. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы САР могут включать: (1) унитарную матрицу сравнения (содержащую величину 1 для идентичностей и 0 для неидентичностей) и матрицу взвешенного сравнения СпЬккоу апб Вигдекк, Ыис1. Ас1бк Век. 14: 6745 (1986), описанную 8с11\\'аг1х апб ЭауНоГГ. ебк., АТЬА8 ΘΡ ΡΒΟΤΕΙΝ 8Ε0υΕΝί.Έ АНЭ 8ТВИСТиВЕ, Ыа11опа1 В1ошей1са1 Векеатск Роипбабоп, рр. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле; и (3) отсутствие штрафа за концевые пробелы.
Посредством идентичности последовательностей, число консервативных аминокислот определяют с использованием стандартных программ алгоритмов сопоставления и используют со штрафами по умолчанию, устанавливаемыми каждым поставщиком. По существу, гомологичные последовательности нуклеиновых кислот будут гибридизоваться обычно при умеренной жесткости или при высокой жесткости вдоль всей длины представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Предпочтительно две молекулы нуклеиновых кислот будут гибридизоваться в условиях высокой жесткости. Обсуждаются также молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодонов в гибридизующейся молекуле нуклеиновой кислоты.
Имеют ли любые две молекулы нуклеиновых кислот нуклеотидные последовательности, которые являются по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичными, может быть определено с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа РА8Т А, с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано в Реагкоп апб Ыршап, Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 85: 2444 (1988). Альтернативно, может быть использована функция ВЬА8Т базы данных Национального центра информации биотехнологии для определения относительной идентичности последовательностей.
Обычно последовательности сопоставляют таким образом, чтобы получить совпадение наивысшего порядка. Идентичность как таковая имеет общепринятое в данной области значение и может быть рассчитана с использованием опубликованных способов (см., например, Сотри1а1юпа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., еб., ОхГогб ишуегкНу Ргекк, №\ν Уотк, 1988; Вюсотрибпд: 1пГоппа1юк апб Сепоте Рго_)ес1к, ЗтЦк Ό.^., еб., Асабетю Ргекк, №\ν Уотк, 1993; СотрШет Апа1ук1к оГ 8ес.|иепсе Оа1а, Рай I, СпРГт, А.М., апб СтЖп, Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, №\ν .Геткеу, 1994; 8ес.|иепсе Апа1ук1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, νοп Неш)е, С., Асабетю Ргекк, 1987; апб 8ес.|иепсе Апа1ук1к Рптет, СпЬккоу, М. апб ^еνе^сиx, I., ебк., М 8Юск1оп Ргекк, №\ν Уотк, 1991). Хотя существует ряд способов для измерения идентичности между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями, термин идентичность является хорошо известным специалистам в данной области (СатШо, Н. апб Ь1р1оп, Ό., 81АМ 1 АррНеб МаШ 45: 1073 (1988)).
Способы, обычно применяемые для определения идентичности или сходства между двумя последовательностями, включают в себя, но не ограничиваются ими, способы, описанные в руководстве Сшбе 1о Ниде СотрШетк, Матйп 1. В1Шор, еб., Асабетю Ргекк, 8ап П1едо, 1994, апб СатШо, Н. апб Ыр1оп, Ό., 81АМ I АррНеб МаШ 48: 1073 (1988). Способы определения идентичности и сходства закодированы в компьютерных программах.
Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включают, но не ограничиваются ими, пакет программ ССС (Оеуегеих, I., е! а1., №ю1е1с Ас1бк Векеатск 12(1): 387 (1984)), ВЬА8ТР, ВЬА8ТН РА8ТА (А1кски1, 8.Р., е! а1., I Мо1ес Вю1 215: 403 (1990)).
Таким образом, в применении здесь термин «идентичность» представляет сравнение между тестируемым и ссылочным полипептидами или полинуклеотидами. Например, тестируемый полипептид может быть определен как любой полипептид, который является на 90% или более идентичным ссылочному полипептиду.
В применении здесь термин «по меньшей мере на 90% идентичный» обозначает процент идентичности от 90 до 99,99% относительно ссылочных полипептидов. Идентичность на уровне 90% или более свидетельствует о том факте, что, предположим с целью примера, сравнивают длину 100 аминокислот испытуемого (тест-)полипептида и ссылочного полипептида. Не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в тест-полипептиде отличаются от аминокислот ссылочных полипептидов. Аналогичные сравнения могут быть сделаны между тест- и ссылочным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точковых мутаций, случайным образом распределенных на протяжении всей длины аминокислотной последовательности, или они могут быть собраны в виде кластеров в одном или более местоположениях варьирующей длины вплоть до максимально допускаемого, например, 10/100 различия аминокислот (приблизительно 90% идентичности). Различия определяют как замены или делеции нуклеиновых кислот или аминокислот.
В применении здесь жесткость гибридизации в определении процента ошибочного спаривания является следующей:
- 20 009181
1) высокая жесткость: 0,1χ88ΡΕ, 0,1% ДСН, 65°С,
2) умеренная жесткость: 0,2χ88ΡΕ, 0,1% ДСН, 50°С,
3) низкая жесткость: 1,0χ88ΡΕ, 0,1% ДСН, 50°С.
Специалисты в данной области знают, что стадию промывки используют для отбора стабильных гибридов, и также знают ингредиенты 88ΡΕ (см., например, 8атЬтоок, Ε.Ρ. РтйзсР, Т. МашаРк, ίη Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога1огу Ρ1Ό55 (1989), νοί. 3, р. Β.13, см. также многочисленные каталоги, в которых описаны обычно используемые лабораторные растворы). 88ΡΕ является забуференным фосфатом до рН 7,4 0,18 №С1. Кроме того, специалисты в данной области знают, что стабильность гибридов определяется Тт, которая является функцией концентрации ионов натрия и температуры (Тт=81.5°С-16.6(1οβ|Ο|Nа'|)+0.41(%С+С)-600/1)). так что единственными параметрами в условиях промывок, критическими для стабильности гибридов, являются концентрация ионов натрия в 88ΡΕ (или 88С) и температура.
Понятно, что эквивалентные жесткости могут быть достигнуты с использованием альтернативных буферов, солей и температур. Например, без ограничения, процедурами, использующими условия низкой жесткости, являются следующие условия (см. также 8Ы1о апб ХУетЬегд, Бгос. №И. Асаб. 8с1. И8А 78: 6789-6792 (1981)): фильтры, содержащие ДНК, предобрабатывают в течение 6 ч при 40°С в растворе, содержащем 35% формамид, 5Х 88С, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 0,1% ПВП, 0,1% фиколл, 1% БСА и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (10Х 88С обозначает 1,5М хлорид натрия и 0,15М цитрат натрия, доведенные до рН 7).
В конкретном варианте гетеромультимерный белковый комплекс получают в виде слитого белка между первым и вторым редокс-белками, где первым редокс-белком является тиоредоксин, а вторым редокс-белком является тиоредоксинредуктаза. В одном варианте второй рекомбинантный полипептид, например тиоредоксинредуктаза, расположен ^терминально относительно первого рекомбинантного полипептида, например тиоредоксина. Таким образом, любой белок, который классифицирован как тиоредоксин, такой как тиоредоксиновый компонент системы НАДФН-тиоредоксина и тиоредоксин, присутствующий в системе ферредоксин/тиоредоксин, также известные как ТКх и ТКт, может быть использован в комбинации с любой тиоредоксинредуктазой, такой как НАДФН-тиоредоксинредуктаза и ферредоксин-тиоредоксинредуктаза и любыми другими белками, обладающими способностью восстанавливать тиоредоксин. В конкретных вариантах тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза получены из растения.
В альтернативном варианте используют природно встречающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слияние белков тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза, получаемых из МусоЬас1етшт 1ергае (^1е1е§ е! а1. (1995) 1. Вю1. С’Нет. 27: 25604-25606), как описано в примерах здесь.
Иммуноглобулины.
В другом варианте данного изобретения мультимерными белковыми комплексами являются иммуноглобулины. В применении здесь «полипептидная цепь иммуноглобулина» обозначает первый полипептид, который способен связываться со вторым полипептидом с образованием иммунологически активного (т.е. способного связывать антиген) мультимерного белкового комплекса. Типы иммуноглобулинов и полипептидных цепей иммуноглобулинов, обсуждаемые для применения здесь, включают иммунологически активные (т. е. антигенсвязывающие) части легкой и тяжелой цепей. Примеры иммуноглобулинов и полипептидных цепей иммуноглобулинов для применения здесь включают, по существу, интактные иммуноглобулины, в том числе любой из ΙβΟ, ΙβΛ, Ι§Ό, Ι§Ε и Ι§Μ, а также любую часть иммуноглобулина, в том числе части, хорошо известные как РаЬ-фрагменты, РаЬ'-фрагменты, Р(аЬ’)2.8иЬ2.фрагменты и Ρν-фрагменты.
В этом варианте первым рекомбинантным полипептидом может быть тяжелая цепь любого иммуноглобулина, в том числе тяжелая цепь любого из ΙβΠ ^А, Ι§Ό, Ι§Ε и Ι§Μ, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина. Таким образом, здесь обеспечены способы получения иммуноглобулина, включающие: (а) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первой полипептидной цепи иммуноглобулина и второй полипептидной цепи иммуноглобулина, где указанная первая полипептидная цепь иммуноглобулина способна связываться с указанной второй полипептидной цепью иммуноглобулина с образованием указанного иммуноглобулина; и (Ь) связывание указанного иммуноглобулина с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанными масляными тельцами и с указанной первой полипептидной цепью иммуноглобулина.
Как показано здесь, мультимерный иммуноглобулин связан с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок. В конкретных вариантах нацеливающим на масляные тельца белком может быть слитый полипептид, содержащий белок масляного тельца и иммуноглобулинсвязывающий белок, такой как, например, белок А, белок Ь и белок С.
Еще в одном варианте с участием иммуноглобулинов первый и второй рекомбинантные полипептиды (иммуноглобулины) по отдельности слиты с белком масляного тельца, например, олеозином или калеозином. Например,
а) первым рекомбинантным полипептидом может быть тяжелая цепь иммуноглобулина, в том числе
- 21 009181 тяжелая цепь любого из 1дС, 1дА, Ι§Ό, 1дЕ и 1дМ, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина; или
b) первым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный и первый константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть легкая цепь каппа или лямбда иммуноглобулина; или
c) первым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторым рекомбинантным полипептидом может быть вариабельный домен легкой цепи каппа или лямбда иммуноглобулина.
В некоторых вариантах слитые полипептиды конструируют или отбирают для обеспечения возможности образования гетеромультимерного белкового комплекса между последовательностями легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина на масляных тельцах в клетке, содержащей масляные тельца.
Получение экспрессирующих векторов, содержащих нацеливающие на масляные тельца белки и первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки.
В соответствии с данным изобретением, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, и нацеливающий на масляные тельца белок подходящим образом продуцируются в клетке. Для получения рекомбинантных полипептидов или мультимерных белковых комплексов последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую либо первый и/или второй рекомбинантые полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды, либо первый и/или второй родственные тиоредоксину белки; и/или нацеливающий на масляные тельца белок, включают в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Таким образом, здесь обеспечены рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие химерные нуклеиновые кислоты, обеспеченные здесь, пригодные для экспрессии нацеливающего на масляные тельца белка и первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов или первого и/или второго родственных тиоредоксину белков, пригодные для выбранной клетки. Термин пригодные для экспрессии в выбранной клетке означает, что рекомбинантный экспрессирующий вектор содержит все последовательности нуклеиновых кислот, требующиеся для осуществления экспрессии в выбранной клетке.
Таким образом, рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат дополнительно регуляторные последовательности нуклеиновых кислот, выбранные на основе клетки, которую используют для экспрессии и осуществления инициации и терминации транскрипции, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс и/или нацеливающий на масляные тельца белок. Регуляторные последовательности нуклеиновых кислот включают промоторы, энхансеры, молчащие элементы, сайты связывания рибосом, последовательности Шайна-Далгарно, интроны и другие элементы экспрессии. Функционально связанные означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие регуляторные участки, связанные с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс и/или нацеливающий на масляные тельца белок, делают возможной экспрессию в данной клетке. Типичная конструкция нуклеиновой кислоты содержит в направлении 5'-3' промоторный участок, способный направлять экспрессию, участок, кодирующий первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и/или нацеливающий на масляные тельца белок, и участок терминации, функциональный в выбранной клетке.
Выбор регуляторных последовательностей будет зависеть от организма и типа клеток, в которых экспрессируются первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и/или нацеливающий на масляные тельца белок, и может влиять на уровни экспрессии данного полипептида. Регуляторные последовательности известны в данной области, и их выбирают для регуляции экспрессии нацеливающего на масляные тельца белка и рекомбинантных полипептидов или мультимерных белковых комплексов в клетке.
Промоторы, которые могут быть использованы в бактериальных клетках, включают промотор 1ас (В1асктап е! а1. (1978) Се11: 13: 65-71), промотор 1гр (Макиба е! а1. (1996) Рго1еш Епд: 9: 101-106) и промо
- 22 009181 торы Т7 (81иб1ег е1 а1. (1986) 1. Мо1. В1о1. 189: 113-130). Промоторы, функциональные в клетках растений, которые могут быть использованы здесь, включают конститутивные промоторы, такие как промотор СаМУ 35δ (Яо11151ет е1 а1. (1987) Сепе: 53: 153-161), промотор актина (МсЕ1гоу е1 а1. (1990) Р1ап1 Се11 2: 163-171) и промотор убиквитина (европейская патентная заявка 0342926). Другие промоторы являются специфическими для определенных тканей или органов (например, корней, листьев, цветков или семян) или типов клеток (например, эпидермальных клеток, мезофильных клеток листьев или клеток коры корня) и/или в отношении определенных стадий развития растений. Тайминг экспрессии может контролироваться выбором индуцируемого промотора, например, промотора РЯ-а, описанного в патенте США 5614395. Таким образом, выбор промотора зависит от желаемого местоположения и времени накопления желаемого полипептида. В особом варианте, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, и/или нацеливающий на масляные тельца белок, экспрессируются в клетке семени и используют семеноспецифические промоторы.
Семеноспецифические промоторы, которые могут быть использованы здесь, включают, например, промотор фазеолина (8епдцр1а-Сора1ап е1 а1. (1985) Ргос. №111. Асаб. δα. И8А: 82: 3320-3324) и промотор олеозина 18 кДа АгаЫборык (уап Яооуеп е1 а1. (1992) Р1ап1. Мо1. Вю1. 18: 1177-1179). Постоянно открываются новые промоторы, применимые в различных типах клеток растений. Многочисленные примеры растительных промоторов могут быть найдены в Ойатцго е1 а1. (Вюсйет о£ Р1. (1989) 15: 1-82).
Генетические элементы, способные усиливать экспрессию полипептида, могут быть включены в экспрессирующие векторы. В клетках растений они включают, например, нетранслируемые лидерные последовательности из вирусов, такие как лидерная последовательность АМУ (1оЫтд апб Сейгке (1987) №11иге: 325: 622-625) и интрон, связанный с промотором убиквитина кукурузы (см. патент США И8 5504200).
Терминаторы транскрипции являются общепризнанными в данной области и наряду с функционированием в качестве сигнала для терминации транскрипции служат в качестве защитного элемента, служащего для удлинения полужизни мРНК (Сиагпегок е1 а1. (1982) Ргос. №111. Асаб. δα. И8А: 79: 238-242). В последовательностях нуклеиновых кислот для экспрессии в растительных клетках терминатор транскрипции обычно имеет длину приблизительно 200 нуклеотидов - приблизительно 1000 нуклеотидов.
Последовательности терминатора, которые могут быть использованы здесь, включают, например, участок терминации нопалинсинтазы (Веуаи е1 а1. (1983) Ыис1. Ас1б. Яек.: 11: 369-385), терминатор фазеолина (уап бег Сеек1 е1 а1. (1994) Р1ап1 1.: 6: 413-423), терминатор гена октопинсинтазы АдгоЬас1егшт 1итеГааепк или другие подобным образом функционирующие элементы. Терминаторы транскрипции могут быть получены, как описано Ап (1987) МеИобк т Епхут. 153: 292. Выбор терминатора транскрипции может оказывать влияние на скорость транскрипции.
Таким образом, здесь обеспечены химерные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или родственные тиоредоксину белки. В одном варианте указанная нуклеиновая кислота содержит:
(a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, полипептидную цепь иммуноглобулина или редокс-белок, связанной в рамке считывания с (c) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, полипептидную цепь иммуноглобулина или редокс-белок, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды, полипептидные цепи иммуноглобулина или редокс-белки способны образовывать мультимерный белковый комплекс.
В другом варианте здесь обеспечен экспрессирующий вектор, содержащий:
1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию в указанной клетке, функционально связанную со
2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей (1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида на масляное тельце, связанную в рамке считывания с (ίί) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей мультимерный слитый белок, такой как слитый редокс-полипептид или иммуноглобулин, содержащий первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок или полипептидная цепь иммуноглобулина, связанный со вторым рекомбинантным полипептидом, таким как второй редокс-белок или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина, функционально связанной с
3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию в указанной клетке.
- 23 009181
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может дополнительно содержать маркерный ген. Маркерные гены, которые могут быть использованы в соответствии с данным изобретением, включают все гены, которые позволяют отличать трансформированные клетки от нетрансформированных клеток, в том числе все селектируемые и скринированные маркерные гены. Маркером может быть маркер устойчивости, такой как маркер устойчивости к антибиотику, например, к канамицину, ампициллину, 0418, блеомицину, гигромицину, хлорамфениколу, который позволяет производить отбор признака химическими средствами, или маркер устойчивости, например, к химическому агенту, такому как в норме фитотоксичный сахар манноза (№дгойо е! а1. (2000) Р1ап! Се11 Кер. 19: 798-803). В растительных рекомбинантных экспрессирующих векторах могут быть удобным образом использованы маркеры устойчивости к гербицидам, например, маркеры, придающие устойчивость к глифозату (патенты США 4940935 и 5188642) или фосфинотрицину (\У1Ше е! а1. (1990) №с1. Ас1йк Кек. 18: 1062; 8репсег е! а1. (1990) Тйеог., Арр1. 0епе1. 79: 625-631). Маркеры устойчивости к гербициду, при связывании вблизи редокс-белка или нацеливающего на масляные тельца белка, могут быть использованы для поддержания давления отбора на популяции клеток растений или популяции растений для тех растений, которые не потеряли представляющий интерес белок. Скринируемые маркеры, которые могут быть использованы для идентификации трансформантов посредством визуального наблюдения, включают β-глюкуронидазу (0И8) (см. патенты США 5268463 и 5599670) и зеленый флуоресцентный белок (0РР) (№ейх е! а1. (1995) Р1ап! Се11 Кер.: 14: 403).
Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут дополнительно содержать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие нацеливающие сигналы, обеспечивающие нацеливание на компартмент клетки или органеллу. Подходящие нацеливающие сигналы, которые могут быть использованы здесь, включают сигналы, которые способны нацеливать полипептиды на эндомембранную систему. Примеры нацеливающих сигналов, которые могут быть использованы здесь, включают нацеливающие сигналы, способные направлять данный белок в периплазму, цитоплазму, аппарат Гольджи, апопласт (8утопк е! а1., 1990, Вю/Тесйпо1о§у, 8: 217-221), хлоропласт (Сота1 е! а1. (1988) 1. Вю1. Сйет. 263: 1510415109), митохондрию, пероксисому (Ипдег е! а1. (1989) Р1ап! Мо1. Вю1. 13: 411-418), эндоплазматический ретикулум (ЭР), вакуоль (8й1пкй1 е! а1. (1990) Р1ап! Мо1. Вю1. 14: 357-368) и масляное тельце. Посредством включения подходящих нацеливающих последовательностей можно направлять нацеливающий на масляные тельца белок или первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редоксполипептиды и/или родственные тиоредоксину белки в желаемые органеллу или клеточный компартмент.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы данного изобретения могут быть получены в соответствии с методологиями, хорошо известными специалистам в области молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е! а1. (1990) Мо1еси1аг С1ошпд, 2'1 ей. Со1й 8рпп§ НагЬог Ргекк). Получение этих конструкций может включать в себя такие способы, как рестрикционное расщепление, лигирование, гельэлектрофорез, секвенирование ДНК и ПЦР. Большое разнообразие клонирующих векторов доступно для выполнения необходимых стадий клонирования, приводящих к получению рекомбинантного экспрессирующего вектора, обеспечивающего экспрессию полипептида. Особенно подходящими для этой цели являются векторы с системой репликации, которая является функциональной в ЕксйепсЫа сой, такие как рВК322, серия векторов РИС, серия векторов М13тр, рВ1ие8спр! и т.д. Обычно эти векторы содержат маркер, позволяющий проводить отбор трансформированных клеток, например, приданием устойчивости к антибиотику. Последовательности нуклеиновых кислот могут быть введены в эти векторы, и векторы могут быть введены в Е. сой, выращенную в подходящей среде. Векторы могут быть извлечены из клеток после сбора и лизиса этих клеток.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы, подходящие для введения последовательностей нуклеиновых кислот в клетки растений, включают векторы на основе АдгоЬас!егшт и КЫ/оЬшт, такие как Т1- и Κί-плазмиды. Векторы на основе АдгоЬас!егшт обычно несут по меньшей мере одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают векторы, такие как рВГЫ 19 (Веуап (1984) М.1с1 АсИк Кек. Уо1. 12, 22: 8711-8721) и другие бинарные векторные системы (например, патент США И8 4940838).
Получение клеток, содержащих первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды и/или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки и нацеливающие на масляные тельца белки.
В соответствии с данным изобретением, рекомбинантные экспрессирующие векторы вводят в клетку, которую подвергают отбору, и отобранные клетки выращивают для получения первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редокс-полипептидов, первого и/или второго родственных тиоредоксину белков; и нацеливающего на масляные тельца белка либо непосредственно, либо в
- 24 009181 клетке-потомке.
Методологии для введения рекомбинантных экспрессирующих векторов в клетку, называемые также трансформацией, хорошо известны в данной области и варьируются в зависимости от выбранного типа клеток. Обычные способы для переноса рекомбинантных экспрессирующих векторов в клетку включают электропорацию; химически опосредованные способы, например, СаС12-опосредованное поглощение нуклеиновых кислот; бомбардировку частицами (баллистику); применение природно инфекционных последовательностей нуклеиновых кислот, например, происходящих из вирусов последовательностей нуклеиновых кислот или, при использовании клеток растений, произведенных из АдгоЬас!епит или ЕЫхоЬшт последовательностей нуклеиновых кислот; ПЭГ-опосредованное поглощение нуклеиновых кислот, микроинъекцию и применение карборундовых усов (нитевидных монокристаллов) (Каерр1ег е! а1. (1990) Р1ап! Се11 Кер. 9: 415-418), все из которых могут применяться здесь.
Введение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку может приводить к интеграции посредством его полного или частичного поглощения в геном клетки-хозяина, в том числе хромосомную ДНК или пластидный геном. Альтернативно, рекомбинантный экспрессирующий вектор может не интегрироваться в геном и реплицироваться независимо от геномной ДНК клетки-хозяина. Обычно используют геномную интеграцию последовательности нуклеиновой кислоты, так как она обеспечит возможность стабильного наследования введенных последовательностей нуклеиновых кислот последующими поколениями клеток и создание линий клеток растений или животных.
Конкретные варианты включают применение растительных клеток. Конкретные используемые здесь клетки растений включают клетки, получаемые из американского ореха (Вегйю11е!1а ехсе1ка); клещевины (Кюстик соттцшк); кокосового ореха (Сосик пиаГега); кориандра (Сопапбгит ка!1уит); хлопчатника (Ооккуршт крр.); земляного ореха, арахиса (АгасЫк Еуродаеа); джоджобы (81ттопбк1а сЫпепк1к); льняного семени/льна (Ьтцт икПаНккипит); кукурузы (2еа таук); горчицы (Вгаккюа крр. и 8тар1к а1Ьа); гвинейской масличной пальмы (Е1ае1к дшпеещ); маслины европейской (О1еа еигореа); семян рапса (Вгаккюа крр.); сафлора (СаПйатик !тс!огшк); сои (ОНсше тах); тыквы (СисигЬйа тах1та); ячменя (Ногбеит уц1даге); пшеницы (Тгйюит аекЕуцт) и подсолнечника (НеКапПшк аппиик).
Методологии трансформации для двудольных видов растений хорошо известны. Обычно используют опосредованную АдгоЬас!егшт трансформацию вследствие ее высокой эффективности, а также общей восприимчивости многими, если ни всеми, видами двудольных растений. Трансформация с использованием АдгоЬас!егшт обычно включает перенос бинарного вектора (например, рВГЫ19), содержащего представляющую интерес ДНК, в подходящий штамм АдгоЬас!егшт (например, С1В542), например, посредством трехродительского скрещивания со штаммом Е. со11, несущим рекомбинантный бинарный вектор, и штаммом Е. со11, несущим хелперную плазмиду, способную мобилизовать бинарный вектор в штамм АдгоЬас!егшт, или посредством трансформации ДНК штамма АдгоЬас!егшт (НоГдеп е! а1. №ю1. Аабк. Кек. (1988) 16: 9877. Другие методологии трансформации, которые могут быть использованы для трансформации видов двудольных растений, включают баллистику (8апГогб (1988) Тгепбк ш Вю!есйп. 6: 299-302); электропорацию (Еготт е! а1. (1985) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 82: 5824-5828); ПЭГ-опосредованное поглощение ДНК (Ро!гукик е! а1. (1985) Мо1. Оеп. СепеНск 199: 169-177); микроинъекцию (КеюЕ е! а1. Вю/Тесйп. (1986) 4: 1001-1004) и применение карборундовых усов (нитевидных монокристаллов) (Каерр1ег е! а1. (1990) Р1ап! Се11 Кер. 9: 415-418). Конкретные методологии трансформации обычно варьируются в некоторой степени в зависимости от используемого вида растений.
В особом варианте масляные тельца получают из сафлора и рекомбинантные белки экспрессируются в сафлоре. Трансформация сафлора описана Вакег апб Эуег (Р1ап! Се11 Кер. (1996) 16: 106-110).
Однодольные виды растений могут быть теперь тоже трансформированы с использованием множества методологий, в том числе бомбардировки частицами (СНпкЮн е! а1. (1991) Вю!есйп. 9: 957-962; \\ еекк е! а1. Р1ап! РЬукю1. (1993) 102: 1077-1084; Оогбоп-Катт е! а1. Р1ап! Се11 (1990) 2: 603-618), ПЭГопосредованного поглощения ДНК (ЕР 0292435; 0392225) или опосредованной АдгоЬас!егшт трансформации (6о!о-Еит1уцк1 е! а1. (1999) №11иге-Вю1ес11. 17 (3): 282-286).
Трансформация пластид описана в патентах США 5451513; 5545817 и 5545818 и в заявках на патент РСТ 95/16783; 98/11235 и 00/39313). Основная трансформация хлоропластов включает введение клонированной пластидной ДНК, фланкирующей селектируемый маркер, вместе с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, в подходящую ткань-мишень с использованием, например, баллистики или трансформации протопластов. Селектируемые маркеры, которые могут быть использованы, включают, например, бактериальный ген аабА (8уаЬ е! а1. Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А 90: 913-917). Пластидные промоторы, которые могут быть использованы, включают, например, промотор гена табака с1рР (заявка на патент РСТ 97/06250).
В другом варианте химерные конструкции нуклеиновых кислот данного изобретения, обеспеченные здесь, трансформируют непосредственно в пластидный геном. Технология трансформации пластид подробно описана в патентах США 5451513, 5545817, 5545818 и 5576198; в заявках РСТ с номерами \О 95/16783 и \О 97/32977; и МсВпбе е! а1., Ргос №111 Асаб δα И8А 91: 7301-7305 (1994), полные описания которых включены здесь в качестве ссылки. В одном варианте трансформация пластид достигается посредством баллистики, впервые проведенной в одноклеточной зеленой водоросли СЫатуботопак
- 25 009181 гетйагбЫ (Воуп!оп е! а1. (1988) 8с1епсе 240: 1534-1537)) и затем распространенной на Мсойапа (аЬаснт (8уаЬ е! а1. (1990) Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 87: 8526-8530), в комбинации с отбором на цис-действующие локусы устойчивости к антибиотику (устойчивости к спектиномицину или стрептомицину) или комплементацией нефотосинтетических мутантных фенотипов.
В другом варианте трансформацию пластид табака проводят бомбардировкой частицами ткани листа или каллуса или опосредованным полиэтиленгликолем (ПЭГ) поглощением плазмидной ДНК протопластами с использованием клонированной пластидной ДНК, фланкирующей селективный маркер устойчивости к антибиотику. Например, фланкирующие участки 1-1,5 т.п.н., называемые нацеливающими последовательностями, облегчают гомологичную рекомбинацию с пластидным геномом и позволяют заменять или модифицировать специфические участки 156 т.п.н. пластидного генома табака. В одном варианте точковые мутации в пластидной рДНК 168 и генах грк12, придающие устойчивость к спектиномицину и/или стрептомицину, могут быть использованы в качестве селектируемых маркеров для трансформации (8уаЬ е! а1. (1990) Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 87: 8526-8530); 8!аиЬ е! а1. (1992) Р1ап! Се11 4: 3945, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки), и они приводят к образованию стабильных гомоплазматических трансформантов при частоте приблизительно один на 100 бомбардировок листьев-мишеней.
Присутствие сайтов клонирования между этими маркерами позволяет создать нацеливающий на пластиду вектор для введения чужеродных генов (8!аиЬ е! а1. (1993) ЕМВ0 1 12: 601-606, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки). В другом варианте существенные увеличения частоты трансформации могут быть получены заменой рецессивных генов устойчивости к антибиотику рРНК или р-белка доминантным селектируемым маркером, бактериальным геном аабА, кодирующим детоксифицирующий спектиномицин фермент аминогликозид-3'-аденилтрансферазу (8уаЬ е! а1. (1993) Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 90: 913-917, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). Этот маркер был успешно использован также для трансформации с высокой частотой пластидного генома зеленой водоросли С11атуботопак гетйагбЫ (Со1бксйт1б!-С1егтоп!, М. (1991) М.1с1 Ас1бк Кек 19, 4083-4089, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). В других вариантах трансформация пластид протопластов табака и мха Рйуксотйте11а может быть достигнута ПЭГ-опосредованным поглощением ДНК (0'№Ш е! а1. (1993) Р1ап! 1 3: 729-738; Коор е! а1. (1996) Р1ап!а 199: 193-201, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки).
Как бомбардировка частицами, так и трансформация протопластов также обсуждаются для применения здесь. Трансформация пластид масличных растений успешно проводилась в родах АгаЫборкй и Вгакыса (81кбаг е! а1. (1998) Р1ап! Се11 Кер. 18: 20-24; заявка РСТ \У0 00/39313, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки).
Химерную конструкцию нуклеиновой кислоты встраивают в пластидную экспрессионную кассету, включающую промотор, способный экспрессировать конструкцию в пластидах растений. Конкретным промотором, способным к экспрессии в пластиде растения, является, например, промотор, выделенный из 5'-фланкирующего участка выше кодирующего участка пластидного гена, который может происходить из того же самого или отличающегося вида и нативный продукт которого обычно обнаруживается в большинстве типов пластид, в том числе пластид, присутствующих в незеленых тканях. Экспрессия генов в пластидах отличается от экспрессии ядерных генов и является родственной экспрессии генов в прокариотах (8!егп е! а1. Тгепбк ш Р1ап! 8а 2: 308-315), полное описание которой включено здесь в качестве ссылки).
Пластидные промоторы содержат обычно элементы -35 и -10, типичные для прокариотических промоторов, и некоторые пластидные промоторы, называемые промоторами РЕР (кодируемой пластидой РНК-полимеразы), распознаются Е. сой-подобной РНК-полимеразой, в большинстве случаев кодируемой в пластидном геноме, тогда как другие пластидные промоторы, называемые промоторами ХЕР, распознаются ядерно-кодируемыми РНК-полимеразами. Оба пластидных промотора являются пригодными для применения здесь. Примеры пластидных промоторов включают промоторы генов с1рР, такие как промотор гена с1рР табака (\У0 97/06250, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки) и промотор гена с1рР АгаЬ1борк1к (заявка США 09/038878, полное описание которой включено здесь в качестве ссылки). Другой промотор, способный управлять экспрессией химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, происходит из регуляторного участка оперона рибосомной РНК 168 (Натк е! а1. (1994) М1стоЬю1 Кеу 58: 700-754; 81ппохак| е! а1. (1986) ЕМВ0 1 5: 2043-2049, полные описания которых включены здесь в качестве ссылки). Другими примерами промоторов, способных управлять экспрессией конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, включают промотор ркЬА и промотор гЬсЬ. Пластидная экспрессионная кассета предпочтительно включает в себя дополнительно 3'-нетранслируемую последовательность (3'ИТК) пластидного гена, функционально связанную с химерной конструкцией нуклеиновой кислоты данного изобретения. Роль нетранслируемых последовательностей заключается скорее в том, чтобы управлять 3'-процессингом транскрибируемой РНК, а не терминировать транскрипцию. Примером 3'ИТК является 3'-нетранслируемая последовательность пластидного гена грк16 или 3'-нетранслируемая последовательность пластидного гена ркЬА АгаЫборык. В дополнительном варианте пластидная экспрессионная кассета включает поли-С-участок 3'-нетрансли
- 26 009181 руемой последовательности. Пластидная экспрессионная кассета предпочтительно включает также 5'нетранслируемую последовательность (5'ИТК), функционирующую в пластидах растений, функционально связанную с химерной конструкцией нуклеиновой кислоты, обеспеченной здесь.
Пластидная экспрессионная кассета содержится в пластидном трансформирующем векторе, который предпочтительно дополнительно включает фланкирующие участки для интеграции в геном пластиды посредством гомологичной рекомбинации. Пластидный трансформирующий вектор может необязательно включать один пластидный сайт инициации репликации. Данное изобретение включает также пластиду растения, трансформированную таким пластидным трансформирующим вектором, где химерная конструкция нуклеиновой кислоты является экспрессируемой в пластиде растения. Здесь описаны также растение или клетка растения, в том числе ее потомство, содержащие эту пластиду растения. В конкретном варианте это растение или клетка растения, в том числе их потомство, является гомоплазматическим в отношении трансгенных пластид.
Другие промоторы, способные управлять экспрессией химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений, включают регулируемые трансактиватором промоторы, предпочтительно гетерологичные в отношении растения или субклеточной органеллы или компонента клетки растения, в которой осуществляется экспрессия. В этих случаях молекулу ДНК, кодирующую трансактиватор, встраивают в подходящую кассету ядерной экспрессии, которую трансформируют в растительную ядерную ДНК. Трансактиватор нацелен на пластиды посредством пластидного транзитного белка. Трансактиватор и управляемая трансактиватором молекула ДНК объединяются вместе либо скрещиванием выбранной линии с трансформированными пластидами с трансгенной линией, содержащей молекулу ДНК, кодирующую трансактиватор, дополненную нацеливающей на пластиды последовательностью и функционально связанную с ядерным промотором, либо прямой трансформацией пластидного трансформирующего вектора, содержащего желаемую молекулу ДНК, в трансгенную линию, содержащую химерную конструкцию нуклеиновой кислоты, кодирующую трансактиватор, дополненной нацеливающей на пластиды последовательностью, функционально связанной с ядерным промотором. Если ядерный промотор является индуцируемым промотором, в частности химически индуцируемым вариантом, экспрессия химерной конструкции нуклеиновой кислоты в пластидах растений активируется посредством нанесения на листья химического индуктора. Такая индуцируемая опосредованная трансактиватором экспрессионная система растений является предпочтительно строго регулируемой, без детектируемой экспрессии перед индукцией и чрезвычайно высокой экспрессией и высоким накоплением белка после индукции.
Конкретным трансактиватором является, например, вирусная РНК-полимераза. Конкретными промоторами этого типа являются промоторы, распознаваемые односубъединичной РНК-полимеразой, такие как промотор гена 10 Т7, который распознается ДНК-зависимой РНК-полимеразой бактериофага Т7. Ген, кодирующий полимеразу Т7 предпочтительно трансформируют в ядерный геном и полимеразу Т7 нацеливают на пластиды с использованием пластидного транзитного пептида. Промоторы, пригодные для ядерной экспрессии гена, например, гена, кодирующего вирусную РНК-полимеразу, такую как полимераза Т7, описаны выше и в другом месте в данной заявке. Экспрессия химерных конструкций нуклеиновых кислот в пластидах может быть конститутивной или может быть индуцируемой, и такая пластидная экспрессия может быть органо- или тканеспецифической. Примеры различных систем экспрессии подробно описаны в XVО 98/11235, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки. Таким образом, в одном аспекте данное изобретение использует сопряженную экспрессию в ядерном геноме нацеленной на хлоропласт РНК-полимеразы фага Т7 под контролем химически индуцируемого промотора РК-1а, например, промотора РК-1 табака, функционально связанного с хлоропластным репортерным трансгеном, регулируемым промоторной/терминаторной последовательностями гена 10 Т7, например, как описано в патенте США И8 5614395, полное описание которого включено здесь в качестве ссылки. В другом варианте, когда пластидные трансформанты, гомоплазматические в отношении наследуемых по материнской линии генов ТК или ΝΊΚ, опыляются линиями, экспрессирующими полимеразу Т7 в ядре, получают растения Р1, которые несут обе трансгенные конструкции, но не зкспрессируют их, пока синтез больших количеств ферментативно активного белка в пластидах не запускается нанесением на листья индукторного соединения РК-1а 8-метилового эфира бензо(1,2,3)тиадиазол-7-карботиокислоты (ВТН).
В конкретном варианте два или более генов, например, гены ТК и ΝΤΚ, транскрибируются из пластидного генома от единственного промотора в оперонподобном полицистронном гене. В одном варианте оперонподобный полицистронный ген включает промежуточную ДНК-последовательность между двумя генами в оперонподобном полицистронном гене. В конкретном варианте промежуточная ДНК не присутствует в пластидном геноме во избежание гомологичной рекомбинации с пластидными последовательностями. В другом варианте ДНК-последовательность является производной 5'-нетранслируемого (иТК) участка неэукариотического гена, предпочтительно вирусного 5'-ИТК, предпочтительно 5'-иТК, производного бактериального фага, такого как фаг Т7, Т3 или 8Р6. В одном варианте часть ДНКпоследовательности может быть модифицирована для предотвращения образования вторичных структур РНК в РНК-транскрипте оперонподобного полицистронного гена, например, между ДНКпоследовательностью и КВ 8 ниже расположенного гена. Такие вторичные структуры могут ингибиро
- 27 009181 вать или репрессировать экспрессию ниже расположенного гена, в частности, инициацию трансляции. Такие вторичные структуры РНК предсказываются посредством определения их температур плавления с использованием компьютерных моделей и программ, таких как программа тЫб, версия 3 (доступная из 2икег апб Τω№Γ, \Уа51ипд1оп ишуегЩу 8с1юо1 о£ Меб1С1пе, 81-Ьош5, ΜΟ), и другими способами, известными специалисту в данной области.
Присутствие промежуточной ДНК-последовательности в оперонподобном полицистронном гене увеличивает доступность ΚΒ8 ниже расположенного гена, приводя к более высоким скоростям экспрессии. Такая стратегия применима к любому из двух или более генов, которые должны транскрибироваться из пластидного генома от единственного промотора оперонподобного химерного гетеромультимерного гена.
После трансформации клетки выращивают обычно в селективной среде, позволяющей идентифицировать трансформанты. Клетки могут собираться в соответствии с известными в данной области методологиями. Для связывания масляных телец с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами, мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами и первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками, целостность клеток может разрушаться с использованием любой физической, химической или биологической методологии, позволяющей разрушать целостность клеток. Эти методологии обычно зависят от типа клеток и являются известными специалисту в данной области. При использовании растений их можно регенерировать в зрелые растения с использованием способов культуры ткани растений, обычно известных специалисту в данной области. Семена могут быть собраны из зрелых трансформированных растений и использованы для размножения линии растения. Растения могут быть также скрещены, и, следовательно, здесь обсуждается разведение клеточных линий и трансгенных растений, которые варьируются по их генетическому фону. Можно также скрестить линию растения, содержащую первый рекомбинантный полипептид, с линией растения, содержащей второй рекомбинантный полипептид. Таким образом, здесь обеспечены способы получения в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие:
(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок (например, родственный тиоредоксину белок и т.п.) или полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;
(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок (например, родственный тиоредоксину белок и т.п.) или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина; и (c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом, а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса.
Второй рекомбинантный полипептид может быть также связан с масляными тельцами. Таким образом здесь обеспечены также способы получения в растении рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающие:
(a) получение первого растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, такой как редокс-белок (или родственный тиоредоксину белок) или полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;
(b) получение второго растения, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид, такой как второй редокс-белок (или родственный тиоредоксину белок) или вторая полипептидная цепь иммуноглобулина, где указанный второй рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок; и (c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, содержащего клетки, причем указанные клетки содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом, а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса.
Выделение масляных телец.
Масляные тельца, описанные здесь, могут быть получены из любой клетки, содержащей масляные
- 28 009181 тельца, в том числе из любой клетки животного; клетки растения; грибковой клетки, например дрожжевой клетки, клетки водорослей; или бактериальной клетки. Здесь может быть использован любой способ, пригодный для выделения масляных телец из клеток. Способы для выделения масляных телец из клеток семян растений были описаны в патентах США (6146645 и 6183762), а выделение масляных телец из клеток дрожжей было описано Τίη§ е! а1. (1997) I. Βώ1. СНет. 272: 3699-3706).
В некоторых вариантах масляные тельца получают из клетки растения, например, из клетки пыльцы; клетки плода; клетки споры; клетки ореха; клетки мезокарпия; например, клетки мезокарпия, получаемой из маслины европейской (01еа еигораеа) или авокадо (Регкеа атепсапа); или клетки семени. В конкретном варианте масляные тела получают из клетки семени растения. Семена могут быть получены из трансгенного растения данного изобретения. В конкретных вариантах семя трансгенного растения в соответствии с данным изобртением содержит первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5% общего клеточного белка семени. В дополнительных вариантах семя трансгенного растения, обеспеченного здесь, содержит рекомбинантный полипептид или мультимерный белковый комплекс в концентрации по меньшей мере 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,25, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% или более общего клеточного белка семени. Верхние границы концентрации рекомбинантного полипептида или мультимерного белкового комплекса могут быть до приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15%. Таким образом, диапазоны по меньшей мере от около 0,5 до около 15%; по меньшей мере от около 1,0 до около 10% и по меньшей мере от около 5 до около 8% находятся среди обсуждаемых здесь различных диапазонов.
Среди семян растений, применимых в этом отношении, находятся семена растений, получаемые из группы видов растений, состоящей из американского ореха (БеПНоПеНа ехсе1ка); клещевины (Ктсстик соттишк); кокосового ореха (Сосик писГега) ; кориандра (Сопапбгцт кайуит); хлопчатника (Соккуршт крр.); земляного ореха, арахиса (АгасЫк Нуродаеа); джоджобы (81ттопйк1а сЫпепЦк); льняного семени/льна (Ьтит ик1!а!1кк1тит); кукурузы (2еа таук); горчицы (Егаккюа крр. и ЗтарЛ а1Ьа); гвинейской масличной пальмы (Е1ае1к дшпееЦ); маслины европейской (01еа еигораеа); семени рапса (Егаккюа крр.), сафлора (СаЛНатик !тс!опик); сои (Сйсте тах); тыквы (СисигЬйа тах1та); подсолнечника (Не11ап!Ник аппиик), ячменя (Ногбеит уц1даге); пшеницы (ΤπΙίαιιη аекйуит) и их смесей. В особом варианте масляные тельца могут быть получены из семян, получаемых из сафлора (СаЛНатик 11пс(1Г1ик).
Для получения масляных телец из семян растений растения выращивают и дают им образовать семена в соответствии с обычной сельскохозяйственной практикой. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также семена, содержащие масляные тельца, где указанные масляные тельца дополнительно содержат мультимерные белковые комплексы данного изобретения, описанные здесь. При сборе семян и, если требуется, удалении больших нерастворимых материалов, таких как косточки или скорлупки семян, например, просеиванием или промыванием, здесь может быть использован любой способ, пригодный для выделения масляных телец из семян. Типичный способ включает измельчение семян с последующим процессом водной экстракции.
Измельчение семян может выполняться любым измельчающим способом, приводящим к существенному разрушению клеточных мембран и клеточных стенок семян без ухудшения структурной целостности масляных телец, присутствующих в клетках семян. Подходящие способы измельчения в этой связи включают прессование и размалывание семян. Особенно применимы в этой связи способы мокрого помола, такие как описанные для хлопчатника (Ьа^Ноп е! а1. (1977) 1. Ат. 011 СНет. 8ос. 63: 533-534) и сои (И8 Ра!еп! 3971856; СаЛег е! а1. (1974) I. Ат. 011 СНет. 8ос. 51: 137-141). Подходящее оборудование для размола, позволяющее размалывание семян в промышленном масштабе, включает коллоидные мельницы, дисковые дробилки, штифтовые дробилки, орбитальные мельницы, КА-мельницы и гомогенизаторы промышленного масштаба. Выбор оборудования для размола будет зависеть от семян, которые выбраны, а также от требований производительности.
Затем твердые примеси, такие как скорлупа, волокнистый материал, нерастворенные углеводы, белки и другие нерастворимые примеси, предпочтительно удаляют из фракции размолотых семян с использованием разделения по размеру на основе таких методологий, как способы на основе фильтрования или гравитации, такие как способ разделения на основе центрифугирования. Центрифугирование может выполняться с использованием, например, декантирующей центрифуги, такой как 2-фазная декантирующая центрифуга НА8С0 200 или NX310Β (А1рНа Ьауа1). Условия эксплуатации выбирают таким образом, чтобы значительная часть нерастворимых примесей и осадков могла быть отделена от растворимой фракции.
После удаления нерастворимых веществ фракция масляных телец может быть отделена от водной фракции. Могут быть использованы основанные на гравитации способы, а также технологии разделения по размеру. Основанные на гравитации способы, которые могут быть использованы, включают центрифугирование с использованием, например, центрифуги с трубчатым ротором, такой как 8Натр1ек А8-16 или А8-46 (А1рНа Ьауа1), центрифуги с набором центробежных дисков или гидроциклона или разделение
- 29 009181 фаз под действием природной гравитации. Методологии разделения по размеру, которые могут быть использованы, включают мембранную ульрафильтрацию и микрофильтрацию с поперечным потоком.
Отделение твердых веществ и отделение фазы масляных телец от водной фазы может также проводиться одновременно с использованием способов разделения на основе гравитации или способов на основе раздения по размеру.
Препараты масляных телец, полученные на этой стадии в данном процессе, являются обычно относительно неочищенными, и в зависимости от применения масляных телец может быть желательным удаление дополнительных загрязнений. В этой связи может быть использован любой способ, позволяющий удалить дополнительные примеси семян. Удобным образом удаление этих примесей из препарата масляных телец может выполняться повторным суспендированием препарата масляных телец в водной фазе и повторным центрифугрованием ресуспендированной фракции, способом, называемым здесь промыванием масляных телец. Выбираемые условия промывания могут варьироваться в зависимости от желаемой чистоты фракций масляных телец. Например, при использовании масляных телец в фармацевтических композициях может быть обычно желательной более высокая степень чистоты, чем при использовании масляных телец в пищевых препаратах. Масляные тельца могут промываться один или более раз в зависимости от желаемой чистоты, и ионная сила, рН и температура могут варьироваться. Могут быть использованы аналитические способы для мониторинга удаления загрязняющих веществ. Например, для мониторинга удаления белков семян может использоваться ДСН-электрофорез.
Весь процесс выделения масляных телец может выполняться периодическим образом или в виде непрерывного режима. В особом варианте используют процессы непрерывного режима промышленного масштаба.
Посредством применения этих и подобных способов специалист может получать масляные тельца из любых клеток, содержащих масляные тельца. Специалисту будет понятно, что обычно этот способ будет в некоторой степени варьироваться в зависимости от выбранного типа клеток. Однако такие вариации могут производиться без отклонения от объема и идеи данного изобретения.
Связывание первого и/или второго рекомбинантных полипептидов, мультимерных белковых комплексов, гетеромультимерных белковых комплексов, мультимерных слитых белков, гетеромультимерных слитых белков, иммуноглобулинов, полипептидных цепей иммуноглобулинов, слитых редоксполипептидов и первого и/или второго родственных тиоредоксину белков с масляными тельцами.
В соответствии с данным изобретением масляные тельца связывают с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами, мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами, первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками посредством связывания с нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с мультимерными белковыми комплексами и с масляными телами. В применении здесь фраза связывание масляных телец с мультимерным белковым комплексом означает, что масляные тельца приближают к мультимерным белковым комплексам таким образом, чтобы обеспечить возможность связывания масляных телец либо с первым и/или вторым рекомбинантными полипептидами, мультимерными белковыми комплексами, гетеромультимерными белковыми комплексами, мультимерными слитыми белками, гетеромультимерными слитыми белками, иммуноглобулинами, полипептидными цепями иммуноглобулинов, слитыми редокс-полипептидами, либо с первым и/или вторым родственными тиоредоксину белками. Связывание масляных телец с мультимерными белковыми комплексами выполняют связыванием нацеливающего на масляные тельца белка как с масляным тельцем, так и с мультимерным белковым комплексом. В конкретных вариантах клетки, экспрессирующие мультимерный белковый комплекс, связываются с масляными тельцами, которые могут быть получены из тех же самых клеток, что позволяет удобным образом получить и выделить мультимерный белковый комплекс, в том числе первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки в содержащей масляные тельца системе клетки-хозяина. Таким образом, в одном варианте связывание масляного тельца с мультимерным белковым комплексом выполняется внутриклеточно во время роста клеток. Например, слитый редокс-полипептид может быть слит с белком масляного тельца, и этот химерный белок может быть экспрессирован в содержащих масляные тельца семенах растений. Выделение масляных телец из семян в этом случае приводит к выделению масляных телец, содержащих либо первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды, либо первый и/или второй родственные тиоредоксину белки. В другом варианте, в котором мультимерный белковый комплекс связывается с масляными тельцами, получаемыми из тех же самых клеток, в которых продуцируется этот комплекс, связывание масляных телец с мультимерным белковым комплексом выполняют после разрушения целостности клеток.
Например, первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплек
- 30 009181 сы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки могут экспрессироваться таким образом, что они направляются на систему эндомембран клеток семян. Масляные тельца, присутствующие в тех же самых клетках семян, содержащие нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с этими мультимерными белковыми комплексами, например, олеозин, связанный с одноцепочечным антителом, способным связываться с рекомбинантным полипептидом или мультимерным белковым комплексом, могут затем связываться с рекомбинантным полипептидом или мультимерным белковым комплексом при измельчении семян.
В соответствии с этим вариантом могут быть получены клетки семян растений, содержащие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина, нацеленные на апопласт растения. Эти конкретные клетки семян получают таким образом, что они дополнительно содержат масляные тельца, связанные с нацеливающим на масляные тельца белком, способным связываться с иммуноглобулином, таким как, например, слитый белок олеозин-белок А и т.п. При размалывании семян масляные тельца, содержащие белок А, ассоциируются с иммуноглобином посредством связывания.
Еще в одном варианте масляные тельца, используемые для связи с мультимерным белковым комплексом, получают из клеточного источника, отличающегося от клетки, содержащей первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки, например, из отдельной линии растения. Например, масляные тельца, связанные с белком А, могут быть получены из одной линии растения. Затем эти масляные тельца смешивают с измельченными семенами, содержащими экспрессируемые в апопласте легкую и тяжелую цепи, составляющие иммуноглобулин. Альтернативно, линия растения, содержащая масляные тельца, связанные с белком А, может быть скрещена с линией растения, содержащей иммуноглобулин.
Первый рекомбинантный полипептид, второй рекомбинантный полипептид и нацеливающий на масляные тельца белок могут быть получены также в отдельных клеточных компартментах. Затем связывание первого полипептида, второго полипептида и масляного тельца может происходить при нарушении целостности клеток. Например, известно, что в растениях существуют различные механизмы для нацеливания продуктов генов и последовательности, регулирующие функционирование этих механизмов, были достаточно подробно охарактеризованы. Например, нацеливание генных продуктов на хлоропласт регулируется транзитной последовательностью, обнаруженной на аминоконце различных белков, которая отщепляется во время импорта в хлоропласт с образованием зрелого белка (Сота1 е! а1. (1988) 1 В1о1 263: 15104-15109). Другие генные продукты локализованы в других органеллах, таких как митохондрия и пероксисома (Ипдег е! а1. (1989) Р1ап! Мо1 Вю1 13: 411-418). кДНК, кодирующие эти продукты, могут манипулироваться для нацеливания продуктов гетерологичных генов в эти органеллы. Кроме того, были охарактеризованы последовательности, которые обуславливают нацеливание генных продуктов в другие клеточные компартменты.
Аминоконцевые последовательности являются ответственными за нацеливание на эндоплазматический ретикулум (ЕК), апопласт, и внеклеточную секрецию из алейроновых клеток (КоеЫег апб Но (1990) Р1ап! Се11 2: 769-783). Дополнительно аминоконцевые последовательности вместе с карбоксиконцевыми последовательностями являются ответственными за нацеливание на вакуоли генных продуктов (БЫпкЫ е! а1. (1990) Р1ап! Мо1 Вю1 14: 357-368). Посредством слияния подходящих нацеливающих последовательностей, описанных выше, с представляющими интерес последовательностями трансгена можно направлять этот трансгенный продукт в желаемые органеллу или клеточный компартмент.
Как упоминалось здесь ранее, редокс-белок, полученный с использованием обеспеченных здесь способов, является ферментативно активным при связывании с масляным тельцем. Предпочтительно редокс-белок является по меньшей мере в 5 раз более активным при получении его в виде слитого редокс-полипептида со вторым редокс-белком, по сравнению с его активностью при получении его в ассоциации с масляным тельцем в виде неслитого полипептида (т.е. без второго редокс-белка). Более предпочтительно редокс-белок является по меньшей мере в 10 раз более активным при получении его в виде слитого редокс-полипептида.
Активность слитых редокс-полипептидов может быть определена в соответствии с методологиями, известными в данной области (см., например, 1оЬп§оп е! а1. (1984) 1. о£ Вас!. Уо1. 158 3: 1061-1069) и может быть оптимизирована, например, добавлением детергентов, в том числе ионогенных и неионогенных детергентов.
Приготовление масляных телец.
Согласно конкретному варианту масляные тельца, содержащие первый и/или второй рекомбинантные полипептиды, мультимерные белковые комплексы, гетеромультимерные белковые комплексы, мультимерные слитые белки, гетеромультимерные слитые белки, иммуноглобулины, полипептидные цепи иммуноглобулинов, слитые редокс-полипептиды или первый и/или второй родственные тиоредоксину белки предпочтительно готовят в виде эмульсии. Эмульсию предпочтительно используют для по
- 31 009181 лучения фармацевтической композиции, продуктов для личной гигиены или пищевых продуктов. В эмульгированной форме масляное тельце предоставляет определенные желаемые свойства, такие как, например, превосходная совместимость с кожей человека.
В специфическом варианте готовую форму масляных телец стабилизируют таким образом, что может быть получен конечный продукт, который может храниться и сохраняться в течение длительных периодов времени. В данном контексте термин стабилизированный препарат масляных телец относится к препарату масляных телец, который готовят таким образом, что готовая форма не подвергается нежелательным физическим или химическим изменениям при хранении этого препарата масляных телец. Требования стабилизации могут варьироваться в зависимости от конечного продукта. Например, продукты личной гигиены являются предпочтительно стабильными в течение по меньшей мере одного года при комнатной температуре, будучи также способными противостоять кратковременным колебаниям температуры. Фармацевтические готовые формы могут быть в некоторых случах менее стабильными, так как они могут храниться при более низких температурах для предупреждения появления нежелательных реакций.
В общем, способы стабилизации, которые могут использоваться здесь, включают любые и все способы консервирования биологического материала, в том числе добавление химических агентов, методологии на основе модуляции температуры, способы на основе облучения и их комбинации. В особых вариантах небольшие количества стабилизирующих химических агентов смешивают с готовой формой масляных телец для достижения стабилизации. Эти химические агенты включают помимо прочего консерванты, антиоксиданты, кислоты, соли, основания, модифицирующие вязкость агенты, эмульгаторы, желирующие агенты и их смеси и могут быть использованы для стабилизации препарата масляных телец. Ввиду присутствия слитого редокс-полипептида обычно выбирают стабилизирующий агент, который является совместимым с хорошей ферментативной функцией слитого редокс-полипептида и приводить к хорошей ферментативной функции слитого редокс-полипептида.
Могут быть желательными диагностические параметры для оценки стабильности препарата масляных телец, и они включают все параметры, являющиеся указаниями на нежелательные качественные или количественные изменения в отношении химической или физической стабильности. Типичные параметры для оценки препарата масляных телец на протяжении времени включают окраску, запах, вязкость, текстуру, рН и микробный рост и ферментативную активность.
В конкретных вариантах готовую форму масляных телец стабилизируют перед добавлением дополнительных ингредиентов, которые могут быть использованы для получения конечного продукта. Однако в других вариантах может быть тем не менее возможным приготовление конечной готовой формы с использованием нестабилизированных масляных телец с последующей стабилизацией конечной готовой формы.
Конечные препараты могут быть получены с использованием одного или более дополнительных ингредиентов и любого способа приготовления, пригодного для получения готовой формы, содержащей масляные тельца. Используемые ингредиенты и способы будут обычно варьироваться в зависимости от желаемого применения конечного продукта, они будут известными для специалистов в данной области и могут быть выбраны по желанию. Ингредиенты и способы, которые могут быть использованы здесь, включают способы, описанные в патентах США (6146645 и 6183762), которые включены здесь в качестве ссылки.
В конкретном варианте слитый редокс-полипептид содержит тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу. Таким образом, здесь обеспечены масляные тельца, содержащие слитый полипептид тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза. Здесь обеспечена также готовая форма, содержащая масляные тельца, содержащие слитый полипептид тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу, способный лечить или защищать мишень против окислительного стресса. Этот стресс мишени лечат или предупреждают контактированием мишени с готовой формой. Мишень может быть любым веществом, чувствительным к окислительному стрессу, в том числе любой молекулой, молекулярным комплексом, клеткой, тканью или органом.
В другом варианте здесь обеспечена готовая форма, содержащая масляные тельца, содержащие слитый полипептид тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза, способный химически восстанавливать мишень. Контактирование мишени с этой готовой формой восстанавливает мишень. Мишенью может быть любое вещество, чувствительное к восстановлению, в том числе любая молекула или молекулярный комплекс. Особенно чувствительными мишенями в этом отношении являются дисульфидные связи, присутствующие в белках.
Масляные тельца, содержащие тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу, могут быть использованы для приготовления готовых форм, используемых для уменьшения аллергенности пищевых продуктов или увеличения усваиваемости пищи. Предпочтительно, способ уменьшения аллергенности пищевых продуктов выполняют на практике посредством смешивания содержащих тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу масляных телец с пищей или ингредиентами пищи, выбранными из разнообразных источников, в том числе, например, пшеничной муки, пшеничного теста, молока, сыра, сои, йогурта и мороженого. Содержащие тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу масляные тельца могут быть также использованы для увеличения усваиваемости молока, а также других содержащих дисульфидные связи белков
- 32 009181 (Лао, I. е! а1. (1992) 1. Адпс. Рооб С1ет. 40: 2333-2336). Дополнительные применения к пищевым продуктам включают применение содержащих тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу масляных телец в качестве пищевой добавки для увеличения «силы» теста и свойств качества хлеба (\Уопд е! а1. (1993) 1. Сегеа1 С1ет. 70: 113-114; КоЬге1е1 е! а1. (1994) С1и1еп ЕгсЛеиъ: А^оааНоп о£ Сегеа1 Ее^еагсН; Пе1то1б, Сегтапу).
Здесь обеспечены также фармацевтические композиции, содержащие в фармацевтически активном носителе масляные тельца, содержащие тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу; масляные тельца, содержащие мультимерные белковые комплесы, такие как гетеромультимерные белковые комплексы; выделенные слитые белки тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза; или выделенные мультимерные белковые комплексы. Эти фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения реперфузионного повреждения (Ао!а е! а1. (1996) 1. Сагбюу. БНагтасо1. (1996) 27: 727-732), катаракты (патент США 4771036), хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) ^ас№е е! а1. (1999) Ат. 1. Ие^рЛ. СгЛ. Саге Μеά. 160: 858-865), диабета (Ио11а е! а1., 1. Εχρ. Μеά. 183: 1445-1451), интоксикации (патентная заявка РСТ 99/20122; патент США 5792506), бронхо-легочного заболевания ^ас№е (2000) СЛеЛ 117: 3035-3175); злокачественных опухолей (патентная заявка РСТ 91/04320) и ослабления аллергенного потенциала аэроаллергена, например, происходящего из пыльцы, и контактных аллергенов (патентная заявка РСТ 00/44781). Другими заболеваниями или состояниями, которые могут лечиться фармацевтическими композициями, описанными здесь, являются: псориаз, заживление ран, сепсис, желудочно-кишечное кровотечение, воспалительное заболевание пищеварительного тракта (ΙΒΌ), язвы, трансплантация, ΟΕΚΌ (желудочно-пищеводный рефлюкс).
В другом варианте фармацевтические композиции, описанные здесь, в частности, композиции, содержащие один или более редокс-белков, отдельно или в комбинации с масляными тельцами, могут быть использованы в лечении воспалительных и вирусных заболеваний посредством восстановительной инактивации фосфолипазы А2, одного из факторов, способствующих воспалительным состояниям. Кроме того, было обнаружено, что система слитых редокс-полипептидов функционирует в качестве механизма иммунной защиты организма в ответ на стимулы окружающей среды, в том числе окислительный стресс, вызываемый генерируемыми ультрафиолетом (УФ) радикалами. В результате этого редокс-белки, например, олеозин-тиоредоксин, олеозин-тиоредоксинредуктаза, различные описанные здесь слитые редокс-полипептиды, обеспечивают выгодные эффекты в определенных состояниях кожи, таких как псориаз, рак кожи, перхоть, опрелость, дерматит, солнечное поражение, старение, воспаление и т.п.
В другом варианте комплексы масляное тельце-родственный тиоредоксину белок, например олеозин-тиоредоксинредуктаза, могут быть также использованы в качестве противоядия. Многочисленные яды животных и другие токсины содержат дисульфидные связи, в том числе все нейротоксины яда змей, некоторые бактериальные нейротоксины, в том числе столбнячный токсин и ботулинический токсин А, фосфолипаза А2 пчелинового яда и яд скорпиона. В следующем варианте содержащие редокс-белок фармацевтические композиции, описанные здесь, могут быть использованы для инактивации токсинов ядов восстановлением дисульфидных связей. Способ лечения индивидуума, страдающего от действий яда или токсина, может включать стадию введения эффективной дозы фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном носителе в количестве, достаточном для ослабления или обращения действий токсина яда на этого индивидуума.
Фармацевтические композиции, описанные здесь, готовят обычно для введения однократных доз. Концентрации соединений в этих композициях являются эффективными для доставки количества, при введении, которое является эффективным для предполагаемого лечения. Обычно эти композиции готовят для введения однократных доз. Для приготовления композиции весовую часть соединения или его смеси растворяют, суспендируют, диспергируют или другим способом смешивают в выбранном носителе в эффективной концентрации, так что подлежащее лечению состояние облегчается или ослабляется. Фармацевтические носители или наполнители, пригодные для введения обеспеченных здесь соединений, включают любые носители, известные специалистам в данной области, являющиеся пригодными для конкретного способа введения.
Кроме того, эти соединения могут быть приготовлены в виде единственного фармацевтически активного ингредиента в композиции или могут быть объединены с другими активными соединениями. Липосомные суспензии, в том числе нацеленные на определенные ткани липосомы, могут быть также пригодными в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть приготовлены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Например, липосомные готовые формы могут быть получены, как описано в патенте США 4522811.
Активное соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного эффекта в отсутствие нежелательных побочных действий на проходящего лечение пациента.
Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически испытанием соединений в известных ΐη νίΙΐΌ и ίη у1уо системах, таких как описанные здесь анализы.
Концентрация активного соединения в лекарственной композиции будет зависеть от скоростей адсорбции, инактивации и экскреции активного соединения, физико-химических характеристик данного
- 33 009181 соединения, схемы введения доз и вводимого количества, а также других факторов, известных специалистам в данной области.
Обычно рассматривается терапевтически эффективная доза. Вводимые количества могут иметь порядок 0,001-1 мг/мл, предпочтительно около 0,005-0,05 мг/мл, более предпочтительно около 0,01 мг/мл объема крови. Фармацевтические дозированные стандартные формы готовят с приблизительно 1 мг приблизительно 1000 мг, предпочтительно приблизительно 10 - приблизительно 500 мг, более предпочтительно приблизительно 25-75 мг основного активного ингредиента или комбинации основных ингредиентов на дозированную унифицированную форму. Точная доза может быть определена эмпирически.
Активный ингредиент может вводиться один раз или может быть разделен на ряд меньших доз для введения с интервалами времени. Понятно, что точная доза и продолжительность лечения зависит от подлежащего лечению заболевания и может быть определена эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или экстраполяцией из тест-результатов ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ. Следует отметить, что концентрации и величины доз могут также варьироваться в зависимости от тяжести состояния, которое должно быть облегчено. Понятно также, что для любого конкретного субъекта, специфические схемы введения дозы должны корректироваться на протяжении времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица, вводящего эти композиции или наблюдающего за введением композиций, и что диапазоны концентраций, приведенные здесь, являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленных композиций и содержащих их комбинаций.
Предпочтительные фармацевтически приемлемые производные включают формы кислот, солей, сложных эфиров, гидратов, сольватов и пролекарств. Производное обычно выбрано таким образом, что его фармакокинетические свойства являются превосходящими фармакокинетические свойства соответствующего нейтрального соединения.
Таким образом, эффективные концентрации или количества одного или более обеспеченных здесь соединений или их фармацевтически приемлемых производных смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или наполнителем для системного, местного или локального введения с образованием фармацевтических композиций. Соединения включают в количестве, эффективном для ослабления или лечения нарушения, лечение которого предполагается. Концентрация активного соединения в композиции будет зависеть от скоростей абсорбции, инактивации и экскреции активного соединения, схемы введения доз, вводимого количества, конкретной готовой формы, а также других факторов, известных специалистам в данной области.
Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального, подкожного или местного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучее масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другой синтетический растворитель; антимикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия; хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты; и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или однодозовые или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла, пластика или другого подходящего материала.
В случаях, когда эти соединения проявляют недостаточную растворимость, могут быть использованы способы солюбилизации соединений. Такие способы известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими, применение сорастворителей, таких диметилсульфоксид (ДМСО), применение поверхностно-активных веществ, таких как Твин®, или растворение в водном растворе бикарбоната натрия. Производные этих соединений, такие как пролекарства этих соединений, могут быть также использованы в приготовлении эффективных фармацевтических композиций. Для офтальмических показаний эти композиции готовят в офтальмически приемлемом носителе. Для офтальмических применений здесь предпочтительным является локальное введение, либо местным введением, либо инъекцией. Желательными являются также препараты пролонгированного действия. Обычно композиции готовят для введения однократной дозы, так что однократная доза вводит эффективное количество.
При смешивании соединения с носителем или добавлении к соединению носителя полученная смесь может быть раствором, суспензией, эмульсией или другой композицией. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе от предполагаемого способа введения и растворимости соединения в выбранном носителе или наполнителе. Если необходимо, готовят фармацевтически приемлемые соли или другие производные этих соединений.
Соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для проявления терапевтически полезного действия в отсутствие нежелательных побочных действий на проходящего лечение пациента. Понятно, что количество и степень побочных действий зависит от состояния, для которого вводят это соединение. Например, некоторые токсические и нежелательные побочные действия являются переносимыми при лечении угрожающих жизни болезней, хотя они могли бы не переноситься при лечении нарушений с меньшими последствиями.
Соединения могут быть также смешаны с другими активными материалами, которые не нарушают
- 34 009181 желаемого действия, или с материалами, которые дополняют желаемое действие, известными специалистам в данной области. Формы соединений и агентов для применения здесь включают формы, пригодные для перорального, ректального, местного, ингаляционного, буккального (например, подъязычного), парентерального (например, подкожного, внутримышечного, интрадермального или внутривенного), трансдермального введения или любого другого способа. Наиболее подходящий способ в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, которое должно лечиться, и от природы конкретного активного соединения, которое используется. Готовые формы предназначены для введения людям и животным в стандартных дозированных формах, таких как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, стерильные парентеральные растворы или суспензии и пероральные растворы или суспензии и эмульсии типа масло-в-воде, содержащие подходящие количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Фармацевтически и терапевтически активные соединения и их производные обычно готовят и вводят в формах однократных доз или формах множественных доз. Формы однократных доз в данном контексте обозначают физически дискретные единицы, пригодные для субъекта-человека и субъектов-животных и упакованные по отдельности, как это известно в данной области. Каждая однократная доза содержит заранее определенное количество терапевтически активного соединения, достаточное для вызывания желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтически активным носителем, наполнителем или разбавителем. Примеры форм для однократного введения включают ампулы и шприцы и индивидуально упакованные таблетки или капсулы. Формы для однократного введения могут вводиться в их частях или в кратных количествах. Форма множественных доз является множеством одинаковых форм для однократного введения, упакованных в один контейнер, для введения в разделенной форме для однократного введения. Примеры форм множественных доз включают флаконы, емкости с таблетками или капсулами или склянки пинт или галлонов. Таким образом, форма множественных доз является множеством однократных доз, которые не являются разделенными в упаковке.
Композиция может содержать вместе с активным ингредиентом разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальцийфосфат или карбоксиметилцеллюлоза; смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция и тальк; связывающий агент, такой как крахмал, природные камеди, такие как аравийская камедь, желатин, глюкозу, мелассы, поливинилпирролидон, целлюлозы и их производные, повидон, кросповидоны и другие подобные связывающие агенты, известные специалистам в данной области. Жидкие фармацевтически вводимые композиции могут быть, например, получены растворением, диспергированием или иным смешиванием активного соединения, определенного выше, и необязательных фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, солевой раствор, водная декстроза, глицерин, гликоли, этанол, и т.п. для образования таким образом раствора или суспензии. Если желательно, вводимая фармацевтическая композиция может также содержать малые количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты или солюбилизирующие агенты, буферящие рН агенты и т.п., например, ацетат, цитрат натрия, производные циклодекстрина, монолаурат сорбитана, триэтаноламин-натрийацетат, олеат триэтаноламина и другие подобные агенты. Способы приготовления таких дозированных форм известны или будут очевидными для специалистов в данной области (см., например, КеттдФп'к Р11аппасеиНса1 8с1епсек, Маск РиЬЕкЫпд Сотрапу, Еайоп, Ра., 15111 ЕбШоп, 1975). Вводимая композиция или готовая форма будет содержать активное соединение в количестве, достаточном для ослабления симптомов получающего лечение субъекта.
Могут быть приготовлены дозированные формы или композиции, содержащие активный ингредиент в диапазоне 0,005-100% с балансом, приготовленным из нетоксичного носителя. Для перорального введения фармацевтические композиции могут иметь, например, форму таблеток или капсул, изготовленных общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связывающие агенты (например, предварительно желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтеграторы (например, картофельный крахмал или гликолат натрий-крахмал); увлажнители (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут иметь оболочки, нанесенные способами, хорошо известными в данной области.
Фармацевтический препарат может быть также в жидкой форме, например в форме раствора, сиропов или суспензий, или может быть представлен в виде лекарственного продукта для восстановления водой или другим подходящим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми вспомогательными средствами, такими как суспендирующие агенты (например, сироп из сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные годные в пищу жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или аравийская камедь); неводные носители (например, миндальное масло, масла типа сложных эфиров или фракционированные растительные масла); и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота).
Формы, пригодные для ректального введения, предпочтительно представлены в виде суппозитори
- 35 009181 ев с однократной дозой. Они могут быть приготовлены смешиванием активного соединения с одним или более общепринятыми твердыми носителями, например какао-маслом, с последующим формованием полученной смеси.
Формы, пригодные для местного нанесения на кожу или в глаз, предпочтительно имеют форму мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые могут быть использованы, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты и комбинации двух или более из этих компонентов. Формы для локального применения могут выгодным образом содержать дополнительно 0,05-15 вес.% загущающих средств, выбранных из гидроксипропилметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, поли(алкиленгликолей), поли/гидроксиалкила, (мет)акрилатов или поли(мет)акрилатов. Форму для локального введения часто вводят инстилляцией (закапыванием) или в виде мази в конъюнктивальный мешок. Она может быть также использована для промывания или смазывания глаза, лицевых пазух и наружного слухового прохода. Она может также инъецироваться в переднюю камеру глазного яблока и другие места. Формы для локального применения в жидком состоянии могут также присутствовать в гидрофильном трехмерном полимерном матриксе в форме полоски (стрипа), контактных линз и т.п., из которых высвобождаются активные компоненты.
Для введения ингаляцией соединения, для применения здесь могут доставляться в форме представления аэрозольных спреев из находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля дозированная единица может определяться обеспечением клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть изготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошкообразную смесь соединения и подходящую порошковую основу, например, из лактозы или крахмала.
Формы, пригодные для буккального (подъязычного) введения, включают, например, лепешки, содержащие активное соединение в ароматизированной основе, обычно сахарозе, аравийской камеди или трагаканте; и пастилки, содержащие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и аравийская камедь.
Соединения могут быть приготовлены для парентерального введения посредством инъекции, например болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Формы для инъекции могут быть представлены в стандартной дозированной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом.
Композиции могут быть суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных носителях и могут содержать требующиеся для приготовления агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в порошкообразной форме для восстановления подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой или другими растворителями, перед использованием.
Формы, подходящие для трансдермального введения, могут быть представлены в виде дискретных пластырей, приспособленных для нахождения в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение пролонгированного периода времени. Такие пластыри предпочтительно содержат активное соединение в виде необязательно забуференного водного раствора, например, с концентрацией 0,1-0,2М относительно этого активного соединения. Формы, подходящие для трансдермального введения, могут также доставляться ионофорезом (см, например, Рйагтасеи!1са1 Кекеагсй 3 (6), 318 (1986)) и обычно имеют форму необязательно забуференного водного раствора активного соединения.
Фармацевтические композиции могут также вводиться средствами регулируемого высвобождения и/или устройствами доставки (см., например, патенты США с номерами 3536809; 3598123; 3630200; 3845770; 3847770; 3916899; 4008719; 4687610; 4769027; 5059595; 5073543; 5120548; 5354566; 5591767; 5639476; 5674533 и 5733566).
Желаемые уровни в крови могут поддерживаться непрерывной инфузией активного агента, как определено по уровням в плазме. Следует отметить, что лечащий врач должен знать, как и когда остановить, прервать или корректировать терапию для понижения дозы вследствие токсичности или дисфункций костного мозга, печени или почек. Лечащий врач должен также знать, как и когда скорректировать лечение для более высоких уровней, если клиническая ответная реакция является неадекватной (с предотвращением токсических побочных действий).
Эффективность и/или токсичность фармацевтических композиций, описанных здесь, отдельно или в комбинации с другими агентами может также оцениваться способами, известными в данной области (см., 0'КеШу, 1пуе8!1да!юпа1 №\ν Эгид^ 15: 5-13 (1997)).
Активные соединения или фармацевтически приемлемые производные могут быть приготовлены с носителями, которые защищают соединение от быстрого выведения из организма, например, в виде форм с пролонгированным действием или форм с покрытиями.
Обеспечены наборы, содержащие композиции и/или комбинации, с инструкциями для их введения. Набор может дополнительно содержать иглу или шприц, предпочтительно упакованные в стерильной форме, для инъекции комплекса и/или упакованную спиртовую подушечку. Необязательно могут быть
- 36 009181 включены инструкции для введения активного агента врачом или пациентом.
Наконец, обеспеченные здесь фармацевтические композиции, содержащие любой из предыдущих агентов, могут быть упакованы в виде изготовленных изделий, содержащих упаковочный материал, соединение или его подходящее производное, обеспеченное здесь, которое является эффективным для лечения обсуждаемых здесь заболеваний или нарушений, с упаковочным материалом и ярлыком, который указывает, что это соединение или его подходящее производное предназначено для лечения обсуждаемых здесь заболеваний или нарушений. Ярлык может необязательно содержать перечни заболеваний, для которых предписывается терапия.
Здесь обеспечены также формы для личной гигиены, содержащие масляные тельца, содержащие слитый полипептид тиоредоксин/тиоредоксинредуктаза. Продукты для личной гигиены, содержащие тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу, описаны, например, в заявках на патенты Японии ΙΡ 9012471 А2, ΙΡ 103743 А2 и ΙΡ 1129785 А2. Формы для личной гигиены, которые могут быть приготовлены в соответствии с данным изобретением, включают формы, способные улучшать физический вид кожи, подвергаемой повреждающему воздействию факторов окружающей среды, приводящему к окислительному стрессу, например окислительному стрессу, вызываемому генерируемыми УФ свободными радикалами.
Масляные тельца, содержащие тиоредоксин/тиоредоксинредуктазу, могут быть также использованы для получения продуктов по уходу за волосами, как описано в патентах США 4935231 и 4973475 (включенными здесь в качестве ссылки в их полном виде).
Следующие далее примеры включены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема данного изобретения.
Пример 1. Выделение генов тиоредоксина и НАДФН-тиоредоксинредуктазы.
Библиотеку кДНК СЭ4-12 АгаЬ1йор818 δί1κ.|ΐκ получали из АгаЬ1борк1к В1о1ощса1 Кекоигсе СеШге (АВКС, Рйр://а1т8.ср8.т8и.ейи) АгаЬИорк1к к!оск сеШге и использовали в качестве матрицы для выделения генов тиоредоксина 11 (ТгхР) и тиоредоксинредуктазы из АгаЬИорк1к. Для выделения гена ТгхР синтезировали следующие праймеры: СУК833: 5' ТАССАТСССТТСССААСААССА 3' (8ΕΟ ΙΌ N0: 1).
Последовательность, идентичная 5'-концу гена Тгхй, опубликованного в КЕ'ега-Майпй е! а1. (1993) ΡΕιηΙ Ρ^δω1 102: 327-328, показана жирным шрифтом. Сайт рестрикции NсοI для облегчения клонирования подчеркнут. СУК834: 5' САААССТТААСССААСТСТТТС 3' (8ΕΟ ΙΌ N0: 2).
Последовательность, комплементарная 3'-концу гена Тгхй, опубликованного в ККега-Майпй е! а1. (1993) ΡΕιηΙ Ρ^δω1 102: 327-328, показана жирным шрифтом. Сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ для облегчения клонирования подчеркнут.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием СУК833 и СУК834 в качестве праймеров и библиотеки кДНК ΓΌ4-12 в качестве матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент выделяли, клонировали в рВ1ие8спр1 и секвенировали. Выделенная последовательность, кодирующая ТгхР, была идентична опубликованной последовательности гена ТгхР (Штега-Майпй е! а1., (1993) ΡΕιηΙ Ρ^δώ1 102: 327328). Вектор рВ1ие8спр!, содержащий ген Тгхй, обозначали р8В82500.
Для выделения гена тиоредоксинредуктазы синтезировали следующие праймеры:
СУК836: 5' ССССАССАСАСТАССАТСААТССТСТССАААСТСАС 3' (8ΕΟ ΙΌ N0: 3). Последовательность, идентичная 5'-концу известного гена тиоредоксинредуктазы (1асцио1 е! а1., 1 Мо1 Вю1. (1994) 235 (4): 1357-63), показана жирным шрифтом.
СУК837: 5' ТТААССТТСААТСАСТСТТАССТТССТС 3' (8ΕΟ ΙΌ N0: 4).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием СУК836 и СУК837 в качестве праймеров и библиотеки кДНК ΓΌ4-12 в качестве матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент выделяли, клонировали в рВ1ие8спр1 и секвенировали. Вектор рВ1ие8сг1р(, содержащий ген тиоредоксинредуктазы, обозначали р8В82502.
Всего секвенировали три клона, последовательности всех этих трех клонов были идентичными. Однако, как изображено на фиг. 1, в этих последовательностях было несколько нуклеотидных различий в сравнении с известной последовательностью гена тиоредоксинредуктазы (Яассщо! е! а1., 1 Мо1 Вю1. (1994) 235 (4): 1357-63). Полная кодирующая последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность показаны в 8Ε0 ΙΌ N0: 10. Как результат этих нуклеотидных различий между известной последовательностью и последовательностью, выделенной в примере 1, предсказаны также несколько аминокислотных изменений. Сравнение расшифрованной аминокислотной последовательности известной последовательности НАДФН-тиоредоксинредуктазы (АТТШКВОВ, 1асцио1 е! а1., 1 Мо1 Вю1. (1994) 235 (4): 1357-63) с последовательностью, выделенной в примере 1 (ТК), показано на фиг. 3.
Пример 2. Конструирование растительных экспрессирующих векторов.
Экспрессирующие векторы конструировали для обеспечения возможности семеноспецифической сверхэкспрессии тиоредоксина и НАДФН-тиоредоксинредуктазы в семенах. Векторы конструировали для обеспечения возможности сверхэкспрессии в ее природном субклеточном местоположении и для накопления масляных телец.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82520.
Ген 1 тиоредоксина АгаЬИорк1к, описанный в примере 1, помещали под регуляторный контроль промотора фазеолина и терминатора фазеолина, происходящих из фасоли обыкновенной ЕНакеоШк νυ1
- 37 009181 дап8 (81|§Н1от е1 а1. (1983) Ргос. Νι11 Асаб 8с И8А 80: 1897-1901; 8епдир1а-Сора1ап е1 а1. (1985) РЫА8 И8А 82: 3320-3324)). Сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Ног1оп е1 а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина с геном Тгхй. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е1 а1. (1990) Мо1еси1аг С1оптд, 2пб Еб. Со1б 8ргтд НагЬог Ргекк) использовали для снабжения промотора и терминатора фазеолина сайтами Рь11 и НшбШ/Крп1, соответственно (см. 8ЕО ГО N0: 14). Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии использовали также для помещения терминатора фазеолина ниже гена Тгх1. Последовательность вставки РкЙ-промотор фазеолина-Тгхй-терминатор фазеолина-Крп1 клонировали в сайты РьИ-Крп! р8В83000 (р8В83000 является производным бинарной плазмиды рР2Р221 АдгоЬас1епит) (На)бик1е\\'1сх е1 а1., 1994, Р1ап1 Мо1ес. Вю1. 25: 989-994). В р8В83000 промотор СаМУ358-ген устойчивости к гентамицину-терминатор СаМУ358 рР2Р221 был заменен последовательностью промотор убиквитина петрушки-ген фосфинотрицин-ацетилтрансферазы-последовательность терминации убиквитина петрушки для придания устойчивости к гербициду глюфозинату аммония. Полученная плазмида обозначена р8В82520.
Последовательность промотор фазеолина-Тгхй АгаЫбормк-терминатор фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 14.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82510.
3'-Кодирующую последовательность гена олеозина АгаЫборкщ (уап Яооуеп е1 а1. (1992) Р1ап1 Мо1. Вю1. 18: 1177-1179) изменяли таким образом, чтобы она содержала сайт ΝοοΙ. №о1-НшбШ-фрагмент вектора р8В82500 (пример 1), содержащий Тгхй, лигировали с кодирующей последовательностью олеозина АгаЬ1бор818 с использованием сайта рестрикции ΝοοΙ. Сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Ног1оп е1 а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина (ЗНдЫот е1 а1. (1983) Ргос. Νιϊ1 Асаб 8с И8А 80: 1897-1901; 8е11Щ|р1а-С>ора1аи е1 а1. (1985) ₽ΝΆ8 И8А 82: 3320-3324), содержащего синтетический сайт РШ (см. конструирование р8В82520), с кодирующей последовательностью олеозина АгаЫборык. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е1 а1. (1990) Мо1еси1аг С1ошп§. 2пб еб. Со1б 8рпп§ НагЬог Ргекк) снова использовали для клонирования НтбШ-Крп1-фрагмента, содержащего терминатор фазеолина (см. конструирование р8В82520) ниже гена Тгхй. Последовательность вставки РкП-промотор фазеолина-олеозин-Тгхйтерминатор фазеолина-Крп1 клонировали в РШ-Крп1-сайты р8В83000. Полученная плазмида названа р8В82510.
Последовательность промотор фазеолина-олеозин-Тгхй-последовательность терминатора фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 16.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82521.
Этот вектор содержит те же самые генетические элементы, что и вставка р8В82510, за исключением того, что ген Тгхй слит с 5'-концом гена олеозина. 3'-Кодирующая последовательность олеозина, включающая ее природный стоп-кодон (уап Яооуеп е1 а1. (1992) Р1ап1 Мо1. Вю1. 18: 1177-1179) была снабжена клонирующим сайтом НтбШ. Опять сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Ног1оп е1 а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина с геном Тгхй и для слияния гена Тгхй с последовательностью олеозина. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е1 а1. (1990) Мо1еси1аг С1ошп§. 2пб Еб. Со1б 8ргтд НагЬог Ргекк) снова использовали для клонирования НшбШ-Крп1-фрагмента, содержащего терминатор фазеолина (см. конструирование р8В82520) ниже гена олеозина.
Последовательность вставки РЩ-промотор фазеолина-Тгхй-олеозин-терминатор фазеолина-Крп1 клонировали в РШ-КрпЪсайты р8В83000. Полученная плазмида обозначена р8В82521.
Последовательность промотор фазеолина-Тгхй-олеозин-последовательность терминатора фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 19.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82527.
Ген НАДФН-тиоредоксинредуктазы АгаЫборкщ, описанный в примере 1, помещали под регуляторный контроль промотора фазеолина и терминатора фазеолина, происходящих из фасоли обыкновенной Рйа8ео1и8 уц1дап8 (811дЫот е1 а1. (1983) Ргос. Νι11 Асаб 8с И8А 80: 1897-1901; 8еидирΐа-Сора1аи е1 а1. (1985) РNА8 И8А 82: 3320-3324). Сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Ног1оп е1 а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина с геном тиоредоксинредуктазы. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е1 а1. (1990) Мо1еси1аг С1опйщ. 2пб Еб. Со1б 8рпп§ НагЬог Ргекк) использовали для снабжения промотора и терминатора фазеолина сайтами РШ и НтбШ/Крп! соответственно (см. 8Е0 ГО N0: 14). Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии использовали также для помещения терминатора фазеолина ниже гена тиоредоксинредуктазы. Последовательность вставки РШ-промотор фазеолинатиоредоксинредуктаза-терминатор фазеолина-Крп1 клонировали в сайты Рз11-Крп1 р8В83000. Полученная плазмида обозначена р8В82527. Последовательность промотор фазеолина-тиоредоксинредуктаза АгаЫборкщ-последовательность терминатора фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 22.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82531.
Сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Ног1оп е1 а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина (811§Ыош е1 а1 (1983) Ргос. Νι11 Асаб 8с И8А 80: 1897
- 38 009181
1901; 8епднр1а-Сора1ап е! а1. (1985) РНА8 И8А 82: 3320-3324) с кодирующей последовательностью олеозина АгаЬ1йорк1к. Тот же самый способ сплайсинга генов использовали для слияния гена олеозина с кодирующей последовательностью тиоредоксинредуктазы. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е! а1. (1990) Мо1еси1аг С1оп1пд, 2пй ей. Со1й 8ргшд НагЬог Ргекк) использовали для клонирования НтйШ/КрпЪфрагмента, содержащего терминатор фазеолина ниже гена тиоредоксинредуктазы. Последовательность вставки РкЙ-промотор фазеолина-олеозинтиоредоксинредуктаза-терминатор фазеолина-Крп1 клонировали в сайт Рк!1-Крп1 р8В83000. Полученная плазмида обозначена р8В82531. Последовательность промотор фазеолина-олеозин-тиоредоксинредуктаза-последовательность терминатора фазеолина показана в 8ЕО ГО N0: 24.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82529.
Этот вектор содержит те же самые генетические элементы, что и вставка р8В82531, за исключением того, что ген тиоредоксинредуктазы слит с 5'-концом гена олеозина. 3'-кодирующая последовательность олеозина, включающая ее природный стоп-кодон (уап Кооуеп е! а1. (1992) Р1ап! Мо1. Вю1. 18: 11771179), была снабжена клонирующим сайтом НшйШ. Сплайсинг генов посредством способа перекрывающегося удлинения (Нойоп е! а1. (1989) 15: 61-68) снова использовали для слияния промотора фазеолина с геном тиоредоксинредуктазы и для слияния гена тиоредоксинредуктазы с последовательностью олеозина.
Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е! а1. (1990) Мо1еси1аг С1оп1пд, 2пй ей. Со1й 8рпп§ НагЬог Ргекк) снова использовали для клонирования НшйШ-КрпЪ фрагмента, содержащего терминатор фазеолина (см. конструирование р8В82520) ниже от гена олеозина.
Последовательность вставки РкЙ-промотор фазеолина-тиоредоксинредуктаза-олеозин-терминатор фазеолина-Крп! клонировали в Рк!1-Крп1-сайты р8В83000. Полученная плазмида обозначена р8В82529. Последовательность промотор фазеолина-тиоредоксинредуктаза-олеозин-последовательность терминатора фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 27.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82530.
Осуществляли трансформацию растения, содержащую ген тиоредоксинредуктазы МусоЬас!егшт 1ергае/ген тиоредоксина (М1ер ТК/Тгхй). Конструкцию, обозначенную рН18/ТК/Тгх1 (^1е1ек е! а1. (1995) 1 Вю1 С1ет 270: 25604-25606), получали из отделения банка иммуногематологии и крови Лейденского университета, Нидерланды и использовали в качестве матрицы для ПЦР для получения р8В82530. Конструирование р8В82530 было идентичным конструированию р8В82531, за исключением того, что использовали ген М1ер ТК/Тгхй вместо гена тиоредоксинредуктазы АгаЫйорщк. Сплайсинг генов посредством способа перекрывающихся удлинений (Нойоп е! а1. (1989) 15: 61-68) использовали для слияния промотора фазеолина (81щ1Иот е! а1. (1983) Ргос. №11 Асай 8с И8А 80: 1897-1901; 8епщ.1р1а-Сора1ап е! а1. (1985) РNА8 И8А 82: 3320-3324) с кодирующей последовательностью олеозина АгаЫйоркщ. Тот же самый способ сплайсинга генов использовали для слияния гена олеозина с кодирующей последовательностью М1ер ТК/Тгхй. Стандартные лабораторные способы молекулярной биологии (см., например, 8атЬгоок е! а1. (1990) Мо1еси1аг Попищ, 2пй ей. Со1й 8рпп§ НагЬог Ргекк) снова использовали для клонирования Нтй111/1<рп1-фрагмента, содержащего терминатор фазеолина ниже гена М1ер ТК/Тгх1. Последовательность вставки Рк!1-промотор фазеолина-олеозин-М1ер ТК/Тгх1-терминатор фазеолина-Крп! клонировали в сайт Рк!1-Крп1 р8В83000. Полученная плазмида обозначена р8В82530. Последовательность промотор фазеолина-олеозин-М1ер ТК/ТгхН-последовательность терминатора фазеолина показана в 8Е0 ГО N0: 30.
Конструирование растительного трансформирующего вектора р8В82542.
Из первоначальных анализов активности (фиг. 4) было очевидно, что масляные тельца, экспрессирующие слитый белок олеозин-М1ер ТК/Тгх1, обладали значительной восстанавливающей активностью. Ожидалось, что сходная слитая конструкция олеозина, кодирующая белки тиоредоксинредуктазу и тиоредоксин АгаЬ1йорк1к, могла бы вести себя аналогичным образом. Использовали молекулярное моделирование для облегчения конструирования такой конструкции. Конструировали праймеры (тиоредоксинлинк-Ь:
5'-АСТ66А6АТ6ТТ6АСТС6АС66АТАСТАС66АТТ66ТС6АС66СТАТ66АА6АА60АСАА ОТ6АТС6ССТОС-3'; (8Е0 ГО N0: 5), и тиоредоксин-линк-К):
5'-АТСС6ТС6А6ТСААСАТСТССА6ТТТССТС66Т66ТСТС6ТТА6ССТТС6АТССА0САА ТСТСТТ6ТАА6ААТ6СТСТОС-3'; (8Е0 ГО N0: 6) для кодирования синтетического линкерного пептида между белками тиоредоксинредуктазой и тиоредоксином. Эти праймеры использовали вместе с праймерами 6УК873 (5'-6Т66АА6СТТАТ66А6АТ66А0-3'; 8 ЕС) ГО N0: 7) и 6УК834 (5'6ААА6СТТАА6ССАА6Т6ТТТ0-3'; 8Е0 ГО N0: 2) для амплификации участка, кодирующего тиоредоксинредуктаза-линкерный участок-тиоредоксин с помощью гена, с использованием способа перекрывающихся удлинений (Нойоп е! а1. (1989) 15: 61-68). Затем кодирующую последовательность тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин клонировали в предсуществующий вектор с использованием стандартных способов молекулярной биологии (8атЬгоок е! а1. (1990) Мо1еси1аг Оопн-щ, 2пй ей. Со1й 8рпп§ НагЬог Ргекк). Полученная плазмида была обозначена р8В82542. Последовательность промотор фазеолина-олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин-участок терминатора фазеолина показана в 8Е0
- 39 009181
ΙΌ N0: 33. Сравнение аминокислотной последовательности между тиоредоксинредуктаза АгаЬ1бор818линкер-тиоредоксин и М. 1ергае ТР/ТгхН показано на фиг. 12.
Плазмиды р8В82510, р8В82520, р8В82521, р8В82527, р8В82529, р8В82530, р8В82531 и р8В82542 электропорировали в штамм ЛдгоЬас1егшт ЕНА101. Штаммы АдгоЬас1егшт использовали для трансформации ЛгаЬИор818. Трансформацию АгаЫборкщ осуществляли фактически, как описано в АгаЫборкщ РгоЮсоГ; Ме11юб5 ίη то1еси1аг Ью1оду Уо1 82. Ебйеб Ьу Маг1тех-2ара1ег ΙΜ аиб 8а1та§ 1. I8ВN 0-89603391-0 рд 259-266 (1998) за исключением того, что предположительные трансгенные растения отбирали на агарозных чашках, содержащих 80 мкМ Ь-фосфотрицин, затем их пересаживали в почву и давали завязаться семенам.
Пример 3. Электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблоттинг экстрактов трансгенных семян.
Источник антител к тиоредоксину, тиоредоксинредуктазе и олеозину АгаЬ1бор818.
Гены тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы АгаЬ1бор818 клонировали в рамке считывания в бактериальном экспрессирующем векторе рВ8ЕТВ Диуйгодеи) для сверхэкспрессии белков тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы АгаЫборкщ. Эти белки очищали с использованием стандартных протоколов (см., например, протокол 1иуйтодеи) и использовали для индукции антител в кроликах с использованием стандартных биохимических способов (См., например, Сштеи! Рго1осо15 ίη Мо1еси1аг В1о1оду, 1оЬи ^11еу аиб 8ои5, Ν.Υ. (1989). Ген олеозина АгаЫборкщ клонировали в рамке считывания в бактериальном экспрессирующем векторе рВ8ЕТВ (1иуйгодеи) для сверхэкспрессии белка олеозина АгаЫборкщ. Этот белок очищали с использованием стандартных протоколов (см., например, протокол 1иу11тодеи) и использовали для получения мышиных моноклональных антител с использованием стандартных биохимических способов (См., например, Сштеи! РгоЮсой 1и Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬи ^11еу аиб 8оик, Ν.Υ. (1989).
Получение общих экстрактов семян АгаЬ1бор818 для электрофореза в ПААГ.
Семена АгаЫборкщ измельчали в приблизительно 20 объемах 2% ДСН, 50 мМ Трис-С1, этот экстракт кипятили, центрифугировали и супернатант готовили для электрофореза в полиакриламидном геле (электрофореза в ПААГ) с использованием стандартных протоколов.
Получение экстрактов белка масляных телец АгаЬ1бор818.
Семена АгаЬ1бор818 измельчали в приблизительно 20 объемах воды и центрифугировали в микрофуге. Масляные тельца извлекали и промывали последовательно приблизительно 20 объемами воды, промывочным буфером высокой жесткости, содержащим 8 М мочевину и 100 мМ карбоната натрия и водой. После последней промывки масляные тельца готовили для электрофореза в полиакриламидном геле (электрофореза в ПААГ) с использованием стандартных протоколов.
Анализ экстрактов семян и масляных телец из растений, трансформированных р8В82510.
Общие экстракты семян и экстракты белка масляных телец из растений, трансформированных р8В82510, наносили на полиакриламидные гели и либо окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо электроблоттировали на ПВДФ-мембраны. Мембраны обрабатывали поликлональным антителом, индуцированным против тиоредоксина АгаЬ1бор818, или моноклональным антителом, индуцированным против олеозина 18,5 кДа АгаЬ1бор818, и визуализировали с использованием щелочной фосфатазы. Экспрессия комплекса олеозин-тиоредоксин приводит к дополнительной полосе 31,2 кДа. Эти результаты указывают на то, что антитела к тиоредоксину являются иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы (31,2 кДа), а антитела к олеозину являются также иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы для слитого белка (31,2 кДа), наряду с полосой, соответствующей природному олеозину АгаЫборкщ (18,5 кДа). Это свидетельствует о том, что комплекс олеозин-тиоредоксин экспрессируется в семенах АгаЫборкщ и правильно нацеливается на масляные тельца.
Анализ экстрактов семян и масляных телец из растений, трансформированных р8В82521.
Общие экстракты семян и экстракты белка масляных телец из растений, трансформированных р8В82521, наносили на полиакриламидные гели и либо окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо электроблоттировали на ПВДФ-мембраны. Мембраны обрабатывали поликлональным антителом, индуцированным против тиоредоксина АгаЬ1бор818, или моноклональным антителом, индуцированным против олеозина 18,5 кДа АгаЬ1бор818, и визуализировали с использованием щелочной фосфатазы. Экспрессия комплекса тиоредоксин-олеозин приводит к дополнительной полосе 31,2 кДа. Эти результаты указывают на то, что антитела к тиоредоксину являются иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы (31,2 кДа), а антитела к олеозину являются также иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы для слитого белка (31,2 кДа), наряду с полосой, соответствующей природному олеозину АгаЫборкщ (18,5 кДа). Это свидетельствует о том, что комплекс тиоредоксин-олеозин экспрессируется в семенах АгаЫборкщ и правильно нацеливается на масляные тельца.
Анализ экстрактов семян и масляных телец из растений, трансформированных р8В82520.
Общие экстракты семян из растений, трансформированных р8В 82520, наносили на полиакриламидные гели и либо окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо электроблоттировали на ПВДФмембраны. Мембраны обрабатывали поликлональным антителом, индуцированным против тиоредоксина
- 40 009181
ЛгаЬ1йор818, и визуализировали с использованием щелочной фосфатазы. Результаты указывают на то, что антитела к тиоредоксину являются иммунологически реактивными с полосой приблизительно правильно предсказанной молекулярной массы (12 кДа). Нетрансформированные семена не обнаруживают детектируемой полосы тиоредоксина.
Анализ экстрактов семян и масляных телец из растений, трансформированных р8В82529.
Общие экстракты семян и экстракты белка масляных телец из растений, трансформированных р8В82529, наносили на полиакриламидные гели и электроблоттировали на ПВДФ-мембраны. Мембраны обрабатывали поликлональным антителом, индуцированным против тиоредоксинредуктазы ЛгаЫйорык, или моноклональным антителом, индуцированным против олеозина 18,5 кДа АгаЬИорщк, и визуализировали с использованием щелочной фосфатазы. Экспрессия комплекса тиоредоксинредуктаза-олеозин приводит к дополнительной полосе 53,8 кДа. Эти результаты указывают на то, что антитела к тиоредоксинредуктазе являются иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы (53,8 кДа), а антитела к олеозину являются также иммунологически реактивными с полосой правильно предсказанной молекулярной массы для слитого белка (53,8 кДа), наряду с полосой, соответствующей природному олеозину АгаЫйоркщ (18,5 кДа). Это свидетельствует о том, что комплекс тиоредоксинредуктаза-олеозин экспрессируется в семенах АгаЫйорык.
Анализ экстрактов семян из растений, трансформированных р8В82527.
Общие экстракты семян из растений, трансформированных р8В 82527, наносили на полиакриламидные гели и электроблоттировали на ПВДФ-мембраны. Мембраны обрабатывали поликлональным антителом, индуцированным против тиоредоксинредуктазы АгаЬИорщк, и визуализировали с использованием щелочной фосфатазы. Антитела против тиоредоксинредуктазы являются иммунологически реактивными с полосой приблизительно правильной молекулярной массы (35,3 кДа). Нетрансформированные семена не обнаруживают детектируемой полосы тиоредоксинредуктазы.
Анализ экстрактов семян из растений, трансформированных р8В82531.
Гель и иммуноблот белка получали анализом экспрессии олеозин-ОМ8В в семенах АгаЫйоркщ Т2 и правильным нацеливанием на масляные тельца АгаЬИорщк. Было рассчитано, что ожидаемая молекулярная масса на основе расшифрованной аминокислотной последовательности равна 53817 Да. В экстракте масляных телец пробы трансгенного комплекса олеозин-тиоредоксинредуктаза наблюдали лишнюю полосу приблизительно 54 кДа. Как было подтверждено, эта полоса согласно иммуноблоттингу является олеозин-тиоредоксинредуктазой. На полиакриламидном геле наблюдали, что экспрессия олеозинатиоредоксинредуктазы является приблизительно в 2 раза более высокой в сравнении с экспрессией основного олеозина 18,5 кДа АгаЫйоркщ. Это составляет приблизительно 2-4% общего белка семян.
Анализ экстрактов семян из растений, трансформированных р8В82530.
Гель и иммуноблот белка получали анализом экспрессии олеозин-М.1ер ТК/ТгхН в семенах АгаЫйор818 Т2 и правильным нацеливанием на масляные тельца АгаЫйоркщ. Было рассчитано, что ожидаемая молекулярная масса на основе расшифрованной аминокислотной последовательности равна 67550 Да. В экстракте масляных телец пробы трансгенного комплекса олеозин-М.1ер ТК/Тгхй наблюдали лишнюю полосу приблизительно 68 кДа. Как было подтверждено, эта полоса согласно иммуноблоттингу является олеозин-М.1ер ТК/ТгхН. На полиакриламидном геле наблюдали, что экспрессия олеозина-М.1ер ТЮТгхй является сходкой с экспрессией основного олеозина 18,5 кДа АгаЫйоркщ. Это составляет приблизительно 1-2% общего белка семян.
Анализ экстрактов семян из растений, трансформированных р8В82542.
Неочищенные экстракты масляных телец из линий р8В82542 получали измельчением 100 мкг семян в 1 мл 100 мМ Трис-буфера при рН 7,5. Затем пробы центрифугировали для выделения фракции масляных телец. Затем фракцию масляных телец наносили на ДСН-полиакриламидный гель для анализа экспрессии. Окрашенный Кумасси гель выявил, что это синтетическое слияние накапливалось до высоких уровней в неочищенных экстрактах масляных телец из 3 из четырех испытанных линий. Было установлено, что этот слитый белок представлял приблизительно 2-5% общего белка семян. Кроме того, вестерн-блоты, использующие либо антитела против тиоредоксин, либо антитела против тиоредоксинредуктазы, подтвердили, что сверхэкспрессируемый белок 70 кДа был действительно комплексом олеозинтиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин.
Пример 4. Биологическая активность трансформантов тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы.
Исходные анализы восстановления.
ОТ№-анализ.
Активность тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы определяли с использованием колориметрического ΟΈΝΡ [5,5'-дитиолбис(2-нитробензойная кислота)]анализа. Этот анализ выполняли в рекционном объеме 700 мкл, содержащем 100 мМ Трис-С1 рН 8,0, 5 мМ ЭДТА, 200 мкМ ΟΈΝΡ [5,5'-дитиолбис(2нитробензойная кислота)] и 200 мкМ НАДФН. При добавлении тиоредоксинредуктазы и тиоредоксина НАДФН будет восстанавливать тиоредоксинредуктазу, которая затем будет восстанавливать тиоредоксин, который будет, в свою очередь, восстанавливать ^ТNВ (см. уравнения ниже).
- 41 009181
НАДФН2+тиоредоксинредуктазаок—>т,иоредоксинредуктазазос+НАДФ тиоредоксинредуктазаВОс+тиоредоксинок—>тиоредоксинВОс+ тиоредоксинредуктазаок тиоредоксиНвос+ΟΤΝΒοκ—>2 (2-нитро-5-меркаптобензойная кислота)+тиоредоксинок
Образование желтого продукта подвергали мониторингу измерением 0Ό412 в спектрофотометре после установленного периода времени (обычно 0,5-2 ч). Результаты первоначальных анализов активности показаны на диаграмме в виде столбцов на фиг. 4 и описаны ниже.
Сначала 100 мкг общего белка семян добавляли из каждой из трансгенных линий АгаЬ1бор818, р8В82520 (цитозольный тиоредоксин) и р8В82527 (цитозольная тиоредоксинредуктаза), что соответствует приблизительно 1 мкг цитозольных тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы, используемых в этом анализе. В этом случае количество восстановленной ЭТЫВ было сравнимым с восстановлением посредством 1 мкг каждого из белков тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы Е. сой. В этих растениях пробы семян растений считывания фона были очень низкими при добавлении к реакции только одного из двух экстрактов (либо цитозольного тиоредоксина, либо цитозольной тиоредоксинредуктазы; фиг. 4, столбцы 3 и 6 соответственно) вместе с масляными тельцами дикого типа.
Анализ с фракциями масляных телец из трансгенных семян выявил, что тиоредоксин и тиоредоксинредуктаза АгаЬ1бор818 были существенно менее активными при слиянии с олеозинами масляных телец. Приблизительно 300 мкг неочищенного, непромытого белка масляных телец использовали в этом анализе (что соответствует 10-30 мкг комплексов тиоредоксин-олеозин (р8В 82521; фиг. 4, столбец 2), олеозин-тиоредоксин (р8В82510, фиг. 4, столбец 1), тиоредоксинредуктаза-олеозин (р8В82529, фиг. 4, столбец 5) или олеозин-тиоредоксинредуктаза (р8В82531, фиг. 4, столбец 4). Белки масляных телец испытывали вместе с 100 мкг общего белка семян, содержащего приблизительно 1 мкг цитозольного тиоредоксина (р8В82520) или цитозольной тиоредоксинредуктазы (р8В82527).
В таких анализах р8В82529 (тиоредоксинредуктаза-олеозин) и р8В82531 (олеозин-тиоредоксинредуктаза) действительно обладают редуктазной активностью при комбинировании с цитозольным тиоредоксином р8В82520 (см. фиг. 4, столбцы 7 и 8 соответственно). Эксперименты показали, что редуктазная активность комплекса олеозин-тиоредоксинредуктаза составляла приблизительно 10-15% редуктазной активности цитозольной тиоредоксинредуктазы. Добавление твина в конечной концентрации 0,4% могло усиливать эту активность в 2-3 раза. Интересно, что комплекс олеозин-тиоредоксинредуктаза (р8В82531) оказался способен восстанавливать ИТЫВ в отсутствие добавленного тиоредоксина, хотя добавленный тиоредоксин вызывает значительно более высокое восстановление ИТЫВ (см. фиг. 4; сравните столбец 4 дикий тип+олеозин-тиоредоксинредуктаза со столбцом 7 тиоредоксин+олеозинтиоредоксинредуктаза). Эксперименты с р8В82521 (тиоредоксин-олеозин) или р8В82510 (олеозинтиоредоксин), объединенными с цитозольной тиоредоксинредуктазой р8В82527 (см. фиг. 4, столбцы 10 и 11 соответственно), показывают, что активность тиоредоксина этих слияний является недетектируемой при этих концентрациях.
Масляные тельца трансгенной линии АгаЬ1йор818 р8В82530 (олеозин-М.1ер ТК/Тгхй) содержат значительную тиоредоксин/тиоредоксинредуктазную активность (см. фиг. 4, столбец 12). В этом анализе испытывали сто микрограммов неочищенного белка масляных телец для р8В82530 (что соответствовало приблизительно 5 мкг слияния олеозин-М.1ер ТК/Тгхй). На основании этого анализа, было определено, что это слияние имеет активность приблизительно 25-40% относительно цитозольных тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы АгаЬ1бор818 (фиг. 4, столбец 9) при сравнении удельной активности.
Анализ восстановления инсулина.
Результаты ОТЫВ-аналнзов были подтверждены анализами восстановления инсулина. Этот анализ содержал инсулин в конечной концентрации 1 мг/мл в 100 мМ КН2Р04 рН 7,0+5 мМ ЭДТА. В присутствии НАДФН (500 мкМ), тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы инсулин восстанавливается и осаждается из раствора. Обычно восстановление инсулина прослеживается измерением мутности при 0Ό 650. Альтернативно, можно измерять превращение НАДФН2 в НАДФ+ мониторингом уменьшения поглощения при 340 нм.
Оба анализа трудно выполнять в присутствии масляных телец вследствие их влияния на показания спектрофотомера. Однако количественные данные могли быть получены центрифугрованием пробирок после установленного периода времени и определением, присутствует ли осадок инсулина (масляные тельца всплывают наверх, тогда как осадок инсулина осаждается). Альтернативно, пробы можно было отфильтровывать после установленного периода времени, и изменение оптической плотности при 340 нм могло быть измерено. Как упоминалось ранее, результаты анализов восстановления инсулина согласовались с результатами ОТМВ-анализа, за исключением наблюдения, что р8В82531 (олеозинтиоредоксинредуктаза) восстанавливал инсулин только в присутствии свободного тиоредоксина из р8В82520.
- 42 009181
Анализы на семенах из гибридов АгаЬ1борз18, которые коэкспрессируют олеозин-тиоредоксин и олеозин-тиоредоксинредуктазу.
На основании первоначальных анализов восстановления 1)Т\В и инсулина очевидно, что смешивание масляных телец из трансгенных семян со слияниями олеозин<->тиоредоксин и олеозин<-> тиоредоксинредуктаза приводило к очень ограниченной восстанавливающей активности (обратите внимание: <-> указывает обе конфигурации слияний олеозина; т.е. олеозин<->тиоредоксин представляет слияния олеозинтиоредоксин и тиоредоксин-олеозин). Для определения, будет ли присутствие белков, имеющих слияния олеозин<->тиоредоксин и олеозин<->тиоредоксинредуктаза, на одном и том же масляном тельце, оказывать положительное действие на восстанавливающую активность этих белков, производили скрещивания для получения двойных трансгенных линий АгаЬ1борз18. Эти скрещивания иллюстрируются в табл. 2.
Таблица 2
Мужская особь Женская особь Подтвержден ные двойные трансгенные линии (ПЦР и вестерн-блот)
Олео-тиоредоксин X олео- А ЗЯ____ 4
Олео-тиоредоксин X Тиоредоксинредуктазаолео 1
тиоредоксин-олео X олео- тиоредоксинредуктаза 0
тиоредоксин-олео X Тиоредоксинредуктазаолео 4
олео-тиоредоксинредуктаза X олео-тиоредоксин 2
олео- тиоредоксинредуктаза X тиоредоксин-олео 0
тиоредоксинредуктаза- олео X олео-тиоредоксин Ί
тиоредоксинредуктазаолео X тиоредоксин-олео 0
Семена гибридов АгаЬ1бор818 проращивали на РРТ-чашках и проростки переносили в почву спустя приблизительно 2 недели. ПЦР-эксперименты на ДНК, выделенных из этих проростков, идентифицировали ряд растений, которые содержат обе генные конструкции олеозин<->тиоредоксин и олеозин<-> тиоредоксинредуктаза в их геномах.
Семена собирали из этих растений для анализов экспрессии и активности. Вестерн-блоттинги проводили для подтверждения экспрессии конструкций как олеозин<->тиоредоксин, так и олеозин<->тиоредоксинредуктаза в этих линиях. Анализы восстановления 1)Т\В и инсулина также выполняли для сравнения активности между родительскими линиями с одним трансгеном и потомками с двумя трансгенами, и эти результаты суммированы в табл. 3. Табл. 3 суммирует активность восстановления 1)Т\В различных трансгенных линий. Последние два ряда сравнивают смешивание масляных телец из родительской линии с одним трансгеном с использованием масляных телец из потомка с двумя трансгенами. Реактивная активность для смеси тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы Е. со11 принята за 100%.
Таблица 3
Источник материала Относительная активность(%)
Вгх + ΝΤΚ Е. соИ 100
«Свободный» тиоредоксин+тиоредоксинредуктаза АгаЫборзгз (ρ3Β32520+ρ3Β32527) 100
Олеозин-М.1ер ТК/ТгхЬ (р5В32530) -30
Олеозин<->тиоредоксинредуктаза + олеозин<->тиоредоксин (смешивание масляных телец из родителей с одним трансгеном) -3
Олеозин<->тиоредоксинредуктаза X олеозин<->тиоредоксин (различные линии с двумя трансгенами) ~50
На основании анализов восстановления 1)Т\В и инсулина очевидно, что растения с двумя трансгенами, коэкспрессирующие олеозин<->тиоредоксин и олеозин<->тиоредоксинредуктазу на одном и том же единственном масляном тельце, содержали значительно большую восстанавливающую активность в сравнении со смешиванием масляных телец из линий с одним трансгеном олеозин<->тиоредоксин или олеозин<->тиоредоксинредуктаза. Кроме того, очевидно, что экстракты масляных телец из коэкспресси
- 43 009181 рующих линий обладали большей восстанавливающей активностью в сравнении с линией р8В82530 (олеозин-М.1ер ТК/Тгхй), которая была ранее идентифицирована как линия, содержащая наивысшую восстанавливающую активность масляных телец.
Эти результаты предполагают, что создание двойных трансгенных линий (либо скрещиванием, либо котрансформацией 2 экспрессионных конструкций в растения) может представлять один из способов, при помощи которых исследователи могли бы решить исходную проблему, заключающуюся в неспособности генерировать восстанавливающую активность смешиванием масляных телец из линий с одним трансгеном олеозин<->тиоредоксин и олеозин<->тиоредоксинредуктаза.
Анализы на семенах из трансгенных линий р8В82542 АгаЫборшк, которые экспрессируют слитый белок олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин.
Экстракты масляных телец из четырех линий р8В582542 испытывали на восстанавливающую активность в анализах восстановления ΌΤΝβ и инсулина с использованием описанных ранее стандартных протоколов. Экстракты масляных телец, содержащие белок олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкертиоредоксин, также обладали значительной восстанавливающей активностью. На основании таких анализов было выявлено, что синтетический слитый белок олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкертиоредоксин был более активным, чем слияние олеозин-М.1ер ТК/Тгхй. Кроме того, оказалось, что масляные тельца, содержащие белок олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин, имеют большую восстанавливающую активность в сравнении с масляными тельцами из линии с двумя трансгенами, которые коэкспрессируют белки олеозин<->тиоредоксин и олеозин<->тиоредоксинредуктаза.
Результаты, сравнивающие восстанавливающую активность для различных конструкций тиоредоксинредуктазы/тиоредоксина, суммированы в табл. 4. Табл. 4 суммирует активность восстановления ^ΤNВ различных трансгенных линий. Линия р8В82542, экспрессирующая конструкцию олеозинтиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин, обладает значительной восстанавливающей активностью, сравнимой с активностью «свободных» форм тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы АгаЫборык и эквивалентных белков Е. сой. Относительная активность смеси тиоредоксина и тиоредоксинредуктазы Е. сой принята за 100%.
Таблица 4
Источник материала Относительная активность(%)
йгх + ΝΤΚ Е. со!1 100
«Свободный» тиоредоксин+тиоредоксинредуктаза АгаЫборзтз (ρ3Β32520+ρ3Β32527) 100
Олеозин-М.1ер ΊΉ/Тгхй (рЗВ32530) -30
Олеозин<->тиоредоксинредуктаза + олеозин<->тиоредоксин (смешивание масляных телец из родителей с одним трансгеном) -3
Олеозин<->тиоредоксинредуктаза X олеозин<->тиоредоксин (различные линии с двумя трансгенами) -50
Олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкертиоредоксин (р5В32542) -75-100
Анализы восстановления, сравнивающие использование НАДН в сравнении с НАДФН в качестве кофактора (донора электрона) для системы тиоредоксинредуктаза/тиоредоксин.
Анализы восстановления ^ΤNВ и инсулина проводили, как описано ранее, за исключением того, что НАДФН заменяли НАДН в качестве донора электрона в системе, использующей тиоредоксинредуктазу и тиоредоксин Е. сой. Таким образом, проводили сравнение утилизации НАДН в сравнении с НАДФН в качестве кофактора для системы тиоредоксинредуктазы/тиоредоксина Е. сой. Для ^ΤNВанализа реакционная смесь состояла из 400 мкМ ^ΤNВ, 10 мкг/мл тиоредоксина Е. сой и 10 мкг/мл тиоредоксинредуктазы Е. сой в 100 мМ Трис-С1-буфере рН 8,0. Затем к ^ΤNВ-реакции добавляли НАДН или НАДФН следующим образом:
Реакция А. 200 мкМ НАДФН (81дта).
Реакция В. 800 мкМ НАДН (81дта).
Реакция С. 800 мкМ НАДН (Косйе).
Реакция Ό. (-) кофактор.
Реакция Е. 800 мкМ НАДН (без ТК или Тгхй).
Для анализа восстановления инсулина реакционная смесь состояла из 1 мг/мл инсулина бычьей поджелудочной железы, 20 мкг/мл тиоредоксина Е. сой и 20 мкг/мл тиоредоксинредуктазы Е. сой в 100 мМ калийфосфатном буфере при рН 7,0. Затем к реакции добавляли НАДН или НАДФН следующим образом:
Реакция А. 800 мкМ НАДФН (81дта).
Реакция В. 800 мкМ НАДН (81дта).
- 44 009181
Реакция С. 800 мкМ НАДН (Восйе).
Реакция Ό. (-) кофактор.
Реакция Е. 2 мМ НАДН (без ТВ или Тгхй).
Результаты показывают, что НАДН, купленный из 81дта или Восйе, мог действовать в качестве донора электрона в анализах восстановления как ^ΤNВ, так и инсулина. Однако скорость восстановления была более низкой, чем скорость восстановления, наблюдаемая с НАДФН в качестве кофактора. Было оценено, что скорость восстановления инсулина с использованием НАДН в качестве донора электрона составляла приблизительно 25-50% в сравнении с максимальной скоростью с использованием НАДФН. Кроме того, было определено, что скорость восстановления ОТ^ с использованием НАДН в качестве донора электронов составляла приблизительно 5-10% максимальной скорости с использованием НАДФН. Сходные результаты наблюдали с использованием слитого белка олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин на масляных тельцах АгаЬ1борз15 вместо тиоредоксинредуктазы и тиоредоксина Е. сой.
Пример 5. Получение мультимерного белка иммуноглобулина в клетках семян растения и улавливание на масляных тельцах с использованием слитых белков белок А-олеозин.
1. Получение мультимерного белка иммуноглобулина в клетках семян растений.
Для экспрессии мультимерных белковых комплексов, содержащих мультимерные комплексы иммуноглобулина, кДНК-последовательности, кодирующие индивидуальные легкую и тяжелую цепи, 1) могут быть выделены из клеточных линий, экспрессирующих конкретное антитело, таких как клональные линии В-клеток или гибридомная клеточная линия, или 2) эти комплексы могут быть рекомбинантным антителом, собранным комбинированием выбранных вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей и доступных последовательностей константных доменов легкой и тяжелой цепей соответственно. Вариабельные домены со специфическими связывающими свойствами могут быть выделены из скрининга популяций таких последовательностей, обычно в форме библиотеки фагового представления одноцепочечных Ρν.
Начиная с известных последовательностей нуклеиновых кислот и источника легкой и тяжелой цепей, кодирующие зрелый полипептид последовательности каждой цепи выделяют с секреторной сигнальной последовательностью. Сигнальной последовательностью может быть природная последовательность антитела или произведенная из известной секреторной последовательности растений последовательность (например, последовательность РВ АгаЬ1борз15 или табака). Присоединение сигнальной последовательности секреции растения к кодирующим последовательностям зрелой легкой и тяжелой цепи проводят стандартными способами молекулярной биологии. Для получения таких модификаций используют рутинно ПЦР-слияние. Сигнальные последовательности секреции включают для нацеливания полипептидов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина для секреции из клетки и дальнейшей сборки этих двух цепей в мультимерный иммуноглобулиновый комплекс. Для экспрессии в семенах трансгенных растений собирают экспрессионную кассету, содержащую: 1) регуляторную промоторную последовательность для обеспечения экспрессии в семенах растений, 2) сигнал секреции-последовательность легкой цепи и 3) регуляторную последовательность для терминации транскрипции. Собирают вторую экспрессионную кассету, содержащую: 1) регуляторную промоторную последовательность для обеспечения экспрессии в семенах растений, 2) сигнал секреции-последовательность тяжелой цепи и 3) регуляторную последовательность для терминации транскрипции. Каждую из экспрессионных кассет цепей антитела клонируют индивидуально в растительный трансформирующий вектор АдгоЬас!егшт или их объединяют в единый трансформирующий вектор с обеими экспрессионными кассетами. В обоих случаях эти экспрессионные кассеты клонируют в векторы трансформации растений, между левой и правой делинеаризующими граничными последовательностями и смежно с кассетой селектируемых маркеров растений. Каждый растительный трансформирующий вектор трансформируют в АдгоЬас!егшт. Полученные штаммы АдгоЬас!егшт используют для инфицирования тканей растений. Трансгенный материал растения регенерируют и отбирают жизнеспособные растения. При применении индивидуальных векторов трансформации растений трансгенные линии растений, которые получают, экспрессирующие последовательности либо легкой, либо тяжелой цепей, скрещивают для получения единой линии растения, экспрессирующей обе цепи в одной и той же растительной клетке. При применении единого трансформирующего вектора, содержащего экспрессионные кассеты как легкой, так и тяжелой цепей, исходное трансгенное растение продуцирует последовательности как легкой, так и тяжелой цепей в одной и той же растительной клетке.
2. Получение трансгенных масляных телец, которые представляют белок А для улавливания иммуноглобулинов.
Для улавливания и представления белка иммуноглобулина на масляных тельцах масляные тельца конструируют для предоставления иммуноглобулинсвязывающего белка. В этом примере используют хорошо известные антитело-связывающие домены белка А. На основе известной последовательности белка А из 8!арйу1ососсиз аигеиз конструируют ПЦР-праймеры для выделения пяти последовательных 1д-связывающих доменов последовательности бактериального белка А. Праймеры конструируют таким образом, чтобы клонировать последовательность белка А в виде №концевого или С-концевого слияния с
- 45 009181 последовательностью олеозина для нацеливания на масляные тельца. Последовательность, которая кодирует в рамке считывания трансляционное слияние между белком А и олеозином, клонируют в экспрессионную кассету растений для семеноспецифической экспрессии. Эта конечная кассета состоит из регуляторной промоторной последовательности, которая обеспечивает экспрессию в семенах, слитой последовательности белок А-олеозин и регуляторной последовательности для терминации транскрипции. Экспрессионную кассету белок А-олеозин клонируют в растительный трансформирующий вектор, совместимый с опосредуемой АдгоЬас1егшт трансформацией растений. Этот трансформирующий вектор содержит левую и правую граничные последовательности, фланкирующие экспрессионную кассету белок А-олеозин, и смежную кассету селектируемых маркеров растений.
Штамм АдгоЬас1егшт, содержащий этот вектор, используют для инфицирования тканей растений и последующей регенерации и отбора из трансгенного растительного материала для создания трансгенных растений.
3. Улавливание и представление мультимерных иммуноглобулинов на масляных тельцах, представляющих белок А.
После получения мультимерных иммуноглобулиновых комплексов легкой и тяжелых цепей в одной трансгенной линии растений и представления белка А на масляных тельцах посредством нацеливания на масляное тельце слитого белка белок А-олеозин во второй линии клеток растений могут быть использованы по меньшей мере два варианта для улавливания иммуноглобулинового комплекса на представляющих белок А масляных тельцах. В первом варианте трансгенные семена обеих экспрессирующих иммуноглобулин или экспрессирующих слияние белок А-олеозин линий объединяют в оптимальном соотношении и затем измельчают вместе таким образом, чтобы разрушенный материал обеих линий семян мог комбинироваться в одном и том же экстракте. Объединенные экстракты семян смешивают и/или инкубируют в условиях, которые делают возможным максимальное извлечение иммуноглобулина белком А. Фракцию масляных телец отделяют с использованием стандартных способов разделения фаз (например, центрифугрованием).
Извлеченная фракция масляных телец содержит как природные масляные тельца из экспрессирующей иммуноглобулин линии, так и трансгенные содержащие белок А масляные тельца из экспрессирующей белок А-олеозин линии.
Во втором варианте линии растений, экспрессирующие иммуноглобулиновый комплекс и слияние белок А-олеозин, скрещивают и индивидуальные линии растений, экспрессирующие оба компонента, идентифицируют и размножают. В этом подходе иммуноглобулиновый комплекс и слияние белок Аолеозин продуцируются в различных клеточных компартментах одной и той же клетки семени растения. Семена из этой двойной трансгенной линии измельчают для разрушения клеточного материала и смешивают содержимое всех клеточных компартментов, объединяя иммуноглобулин во внеклеточном компартменте и слияние белок А-олеозин на масляном тельце в цитозольном компартменте. Этот материал смешивают и/или инкубируют в условиях, позволяющих максимально извлекать иммуноглобулин посредством белка А, и фракцию масляных телец отделяют способами разделения фаз. Извлеченная фракция масляных телец содержит представленный белок А и уловленный иммуноглобулиновый комплекс.
Пример 6. Получение собранных мультимерных иммуноглобулиновых комплексов в виде слияний с нацеливающими на масляные тельца доменами.
Индивидуальные полипептиды получают в виде слитого белка с нацеливающими на масляные тельца последовательностями (например, олеозином) для представления на масляных тельцах.
Было обнаружено, что индивидуальные субъединицы природно ассоциирующихся гетеродимерных белков могут быть одновременно продуцируемыми в виде индивидуальных слияний с олеозином и все еще связываться в виде активного гетеродимера на поверхности масляного тельца. В этом примере гетеродимером являются субъединицы легкой и тяжелой цепей или произведенные из них части иммуноглобулинового комплекса.
Получение иммуноглобулинового РаЬ-комплекса на масляных тельцах.
Последовательность зрелой легкой цепи, не содержащую сигнальной последовательности секреции, присоединяют в виде находящегося в рамке считывания Ν-концевого слияния к последовательности олеозина. Эту слитую последовательность собирают в семеноспецифическую экспрессионную кассету, состоящую из семеноспецифической промоторной последовательности, слитой последовательности легкая цепь-олеозин и последовательности терминации транскрипции. Эту экспрессионную кассету встраивают между левым и правым граничными маркерами, смежно с кассетой селектируемых маркеров растения, трансформирующего вектора. Этот трансформирующий вектор в АдгоЬас1егшт используют для инфицирования растений и получения трансгенных растений.
Эквивалентную конструкцию для субъединицы тяжелой цепи, содержащую вариабельный и константный домены тяжелой цепи, также присоединяют в виде слияния в рамке считывания с олеозином и собирают в экспрессионную кассету для семеноспецифической экспрессии. Эта экспрессионная кассета может быть частью отдельного трансформирующего вектора для генерирования отдельной трансгенной линии, или экспрессионная кассета тяжелой цепи может быть объединена с кассетой легкой цепи в единый трансформирующий вектор. Если экспрессионные кассеты легкой и тяжелой цепей трансформируют
- 46 009181 в растения на отдельных трансформирующих векторах, индивидуальные линии растений скрещивают для создания единой линии, экспрессирующей оба гетеродимерных слияний субъединица-олеозин в одной и той же клетке растения. Семена из линии с двумя трансгенами или линии с одним трансгеном, генерируемой из экспрессирующего вектора с двойной экспрессией, экстрагируют для выделения масляных телец. Семенной материал измельчают для высвобождения клеточного содержимого, и масляные тельца выделяют разделением фаз. Нацеливание как последовательности легкой цепи, так и последовательности тяжелой цепи на масляные тельца, в виде слияния с олеозином, позволяет связывать иммуноглобулиновый комплекс на поверхности масляного тельца.
Подобные конфигурации, использующие всю последовательность тяжелой цепи в комбинации со всей последовательностью легкой цепи, или использующие вариабельные домены из последовательностей как легкой, так и тяжелой цепей, конструируют для сборки различных типов гетеромультимерных иммуноглобулиновых комплексов (например, гетеродимеров) на поверхности масляных телец.
Таким образом, данное изобретение не должно рассматриваться как ограничиваемое конкретными описанными здесь вариантами, и должно быть понятно, что данное изобретение имеет широкую применимость вообще к экспрессии белков. Поскольку модификации будут очевидными специалистам в данной области, предполагается, что данное изобретение ограничивается только объемом прилагаемой формулы изобретения.
Краткое описание последовательностей
8ΕΟ ΙΌ N0: 1-4 показывают праймеры, которые были синтезированы для выделения генов тиоредоксина 11 (Тгх1) и тиоредоксинредуктазы АтаЬйорк1к, как описано в примере 1.
8Ε0 ΙΌ N0: 5-7 показывают праймеры, которые были сконструированы для кодирования специфического линкерного пептида между белками тиоредоксинредуктазы и тиоредоксина, как описано в примере 2.
8Ε0 ΙΌ N0: 8, 10 и 11 показывают нуклеотидную последовательность и расшифрованную аминокислотную последовательность последовательности НАДФН-тиоредоксинредуктазы, выделенной здесь, как описано в примере 1.
8Ε0 ΙΌ N0: 9 и 11 соответственно, показывают нуклеотидную последовательность известной последовательности НАДФН-тиоредоксинредуктазы (АТТШКЕОВ) и расшифрованную аминокислотную последовательность.
8Е0 ΙΌ N0: 12 показывает расшифрованную аминокислотную последовательность известной последовательности НАДФН-тиоредоксинредуктазы.
8Е0 Ш N0: 13 показывает расшифрованную аминокислотную последовательность последовательности НАДФН-тиоредоксинредуктазы, выделенной в данном сообщении.
8Е0 ΙΌ N0: 14 и 15 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-Ттхй АтаЬйорк1к-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованную аминокислотную последовательность. Указаны кодирующая последовательность Тгх11 и ее расшифрованная аминокислотная последовательность. Промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554, а терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 1905-3124. Промотор снабжен сайтом РкП (нуклеотиды 1-6), а терминатор снабжен сайтом НшбШ (нуклеотиды 1898-1903) и сайтом Крп! (нуклеотиды 3124-3129) для облегчения клонирования.
8Е0 Ш N0: 16, 17 и 18 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-олеозин-Ттхй-терминатор фазеолина, описанную в примере 2, и расшифрованные аминокислотные последовательности. Кодирующая последовательность и расшифрованные аминокислотные последовательности олеозин-Ттхй показаны в 8Е0 ΙΌ N0: 16. Как и в 8Е0 ΙΌ N0: 14, промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Последовательность, кодирующая олеозин, соответствует нуклеотидам 1555-2313, интрон в этой последовательности (нуклеотиды 1908-2147) показан курсивом. Кодирующая последовательность Тгх1 соответствует нуклеотидам 2314-2658. Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 2664-3884.
8Е0 Ш N0: 19, 20 и 21 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-Ттхй-олеозин-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованные аминокислотные последовательности. Кодирующая Тгх1-олеозин последовательность и его расшифрованные аминокислотные последовательности показаны в 8Е0 ΙΌ N0: 19. Как и в 8Е0 ΙΌ N0: 14 и 16, промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Кодирующая последовательность Тгх1 соответствует нуклеотидам 1555-1896. Последовательность, кодирующая олеозин, соответствует нуклеотидам 1897-2658, интрон в этой последовательности (нуклеотиды 2250-2489) показан курсивом. Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 2664-3884.
8Е0 ΙΌ N0: 22 и 23 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-тиоредоксинредуктаза-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованную аминокислотную последовательность. Кодирующая тиоредоксинредуктазу последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ΙΌ N0: 22. Промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Кодирующая тиоредоксинредуктазу последовательность соответствует нуклеотидам 1555-2556, а расшифрованная аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ΙΌ N0:
- 47 009181
23. Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 2563-3782.
8ЕО ГО N0: 24, 25 и 26 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-олеозин-тиоредоксинредуктаза-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованные аминокислотные последовательности. Показаны кодирующая олеозин-тиоредоксинредуктазу последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность. Промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Последовательность, кодирующая олеозин, соответствует нуклеотидам 1555-2313, интрон в этой последовательности (нуклеотиды 1980-2147) указан курсивом. Кодирующая тиоредоксинредуктазу последовательность соответствует нуклеотидам 2314-3315. Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 3321-4540.
8Е0 ГО N0: 27, 28 и 29 показывают нуклеотидную последовательность последовательности промотор фазеолина-тиоредоксинредуктаза-олеозин-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованные аминокислотные последовательности. Указаны кодирующая тиоредоксинредуктазу последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность. Промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Кодирующая тиоредоксинредуктазу последовательность соответствует нуклеотидам 1555-2553. Последовательность, кодирующая олеозин, соответствует нуклеотидам 2554-3315, интрон в этой последовательности (нуклеотиды 2751-3146) указан курсивом. Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 3321-4540.
8Е0 ГО N0: 30, 31 и 32 показывают последовательность последовательности промотор фазеолинаолеозин-тиоредоксинредуктаза/тиоредоксин М1ер-терминатор фазеолина, описанной в примере 2, и расшифрованные аминокислотные последовательности. Указаны кодирующая тиоредоксинредуктазу/тиоредоксин М1ер последовательность и ее расшифрованная аминокислотная последовательность. Промотор фазеолина соответствует нуклеотидам 6-1554. Последовательность, кодирующая олеозин, соответствует нуклеотидам 1555-2313, интрон в этой последовательности (нуклеотиды) указан курсивом. Кодирующая тиоредоксинредуктаза/тиоредоксин М1ер последовательность соответствует нуклеотидам 2314-3690.
Терминатор фазеолина соответствует нуклеотидной последовательности 3698-4917.
8Е0 ГО N0: 33, 34 и 35 показывают нуклеотидную последовательность участка промотор фазеолина-олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин-терминаторный участок р8В82542 и расшифрованные аминокислотные последовательности. Расшифрованная аминокислотная последовательность олеозин-тиоредоксинредуктаза-линкер-тиоредоксин также показана в 8Е0 ГО N0: 33. Аминокислоты, представляющие олеозин, показаны в положениях 1-173, аминокислоты, представляющие тиоредоксинредуктазу, показаны в положениях 174-501, аминокислоты, представляющие линкерный или спейсерный пептид, показаны в положениях 501-524, а аминокислоты, представляющие тиоредоксин, показаны в положениях 525-636.
8Е0 ГО N0: 38 и 39 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксина И (ТгхИ 1) АгаЬ1йорк1к ШаНапа и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 40 и 41 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксинредуктазы АгаЫйорк1к ШаНапа (№ТК1) и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 42 и 43 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксина Е. сой (ТгхА) и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 44 и 45 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксинредуктазы Е. сой и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 46 и 47 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксина человека и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 48 и 49 показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксинредуктазы человека и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 50 и 51 соответственно, показывают нуклеотидную последовательность тиоредоксинатиоредоксинредуктазы МусоЬас1егшт 1ергае и кодируемый белок соответственно.
8Е0 ГО N0: 52-313 описаны в табл. 5.
- 48 009181
Таблица 5
5Е<2 Ю N0: ИДЕНТИФИКАТОР 3ΝΙ33 ΡΚΟΤΕΙΝ (в скобках)
Примеры редокс-белков
ТИОРЕДОКСИНЫ РАСТЕНИЙ
£-тип тиоредоксина
52 (О9ХЕН8) Тиоредоксин Е-типа 1, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е1) . - АгаЫборзтз бЬаПапа (резушка Таля)
53 (О9ХЕН9) Тиоредоксин Е-типа 2, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е2) {Ген: АТ5С16400 или М0К4.13} - АгаЫборзтз бЬаПапа (резушка Таля)
54 (048897) Тиоредоксин Е-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е). {ГЕН: ТКХЕ}-Вгаззтса париз (рапс)
55 (081331) Тиоредоксин Е-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е)-МезетЬгуапбЬешит сгузбаШпит (ледяник)
56 (Р29450) Тиоредоксин Е-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е)- Рбзит забрит (горох огородный)
57 (Р09856) Тиоредоксин Е-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-Е)- Зртпаста оГегасеа (шпинат)
т-тип тиоредоксина
58 (Р06544) Тиоредоксин 1 (ТКХ-1) (Тиоредоксин М). {ГЕН: ТКХА} - АпаЬаепа зр. (штамм РСС 7119)
59 (048737) Тиоредоксин М-типа 1, хлоропластный предшественник (ТКХ-М1). {ГЕН: АТ1С03680 или Е21В7_7 или Е21В7.28} - АгаЫЬорзтз бЬаПапа (резушка Таля)
60 (<293Εϋ8) Тиоредоксин М-типа 2, хлоропластный предшественник (ТКХ-М2). {Ген: АТ4СО3520 или Е9Н3.15 или Т5Д23.1} - АгаЫЬорзтз бЬаПапа (резушка Таля)
61 (О93ЕН7) Тиоредоксин М-типа 3, хлоропластный предшественник (ТКХ-МЗ). {Ген: АТ2С15570 или Е9О13.12} - АгаЫборз1з бЬаПапа (резушка Таля)
62 (093Εϋ6) Тиоредоксин М-типа 4, хлоропластный предшественник (ТКХ-М4) . - АгаЫборзгз бЬаПапа (резушка Таля)
63 (09X030) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М). - Вгаззгса париз (рапс)
64 (Р23400) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М) (Тиоредоксин СН2). {Ген: ТКХМ} - С1атуЬотопаз гехпЬагЬбИ
65 (041864) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М). {Ген: ТКМ1} - геа тауз (кукуруза)
66 (09ΖΡ20) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М).- Огуга забава (рис)
67 (Р48384) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М).- Ртзигп заЫчит (горох огородный)
68 (Р07591) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М).- Зртпаста о1егасеа (шпинат)
69 (09ΖΡ21) Тиоредоксин М-типа, хлоропластный предшественник (ТКХ-М) .- Тгтбгсиш аезб^ит (пшеница)
70 (Р12243) Тиоредоксин (ТКХ-1) (Тиоредоксин М). {ГЕН: ТКХА или ТКХМ} - ЗупесЬососсиз зр. (штамм РСС 7942) (Апасузбтз пхЬиТапз К2)
71 (Р37395) Тиоредоксин. {ГЕН: ТКХА или ТКХ} СуапгсНит са1Ьаг1иш (хлоропласт)
72 (022022) Тиоредоксин. {ГЕН: ТКХА или ТКХМ} СуаптсНозсЬугоп шего1ае (хлоропласт)
73 (Р50338) Тиоредоксин. {ГЕН: ТКХА} - Сг1£б1бНз1а растТгса (хлоропласт)
74 (Р50254) Тиоредоксин. {ГЕН: ТКХА} - РогрЬуга уегоепзтз (хлоропласт)
75 (Р51225) Тиоредоксин. {ГЕН: ТКХА} - РогрЬуга ригригеа (хлоропласт)
Ιί-тип тиоредоксина
76 (Р29448) Тиоредоксин Н-типа 1 (ТКХ-Н-1). {ГЕН: ТКХ1 или АТЗС51ОЗО или Е24М12.70} - АгаЫборзтз бЬаПапа (резушка Таля)
77 (Р20857) Тиоредоксин 2 (ТКХ-2). {ГЕН: ТКХВ} АпаЬаепа зр. (штамм РСС 7120)
78 (042388) Тиоредоксин Н-типа 1 (ТКХ-Н-1) (белок оболочки пыльцы). {ГЕН: ТНЬ-1 или ВОРС17} - Вгаззтса париз (рапс), Вгаззбса о1егасеа (цветная капуста)
79 (Р29449) Тиоредоксин Н-типа 1 (ТКХ-Н1) . - МсоИапа баЬасиш (табак виргинский)
- 49 009181
80 (038879) Тиоредоксин Н-типа 2 (ТВХ-Н-2). {ГЕН: ТВХ2 или АТ5С39950 или ΜΥΗ19.14} - АгаЫборзтз ННаИапа (резушка Таля)
81 (039362) Тиоредоксин Н-типа 2 (ТВХ-Н-2). {ГЕН: ТНЕ2} - Втаззтса париз (рапс)
82 (007090) Тиоредоксин Н-типа 2 (ТВХ-Н-2). -ЫсоЫапа РаЬасит (табак виргинский)
83 (042403) Тиоредоксин Н-типа 3 (ТВХ-Н-3). {ГЕН: ТВХЗ или ΑΤ5Θ42 980 или МВО2.18} - АгаЫборзтз РЬаПапа (резушка Таля)
84 (039239) Тиоредоксин Н-типа 4 (ТВХ-Н-4). {ГЕН: ТВХ4} - АгаЫборзтз СНаИапа (резушка Таля)
85 (039241) Тиоредоксин Н-типа 5 (ТВХ-Н-5). {ГЕН: ТВХ5} - АгаЫборз1з ННаИапа (резушка Таля)
86 (064432) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н). {ГЕН: РЕС-2} Вгаззтса гара (турнепс)
87 (Р80028) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н) (Тиоредоксин СН1) . {ГЕН: ТВХН) - СЫатуботопаз гетпЬагбШ
88 (096419) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н). - Еадоругит езси1епбит (гречиха посевная)
89 (042443) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н) (белок-1 сока флоэмы 13 кДа) . - Огуга забд^а (рис)
90 (065049) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н). {ГЕН: 5В09} Ртсеа шаг1апа (черная ель)
91 (043636) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н). - Вчстпиз соттиптз (клещевина обыкновенная)
92 (064394) Тиоредоксин Н-типа (ТВХ-Н) (ТгхТа). - ТггЫсит аезИуит (пшеница)
93 (Р29429) Тиоредоксин. - ЕтеггсеПа п1би1апз (АзрегдШиз птбиТапз)
ТИОРЕДОКСИНЫ ВИРУСОВ, БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ
94 (р80579) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА} - АИсус1оЬасИ1из асШосаШаггиз (ВасШиз ас1боса1баг1из)
95 (028137) Тиоредоксин. {ГЕН: АЕ2145} - АгсЬаеодТоЬиз £и1д1диз
96 (Р14949) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТВХ} - ВасШиз зиЫШз
97 (Р00276 Тиоредоксин. {ГЕН: ΝΒϋΟ} - бактериофаг Т4
98 (051088) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ВВ0061} - ВоггеПа ЬигдбогГегг (спирохета болезни Лайма)
99 (Р57653) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или Ви597} ВисИпега арЫД1со1а (подвид АсугбИозтрИоп ртзит) (симбиотическая бактерия АсугРНозтрНоп ртзит)
100 (051890) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА} -ВисИпега арЫсНсо1а (подвид ЗсЫгарЫз дгаттпит)
101 (Р10472) Тиоредоксин (ТВХ) . {ГЕН: ТВХА} - СЫогоЫит 11т1со1а £.зр. СЫози1£аборЫ1ит
102 (09РДКЗ) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТС0826} СЫатусИа тиггбагит
103 (09Ζ7Ρ5) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ΟΡΝ0659
или СР0088} - СЫатусИа рпеитопФае (СЫатуборЫ1а рпеитоптае)
104 (Р52227) Тиоредоксин (ТВХ) . {ГЕН: ТВХА} - СЫатусИа рэИПаст (СЫатуборЫ1а рзтРРаст)
105 (084544) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или СТ539} - СЫатусИа РгасИотаР1з
106 (Р00275) Тиоредоксин С-1. - СогупеЬасЬегФит перЪгФсШ
107 (Р07887) Тиоредоксин С-2. - СогупеЬасРеггит перЬгасИ!
108 (Р52228) Тиоредоксин С-3. - СогупеЬасРегтит перЫФсНФ
109 (Р09857) Тиоредоксин (ТВХ) . {ГЕН: ТВХА} - СЬготаЫит ИТПОЗит
110 (Р21609) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА} - С1озРг1сИит Ибога1е (ВасРегТит Иб)
111 (Р81108) Тиоредоксин (ТВХ) (фрагмент). {ГЕН: ТВХА} - С1озРгйсИиш зрогодепез
112 (Р81109) Тиоредоксин (ТВХ) (фрагмент). {ГЕН: ТВХА} - СТозбгФсНит зЫск1апсН1
113 (09БИ02) Тиоредоксин (аллерген Сор с 2) . - СорЫпиз сотабиз (лохматая грива)
114 (Р29445) Тиоредоксин 1. {ГЕН: ТВХА или ТВХ1} - БгсРуозРеЫит сИзсоШеит (мокрая гниль)
115 (Р29446) Тиоредоксин 2 (фрагмент). {ГЕН: ТВХВ или ТВХ2} - ОгсРуозЪеЫит сНзсоЫеит (мокрая гниль)
116 (Р29447) Тиоредоксин 3. {ГЕН: ТВХС или ТВХЗ} - ОФсРуозРеЫит сНзсоЫеит (мокрая гниль)
117 (Р00274) Тиоредоксин 1 (ТВХ1) (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТБЫС или ΕΙΡΑ или В3781} - ЕзсНегтсЫа со11, За1топе11а РурЫтиггит
118 (Р52232) Тиоредоксин-подобный белок 5БВ0233. {ГЕН: Ξ1Β0233} - ВупесНосузЫз зр. (штамм РСС 6803)
119 (Р33636) Тиоредоксин 2 (ТВХ2). {ГЕН: ТВХС или В2582 или Ζ3867 или ЕС53448} - ЕзсЬеггсЫа со11, ЕзсЬегФсЫа соИ 0157:Н7
120 (Р21610) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА} - ЕиЬасбегФит ас1бат1порЫ1ит
121 (Р43785) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТВХМ или ΗΙ0084} - НаеторЫ1из тпЫиепгае
122 (Р43787) Тиоредоксин-подобный белок ΗΙ1115. {ГЕН: ΗΙ1115} - НаеторЫ1из 1п£1иепгае
123 (Р56430) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или НР0824 или 3ΉΡ07 63} - НеЫсоЬасбег ру1огФ (Сатру1оЬасбег ру1ог1) , НеИсоЬасбег ру1огт Д99 (Сатру1оЬасбег ру1огг Д99)
124 (093386) Тиоредоксин (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТВХА} - ЫзРегха топосуродепез
125 (057755) Тиоредоксин. {ГЕН: ТВХ или МД0307} - Мерйапососсиз ^аηηа5сЫ^
126 (Р47370) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТВХ или
- 50 009181
МС12 4} - Мусор1азта депИаИиш
127 (Р46843) Бифункциональный комплекс тиоредоксинредуктаза/тиоредоксин [включает тиоредоксин]. {ГЕН: ТВХВ/А или ТВХ или М12703} МусоЬасбеггит 1ергае
128 (Р75512) Тиоредоксин (ТВХ). {ГЕН: ТВХА или ТВХ или ΜΡΝ263 или МР570} - Мусор1азта рпеитопФае
129 (030974) Тиоредоксин (ТЕХ). {ГЕН: ТВХА} - МусоЬасбегйит зтедтаИз
130 (Р52229) Тиоредоксин (ТВХ) (МРТ46). {ГЕН: ТВХА или ТЕХ или ТВХС или ВУ3914 или МТ4033 или ΜΤν028.05} МусоЬасбегТит РиЬегси1оз1з
131 (Р42115) Тиоредоксин. {ГЕН: ТЕХ} - Ыеигозрога сгазза
132 (Р34723) Тиоредоксин. {ГЕН: ТВХЕ} - РепФсИПит сНгузодепит
133 (09Х2Т1) Тиоредоксин (ТЕХ) {ГЕН: ТВХА или ТВХ или РА5240} - Рзеиботопаз аегидгпоза
134 (Р10473)- Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА) - ВЪойозрхгШит гиЬгит
135 (Р08058) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА} - ВЬобоЬасбег зркаегогбез (ВЪоборзеиботопаз зрЬаегогбез)
136 (Ο9ΖΕΕ0) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА или ВР002}ВгскеИзга ргоиагекИ
137 (Р33791) Тиоредоксин (ТВХ) (фрагмент) {ГЕН: ТВХА} НГгерботусез аигеоТасгепз
138 (Р52230) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА или 5СН24.11С} - БЕгерРотусез соеПсо1ог
139 (005739) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА} БРгеркотусез с1ачи11дегиз
140 (Р52231) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА или 5ЬВ0623} Бупесйосуз'Ыз зр. (штамм РСС 6803)
141 ((Р73263) Тиоредоксин-подобный белок 5ЬВ1139. {ГЕН: 5ДВ1139} - ЗупесЪосузИз зр. (штамм РСС 6803)
142 (Р52233) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА} - ТЫоЬасШиз ЕеггоохФсЗапз
143 (Р96132) Тиоредоксин (ТВХ) (фрагмент) {ГЕН: ТВХА}ТЫосарза гозеорегзгсФпа
144 (Р81110) Тиоредоксин (ТВХ) (фрагмент). {ГЕН: ТВХА} ТгззФегеИа сгеаНпорНИа
145 (083889) Тиоредоксин (ТВХ) {ГЕН: ТВХА или ТРО919} Тгеропеша раШскип
ТИОРЕДОКСИН ЖИВОТНЫХ
146 (097680) Тиоредоксин. {ГЕН: ΤΧΝ} - Воз Раигиз (бык)
147 (095108) Тиоредоксин, митохондриальный предшественник (МТ-ТВХ). {ΓΕΗ:ΤΧΝ2} - Воз Раигиз (бык)
148 (009433) Тиоредоксин. {ГЕН: В0228.5} СаепогйаЬбШз е1едапз
149 (Р99505) Тиоредоксин (фрагмент). {ГЕН: ΤΧΝ} - Сап1з ЕатШаггз (собака)
150 (Р08629) Тиоредоксин. {ГЕН: ΤΧΝ} - Са11из да11из (курица)
151 (Р47938) Тиоредоксин (белок ΟΕΑϋ-блока). {ГЕН: ОНО или СС4193} - ОгозорПИа те1аподазбег (плодовая мушка, обыкновенная)
152 (Р10599) Тиоредоксин (полученный из АТЕ фактор) (ΑΌΕ) (поверхностно-связанный сульфгидрильный белок) (БА5Р). {ГЕН: ΤΧΝ или ΤΒϋΧ или ТВХ)} - Ното заргепз (человек)
153 (099757) Тиоредоксин, митохондриальный предшественник (МТ-ТВХ). {ГЕН: ΤΧΝ2} - Ното заргепз (человек)
154 (Р29451) Тиоредоксин. {ГЕН: ΤΧΝ} - Масаса тиГабба (макак резус)
155 (Р10639) Тиоредоксин (полученный из АТЪ фактор) (ΑΌΓ). {ГЕН: ΤΧΝ} - Миз тизси1из (мышь)
156 (Р97493) Тиоредоксин, митохондриальный предшественник (МТ-ТВХ). {ГЕН: ΤΧΝ2} - Миз шизси1из (мышь)
157 (Р82460) Тиоредоксин (фрагмент). {ГЕН: ΤΧΝ} - Биз зсго£а (свинья)
158 (Р08628) Тиоредоксин. {ГЕН: ΤΧΝ} - Огусбо1адиз сипгсиФиз (кролик)
159 (Р11232) Тиоредоксин. {ГЕН: ΤΧΝ} - Ваббиз погчедтсиз (крыса)
160 (Р97615) Тиоредоксин, митохондриальный предшественник (МТ-ТВХ). {ГЕН: ΤΧΝ2 или ТВХ2} Ваббиз погчедгсиз (крыса)
161 (Р50413) Тиоредоксин. {ГЕН:: ΤΧΝ} - ОчФз аггез (овца)
ТИОРЕДОКСИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ РАСТЕНИЙ
162 (023166) Белок тиол-дисульфидного взаимообмена (тиоредоксин-подобный белок) {ГЕН: С7А10.160 или АТ4С37200 или НСЕ164) - АгаЫборзТз бйаПапа (резушка Таля)
163 (09Ο9Υ6) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: Г17014.18} - АгаЫборзгз РйаНапа (резушка Таля)
164 (<29ΕΥϋ5) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: Е21Е1_180} - АгаЫборзхз РЪаИапа (резушка Таля)
165 (038878) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: ТВХ6 или Т7О17.3} - АгаЫборзгз РйаПапа (резушка Таля)
166 (0916712) Тиоредоксин-подобный белок - АгаЫборзгз РНаИапа (резушка Таля)
167 (095СЫ9) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: Т4Б2.150} - АгаЫборзгз ЕЬаПапа (резушка Таля)
168 (09БВБ7) Тиоредоксин-подобный белок, 49720-48645 {ГЕН:Е28016.13} - АгаЫборзгз ЕЬаНапа (резушка Таля)
169 (О95Б84) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:Т16Ь4.180 или ΑΤ4Θ2 9670} - АгаЫборзгз РНаПапа (резушка Таля)
- 51 009181
170 (095ПС6) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:ТЕХ} - Ногбеит Ъ>и1Ьозит
171 (09БИС4) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:ТЕХ} БоИит регеппе (райграсе пастбищный)
172 (О9АБ75) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:Р0028Е10.17} - Огуга забФча (рис)
173 (004002) Белок СБ5Р32 (хлоропластный индуцируемый засухой «стрессовый» белок 32 кДа) - 5о1апит ЪиЬегозит (картофель)
174 (093ИС5) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:ТЕХ} Зеса1е сегеаТе (рожь)
175 (093Р36) Тиоредоксин-подобный белок (фрагмент) {ГЕН:ТЕХ} -Зеса1е сегеа1е (рожь)
176 (09и515) Тиоредоксин-подобный белок - Мапбиса зехба (табак ЬаиктоЪЬ) (табак Ногпиогт)
ТИОРЕДОКСИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ВИРУСОВ, БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ
177 (Р43221) Белок В1рА тиол-дисульфидного обмена (белок С1рА биогенеза цитохрома с). {ГЕН: ТБРА} - ВгайугЫгоЫит ^аροη^сит
178 (Р43787) Тиоредоксин-подобный белок ΗΙ1115. {ГЕН: ΗΙ1115} - НаеторНПиз 1п£1иепгае
179 (<29СиР7) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: ТЕХЪР} ЪеФзНтапФа тадог
180 (<29υνΗ0) Тиоредоксин-подобный белок - МогбФегеПа а1рФпа
181 (Р95355) Тиоредоксин-подобный белок - ЫеФззегга допоггЬоеае
182 (О98С37) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:МЪЪ3505} ЕЫгоЫит Ιοϋί (МезогЫгоЫит ΙοΕί)
183 (Р36893) Предшественник белка тиол-дисульфидного взаимообмена Не1Х (белок Ье1Х биогенеза цитохрома с). {ГЕН: НЕЪХ} - ЕНобоЬасбег сарзи1айиз (ЕНоборзеиботопаз сарзи1аба)
184 (Р52232) Тиоредоксин-подобный белок ЗБЕ0233. {ГЕН: ЗБЕ0233} - Зупесйосизбгз зр. (штамм РСС 6803)
185 (Р73263) Тиоредоксин-подобный белок 5ЪЕ1139. {ГЕН: ЗБЕ1139} - БупесНосизбФз зр. (штамм РСС 6803)
186 (09БЗЕ1) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН: ЗРВС577.08С} - ЗсЫгозассйагошусез ротЬе (делящиеся дрожжи)
187 (09Е788) Тиоредоксин {ГЕН: ТРТЕХ} - Тгеропета раШдит
ТИОРЕДОКСИН-ПОДОБНЫЕ БЕЛКИ ЖИВОТНЫХ
188 (ζ)9ϋΑν4) Белок Е46Е10.9 (Тиоредоксин-подобный белок ΌΡΥ-11) {ГЕН: Е46Е10.9 или ϋΡΥ-11} - СаепогЬаЬбФМз е1едапз
189 (Ο9Ν2Κ6) Тиоредоксин-подобный белок (белок Υ54Ε10Α.3) (Тиоредоксин-подобный белок ТХЪ) {ГЕН: ТХЪ или Υ54Ε10Α.3} - СаепогИаЬбАЛхз еГедапз
190 (О9УЕРЗ) Тиоредоксин-подобный белок ТХЪ (белок СС5495) {ГЕН: ТХЪ или СС5495} - БгозорНИа те1аподазбег (плодовая мушка, обыкновенная)
191 (043396) Тиоредоксин-подобный белок (родственный тиоредоксину белок 32 кДа). {ГЕН: ΤΧΝΕ или ТЕР32 или ТХЪ} - Ното зарФепз (человек)
192 (076003) Тиоредоксин-подобный белок - Ното зарФепз (человек)
193 (093753) Тиоредоксин-подобный белок {ГЕН:ТЕХ} РНаФагФз соеги1езсепз
194 (077404) ТРИПАРЕДОКСИН - Тгурапозота Ьгисет Ьгисег
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ РАСТЕНИЙ
195 (039243) Тиоредоксинредуктаза 1 (ЕС 1.6.4.5) (НАДФНзависимая тиоредоксинредуктаза 1) (ΝΤΕ 1). {ГЕН: ΝΤΕ1 или АТ4С354 60 или Е15Л.30} -АгаЫборзгз ЪНаПапа (резушка Таля)
196 (039242) Тиоредоксинредуктаза 2 (ЕС 1.6.4.5) (НАДФНзависимая тиоредоксинредуктаза 2) (ΝΤΕ 2). {ГЕН: ΝΤΕ2 или АТ2С17420 или Е5Д6.18} -АгаЫборзФз •ЬЬаПапа (резушка Таля)
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ ВИРУСОВ, БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ
197 (066790) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХН). {ГЕН: ТЕХВ или АО 500)} - Αςιιίίθχ аеоИсиз
198 (Р80880) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ) (основной стрессовый белок 35) (СЗР35). {ГЕН: ТЕХВ} - ВасШиз зиЫШз
199 (Р94284) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ВВ0515} - ВоггеИа ЬигдбогГегФ (спирохета болезни Лайма)
200 (Р57399) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ВБ314} - ВисНпега арПФбФсоЪа (подвид АсугЪНозФрЬоп рфзит (симбиотическая бактерия АсугбНозЪрПоп рФзит)
201 (Р81433) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ} - ВисНпега арЪ1с11со1а (подвид ЗсЫгарНЪз дгатЪпит)
202 (О9РКТ7) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ТС0375} - СЫатубФа тигФбагит
203 (09Ζ8Μ4) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или СРЫ0314 или СР0444} - СЫатубФа рпеитопгае (СНФатуборПИа рпеитопФае)
204 (084101) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или СТ099} - СЫатубФа ЪгасНота-Ыз
205 (Р52213) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ} - С1озЪг1сНит ПбогаЪе (бактерия И6)
206 (Р39916) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ} - СохФеПа ЬигпебФФ
207 (Р09625) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или В0888 или Ζ1232 или ЕС30973} ЕзсЪеггсЫа со1Ф, ЕзсЪегФсЪФа со1Ф 0157 :Н7
- 52 009181
208 (Р50971) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХН). {ГЕН: ТЕХВ) - ЕибасРеггит асгбаттпорЬИит
209 (Р43788) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХН). {ГЕН: ТЕХВ или ΗΙ1158) - НаеторЫ1из 1п£1иепгае
210 (Ο9ΖΣ18) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ДНР07 64} - Не11соЬас£ег ру1огг 0'99 (Сашру1оЬас£ег ру1ог1 Д99)
211 (Р56431) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХВ). {ГЕН: ТЕХВ или НР0825} - НеИсоЬасЪег ру1ог1 (СатруТоЬасРег ру1ог!)
212 (032823) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХН). {ГЕН: ТЕХВ или ЬМО2478} - Ызбегта топосубодепез
213 (Р47348) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или МС102} - Мусор1азта депИаИит
214 (Р46843) Бифункциональный белок тиоредоксинредуктаза/тиоредоксин [включает: тиоредоксинредуктазу (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХВ); тиоредоксин]. {ГЕН: ТВХВ/А или ТЕХ или МЬ2703} МусоЬасбегтит 1ергае
215 (Р75531) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХН). {ГЕН: ТЕХВ или ΜΡΝ240 или МР591) - Мусор1азта рпеитопгае
216 (030973) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ} - Мусобасбеггит зтедтаРхз
217 (Р52214) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ) (ТЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ЕУ3913 или МТ4032 или ΜΤν028.04) - Мусобасбегтиш Рибегси1оз1з
218 (Р51978) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: СУЗ-9) - Ыеигозрога сгазза
219 (Р43496) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ТЕХВ) - РепхсИИшп сбгузодепит
220 (09ΖΟ97) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ЕР445) - ВтскебРзба ргоиагекИ
221 (¢92375) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: БРВСЗЕ6.ОЗ) - ЗсМгозассЬаготусез ротбе (делящиеся дрожжи)
222 (005741) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ) - Ббгербошусез с1ачиИдегиз
223 (Р52215) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или 5СН24.12) - Ббгерботусез сое11со1ог
224 (083790) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ). {ГЕН: ТЕХВ или ТР0814) - Тгеропета раШбит
225 (Р80892) Тиоредоксинредуктаза 1 (ЕС 1.6.4.5) (ТЕХЕ) (фрагмент) {ГЕН: ТЕХВ) - УФЬгФо £1зсбег1
226 (Р29509) Тиоредоксинредуктаза 1 (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ΤΕΕΙ или УБВ353И или 09476.5} - Бассбагошусез сегеч1з1ае (пекарные дрожжи)
227 (Р38816) Тиоредоксинредуктаза 2, митохондриальный предшественник (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ТЕЕ2 или ΥΗΕ106Ν) - ЗассЬаготусез сегеутзтае (пекарные дрожжи)
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ ЖИВОТНЫХ
228 (062768) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ΤΧΝΒϋΙ) - Воз Раигиз (бык)
229 (¢17745) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: СО6С3.7) - СаепогбабсНРгз е1едапз
230 (¢17881) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ΤΧΝΒϋΙ} - Ното заргепз (человек)
231 (¢25861) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) (ТгхВ). {ГЕН: ТВ или СВ) - Р1азтос11ит £а1с1рагит (изолят ГСН-5)
Другие тиоредоксинредуктазы
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ РАСТЕНИЙ
232 (022229) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:АТ2641680} - АгаЫс1орз1з РбаИапа (резушка Таля)
233 (¢39951) НАДФН-тиоредоксинредуктаза (фрагмент) - НеИапббиз аппииз (подсолнечник однолетний)
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ ВИРУСОВ, БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ
234 (028718) Тиоредоксинредуктаза (ТЕХВ) {ГЕН:АЕ1554} - Агсбаеод1обиз £и1д1биз
235 (е9К703) Тиоредоксинредуктаза (НАДФН) (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ТЕХВ или ВН3571) - ВасШиз На1ос1игап8
236 (09К7ГЗ) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН: ВН3408) - ВасШиз На1обитапз
237 (Ο9ΚΟΖ0) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН: ВН1429) - ВасШиз На1обигапз
238 (09ΚΟΖ1) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН: ВН1428) ВасШиз ЬаФобигапз
239 (09ΡΙΥ1) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5). {ГЕН: ТВХВ или СД0146) - Сатру1обасбег }е;}ип1
240 (е9А4СЗ) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:СС2871} - Саи1оЬас£ег сгезсепбиз
241 (О97ЕМ8) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:САС3082} - С1о8бг1сНит асебобибуИсит
242 (¢971(12) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:САС154 8} - С1оз-Ьг1сНит асебоЬибуПсит
243 (09ЕУ9б) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН: ТЕХВ) - С1озРг1сНит з£1ск1апсШ
244 (09ВБУ7) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:БВ1982} - Оетпососсиз гасНобигапз
245 (030739) Тиоредоксинредуктаза (фрагмент) Епбегососсиз ГаесаПз (Збгербососсиз ГаесаИз)
246 (054535) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТЕХВ или ТВХВ1_2 или УЫО6452О или ТВХВ1_1или УЫС6074С) На1оЬас£ег1ит зр. (штамм ΝΒ0-1) [плазмида рЫВСЮО и плазмида рЫВС200]
247 (Р82854) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН:ТВХВ2} - На1оЬас£ег1ит зр. (штамм ΝΚ0-1)
248 (09ΗΝ08) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТВХВЗ или УЫО2301С) - На1оЬасЪег1иш зр. (штамм ΝΚ0-1)
249 (025779) Тиоредоксинредуктаза (ТЕХВ). {ГЕН: НР1164} - НеИсоЬасбег ру1ог1 (СатруГоЬасбег ру1ог1)
- 53 009181
250 (086255) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН.-ТВХВ} - К1еЬз1е11а охубоса
251 (О9АЕУ9) Тиоредоксинредуктаза (фрагмент) {ГЕН:ТКХВ}
- Ъасбососсиз 1асб1з (подвид 1асб1з) (Ббгербососсиз
1асб1з)
252 (09СЕ34) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН:ТКХВ2} - Ъасбососсиз 1асб13 (подвид 1асб1з) (Ббгербососсиз 1асб1з)
253 (О9СН02) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН:ТКХВ1} - Ьасбососсиз 1асб13 (подвид 1асб1з) (Ббгербососсиз 1асб1з)
254 (Ο9ΖΕΟ8) Тиоредоксинредуктаза (фрагмент) {ГЕН:ТКХВ} - Ьасбососсиз 1асб1з
255 (032822) Гипотетический белок 39,7 кДа (фрагмент) - ЫзбегТа топосубодепез
256 (026804) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:МТН708} - МебНапобНегтоЬасбег ббегтаибобгорЫсиз
257 (Р94 397) Гомолог тиоредоксинредуктазы Мусор1азгпа депа-РаЫит {ГЕН: УССТ} - ВасШиз зиЬШ15
258 (098РК9) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ΜΥΡυ 7130} - Мусор1азта ри1топ1з
259 (090Ш23) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТКХВ или ΝΜΑ1538} - Иегззегта теп1пд1б1Р1з (серогруппа А)
260 (Ο9ΤΖ28) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ΝΜΒ1324} - Ыетззегта шепгпдгМсНз (серогруппа В)
261 (09ΙΟΜ2) Тиоредоксинредуктаза 1 {ГЕН:ТКХВ1 или РА2616} - РзеиРотопаз аегидтпоза
262 (091592) Тиоредоксинредуктаза 2 {ГЕН:ТКХВ2 или РА0849} - РзеиРотопаз аегидбпоза
263 (09У008) Тиоредоксинредуктаза (ТКХВ) {ГЕН: ТКХВ или РАВ0500} - Ругососсиз аЬуззг
264 (09ΖΒ33) Тиоредоксинредуктаза (ТКХВ2) {ГЕН:КР514} - К1скеббз1а ргоиагекИ
265 (054079) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТКХВ} - 8барИу1ососсиз аигеиз
266 (09ΚΙ32) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТКХВ или ТКХВ2} - Збгерботусез соеИсо1ог
267 (О9К4Ь6) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:8С5Е8.08С} - Збгерботусез сое11со1ог
268 (097ΡΥ2) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:5Р1458} - Ббгербососсиз рпеитопФае
269 (О9А0В5) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:3ΡΥ0850} - Ббгербососсиз руодепез
270 (097У69) Тиоредоксинредуктаза (бгхВ-2) (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТКХВ-2} - 5и1£о1оЬиз зо1£абаг1сиз
271 (097^27) Тиоредоксинредуктаза (бгхВ-3) (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТКХВ-3} - 5и1£о1оЬиз зо1£абаг1сиз
272 (097ЫЭ5) Тиоредоксинредуктаза (бгхВ-1) (ЕС 1.6.4.5) {ГЕН: ТКХВ-1} - 5и1£о1оЬиз зо1£абаг1сиз
273 ((098159) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:МЬЬ2552} - КЫгоЫиш 1об£ (МезогЫгоЫит 1ο6ί)
274 (О98М06) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:МЬЬ0792} - КНггоЫит 1ο6ί (МезогЫгоЫит 1ο6ί)
275 (09иК80) Тиоредоксинредуктаза 35 кДа ГОМОЛОГ (ФРАГМЕНТ) {ГЕН:ТКК1 и ΥϋΚ353Ν} - БассИаготусез сегеч1з1ае (пекарные дрожжи)
276 (09ΖΕΗ4) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТКХА или 5А0992} - 5барйу1ососсиз аигеиз, 5Рарку1ососсиз аигеиз подвид аигеиз N315
277 (0931Н1) Тиоредоксинредуктаза (фрагмент) {ГЕН:ТКХВ} - 5барб1у1ососсиз ху1озиз
278 (09НЛ4) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТА0984} - ТНегтор1азта асгборИНит
279 (09ΜΖΧ3) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТМ0869} - ТЪегтобода тагхбхта
280 (О979К8) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТУС1183005} - Тйегтор1азта чо1сап1ит
281 (О9РК71) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТКХВ или υϋ074} игеар1азта рагчит (игеар1азта игеа1уб1сит Ыобуре 1)
282 (09К334) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:УС1182} - УтЬгто сЬоТегае
283 (09Р001) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ХЕ1448} - Ху1е11а £азб101оза
284 (09Х5Е7) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТКХВ1} - Бутотопаз шоЬШз
ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ ЖИВОТНЫХ
285 (09СКИ9) Тиоредоксинредуктаза 3 (фрагмент) {ГЕН:ТКХКЗ} - Воз баигиз (бык)
286 (Ο9Ν2Ι8) Тиоредоксинредуктаза (ЕС 1.6.4.5) - Воз баигиз (бык)
287 (09Ν2Κ1) Гомолог тиоредоксинредуктазы - СаепогЬаЬР1б1з е1едапз
288 (ζ)9Ν8Ή3) Тиоредоксинредуктаза ~ СаепогНаЬсИбгз е1едапз
289 (09νΝΤ5) БЕЛОК СС11401 (Тиоредоксинредуктаза 2) {ГЕН:ТКХК-2 или СС11401} - БгозорИНа те1аподазбег (плодовая мушка, обыкновенная)
290 (095840) Тиоредоксинредуктаза - Ното зар1епз (человек)
291 (09БЕ58) Тиоредоксинредуктаза СК1М-12 - Ното зартепз (человек)
292 (<29ϋΗ7 9) Тиоредоксинредуктаза {ГЕН: ТВ} - Ното заргепз (человек)
293 (09и<2и8) Тиоредоксинредуктаза - Ното заргепз (человек)
294 (Ο9ΝΝΝ6) Тиоредоксинредуктаза ТК2 (фрагмент) - Ното зараепз (человек)
295 (ζ)9Ν№47) Тиоредоксинредуктаза ТКЗ - Ното зардепз (человек)
- 54 009181
296 (О9Р101) Тиоредоксинредуктаза 3 (фрагмент) {ГЕН: ТК.ХК.З } - Ното заргепз (человек)
297 (Ο9Ρ2Υ0) Тиоредоксинредуктаза II бета (ЕС 1.6.4.5) - Ното зартепз (человек)
298 (Ο9Η2Ζ5) Митохондриальная тиоредоксинредуктаза {ГЕН.-ТКХК2А} - Ното заргепз (человек)
299 (099475) Полученный из КМ-102 редуктаза-подобный фактор (Тиоредоксинредуктаза) - Ното заргепз (человек)
300 (О99Р49) Тиоредоксинредуктаза 1 {ΓΕΗ:ΤΧΝΚΌ1} - Миз тизси1из (мышь)
301 (09С5У5) Тиоредоксинредуктаза 1 (фрагмент) {ΓΕΗ:ΤΧΝΚΌ1} - Миз тизсиТиз (мышь)
302 (Ο9ΟΖΕ5) Тиоредоксинредуктаза 1 {ΓΕΗ;ΤΧΝΚϋ1} - Миз тизсиГиз (мышь)
303 (ζ)9όΓΗΑ7) Тиоредоксинредуктаза ТКЗ {ΓΕΗ:ΤΧΝΚϋ2 или ТКЗ} - Миз тизси1из (мышь)
304 (О9СГЬТ4) Тиоредоксинредуктаза {ΓΕΗ:ΤΧΝΚϋ2 или ТКХК2} - Миз тизсиГиз (мышь)
305 (О9ДМН5) Тиоредоксинредуктаза 2 {ΓΕΗ:ΤΧΝΚϋ2 или ΤΧΝΗΟ2} - Миз тизси1из (мышь)
306 (О9ДМН6) Тиоредоксинредуктаза 2 {ГЕН:ΤΧΝΚΏ1 или ΤΧΝΚΏ1} - Миз тизси1из (мышь)
307 (089049) Тиоредоксинредуктаза - Каббиз погуедтсиз (крыса)
308 (Ο9ΠΚΖ3) Тиоредоксинредуктаза 1 (фрагмент) - Паббиз погуедгсиз (крыса)
309 (ζ)9ΠΚΖ4) Тиоредоксинредуктаза 1 - Каббиз погуедйсиз (крыса)
310 (О9СГЪЕ6) Тиоредоксинредуктаза (фрагмент) - Каббиз погуедгсиз (крыса)
311 (Ο9Κ1Ι3) НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза {ГЕН:ТЕК1} - Каббиз погуедтсиз (крыса)
312 (Ο9Ζ0Π5) Предшественник тиоредоксинредуктазы {ГЕН:ТКХН2} - Паббиз погуед1сиз (крыса)
313 (Ο9ΜΥΥ8) Редокс-фермент тиоредоксинредуктаза -Низ зсгоба (свинья)
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (3)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения масляного тельца, связанного с биологически активным рекомбинантным мультимерным белковым комплексом, включающий:
    (a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса; и (b) связывание указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса с масляным тельцем через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    2. Способ по п.1, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    3. Способ по п.2, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    4. Способ обеспечения экспрессии в клетке биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, содержащего первый и второй рекомбинантные полипептиды, включающий:
    (a) введение в клетку первой химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
    (I) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию первого рекомбинантного полипептида в указанной клетке, функционально связанную со (II) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид;
    (b) введение в указанную клетку второй химерной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей:
    (I) третью последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию второго рекомбинантного полипептида в указанной клетке, функционально связанную с (II) четвертой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид; и (c) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных первого и второго рекомбинантных полипептидов в клетке-потомке, содержащей масляные тельца, где указанный первый рекомбинантный полипептид и указанный второй рекомбинантный полипептид способны образовывать биологически активный рекомбинантный мультимерный белковый комплекс;
    причем указанный первый рекомбинантный полипептид связывается с масляным тельцем через нацеливающий на масляное тельце белок, способный связываться с указанным масляным тельцем и указанным первым рекомбинантным полипептидом, и
    - 55 009181 причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    5. Способ по п.4, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    6. Способ по п.5, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    7. Способ получения в растении биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающий:
    (a) получение первого растения, клетки которого содержат масляные тельца и первый рекомбинантный полипептид, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанными масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок;
    (b) получение второго растения, клетки которого содержат масляные тельца и второй рекомбинантный полипептид; и (c) половое скрещивание указанного первого растения с указанным вторым растением с получением растения-потомка, клетки которого содержат масляные тельца, где указанные масляные тельца способны связываться с указанным первым рекомбинантным полипептидом, а указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного рекомбинантного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    8. Способ по п.7, в котором указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    9. Способ по п.8, в котором указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    10. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая биологически активный мультимерный слитый белок, содержащая:
    (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нацеливающий на масляные тельца белок, функционально связанную в рамке считывания со (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей первый рекомбинантный полипептид, связанной в рамке считывания с (c) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный слитый белок, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного слитого белка, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    11. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты по п.10, где указанный биологически активный мультимерный слитый белок представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    12. Химерная последовательность нуклеиновой кислоты по п.11, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    13. Биологически активный рекомбинантный мультимерный слитый белок, содержащий:
    (ί) нацеливающий на масляные тельца белок или его фрагмент, (ίί) первый рекомбинантный полипептид и (ΐϊϊ) второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный слитый белок, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного слитого белка, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    14. Рекомбинантный мультимерный слитый белок по п.13, где указанный биологически активный рекомбинантный мультимерный слитый белок представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    15. Рекомбинантный мультимерный слитый белок по п.14, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    16. Выделенные масляные тельца, содержащие биологически активный мультимерный белковый
    - 56 009181 комплекс, содержащий:
    (ί) нацеливающий на масляные тельца белок и (ίί) первый рекомбинантный полипептид, причем указанные масляные тельца дополнительно содержат второй рекомбинантный полипептид, где указанные первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный белковый комплекс, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    17. Выделенные масляные тельца по п.16, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    18. Выделенные масляные тельца по п.17, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    19. Выделенные масляные тельца, содержащие:
    (a) первый слитый белок, содержащий первый нацеливающий на масляные тельца белок, слитый с первым рекомбинантным полипептидом; и (b) второй слитый белок, содержащий второй нацеливающий на масляные тельца белок, слитый со вторым рекомбинантным полипептидом, причем указанный первый и второй рекомбинантные полипептиды способны образовывать биологически активный мультимерный белковый комплекс и причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго рекомбинантных полипептидов с образованием биологически активного мультимерного белкового комплекса, включающего первый и второй рекомбинантные полипептиды.
    20. Выделенные масляные тельца по п.19, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    21. Выделенные масляные тельца по п.20, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    22. Растительная клетка, содержащая масляные тельца по п.16.
    23. Клетка по п.22, где указанный мультимерный белковый комплекс представляет собой гетеромультимерный белковый комплекс.
    24. Клетка по п.23, где указанный гетеромультимерный белковый комплекс представляет собой ферментативно активный редокс-комплекс или иммуноглобулиновый комплекс.
    25. Композиция, содержащая выделенные масляные тельца по п.16, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу.
    26. Композиция, содержащая выделенные масляные тельца по п.19, тиоредоксин и тиоредоксинредуктазу.
    27. Пищевой продукт, содержащий композицию по п.25 или 26.
    28. Продукт для личной гигиены, содержащий композицию по п.25 или 26.
    29. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по п.25 или 26.
    30. Способ уменьшения аллергенности пищевых продуктов, включающий стадии получения выделенных масляных телец по п.16 или 19 и добавления выделенных масляных телец в пищевые продукты, посредством чего аллергенность пищевых продуктов уменьшается.
    31. Способ восстановления мишени, включающий стадии получения биологически активного рекомбинантного мультимерного слитого белка по п.13 и контактирования биологически активного рекомбинантного мультимерного слитого белка с мишенью, где мишень является чувствительной к окислительному стрессу.
    32. Способ получения ферментативно активного редокс-комплекса, связанного с масляными тельцами, включающий:
    a) получение в клетке слитого редокс-белка, содержащего первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком;
    b) связывание указанного слитого редокс-белка с масляными тельцами через нацеливающий на масляные тельца белок, способный связываться с указанным слитым редокс-белком и указанными масляными тельцами; и
    c) выделение указанных масляных телец, связанных с указанным слитым редокс-белком.
    33. Химерная нуклеиновая кислота, содержащая:
    1) первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную регулировать транскрипцию второй нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, функционально связанную со
  2. 2) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный слитый полипептид, содержащей:
    (ί) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую достаточную часть белка масляного тельца для обеспечения нацеливания указанного рекомбинантного слитого полипептида к масляному
    - 57 009181 тельцу, связанную с (ίί) последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый редокс-полипептид, содержащий первый редокс-белок, связанный со вторым редокс-белком, функционально связанной с
  3. 3) третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, способной терминировать транскрипцию указанной второй нуклеиновой кислоты в указанной клетке, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго редокс-белков с образованием биологически активного рекомбинантного слитого редокс-полипептида, включающего первый и второй редокс-белки.
    34. Способ получения биологически активного редокс-комплекса, связанного с масляными тельцами, включающий:
    a) введение в клетку химерной последовательности нуклеиновой кислоты по п.33;
    b) выращивание указанной клетки в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного слитого редокс-белка в клетке-потомке, содержащей масляные тельца; и
    c) выделение из указанной клетки-потомка указанных масляных телец, содержащих указанный слитый редокс-белок, причем обеспечивают непрерывное или периодическое взаимодействие или непрерывную или периодическую координацию первого и второго редокс-белков с образованием биологически активного редокс-комплекса, включающего первый и второй редокс-белки.
    35. Трансгенное растение, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.
    36. Растение СайНатик 11пс1ог1ик, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.
    37. Семя растения, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.
    38. Семя СайНатик йпс!огшк, содержащее химерную нуклеиновую кислоту по п.33.
    39. Ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, полученный способом по п.32.
    40. Пищевой продукт, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.
    41. Композиция, содержащая ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.
    42. Продукт для личной гигиены, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.
    43. Продукт, способный восстанавливать мишень, чувствительную к окислительному стрессу, содержащий ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.
    44. Детергентная композиция, содержащая ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, по п.39.
    45. Эмульсионная форма, содержащая указанный ферментативно активный редокс-комплекс, связанный с масляными тельцами, полученный способом по п.32.
    46. Семя растения по п.35.
    47. Экстракт семян по п.46, содержащий биологически активный рекомбинантный слитый редоксполипептид.
    48. Масляное тельце из семени по п.46.
    49. Масло, полученное из семени по п.46.
EA200300708A 2000-12-19 2001-12-19 Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции EA009181B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74290000A 2000-12-19 2000-12-19
US30288501P 2001-07-05 2001-07-05
US603801A 2001-12-04 2001-12-04
PCT/US2001/050240 WO2002050289A1 (en) 2000-12-19 2001-12-19 Methods for the production of multimeric proteins, and related compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300708A1 EA200300708A1 (ru) 2003-12-25
EA009181B1 true EA009181B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=27358025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300708A EA009181B1 (ru) 2000-12-19 2001-12-19 Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20090197337A1 (ru)
EP (1) EP1346056A1 (ru)
JP (1) JP4570327B2 (ru)
KR (1) KR20030066732A (ru)
CN (1) CN100385005C (ru)
AR (1) AR037083A1 (ru)
AU (2) AU3281902A (ru)
BR (1) BR0116220A (ru)
CA (1) CA2432315A1 (ru)
EA (1) EA009181B1 (ru)
IL (1) IL156334A0 (ru)
MX (1) MXPA03005548A (ru)
NZ (1) NZ526822A (ru)
TW (1) TWI317736B (ru)
WO (1) WO2002050289A1 (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7009087B1 (en) 2000-12-01 2006-03-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for altering the disulfide status of proteins
JP2005505250A (ja) * 2001-05-04 2005-02-24 ゼンコー 核酸およびチオレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質
US20060179514A1 (en) * 2001-07-05 2006-08-10 Sembiosys Genetics, Inc. Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
BRPI0411479A (pt) * 2003-06-17 2006-07-25 Sembiosys Genetics Inc métodos para a produção de insulina em plantas
TW200526778A (en) * 2003-11-14 2005-08-16 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants
WO2005087249A1 (ja) * 2004-03-11 2005-09-22 Kurume University プロテアーゼ阻害剤及び疾患の予防又は治療剤
JP2006151861A (ja) * 2004-11-29 2006-06-15 Redox Bioscience Inc 喫煙によって引き起こされる臓器障害の予防乃至治療剤
GB0524884D0 (en) * 2005-12-06 2006-01-11 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO2009009142A2 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
NZ588441A (en) * 2008-04-11 2012-10-26 Sembiosys Genetics Inc Method for controlled release of an active agent from oleosomes
ES2384777B1 (es) * 2008-06-27 2013-06-19 Universidad Pública de Navarra Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.
ES2354537B1 (es) * 2008-06-27 2012-01-23 Universidad Pública de Navarra Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.
TWI377954B (en) * 2009-11-25 2012-12-01 Univ China Medical Oil body carriers, uses in target therapy and/or detection of the same, and fusion proteins comprised therein
US9745362B2 (en) 2009-12-09 2017-08-29 Shengjun An Seed-specific expression vector and its construction methods and applications
CN103343137B (zh) * 2013-07-10 2015-05-20 吉林农业大学 一种含有表皮生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液
CN103343138B (zh) * 2013-07-10 2016-07-13 吉林农业大学 一种含有酸性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液
CN103333915B (zh) * 2013-07-10 2015-08-05 吉林农业大学 一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液
KR101831888B1 (ko) * 2016-04-15 2018-04-16 (주)케어젠 항염증 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
CN106905435B (zh) * 2017-03-13 2020-04-10 武汉海沙百得生物技术有限公司 一种制备基于蛋白a突变体的结合蛋白的方法
WO2019014755A1 (en) * 2017-07-19 2019-01-24 Alcantara Research Group Inc. CHLOROPLASTS OF ALGAE ENRICHED IN RECOMBINANT POLYPEPTIDE, PROCESSES FOR PRODUCTION THEREOF AND USES THEREOF
JP6923166B2 (ja) * 2019-07-16 2021-08-18 住友ゴム工業株式会社 融合タンパク質、物質製造方法、ベクター、形質転換細胞、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法
JP7608472B2 (ja) * 2020-04-03 2025-01-06 ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト シスチンを生体触媒還元するための酵素的触媒酸化還元系のコア構成成分としての生体触媒
EP4060045A1 (en) * 2021-03-16 2022-09-21 Core Biogenesis A genetically engineered plant or part thereof adapted for the production of recombinant proteins and process thereof
CA3222715A1 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 Noriyuki HATSUGAI Fusion protein, fusion protein production method, electrode, redox device, redox method, method for cutting disulfide bonds, and method for inactivating allergen
AU2022202825B1 (en) * 2022-04-28 2023-09-07 AUSTRALIAN HEALTH INDUSTRY Co. PTY LTD Polypeptide, polypeptide composition and application, and prepared anti-wrinkle lotion thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053698A1 (en) * 1997-05-27 1998-12-03 Sembiosys Genetics Inc. Uses of oil bodies
US5948682A (en) * 1991-02-22 1999-09-07 Sembiosys Genetics Inc. Preparation of heterologous proteins on oil bodies

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5151350A (en) * 1982-10-27 1992-09-29 Repligen Corporation Cloned genes encoding recombinant protein a
US4771036A (en) * 1986-02-10 1988-09-13 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method and ophthalmic composition for the prevention and reversal of cataracts
US4954618A (en) * 1986-02-14 1990-09-04 Genex Corporation Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
EP0461863A1 (en) * 1990-06-12 1991-12-18 Immuno Japan Inc. Oligonucleotide primers, and their application for high-fidelity detection of non-A, non-B hepatitis virus
US6288304B1 (en) * 1991-02-22 2001-09-11 Sembiosys Genetics Inc. Expression of somatotropin in plant seeds
US6750046B2 (en) * 1991-02-22 2004-06-15 Sembiosys Genetics, Inc. Preparation of thioredoxin and thioredoxin reductase proteins on oil bodies
US7091401B2 (en) * 1991-02-22 2006-08-15 Sembiosys Genetics Inc. Expression of epidermal growth factor in plant seeds
US5650554A (en) * 1991-02-22 1997-07-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
US5792506A (en) * 1991-10-12 1998-08-11 The Regents Of The University Of California Neutralization of food allergens by thioredoxin
AU678154B2 (en) * 1992-04-02 1997-05-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
SE9201331D0 (sv) * 1992-04-28 1992-04-28 Hightech Receptor C O Active Protein l och hybridproteiner daerav
US6046037A (en) * 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
JPH0912471A (ja) * 1995-06-29 1997-01-14 Noevir Co Ltd 皮膚外用剤
US5856452A (en) * 1996-12-16 1999-01-05 Sembiosys Genetics Inc. Oil bodies and associated proteins as affinity matrices
US7585645B2 (en) * 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
US6761914B2 (en) * 1997-05-27 2004-07-13 Sembiosys Genetics Inc. Immunogenic formulations comprising oil bodies
US6183762B1 (en) * 1997-05-27 2001-02-06 Sembiosys Genetics Inc. Oil body based personal care products
US6372234B1 (en) * 1997-05-27 2002-04-16 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
US6599513B2 (en) * 1997-05-27 2003-07-29 Sembiosys Genetics Inc. Products for topical applications comprising oil bodies
JP2000103743A (ja) * 1998-09-29 2000-04-11 Jiyunji Yodoi チオレドキシン活性を有するファミリーに属するポリペプチド類を含有する食品、化粧品及び医薬
US20060179514A1 (en) * 2001-07-05 2006-08-10 Sembiosys Genetics, Inc. Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
TW200526778A (en) * 2003-11-14 2005-08-16 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5948682A (en) * 1991-02-22 1999-09-07 Sembiosys Genetics Inc. Preparation of heterologous proteins on oil bodies
WO1998053698A1 (en) * 1997-05-27 1998-12-03 Sembiosys Genetics Inc. Uses of oil bodies

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002050289A9 (en) 2003-04-17
CN100385005C (zh) 2008-04-30
WO2002050289A8 (en) 2005-01-20
EP1346056A1 (en) 2003-09-24
MXPA03005548A (es) 2004-04-20
EA200300708A1 (ru) 2003-12-25
AU2002232819B2 (en) 2008-01-03
JP4570327B2 (ja) 2010-10-27
NZ526822A (en) 2005-03-24
IL156334A0 (en) 2004-01-04
WO2002050289A1 (en) 2002-06-27
US20090197337A1 (en) 2009-08-06
CA2432315A1 (en) 2002-06-27
BR0116220A (pt) 2003-09-23
TWI317736B (en) 2009-12-01
AR037083A1 (es) 2004-10-20
CN1486368A (zh) 2004-03-31
AU3281902A (en) 2002-07-01
KR20030066732A (ko) 2003-08-09
JP2004527227A (ja) 2004-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009181B1 (ru) Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции
DE69535181T2 (de) Öl-körper proteine als träger von hochwertigen peptiden in pflanzen
US7253341B2 (en) Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
JPS63500425A (ja) 分子ファ−ミング
EA014887B1 (ru) Способ экспрессии инсулина в семенах растения, способ получения семян растений, содержащих инсулин, и растения, способные производить семена, содержащие инсулин
WO1998005785A1 (fr) Phytases de plantes et applications biotechnologiques
EP0839204A2 (fr) Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines
CA2440358A1 (en) Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same and their uses
US7098383B2 (en) Methods for the production of multimeric immunoglobulins, and related compositions
DE69836075T2 (de) Verfahren zur spaltung von fusionproteinen
ES2336861T3 (es) Produccion de il-10 en biorreactor de planta de cultivo no alimenticia.
FR2774379A1 (fr) Procede de production, par des cellules vegetales, d&#39;alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l&#39;alpha-antitrypsine ainsi obtenue
US20080104725A1 (en) Methods For The Modulation of Oleosin Expression In Plants
TW201139672A (en) Immunization of fish with plant-expressed recombinant proteins
US20030167524A1 (en) Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
CA2309323A1 (fr) Gene codant pour la thanatine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies
US20060172298A1 (en) Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof
US20070006343A1 (en) Modified oleosins
ES2354537B1 (es) Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.
US20060179514A1 (en) Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
LaManna Plastid Transformation Biotechnology: Increasing Efficiency and Expanding Application
DE102016204700A1 (de) Rekombinante Herstellung von Subfatin
ES2384777B1 (es) Tiorredoxinas plastidiales: sobreexpresión y aplicaciones biotecnológicas.
WO1998041616A1 (en) Mammalian alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase production in plants
WO1998041616A9 (en) Mammalian alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase production in plants

Legal Events

Date Code Title Description
PC1A Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU