DK170477B1 - Mikrobiel hybrid promotor/operator, vektor og udtrykkelsesvektor indeholdende denne, og E. coli stamme transformeret med udtrykkelsesvektoren, kultur af E. coli stammen og fremgangsmåde til mikrobiel produktion af heterologe polypeptider under anvendelse af kulturen - Google Patents

Description

i DK 170477 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte mikrobielle promotor/-operator-systemer, som dirigerer effektiviteten og den styrede produktion af polypeptider ved mikrobiel udtryk-kelse af heterologe gener. Promotor/operatorerne ifølge 5 opfindelsen er hybrider af promotorer, som funktionelt samvirker med E. coli DNA-afhængig RNA-polymerase. De er konstrueret ifølge kendte metoder inden for rekombinant-DNA-teknologien under udnyttelse af den erkendelse, at visse områder af DNA-sekvenserne af forskellige kendte 10 promotorsystemer er ansvarlige for deres karakteristiske fordele under givne betingelser. Disse områder isoleres og genforenes selektivt og funktionelt på en sådan måde, at der tilvejebringes hidtil ukendte hybride promotorer/-operatorer, som samlet udviser nye fordelagtige egenska-15 ber. Således gør opfindelsen det muligt at konstruere hidtil ukendte hybride promotor/operatorer, som er stærkt specifikke, skræddersyet til at opnå optimal effektivitet og styring ved reguleringen af mikrobiel udtrykkelse af heterologe gener.

20

Med fremkomsten af rekombinant-DNA-teknologien er den styrede mikrobielle produktion af en lang række forskellige nyttige polypeptider blevet mulig. Mange pattedyrpo-lypeptider, såsom leukocyt-interferoner, er allerede ble-25 vet produceret af forskellige mikroorganismestammer. Teknologien giver potentielle muligheder for mikrobiel produktion af enorm mængde nyttige polypeptider, idet den bringer den mikrobielt styrede fremstilling af hormoner, enzymer, antistoffer og vacciner mod en række forskellige 30 sygdomme inden for rækkevidde.

Et grundelement i rekombinant-DNA-teknologien er plasmi-det, en ikke-chromosomal løkke af dobbeltstrenget DNA fundet i bakterier, ofte i mange kopier pr. celle. Inklu-35 deret i den information, som er indkodet i plasmid-DNA’en, er den der kræves til at reproducere plasmidet i datterceller (dvs. et "replicon”) og almindeligvis en el- DK 170477 B1 2 ler flere selektionsegenskaber, såsom resistens over for antibiotics, som gør det muligt at genkende kloner af værtscellen indeholdende det pågældende plasmid og dyrke * med fortrin i selektive medier. Anvendeligheden af bakte-5 rielle plasmider ligger i, at de kan spaltes specifikt af ? en eller anden restriktionsendonuclease eller "restriktionsenzym", som hver genkender et forskelligt sted på den plasmidiske DNA. Derefter kan heterologe gener eller genfragmenter indsættes i plasmidet ved ende-mod-ende 10 sammenføjning ved spaltningsstedet eller ved rekonstruerede ender op til spaltningsstedet. (I denne beskrivelse henfører betegnelsen "heterolog" til et gen, som ikke almindeligvis findes i, eller en polypeptidsekvens, som almindeligvis ikke produceres af en given mikroorganisme, 15 medens betegnelsen "homolog" henfører til et gen eller polypeptid som findes i eller produceres af den tilsvarende vild-type-mikroorganisme). DNA-rekombination gennemføres uden for mikroorganismen, og den resulterende "rekombinante" udtrykkelsesvektor eller plasmid kan ind-20 føres i mikroorganismer ved en proces, der kendes som transformation, og store mængder af det heterologe gen-» holdige rekombinant-medium kan opnås ved dyrkning af transformanten. Endvidere kan den resulterende udtrykkelsesvektor, hvor genet er rigtigt indsat med hensyn til 25 dele af plasmidet, som styrer transkriptionen og translationen af det indkodede DNA-budskab, anvendes til faktisk at producere den polypeptidsekvens, for hvilken det indsatte gen koder, en proces, der betegnes som udtrykkelse.

Udtrykkelse startes i et område, der kendes som promoto-30 ren. RNA-polymerase genkender en promotor og bindes til den før starten af transkriptionen. I nogle tilfælde, som ved lac- og trp-systemerne omtalt nedenfor, overlappes promotorområderne af "operator"-områder til dannelse af en kombineret promotor-operator. Operatorer er DNA-sek-35 venser, som genkendes af såkaldte repressorproteiner, der tjener til at regulere hyppigheden af transkriptionsstart i en bestemt promotor. I transkriptionsfasen af udtryk- DK 170477 B1 3 kelsen genkender RNA-polymerasen visse sekvenser i og bindes til promotor-DNA'en. Bindingssamvirkningen frembringer en opvikling af DNA'en i dette område, der blotter DNA'ens meningskodningstreng som skabelon for den 5 startede syntese af budbringer-RNA (mRNA) fra 5'- til 3'-enden af hele DNA-sekvensen. mRNA'en bindes på sin side af ribosomer, hvori det indkodede budskab translateres til et polypeptid med den aminosyresekvens, for hvilken DNA'en koder. Hver aminosyre er indkodet af en unik nu-10 cleotid-triplet eller "codon", og en række codoner udgør tilsammen "strukturgenet", dvs. en del, som koder for aminosyresekvensen af det udtrykte polypeptidprodukt.

Efter binding til promotoren starter RNA-polymerasen 15 først transkriptionen af nucleotider, som koder for et ribosombindingssted, der inkluderer et translationsstartsignal (almindeligvis ATG, som i den resulterende mRNA bliver AUG), og derpå transkriptionen af nucleotidcodo-nerne i strukturgenet selv. Såkaldte stopcodoner tran-20 skriberes ved enden af strukturgenet, hvorefter polymerasen kan danne en yderligere sekvens af mRNA, som på grund af tilstedeværelsen af stopsignalet vil forblive utrans-lateret af ribosomerne.

25 Ribosomer bindes til bindingsstedet på mRNA'en, i bakterier almindeligvis efterhånden som mRNA'en dannes, og dirigerer selv produktionen af det indkodede polypeptid begyndende ved translationsstart-signalet og endende ved det eller de tidligere nævnte stopsignaler. Det ønskede 30 polypeptidprodukt produceres, hvis alle resterende codoner følger startcodonen i fase. Det resulterende produkt kan opnås ved lysering af værtscellen og udvinding af produktet ved passende rensning fra andet bakterieprotein.

Polypeptider udtrykt ved anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi kan være helt heterologe som ved den direkte 35 DK 170477 B1 4 udtrykkelse af humant væksthormon eller kan alternativt bestå af et heterologt polypeptid og, knyttet dertil, mindst en del af aminosyresekvensen af et homologt poly-peptid som ved fremstilling af mellemprodukter for soma-5 tostatin og komponenterne af humant insulin. I de sidstnævnte tilfælde bestod det tilknyttede homologe polypep-tid f.eks. af en del af aminosyresekvensen for Æ-galacto-sidase. I de tilfælde bioinaktiveres det ønskede bioaktive produkt af det tilknyttede homologe polypeptid, indtil 10 dette fraspaltes i et ekstracellulært miljø. Fusionsproteiner som de netop nævnte kan udformes således, at de tillader meget specifik spaltning af forstadieproteinet fra det ønskede produkt som ved indvirkning af cyanbromid på methionin eller alternativt ved enzymatisk spaltning; 15 se f.eks. GB patentskrift nr. 2 007 676.

Hvis rekombinant-DNA-teknologien fuldt ud skal holde, hvad den lover, må der udformes systemer, som optimerer udtrykkeisen af genindsætninger, således at de ønskede 20 polypeptidprodukter kan fremstilles i kontrollerede miljøer i høje udbytter.

Lactose-promotor/operator-systemerne har været almindeligt anvendt, men selv om de er anvendelige, udnytter de 25 ikke fuldt ud teknologiens kapacitet med henblik på udbytte. Imidlertid har de den afgjorte fordel at være meget kontrollerbare, en egenskab, som er meget ønskelig, hvor det drejer sig som mikrobiel gæringsproduktion i stor målestok. Kontrolmekanismen ligger i operatorens 30 virkningsmåde. Når operatoren er i represseret tilstand på grund af bundet repressorprotein, forhindres den DNA-afhængige RNA-polymerase af konkurrencen i at bindes og starte transkription. Således lukkes transkriptionsvejen, og dette blokerer effektivt promotoroperébiliteten. Dette 35 system kan derepresseres ved induktion efterfulgt af tilsætning af en kendt induktor, såsom isopropyl-Æ-D-galac-tosid (IPTG). Induktoren får repressorproteinet til at DK 170477 B1 5 falde bort, således at RNA-polymerasen kan fungere. Således siges disse typer af promotor/operatorer at være "in-ducerbare". Celler transformeret med plasmider, der bærer det såkaldte lac-promotor/operator-system, kan tillades 5 at vokse op til maksimal tæthed, medens promotor/opera-tor-systemet holdes i represseret tilstand, simpelthen ved udeladelse af en induktor, såsom IPTG, i gæringskulturen. Når der er opnået et højt niveau af celletæthed, kan systemet derepresseres ved tilsætning af induktor, og 10 promotoren er derpå fri til at starte transkription, således at der opnås optimal udtrykkelse af genprodukterne i udbytter overensstemmende med promotorstyrken. Trods disse fordele er visse af de inducerbare promotorer, såsom lac-promotor/operator-systemet, imidlertid relativt 15 svage, og produktioner under anvendelse af sådanne promotorer får ikke mikroorganismen til at frembringe maksimalt udbytte.

Som reaktion behovet for mikrobielle udtrykkelsesvekto-20 rer, som er i stand til at producere ønskede polypeptid-produkter i højere udbytte, blev den såkaldte tryptophan-promotor/operator lagt i tøjler og er for tiden udbredt anvendt. Tryptophan-promotor/operator-systemet er et af mange kendte, relativt kraftige systemer - mere end ti 25 gange så stærkt som lac-promotoren. Selv om sådanne systemers styrke er attraktiv til kommerciel produktion, opvejes fordelene ved denne styrke i nogen grad af mindre promotor-kontrol. I mange af disse kraftige systemer er operatoren ikke inducerbar i den ovenfor definerede for-30 stand. I stedet kan den bundne repressor, som lukker af for promotorvejen, ikke fjernes ved induktion. Der blev udformet et andet system, hvorved dæmper-området af tryp-tophan-promotor/operator-systemet blev fjernet, og de med dette system transformerede celler blev opdyrket i nærvær 35 af tryptophanrige medier, se f.eks. EP offentliggørelsesskrifterne nr. 36776 (30. september 1981) og 86548 (24. august 1983). Dette gav tilstrækkeligt tryptophan til i DK 170477 B1 6 hovedsagen fuldstændigt at repressere operatoren, således at cellevækst kunne foregå uinhiberet af for tidlig ud-trykkelse af det ønskede heterologe polypeptidsystem. Når = kulturen nåede passende vækstniveauer, blev der ikke til-5 ført yderligere tryptophan, hvilket resulterede i mild r tryptophan-begrænsning og dermed derepression af promotoren med højeffektiv udtrykkelse af den heterologe indsætning. Hvor udspekuleret det end kan være, har dette system i industriel målestok ikke de raffinerede kontrol-10 egenskaber hos et promotorsystem med en operator, som kan represseres fuldstændigt og derepresseres ved induktion.

I praksis er det f.eks. nødvendigt at holde høje niveauer af tryptophan under opdyrkningsfasen for fuldstændigt at repressere promotoren og at tillade mediet at blive fuld-15 stændigt udtømt for tryptophan efter fuld vækst af kulturen. »

Det er derfor klart, at der har været behov for et mikrobielt promotor/operator-system, som er i stand til stærkt 20 kontrolleret produktion af ønskede polypeptidprodukter i højt udbytte.

Den foreliggende opfindelse afhjælper de problemer, som er forbundet med de hidtidige promotor/operator-systerner, 25 og tilvejebringer på enestående måde hidtil ukendte hybridsystemer, som udviser væsentlige fordele sammenlignet med de kendte systemer. Opfindelsen er yderligere rettet mod en fremgangsmåde til mikrobiel produktion af heterologe polypeptider, dirigeret af de ovennævnte højeffekti-30 ve og kontrollerede promotor/operator-systemer, og dermed forbundne midler. Den er særligt rettet mod anvendelsen af hybride promotor/operator-systemer, som er udformet til at fungere godt ved produktion i stor industriel målestok.

I betragtning af at evolutionen har frembragt aminosyre-sekvenser, f.eks. dem der repræsenteres af forskellige 35 DK 170477 B1 7 promotorer i E. coli, som på enestående måde er tilpasset til det miljø, hvori de findes, og hvorigennem de har udviklet sig med tiden, er det højst uventet> at man ifølge opfindelsen kan tage portioner af forskellige naturlige 5 promotortyper og ligere dem sammen til dannelse af en hybrid promotor, som ikke blot fungerer, men fungerer lige så godt eller bedre end de respektive udgangsmolekyler, uden at der er fundet skadelige virkninger.

10 Ifølge opfindelsen tilvejebringes hidtil ukendte hybride promotor/operator-systemer til anvendelse i udtrykkelses-vektorer udformet til at dirigere produktionen af heterologt polypeptid i en transformant-mikroorganisme. I disse udtrykkelsesvektorer er de hidtil ukendte hybride promo-15 tor/operator-systemer ifølge opfindelsen operabelt for bundet med en heterolog genindsætning, der koder for et heterologt polypeptid, som ikke normalt produceres af den transformerede mikroorganisme, når den er i sin naturlige utransformerede tilstand. Opfindelsen angår endvidere 20 hidtil ukendte vektorer indeholdende en hybrid promo-tor/operator ifølge opfindelsen og hidtil ukendte udtrykkelsesvektorer omfattende en heterolog geninsert, hvis udtrykkelse er under styring af en hybrid promotor/operator ifølge opfindelsen. Desuden angår opfindelsen en 25 Escherichia coli stamme transformeret med en sådan ud-trykkelsesvektor og en kultur af en sådan E. coli stamme, som er i stand til at producere et heterologt polypeptid ved udtrykkelse af et gen, som koder for dette, idet udtrykkeisen dirigeres af en hybrid promotor/operator 30 ifølge opfindelsen, samt en fremgangsmåde til mikrobiel produktion af heterologe polypeptider, som er særegen ved, at en sådan E. coli kultur dyrkes i et egnet næringsmedium, og det dannede heterologe polypeptid udvindes fra blandingen.

Ved anvendelse af konventionel nummerering forekommer det første område af hovedsagelig sekvenshomologi inden for 35 DK 170477 B1 8 givne promotor/operatorer ved omkring -10 nucleotidbasen i DNA-sekvensen. Dette er området for den såkaldte Prib-now-kasse-konsensussekvens, hvis prototypesekvens er TATAATG, hvori det sidste T (thymin) er identisk i alle 5 promotorer, som hidtil er blevet undersøgt. Et andet område med homologi er centreret omkring position -35 på 8 DNA-sekvensen. Denne såkaldte -35 konsensussekvens har en stærkt bevaret trinucleotidsekvens TTG efterfulgt af en mindre strengt bevaret sekvens af en total hexomer, 10 TTGACA, som er del af en strækning på 12 nucleotider, hvori der kan findes yderligere homologier. Det er disse to områder med homologi, som E. coli RNA-polymerasen antages at genkende og funktionelt bindes tættest til. Den overvejende kontakt mellem RNA-polymerase-enzymet og pro-15 motor-DNA'en skaber "åbne" områder, som antages at lette en rigtig genkendelse af det sted, hvor mRNA-dannelse ved transkription skal startes. Dette transkriptionsstarts'ted afmærkes ved konvention som +1 på DNA-sekvensen. Igen synes området mellem Pribnow-kassen og -35 konsensussekven-20 serne, med en længde på fra ca. 15 til ca. 25 nucleotid-baser, ikke at have væsentlige områder med homologi fra en promotor til en anden. Således antages dette område ikke at være væsentligt for funktionel binding af RNA-polymerasen. (Se Hermann Bujard, Trends in Biological 25 Sciences, October 1980, side 274, og Siebenlist, U. et al., Cell 20, 269 (1980)). Ved arbejdet med den foreliggende opfindelse er det opdaget, at dette område, hvad sekvens angår, måske heller ikke er væsentligt med hensyn til signalstyrke og operatorfunktion.

30

De hidtil ukendte hybride promotor/operator-systemer ifølge opfindelsen er i stand til at dirigere E. coli DNA-afhængig RNA-polymerase-transkription af et rekombi-nant DNA-fragment anbragt neden for dem og er særegne 35 ved, at de omfatter DK 170477 B1 9 a) en promotor/operator-sekvens, som kan derepresseres ved induktion og udviser en første promotorstyrke, og operabelt anbragt oven for denne, 5 b) et fragment omfattende -35 konsensussekvensen og det 5'-flankerende område af en anden promotor med en større promotorstyrke, hvilke elementer (a) og (b) er kovalent sammenføjet mel-10 lem den nævnte -35 konsensussekvens og Pribnow-kassen i • den nævnte promotor/operator-sekvens.

Således spaltes en første E. coli DNA-afhængig-RNA-poly-merase-samvirkende promotor indeholdende en operator, som 15 er i stand til at derepresseres ved induktion, ved et punkt mellem, dens Pribnow-kasse- og -35 konsensussekven-ser. En anden E. coli DNA-afhængig-RNA-polymerase-samvir-kende promotor med en større promotorstyrke end den første spaltes på lignende måde. I foretrukne udførelsesfor-20 mer ligger spaltningsområderne mellem nucleotidbaseparre-ne -10 og -35. De spaltede DNA-sekvenser ligeres derpå ved kendte metoder.

Fortrinsvis udvælges restriktionsstederne således, at der 25 frembringes komplementære ender, som tillader bekvem en-de-mod-ende ligering. Alternativt kan sammenbinding frembringes efter indførelse af komplementære restriktionssteder på de to sekvenser ved rekonstruktion af enderne op til spaltningsstederne, fortrinsvis under anvendelse 30 af syntetisk afledte linkernucleotider. I en udførelsesform-kan de to DNA-sekvenser, som har ikke-komplementære restriktionssteder, ligeres til en syntetisk insert, der er specifikt fremstillet til at passe med de to DNA-se-kvensers respektive restriktionssteder. Denne insert 35 kan på sin side også indeholde forskellige unikke restriktionssteder, som muliggør udskæring af dele, når man ønsker at opnå promotorer med forskellige afstande mellem DK 170477 B1 10

Pribnow-kasse- og -35 konsensussekvenserne.

I de foretrukne udførelsesformer udvælges eller konstrue- res restriktionsstederne således, at den resulterende hy-5 bride promotor/operator vil have et DNA-område mellem dens Pribnow-kasse- og -35 konsensussekvenser, som er tilnærmelsesvis af samme længde som de tilsvarende områder i udgangspromotorerne.

10 De hybride promotor/operator-systemer ifølge opfindelsen indeholder en sekvens af dobbeltstrenget DNA, som i rækkefølge omfatter nucleotidbaser svarende til en inducer-bar operator, transkriptionsstartsted og Pribnow-kasse-konsensussekvens forbundet via en sekvens af nucleotider 15 dannet ved DNA-rekombination med en sekvens af nucleotid-“ baser af en -35 konsensussekvens og det 5'-flankerende område deraf. Operatorens og startstedets baser er afledt fra eller modelleret efter en promotor/operator med en , inducerbar operator, som defineret i denne beskrivelse, 20 og baserne af -35 konsensussekvensen og det 51-flankerende område er afledt fra eller modelleret efter en promotor med en større promotorstyrke end den nævnte promotor/operator. Linkersekvensen- dannet ved DNA-rekombina-tion er enten afledt fra komplementær ligering af de 25 spaltede sekvenser fra udgangspromotorerne eller er syntetisk fremstillet, eventuelt sammen med de tilsvarende nedenfor og ovenfor beliggende DNA-sekvenser som beskrevet ovenfor. Hvor der anvendes rekonstruktion til at frembringe komplementære ender, repareres Pribnow-kasse-30 og/eller -35 konsensussekvenserne i hvert fald fortrinsvis således, at den oprindelige homologi genoprettes optimalt.

en udførelsesform tilvejebringer opfindelsen nucleotid-35 sekvenser nedad fra omkring Pribnow-kasse-sekvensen, som er modelleret efter sekvenser svarende til sekvenserne af en promotor/operator med en inducerbar operator. Således DK 170477 B1 11 kan der anvendes syntetisk afledt DNA til at tilvejebringe et eller andet fragment ved fremstillingen af de her omhandlede hybride promotorer. F.eks. kan syntetiske eller naturlige sekvenser af en promotors -35 konsensus-5 sekvens således passende sammenføjes f.eks. ved omkring Pribnow-kasse-området med syntetiske eller naturlige sekvenser af en given anden inducerbar promotor eller med et eller flere syntetiske DNA-fragmenter omfattende en operator, Shine-Dalgarno-sekvens og transkriptionsstart-10 sted svarende til en given anden inducerbar promotor.

Igen kan DNA-fragmentet også indeholde forskellige unikke restriktionssteder, som letter dets ligering med -35 sekvensfragmentet og translationsstartcodonen og den heterologe gensekvens anbragt neden for dette. Endvidere 15 kan et sådant DNA-fragment også indeholde unikke restriktionssteder, der omgiver Shine-Dalgarno-sekvensen og muliggør dens flytbarhed og dermed udskiftelighed.

De hybride promotor/operatorer ifølge opfindelsen er, når 20 de anvendes i udtrykkelsesvektorer operabelt forbundet med nucleotider, der koder for translationsstarten, og strukturgenet, der koder for aminosyresekvensen af det ønskede heterologe polypeptid.

25 Promotorer, som har en operator, der er i stand til at derepresseres ved induktion, inkluderer: lac, XPR, APL, gal P2, ara BAD, ara C, tet, str, spe, rpoB, Lll og gal Pi; se Siebenlist, U. et al., ovenfor. Promotorer, der udviser relativt høje promotorstyrker, inkluderer: trp, 30 rrn familien, tRNA familien, T^A,j, T7Ai' λΡΚ/ λΡΐι, str, spe, tufA, rpoB og tufB; se Siebenlist, U. et al., ovenfor.

Faktorer, som antages at medvirke til relativ styrke af 35 promotorer, inkluderer sammensætning og sekvensintegritet af Pribnow-kasse- og -35 konsensussekvenser, afstanden mellem Pribnow-kasse- og -35 konsensussekvenser og sam- DK 170477 B1 12 mensætningen af det 5’-flankerende område oven for -35 konsensussekvensen, især i området i og omkring -40 nu-cleotidbasen. Hos stærke promotorer indeholder dette område af DNA-sekvensen yderst A/T-rige områder med klynger 5 af A/T- og T/A-basepar. Det har vist sig, at et signalsignifikant område, som er ansvarligt for høj styrke af en given promotor, er området opad fra -35 promotorkon-sensussekvensen. Det har også vist sig, at promotorer af den første kategori, som er inducerbare ved derepression, 10 ikke påvirkes særligt med hensyn til denne egenskab af DNA-sammensætningen opad fra omkring Pribnow-kasse-kon-sensus-sekvensen.

Området mellem Pribnow-kasse- og -35 konsensussekvenserne 15 kan indeholde naturligt forekommende restriktionsendonu-clease-spaltningssteder. Ved fremstilling af de hybride promotor/operatorer ifølge opfindelsen drages der fordele af sådanne steder til dannelse af fragmenter, som kan ligeres med tilsvarende fragmenter fra andre promotorer.

20 F.eks. hvor der findes et fælles restriktionsendonucle-ase-spaltningssted i to egnede donorpromotorer opnås spaltning og efterfølgende passende ligering således let under bevarelse af funktionel i-fase-sekvensfølge. Hvis der findes endonuclease-spaltningssteder, som ikke er 25 identiske, kan der drages fordel af de kendte spaltningsmønstre og efterfølgende ligering. Dette ligger alment inden for fagmandens kunnen.

De foretrukne udførelsesformer af opfindelsen indebærer 30 anvendelse af et antal almindeligt tilgængelige restrik-tionsendonucleaser, der herefter vises som eksempler med deres tilsvarende genkendelsessekvenser og (angivet ved pil) spaltningsmønstre.

35 DK 170477 B1 13 i 1

Xbal: TCTAGA Taql: TCGA

AGATCT AGCT

t f J· - l

EcoRI: GAATTC Hindlll: AAGCTT

CTTAAG TTCGAA

i f

Bglll: AGATCT Hpal: GTTAAC

TCTAGA CAATTG

t f i l

PvuII GAGCTG PstI: CTGCAG

η n GTCGAC GACGTC

10 , t f

BamHI: (&ATCC

CCTAGG

t 15

Hvor spaltningspunkterne er adskilt fra hinanden på de respektive strenge, vil de spaltede ender være "klistrende", dvs. i stand til at smelte sammen igen eller at 20 smelte sammen med en anden DNA med komplementært "klistrende" ende ved Watson-Crick-baseparring (A til T og G til C) på tap- og -hulmåde. Nogle restriktionsenzymer, såsom Hpal og PvuII ovenfor, spalter til dannelse af "stumpe" ender. De ovenstående nucleotidsekvenser er re-25 præsenteret i overensstemmelse med den konvention, der anvendes hele vejen igennem: Den øvre streng er proteinkodningsstrengen, og når man går fra venstre til højre på den streng, bevæger man sig fra 5'- til 3'-enden deraf, dvs. i transkriptionsretningen fra et "proximalt" til et 30 "distalt" punkt.

I tilfælde af at de bestemte promotor/operator-udgangsma-terialer ikke indeholder nogen eller ikke nogen fordelagtige restriktionsendonuclease-spaltningssteder, kan den 35 dobbeltstrengede DNA ved en metode, som er nyttig til spaltning, behandles ved ethvert specifikt ønsket sted.

Ved denne metode omdannes den dobbeltstrengede DNA til DK 170477 B1 14 enkeltstrenget DNA i det område, der angiver det påtænkte spaltningspunkt, f.eks. ved reaktion med exonuclease. En syntetisk eller anden enkeltstrenget DNA-primer hybridi-seres derpå til den tidligere dannede enkeltstrenglængde 5 ved Watson-Crick-baseparring, idet primeren er således, at det sikres, at dens 5’-ende vil være coterminal med nucleotidet på den første streng lige før det påtænkte spaltningspunkt. Primeren udvides derpå i 3’-præpareringsretningen ved reaktion med DNA-polymerase og gen-10 skaber den del af den oprindelige dobbeltstrengede DNA før den påtænkte spaltning, som gik tabt i det første trin. Samtidig med eller derefter nedbrydes den del af den første streng, som ligger udover det påtænkte spaltningspunkt. I den mest foretrukne udførelsesform gennem-15 føres primer-udvidelses- og enkeltstrengsnedbrydnings-. trinnene samtidigt ved anvendelse af en polymerase, som samtidig nedbryder den udragende enkeltstrengede ende i 3' - til 5 ’ -retningen og udvider primeren i 5' - til 3' -retningen. Det foretrukne materiale til dette formål er 20 Klenow Polymerase I, dvs. det fragment opnået ved proteo-- lytisk spaltning af DNA-polymerase I, som indeholder ud gangsenzymets 5'- til 3'-polymeriserende aktivitet og 3f-til 5'- exonucleolytiske aktivitet, men mangler dets 5'-til 3'- exonucleolytiske aktivitet; se A. Kornberg, DNA 25 Synthesis, 98, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1974).

Ligeringen af de fragmenter, der er dannet ved en sådan spaltning eller ved spaltning ved et restriktionsendo-30 nuclease-spaltningssted, kan frembringes f.eks. ved stump-ende-ligering eller andre metoder, som er nærliggende for fagmanden.

Mikroorganismer, som ved kendte metoder er transformeret 35 med udtrykkelsesvektorer indeholdende de her omhandlede hybride promotor/operator-systerner, kan opdyrkes til niveauer passende for industriel produktion af polypeptidet DK 170477 B1 15 med promotor/operatoren i represseret tilstand. Efter at der er opnået i hovedsagen fuld vækst, tilføres en induk-tor fra en ydre kilde, og i overensstemmelse hermed dere-presseres operatoren, og der sker højeffektiv udtrykkelse 5 af den heterologe insert. På denne måde dræbes cellerne aldrig tidligt i det tilfælde, at det producerede heterologe polypeptid er dødeligt for cellen, og endvidere giver cellekulturen maksimal produktion af det heterologe polypeptid som følge af, at den er i eller nær ved dens 10 maksimale væksttilstand. På denne måde tilvejebringes en strengt kontrolleret og effektivt udtrykkelsesvektor, som er særlig nyttig til produktion af de høje niveauer af heterologe polypeptider, som kræves af nutidens højt raffinerede rekombinant-DNA-teknologi.

15

Alle mikroorganismestammer, som anvendes ved den direkte udtrykkelse af det hybride promotor/operator-system ifølge opfindelsen, er E. coli stammer, som udnytter den E. coli DNA-afhængige RNA-polymerase (enzym nr. E. C.

20 2.7.7.6). Opfindelsen er i dens mest foretrukne udførel sesform beskrevet med hensyn til E. coli stamme D 1210, men det er underforstået, at der kan anvendes andre kendte E. coli arter, såsom E. coli B, E. coli K-12 og andre E. coli stammer, f.eks. E. coli K-12 294 (ATCC-Acces-25 sionsnr. 31446), E. coli K-12 RR1 (ATCC Accessionsnr.

31343), E. coli K-12 X1776 (ATCC Accessionsnr. 31537) og E. coli RV308 (ATTC Accessionsnr. 31608). Mange af disse er deponeret og (potentielt) tilgængelige fra anerkendte mikroorganismedeponeringsinstitutioner, såsom the Ameri-30 can Type Culture Collection (ATTC) jvf. ATCC katalog listen? se også DE offentliggørelsesskrift nr. 2 644 432.

Som nævnt foretrækkes især E. coli stamme D 1210, som har følgende morfologiske egenskaber: lac+, iq, o+, y+, thi”, leu”, pro”, gal”, strr, B^”, recA-, r”, mB”. En prøve 35 af denne mikroorganisme, som har inkorporeret et insulin-B-gen, er blevet deponeret (ATCC accessionsnr. 31449).

DK 170477 B1 16

Kort beskrivelse af tegningerne

Fig. 1 viser konstruktionen af plasmid pHGH107-ll, som anvendes i den konstruktion, som er vist i fig. 2.

5

Fig. 2 viser oprindelsen til DNA-fragmenter afledt fra henholdsvis trp- og lac-promotorholdige plasmider, som blev anvendt til at konstruere et plasmid indeholdende en hybrid promotor/operator ifølge opfindelsen operabelt 10 forbundet med strukturgenet, der koder for humant væksthormon (HGH), nemlig pHGH807-tacI. Den hybride promotor/-operator er en sammenføjning af en sekvens oven for position -22 af trp-promotoren med en sekvens neden for position -19 af lac-promotor/operatoren. Den sorte kasse vist 15 i P lac området, er Pribnow-kasse-sekvensen. Sammenføj-ningspunktet er angivet ved den takkede linie. Det resulterende plasmid bærer ampicillin- og tetracyclin-resis-tens-gener. Transkriptionsretningen er angivet ved pilen.

20 Fig. 3 viser DNA-sekvenserne af trp-promotoren, lacUV5 promotoren og to hybride tac-promotor/operatorer, hvis konstruktion er belyst i fig. 2 og er beskrevet mere detaljeret nedenfor. DNA-sekvenserne af trp- og lac-promo-torerne er kendte, jvf. Siebenlist et al., ovenfor. DNA-25 sekvenserne af tac-promotorerne blev bestemt ved anvendelse af dideoxy-sekvensbestemmelsesmetoden under anvendelse af denatureret plasmid-DNA, hvortil der blev føjet et syntetisk enkeltstrenget DNA-fragment, som passede til -40 området af trp-promotoren. Der er sat en streg over 30 Shine-Dalgarno- og startcodonen af HGH-genet. Promotorernes Pribnow-kasser og -35 sekvenser er understreget. Operatorsekvenserne er angivet med stiplede linier. Udgangs-nucleotiderne er angivet ved +1. De relevante restriktionssteder Tagl og Hpall er angivet ved pile. I tilfælde 35 af tac-promotorerne er sammenføjningerne mellem "trp"- og "lac"-sekvenserne angivet med dobbelte pile. Nucleotid-afstanden mellem -35 konsensussekvensen og Pribnow-kassen DK 170477 B1 17 er 17 bp for Ptrp, 18 bp for Ptac, 16 bp for Ptac I og 17 bp for Ptac II.

Fig. 4 viser fremstillingen af humant væksthormon (HGH) 5 promoteret af den hybride promotor/operator, hvis konstruktion er vist i fig. 2. Friske kulturer af E. coli D1210/pHGH807-tacI og E. coli D1210/pHGH 107-11 (fremstillet ved standardtransformationsprocedurer), dyrket natten over, blev anvendt til at pode 50 ml LB-ampicillin 10 (20 ug/ml) til en celletæthed på 0,03 (0D,-(-q). Efter en time blev den første prøve udtaget (t = 0 min). Induktion af tac-promotoren i blev udført ved tilsætning af 1,0 mM IPTG ved t * 80 min (vist ved pil). HGH-niveauer blev bestemt ved en radioimmunoprøvning. Symboler ·-· : 15 D1210/pHGH107-ll (enkelt lac-promotor); - ·:

Di2iq/pHGH807- tacl (enkelt tac-promotor). Produktion af HGH under anvendelse af den hybride pHGH907tacII promotor/operator ifølge opfindelsen er i det væsentlige identisk med de niveauer, der opnås under anvendelse af 20 pHGH807tacI promotor/operatoren, som vist i denne figur. Ligeledes er produktionen af HGH under anvendelse af den hybride Prac5-16 promotor/operator ifølge opfindelsen af samme størrelse som de niveauer, der opnås under anvendelse af Ptac promotor/operatoren, som vist i fig. 4 (da-25 ta ikke vist).

Fig. 5 og 6 viser konstruktionen af udtrykkelsesplasmidet pHGH-Prac5-16, opnået ud fra pHGH-Prrnlac, som har inkorporeret en hybrid promotor/operator ifølge opfindelsen: 30 En sekvens opad fra position -28 i rrn-promotoren og en sekvens nedad fra position -19 af lac-promotor/operato-ren, sammenbundet via en syntetisk afledt DNA-sekvens.

Fig. 7 viser konstruktionen af plasmidet pHGH907tacII, 35 som har inkorporeret en hybrid promotor/operator ifølge opfindelsen: En sekvens nedad fra position -10 i lac-pro-motor/operatoren og en sekvens opad fra position -12 af DK 170477 B1 18 trp-promotor/operatoren. Dette plasmid indeholder også en flytbar Shine-Dalgarno-sekvens.

Fig. 8 viser DNA-sekvenser af de hybride promotorer Lac-5 UV5, rrnB, den forkortede (Prrn-lacI), den forlængede (Prrn-lacII) og den aktiverede (rac5-16). Der er sat en streg over henholdsvis -35 sekvensen og Pribnow-kasse-sekvensen. Den syntetiske insert i Prrn-lacII er understreget. Transkriptionsstartstedet i Plac og Prrn eller 10 nucleotidet svarende til det startsted i tilfælde af

Prrn-lacI, Prrn-lacII og Prac5-16 er angivet.

1. Konstruktion af pHGH 207-1 15 Plasmidet pGMl bærer E. coli tryptophan-operonet indeholdende deletionen LE1413 (G.F. Miozzari, et al., (1978) J. Bacteriology 1457-1466) og udtrykker derfor et fusionsprotein omfattende de 6 aminosyrer af trp-lederen og tilnærmelsesvis den sidste trediedel af trp-E-polypeptidet 20 (herefter i sammensætning betegnet som LE') såvel som trp-D-polypeptidet i dets helhed, alle under styring af trp-promotor/operator-systemet. Plasmidet, 20 ug, blev nedbrudt med restriktionsenzymet PvuII, som spalter plasmidet ved 5 steder. Genfragmenterne blev dernæst kombine-25 ret med EcoRI-linkere (bestående af et selvkomplementært oligonucleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG), hvorved der tilvejebragtes et EcoRI-spaltningssted for en senere kloning ind i et plasmid indeholdende et EcoRI-sted. De 20 ug DNA-fragmenter opnået ud fra pGMl blev behandlet med 30 10 enheder T^-DNA-ligase i nærvær af 200 picomol af det 5'-phosphorylerede syntetiske oligonucleotid pCATGAATTCATG og i 20 μΐ T^-DNA-ligase-puffer (20 mM "tris", pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM MgC^, 5 mM dithio-threitol) ved 4 °C natten over. Opløsningen blev derpå 35 opvarmet i 10 minutter til 70 °C for at inaktivere ligasen. Linkerne blev spaltet ved EcoRI-nedbrydning, og fragmenterne, nu med EcoRI-ender, blev adskilt ved anven- DK 170477 B1 19 delse af polyacrylamidgel-elektroforese (i det følgende betegnet "PAGE"), og de 3 største fragmenter blev isoleret fra gelen ved først at farve denne med ethidiumbro-mid, lokalisere fragmenterne med ultraviolet lys og ud-5 skære portionerne af interesse fra gelen. Hvert gelfragment, med 300 ul 0,1 x TBE, blev anbragt i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 V i en time i 0,1 x TBE-puffer (TBE-puffer indeholder: 10,8 g "tris"-base, 5,5 g borsyre, 0,09 g Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige 10 opløsning blev opsamlet fra dialyseposen, ekstraheret med phenol, ekstraheret med chloroform og gjort 0,2 M med hensyn til natriumchlorid, og DNA'en udvundet i vand efter ethanolfældning. (Alle DNA-fragment-isoleringer beskrevet i det følgende gennemføres under anvendelse af 15 PAGE efterfulgt af den netop omtalte elektroeluerings-metode). Det trp-promotor/operator-holdige gen med EcoRI-klistrende ender blev identificeret ved den herefter beskrevne procedure, som indebærer indsætning af fragmenter i et tetracyclin-følsomt plasmid, som efter promotor/ope-20 rator-indsætning bliver tetracyclin-resistent.

Plasmidet pBRHl, (R.I. Rodrigez et al., Nucleic Acids

Research 6, 3267-3287 [1979] udtrykker ampicillinresis-tens og indeholder genet for tetracyclin-resistens, men 25 udtrykker ikke den resistens, da der ikke er nogen dermed forbundet promotor. En med plasmidet transformeret mikroorganisme er derfor tetracyclin-følsom. Ved indførelse af et promotor/operator-system i EcoRl-stedet kan plasmidet bringes til at udtrykke tetracyclin-resistens.

30 pBRHl blev nedbrudt med EcoRI, og enzymet fjernet ved phenol/CHCl^-ekstraktion efterfulgt af chloroformekstrak-tion og DNA'en udvundet i vand efter ethanolfældning. Det resulterende DNA-molekyle blev i adskilte reaktionsblan-35 dinger kombineret med hvert af de 3 DNA-fragmenter opnået som beskrevet oven for og ligeret med T^-DNA-ligase som tidligere beskrevet. Den i reaktionsblandingen tilstede- DK 170477 B1 20 værende DNA blev anvendt til at transformere kompetent E. coli K-12 stamme 294 (K. Backman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 73, 4174-4198 (1976) (ATCC nr. 31446) ved standardteknik (V. Hershfield et al., Proc. Nat'l Acad.

5 Sci. USA 71, 3455-3459 (1974), og bakterierne blev udsået på LB-plader indeholdende 20 ug/ml ampicillin og 5 ug/ml tetracyclin. Flere tetracyclinresistente kolonier blev udvalgt, plasmid-DNA isoleret, og tilstedeværelsen af det ønskede fragment bekræftet ved restriktionsenzymanalyse.

10 Det resulterende plasmid, betegnet pBRHtrp, udtrykket 0-lactamase, som giver ampicillin-resistens, og det indeholder et DNA-fragment, som inkluderer trp-promotor/ope-ratoren og koder på et første protein omfattende en sammensmeltning af de første 6 aminosyrer af trp-lederen 15 og tilnærmelsesvis den sidste trediedel af trp-E-polypep-. tidet (dette polypeptid betegnes LE') og et andet protein svarende tilnærmelsesvis til den første halvdel af trp-D-polypeptidet (dette polypeptid betegnes D') og et tredie protein, som der kodes for af tetracyclinresistensgenet.

20 pBRHtrp blev nedbrudt med EcoRI-restrlktionsenzym, og det resultende fragment blev isoleret ved PAGE og elektroelu- ering. EcoRI-nedbrudt plasmid pSom 11 (K. Itakura et al..

Science 198, 1056 (1977); GB-A-2 007 676) blev kombineret 25 med dette fragment 1. Blandingen blev ligeret med T^-DNA-

ligase som tidligere beskrevet, og den resulterende DNA

transformeret ind i E. coli K-12 stamme 294 som tidligere beskrevet. Transformantbakterier blev udvalgt på ampicil- linholdige plader. Resulterende ampicillinresistente ko- 30 lonier blev screenet ved kolonihybridisering (M.

Gruenstein et al., Proc, Nat'l Acad. Sci. USA 72, 3951- 3965 [1975] under anvendelse som sonde af det fra pBRHtrp isolerede trp-promotor/operator-holdige fragment 1, som 32 var blevet radioaktivt mærket med P. Flere kolonier, 35 som viste sig positive ved kolonihybridisering blev udvalgt, plasmid-DNA blev isoleret, og orienteringen af de indsatte fragmenter bestemt ved restriktionsanalyse DK 170477 B1 21 under anvendelse af restriktionsenzymerne Bglll og BamHI i dobbeltnedbrydning. E. coli 294 indeholdende plasmidet betegnet pSom7A2, som har trp-promotor/operator fragmentet i den ønskede orientering, blev dyrket i LB-5 medium indeholdende 10 ag/ml ampicillin. Cellerne blev dyrket til optisk tæthed 1 (ved 550 nm) opsamlet ved centrifugering og gensuspenderet i M9-medier i 10 ganges fortynding. Celler blev dyrket i 2-3 timer, igen til optisk tæthed 1, derpå lyseret, og det totale cellulære 10 protein analyseret ved SDS (natriumdodecylsulfat) område (15%) PAGE (J.V. Maizel Jr. et al., Meth Viral 5, 180-246 (1971)).

Plasmidet pSom7A2, 10 ag, blev spaltet med EcoRI, og DNA-15 fragmentet 1 indeholdende de tryptophangenetiske elementer blev isoleret ved PAGE og elektroeluering. Dette fragment, 2 ag, blev nedbrudt med restriktionsendonuclea-se Taq I, 2 enheder, 10 minutter ved 37 °C, således at i gennemsnit kun et af de tilnærmelsesvis fem Taq I steder 20 i hvert molekyle blev spaltet. Denne delvis nedbrudte blanding af fragmenter blev adskilt ved PAGE, og et fragment 2 på tilnærmelsesvis 300 basepar, som indeholdt en EcoRI-ende og en Taq I ende, blev isoleret ved elektroeluering. Det tilsvarende Taq I sted er lokaliseret mel-25 lem transkriptionsstart- og translationsstartstederne og er 5 nucleotider opad fra ATG-codonen i trp-lederpepti- det. Ved at gå frem som beskrevet kunne der isoleres et fragment indeholdende alle kontrolelementer i trp-operon-et, dvs. promotor/operator-system, transkriptionsstart-30 signal og en del af trp-leder-ribosombindingsstedet.

Taq I resten ved 31-enden af det resulterende fragment op til translationsstartsignalet for trp-ledersekvensen blev derpå omdannet til et Xbal-sted. Dette blev gjort ved li-35 gering af det oven for opnåede fragment 2 til et plasmid indeholdende et enkelt EcoRI-sted og et enkelt Xbal-sted.

Til dette formål kan man anvende i hovedsagen ethvert DK 170477 B1 22 plasmid, som i rækkefølge indeholder et replicon, en se-lekterbar markør, såsom antibioticumresistens, og EcoRI-, Xbal- og BamHI-steder. Således kan f.eks. et Xbal-sted indføres mellem EcoRI- og BamHI-stederne i pBR322 (F. Bo-5 livar et al.. Gene 2, 95-119 [1977]) f.eks. ved spaltning af plasmidets enkelte Hindlll-sted med Hindlll efterfulgt af enkeltstreng-specifik nucleasenedbrydning af de resulterende klistrende ender og stump-ende-ligering af et selvtilhæftende dobbeltstrenget syntetisk nucleotid inde-10 holdende genkendelsesstedet, såsom CCTCTAGAGG. Alternativt kan der anvendes naturligt afledte DNA-fragmenter, som det blev gjort i det foreliggende tilfælde, der indeholder et enkelt Xbal-sted mellem EcoRI- og BamHI-spalt-ningsresterne. Således blev et EcoRI- og BamHI-nedbryd-15 ningsprodukt af det virale genom af hepatitis B opnået ved konventionelle midler og klonet ind i EcoRI- og BamHI-stederne af plasmid pGH6 (D.V. Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979])) til dannelse af plasmidet pHS32.

- Plasmid pHS32 blev spaltet med Xbal, phenolekstraheret, 20 chloroformekstraheret og ethanolfældet. Det blev derpå behandlet med 1 vi E. coli polymerase I Klenow-fragment (Boehringer-Mannheim) i 30 al polymerase-puffer (50 mM kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mM MgC^, 1 mM Æ-mercaptoetha-nol) indeholdende 0,1 mM dTTP og 0,1 mM dCTP i 30 minut-25 ter ved 0 °C og derpå i 2 timer ved 37 °C. Denne behandling for 2 af de 4 nucleotider komplementære til den 5'-udragende ende af Xbal-spaltningsstedet til at fyldes ind: 30 5' CTAGA- ^ 5' CTAGA- 31 T_ ^ 3 · TCT-

Der blev inkorporeret to nucleotider, dC og dT, til dan-35 nelse af en ende med to 5'-udragende nucleotider. Denne lineære rest af plasmid pHS32 (efter phenol- og chloro-form-ekstraktion og udvinding i vand efter ethanolfæld- DK 170477 B1 23 ning) blev spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragment blev adskilt fra det mindre EcoRI-Xbal-fragment ved PAGE og isoleret efter elektroeluering. Dette DNA-fragment fra pHS32 (0,2 ug) blev under lignende betingelser som be-5 skrevet oven for ligeret til EcoRI-Taq I-fragmentet af tryptophan-operonet (0,01 ug). Ved denne fremgangsmåde ligeres den Taq I-udragende ende til den resterende Xbal-udragende ende, selv om den ikke Watson-Crick-baseparres fuldstændigt: 10 T + CTAGA- - -TCTAGA- -AGC TCT- -AGCTCT-

En portion af denne ligeringsreaktionsblanding blev transformeret ind i E. coli 294 celler som i afsnit I 15 ovenfor, varmebehandlet og udsået på LB-plader indeholdende ampicillin. 24 kolonier blev selekteret, dyrket i 3 . ml LB-medier, og plasmidet isoleret. 6 af disse fandtes at have Xbal-stedet regenereret via E. coli katalyseret DNA-reparation og replicering: 20 -TCTAGA- -TCTAGA- - -AGCTCT- -AGATCT-

Disse plasmider fandtes også at spaltes både med EcoRI og 25 Hpal og at give de forventede restriktionsfragmenter. Et plasmid 14, betegnet pTrpl4, blev anvendt til udtrykkelse af heterologe polypeptider som omtalt herefter.

Plasmidet pHG 107 (D.V. Goeddel et al., Nature, 281, 544, 30 1979) indeholder et gen for humant væksthormon bestående af 23 aminosyrecodoner produceret ud fra syntetiske DNA-fragmenter og 163 aminosyrecodoner opnået ud fra.komplementær DNA produceret via revers transkription af HGH-mRNA.

Selv om dette gen, 3, mangler codonerne af "præ"-sekvensen af humant væksthormon, indeholder det en ATG transla- 35 DK 170477 B1 24 tionsstart-codon. Genet blev isoleret fra 10 μ g pHGH107 efter behandling med EcoRI efterfulgt af E. coli polymerase I, Klenow-fragment, og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Efter phenol- og chloroform-ekstraktion og 5 ethanolfældning blev plasmidet behandlet med BamHI.

Fragmentet 3 indeholdende HGH-genet blev isoleret ved PAGE efterfulgt af elektroeluering. Det resulterende DNA-fragment indeholder også de første 350 nucleotider af 10 tetracyclinresistens-strukturgenet, men mangler tetra-cyolinpromotor/operator-systemet, således at når det derefter klones ind i et udtrykkelsesplasmid, kan plasmider indeholdende inserten lokaliseres ved genoprettelsen af tetracyclin-resistensen. På grund af at EcoRI-enden af 15 fragmentet 3 er blevet fyldt ud ved Klenow-polymerase I-proceduren, har fragmentet en stump og en kohæsiv ende, hvilket sikrer rigtig orientering, når det senere indsættes i et udtrykkelsesplasmid.

20 Udtrykkelsesplasmidet pTrpl4 blev derpå præpareret til at modtage det ovenfor fremstillede HGH-gen-holdige fragment. Således blev pTrpl4 nedbrudt med Xbai, og de resulterende kohæsive ender fyldt ud ved Klenow-polymerase I-proceduren under anvendelse af dATP, dTTP, dGTP og dDTP.

25 Efter phenol- og chloroform-ekstraktion og ethanolfæld-ning blev den resulterende DNA-behandlet med BamHI, og det resulterende store plasmid-fragment isoleret ved PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-afledte fragment havde en stump og en kohæsiv ende, hvilket tillod rekombination i 30 rigtig orientering med det tidligere beskrevne HGH-gen-holdige fragment 3.

HGH-gen-fragmentet 3 og pTrpl4-Xba-BamHI-fragmentet blev kombineret og ligeret sammen under betingelser svarende 35 til dem der er beskrevet ovenfor. De udfyldte Xbai- og EcoRI-ender blev ligeret sammen ved stump-ende-ligering til gendannelse af både Xbai- og EcoRI-stedet: DK 170477 Bl 25

Xbal fyldt ud EcoRI fyldt ud HGH-gen-start _TCTAG + AATTCTATG_ _T|CTAGIAATTCTATG_ , AGATC TTAAGATACJZ ^ AGATc|t T AA GAT AC_

Xbal EcoRI 5

Denne konstruktion genskaber også tetracyclinresistens-genet. Eftersom plasmidet pHGH107 udtrykker tetracyclin-resistens fra en promotor, der ligger oven for HGH-genet (lac-promotoren), tillader denne konstruktion, betegnet 10 pHGH207, udtrykkelse af genet for tetracyclinresistens under kontrol af tryptophan-promotor/operatoren. Således blev ligeringsblandingen transformeret ind i E. coli 294, og kolonier blev selekteret på LB-plader indeholdende 5 »ig/ml tetracyclin.

15 A. Konstruktion af pHGH107-ll

Plasmid pHGH107-ll blev afledt fra pHGHl07, et plasmid som er beskrevet tidligere (Goeddel et al., 1979, Nature 20 281, 544-548). Begge plasmider er afledt fra pBR322 og har genet for HGH indsat som beskrevet (se fig. 1). pHGH107-ll har en enkelt lac-promotor føjet til HGH-genet, medens pHGH107 har 2 lac-promotorer adskilt af et heterologt stykke DNA. Til opnåelse af pHGH107-ll isole-25 redes et EcoRI-Alul-DNA-fragment på 105 bp under anvendelse af 6% polyacrylamidgeler. Til dette fragment, som har én stump ende, ligeredes under anvendelse af T4~poly-nucleotid-ligase en EcoRI-linker med den følgende sekvens : 30

EcoRI

5'-CGCGAATTCGCG 3'-GCGTTAAGCGC

35 Dette ligerede materiale blev derpå behandlet med EcoRI, som spalter i midten af linkeren og også spalter concate-mere af DNA-fragmentet kovalent bundet igennem det oprin DK 170477 B1 26 delige EcoRI-sted. Blandingen adskilles på en 12% poly-acrylamidgel, og et fragment, hvis størrelse er lidt forøget, fra 105 bp til 110 bp, ekstraheres og ethanol-fæl- des. Dette fragment har nu EcoRI-kohæsive ender på hver 5 ende og er let at indsætte i en vektor afledt fra pHGH 207-1.

Plasmid pHGH 207-1, som har en enkelt trp-promotor, er blevet opnået ved fjernelse af den dobbelte lac-promotor 10 fra pHGH 207, som har en dobbelt lac-promotor efterfulgt af en enkelt trp-promotor. Dette blev gjort som følger: trp-promotor-DNA-fragmentet på 310 bp blev opnået ud fra pFIF-trp 69 (se Goeddel et/al., Nucleic Acids Research, 8, 4057 (1980)) ved nedbrydning med EcoRI. Dette fragment 15 blev indsat i pHGH 107 (se fig. 1), åbnet med EcoRI under . anvendelse af T^-DNA-ligase. Således blev der opnået et plasmid (pHGH 207), som har en dobbelt lac-promotor efterfulgt trp-promotoren, flankeret af EcoRI-steder. Det således opnåede pHGH 207 blev nedbrudt med BamHI? de re-20 suiterende fragmenter blev delvis nedbrudt med EcoRI, og det største fragment blev isoleret. Dette fragment har derfor trp-promotoren. Fra pBR322 isoleredes det største EcoRI-BamHI-fragment. Begge fragmenter blev ligeret, og blandingen blev anvendt til at transformere E. coli 294 25 Tetr. Ampr-kolonier blev isoleret, og de fleste af dem havde plasmidet med den struktur, som er vist for pHGH 207-1.

Med restriktionsenzymet EcoRI blev dette plasmid (pHGH 30 207-1) spaltet, og det største fragment, vektoren, blev isoleret fra en 6% gel. Til omkring 0,1 ug af denne vek-tor-DNA sattes et 5 gange molært overskud af EcoRI-fragmentet på 100 bp indeholdende hele lac-promotor/operato-ren som beskrevet ovenfor. Fragmenterne blev sammenføjet 35 kovalent under anvendelse af T4-DNA-ligase, og blandingen blev anvendt til at transformere E. coli 294 ifølge standardprocedurer. Celler blev udsået på X-gal-indikator- DK 170477 B1 27 plader indeholdende 5 ug/ml tetracyclin. Der blev opsamlet blå kolonier indeholdende plasmidstrukturen pHGH 107-11.

5 B. Fremstilling af sekvensen indeholdende lac-Pribnow-kassen og lac-operatoren_

Omkring 10 ug pHGH 107-11 blev nedbrudt med Hpall. Et enkelt fragment på 450 bp blev isoleret. Denne DNA blev 10 derpå nedbrudt med PstI, og det resulterende fragment på 200 bp blev isoleret (se fig. 2). Dette fragment har en Hpall-kohæsiv ende svarende til position -19 med hensyn til transkriptionsstartpunktet. lac-Pribnow-kassen efterfølges nedad af lac-operatorsekvensen. Nucleotid +1 fore-15 kommer i begyndelsesdelen af lac-operator-sekvensen. Dette fragment ender med sekvenser af HGH op til PstI-stedet (se Goeddel et al., ovenfor).

C. Fremstilling af en sekvens indeholdende trp -35 kon-20 sensussekvensen_

Den del af tac-promotoren, som afledes fra trp-promoto-ren, opnås som følger: Et EcoRI-fragment på 310 bp blev isoleret fra omkring 10 ug pHGH 207-1 (fremstillet som' 25 beskrevet ovenfor). Dette fragment indeholder hele trp-promotor-sekvensen inklusive trp-repressor-bindingsste-det, men mangler trp-dæmperen. Dette fragment på 310 bp blev delvis nedbrudt med Taql. Fragmentet på 240 bp, som indeholder alle sekvenserne fra det øvre EcoRI-sted til 30 Tagl-stedet ved position -22, men derfor mangler trp-Pribpow-kassen, blev isoleret fra en 6% gel. Som vektor anvendtes det store EcoRI-Pstl-fragment afledt fra pBR322. Disse tre fragmenter blev blandet og ligeret under anvendelse af standardteknik til dannelse af en cir-35 kel på kun én måde. Efter transformation og udsåning som beskrevet ovenfor fandtes flere blå kolonier at have plasmider pBR322-Ptacl3 som vist i fig. 2.

DK 170477 B1 28 D. Konstruktion af pHGH 807tacl

Det blev forventet, at denne promotor kunne være meget kraftig, og dens udtrykkelse derfor kunne medføre skade-5 lige eller dødelige virkninger på cellen. Ved at dirigere transkriptionen imod det ødelagte amp-gen, som der er tilfældet i pBR322tacI, dannes et nonsensprotein, som forventes at nedbrydes hurtigt og derfor ikke forventes at være dødeligt. Derefter blev tac-promotoren udskåret 10 med EcoRI, og 300 bp fragmentet blev indsat i en vektor afledt fra pHGH 207-1 (hvorfra trp-promotoren var fjernet under anvendelse af EcoRI-nedbrydning). Efter ligering blev blandingen anvendt til at transformere E. coli (lac i ^). I disse celler er der en overproduktion af 15 lac-repressor-protein; derfor undertrykkes tac-promoto ren, som har en naturlig lac-operator-sekvens, og der sker ingen dødelig akkumulering af noget genprodukt. Det resulterende plasmid er vist i fig. 2 (pHGH 807tacl). De relevante sekvenser af Ptrp, Plac og PtacI og PtacII er 20 vist i fig. 3.

E. Konstruktion af de hybride rrn-lac- og rac(5-16)-promotorer 25 Det DNA-fragment, som koder for en af de otte på hinanden følgende ribosomal-RNA-promotorer (rrn B) i E. coli, blev afledt fra plasmid pKK3535, der blev opnået som følger: Eftersom nucleotidsekvensen af både 7,5 kb inserten pKH 2361 og 4,3 kb plasmidet pBR322 er til rådighed (Brosius 30 et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 77, 201 (1980) og Proceedings of the National Academy of Sciences 75, 4801, og Sutcliff, (1978) Cold Springs

Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 77), blev 7,5 kb BamHI-fragmentet fra pKK2361 subklonet ind i. BamHI-stedet af 35 pBR322. Efter ligering blev E. coli stamme HB101 trans formeret, og ampicillinresistente, tetracyclinfølsomme kolonier blev screenet for plasmider med den forudsagte 29 DK 170477 B1 størrelse. 3 ud af 12 transformanter blev yderligere prøvet ved nedbrydning af deres plasmid-DNA med EcoRI. I alle tilfælde blev 3 fragmenter (6,17 kb, 3,54 kb og 2,15 kb) opløst på en 1% agarosegel, hvilket viser, at 7,5 kb 5 fragmentet bærende rrn-B-operonet var klonet ind i vektor pBR322 i den samme orientering. Celler fra en af de 3 positive kolonier blev dyrket, og plasmid pKK3535 blev isoleret. Dette plasmid blev nedbrudt med Hindil og SacII, hvilket gav et 906 bp DNA-fragment, som indeholder de to 10 på hinanden følgende rrn-B-promotorer komplet. Dette fragment har et Alul-sted og blev skåret med det enzym. EcoRI-linkere blev ligeret til dette Alul-sted som beskrevet tidligere (se fig. 1), og denne ligeringsblanding blev derpå nedbrudt med Hpall og EcoRI. Det enkelte 15 Hpall-sted på dette fragment er lokaliseret ved position -28 i forhold til transkriptionsstartstedet af den først rrn-B-promotor. Således blev der opnået et 130 bp EcoRI-Hp a11-fragment.

20 lac-delen af den hybride promotor var nøjagtigt den samme som beskrevet tidligere i forbindelse med konstruktionen af lac-promotoren, nemlig 200 bp HpalI-Pst-fragmentet.

Som beskrevet er Hpall-enden ved position -19 i forhold til lac-promotorens transkriptionsstartsted. rrn-pro-25 motorerne er yderst kraftige? de er de mest effektive promotorer hos E. coli og er ansvarlige for syntesen af store mængder ribosomal RNA, som er nødvendig til at opretholde høje væksthastigheder af E. coli. Normalt dirigerer denne promotor syntesen af en RNA-art, som ikke 30 translateres. Hvis denne promotor skulle blive tvunget til at syntetisere en translaterbar mRNA, ville den dræbe cellen. Derfor var det vigtigt under konstruktionen af den hybride rrn-lac-promotor at holde denne promotor i represseret tilstand under konstruktionen.

EcoRI-HpaII-"Prrn"-fragmentet på 130 bp og Hpall-Pst-"Plac"-fragmentet på 200 bp blev ligeret med det store 35 DK 170477 B1 30

EcoRI-Pst-fragment af pBR322 nøjagtigt som beskrevet for tao-promotoren. Det resulterende plasmid pBR322-Prrnlac er vist (se fig. 5).

5 I tilfælde af rrn-lac-hybriden er der en sammenføjning af position -19 i Plac med nucleotid -28 i Prrn. Afstanden mellem Pribnow-kassen og -35 området er meget for kort, og ingen transkription kan starte ved en sådan promotor.

Der blev således opnået store mængder af de to promotor-10 fragmenter i pBR322-Prrnlac. Plasmid-DNA (20 μg) blev nedbrudt med EcoRI, og et 190 bp fragment blev renset og derpå nedbrudt med Hpall. Begge fragmenter, "Prrn"-stykket på 130 bp og "Plac"-stykket på 60 bp, blev renset.

Til 130 bp fragmentet blev ligeret to selvkomplementære 15 syntetiske fragmenter 1 og 2. Deres sekvens er: r

Hpall SacI Xho 1: CGCAGCTC

2: CTCGAGAGTC

20

Efter ligering og nedbrydning med EcoRI og Xhol blev der isoleret et DNA-fragment på omkring 140 bp.

På lignende måde blev 60 bp "Plac"-fragmentet forsynet 25 med to selvkomplementære syntetiske fragmenter 3 og 4 som følger:

Xho Xba Clal

3. TCGAGTCTAGAAT

30 4: CAGATCTTAGC

Efter nedbrydning af' ligeringsblandingen med EcoRI og Xhol blev der isoleret et 70 bp fragment. Disse to fragmenter, som har en syntetisk linker bundet til deres 35 Hpall-ende, og nu har Xhol- og EcoRI-kohæsive ender, blev indsat i vektor PCV I, der blev åbnet med EcoRI og Xhol. Konstruktionen af vektor PCV I er som følger (se fig. 6):

F. Konstruktion af PCV I

DK 170477 B1 31

De fire fragmenter PP-1 til PP-4 blev syntetiseret ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet af Cren et al., 5 Nucleic Acids Research, 8, 2331 (1980). Syntesen af fragmenterne blev gennemført ud fra de passende faste bærere ved sekventiel tilføjelse af de passende fuldt beskyttede mono- eller trimer-blokke. Trinnene blev gennemført under de samme betingelser som beskrevet ved syntesen af oligo-10 thymidylsyre (se Crea et al., ovenfor). Den endelige polymer blev behandlet med base (kone. ammoniakvand) og syre (80% vandig eddikesyre), polymeren blev udpellete-ret, og supernatanten inddampet til tørhed. Remanensen, opløst i 4% ammoniakvand, blev vasket med ether og an-15 vendt til isolering af det fuldt afbeskyttede fragment. Rensning blev gennemført ved højtryksvæskechromatografi på "Permaphase AAX". Gelelektroforetisk analyse viste, at hvert af fragmenterne PP-1 til PP-4 havde den korrekte størrelse: 20 fragment sekvens størrelse PP-1: 51-CGG*AGC*T*C-31 (8-mer) PP-2: 51-TCG*AGA*GCT*C-31 (10-mer)

Pf>-3: 51-TCG*AGT'CTA‘GAA.T-31 (13-mer) 25 PP-4: 51-CGA'TTC*TAG'A,C-31 (11-mer)

De syntetiske selvkomplementære sekvenser 1, 2, 3 og 4 blev blandet og ligeret. Blandingen blev spaltet med 30 Hpall og Clal, og 21 bp fragmentet blev renset og indsat i Clal-åbnet pBR322. Eftersom Clal-stedet i pBR322 er inden for tet-promotoren, vil værter indeholdende en insert let kunne genkendes, da de er tet-følsomme. Derfor blev cellerne efter transformation udsået på amp-plader.

35 Kolonier blev overført på tet-plader, og plasmid-DNA'en af dem, som var tet-følsomme, blev analyseret. Det resulterende plasmid er vist og kaldes PCV I (promotor-klo- DK 170477 B1 32 ningsvektor I). Denne vektor har 6 unikke restriktionssteder foran tet-genet. En promotor indsat i ethvert af disse steder vil genoprette nyttig tet-resistens.

5 G. Indsættelse af 140 bp "Prrn"- og 70 pb MPlac"-sekven-ser i PCV I_

Plasmid PCV I blev åbnet med Xhol og EcoRI, og det store vektorfragment blev isoleret. Under anvendelse af stan-10 dardteknik indsattes de førnævnte fragmenter. Da kun plasmider, som har en insert, kan lukkes igen, havde hovedparten af plasmiderne den viste struktur (PCV I-Prrn og PCV I-Plac). Plasmidet blev opformeret og isoleret, og de to fragmenter 140 bp og 70 bp blev isoleret. De blev 15 blandet, ligeret, og de concatemere blev spaltet med - EcoRI og Xhol. Nedbrydningsproduktet blev adskilt på en 6% gel, og der blev udvundet et 210 bp fragment. Dette fragment blev indsat i en vektor afledt fra pHGH 207-1 (hvorfra trp-promotoren var fjernet med EcoRI; se oven-20 for).

Prrn Lac -35 -28 SacI Xhol Xbal +* ~ u) U 1 (3> ---TTTTAAATTTCCTCTTGTCAGGCCGGAGCTCTCGAGTCTAGAAT- —aaaatttaaaggagaacagtccggcctcgagagctcagatcttagc- (Prrn) <2> ,4) syntetisk indsats -19 -10 CGGCTCGTATAATGTGTGGA lac-operator HGH CGAGCATATTACACACCT 30 (Plac) 35 Således er der konstrueret en hybrid promotor med 21 bp insert i -28/-19 sammenføjningen. Afstanden mellem Pribnow-kassen og -35 sekvensen er for lang til at være DK 170477 B1 33 aktiv. For at aktivere denne promotor, dvs. at etablere den rigtige afstand mellem Pribnow-kassen og -35 sekvensen, blev plasmidet pHGH-Prrnlac spaltet med sacl og Xbal. De klistrende ender blev fjernet med enzym SI, og 5 de stumpe ender blev ligeret. Sekvensen af den resulterende "rac"-promotor (se pHGH-Prrnlac; fig. 6) er vist neden for sammen med lac- og rrn B-promotoren:

Plac/UV5 CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGT- +1

GT GG AATTGT G AGC G G AT AAC AATTT C AC AC AGG AAAC AG AATTCT AT

Prac 5-16 TTCCTCTTGTCAGGCCGGAAT CGGCTCGTATAATGT- +1

GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACA.GAATTCTAT

+1

PrrnB TTCCTCTTGTCAGGCCGGAAT AACTCCCTATAATGCGCCACCACTG

H. Konstruktion af hybrid tadI-promotor 20 Der blev konstrueret en anden hybrid promotor, som kontrolleres af lac-repressoren, og som ikke påvirkes af trp-repressoren. I trp-promotoren overlapper trp-repressorbindingsstedet med Pribnow-kassen (Siebenlist, ovenfor), som i dette tilfælde også specificerer et Hpal-25 sted (gTTAC) (se fig. 7). Sekvenser nedad fra dette Hpal-sted blev erstattet med et syntetisk DNA-fragment. Således blev trp-repressor-bindingsstedet ødelagt. Plasmid pHGH 207-1 blev åbnet med Hpal og Xbal, og et syntetisk DNA-f ragment på 42 bp blev indsat. Sekvensen af dette 30 syntetiske fragment er identisk med den, som findes i det homologe område af lac-UV5-promotor/operatoren. Således føjes de første 2 bp af trp-Pribnow-kassen (TTAACTA) til de sidste 5 bp af lac-UV5-Pribnow-kassen (TATAATG), hvilket resulterer i en hybrid Pribnow-kasse (TTTAATG). Neden 35 for denne hybride Pribnow-kasse er en 5 bp sekvens, som er identisk med den, der findes i lac-UV5~promotor/opera-toren. Denne 5 bp sekvens er den venstre arm af det sym- 34 DK 170477 B1 metriområde, som flankerer kernen af den naturlige lac-operator. Denne 5 bp sekvens efterfølges af nucleotider, som specificerer kernen af lac-operatoren (Heyneker et al., Nature 263, 748 (1976)). lac-operatoren efterfølges 5 af et Hindlll-sted og en Shine-Dalgarno-sekvens, som har en 4 bp homologi med 16 s-ribosomal-RNA. Det syntetiske fragment ender med et Xbal-sted, hvorved det er føjet til HGH-genet. Således flankeres Shine-Dalgarno-området af to forskellige restriktionssteder, som er unikke på plas-10 midet. Det skal bemærkes, at tadI-promotor/operatoren mangler den højre arm af symmetriområdet, som flankerer den naturlige lac-operator. Den resterende hybride promotor, pHGH 907tacII, indeholder således en operator svarende til lac-promotoren og, tilføjet i de respektive 15 Pribnow-kasse-områder, 5'-DNA-sekvensen oven for trp-pro-.. motoren.

20 25 30 35

Claims (17)

1. Hybrid promotor/operator, som er i stand til at diri- 5 gere E. coli DNA-afhængig RNA-polymerase-transkription af et rekombinant DNA-fragment anbragt neden for denne, kendetegnet ved, at den omfatter a) en promotor/operator-sekvens, som kan derepresseres 10 ved induktion og udviser en første promotorstyrke, og operabelt anbragt oven for denne, b) et fragment omfattende -35 konsensussekvensen og det 5'-flankerende område af en anden promotor med en større 15 promotorstyrke, hvilke elementer (a) og (b) er kovalent sammenføjet mellem den nævnte -35 konsensussekvens og Pribnow-kassen i promotor/operator-sekvensen. 20

2. Hybrid promotor/operator ifølge krav 1, kendetegnet ved, at elementerne (a) og (b) er sammenføjet ved en position mellem -10 og -35 sekvensen.

3. Hybrid promotor/operator ifølge krav 1, kende tegnet ved, at elementerne (a) og (b) er sammenføjet via komplementære restriktionssteder på disse.

4. Hybrid promotor/operator ifølge krav 3, kende-30 tegnet ved, at de komplementære restriktionssteder er syntetisk afledt.

5. Hybrid promotor/operator ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at elementet (a) er afledt 35 fra en promotor/operator valgt blandt lac, gal P2, ara BAD, ara C og gal PI. 36 DK 170477 B1

6. Hybrid promotor/operator ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at elementet (b) er afledt fra en promotor valgt blandt trp, rrn, λPR, XPL, str, spe og rpoB. 5

7. Hybrid promotor/operator ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen nedad fra en position mellem -10 og -35 sekvensen af en promotor/-operator, hvis operator er i stand til at derepresseres 10 ved induktion, hvilken DNA-sekvens er sammenføjet med en DNA-sekvens opad fra en position mellem -10 og -35 sekvensen af en promotor med en større promotorstyrke.

8. Hybrid promotor/operator ifølge krav 1 eller 7, 15 kendetegnet ved, at promotor/operatoren, hvis operator er i stand til at derepresseres ved induktion, er lac-promotor/operatoren.

9. Hybrid promotor/operator ifølge krav 8, kende-20 tegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen nedad fra position -19 af lac-promotor/operatoren sammenføjet med DNA-sekvensen opad fra position -22 af trp-promotoren.

10. Hybrid promotor/operator ifølge krav 8, k e n d e -25 tegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen opad fra position -12 af trp-promotoren sammenføjet med en DNA-sekvens modelleret efter DNA-sekvensen nedad fra position -11 af lac-promotoren.

11. Hybrid promotor/operator ifølge krav 8, kende tegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens nedad fra position -19 af lac-promotoren og en DNA-sekvens opad fra position -28 af rrn-promotoren, sammenføjet via en syntetisk DNA-sekvens af nukleotidbaser.

12. Vektor indeholdende en hybrid promotor/operator ifølge krav 1-11, kendetegnet ved, at den er plas- 35 37 DK 170477 B1 midet pBR322-Prrnlac fremstillet som angivet i beskrivelsen og vist i fig. 5.

13. Udtrykkel sesvektor, kendetegnet ved, at 5 den omfatter en heterolog geninsert, hvis udtrykkelse er under styring af en hybrid promotor/operator ifølge ethvert af kravene 1-11.

14. Vektor ifølge krav 13, kendetegnet ved, at 10 den er et plasmid valgt blandt pHGH807-tacI fremstillet som angivet i beskrivelsen og vist i fig. 2, pHGH-Prac 5-16 fremstillet som angivet i beskrivelsen og vist i fig. 6 og pHGH907-tacII fremstillet som angivet i beskrivelsen og vist i fig. 7. 15

15. Escherichia coli stamme transformeret med en vektor ifølge krav 13 eller 14.

16. Kultur af en E. coli stamme ifølge krav 15, som er i 20 stand til at producere et heterologt polypeptid ved udtrykkelse af et gen, som koder for dette, idet udtrykkeisen dirigeres af en hybrid promotor/operator ifølge ethvert af kravene 1-11.

17. Fremgangsmåde til mikrobiel produktion af heterologe polypeptider, kendetegnet ved, at en E. coli kultur ifølge krav 16 dyrkes i et egnet næringsmedium, og det dannede heterologe polypeptid udvindes fra blandingen. 30 35