DK1991694T3 - Genekspressionsanalyse med grundstoftagget oligonukleotid - Google Patents

Claims (12)

1

1. Fremgangsmåde til cellulær analyse af en celle eller en cellulær partikel, hvor cellen er en hel celle af dyre-, plante-, bakterie- eller svampeoprindelse, eller den cellulære 5 partikel er udvalgt fra gruppen, der består af et isoleret kromosom, en isoleret cellekerne, et isoleret mitokondrie, et isoleret kloroplast og et isoleret virus, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) fiksering og permeabilisering af cellen eller den cellulære partikel; (b) inkubering af cellen eller den cellulære partikel i en hybridiseringsopløsning med 10 en nukleinsyreprobe, der er specifik for en målnukleinsyre, hvilken probe er mærket med et unikt grundstoftag, således at én type af proben, der er mærket med én type af tagget, kan skelnes fra enhver anden type af proben, der er mærket med en anden type af tagget, ved hjælp af grundstofanalyse, der omfatter ICP-MS; 15 (c) separering af uhybridiseret probe fra probe, der er hybridiseret til målnukleinsyren, ved hjælp af stringente vaskebetingelser; og (d) analyse af cellen eller den cellulære partikel ved hjælp af ICP-MS til identificering af proben og kvantificering af proben, der er bundet til målnukleinsyren, hvor hvert grundstoftag omfatter en kemisk del, der inkluderer et grundstofatom eller en 20 mængde grundstofatomer med en eller mange isotoper bundet til en bærende molekylstruktur, og hvor grundstoftagget yderligere omfatter et middel til binding af tagget til et substrat.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor to eller flere differentielle prober mærket med 25 differentielle grundstoftags hybridiseres til to eller flere målnukleinsyrer.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvor målnukleinsyren er udvalgt fra gruppen, der består af intracellulære nukleinsyremolekyler, matrix-RNA, mikro-RNA, gentranskriptprecursor-RNA, messenger-RNA, transport-RNA, ribosomalt RNA, 30 kromosomalt DNA, mitokondrie-DNA, kloroplast-DNA, virus-DNA, virus-RNA, bakterie- DNA, bakterie-RNA og plasmid-DNA.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, der yderligere omfatter samtidig analyse af overfladeproteinmolekyler og/eller intracellulære proteinmolekyler. 35

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor cellen eller den cellulære partikel efter trin (b) reageres med et affinitetsreagens, der er specifikt for et overflademolekyle og/eller et intracellulært molekyle, og affinitetsreagenset er mærket med et grundstoftag, således 2 at én type af affinitetsreagenset mærket med én type af tagget kan skelnes fra en anden type af tagget ved hjælp af ICP-MS, efterfulgt af separering af et ubundet affinitetsreagens fra et bundet affinitetsreagens.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor overflademolekylet og/eller det intracellulære molekyle er et lipid, et polysaccharid eller et lille molekyle.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor affinitetsreagenset er udvalgt fra gruppen, der består af et antistof, en aptamer, et lectin og et lille molekyle. 10

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 7, hvor proben er udvalgt fra gruppen, der består af en oligonukleotidprobe, et låst nukleinsyre (LNA)-molekyle, et peptidnukleinsyre (PNA)-molekyle, et plasmid-DNA, et amplificeret DNA eller et fragment deraf, et amplificeret RNA eller et fragment deraf, et fragment af RNA og et 15 fragment af genomisk DNA.

9. Fremgangsmåde til analyse af mRNA-molekyler i homogen opløsning, der omfatter: (a) inkubering af mRNA-molekylerne med oligonukleotider, hvor oligonukleotiderne er mærket med grundstoftags, der omfatter et overgangsgrundstof, og er mærket 20 med en unikt tagget mikrosfære, således at hver type af mikrosfæren, der er mærket med én type tag, kan skelnes fra en anden type af mikrosfæren, der er mærket med en anden type af tagget, ved hjælp af ICP-MS, under betingelser, der muliggør, at oligonukleotiderne hybridiserer med mål-mRNA-molekylerne; (b) separering af mikrosfærerne med bundne mål-mRNA-molekylerfra ubundne 25 mikrosfærer; og (c) måling af de bundne mikrosfærer ved hjælp af ICP-MS, hvor mikrosfærerne dispergeres i en væske, til kvantitativ måling af atom- og isotopsammensætningen af individuelle mikrosfærer til derved påvisning af typerne og antallene af mål-mRNA-molekyler, der er bundet til mikrosfærerne. 30

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvor mRNA-molekylerne er fra en vævs- eller celleprøve.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor prøven er udvalgt fra gruppen, der består af en 35 dyreprøve, en planteprøve, en bakterieprøve og en svampeprøve.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, hvor oligonukleotiderne omfatter et antal deoxythymidintriphosphatnukleosider og komplementære nukleinsyreprober, der er 3 bundet til unikt taggede mikrosfærer. DRAWINGS FIG. 1 A o ir> -»--—-- : KG-1a o : cvj - ^ 3 1| ο Ο · I l fin» Sr V Olo" I l I I |< I °-l"< 1 iimJ 10° 101 102 103 10* StrAv-PerCP B 28S oligo-biat +StrAv-PerCp 28S oligo-biot +StrAv-Tb O * 28Soligo o. : jAi 28S oligo :/ ill negative cnw ~:\J \. ., o4, -" ·ι;- 'I___ 10 10 SlrtvPMCP '* '° 0 10 20 30 43 SC sxrAvrttvr signal, relative κι ir FCM ICP-MS FIG 2 A KS62 1e6 cells/sample Control SO Sample S1 Fix.perm % random — — BCR/Abl fg transcript probe-biot « probe W | W ., " | M 2"“ StrAv-Éu lållifti™ w strAv W—___ pw XjgiriRNArlOJ/ ' 1 i y^y , i' —U— B __ __ ; BCR/Abl |P3 ^ ; 2ss mmmmmmmmrn' BCR/abl ΊΐΒ,ΙΙίΜΙ”^ · ' · j 6-a~· ilF!f-;*y=4 “ Tb - ~ ...... ^^ ^ - i ctri gggg< 28s ·. o 2 4 6 8 10 12 ....... .....-- - -......-....... Signal, relatfve to lr Signal, relative to Ir FIG 3

D-cyclin EGFR 28S B/A 12. normalized response 28S FIG. 4

0.02 0.04 0.06 0.08 normalized response B/A 28S B/A BCR/Abl BCR/Abl igG IgG FIG. 5 S;

FIG. 6

FIG. 7