DK175186B1

DK175186B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af bakteriestammer

Info

Publication number: DK175186B1
Application number: DK198504606A
Authority: DK
Inventors: Denis Horace Burges; Paul Jarrett
Original assignee: Agricultural Genetics Co
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 2004-07-05
Also published as: MA20545A1; GR852425B; GB2165261B; IL76580A; IL76580A0; EG19367A; NL971029I1; DK460685D0; ZA857689B; ATE64152T1; PH21337A; PT81260A; EP0178151A3; GB8524826D0; CN1017722B; EP0178151B1; DE3583105D1; AU4835285A; JPS61181372A; US5063055A

Description

i DK 175186 B1

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af hidtil ukendte stamme? af en toxindannende bakterie med entomocid aktivitet, en ny stamme, som fremstilles derved, og anvendelsen af denne bakterie til beskyttelse af planter, som er modtagelige over for visse skadedyr.

5 Nærmere betegnet angår opfindelsen en hidtil ukendt stamme af Bacillus thuringiensis, som har en forbedret entomocid aktivitet mod visse lepidoptera-skadedyr.

10 Mange planter af kommerciel og/eller hjemlig betydning er udsatte for invasion og beskadigelse fra lepidoptera-skadedyr. Disse skadedyr findes over hele verden, og for tiden kræver bekæmpelse af dem gentagen og kostbar påføring af de pesticider, som er tilgængelige.

15 Mange afgrøder er modtagelige over for flere lepidoptera-skadedyr. Blandt de betydeligste skadedyr er Spodoptera littoralis, Heliothisarmigera, Heliothis virescens,

Plutella maculipennis, Mamestra brassicae og Pieris brassicae.

Bredspektrede pesticider er et nyttigt og værdifuldt værktøj til afgrødebeskyttelse, 20 men ukritisk anvendelse af bredspektrede kemiske insecticider kan ødelægge mange naturlige bekæmpelsesmidler. Da de fleste kemiske insecticider er relativt uselektive, kan de ødelægge organismer, der ikke er målet, herunder gavnlige rovdyr og para-itter for destruktive skadedyr. Visse insekter udvikler også modstandsdygtighed over for kemiske insecticider, hvilket ofte gør det umuligt at bekæmpe dem ved hjælp af 25 disse insecticider og kan gøre det muligt for mindre betydningsfulde skadedyr at blive særdeles betydningsfulde.

Anvendelsen af selektive mikrobielle insecticider, der anvender naturligt forekommende bakterier som den aktive og værtsspecifikke bestanddel, har medvirket til at 30 overvinde mange af disse problemer.

Et eksempel på et mikrobielt insecticid er Bacillus thuringiensis, hvoraf flere stammer er kommercielt tilgængelige og for tiden udnyttes på grund af deres unikke insecticide aktivitet, når de ædes af modtagelige larver, især larver fra insektordenen Lepidop-35 tera.

I DK 175186 B1 I

I I

I Disse stammer kan anvendes uden skadelig virkning på gavnlige insekter. Bacillus I

I thuringiensis passer godt ind i de for tiden fremherskende land-brugsteorier, der I

I favoriserer anvendelsen af naturligt forekommende organismer til bekæmpelse af I

I skadelige insekter. Det er en almindeligt forekommende, stavformet, sporedannende, I

I 5 aerob, grampositiv mikroor-ganisme og er karakteriseret ved under sporedannelses- I

I cyklen at danne én eller flere proteinøse parasporale krystaller, ved sin patogenicitet I

I over for lepidoptera-larver, ved sin evne til at anvende citrat som eneste carbonkilde I

og ved det usædvanlig høje phosphatindhold i sporen. - I

I 10 Bacillus thuringiensis er almindeligt forekommende i miljøet og er i stand til at vokse i I

I visse typer jord. Den har ingen kendt negativ virkning på livsformer som mennesker, I

I kæledyr, fugle, fisk, regnorme, de fleste gavnlige insekter eller planter. Dens påtoge- I

nicitet for følsomme insekter skyldes i det væsent-lige tilstedeværelsen af en para- I

I sporal krystal, der kan udgøre 30-40% af cellens tørvægt på I

I 15 sporedannelsestidspunktet. I

I Bacillus thuringiensis er kun aktiv, når den indtages. Nogle timer efter indtagelse har I

fundet sted, ophører lepidoptera-skadedyr med at æde, og beskadigelse af planten I

standses. De fleste arter dør efter ca. 24-72 timer af toxæmi som følge af de I

I 20 krystallinske toxiner. Dette ledsages af og til af septikæmi som følge af tilstede- I

H værelse af sporen. I

Således skyldes hovedvirkningen krystallen, der kun virker efter opløsning i larvens I

I indvolde. I

I 25 I

Aktiveringen af krystallen forårsages af en kombination af basisk pH og proteolytiske I

enzymer i tarmindholdet. Reaktionen er afhængig af den høje tarm-pH hos lepidop- I

tera-larver (pH over 7), der muliggør afgivelsen af krystallens toxiske bestanddele. I

I Disse toxiner nedbryder mellemtarmens væg, hvilket får ædningen til at standse. I

I 30

I Væksten af bakterier, som således frigives i bughulen, medfører septikæmi, som også I

I kan spille en rolle for insektets død. I

Det er klart, at anvendelsen af Bacillus thuringiensis som insecticid udgør en effektiv 35 og miljømæssigt acceptabel metode til at bekæmpe lepidoptera-skadedyr.

3 DK 175186 B1

Derfor søges der for tiden efter nye stammer med forbedret insecticid aktivitet, enten udtrykt som forøget toxicitet for en given art eller som en mere bredspektret aktivitet. Imidlertid har kombinationen af høj toxicitet og bredspektret aktivitet i praksis været meget vanskelig at opnå.

5

Det har nu vist sig, at en ny stamme af Bacillus thuringiensis, GC91, har en forbedret entomocid aktivitet mod visse lepidoptera-skadedyrarter, hvilket effektivt har gjort aktivitetsspektret bredere.

10 Den foreliggende opfindelse angår derfor en hidtil ukendt stamme af Bacillus thuringiensis, GC91, hvoraf en prøve er deponeret i National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT med deponeringsnummeret NCTC 11821, deponeret den 7. september 1984, eller et derivat eller en mutant deraf med entomocid aktivitet mod lepidoptera-skadedyr.

15

Denne hidtil ukendte stamme kombinerer effektivt den potentielle entomocide aktivitet af to stammer af Bacillus thuringiensis, hvoraf én er en asporogen mutant og således ikke udviser entomocid aktivitet, selv om den indeholder det genetiske materiale, som ville gøre den i stand til at gøre det, hvis den faktisk dannede sporer eller 20 krystaller. Således kan den overraskende styrke af den nye stamme, GC91, ikke opnås ved anvendelse af en simpel blanding af de to mutantstammer.

Den hidtil ukendte stamme har en forbedret entomocid aktivitet mod lepidoptera-skadedyr fra slægterne Galleria, Mamestra, Heliothis, Spodoptera og Pieris.

25

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af Bacillus thuringiensis med forbedrede entomocide egenskaber ved kombination i en enkelt stamme af de forskellige entomocide egenskaber hos to respektive udgangsstammer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 30 a) der selekteres en mutant fra en første udgangsstamme, hvilken mutant er karakteriseret ved tab af et plasmid, som koder for et polypeptid, der udgør en del af krystalproteinet, og 35 b) et plasmid, som koder for δ-endotoxinkrystalsyntese, overføres fra en anden udgangsstamme (donor) eller mutant deraf til den mutant (modtager), der fremstilles i trin a), hvorved den ønskede nye stamme fremstilles.

I DK 175186 B1 I

I 4 I

I Fortrinsvis udvælges først en asporogen mutant fra den anden udgangsstamme, I

I hvilken mutant har i det væsentlige samme plasmidproRI som den anden udgangs- I

I stamme. Plasmidet overføres derefter fra den asporogene mutant til den i trin a) I

I 5 fremstillede modtagermutant. I

I Den første udgangsstamme er fortrinsvis stamme HD 135, og den i trin a) fremstillede I

I mutant er stamme 135-S4 (NCTC 11822). I

I 10 Fortrinsvis er den anden udgangsstamme stamme HD 191, og den asporogene mutant I

I er stamme 191-A2 (NCTC 11823). I

I Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af Bacillus I

H thuringiensis GC 91 (NCTC 11821), ved hvilken et plasmid overføres fra Bacillus I

I 15 thuringiensis stamme 191-A2 (NCTC 11823) til Bacillus thuringiensis stamme 135-S4 I

(NCTC 11822), hvilket plasmid koder for δ-endotoxinkrystalsyntese i stamme 191-A2. I

I en udførelsesform for fremgangsmåden dyrkes stammerne 191-A2 og 135-S4 I

sammen i blandet kultur for at forårsage konjugationslignende plasmidoverførsel, den I

20 blandede kultur fortyndes og overføres til et fast medium, hvorved fås enkelte I

H kolonier, kolonier af stamme GC 91 selekteres ved den forøgede størrelse af den I

I parasporale krystal, og stamme GC 91 dyrkes derfra. I

Opfindelsen angår også et entomocidt stof, der stammer fra Bacillus thuringiensis I

25 stamme GC 91 (NCTC 11821) eller fra et derivat eller en mutant deraf eller fra en I

stamme, som fremstilles i henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. I én I

udførelsesform er det entomocide stof et spore-krystalcomplex. I

Opfindelsen angår endvidere et entomocidt præparat, som omfatter Bacillus I

30 thuringiensis stamme GC 91 (NCTC 11821) eller et derivat eller en mutant deraf eller I

H et entomocidt stof som ovenfor defineret sammen med en landbrugsmæssig adjuvans I

såsom en bærer, et fortyndingsmiddel, et overfladeaktivt middel eller en påførings- I

I fremmende adjuvans. Præparatet kan også indeholde en yderligere biologisk aktiv I

forbindelse valgt blandt gødningsstoffer, mikronæringsstof-donorer, plantevækst- I

35 præparater, herbicider, insecticider, fungicider, bactericider, nematicider og I

molluscicider og blandinger deraf. Præparatet kan omfatte 0,1-99 vægtprocent I

Bacillus thuringiensis GC 91 eller derivatet eller mutanten deraf eller det entomocide I

DK 175186 B1 5 stof, 1-99,9 vægtprocent af en fast eller flydende adjuvans og 0-25 vægtprocent af et overfladeaktivt middel.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til bekæmpelse af lepidoptera-5 skadedyr, ved hvilken en entomocidt virksom mængde af Bacillus thuringiensis stamme GC 91 (NCTC 11821) eller et derivat eller en mutant deraf eller et entomocidt stof som defineret ovenfor eller et præparat, der indeholder den ovennævnte stamme, derivat, mutant eller stof, påføres på skadedyrene eller deres miljø.

10 Stammen af Bacillus thuringiensis GC 91 eller et præparat, som indeholder den, kan administreres til planterne eller afgrøderne, som skal beskyttes, sammen med visse andre insecticider eller kemikalier uden tab af styrke.

Den er kompatibel med de fleste andre almindeligt anvendte landbrugssprøjte-15 materialer, men bør ikke anvendes i stærkt basiske sprøjteopløsninger.

Den kan administreres som et pudder, en suspension, et befugteligt pulver eller i en hvilken som helst anden materiel form, som egner sig til landbrugsanvendelse.

20 Under produktionen ved fermentering og efter normal vækst af Bacillus thuringiensis lyserer modercellerne og frigiver sporerne og krystallerne i vækstmediet. Sporerne og krystallerne kan høstes ved centrifugering eller filtrering, spraytørring, vakuumtørring eller en udfældningsmetode såsom den i Duimage et al., Journal of Invertebrate Pathology 15, 1970, s. 15-20 beskrevne lactose-copræcipiteringsteknik. Det 25 resulterende spore-krystalcomplex er stabilt i lange perioder og kan formuleres til et produkt, som egner sig til påføring på afgrøder.

En fremgangsmåde til fremstilling af et insecticidt præparat ifølge opfindelsen omfatter dyrkning af Bacillus thuringiensis stamme GC 91 ved 30 A) opbevaring af denne stamme i lyofiliserede ampuller, B) inokulering med denne stamme på en skråagar, C) inkubation af skråagaren i 1-5 dage ved 20-40°C, fortrinsvis 25-33°C, D) inokulering fra skråagaren i rystekolber, som indeholder et vandigt 35 dyrkningsmedium, E) rystning af denne beholder ved en temperatur på 20-40°C, fortrinsvis 30°C, i 1-5 dage, fortrinsvis 1-2 dage, og eventuelt gentagelse af denne vegetative

I DK 175186 B1 I

I 6 I

I vækstfase mindst én gang i en separat kolbe, I

I F) inokulering af et vandigt dyrkningsmedium i en fordyrkningsfermentor med de i I

I trin E) vundne kulturer, I

I G) omrøring og luftning af mediet, som indeholder inokulatet, ved en temperatur på I

I 5 20-40°C, fortrinsvis 30-35°C, og eventuelt gentagelse af dette fordyrknings- I

I fermenteringstrin mindst én gang i en separat større beholder, I

I H) anbringelse af 2-20 vægtprocent af den i trin G) vundne inkuberingsvaeske i en I

I produktionsfermentor, som indeholder et vandigt dyrkningsmedium, I

I I) omrøring og luftning af mediet ved en temperatur på 20-40°C, fortrinsvis I

I 10 30-35°C, I

I J) høst af Bacillus thuringiensis GC 91-væsken, når sporedannelse og krystal- I

I dannelse i produktionsfermentoren når et maksimum, I

I K) idet agaren og væsken i A-D bør indeholde mindst én nitrogenkilde, mindst én I

I carbonkilde og mindst ét salt, fortrinsvis pepton, glucose og mindst ét salt. I

I 15 Medierne i trin F-J bør indeholde mindst én nitrogenkilde (fx pepton, gærekstrakt, I

I majsstøbevand, sojabønnemel, bomuidsfrømel, fiskemel), mindst én carbonhy- I

I dratkilde (fx glucose, lactose, saccharose, stivelse eller et råmateriale, som er I

I rigt på disse bestanddele) og mindst ét mineralsalt. Nitrogenet og carbonhydratet I

I bør afbalanceres, således at det så vidt som muligt bliver opbrugt samtidigt. I

I 20 I

I Spore-krystalcomplexet elier det præparat, som indeholder det, kan administreres til I

I de planter eller afgrøder, som skal beskyttes, sammen med visse andre insecticider I

I eller kemikalier uden tab af styrke. I

I 25 Det er muligt at dræbe sporerne i spore-krystalcomplexet, fx ved γ-stråling eller en I

I anden metode, som ikke beskadiger krystallen, eller at forhindre sporedannelse ved I

I anvendelse af en asporogen, krystaldannende mutant, hvorved der dannes et ikke- I

I levedygtigt produkt. Et ikke-levedygtigt produkt kan være en fordel i visse tilfælde, I

I hvor det ønskes at forhindre bakterie-spredning af æstetiske grunde eller for at undgå I

I 30 at forårsage sygdom hos gavnlige lepidoptera, fx silkeorme. Imidlertid er ikke-leve- - I

I dygtige produkter sædvanligvis ikke så aktive som de produkter, som indeholder I

I levende sporer, og en yderligere ulempe er de forøgede omkostninger, som er for- I

I bundet med at dræbe sporerne. I

I 35 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til behandling af planter, hvilken I

I fremgangsmåde omfatter påføring af en entomocidt virksom mængde af S. I

I thuringiensis GC 91 eller et præparat deraf. I

7 DK 175186 B1 Målafgrøder, som skal beskyttes inden for opfindelsens omfang, omfatter fx følgende plantearter: 5 Kornsorter (hvede, byg, rug, havre, ris, sorghum og beslægtede afgrøder), roer (sukkerroer og foderroer), stenfrugter, kernefrugter og blød frugt (æbler, pærer, blommer, ferskner, mandler, kirsebær, jordbær, hindbær og solbær), bælgplanter (bønner, linser, ærter, sojabønner), olieplanter (raps, sennep, valmue, oliven, solsikker, kokosnødder, ricinusplanter, kakaobønner, jord-nødder), græskarplanter 10 (agurker, græskar, meloner), fiberplanter (bomuld, hør, hamp, jute), citrusfrugter (appelsiner, citroner, grapefrugt, mandariner), grønsager (spinat, salat, asparges, kål og andre brassicae, løg, tomater, kartofler, paprika), lauraceae (avokado, gulerødder, kanel, campher), løvtræer og nåletræer (fx lindetræer, takstræer, egetræer, hyld, poppel, birketræer, gran, lærk, fyr), eller planter såsom majs, tobak, nødder, kaffe, 15 sukkerrør, te, vin, humle, bananer og naturlige gummiplanter samt prydplanter (herunder kurveblomster).

Bacillus thuringiensis GC 91 påføres sædvanligvis i form af præparater og kan påføres på afgrødeområdet eller den plante, som skal behandles, samtidigt eller successivt 20 med yderligere biologisk aktive forbindelser. Disse forbindelser kan være både gødningsstoffer og mikronæringsstoffer eller andre præparater, som indvirker på plantevækst. Det kan også være selektive herbicider, insecticider, fungicider, bacte-ricider, nematicider, molluscicider eller blandinger af flere af disse præparater, om ønsket sammen med yderligere bærere, overfladeaktive midler eller påførings-25 fremmende adjuvanser, der sædvanligvis anvendes inden for formuleringsteknikken.

Egnede bærere og adjuvanser kan være faste eller flydende og svarer til de stoffer, som sædvanligvis anvendes inden for formuleringsteknologien, fx naturlige eller regenererede mineralske stoffer, opløsningsmidler, dispergeringsmidler, befugtnings-midler, klæbemidler, bindemidler eller gødningsstoffer.

3°

Formuleringerne, dvs. præparaterne eller blandingerne, som indeholder B. thuringiensis GC 91 som aktiv bestanddel eller kombinationer deraf med andre aktive bestanddele og om ønsket en fast eller flydende adjuvans, fremstilles på kendt måde, fx ved homogen blanding og/eller formaling af de aktive bestanddele med 35 fyldstoffer, fx opløsningsmidler, faste bærere og i visse tilfælde overfladeaktive forbindelser (overfladeaktive midler).

I DK 175186 B1 I

I I

I Egnede opløsningsmidler er aromatiske carbonhydrider, især fraktionerne med 8-12 I

I carbonatomer, fx xylenblandinger eller substituerede naphthalener, phthalater såsom I

I dibutylphthalat eller dioctylphthalat, aliphatiske carbonhydrider såsom cyclohexan I

I eller paraffiner, alkoholer og glycoler og deres ethere og estere, såsom ethanol, I

I 5 ethylenglycol-monomethyl- eller -mono-ethylether, ketoner såsom cyclohexanon, I

I stærkt polære opløsningsmidler såsom N-methyl-2-pyrrolidon, dimethylsulfoxid eller I

I dimethylformamid samt vegetabilske olier eller epoxiderede vegetabilske olier såsom I

I epoxideret kokosolie eller sojaolie, eller vand. I

I 10 De faste bærere, der fx anvendes til puddere og dispergerbare pulvere, er normalt

I naturlige mineralske fyldstoffer såsom calcit, talkum, kaolin, montmorillonit eller I

I attapulgit. For at forbedre de fysiske egenskaber er det også muligt at tilsætte I

I højdispergeret kiselsyre eller højdispergerede absorberende polymerer. Hensigts- I

I mæssige granulerede adsorptionsbærere er porøse typer, fx pimpsten, knust mursten, I

I 15 sepiolit eller bentonit; og hensigtsmæssige ikke-absorberende bærere er materialer I

I såsom calcit eller sand. Endvidere kan der anvendes et stort antal forgranulerede I

I materialer af uorganisk eller organisk art, fx især dolomit eller pulveriserede plan- I

I terester. I

I 20 Afhængig af arten af de aktive bestanddele, der skal formuleres, er hensigtsmæssige

I overfladeaktive forbindelser ikke-ioniske, kationiske og/eller anioniske overfladeaktive I

I midler med gode emulgerende^ dispergerende og befugtende egenskaber. Udtrykket I

I "overfladeaktive midler" skal også omfatte blandinger af overfladeaktive midler. I

I 25 Hensigtsmæssige anioniske overfladeaktive midler kan være både vandopløselige I

I sæber og vandopløselige syntetiske overfladeaktive forbindelser. I

I Hensigtsmæssige sæber er alkalimetalsajte, jordalkalimetaisalte eller usubstituerede I

I eller substituerede ammoniumsalte af højere fedtsyrer (C10-22), fx natrium- eller I

I 30 kaliumsaitet af olein-eller stearinsyre, eller af naturlige fedtsyreblandinger, der fx kan I

I fås fra kokosolie eller talgolie. Yderligere hensigtsmæssige overfladeaktive midler er I

I også fedtsyre-methyltaurinsalte samt modificerede og umodificerede phospholipider. I

I Imidlertid anvendes oftere de såkaldte syntetiske overfladeaktive midler, især fedt- I

I 35 sulfonater, fedtsulfater, sulfonerede benzimidazolderivater eller alkylarylsulfonater. I

9 DK 175186 B1

Fedtsulfonaterne eller -sulfaterne er sædvanligvis i form af alkalimetalsalte, jordalka-limetalsalte eller usubstituerede eller substituerede ammoniumsalte og indeholder sædvanligvis et C8.22-alkylradikal, der også omfatter alkyldelen af acylradikaler, fx natrium- eller calciumsaltet af ligninsulfonsyre, dodecylsulfat eller en blanding af 5 fedtalkoholsulfater, som fås fra naturlige fedtsyrer. Disse forbindelser omfatter også saltene af svovlsyreestere og sulfonsyrer af fedt-alkohol/ethylenoxidaddukter. De sulfonerede benzimidazolderivater indeholder fortrinsvis to sulfonsyregrupper og et fedtsyreradikal med ca. 8-22 carbon-atomer. Eksempler på alkylarylsulfonater er natrium-, calcium- eller trietha-nolaminsaltet af dodecylbenzensulfonsyre, dibutyl-10 naphthalensulfonsyre eller et naphthalensulfonsyre/formaldehydkondensationspro-dukt. Tilsvarende phos-phater er også egnede, fx salte af phosphorsyreesteren af et addukt af p-no-nylphenol med 4-14 mol ethylenoxid.

Ikke-ioniske overfladeaktive midler er fortrinsvis polyglycoletherderivater af alipha-15 tiske eller cycloaliphatiske alkoholer eller mættede eller umættede fedtsyrer og alkylphenoler, hvilke derivater indeholder 3-30 glycolether-grupper og 8-20 carbon-atomer i den (aliphatiske) carbonhydriddel og 6-18 carbonatomer i alkyldelen af alkylphenolerne.

20 Yderligere egnede ikke-ioniske overfladeaktive midler er vandopløselige addukter af polyethylenoxid med polypropylenglycol, ethylendiaminpoly-propylenglycol og alkyl-polypropylenglycol med 1-10 carbonatomer i alkylkæden, hvilke addukter indeholder 20-250 ethylenglycolethergrupper og 10-100 propylenglycolethergrupper. Disse forbindelser indeholder sæd-vanligvis 1-5 ethylenglycolenheder pr. propylen-25 glycolenhed.

Repræsentative eksempler på ikke-ioniske overfladeaktive midler er nonyl-phenolpolyethoxyethanoler, ricinusolie-polyglycolethere, polypropylen/-polyethy-lenoxidaddukter, tributylphenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglycol og octyl-30 phenoxypolyethoxyethanol. Fedtsyreestere af polyoxyethylensorbitan såsom polyoxyethylensorbitan-trioleat er også egnede ikke-ioniske overfladeaktive midler.

Kationiske overfladeaktive midler er fortrinsvis kvaternære ammoniumsalte, der som N-substituent indeholder mindst ét C8-22*alkylradikal og som yderligere substituenter 35 lavere usubstitueret eller halogeneret alkyl, benzyl eller hydroxy-lavere alkylradikaler. Saltene er fortrinsvis i form af halogenider, methylsulfater eller ethylsulfater, fx ste-aryl-trimethylammoniumchlorid eller benzyldi-(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.

I DK 175186 B1 I

I 10 I

I De overfladeaktive midler, som sædvanligvis anvendes inden for formulerings-

I teknikken, er fx beskrevet i McCutcheon's Detergents andEmulsifiers Annual, MC

I Publishing Corp. Ridgewood, New Jersey, 1979 og Dr. Helmut Stache, Tensid I

I 5 Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, Méunchen/Wien. I

I De entomocide præparater indeholder sædvanligvis 0,1-99%, fortrinsvis 0,1-95%, I

I Bacillus thuringiensis GC 91 eller en kombination deraf med andre aktive bestanddele, I

I 1-99,9% af en fast eller flydende adjuvans og 0-25%, fortrinsvis 0,1-20%, af et I

I 10 overfladeaktivt middel. I

I Medens kommercielle produkter fortrinsvis formuleres som koncentrater, vil brugeren I

I sædvanligvis anvende fortyndede formuleringer med en væsentlig lavere koncen- I

I tration. I

I 15 I

I Præparaterne kan også indeholde yderligere bestanddele såsom stabiliseringsmidler, I

I antiskumningsmidler, viskositetsregulerende midler, bindemidler, klæbemidler samt I

I gødningsstoffer eller andre aktive bestanddele for at opnå specielle virkninger. I

I 20 Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, som viser plasmid- I

I profilerne for vildtypestammen, den mutante donorstamme, den mutante modtager- I

I stamme og den rekombinante stamme GC 91. Den firkantede parentes viser I

I positionen af det chromosomale DNA. I

I 25 Den hidtil ukendte stamme af Bacillus thuringiensis, GC 91, blev fremstillet ud fra to I

I andre Bacillus thuringiensis-stammer under anvendelse af den i eksemplerne be- I

I skrevne forsøgsprotokol. I

I 30 EKSEMPEL 1 I

I Fremstilling af stamme 135-S4 I

I Udgangsstammen var en vildtype, H-serotype 7, variant a/zawaZ-stamme af Bacillus I

I 35 thuringiensis HD 135 (frit tilgængelig fra Dr. H.T. Duimage, Cotton Insects Research I

I Laboratory, US Dept, of Agriculture, Brownsville, Texas). Stamme HD 135 er opført i I

I kataloget med titlen Bacillus thuringiensis cultures available from the US. Department I

11 DK 175186 B1 of Agriculture, Agricultural Reviews and Manuals ARM-S-30/oktober 1982. Den er også anført som tilgængelig i kataloget med titlen Collection de Souches de Bacillus thuringiensis 1983 fra Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankrig (index nr. 7-28).

5

Stamme HD 135 udviste entomocid aktivitet over for Pieris brassicae, Mamestra brassicae, Heiiothis virescens, Heliothis armigera, Galleriamellonella og Spodoptera littoralis (jfr. tabel 1 nedenfor).

10 Stamme HD 135 blev dyrket i en næringsvæske (Oxoid Ltd., Storbritannien) (sammensætning: Lab-Lemco pulver 1,0 g/l, gærekstrakt L-20 2,0 g/l, pepton L-37 5,0 g/l, NaCI 5,0 g/l) i 16 timer ved 42°C. Kulturen blev derefter fortyndet i 0,8% (w/v) bactopepton (Difco) og udpladet på næringsagar (Oxoid Ltd., Storbritannien) (sammensætning som næringsvæsken, men tilsat 15,0 g/l agar nr. 3), hvilket gav ca.

15 100 kolonier pr. plade. Der blev derefter udført inkubation i 48 timer ved 30eC. De enkelte kolonier blev undersøgt mikroskopisk, og én koloni viste sig at danne para-sporale krystaller med reduceret størrelse. Denne koloni viste sig at være en mutant stamme af HD 135 og fik betegnelsen 135-S4. Stamme 135-S4 er deponeret i NCTC med deponerings-nummeret NCTC 11822, deponeret den 7. september 1984. Plas-20 midanalyse i mutanten 135-S4 ved den af P. Jarret, FEMS MicrobiologyLetters 16, 1983, s. 55-60 beskrevne metode viste, at den manglede et 53 Md plasmid og et 8,8 Md plasmid, som var til stede i forældrestammen (se tegningen). Elektroforese på SDS (natriumdodecylsulfat)-polyacrylamidgeler af solubiliseret krystalprotein fra vildtypen HD 135 og 135-S4 viste, at de parasporale krystaller fra 135-S4 manglede 25 et polypeptid med en molekylvægt på 130K. De metoder, som blev anvendt til oprensning af krystallerne, opløsning af dem og testning deraf på SDS-polyacryl-amidgeler, er kendte inden for teknikken og fx beskrevet af P. Jarrett, Journal of Applied Bacteriology 58, 1985, s. 437-448. Bioassay af stamme 135-S4 viste, at den entomocide aktivitet var gået tabt over for Pieris brassicae og Heliothis virescens, men . 30 var bevaret over for Mamestra brassicae, Galleria mellonella, Heliothisarmigera og

Spodoptera littoralis (tabel 1).

Bakteriestammens aktivitet over for Galleria mellonella blev testet under anvendelse af det af H.D. Burges, Entomologia Experimentalis etApplicata 19, 1976, s. 217-222 35 beskrevne kunstige fødeassay.

Bakteriestammernes aktivitet over for Heliothis armigera, Heliothisvirescens,

I DK 175186 B1 I

I 12 I

I Mamestra brassicae og Spodoptera littoralis blev testet ved tilsætning af en serie I

I koncentrationer af bakterierne til et kunstigt agarbaseret foder, hvormed larverne blev I

I fodret. Det anvendte foder er beskrevet af C.C. Payne, Journal of Invertebrate I

I Pathology 38, 1981, s. 71-77. I

I5 I

I For Pieris brassicae anvendtes det semi-syntetiske foder beskrevet af W.A.L. David og I

I R.O.C. Gardiner, Nature, London 207, nr. 4999, 1965, s. 882-883. Alle de larver, der I

I blev anvendt til bioassay, var 6 dage gamle. Mortaliteten blev optegnet efter 6 dage,

I idet temperaturen blev holdt ved 25°C. I

I 10 I

I Den entomocide aktivitet af stamme 135-S4 over for en række lepidoptera-skadedyr I

I er vist i tabel 1. I

I 15 EKSEMPEL 2 I

I Fremstilling af stamme 191-A2 I

I En anden mutant stamme med kodebetegnelsen 191-A2 blev afledt af en vild-type, I

I 20 H-serotype, kurstaki stamme HD 191 (fås fra H.T. Duimage, Cotton Insects Research I

I Laboratory, US Dept, of Agriculture, Brownsville, Texas). Stamme HD 191 er anført I

I som tilgængelig i katalogerne fra US Department of Agriculture og Institut Pasteur I

I (indexnr. 30-49), hvortil der er henvist i eksempel 1. I

I 25 Stamme HD 191 blev strøget ud på næringsagaroverfladen (mediesammensætning: I

I Lab-Lemco pulver (L-29) 1,0 g/l, gærekstrakt (L-20) 2,0 g/l, pepton (L-37) 5,0 g/l, I

I natriumchlorid 5,0 g/l, agar nr. 3 15,0 g/l) og inkuberet ved 42°C i 48 timer. Efter I

I inkubation blev pladerne undersøgt under et dissekeringsmikroskop ved ca. 8 ganges I

I forstørrelse. Der iagttoges mange små, ophævede områder eller papiller i udstryg- I

I 30 ningerne, hvilket viste asporogene kolonier. Disse blev udtaget og på ny strøget ud på I

I næringsagar og inkuberet ved 30°C i 48 timer. Den resulterende vækst muliggjorde I

I isolering afen stabil, asporogen mutant stamme (betegnet 191-A2) som en enkelt I

I koloni. Stamme 191-A2 er deponeret i NCTC med deponeringsnummeret NCTC 11823, I

I deponeret den 7. september 1984. I

I 35 I

I Der blev ikke iagttaget nogen forskel mellem forældrestammen og mutantstammen, I

I når de to plasmidprofiler blev analyseret ved agarosegelelektroforese (se tegningen). I

13 DK 175186 B1

Dette viser, at plasmidprofilen for entomocid aktivitet sandsynligvis var den samme som for den sporedannende forældrestamme HD 191, dvs. entomocid aktivitet mod Heliothisarmigera, Heliothis virescens og Pieris brassicae (tabel 1).

5 EKSEMPEL 3

Fremstilling af stamme GC 91 10 Under anvendelse af det konjugationslignende plasmidoverførselssystem, der er beskrevet af J.M. Gonzalez, Jr., B.J. Brown og B.C. Carlton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1982, s. 6951-55 med nedenstående variation, blev mutantstammen 191-A2 testet for at identificere, hvilket plasmid var ansvarligt for toxindannetse.

15 Donororen 191-A2 og modtagerstammen, en ikke-krystaldannende mutant, som fås fra Bacillus thuringiensis stamme HD 1, blev dyrket separat på hjerte/hjerteinfu-sionsagarplader (Oxoid) (bestanddele i g/l: kalvehjerneinfusion-faste stoffer 12,5, oksehjerteinfusion-faste stoffer 5,0, proteasepepton (Oxoid L 46) 10,0, natriumchlorid 5,0, dextrose 2,0, vandfrit natriumphosphat 2,5 og agar nr. 3 15,0). Efter inkubation i 20 16 timer ved 30°C blev et podeøjefuld celler fra hver stamme blandet sammen på overfladen af en hjerne/hjerte-infusionsagarplade og inkuberet i yderligere 24 timer ved 30°C. Den resulterende vækst stryges derefter ud på næringsagarplader (Oxoid) og inkuberes i 48 timer ved 30°C for at tillade modtagerstammen at sporulere. Et podeøjefuld vækst fra næringsagarpladen suspenderes derefter i 10 ml sterilt 25 destilleret vand og opvarmes ved 60°C i 15 minutter for at dræbe den asporogene donor 191-A2 (den sporedannende modtager er uskadt). Reversion af donoren 191-A2 til dannelse af varmeresistente endosporer forekom ved frekvenser på >1 i 107 levedygtige celler efter vækst på nærings-agarplader.

» 30 Efter opvarmning blev kulturen fortyndet og udpladet på næringsagar, hvilket gav individuelle kolonier. Efter inkubation i 48 timer ved 30°C blev kolonier undersøgt mikroskopisk til detektion af tilstedeværelsen af δ-endotoxinkrystaller. Procentdelene af kolonier, som danner krystaller i fire separate forsøg, var 59%, 41%, 22% og 31%. Plasmidprofilerne fra modtagerne, der igen opnår krystaldannelse, viser, at krystal-35 syntesen blev ledsaget af overførselen af et 50 Md stort plasmid fra donoren 191-A2.

20 individuelle kolonier blev undersøgt, og alle indeholdt det 50 Md store plasmid. Modtagere, som modtog det 50 Md store plasmid fra 191-A2, viste den fulde biolo-

I DK 175186 B1 I

I 14 I

I giske aktivitet af donor vildtype forældrestammen HD 191. Resultaterne er vist i tabel I

I 2. Pi baggrund af disse data blev det konkluderet, at et 50 Md stort plasmid kodede I

I for δ-endotoxinkrystalsyntese i 191-A2. I

I 5 Under anvendelse af den ovennævnte plasmidoverførselmetode og selektion af I

I varmeresistente, sporedannende modtagere blev det 50 Md store plasmid fra 191-A2 I

I overført til mutanten 135-54. Individuelle kolonier af 135-S4, der muligvis indeholdt I

I det 50 Md store plasmid, blev undersøgt under mikroskop for at udvælge for de I

I kolonier, der dannede krystaller med forøget størrelse. Procentdelen af 135-S4- I

I 10 kolonier, der dannede krystaller med forøget størrelse efter plasmidoverførsel, var i to I

I separate forsøg 29% og 21%. Plasmidprofiler af sådanne kolonier viste tilstede- I

I værelsen af et 50 Md stort plasmid i alle de analyserede store krystaldannende I

I kolonier (10). Det blev konkluderet, at optagelsen af det 50 Md store plasmid med- I

I førte en forøgelse i størrelsen af den parasporale krystal og samtidig ændring og I

I 15 forøgelse af den entomocide aktivitet af mutanten 135-S4. I

I Den kombinerede entomocide aktivitet var forbedret med hensyn til skadedyrarterne I

I Spodoptera littoralis, Heliothis armigera, Heliothisvirescens, Mamestra brassicae, I

I Galleria mellonella og Pieris brassicae. I

I 20 I

I Mutanten 135-S4, der yderligere indeholdt det 50 Md store plasmid, blev betegnet I

I som mutant GC 91. I

I Den entomocide virkning af stamme GC 91 og af andre stammer af Bacillus I

I 25 thuringiensis er anført i tabel 1. I

I Der henvises også til tegningen, som viser plasmidprofiler for vildtypestammen, den I

I mutante donorstamme, den mutante modtagerstamme og den rekombinante stamme I

I GC 91. Den firkantede parentes angiver positionen af det chromosomale DNA. I

I 30 I

Η I

TABEL 1 15 DK 175186 B1

BIOASSAY-DATA

5 Insektart LC,^ bakterier / 9 insektfoder

HD 1* HD 191 HD-135' 135-S4 GC

91

Galleria mellonella 2600 3500 20 64 18,4 jq Heliothis armigera 42 48 228 845 44

Heliothis virescens 8,6 5,8 205 >2000 4,8

Spodoptera littoralis 5780 >10000 445 694 330

Piens brassicae 0,64 0,98 1,2 >100 0,72

Mamestra brassicae 1510 >10000 185 282 162 15 --------------

* HD 1 er den bakteriestamme, som anvendes i de fleste kommercielle Bacillus 20 thuringiensis-produkter til bekæmpelse af lepidoptera-larver. Den fås fx fra US

Department of Agriculture og Institut Pasteur (detaljer er anført i eksempel 1).

** Bakterier blev dyrket og høstet til bioassay i henhold til den af Duimage et al.,

Journal of Invertebrate Pathology 15, 1970, s. 15-20 beskrevne metode.

ϊ 25 TABEL 2

BIOASSAY-DATA

LCS0 pmpg bakterier/g insektfoder 30 Insektart Ikke-krystal- Krystaldan- k dannende nende mod- HD 1 HD 191 tager

Galleria mellonella >100.000 3750 2940 35 Heliothis armigera >10.000 57,0 52,0

Heliothis virescens >10.000 6,4 6,2

I DK 175186 B1 I

I 16 I

I Note: De i tabel 2 viste resultater blev frembragt under anvendelse af tilsvarende H

I metoder som de for tabel 1 beskrevne. Bioassay-resultaterne for HD 191 varierer en

I smule fra de i tabel 1 viste, da bakterierne blev dyrket og bio-analyseret på forskellige I

I 5 datoer. H

I Eksempler på formulering af faste aktive bestanddele af Bacillus thuringiensis GC 91 I

I eller kombinationer deraf uden andre aktive bestanddele (alle procentangivelser er i I

I vægtprocent) I

I 10 I

I 1. Befugtelige pulvere a) b) c) B

I Bacillus thuringiensis GC 91 25% 50% 75% I

I Natriumlignosulfonat 5% 5% I

I Natriumlaurylsulfat 3% 5% I

I 15 Natriumdiisobutylnaphthalensulfonat - 6% 10% I

I Octylphenol-polyethylenglycol- I

I ether (7-8 mol ethylenoxid) 2% - I

I Højdispergeret kiselsyre 5% 10% 10% I

I Kaolin 62% 27% I

I 20 I

I Bacillus thuringiensis GC 91 blandes grundigt med adjuvanserne, og blandingen I

I formales grundigt i en hensigtsmæssig mølle, hvilket giver befugtelige pulvere, der I

I kan fortyndes med vand, hvorved fås suspensioner med den ønskede koncentration. I

I 25 2. Emulgerbart koncentrat I

I Bacillus thuringiensis GC 91 10% I

I Octylphenol-polyethylenglycol- I

I ether (4-5 mol ethylenoxid) 3% I

I Calcium-dodecylbenzensulfonat 3% I

I 30 Ricinusolie-polyglycolether I

I (36 mol ethylenoxid) 4% I

I Cyclohexanon 30% I

I Xylenblanding 50% I

I 35 Emulsioner med en hvilken som helst krævet koncentration kan fås ud fra dette I

I koncentrat ved fortynding med vand. I

17 DK 175186 B1 3. Puddere a) b)

Bacillus thuringiensis GC 91 5% 8%

Talkum 95%

Kaolin - 92% 5

Puddere, som er klar til brug, fås ved blanding af den aktive bestanddel med bærerne og formaling af blandingen i en hensigtsmæssig mølle.

4. Ekstrudergranulat 10

Bacillus thuringiensis GC 91 10%

Natriumlignosulfonat 2%

Carboxymethylcellulose 1%

Kaolin 87% 15

Den aktive bestanddel eller kombination blandes og formales med adjuvanserne, og blandingen fugtes derefter med vand. Blandingen ekstruderes, granuleres og tørres derefter i en luftstrøm.

20 5. Overtrukket granulat

Bacillus thuringiensis GC 91 3%

Polyethylenglycol (MW 200) 3%

Kaolin _ 94% 25 Den finmalede aktive bestanddel eller kombination sættes i et blandeapparat til det med polyethylenglycol befugtede kaolin. Herved fås overtrukne granulater, som ikke støver.

6. Suspensionskoncentrat * 30

Bacillus thuringiensis GC 91 40%

Ethylenglycol 10%

Nonylphenol-polyethylenglycolether (15 mol ethylenoxid) 6% 35 Natriumlignosulfonat 10%

Carboxymethylcellulose 1% 37%’s vandig formaldehydopløsning 0,2%

I DK 175186 B1 I

I 18 I

I Siiiconeolie i form af en I

I 75%'s vandig emulsion 0,8% I

I Vand 32% I

5 Den finmalede aktive bestanddel eller kombination blandes grundigt med adjuvan- I

I serne, hvilket giver et suspensionskoncentrat, hvorfra der kan fås suspensioner med - I

I en hvilken som helst ønsket koncentration ved fortynding med vand. I

I De hidtil ukendte stammer af Bacillus thuringiensis, som er beskrevet i nærværende I

I 10 beskrivelse, dvs. GC 91, 135-S4 og 191-A2, har alle bortset fra de specifikt nævnte I

I undtagelser de morfologiske og biokemiske karakteristika, som er typiske for slægten I

I og arten. Ved H-serotypebestemmelse (baseret på flageller eller H-antigener) kan der I

I skelnes forskellige varieteter som beskrevet af H. de Barjac i Microbial Control of Pests I

I and Plant Diseases 1970-1980, kap. 3, red. H.D. Burges, Academic Press, 1981. I

I 15 I

I Følgende biokemiske karakteristika hos NCTC 11821 (GC 91), NCTC 11822 (135-S4) I

I og NCTC 11823 (191-A2) er blevet testet: I

I 11821 11822 11823 I

I Gramreaktion + + + I

I 20 Motilitet (hængende dråbe) + + + I

I Luftbetingelser aerob aerob aerob I

Vækst på næringsagar I

I ved 22°C + + + I

I ved 37°C + + + I

I 25 ved 42°C + + + I

I ved 60°C NT I

Koser’s citrat I

I Indol I

I Methy Irødt + + + I

30 Voges-Proskauer + + + » I

I Hydrogensulfiddannelse ... I

I Nitrater reduceret + + + I

I Nitriter reduceret ... I

I Catalase + + + I

I 35 Gelatine gjort flydende + NT + I

19 DK 175186 B1

Syre dannet fra

Glucose + + +

Arabinose ...

Xylose NT - NT

5 Lactose

Saccharose -

Maltose + + +

Mannitol ...

Dulcitol 10 Sorbitol

Salicin + + +

Hydrolyse af stivelse + + +

Urinstof + + +

Casein + + +

15 Aesculin NT - NT

Hugh og Leifson's reaktion Ingen Ingen Ingen

Oxidase + + +

Gluconat - NT

20 Malonat ...

Phenylalanin - NT

Decarboxylaser:

Arginin + + +

Lysin 25 Ornithin - - - Vækst på MacConkey-plader + NT + (NT = ikke testet) . 30

Claims

1. Stamme af Bacillus thuringiensis GC 91, hvoraf en prøve er blevet deponeret med I I deponeringsnummeret NCTC 11821, eller et derivat eller en mutant deraf med I I 5 entomocid aktivitet mod lepidoptera-skadedyr.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af Bacillus thuringiensis med forbedrede entomocide I I egenskaber ved at kombinere de forskellige entomocide egenskaber hos to respektive ’ I I udgangsstammer til en enkelt stamme, I I 10 kendetegnet ved, at I I a) en mutant, som er karakteriseret ved tab af et plasmid, der koder for et polypeptid, I I som udgør en del af krystalproteinet, selekteres fra en første udgangsstamme, og I 15 b) et plasmid, der koder for δ-endotoxinkrystalsyntese, overføres fra en asporogen I I mutant af en anden udgangsstamme, som har i det væsentlige samme plasmidprofil I I som den anden udgangsstamme, til den i trin a) fremsbllede mutant, hvorved den I I ønskede nye stamme fremstilles. I I 20

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, I I kendetegnet ved, at den første udgangsstamme er stamme HD 135, og at den I I i trin a) fremstillede mutant er stamme 135-S4 (NCTC 11822). I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, I I 25 kendetegnet ved, at den anden udgangsstamme er stamme HD 191, og at den I I asporogene mutant er stamme 191-A2 (NCTC 11823). I

5. Fremgangsmåde til fremstilling af Bacillus thuringiensis GC 91 (NCTC 11821), I I kendetegnet ved, at et plasmid, der koder for δ-endotoxinkrystalsyntese i I I 30 stamme 191-A2, overføres fra Bacillus thuringiensisstamme 191-A2 (NCTC 11823) til 4 I I Bacillus thuringiensis stamme 135-S4 (NCTC 11822). I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, I I kendetegnet ved, at stammerne 191-A2 og 135-S4 dyrkes sammen i blandet I I 35 kultur for at forårsage konjugationslignende plasmidoverførsel, den blandede kultur I I fortyndes og overføres til et fast medium, hvorved fås enkeltkolonier, kolonier af I DK 175186 B1 stamme GC 91 selekteres ved den forøgede størrelse af den parasporale krystal, og stamme GC 91 dyrkes derfra.

7. Entomocidt stof, . 5 kendetegnet ved, at det stammer fra Bacillus thuringiensiss tamme GC 91 (NCTC 11821) eller fra et derivat eller en mutant deraf eller fra en stamme, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 2.

8. Entomocidt stof ifølge krav 7, 10 kendetegnet ved, at det er et spore-krystalcompiex.

9. Entomocidt præparat, kendetegnet ved, at det omfatter Bacillus thuringiensisstamme GC 91 (NCTC 11821) eller et derivat eller en mutant deraf eller et entomocidt stof ifølge krav 7 15 sammen med en bærer, et fortyndingsmiddel, et overfladeaktivt middel eller en påføringsfremmende adjuvans.

10. Præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det også indeholder en yderligere biologisk aktiv 20 forbindelse valgt blandt gødningsstoffer, mikronæringsstoffer, plantevækstpræparater, herbicider, insecticider, fungicider, bactericider, nematicider og molluscicider og blandinger deraf.

11. Præparat ifølge krav 9, 25 kendetegnet ved, at det indeholder 0,1-99 vægtprocent Bacillus thuringiensis GC 91 eller et derivat eller en mutant deraf eller det entomocide stof, 1-99,9 vægtprocent af en fast eller flydende adjuvans og 0-25 vægtprocent af et overfladeaktivt middel. r 30

12. Fremgangsmåde til bekæmpelse af lepidoptera-skadedyr, kendetegnet ved, at der på skadedyrene eller deres miljø påføres en ento-mocid virksom mængde af Bacillus thuringiensis stamme GC 91 (NCTC 11821) eller et derivat eller en mutant deraf eller et entomocidt stof ifølge krav 7 eller et præparat, der indeholder denne stamme, derivatet, mutanten eller stoffet. 35