DK171026B1 - Antibiotikum GE 2270 faktor A og et kompleks deraf, fremgangsmåde til disses fremstilling, disse til anvendelse som lægemiddel, anvendelse af disse til fremstilling af et medikament, farmaceutisk præparat indeholdende disse, samt mikroorganismen Planobispora rosea ATCC 53773 - Google Patents

Description

i DK 171026 B1

Den foreliggende opfindelse angår det hidtil ukendte antibiotikum GE 2270 faktor A og dets additionssalte samt et kompleks heaf indeholdende dette antibiotikum eller dets additionssalte som hovedkomponent. Disse forbindelser og komplekser vil i det 5 følgende af og til blive betegnet som "forbindelser ifølge opfindelsen".

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne ifølge opfindelsen, et farmaceutisk præparat indeholdende forbindelserne ifølge opfindelsen, forbin-10 delserne ifølge opfindelsen til anvendelse som lægemiddel og anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen til fremstilling af et medikament til anvendelse som antibiotikum.

Endelig angår opfindelsen den deponerede mikroorganisme Planobispora rosea ATCC 53773 og en biologisk renkultur heraf. 15 Forbindelserne ifølge opfindelsen kan bruges som lægemidler, navnlig til behandling af infektionssygdomme som er følsomme derfor.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er tillige virksomme som vækstfremmende midler for dyr såsom fjerkræ, svin og 20 drøvtyggere.

Den omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved at man dyrker Planobispora rosea ATCC 53773 eller en GE 2270-producerende mutant deraf under submerse aerobe betingelser i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen 25 og uorganiske salte og udvinder det dannede antibiotikum derfra.

Planobispora rosea ATCC 53773 blev isoleret fra en jordprøve og deponeret den 14. juni 1988 hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 3q MD 20852, Maryland, USA, i henhold til Budapest-traktatens regler.

Denne omhandlede stamme har fået tildelt accessions-nummeret ATCC 53773. Den biologiske rene mikroorganismekultur ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at det er en biologisk renkultur af Planobispora rosea ATCC 53733 eller 35 af en GE 2270-producerende mutant deraf, med undtagelse af Planobispora rosea ATCC 23866, og med evne til at producere DK 171026 B1 2 antibiotikum GE 2270 faktor A under aerobe gæringsbetingelser i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte.

I nærværende beskrivelse gælder det, når der tales om 5 forbindelserne ifølge opfindelsen i relation til deres fy-sisk-kemiske eller biologiske egenskaber, at betegnelsen "antibiotikum GE 2270" generelt anses for at referere til antibiotikum GE 2270-kompleks som det udvindes ved slutningen af gæringsprocessen (eksempel 2) såvel som til antibiotikum GE 2270 faktor A, som er antibiotikets hovedkomponent.

Produktionen af antibiotikum GE 2270 opnås ved at man dyrker Planobispora rosea ATCC 53773 eller en antibiotikum GE 2270-producerende mutant deraf under aerobe betingelsere 15 1 et vandigt næringsmiddel indeholdende assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte. Mange af de næringsmedier der bruges sædvanligt i gæringsindustrien kan bruges, men visse medier foretrækkes. Foretrukne kilder til kulstof er glukose, mannose, galaktose, stivelse, majsmel og 20 lignende kulstofkilder. Foretrukne kilder til nitrogen er ammoniak, nitrater, sojamel,pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, trypton, aminosyrer og lighende nitrogenkilder. Blandt de uorganiske salte som kan inkorporeres i dyrkningsmedierne er de sædvanlige opløselige salte med evne til at levere 25 natriumioner, kaliumioner, jernioner, zinkioner, koboltioner, magnesiumioner, kalciumioner, ammoniumioner, kloridioner, karbonationer, sulfationer, fosfationer, nitrationer og lignende ioner.

Sædvanligvis for-dyrkes den antibiotikumproducerende 30 stamme i en rystekolbe hvorefter kulturen bruges til at pode krukkefermentorer til produktion af væsentlige mængder af det antibiotiske stof. Det medium der bruges til for-kulturen kan være det samme som det der bruges til større gæringsportioner, men der kan også bruges andre medier. Den 35 antibiotikum GE 2270-producerende stamme kan dyrkes ved en temperatur mellem 20 og 40 *C og fortrinsvis mellem 24 og 35 *C.

DK 171026 B1 3

Under gæringen kan antibiotikumproduktionen overvåges ved afprøvning af prøver af gæringssuppen eller en myce-lieekstrakt med hensyn til antibiotisk aktivitet, fx ved biobestemmelser eller ved TLC- eller HPLC-procedurer.

5 Organismer der er følsomme for antibiotikum GE 2270 såsom Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus kan bruges som testorganismer. Biobestemmelsen udføres hensigtsmæssigt ved agar-diffusionsmetoden på agarplader. Den maksimale produktion af den antibiotiske aktivitet indtræder i alminde-10 lighed mellem gæringens anden og femte dag.

Antibiotikum GE 2270 produceres som nævnt ved at man dyrker stammen Planobispora rosea ATCC 53773 eller en antibiotikum GE 2270-producerende mutant deraf, og det fo-findes hovedsagelig i myceliet.

15 Morfoliske egenskaber af Planobispora rosea ATCC 53773

Planobispora rosea ATCC 53773 vokser godt på de fleste standardmedier. Det vegetative mycelium danner lange og uregelmæssigt forgrenede filamenttråde (0,5-1,0 pm), trænger gennem agaren og danner en kompakt vækst på agaroverfladen. 20 Myceliet forbliver ufragmenteret hvad enten det dyrkes i flydende eller i faste medier. Dets farve er fra lyst koralfarvet til lyserødt-koralfarvet på de fleste af de afprøvede medier. Luftmyceliet er dannet af lange, bølgede og tynde hyfer med få sidegrene, og det vokser i luften i det væsent-25 lige parallelt med agar-overfladen. Når der er luftmycelium til stede har det en hvid-lyserød farve. Sporangier dannes enkeltvis eller i grupper langs luftmyceliets hyfer og er omkring 6,0-8,0 pm lange og 1,0-1,2 pm brede. De er knyttet til hyferne ved hjælp af en kort sporangiofor (med en længde 30 på 1,0-2,0 pm). I hvert sporangium dannes der et i forlængelse af hinanden beliggende par fusiforme lige sporer (3,0- 3,5 x 1,0-1,2 pm). I sporangierne er sporerne adskilt af en tværgående skillevæg. Efter frigørelse fra sporangiehylste-ret bliver sporerne bevægelige ved hjælp af peritriche fla-35 geller.

DK 171026 B1 4

Kulturegenskaber af Planobispora rosea ATCC 53773

Til undersøgelse af kulturegenskaberne blev Planobispora rosea ATCC 53773 dyrket på forskellige standardmedi-er som foreslået af Shirling og Gottlieb (E.B. Shirling og 5 D. Gottlieb, 1966, Method for characterization of Streptomy-ces species, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340) med tilsætning af et antal medier som anbefalet af Waksman (S.A. Waksman 1961, The Actinomycetes, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, bind 2, 328-334).

10 Når farvebestemmelser var nødvendige blev de foreta get ved den af Maerz og Paul angivne metode (A. Maerz og M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2. udgave, McGraw-Hill Book Company Inc., New York).

Organismens evne til at udnytte forskellige kulstof- 15 kilder blev undersøgt ved den af Shirling og Gottlieb beskrevne metode.

Kulturegenskaberne og de fysiologiske egenskaber samt udnyttelse af kulstofkilderne er anført i tabellerne I, II og III.

2o Aflæsning af de i tabel I rapporterede værdier er gjort efter to ugers inkubering ved 28*C.

Tabel I

Kulturkarakterer af stammen Planobispora rosea ATCC 53773 25

Dyrkningsmedium Morfologiske egenskaber

Havremelsagar, 6%s Rigelig vækst med glat overflade, koral- farvet-lyserød (2-H-10), rigelig produk-30 tion af lyserødt luftmycelium (l-A-9) ISP 2 (gærekstrakt- Rigelig vækst med rynket overflade, maltagar blegt lyserød (2-E-9), spor af lyst luftmycelium ISP 3 (havre- Moderat vækst med glat overflade, blegt melsagar, 2%s) lyserød (2-E-8), spor af lyserødlig- hvidt luftmycelium 35 DK 171026 B1 5 ISP 4 (uorganiske Moderat vækst med glat overflade, salte-stivelses- koralfarvet-lyserod (2-E-10) agar) 5 ISP n 5 (glycerol- Moderat vækst med glat og flad over-asparagin-agar) flade, blegt lyserod (2-A-9), rigelig produktion af hvidt luftmycelium 10 ISP 6 (pepton- Moderat vækst, svagt rynket, gærekstrakt-jern- blegt koralfarvet-lyserod (l-A-10) agar)

Tabel I (fortsat) 15 Dyrkningsmedium Morfologiske egenskaber ISP 7 (tyrosin- Moderat vækst med glat og tynd overflaagar) de, blegt lyserød (l-A-9), rigelig dan nelse af blegt lyserødt (l-C-9) luft-20 mycelium

Hichey og Tres- Rigelig vækst med tyk og rynket overflaners agar de, blegt koralfarvet-lyserod (l-A-10), moderat produktion af blegt lyserødt 25 luftmycelium

Czapeks glukose- Meget sparsom vækst med glat og tynd agar overflade, moderat produktion af blegt lyserødt luftmycelium 30

Glukose-asparagin- Moderat vækst med glat og tynd overfla-agar de, farvelos, luftmycelium fraværende Næringsagar God vækst med glat overflade, lyst 35 orangefarvet med lyserodligt anstrøg (9-A-7) DK 171026 B1 6

Tabel I (fortsat)

Bennetts agar Moderat vækst med svagt rynket over flade, blegt ravfarvet-lyserød (10-A-6) 5 Kalciummalatagar Svag vækst med glat og flad overflade, farveløs

Skummetmælksagar Moderat vækst med glat overflade, koralfarvet-lyserød (2-F-9) 10 Ægalbuminagar Svag vækst med glat og tynd overflade, farveløs til blegt lyserød (2-A-8) Dyrkningsmedium Morfologiske egenskaber 15

Dextrose-tryptose- Ingen vækst agar

Kartoffelagar God vækst med glat overflade, lyst oran- 20 gefarvet med et lyserødligt anstrøg (9-A-7)

Bogstaver og tal refererer til den farve som er bestemt i henhold til Maerz og Paul (se foran) 25

Tabel II

Fysiologiske egenskaber af Planobispora rosea ATCC 53773

Test Resultat 30

Stivelseshydrolyse positiv

Dannelse af hydrogensulfid negativ

Tyrosin- reaktion positiv

Kaseinhydrolyse svagt positiv 3- Fordøjelse af kalciummalat negativ

Flydendegørelse af gelatine svagt positiv

Koagulering af mælk negativ DK 171026 B1 7

Tabel II (fortsat)

Peptonisering af mælk negativ

Nitratreduktion positiv 5 -—-

Tabel III

Udnyttelse af kulhydrater 10 Kulstofkilde Vækst

Arabinose +

Xylose +

Ribose 15 Fruktose +/-

Galaktose

Glukose +

Rhamnose

Laktose 20 Sakkarose

Maltose +

Raffinose

Cellulose

Mannitol 25 Salicin +

Inositol +

Cellobiose + moderat vækst +/- sparsom vækst ingen vækst

Til disse bestemmelser anvendtes testmedium nr. 8 og resultaterne blev bedømt efter 2 ugers inkubering ved 28- 35 30'C· DK 171026 B1 8

Temperaturfølsomhed

Den optimale væksttemperatur strækker sig fra 28*C til 37*C. Der ses ingen vækst ved 15 *C og 50*c, moderat vækst ved 20*C.

5 Kemotaxonomiske egenskaber Analyse af cellevæggen

Analyse af aminosyrer som er til stede i cellevæggen blev udført ved den metode der er beskrevet af Becker et al. 10 ("Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolyzates", Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964).

Analyse af hydrolyserede hele celler viste tilstedeværelse af meso-diaminopimelinsyre.

15 Der fandtes ikke noget glycin ved analyse af et rent cellevækstpræparat frembragt i henhold til den metode der er angivet af Kawamoto et al. (I. Kawamoto, O. Tetsuo og N. Ta-kashi, "Cell wall composition of Micromonospora olivoaste-rosporia, Micromonospora sagamiensis and related organism." 20 J. of Bacteriol. 146, 527-534, 1981).

Sukkermønsteret for hele celler

Analyse af sukkerindholdet i de hydrolyserede hele 25 celler blev udført på den måde der er angivet af M.P. Leche-valier ("Identification of aerobe actinomycetes of clinical importance", J.Lab.Clin.Med. 7^, 934-944, 1968) ved anvendelse af celluloseark til tyndlagskromatografering som beskrevet af J.L. Staneck og G.D. Roberts ("Simplified 30 approach to identification of aerobic actinomycetes by thin layer chromatography", Appl. Microbiol. 28, 226-231, 1974) med følgende opløsningsmiddelsystem: ætylacetat/pyridin/vand 100:35:25 (rumfang).

De opnåede resultater viste tilstedeværelse af madu-35 rose (3-0-metyl-D-galaktose) og fravær af arabinose og ga-laktose.

DK 171026 B1 9

Identitet af stammen Planobispora rosea ATCC 53773

Denne stamme blev henført til slægten Planobispora og blev klassificeret som Planobispora rosea på grundlag' af følgende morfologiske og kemiske egenskaber: a) Tilstedeværelse af meso-diaminopimelinsyre og fravær af glycin i cellevæggen (cellevæg-kemotype III) b) Tilstedeværelse af madurose i hydrolysatet af hele celler (helcelle-sukkermønster B) 10 c) Dannelse på luftmyceliet af lange og cylindriske sporangier som indeholder et par bevægelige sporer d) Det vegetative myceliums lyserøde farve.

15

De morfologiske egenskaber af Planobispora rosea ATCC 53773 som er anført foran er ikke væsentligt forskellige fra de egenskaber hos en stamme af Planobispora rosea som blev beskrevet af J.E. Thieman et al. i "The Actinomycetales", 20 The Jena Intern. Symp. on Taxon., septembr 1968, redigeret af H. Prauser, Jena. Stammen blev deponeret hos American Type Culture Collection hvor den modtog accessionsnummeret 23866. Der blev ikke beskrevet nogen antibiotikumproduktion for denne stammes vedkommende.

2^ Som hos andre mikroorganismer kan de karakteristiske egenskaber af de GE 227O-producerende stammer være udsat for variationer. Fx kan der opnås kunstige mutanter af stammen ved behandling med forskellige kendte mutagener såsom ultraviolette stråler, røntgenstråler, højfrekvensbølger, 30 radioaktive stråler og kemikalier såsom salpetersyrling, N-metyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin og mange andre. Alle naturlige og kunstige mutanter af Planobispora rosea ATCC som producerer antibiotikum GE 2270 anses for at være ækvivalente med stammen Planobispora rosea ATCC 53773 med 35 hensyn til den foreliggende opfindelses formål.

Som nævnt foran findes antibiotikum GE 2270 alminde- DK 171026 B1 10 ligvis hovedsageligt i myceliet af den producerende stamme mens en mindre mængde af stoffet også findes i gæringssup-pen.

Udvinding af antibiotikum GE 2270 fra myceliet eller 5 fra gæringssuppen fra den producerende mikororganisme gennemfores ved i og for sig kendte teknikker såsom ekstraktion med opløsningsmidler, fældning ved tilsætning af ikke-opløs-ningsmidler eller ved ændring af opløsningens pH-værdi, for-delingskromatografering, reversfase-fordelingskromatografβίο ring, ionbytterkromatografering og molekylær udelukkelses-kromatografering.

En foretrukken fremgangsmåde til udvinding af det antibiotiske stof ifølge opfindelsen fra myceliet indbefatter ekstraktion af det filtrerede eller centrifugerede mycelium 15 med et vandblandbart organisk opløsningsmiddel, koncentrering af ekstrakter og udvinding af det rå antibiotiske stof ved udfældning, eventuelt under tilsætning af et udfældningsmiddel, ved ekstraktion af den vandige remanens med et vandublandbart organisk opløsningsmiddel eller ved adsorpti-20 onskromatografering efterfulgt af eluering af det ønskede produkt fra absorptions-matrixen.

En foretrukken fremgangsmåde til udvinding af det antibiotiske stof ifølge opfindelsen fra gæringssuppen indbefatter ekstraktion med et vandublandbart organisk opløs-25 ningsmiddel efterfulgt af fældning fra de koncentrerede ekstrakter, eventuelt ved tilsætning af et fældningsmiddel eller yderligere ekstraktion af en vandig rest deraf med et vandublandbart opløsningsmiddel. Man kan også bringe gæringssuppen i kontakt med en adsorptions-matrix efterfulgt 30 af eluering med en polær elueringsblanding. Denne kromatografi-procedure kan anvendes på en koncentreret ekstrakt vundet fra gæringssuppen i stedet for fra suppen selv.

Med betegnelsen "vandblandbart opløsningsmiddel" som er anvendt i nærværende beskrivelse menes der at udtrykket 35 skal have den betydning der for tiden gives det i teknikken, og det sigter til opløsningsmidler som under anvendelsesbetingelserne er blandbare med vand i et rimeligt bredt kon- DK 171026 B1 11 centrationsområde.

Eksempler på vandblandbare opløsningsmidler som Jean bruges ved ekstraktion af det antibiotiske stof ifølge opfindelsen fra myceliemassen er lavtkogende alkanoler, fx Cx_ 5 a alkanoler såsom metanol, ætanol og propanol; fenyl-C^ alkanoler såsom benzylalkohol; lavtkogende ketoner som fx C3_4 ketoner såsom acetone og ætylmetylketon; cykliske ætere såsom dioxan og tetrahydrofuran; glykoler og produkter af partiel forætring deraf såsom ætylenglykol, propylenglykol 10 og ætylglykol-monometylæter; samt lavtkogende amider såsom dimetylformamid og diætylformamid.

Med betegnelsen "vandublandbart opløsningsmiddel" som er anvendt i nærværende beskrivelse sigtes der til den betydning af udtrykket som det for tiden normalt har i 15 teknikken, og det tager sigte på opløsningsmidler som under anvendelsesbetingelserne er svagt blandbare eller praktisk talt ublandbare med vand inden for et rimeligt bredt koncentrationsområde SOm egner sig til den tilsigtede anvendelse.

Eksempler på vandublandbare organiske opløsningsmidler som kan bruges ved ekstraktion af det antibiotiske stof ifølge opfindelsen fra gæringssuppen er de sædvanlige kulbrinte-opløsningsmidler som kan være ligekædede, forgrenede eller cykliske såsom hexan eller cyklohexan; halogenerede kulbrinter såsom kloroform, kulstoftetraklorid, diklorætan, 25 fluorbromætan, dibromætan, triklorpropan og klortrifluorok-tan; aromatiske kulbrinter såsom benzen, toluen og xylen; estere med under fire kulstofatomer såsom ætylacetat, pro-pylacetat og ætylbutyrat; alkanoler indeholdende mindst fire kulstofatomer, der kan være ligekædede, forgrenede eller cykliske såsom butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 3,3-dimetyl-l-butanol, 4-metyl-l-pentanol, 3-metyl-l-pentanol, 2,2-dimetyl-3-penta-nol, 2,4-dimetyl-3-pentanol, 4,4-dimetyl-2-pentanol, 5-me-35 tyl-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metyl-2-hexanol, 2-ætyl-l-hexanol, 2-metyl-3-hexanol, 1-oktanol, 2-oktanol, cyklopentanol, 2-cyklopentylætanol, 3-cyklopentyl-l-propa- DK 171026 B1 12 nol, cyklohexanol, cykloheptanol, cyklooktanol, 2,3-dimety1-cyklohexanol, 4-ætylcyklohexanol, cyklooktylmetanol, 6-me-tyl-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-dekanol, 2-deka-nol og 3-dekanol; ligekædede eller forgrenede alkylætere og 5 blandinger deraf såsom petroleumsæter, ætylæter, propylæter og butylæter; og blandinger og funktionelle derivater deraf.

Som kendt i teknikken kan faseadskillelse forbedres ved saltning.

Når der efter en ekstraktion udvindes en vandig fase 10 indeholdende en væsentlig mængde af et organisk opløsningsmiddel kan det være hensigtsmæssigt at afdestillere vand a-zeotropt derfra. I almindelighed fordrer dette tilsætning af et opløsningsmiddel med evne til at danne minimum-azeotrope blandinger med vand, om nødvendigt efterfulgt af tilsætning 15 af et fældningsmiddel til udfældning af det ønskede produkt. Repræsentative eksempler på organiske opløsningsmidler med evne til at danne minimum-azeotrope blandinger medvand er n-butanol, benzen, toluen, butylæter, kulstoftetraklorid, kloroform, cyklohexan, 2,5-dimetylfuran, hexan og m-xylen; det 20 foretrukne opløsningsmiddel i denne sammenhæng er n-butanol.

Eksempler på fældningsmidler er petroleumsæter, lavt-kogende alkylætere såsom ætylæter, propylæter og butylæter og lavtkogende alkylketoner såsom acetone.

Eksempler på kromatografiske systemer som hensigts-25 mæssigt kan bruges ved udvinding af det antibiotiske stof ifølge den foreliggende opfindelse er polystyren-harpikser og blandede polystyren-divinylbenzen-harpikser såsom "Amber-lite"(R> XAD2 eller XAD4 (Rohm og Haas), S112 (Dow Chemical Co.) og "Diaion" HP 20 (Mitsubishi); akrylharpikser såsom 30 XAD7 og XAD8 (Rohm og Haas); polyamider såsom polykaprolak-tamer, nylon og tværbundne polyvinylpyrrolidoner der i almindelighed har et porerumfang (ml/g) mellem 1 og 5, et o-verfladeareal (m2/g) mellem 1 og 100, en tilsyneladende tæthed (g/ml) mellem 0,15 og 0,50, en gennemsnitlig porediame-35 ter (Ångstrøm-enheder) mellem 100 og 3000 og en partikelstørrelsesfordeling hvor mindst 40% af partikelstørrelsen er under 300 pm såsom "Polyamide"-CC6, "Polyamide"-SC 6, "Poly- DK 171026 B1 13 amide"-CC 6.6, "Polyamide"-CC 6AC og "Polyamide"-SC 6AC (Macherey-Nagel & Co., Vesttyskland), polyvinylpyrrolidon-harpiksen PVP-CL (Aldrich Chemie GmbH & Co., KG, Vesttyskland), polyamidharpiksen PA 400 (M. Woelm AG, Vesttysk-5 land); og kul.

I tilfælde af polystyren eller akrylharpiks er et foretrukket elueringsmiddel en polær opløsningsmiddelblanding af vandblandbare opløsningsmidler såsom de ovenfor nævnte; i tilfælde af en polyamidharpiks er elueringsmidlet fortrins-10 vis en vandig blanding af vand og et vandblandbart opløsningsmiddel såsom dem der er nævnt ovenfor, mens et foretrukket eluringsmiddel ved anvendelse af kul er en lavere keton såsom acetone eller en lavere alkohol såsom metanol.

Den yderligere rensning af et råt præparat af antibi-15 otikum GE 2270 kan udføres ved en hvilken som helst af de kendte teknikker men gennemføres fortrinsvis ved hjælp af kromatografiske fremgangsmåder.

Eksempler på disse kromatografiske fremgangsmåder er dem der er rapporteret ovenfor i relation til udvindings-2o trinnet og indbefatter også kromatografering på stationære faser såsom silikagel, alumina, "Florisil" og lignende stoffer, hvorved der anvendes en organisk elueringsfase fremstillet af blandinger af opløsningsmidler der bl.a. kan indbefatte halogenerede kulbrinter, ætere, højerekogende keto-25 ner af de allerede ovenfor nævnte typer; eller reversfase-kromatografering på silaniseret silikagel med forskellige funktionelle derivatiseringer, og eluering med en vandig blanding af vandblandbare opløsningsmidler af de ovenfor nævnte arter.

30 Hensigtsmæssigt kan der også anvendes den såkaldte steriske udelukkelses-kromatografiteknik med gode resultater af rensningen. Navnlig kan der til denne teknik med fordel bruges tværbundne dextraner med kontrolleret porestørrelse og i hvilke de fleste hydroxylgrupper er blevet alkyleret, 35 fx "Sephadex"tR> LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Ab).

Som sædvanligt i denne gren af teknikken kan produktionen såvel som udvindingstrinnet og rensningstrinnet over- DK 171026 B1 14 våges ved forskellige analytiske metoder, herunder biobe-stemmelser såsom papirskive- eller agar-diffusionsbestemmelser' på følsomme mikroorganismer eller TLC- eller HPLC-meto-der der kan indebære et UV- eller mikrobielt tilbageholdel-5 sestrin.

En foretrukken HPLC-teknik er en reversfase-HPLC-me-tode under anvendelse af en kolonne med porøse og kugleformede partikler af silaniseret silikagel, fx silikagel funktio-naliseret med C-18 alkylgrupper med ensartet diameter (fx 5 10 pm "Ultrasphere" ODS Altex; Beckman Co.), en for-kolonne som er en silikagel funktionaliseret med C-18 alkylgrupper (såsom RP 18 fra Brownlee Labs) og et elueringsmiddel som er en lineær gradientblanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel såsom et af de ovenfor beskrevne opløsningsmid-15 ler, i en vandig bufret opløsning. Fortrinsvis er denne opløsning reguleret til pH 5-7. Et i særlig grad foretrukket elueringsmiddel er en linær gradient fra 45 til 70% elueringsmiddel A i elueringsmiddel B, hvor elueringsmiddel B er en blanding acetonitril/vandig buffer pH 5-7 10:90 og elue-20 ringsmiddel A er en blanding acetonitril/vandig buffer pH 5-7 70:30.

Antibiotikum GE 2270 faktor A ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved at det i ikke-saltform har følgende egenskaber;

O C

A) Et ultraviolet absorptionsspektrum som er vist på tegningens fig. 1 og som udviser følgende absorptions-roaxima:

Elxlcm Lambda max (nm) 30 0,1 M HCl 245 (skulder) 310 0,1 M KOH 245 (skulder) 35 313 DK 171026 B1 15

Fosfatpuffer pH 7,4 245 (skulder) 314

Metanol 265 244 (skulder) 5 310 B) Et infrarødt spektrum i nujol som er vist på tegningens fig. 2 og som udviser følgende absorptionsmaxima (cm-1): 3700-3060; 3060-2660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 10 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840, 810, 750, 720 (nujol), 700;

De vigtigste funktionelle IR-absorptionsbånd af dette spektrum kan tilskrives som følger: 15 v, (cm-1) Tilskrivning

3600-3100 vNH, υ OH

1650 amid I (vC=0)

1545 heterocyklisk vC=C og vC=N

20 1525, 1495 amid II (6NH)

1250, 1205 aromatisk 6CH

870 heterocyklisk rCH

745, 700 aromatisk yCH

25 c) Et 1H-NMR-spektrum som er vist på tegningens figur 3 og som udviser følgende grunper signaler (i ppm) ved 500 MHz, optaget i DMSO-de (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm); antallet af protoner for hvert signal er vist i parentes: 30 9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2); 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4.97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3.98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 35 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3); DK 171026 B1 16 D) Et 13C-NKR-spektrum som er vist på tegningens fig. 4 og som udviser følgende grupper signaler (ppm) ved 125 MHz i DMS0-d6 med TMS som den interne reference (0,00 ppm), idet Q står for kvaternære kulstofatomer eller C=0 grup-5 Peri 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 10 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2[CH]; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 126.76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36, CH2; 15 60,12, CH; 58,63, CH3; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2; 34,06, CH; 29.76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 17,98, CH3; 11,99, CH3; 20 E) En retentionstid (Rt) på 14,9 minutter ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser:

Kolonne: "Ultrasphere ODS" (reversfase-silaniseret silikagel; 5 pm) Altex (Beckman), 4,6 mm (indvendig 25 diameter) x 250 mm.

For-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (oktadecylsilan-silikagel; 5 pm).

Elueringsmiddel A: acetonitril/18 mM natriumfosfat 70:30 (rumfang), reguleret til pH 7,0.

30 Elueringsmiddel B: acetonitril/18 mM natriumfosfat 10:90 (rumfang), reguleret til pH 7,0.

Elueringsmåde: lineær gradient af elueringsmiddel A i elueringsmiddel B fra 45% til 70% i 20 minutter. Strømningshastighed: 1,8 ml/min.

35 UV-detektering: 254 nm

Intern standard: kloramfenikol (Rt = 3,7 min).

DK 171026 Bl 17 F) En elementæranalyse der efter at prøven er blevet tørret ved ca. 140*C under en inert atmosfære viser følgende kvalitative sammensætning: kulstof, hydrogen, nitrogen og svovl.

5 G) En Rf-værdipå 0,37 i følgende kromatografiske system: diklormetan/metanol 9:1 (rumfang) under anvendelse af silikagelplader (silikagel 60F254, Merck Co).

Synliggørelse: ultraviolet lys ved 254 nm, gul plet 10 med joddampe eller bioautografering under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på et minimalt Davis medium; intern standard: kloramfenikol (Rf = 0,56).

H) En FAB-MS analyse som udviser den laveste masseisotop 15 af den protonerede molekylære ion ved m/z 1290,3 ± 0,1 dalton. Alle andre toppe på over 800 m/z masseenheder (bortset fra isotop-toppe) i spektret var under 20% af molekylærionen, ved analyse med et "Kratos" MS-50 dobbelt fokuserende massespektrometer under følgnede.for- 20 søgsbetingelser: Xe hurtigt atombombardement ved 6 kV ; glycerolmatrix; positiv ioniseringsmåde.

I) En aminosyreanalyse af saltsyrehydrolysatet som udviser tilstedeværelse af følgende naturlige aminosyrer: gly- 25 cin, (L)-prolin og (L)-serin, under følgende forsøgsbetingelser:

Prøven hydrolyseres ved 105*C i 20 timer i nærværelse af 6N HCl indeholdende 1% fenol og derivatiseres derefter i to trin som følger: 30 a) dannelse af n-propylestrene af karboxylsyrefunktionerne med 2M HCl i vandfrit propanol (90*C, 1 time) og efterfulgt af tørring under nitrogen; 35 b) omdannelse af de fri aminogrupper til amider med pentafluorpropionsyreanhydrid/vandfrit diklormetan 1:9 DK 171026 B1 18 (rumfang) ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af tørring under nitrogen; den på denne måde vundne derivatiserede remanens opløses i diklormetan og analyseres ved GC-MS under anvendelse 5 af et HP5985B-system under følgende betingelser: kolonne: en smeltet silika kapillær kolonne coated med chiral n-propionyl-L-valin-t-butylamid-polysiloxan (25 m x 0,2 mm indvendig diameter; C.G.C. ANALYTIC); temperaturprogram: 80*C i 4 minutter, derefter 4*C/min.

10 L) Ioniseringsstudier:

Der konstateres ikke nogen ioniserbare funktioner ved titrering med 0,1 N HCl og 0,1 N NaOH i metylcellosolve/ vand; der afsløres en svag basisk funktion ved filtre-15 ring med 0,1 N HC104 i et ikke-vandigt medium (eddike syre) .

M) Specifik drejning: [a)D20 * +140,8 i absolut ætanol ved en koncentration 20 på ca. 5 g/1.

Antibiotikum GE 2270-komplekset ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved at komplekset er et antibiotisk stof som vindes ved udvinding fra myceliet af Planobispora rosea ATCC 53773 eller en GE 2270-producerende mutant deraf.

25

Den antimikrobielle aktivitet af forbindelserne ifølge opfindelsen kan påvises ved en række standardforsøg in vitro.

MIC for Clostridium difficile, Propionibacterium ac-nes og Bacteroides fragilis bestemmes ved agar-fortynding 30 (inokula 104 CFU). MIC for andre organismer bestemmes ved mikro-suppefortynding (inokula 104-105 CFU/ml). Inokula for Ureaplasma urealyticum var ca. 104 farveændrende enheder/ml. Inkuberingstider 18-24 timer undtagen for Neisseria gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis, Haemophilus 35 influenzae, Clostridium difficile, Propionibacterium acnes og Bacteroides fragilis (48 timer). Alle organismerne inkuberes ved ca. 37*C undtagen Candida albicans (30*C). Neisse- DK 171026 B1 19 ria gonorrhoeae og Haemophilus influenzae inkuberes i en 5%s C02-atmosfaere, anaerobe organismer i en anaerob gasblanding. De anvendte medier er: "Iso-Sensitest" suppe (Oxoid), (stafylokokker, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, 5 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae); Todd-Hewitt suppe (Difco); (andre streptokokker): GC base-suppe (Difco) + 1% "IsoVitalex" BBL (Neisseria gonorrhoeae); hjerne-hjerte-infusionssuppe (Difco) + 1% Supplement C (Difco); (Haemophilus influenzae); 10 Mueller-Hinton suppe (BBL; Branhamella catarrhalis); AC-medium (Difco; Clostridium perfringens); Wilkins-Chalgren agar (Oxoid; andre anaerobe organismer) (T.D. Wilkins og S. Chalgren, Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976); Evans og Taylor-Robinson suppe (Difco) med supplementer til Urea-25 plasma urealyticum; gaer-nitrogensuppe (Difco; Candida albicans ).

De mindste inhiberende koncentrationer (MIC, pg/ml) for visse mikroorganismer er vist i nedenstående tabel IV.

20 25 30 35 DK 171026 B1 20

Tabel IV

Stamme MIC, pg/ml

Antibiotikum GE 2270 faktor A

5 ________

Staphylococcus aureus Tour L165 0,25

Staphylococcus aureus Tour L165 (106 cfu/ml) 0,25

Staphylococcus aureus Tour L165 + 30% okseserum 0,25

Staphylococcus epidermidis L147 ATCC 12228 0,13 10 Staphylococcus haemolyticus L602 0,5

Staphylococcus haemolyticus L602 (106 cfu/ml) 1

Streptococcus pyogenes C203 0,25

Streptococcus pneumoniae UC41 0,13

Streptococcus faecalis ATCC 7080 0,13 15 Streptococcus mitis L796 0,13

Clostridium perfringens ISS 30543 0,03

Clostridium difficile ATCC 9689 0,03

Propionibacterium acnes ATCC 6919 £0,004

Bacteroides fragilis ATCC 23745 2 20 Neisseria gonorrhoeae ISM68/126 32

Branhamella catarrhalis ATCC 8176 1

Haemophilus influenzae ATCC 19418 128

Ureaplasma urealyticum L 1479 32

Escherichia coli SKF 12140 >128 25 Proteus vulgaris ATCC 881 >128

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 >128

Klebsiella pneumoniae L142 >128

Candida albicans SKF 2270 >128 DK 171026 B1 21

Aktiviteten af antibiotikkum GE 2270 blev også bekræftet ved forsøg in vitro mod kliniske isolater af entero-kokker.

Tabel V viser resultaterne af disse forsøg.

5

Tabel V

Aktivitet af antibiotikum GE 2270 mod enterokokker

Art Antal pg/ml 10 stammer MIC-område MIC50 MIC90

Streptococcus faecalis 15* 0,03-0,25 0,06 0,25 15 * herunder fire vancomycin-resistente stammer

Streptococcus faecium 15* 0,06-0,5 0,06 0,13 20 * herunder fem ancomycin-resistente stammer DK 171026 B1 22

Resultaterne af nogle forsøg in vitro mod klinisk isolerede koagulase-negative stafylokokker er vist i nedenstående tabel VI.

5 Tabel VI

Aktivitet af antibiotikum GE 2270 mod koagulase-negative stafylokokker MIC, pg/ml 10 GE 2270

Staphylococcus epidermidis L408 0,5 L423 0,25 L410 0,5 15 L393 0,5 L425 0,25

Staphylococcus haemolyticus L353 0,25 L602 1 20 L383 0,5 L626 0,5 L382 1 L620 1 L381 0,5 25 _ DK 171026 B1 23

Det antimikrobielle aktivitetsspektrum af antibiotikum GE2270 indbefatter også anaerobe bakterier som det fremgår af de i nedenstående tabel VII viste resultater af forsøg in vitro.

5

Tabel VII

Aktivitet af GE 2270 mod anaerobe bakterier MIC, pg/ml 10 GE 2270

Bacteroides fragilis L1236 2 L1237 1 L1226 1 15 L1228 1 L1010 2

Propionibacterium aenes L1014 0,004 L1560 0,004 20 L1563 0,03 L1565 0,008

Aktiviteten mod Propionibacterium aenes blev også 25 bekræftet ved forsøg in vitro med 11 klinisk isolerede stammer, og resultatet heraf er viste i nedenstående tabel.

Aktivitet af antibiotikum GE 2270 mod Propionibacterium aenes 30 _

Antal pg/ml stammer MIC-område MIC50 MICgo 11 0,004-0,008 0,008 0,008 35 ___ DK 171026 B1 24

Baktericid aktivitet mod Enterococcus faecalis

Kurver over dødeligheden for visse mikroorganismer i tiden blev optegnet på basis af 10 ml Todd-Hewitt suppe i 100 ml store Erlenmeyer kolber der blev inkuberet ved 37*C 5 uden omrøring. En logaritmisk voksende kultur af Enterococcus faecalis, stammen L 149, blev podet med en mængde på 1,4 x 107 CFU/ml.

Reference-antibiotiket (teicoplanin, 8 mg/1) dræbte 99% af de inficerende bakterier på 48 timer, mens antibioti-10 kum GE 2270 faktor A (0,13 mg/1) dræbte 99,8% af bakterierne i løbet af 2 timer og 99,99% af dem i løbet af 48 timer ved denne dosis eller i løbet af 24 timer ved en dosis på 4 mg/1.

Denne aktivitet mod Enterococcus faecalis gælder også 15 for stammer som er resistente mod glykopeptidiske antibiotika .

Aktivitet mod Gardnerella vaginalis 13 kliniske isolater af Gardnerella vaginalis blev 20 afprøvet på Casman agar med 5% kaninblod og 0,15% lyseret kaninblod (inokulum på ca. 104 CFU). MIC-værdien for GE 2270 faktor A var i området 2-4 mg/1; MIC50 var 2 mg/1. Inkube-ringen blev foretaget i 48 timer ved 37*C i en anaerob gasblanding.

25

Eksperimentel septicæmi hos mus

Den antimikrobielle aktivitet af forbindelsen ifølge opfindelsen bekræftes også ved forsøg med eksperimentelt fremkaldt septicæmi hos mus.

30 Grupper på otte CDl-mus af begge køn (stammen Charles

River, gennemsnitlig vægt 18-22 g) blev inficeret intraperi-tonealt med staphylococcus aureus ATCC 19636. Den bakterielle belastning (10® celler pr. mus) blev indgivet i en tilstand suspenderet i 0,5 ml 5%s bakteriologisk mucin (Difco).

35 Testforbindelsen blev indgivet intravenøst én gang straks efter inficeringen i steril vandig opløsning indeholdende 5% dimetylformamid og 10% "Cremophor"EL (polyætoxyleret ri- DK 171026 B1 25 cinusolie).

ED50 blev beregnet den syvende dag på basis af procentandelen af overlevende mus ved hver dosis idet beregningen skete ved Spearman og Kaerbers metode; den resulterende 5 værdi var 1,13 mg/kg.

Eksperimentelt fremkaldt endocarditis hos rotter

Endocarditis blev induceret i hanlige CD-rotter (af stammen Charles River) med en vægt på ca. 200 g. Der blev 10 indsat et polyætylen-kateter (PP.25 "Portex"tR) ) gennem aorta-ventilen i venstre hjertekammer via højre halsarterie og fæstnet ved hjælp af en silke-ligatur. Korrekt position af kateteret blev kontrolleret ved hjælp af en registrerende forstærker (Hewlett Packard model 7782A) med en 15 tryk-transducer. To dage senere blev rotterne inficeret ved intravenøs injektion af 0,5 ml saltvand indeholdende Staphylococcus aureus L 1524 i en koncentration på 104 CFU. Behandlingen fandt sted i 5 dage begyndende 16 timer efter inficeringen. Antibiotikum GE 2270 faktor A, opløseliggjort i 20 propylenglykol/"Cremophor"<R> EL/5% glukose 10:20:70 blev indgivet intravenøst i en mængde på 20 mg/kg to gange om dagen. Overlevende rotter blev dræbt på sjette dag efter behandlingen og deres hjerter fjernedes. Alle dyr som døde før afslutningen af behandlingen blev obduceret og deres hjerter 25 fjernet. Alle hjerterne blev vejet og homogeniseret; homoge-nisaterne blev seriefortyndet og udstrøget på plader af Todd-Hewitt agar for at bestemme bakteriebelastningen. Tilstedeværelse af blod i homogenisaterne af de hele hjerter påvirkede ikke resultaterne eftersom bakterietiterne i blo-30 det stedse var mindst 1000 gange lavere end hjertebelastningerne. De opnåede data blev statistisk analyseret ved hjælp af Scheffe's multiple sammenligningstest. De rotter som døde inden for 40 timer efter inficeringen blev udelukket fra den statistiske analyse. Resultaterne af dette forsøg er vist 35 nedenfor.

DK 171026 B1 26

Aktivitet af antibiotikum GE 2270 faktor A mod stafylokokfremkaldt endocarditis hos rotter

Inficerende Behandling Dags- Antal Log10 CFU/g 5 organisme** dosis rotter hjerte (mg/kg) (middeliSD)*** vej

Staphylococ- ingen 11 9,48 ± 0,33 10 cus aureus L1524 bærevæske intra- alene venøs 13 9,61 ± 0,31 GE 2270 (20x2) 15 faktor A intravenøs 12 4,89 ± 1,29* * p <0,001 i forhold til kontrollerne (ubehandlet eller behandlet med bærevæske) 20 ** MIC af antibiotikum GE 2270 faktor A for Staphylococcus aureus L1524: 0,25 pg/ml *** Bakteriebelastning i hjertet ved behandlingens igangsæt-25 ning: 7,36 ± 0,32 (middelværdi ± SD af log10 CFU/g hjer te for 5 dyr)

Akut toxicitet

Forsøg over den akutte toxicitet blev udført hos mus 30 og viste at LD-værdien for antibiotikum GE 2270 faktor A var på over 100 mg/kg ved intravenøs indgift og på over 500 mg/kg ved intraperitoneal indgift hos den dyreart.

I betragtning af forbindelsens egenskaber kan den bruges som virksom bestanddel til fremstilling af medikamen-35 ter til behandling af mennesker og dyr.

Navnlig er antibiotikum GE 2270 faktor A et antimi-krobielt middel som hovedsagelig er virksomt mod grampositi- DK 171026 B1 27 ve bakterier og grampositive såvel som gramnegative anaerobe organismer. Den viser sig at være aktiv også ved stafylokokfremkaldt endocarditis uden nogen krydsresistens med me-ticillin, aminoglykosider eller glycopeptid-antibiotika.

5 Den vigtigste terapeutiske indikation for det antibi otiske stof ifølge den foreliggende opfindelse er således behandling af infektioner som hænger sammen med tilstedeværelse af en mikroorganisme som er følsom derfor.

Med betegnelsen "behandling" menes her både profylak-10 se, terapi og helbredelse.

De patienter som modtager en sådan behandling er et hvilket som helst dyr der har behov derfor, herunder primater og navnlig mennesker samt andre pattedyr såsom heste, kvæg, svin og får, samt fjerkræ og kæledyr i almindelighed.

15 Forbindelsen ifølge opfindelsen kan indgives som så dan eller i blanding med farmaceutisk acceptable bærestoffer og kan også indgives sammen med andre antimikrobielle stoffer såsom penicillin, cephalosporiner, aminoglykosider og glykopeptider. Konjunktiv terapi indbefatter således indgift 20 i rækkefølge, samtidig og særskilt af den aktive forbindelse på en sådan måde at de terapeutiske virkninger af den først indgivne dosis ikke er ganske forsvundet når den påfølgende indgives.

I overensstemmelse hermed er det farmaceutiske 25 præparat ifølge opfindelsen ejendommeligt ved at det indeholder en forbindelse ifølge opfindelsen i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

Et foretrukket farmaceutisk præparat er et præparat som egner sig til topisk (lokal) påføring på en intakt eller 30 beskadiget hud eller slimhinde. Eksempler på sådanne præparater er pulvere, salver, cremer og lotioner. Excipienterne i disse præparater er de sædvanlige farmaceutisk acceptable bærestoffer såsom olieagtige salvegrundlag (fx cetylester-vokser, oliesyre, olivenolie, paraffin, spermacet eller sti-35 velsesglycerit); absorberende salvegrundlag (fx vandfri lanolin eller hydrofil vaselin), salvegrundlag til emulsioner (fx cetylalkohol, glycerylmonostearat, lanolin eller stea- DK 171026 B1 28 rinsyre), vandopløselige salvegrundlag (fx glykolætere og derivater deraf som indbefatter polyætylenglykoler, poly-(oxy-i,2-ætandiyl)-a-hydro- -hydroxyoktadekanoat, polysorba-ter og polyætylenglykol-monostearater).

5 Disse præparater kan indeholde andre kendte excipien- ter såsom konserveringsmidler og fremstilles på de i farmacien kendte måder som også er rapporteret i sådanne reference-håndbøger som Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17. udgave 1985, Mack Publishing Co.

10 Forbindelsen ifølge opfindelsen kan også oparbejdes til præparater som egner sig til parenteral indgift og en sådan oparbejdning sker ved fremgangsmåder der er kendt i og for sig i teknikken og som er gengivet i referencebøger som fx den ovennænvnte.

15 Fx kan forbindelsen ifølge opfindelsen oparbejdes med et opløseliggørende middel såsom polypropylenglykol eller dimetylacetamid og et overf ladeaktivt middel såsom polyoxyæ-tylen-sorbitanmonooleat eller polyætoxyleret ricinusolie i sterilt vand til injektion.

2o Et eksempel på et typisk præparat til parenteral ind gift indeholder 10 mg antibiotikum GE 2270 faktor A pr. ml slutpræparat, 10-20% af et overfladeaktivt middel som kan være en polyoxyætylen-sorbitanfedtsyreester, et polyoxyæty-leret ricinusoliederivat eller et polyoxyætylen-hydrogeneret 25 ricinusoliederivat samt 0-20%, fortrinsvis 10-20% af et so-lubiliseringsmiddel såsom propylenglykol, dimetylacetamid, dimetylformamid, tert-butyl-N-hydroxykarbamat, 1,2-, 1,3-eller 1,4-butandiol, ætyloleat, tetrahydrofurfuryl-polyæty-lenglykol 200, dimetylisosorbid eller benzylalkohol. Et fo-30 retrukket solubiliseringsmiddel eller opløseliggørende middel er propylenglykol.

Polyoxyætylensorbitan-fedtsyreestere er kommercielt tilgængelige og nogle af dem går i handelen under varemærket "Tween"De er også kendt under trivialnavnet "polysorba-35 ter". Eksempler på sådanne forbindelser er polysorbat 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81 og 85. Det foretrækkes til anvendelse i præparater ifølge den foreliggende opfindelse at DK 171026 B1 29 bruge polysorbat 80 (sorbitan-mono-9-oktadekanoat, poly(oxy- 1,2-ætandiyl)-derivater).

Polyoxyætylen-ricinusolier og polyoxyætylen-hydroge-nerede ricinusolier er også kommercielt tilgængelige. Nogle 5 af dem føres i handelen under varemærket "Cremophor"(R>. Eksempler på sådanne forbindelser er dem der kendes som "Cre-mophor"{R) EL (polyætoxyleret ricinusolie), "Cremophor"fR> RH 40 (polyætoxyleret, hydrogeneret ricinusolie), "Cremophor" (R> RH 60 (PEG 60 hydrogeneret ricinusolie) og "Emul-10 phor"(R> EL-719 (polyoxyætyleret vegetabilsk olie).

Fortrinsvis bør et præparat til injektion have en pH-værdi i området 7 ± 0,5. Det kan eventuelt være nødvendigt eller tilrådeligt at regulere præparatets pH-værdi med et egnet bufringsmiddel. Hensigtsmæssigt kan man bruge TRIS 15 (dvs. trihydroxymetylaminometan) eller fosfat som bufringsmidler .

Et foretrukket præparat til parenteral indgift indeholder følgende excipienter: 20% "Cremophor"<R> EL (polyo-xyl-35-ricinusolie USP/NF) og 5-20%, fortrinsvis 10-20% pro-20 pylenglykol.

I almindelighed kan disse præparater fremstilles ved at man opløser den virksomme forbindelse i det organiske opløsningsmiddel og derefter under omrøring tilsætter den o-verfladeaktive bestanddel og til slut fortynder til det øn-25 skede rumfang med sterilt vand til injektion.

Andre excipienter såsom konserveringsmidler eller stabiliseringsmidler kan tilsættes som kendt i teknikken.

Et eksempel på et parenteralt indgiveligt præparat er følgende: 30

Antibiotikum GE 2270 faktor A 10 mg PEG 40 ricinusolie ("Cremophor"{R) EL) 0,2 ml

Propylenglykol 0,2 ml

Metyl-parahydroxybenzoat 0,5 mg 35 Propyl-parahydroxybenzoat 0,05 mg

Vand til injektion efter behov til 1 ml DK 171026 B1 30

Det er også muligt at fremstille det virksomme stof som et frysetørret pulver til rekonstitution før brugen.

Hvis det frysetørrede materiale fremstilles ud' fra en blanding indeholdende den virksomme bestanddel og det over-5 fladeaktive middel, fx polyætylenglykol 60-hydrogeneret ricinusolie, kan det hensigtsmæssigt rekonstitueres med det vandige medium alene, uden tilsætning af noget organisk opløsningsmiddel .

Eventuelt kan der om nødvendigt eller ønskeligt til-io sættes et sædvanligt hjælpestof for frysetørringen for at opnå et frysetørret materiale i pulverform.

Fortrinsvis bruges alle disse præparater til intravenøs indgift ved behandling af en hvilken som helst infektion hvori der er indblandet en mikroorganisme som er følsom for 15 det antibiotiske stof ifølge opfindelsen.

Ved behandling af pseudomembranøs colitis eller andre sygdomme som kan tilskrives tilstedeværelse af anaerobe bakterier i mave-tarmkanalen kan man indgive en effektiv dosis af forbindelsen ifølge opfindelsen oralt i en egnet farma-20 ceutisk form såsom en kapsel, en tablet eller en vandig suspension .

Dosis af det virksomme stof afhænger af mange faktorer som indbefatter patientens type, alder og tilstand, den specifikke form af det virksomme stof og den oparbejdning 25 der er valgt for præparatet til indgift samt indgiftskemaet og lignende faktorer.

I almindelighed bruges der effektive antimikrobielle doser for hver enkelt enhedsdosisform.

Gentagne påføringer eller indgifter, fra fx 2 til 6 30 gange om dagen, foretrækkes i almindelighed. En effektiv dosis kan generelt ligge i området 0,5-50 mg/legemsvægt om dagen .

Et foretrukket topisk (lokalt) præparat er en salve indeholdende fra 1% til 10% af en forbindelse ifølge den fo-35 religgende opfindelse.

I alle tilfælde vil den receptudstedende læge være i stand til at fastslå den optimale dosis for en given patient DK 171026 B1 31 i en given situation.

Foruden deres anvendelse som medikamenter i humanterapien og veterinærterapien kan forbindelserne ifølge opfindelsen også bruges til fremme af dyrs vækst.

5 Til dette formål indgives en forbindelse ifølge op findelsen oralt i et egnet foder. Den præcise koncentration der bruges er den som behøves til at sikre at det virksomme stof konsumeres i en til fremme af væksten effektiv mængde når der indtages normale mængder foder.

10 Tilsætningen af den virksomme forbindelse ifølge op findelsen til dyrefoder gennemføres fortrinsvis ved tilberedning af en passende foder-forblanding indeholdende den virksomme forbindelse i en effektiv mængde og derefter inkorporerer forblandingen i det fuldstændige foder.

15 Man kan også fremstille et mellemprodukt bestående af et koncentrat eller fodersupplement indeholdende det aktive stof og blande dette mellemprodukt i foderet. Den måde på hvilken sådanne foder-forblandinger og fuldstændige fodere kan fremstilles og indgives er beskrevet i sådanne referen-20 cebøger som "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., San Francisco, USA, 1969, og "Livestock Feeds and Feeding" 0 and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).

Kort beskrivelse af tegningen 25 Fig. 1 viser det ultraviolette spektrum for antibio tikum GE 2270 faktor A. Sammenhængen mellem symbolerne og de anvendte opløsningsmidler er som følger:

---- refererer til bestemmelse i CH3OH

30 · refererer til bestemmelse i 0,1 N HCl refererer til bestemmelse i fosfatbuffer pH 7,4

i refererer til bestemmelse i 0,1 N KOH

Fig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum for 35 antibiotikum GE 2270 faktor A i nujol.

Fig. 3 viser JH-NMR for antibiotikum GE 2270 faktor A målt ved 500 MHz i DMSO-d6.

DK 171026 B1 32

Fig. 4 viser 13C-NMR for antibiotikum GE 2270 faktor A ved 125 MHz i DMS0-d6.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

5 Eksempel 1

Produktion af antibiotikum GE 2270

En kultur af Planobispora rosea ATCC 53773 dyrkes på en skråkultur af havremelsagar i to uger ved 28-30*C og bru-10 ges derefter til at pode 500 ml store kolber indeholdende 100 ml af et udsædsmedium med følgende sammensætning:

Stivelse 20 g/1

Polypepton 5 g/1 15 Gærekstrakt 3 g/1

Oksekødsekstrakt 2 g/1

Sojabønnemel 2 g/1

Kalciumkarbonat 1 g/1

Destilleret vand til 100 ml 20 (reguleret til pH 7,0 før sterilisation)

Kolben inkuberes på en roterende ryster (200 opm) ved 28-30*C i 92 timer. Den opnåede kultur bruges derefter til podning af en krukkefermentor indeholdende 4 liter af samme 25 medium og kulturen inkuberes ved 28-30*C i 48 timer under omrøring (ca. 900 opm) og luftning med ca. en standard liter luft pr. rumfang pr. minut.

Den fremkomne suppe overføres til en gæringsbeholder indeholdende 50 liter af følgende produktionsmedium: 30

Stivelse 20 g/1

Pepton 2,5 g/1

Hydrolyseret kasein 2,5 g/1 Gærekstrakt 3 g/1 35 Oksekødsekstrakt 2 g/1

Sojabønnemel 2 g/1

Kalciumkarbonat 1 g/1 DK 171026 B1 33

Destilleret vand efter behov (reguleret til pH 7,0 før sterilisation) og der inkuberes i ca. 72 timer ved 28-30*C.

5 Antibiotikumproduktionen overvåges ved bestemmelse på papirskive-agar under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 dyrket på et minimum Davis-medium. Inhiberingszonerne bedømmes efter inkubering natten over ved 35*C.

10 Eksempel 2

Udvinding af antibiotikum GE 2270

Den på den i eksempel 1 beskrevne måde opnåede gæringsmasse (50 liter) indhøstes og underkastes filtrering i 15 nærværelse af filterhjælp ("Clarcell").

Antibiotikum GE 2270 findes hovedsagelig i myceliet selv om der også kan udvindes en vis mængde deraf af filtraterne .

a) Filtratet reguleres til pH ca. 7,0 og ekstraheres 20 med 50 liter ætylacetat. Den organiske fase fraskilles ved centrifugering og koncentreres til et lille rumfang under nedsat tryk. Den opnåede olieagtige remanens behandles derefter med petroleumsæter til udfældelse af råt antibiotikum GE 2270, der opsamles ved filtrering og tørres. Der vindes 25 415 mg råt antibiotikum GE 2270 kompleks.

b) Myceliet ekstraheres to gange med 20 liter metanol og de forenede ekstrakter koncentreres under nedsat tryk og giver en vandig remanens som ekstraheres to gange med ætylacetat. Der udfældes 6,06 g råt antibiotikum GE 2270 ved til- 30 sætning af petroleumsæter til den koncentrerede organiske fase.

Eksempel 3

35 Rensning af antibiotikum GE 2270 faktor A

3 g af det rå materiale der opnåedes fra myceliet ved DK 171026 B1 34 den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 2 opløses i tetrahydrofuran og koncentreres under nedsat tryk i nærværelse af silikagel (230-400 mesh). Den opnåede faste remanens opsamles og overføres til en kromatografikolonne' inde-holdende 300 g silikagel (230-400 mesh) tilberedt i metylenklorid (CH2C12) · Kolonnen fremkaldes med 2 liter metylenklorid og derefter i rækkefølge med 1,5 liter af blandinger af metylenklorid og metanol i følgende mængdeforhold: 98:2; 96:4; 94:6; 92:8; 90:10 og 88:12 (rumfang).

10 Der opsamles fraktioner, de analyseres ved TLC, HPLC

eller på mikrobiologisk måde mod Bacillus subtilis og forenes i henhold til deres indhold af antibiotikum.

De forenede fraktioner indeholdende rent antibiotikum GE 2270 faktor A (HPLC-retentionstid 14,9 minutter, se foran 15 under de fysisk-kemiske data, punkt E) og koncentreres under nedsat tryk til frembringelse af en olieagtig remanens som opløses i tetrahydrofuran. Fra denne opløsning udfældes antibiotikum GE 2270 i en mængde på 600 mg ved tilsætning af petroleumsæter.

20

Eksempel 4

Et yderligere udbytte af antibiotikum GE 2270 faktor A udvindes fra andre fraktioner som er fraskilt ved hjælp af 25 det i eksempel 3 beskrevne kromatografiske system men som indeholder det i uren form (HPLC). Også disse fraktioner, koncentreres og behandles til frembringelse af et fast stof på den ovenfor beskrevne måde. Det rå præparat af antibiotikum GE 2270 faktor A renses ved HPLC på følgende måde: 30 En portion på 6 mg af dette bundfald opløses i aceto- nitril/vand 1:1 (rumfang) og indsprøjtes i et HPLC-kromato-grafisk system udstyret med en silaniseret silikagelkolonne ("LiChrosorb"(R) RP 18, 7 pm, 250 x 10 mm, Merck,

Darmstadt).

35 Der foretages eluering med en linær gradient af en blanding af opløsningerne A og B på fra 50% til 85% opløsningsmiddel A i opløsningsmiddel B, i 20 minutter og med en DK 171026 B1 35 strømningshastighed på ca. 4 ml/minut. Opløsning A er en blanding af acetonitril og 18 mM natriumfosfatbuffer i mængdeforholdet 70:30 (rumfang), reguleret til pH 6; mens opløsning B er en blanding af acetonitril og 18 mM fosfatbuffer i 5 forholdet 10:90 (rumfang), reguleret til pH 6.

Kolonnen er forbundet med en Perkin Elmer LC85 UV-de-tektor ved 330 nm. Fraktionerne af 11 på hinanden følgende kromatografi-forløb med homogent indhold forenes og koncentreres under nedsat tryk for at fjerne acetonitril, hvorved der opnås fraskilte tilbageværende opløsninger indeholdende antibiotikum GE 2270 faktor A. Disse opløsninger ekstraheres to gange med lige store rumfang ætylacetat og det antibiotiske produkt opnås ved udfældning fra den koncentrerede organiske fase ved tilsætning af petroleumsæter. Efter udvin-15 ding ved filtrering og tørring opnås der 27 mg antibiotikum GE 2270 faktor A.

20 25 30 35

Claims (8)

1. Antibiotikum GE 2270 faktor A og dets additionssalte, kendetegnet ved, at det i ikke-saltform har følgende egenskaber: 5 A) Et ultraviolet absorptionsspektrum som er vist på tegningens fig. 1 og som udviser følgende absorptions-maxima:

10 E:*lcm Lambda max (nm) 0,1 M HCl 245 (skulder) 310 15 0,1 M KOH 245 (skulder) 313 Fosfatpuffer pH 7,4 245 (skulder) 314 20 Metanol 265 244 (skulder) 310 B) Et infrarødt spektrum i nujol som er vist på tegningens 25 fig. 2 og som udviser følgende absorptionsmaxima (cm-1): 3700-3060; 3060-2660 (nujol); 1650; 1590-1490; 1490-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1310; 1245; 1210; 1165; 1090; 1060; 1020; 970; 930; 840, 810, 750, 720 (nujol), 700; De vigtigste funktionelle IR-absorptionsbånd af dette 30 spektrum kan tilskrives som følger: v, (cm-1) Tilskrivning 3600-3100 vNH, v OH 35 1650 amid I (vC=0) 1545 heterocyklisk vC-C og vC=N 1525, 1495 amid II (6NH) DK 171026 B1 1250, 1205 aromatisk 6CH 870 heterocyklisk yCH 745, 700 aromatisk yCH

2. Antibiotikum GE 2270-kompleks indeholdende antibiotikum GE 2270 faktor A eller dets additionssalte ifølge krav 1 som hovedkomponent, kendetegnet ved at komplekset er et antibiotisk stof som vindes ved 5 udvinding fra myceliet af Planobispora rosea ATCC 53773 eller en GE 2270-producerende mutant deraf.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse ifølge krav 1 eller et kompleks ifølge krav 2, kende -tegnet ved, at man dyrker Planobispora rosea ATCC 10 53773 eller en GE 2270-producerende mutant deraf under submerse aerobe betingelser i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte og udvinder det dannede antibiotikum derfra.

4. Farmaceutisk præparat, kendetegnet 15 ved at det indeholder en forbindelse ifølge krav 1 eller et kompleks ifølge krav 2 i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.

5. Forbindelse ifølge krav 1 eller et kompleks ifølge krav 2 til anvendelse som lægemiddel.

5 C) Et 1H-NMR-spektrum som er vist på tegningens figur 3 og som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 500 MHz, optaget i DMSO-d6 (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm); antallet af protoner for hvert signal er vist i parentes: 10 9,02 (1); 8,68 (1); 8,70 (1); 8,57 (1); 8,50 (1); 8,43 (1); 8,37 (1); 8,26 (1); 8,25 (1); 7,4-7,20 (9); 6,96 (2); 6,02 (1); 5,30-5,18 (3); 5,01 (1); 4.97 (2); 4,80 (1); 4,56 (1); 4,30 (1); 4,26 (1); 3.98 (1); 3,81 (1); 3,79 (1); 3,38 (3); 2,72 (1); 15 2,58 (3); 2,48 (3); 2,16 (1); 2,13 (1); 1,96 (2); 1,88 (1); 1,34 (1); 0,87 (3); 0,84 (3); D) Et 13C-NMH-spektrum som er vist på tegningens fig. 4 og som udviser følgende grupper signaler (ppm) ved 125 MHz

20. DMSO-d6 med TMS som den interne reference (0,00 ppm), idet Q står for kvaternære kulstofatomer eller C=0 grupper; 173,69, Q; 171,10, Q; 169,83, Q; 169,51, Q; 168,45, Q; 168,26, Q; 167,84, Q; 165,68, Q; 164,75, Q; 25 161,40, Q; 161,23, Q; 160,46, Q; 160,29, Q; 159,35, Q; 153,42, Q; 150,31, Q; 150,11, Q; 149,41, Q; 146,93, Q; 144,73, Q; 143,75, Q; 142,10, Q; 141,78, Q; 141,33, CH; 140,97, Q; 139,53, Q; 128,68, CH; 127,99, 2[CH]; 127,67, Q; 127,67, CH; 126,88, CH; 30 126,76, 2[CH]; 123,17, CH; 118,66, CH; 116,42, CH; 73,81, CH; 69,41, CH2; 67,97, CH; 67,36, CH2; 60,12, CH; 58,63, CH3; 58,24, CH; 55,41, CH; 48,15, CH; 47,03, CH2; 41,19, CH2; 37,60, CH2; 34,06, CH; 29,76, CH2; 25,85, CH3; 24,28, CH2; 18,49, CH3; 35 17,98, CH3; 11,99, CH3; E) En retentionstid (Rt) på 14,9 minutter ved analyse ved DK 171026 B1 reversfase-HPLC under følgende betingelser: Kolonne: "Ultrasphere ODS" (reversfase-silaniseret silikagel; 5 pm) Altex (Beckman), 4,6 mm (indvendig 5 diameter) x 250 mm. For-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (oktadecylsilan-silikagel; 5 pm) . Elueringsmiddel A: acetonitril/18 mM natriumfosfat 70:30 (rumfang), reguleret til pH 7,0.

10 Elueringsmiddel B: acetonitril/18 mM natriumfosfat 10:90 (rumfang), reguleret til pH 7,0. Elueringsmåde: lineær gradient af elueringsmiddel A i elueringsmiddel B fra 45% til 70% i 20 minutter. Strømningshastighed: 1,8 ml/min.

15 UV-detektering: 254 nm Intern standard: kloramfenikol (Rt = 3,7 min). F) En elementæranalyse der efter at prøven er blevet tørret ved ca. 140*C under en inert atmosfære viser følgende 20 kvalitative sammensætning: kulstof, hydrogen, nitrogen og svovl. G) En Rf-værdipå 0,37 i følgende kromatografiske system: diklormetan/metanol 9:1 (rumfang) under anvendelse af 25 silikagelplader (silikagel 60F254, Merck Co). Synliggørelse: ultraviolet lys ved 254 nm, gul plet med joddampe eller bioautografering under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på et minimalt Davis medium; intern standard: kloramfenikol (Rf = 0,56). 30 H) En FAB-MS analyse som udviser den laveste masseisotop af den protonerede molekylære ion ved m/z 1290,3 ± 0,1 dalton. Alle andre toppe på over 800 m/z masseenheder (bortset fra isotop-toppe) i spektret var under 20% af 35 molekylærionen, ved analyse med et "Kratos" MS-50 dobbelt fokuserende massespektrometer under følgnede forsøgsbetingelser: Xe hurtigt atombombardement ved 6 kV; DK 171026 B1 glycerolmatrix; positiv ioniseringsmåde. I) En aminosyreanalyse af saltsyrehydrolysatet som udviser tilstedeværelse af følgende naturlige aminosyrer: gly-5 cin, (L)-prolin og (L)-serin, under følgende forsøgsbetingelser: Prøven hydrolyseres ved 105*C i 20 timer i nærværelse af 6N HCl indeholdende 1% fenol og derivatiseres derefter i to trin som følger: 10 a) dannelse af n-propylestrene af karboxylsyrefunktio-nerne med 2M HCl i vandfrit propanol (90*C, 1 time) og efterfulgt af tørring under nitrogen; 15 b) omdannelse af de fri aminogrupper til amider med pentafluorpropionsyreanhydrid/vandfrit diklormetan 1:9 (rumfang) ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af tørring under nitrogen; den på denne måde vundne derivatiserede remanens opløses 20 i diklormetan og analyseres ved GC-MS under anvendelse af et HP5985B-system under følgende betingelser: kolonne: en smeltet silika kapillær kolonne coated med chiral n-propionyl-L-valin-t-butylamid-polysiloxan (25 m x 0,2 mm indvendig diameter; C.G·C. ANALYTIC); 25 temperaturprogram: 80*C i 4 minutter, derefter 4*C/min. L) Ioniseringsstudier: Der konstateres ikke nogen ioniserbare funktioner ved titrering med 0,1 N HCl og 0,1 N NaOH i metylcellosolve/ 30 vand; der afsløres en svag basisk funktion ved filtrering med 0,1 N HC104 i et ikke-vandigt medium (eddikesyre ). M) Specifik drejning: 35 [a]020 = +140,8 i absolut ætanol ved en koncentration på ca. 5 g/1. DK 171026 B1

6. Anvendelse af en forbindelse ifølge krav l eller et kompleks ifølge krav 2 til fremstilling af et medikament til anvendelse som antibiotikum.

7. Mikroorganismen Planobispora rosea ATCC 53773.

8. Biologisk ren mikroorganismekultur, kende- 25 tegnet ved at det er en biologisk renkultur af Planobispora rosea ATCC 53773 eller af en GE 2270-pro- ducerende mutant deraf, med undtagelse af Planobispora rosea ATCC 23866, og med evne til at producere antibiotikum GE 2270 faktor A under aerobe gæringsbetingelser i nær- 30 værelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte. 35