DK175122B1 - Farmaceutisk præparat omfattende et farmaceutisk acceptabelt derivat af 3'azido-3'-desoxythymidin samt fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

I - DK 175122 B1 i

Opfindelsen angår farmaceutiske præparater, der indeholder farmaceutisk acceptable derivater af 3'-azido-3'-desoxythymidin samt fremgangsmåde til fremstil-ling af præparaterne.

5 Retrovira danner en undergruppe af RNA-vira, som for at reproducere sig selv først må foretage en omvendt tranekription af RNA i deres genom til DNA (transkrip-tion betyder konventionelt syntesen af RNA fra DNA). Når det virale genom er på DNA-form, vil det blive inkorpo-1Q reret i værtcellegenomet og her kan det fuldstændig udnytte værtcellens transkription/translationsudstyr til replikation. Når det virale DNA én gang er inkorporeret, er det praktisk talt umuligt at skelne det fra værtens DNA, og det kan i denne tilstand eksistere lige så længe som cellen lever. Da det i denne form praktisk talt er 15 fuldstændig modstandsdygtig mod angreb, må man rette behandling mod et andet trin i dets livscyklus, og denne behandling må nødvendigvis fortsætte, indtil alle virus-bærende celler er døde.

Man har nu på reproducerbar måde isoleret en re-20 trovirus fra patienter med erhvervet immundefektsyndrora (AIDS). Denne virus er blevet grundigt karakteriseret, og dens internationalt accepterede navn er nu human immun-defektvirus (HIV). Man har vist, at denne virus (som heri betegnes HIV) fortrinsvis inficerer og ødelægger 25 T-celler, der bærer OKT4 overflademarkøren, og man accepterer den nu i al almindelighed som sygdomsfremkalderen for AIDS. Patienten mister mere og mere disse T-celler, hvorved immunsystemets balance forstyrres, og patientens evne til at bekæmpe andre infektioner reduceres, hvorved han bliver modtagelig for opportunistiske infektioner, 30 som ofte viser sig dødelige. Den sædvanlige dødsårsag hoe AIDS ofre er de opportunistiske infektioner, såsom lungebetændelse eler viralt inducerede cancertyper, og er ikke et direkte resultat af HIV infektionen.

2

Ul\ I /O Dl

Man har fornyligt ogs& udvundet HIV af andre vævstyper, deriblandt B-celler, der eksprimerer T4 markøren, makrofager og væv i centralnervesystemet (CNS), der ikke er associeret med blod· Denne sidstnævnte in-5 fektion er opdaget hos patienter, der udviser klassiske AIDS symptomer, og er forbundet med fremadskridende de-myelinering, hvad der fører til udmarvning, og sådanne symptomer som encephalopathi, fremadskridende dysartria, ataxi og manglende orientering.

Der findes i det mindste fire kliniske manifestationer af en HIV. infektion. Ved den indledende bærertilstand er det eneste tegn på infektion tilstedeværelsen af anti-HIV-antistoffer . i blodstrømmen. Man mener, at sådanne bærere kan overføre infektionen f.eks. ved blodtransfusion, seksuel omgængelse eller ved brugte ka- 15 ny ler. Bærertilstanden udvikler sig ofte ikke til anden tilstand, der er karakteriseret ved vedvarende almen lymphadenopathi (PGL). Man mener i øjeblikket, at ca.

20% af PGL patienter senere vil udvise den fremadskredne tilstand kendt som AIDS-relateret kompleks (ARC). Fy-20 siske symptomer i forbindelse med ARC kan omfatte almindelig utilpashed, forhøjet temperatur og kroniske infektioner. Sædvanligvis vil denne tilstand føre til den endelige dødelige AIDS tilstand, hvor patienten fuldstændig mister evnen til at bekæmpe infektioner.

Eksistensen af disse humane retrovira og andre er 25 3 føret fornylig blevet opdaget, og da de sygdomme, de er forbundet med er livstruende, er der et stærkt behov for at udvikle metoder til at bekæmpe disse vira.

Man har i Øjeblikket foreslået forskellige medikamenter, der siges at kurere AIDS. Disse omfatter anti-30 roonwolframat, suramin, ribavirin og isoprinosin, som enten er noget giftige eller ikke udviser synderlig antiretroviral aktivitet. Da HIV genomet inkorporeres i 3 DK 175122 B1 værtcelle DNA efter infektionen og i praksis ikke kan angribes i denne tilstand vil det eksistere så længe som værtcellen overlever og i mellemtiden forårsage nye infektioner* Derfor vil en hvilken som helst behandling 5 for AIDS strække sig over en længere periode, muligvis for livstid, og kræve midler roed en tolerabel giftighed.

Der findes rapporter, der beskriver afprøvning af forbindelser mod diverse retrovira, f.eks. Friend leukæmivirus (FLV), en retrovirus hos mus. F.eks. fandt 10 Krieg et al. (Exp. Cell Res., 116 (1978) 21-29), at 3*-azido-3'-desoxythimidin ved in vitro eksperimenter påvirkede frigivelsen af C-type partikler og forøgede dannelsen af A-type partikler af et FLV kompleks, og Ostertag et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1974) 71, 4980-85) mente, på basis af en overfortolkning af resul- 15 tater i forbindelse med det ovenfor nævnte FLV kompleks som antiviral aktivitet og på basis af mangel på cellulær giftighed, at 3'-azido-3'-desoxythymidin på fordelagtig vis kunne erstatte bromdesoxyuridin ved medicinsk behandling af sygdomme forårsaget af DNA vira.

20 Imidlertid fastslog De Clerg et al. (Biochem.

Pharm. (1980) 29, 1849-1851) seks år senere, at 3'-azi-do-3'-desoxythymidin ikke udviste nogen mærkbar aktivitet over for nogensomhelst vira ved deres afprøvninger, omfattende vaccinia, HSV i og varicella zoster virus 25 (vzv). Glinski et al. (J. Org. Chem. (1973), 38, 4299-4305) beskriver visse derivater af 3'-azido-3'-desoxythymidin og deres evne til at blokere exoribonu-cleaseaktiviteten hos pattedyr.

4 DK 175122 B1

Opfindelsen angår som ovenfor nævnt farmaceutiske præparater omfattende farmaceutisk acceptable derivater (som nedenfor defineret) af en forbindelse med formel I: :Λ "· 0) HO η \y (d.v.s. 3'-azido-3'-desoxythymidin eller AZT).

Aktiviteten af 3' -azido-3' -desoxythymidin overfor humane retrovira er blevet fastslået ved diverse in vi-15 tro assay systemer. F.eks. forhindrer man effektivt infektion af H9 human lymphoblaetoidcellelinien med HIV ved koncentrationer af 3' -azido-3* -desoxythymidin, der er så lave som 0,013 mcg/ml op til 20 timer efter infektionen. HIV - infektion af U937 humane lymphoblastoid-20 celler, PHA-stimulerede hvide blodceller og kultiverede periferale blodlymphocytter forhindres også ved tilsvarende lave koncentrationer. Derudover viste der sig* ved 10 dages overbelastningseksperimenter, hvor man benyttede op til 5000 HIV virioner pr. celle og klonede T4, tetanusspecifikke T-hjælper lymphocytter ingen nedgang i 25 antal af celler behandlet med 31-azido-3*desoxythymidin, hvorimod antallet af ubehandlede celler faldt med en faktor 5. Cy topa thi ske effekter blev også fuldstændig blokeret ved den samme cellelinie, der var transformeret med HTLV I og overinficeret med HIV.

30 Andre studier, hvor man anvender renset HIV

revers transkriptase' har vist, at aktiviteten af dette enzym blokeres af triphoephatet af 3'-azido-3'-desoxy-thymidin ved en konkurrerende inhibitionsmekanisme.

5 I

DK 175122 B1

Fase 1 kliniske prøver har også vist« at 3‘- I

azido-3’-desoxythymidin er i stand til at overskride I

blod/hjernebarrieren i klinisk effektive mængder. Denne I

I egenskab er usædvanlig og også værdifuld ved behandling I

I 5 eller profylakse af CHS infektioner forårsaget af humane I

I retrovira. I

I Evnen hos 3' -azido-3' -desoxythymidin til-at modi» I

I ficere forløbet af en retrovirusinduceret skavank er I

I blevet demonstreret i en musemodel« hvori tilførsel af I

I 3'-azido-3'-desoxythymidin forhindrede splenomegali I

I forårsaget af intravenøst tilført Rauecher museleukæmi- I

I virus« hvad der hos mus er aekvivalent med HTLV I. I I

I andre eksperimenter har man vist, at 3'-azido-3'-desoxy- I

I thymidin forhindrer in vitro replikation af HTLV I ved I

I koncentrationer der er så lave som 0,8 iig/ml. I

I 15 Eksempler på humane retrovirusinfektioner, som kan I

I behandles eller forhindres med farmaceutiske præparater I

I ifølge opfindelsen, inkluderer T-celle lymfotropiske re- I

trovira (HTLV) især HTLV I, HTLV II og HIV (HTLV III) . I

I kliniske tilstande, der kan behandles eller forhindres I

I 20 på samme måde, inkluderer AIDS, AIDS'relateret kompleks I

I og HTLV I positiv leukæmi og lymphoma. Patienter, der I

kan behandles på denne måde, omfatter også sådanne, der I

I har antistoffer mod HIV, HIV-infektioner i centralnerve- I

systemet, PGL og ARC. I

I 25 Ved et' "farmaceutisk acceptabelt derivat" menes et I

farmaceutisk acceptabelt salt, ester som nedenfor define- I

ret eller salt af en sådan ester, idet en sådan forbindel- I

I se, når den indgives til et menneske, er i stand til at I

tilvejebringe (direkte eller indirekte) 3'-azido-3'-des- I

oxythymidin eller en antiretroviral aktiv metabolit eller I

30 I

residue deraf. I

De ovenfor nævnte farmaceutisk acceptable estere af forbindelsen med formel I er carboxylsyreestere, hvori 6 DK 175122 B1 ikke-carbonyldelen af estergruppen udvælges blandt ligekæ-det eller forgrenet alkyl, alkoxyalkyl (f.eks. methoxyme-thyl}, aralkyl (f.eks. benzyl), aryloxyalkyl (f.eks. phe-noxymethyl), aryl (f.eks. phenyl evt. substitueret med ha-5 logen, C^4 alkyl eller C1-4 alkoxy); sulfonerede estere såsom alkyl- eller aralkylsulfonyl (f.eks. methansulfonyl); og mono-, di- eller triphosphatestere. I forbindelse med de ovenfor beskrevne estere vil en hvilken som helst al-kyldel, der er til stede i sådanne estere, med mindre andet anføres indeholde 1-18 carbonatomer, især 1-4 carbon- 10 atomer. En hvilken som helst aryldel, der findes i sådanne estere, vil indeholde en phenylgruppe.

Alle referencer til de ovenfor nævnte forbindelser omfatter også reference til farmaceutisk acceptable salte deraf.

15 Eksperimenter har vist, at 31-azido-3’-desoxythy- midin in vivo omdannes til 5' -monophosphatet ved hjælp af cellulære enzymers virkning. Monophosphatet phospho-ryleres derefter af andre enzymer, så triphosphatet dannes via diphosphatet og andre studier har demonstreret, 20 at det er triphosphatformen af 3'-azido-3'-desoxythyroi-din som anses at være den effektive kædeafslutter i revers transkription af HIV, som det ses af dets virkning på myeloblastosisvirus hos fugle og Moloney leukæmivirus hos mus. Denne form inhiberer også HIV revers fransk riptase in vitro, idet den samtidig næsten ingen virkning har på human DNA polymeraseaktivitet.

Eksempler på farmaceutisk acceptable salte af forbindelsen med formel I og dens farmaceutisk acceptable derivater omfatter basesalte, f.eks. afledt af en passende base såsom et alkalimetal (f.eks. natrium), 30 jordalkalimetal (f.eks. magnesium), salte, ammonium og NX4+, hvori X er alkyl).

7 DK 175122 B1

Specielle eksempler på farmaceutisk acceptable derivater af forbindelsen med formel I, der kan benyttes i farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, omfatter mononatriumsaltet og de følgende 5'-estere: monophos-5 phat, dinatriumphosphat, diphosphat, triphosphat, acetat, 3-methylbutyrat, octanoat, palmitat, 3-chlorbenz-oat, benzoat, 4-methylbenzoat, hydrogensuccinat, pivalat og mesylat.

Disse forbindelser kan via de omhandlede præpara-10 ter indgives til mennesker ved behandling eller profylakse på en hvilken som helst passende måde omfattende oral, rectal, nasal, topisk (inkluderende buccal og sublingual) , vaginal og parenteral (inkluderende subcutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal) indgivelse.

15 Den foretrukne måde for indgivelsen vil afhænge af tilstanden og alderen af modtageren, infektionens natur og derivatet af forbindelsen med formel I.

I almindelighed vil et passende dosis være i området 3,0-120 mg/kg kropsvægt til en patient hver dag, 20 foretrukken i området 6-90 mg/kg kropsvægt pr. dag og mest foretrukket i området 15-60 mg/kg kropsvægt pr. dag. Det foretrækkes, at den ønskede dosis indgives som to, tre, fire, fem, seks eller flere underdoser roed passende mellemrum i løbet af dagen. Disse underdoser kan indgives i enhedsdosisform, f.eks. med indhold af 25 _ 5.-1500 mg, foretrukken 10-1000 mg og mest foretrukken 10-700 mg aktiv ingrediens pr. enhedsdosis.

Eksperimenter med 3'-azido-3'-desoxythymidin tyder på, at en dosis af en forbindelse ifølge opfindelsen skal indgives, så man opnår maksimum plasmakon-30 centration af den aktive forbindelse på ca. 1-75 μΜ, foretrukket 2-50 μΜ-mest foretrukket ca. 3-30 μΜ. Dette kan f.eks. opnås ved intravenøs injektion af 0,1-5% opløsning af forbindelsen, eventuelt i saltvand eller indgivelse oralt som 8 DK 175122 B1 en bolus, der indeholder 1-100 mg/kg af forbindelsen.

Man kan opretholde det ønskede niveau i blodet ved hjælp af kontinuerlig infusion, hvorved der indgives ca. 0,01- 5,0 mg/kg/time, eller ved afbrudte infusioner, der inde-5 holder ca. 0,4-5 mg/kg af forbindelsen.

De nævnte plasmakoncentrationer på ca. 1-75 μΜ er omkring 3-250 gange lavere end angivet ifølge ovennævnte artikel af Ostertag et al. som nødvendige til hindring af replikation af muse-retrovirus uden at være alt for 10 toksiske over for museceller. Det er overraskende og fordelagtigt, at AZT-derivater ved så lave koncentrationer skulle være aktive mod humane retrovira.

I overensstemmelse hermed er de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de som 15 aktivt middel omfatter et farmaceutisk acceptabelt derivat af 3'-azido-3'-desoxythymidin og en farmaceutisk acceptabel bærer, hvor præparatet omfatter en enhedsdosis på mellem 5 og 1500 mg af den aktive ingrediens.

De farmaceutiske præparater (i det følgende af og 20 til kaldt midlerne) ifølge opfindelsen indeholder i det mindste et farmaceutisk acceptabelt AZT-derivat sammen med en eller flere acceptable bærere derfor. Alle bærere må være acceptable, idet de skal være forligelige med de andre ingredienser i midlet og ikke skadelige for pati-25 enten. Midler omfatter sådanne, der er egnet til oral, rectal, nasal, topisk (inkluderende buccal og sublingual) , vaginal eller parenteral (inkluderende subcutan, intramuskulær, intravenøs og intradermal indgivelse). Midlerne foreligge bekvemt på enhedsdosisform og kan 30 fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved, at den omfatter at forene et farmaceutisk acceptabelt derivat af 3'-azido-3'-desoxythymidin med en farmaceutisk acceptable bærer som ovenfor nævnt.

9 DK 175122 B1

Midler ifølge opfindelsen, der er egnet til oral indgivelse, kan foreligge som enkelte enheder såsom kapsler, cachetter eller tabletter, der hver indeholder en forbestemt mænqde af azidothvmidin-derivatet; som et ^ pudder eller granulat; som en opløsning eller suspension i en vandig eller ikke vandig væske; eller som en olie i vand, væskeformig emulsion eller en vand i olie, væskeformig emulsion. Den aktive ingrediens kan også foreligge i en bolus, latværge eller pasta. Orale midler I kan ydermere indeholde andre kendte midler såsom s Øde- I 10 midler, aromastoffer og fortykningsmidler. Endvidere I inkluderes midler, der tilvejebringer forsinket frigi- I velse af den aktive ingrediens efter oral indgivelse.

I En tablet kan fremstilles ved sammenpresning eller I formstøbning, evt. sammen med en eller flere hjælpe- I 15 ingredienser. Man kan fremstille pressede tabletter, I idet man i en passende maskine sammenpresser et azi- I dothvmidin-derivat som nævnt på fritflydende form, såsom I et pudder eller et granulat, evt. blandet med et bindemiddel I (f.éks. povidon, gelatine, hydroxyprcpylmethylcellulose), et I 20 snøremiddel, et inert fortyndingsmiddél, præserverings- I middel, sønderdelingemiddel (f.eks. natriumstivelsegly- I colat), tværbundet povidon, tværbundet, natriumcarboxy- I methylcellulose, et overfladeaktivt eller et fordelende I middel.

I Man kan fremstille formstøbte tabletter ved i en I 25 passende maskine at formstøbe en blanding af forbin- I delsen på pulverform, fugtet med en inert væskeformig I fortynder. Tabletterne kan eventuelt overdækkes eller I forsynes med en kærv og kan formuleres så de medfører I langsom eller kontrolleret frigivelse af deres indhold I 30 af aktiv ingrediens, idet man f.eks. benytter hydroxy- I propylmethylcellulose i varierende mængder til at opnå I den ønskede form for frigivelse.

10 DK 175122 B1

Midler, der er egnet til topisk indgivelse i munden, omfatter pastiller, der indeholder azidothymidin-derivatet sammen med en aromatisk bærer, sædvanligvis saccharose og acacia eller tragant; andre pastiller, der 5 indeholder derivatet sammen med en inert bærer, såsom gelatine og glycerol eller saccharose og acacia, og mundskyllemidler, der indeholder derivatet i en passende væskeformig bærer.

Præparater til rectal indgivelse kan foreligge som 10 stikpiller, hvor bæreren f. eks. indeholder cacaosmør eller et salicylat.

Præparater, der er egnet til vaginal indgivelse, kan foreligge som vagitorier, tamponer, cremer, geler, pastaer, skum eller spray, der foruden azidothymidin-15 derivatet indeholder bærere, der er kendt af fagmanden.

Midler egnede til parenteral indgivelse inkluderer vandige og ikke vandige ieotoniBke sterile injec-tionsopløsninger, som kan indeholde antioxidanter* puffere« antibakteriemidler og opløste stoffer som gør mid-20 isotoniek med hensyn til modtagerene blod; og van dige og ikke vandige sterile suspensioner som kan indeholde suspensionemidler og fortykningsmidler. Midlerne kan foreligge i enhedsdosis eller mangedosie lukkede beholdere* f.eks. ampuller og småglas og kan opbevares 2^ frysetørrede (lyofilieerede), så man kun behøver at tilsætte steril væskeformig bærer« f.eks. vand til injection umiddelbart før de skal anvendes. Improviserede inject ionsopløsninger og suspensioner kan fremstilles fra sterilt pudder« granulat eller tabletter som ovenfor beskrevet.

Foretrukne enhedsdosismidler er sådanne« der indeholder en daglig dosis eller enhed, en daglig under-dosie som nævnt ovenfor eller en passende brøkdel deraf af det nævnte azidothymidin-derivat.

DK 175122 B1 I

11 I

Det må forstås, at de farmaceutiske præparater I

ifølge opfindelsen foruden de nævnte ingredienser også I

kan indeholde andre konventionelle midler, som man be- I

nytter, når man fremstiller farmaceutiske præparater. I

5 De farmaceutisk acceptable derivater af 3'-azido- I

3'-desoxythymidin kan fremstilles på konventionel vis, I

f. eks. som beskrevet i følgende referencer eller ved I

I analoge metoder: J.R. Horwitz et al., J. Org. Chem. I

I 29, (juli 1964) 2076-78; M. Imazawa et al., J. Org. I

I 10 Chem, 43(15) (1978) 3044-3048; Κ.Λ. Watanabe et al., J. I

I Org. Chem., 45, 3274 (1980); og R.P. Glinski et al., J. I

Chem· Soc. Chem. Commun·, 915 (1970), såvel som ved I

I . fremgangsmåderne beskrevet i eksemplerne. I

Eksempelvis kan man I

15

(λ) lade en forbindelse med den almene formel II I

I I

I 20 0 II

I 25 *3 I (hvori N repræsenterer en precursorgruppe for 3 * -azido- I gruppen) eller et derivat (f.eks. en ester eller et I salt) deraf, reagere med et passende middel eller under I passende reaktionsbetingelser, så nævnte precursorgruppe I omdannes til den ønskede azidogruppe; eller 30 12 DK 175122 B1

(B) lade- en forbindelse med den almene formel XIX

0 W3

5 III

\i 10 (hvori R repræsenterer en precursorgruppe for hydroxy-gruppen eller for en farroaceutisX acceptabel derivat-gruppe deraf)« reagere med et passende middel eller under passende realctionsbetingelser, så nævnte precur-15 sorgruppe omdannes til den tilsvarende ønskede gruppe; eller (C) lade en forbindelse

O

2o med formlen IV

(IV) H 1 eller en funXtionel æXvivalent deraf, reagere med en forbindelse, der tjener til at indføre den ønsXede ribo-furanosylring i 1-stilling i forbindelse med formel IV: eller 13 DK 175122 B1

(D) lade en forbindelse med den almene formel V

Λ' 0 ^ N ' v s ^ (hvori R1 er hydroxy eller R som defineret ovenfor), reagere med et middel under passende betingelser, hvorved 10 denne forbindelse omdannes til 3'-azido-3’-desoxythymi-din eller et farmaceutisk acceptabelt derivat deraf; og derefter eller samtidigt om nødvendigt udføre følgende omdannelse: hvis 3'-azido-3'-desoxythymidin er dannet, omdannelse af dette til et farmaceutisk acceptabelt 15 derivat.

Oet må noteres, at man ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde skal udvælge precursor- forbindelser med formlerne II og III, såvel som de ovenfor nævnte midler og reaktionsbetingelser i overensstem-20 raelee med kendt teknik ved kemien for nucleosidsyntese. Eksempler på sådanne omdannelsesfremgangsmåder beskrives nedenfor som vejledning, og man må forstå, at man kan ændre dem på konventionel vis afhængig af den ønskede forbindelse med formel I* Især når der beskrives en omdannelse, som vil føre til en uønsket reaktion ved reak-25 .

tionsdygtige grupper kan man beskytte sådanne grupper pa konventionel vis og senere fjerne de beskyttende grupper efter omdannelsen. I trin A kan gruppen M med formlen II repræsentere f.eks. et halogen (f.eks. chlor), hydroxy eller organosulfonyloxy, f.eks. trifluormethyleulfonyl-30 oxy, methansulfonyloxy eller p-toluensulfonyloxygruppen.

Ved fremstilling af en forbindelse med formel I kan man f.eks. behandle en forbindelse med formel II, hvori gruppen M er et halogen (f.eks. chlor) i treokon- 14 DK 175122 B1 figurationen (hvori 5'-hydroxy med fordel er beskyttet f.eke. med en tritylgruppe) med et lithium eller natri-umazid. 3*-threohalogen (f.eks. chlor) -udgangsmateriale kan f.eks. tilvejebringes ved reaktion a£ den tilsva-5 rende 3'-erythrohydroxyforbindelse med f.eks· triphenyl-phoephin og carbontetrachlorid eller alternativt ved behandling med organosulfonylhalogenid (f.eks. trifluormethan-sulfonylchlorid) under dannelse af en tilsvarende 3' -erythroorganoeulfonyloxyforbindelse, som derefter ha-logeneree. Eller man kan behandle en 3'-threohydroxyfor-bindeIse med formel II# f.eks. med triphenylphosphin# carbontetrabromid og lithiumazid under dannelse af den tilsvarende 3'-erythroforbindelse. Man kan derefter fjerne en hvilken som helst beskyttende gruppe f.eks. som ovenfor nævnt.

15 Angående trin B kan R repræsentere en beskyttet hydroxygruppe, f.eks. en estergruppe, som nævnt ovenfor i forbindelse med formel I# især acetoxy eller en ether-gruppe såsom trialkylsilyloxygruppe# f.eks. t-butyldime-thyleilyloxy eller en aralkoxygruppe# f.eks. triphenyl-2Q methoxy. sådanne grupper kan omdannes f.eks. ved hydrolyse til den ønskede hydroxygruppe eller omdannes ved transesterificering til en anden estergruppe i 3*-azido-31-desoxythymidin.

Angående trin C kan man udføre dette eksempelvis ved at behandle en passende pyrimidin med formel IV ^ eller et salt eller beskyttet derivat deraf med en forbindelse med formlen •<r N3

I DK 175122 B1 I

I 15 I

I (hvori A repræsenterer en udgående gruppe, f.eks* en I

I acetoxy- eller benzoyloxy- eller halo-, f.eks. chlor- I

I gruppe, og B repræsenterer en eventuel beskyttet hydro- I

I *ygruppe, f.eks. en p-toluensulfonyloxygruppe) og deref- I

I 5 ter fjerne en hvilken som helst beskyttende gruppe. I

I Angående trin D kan R1 repræsentere en precursor- I

I gruppe som beskrevet ovenfor for R i formel III. Man kan I

I derefter, f.eks. tilvejebringe 3'-azido-3'-desoxythymi- I

I din ved reaktion med et alkalimetalazid, f.eks. lithi- I

I umazid, med fordel i et passende opløsningsmiddel såsom I

I vandholdig OMP fulgt af sur eller basisk hydrolyse med I

I fordel under milde betingelser. I

3 *-azido-3'-desoxythymidin kan omdannes til et I

I farmaceutisk acceptabelt phosphat eller anden ester ved I

I reaktion med henholdsvis et phosphorylerende middel, f. I

I 15 eks. P0C13 eller et passende esterdannende middel, f.eks. I

et syrehalogenid eller -hydrid. Forbindelser med formel I, I

I inkluderende estere deraf, kan omdannes til farmaceutisk I

acceptable salte deraf på konventionel vis, f.eks. ved I

I behandling med en passende base. I

I 20 De f®lgen<3e eksempler er givet som illustrationer. I

I Betegnelsen "aktiv ingrediens" benyttet i eksemplerne be- I

I tyder et farmaceutisk acceptabelt derivat af en forbindel- I

se med formel I. I

I 25 I

Eksempel 1 I

I Tabletformuleringer I

I De følgende formuleringer A-C blev fremstillet I

I ved våd granulering af ingredienserne med en opløsning I

I af povidon, hvorefter man tilsatte magnesiums tear at og I

I 30 komprimerede. I

Formulering A

16 DK 175122 B1 mg/tablet mg/tablet (a) Aktiv ingrediens 250 250 5 (b) Lactose B.P. 210 26 (c) Povidon B.P. 15 9 (d) Natriumstivelsesglycolat 20 12 (e) Magnesiumstearat _ 5 3 500 300 10

Formulering B

mg/tablet mg/tablet (a) Aktiv ingrediens 250 250 15 (b) Lactose 150 (c) Avicel PH 101 60 26 (d) Povidon B.P. 15 9 (e) Natriumstivelsesglycolat 20 12 (f) Magnesiumstearat 5 3 20 500 300

Formulering C

mg/tablet 25 Aktiv ingrediens 100

Lactose 200

Stivelse 50

Povidon 5

Magnesiumstearat 4 30 359

De følgende formuleringer D og E blev fremstillet ved direkte sammenpresning af de sammenblandede ingredienser. Lactosen benyttet i formulering E var af direkte 35 sammenpresningstype (Dairy Crest - Zeparox j·

Formulering D

17 DK 175122 B1 mg/tablet

Aktiv ingrediens 250 5 Prægelatineret stivelse NF 15 150 400

Formulering E

mg/tablet 10

Aktiv ingrediens 250

Lactose 150

Avicel^ 100 500 15

Formulering F (til kontrolleret afgivelse)

Man fremstillede formuleringen ved vådgranulering af de nedennævnte ingredienser med en opløsning af povi-don, hvorefter man tilsatte magnesiumstearat og presse-20 de.

mg/tablet (a) Aktiv ingrediens 500 (b) Hydroxypropylmethylceilulose 112 25 (Methocel K4M, bedste kvalitet) (c) Lactose B.P. 53 (d) Povidon B.P.C. 28 (e) Magnesiumstearat 7 700 30

Frigivelsen af aktiv ingrediens fandt sted over en periode på ca. 6-8 timer og var fuldstændig efter 12 t imer.

18 DK 175122 B1

Eksempel 2 Kapselformuleringer

5 Formulering A

Man fremstillede en kapselformulering, idet man sammenblandede ingredienserne i formulering D i Eksempel 1, nævnt ovenfor, og fyldte dem i en todelt kapsel af hård gelatine. Formulering B (infra) blev fremstillet på 10 samme måde. - -

Formulering B

mg/kapsel 15 (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Lactose B.P. 143 (c) Natriumstivelsesglycolat 25 (d) Magnesiumstearat 2 420 20

Formulering C

mg/kapsel (a) Aktiv ingrediens 250 25 (b) Macrogol 4000 BP 350 600

Man fremstillede kapsler ved at smelte Macrogol 4000 BP, heri uddispergeredes den aktive ingrediens og 30 dette blev fyldt i en todelt kapsel af hård gelatine.

Formulering D

19 DK 175122 B1 mg/kapsel

Aktiv ingrediens 2SO

5 Lecithin 100

Arachisolie 100 450

Man fremstillede kapsler ved at uddispergere den 10 aktive ingrediens i lecithin og arachisolie, hvorefter man fyldte dispersionen i bløde elastiske gelatinekapsler.

Formulering E (kapsler til kontrolleret afgivelse) 15 Den følgende kapselformulering til kontrolleret afgivelse blev fremstillet, idet man benyttede en extru-sionsmaskine til at sammenblande ingredienserne A, B og C, hvorefter extrudatet blev omdannet til småkugler og tørret. De tørrede kugler blev overtrukket med en mem-20 bran til kontrollering af afgivelse (d) D og fyldt i todelte kapsler af hård gelatine.

mg/kapsel 25 (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Mikrokrystallinsk cellulose 125 (c) Lactose BP 125 (d) Ethylcellulose 13 513 LIIV ΜΌΥίά b Η

Eksempel 3 H Formulering til Injection

5 Formulering A

H Aktiv ingrediens 0,200 g

Saltsyreopløsning, 0,1M q.s. til pH 4,0 til 7,0 H Natriumhydroxidopløsning, 0,1M q.s. til pH 4,0 til 7,0 10 Sterilt vand q.s. til 10 ml

Den aktive ingrediens blev opløst i hovedparten a£ vandet (35-40°C) og pH reguleret til mellem 4,0 og 7,0 med saltsyre eller natriumhydroxid, som det nu passede.

15 Man £yldte op med vand og filtrerede gennem et sterilt mikroporefilter i en steril 10 ml beholder af ravfarvet glas, type 1, og lukkede og forseglede sterilt.

Formulering B

Aktiv ingrediens 0,125 g

Steril, pyrogenfri pH 7 phosphatpuffer, q.s.til 25 ml I 25 Eksenqpel 4 I Intramuskulær injection I Aktiv ingrediens 0,20 g I 30 Benzylalkohol 0,10 g I Glycofurol 75 1,45 g I Vand til injection q.s.til 3,00 ml

Den aktive ingrediens blev opløst i glycofurol.

35 Man tilsatte benzylalkoholen og lod den opløses, hvor- 21 DK 175122 B1 efter man med vand bragte rumfanget til 3 ml· Derefter filtrerede man blandingen gennem et sterilt mikropore-filter og forseglede den i sterile 3 ml beholdere af ravfarvet glas, type 1.

5

Eksempel 5

Ingredienser 10 Aktiv ingrediens 0,2500 g

Sorbitolopløsning 1,5000 g

Glycerol 2,0000 g

Natriumbenzoat 0,0050 g

Ferskenaroma 17.42.3169 0,0125 ml 15 Renset vand q.s. til 5,0000 ml

Den aktive ingrediens blev opløst i en blanding af glycerol og det meste af det rensede vand. Derefter tilsatte man vandig opløsning af natriumbenzoat til opløs-20 ningen, hvorefter man tilsatte sorbitolopløsningen og endelig aromastoffet. Man tilpassede rumfanget med renset vand og sammenblandede godt.

Eksempel 6 25

Stikpiller mg/stikpiller

Aktiv ingrediens (63pm) 250 Hårdt fedt, BP (Witepsol H15 - Dynamit NoBel) 1770 30 2020 1

Den aktive ingrediens blev benyttet som et pud der, hvori i det mindste 90% af partiklerne havde en størrelse på mindre end eller lig med 63pra i 35 diameter.

22 DK 175122 B1

En femtedel af Witepsol H15 blev smeltet i en dampopvarmet beholder ved højst 45°C. Den aktive ingrediens blev siet gennem en 200iim si og tilsat den smeltede basis under opblanding, idet man benyttede en silver-5 sonblander forsynet med et skærehoved indtil en jævn dispersion var tilvejebragt. Idet temperaturen af blandingen blev holdt konstant på 45°C, blev resten af Witep-soiH15 tilsat til suspensionen, og man omrørte til homogenitet. Hele suspensionen blev filtreret gennem et 10 250ym filter af rustfrit stål og blev under stadig omrøring afkølet til 40°C. Ved en temperatur på 38-40°C fyldte man 2,02 g af blandingen i passende plasticforme. Stikpillerne henstod så til de var afkølet til stuetemperatur.

15

Eksempel 7

Vagitorier mg /vagi tor ie 20 Aktiv ingrediens 63pm 250

Vandfrit dextrose 380

Kartoffelstivelse 363

Magnesiumstearat 7 1000 25

De ovenstående ingredienser blev sammenblandet, og man fremstillede vagitorier ved sammenpresning af den resulterende blanding. 1 2 3 4 5 6

Eksempel 8 2 3 7 -Azido-3 7 -desoxy-51 -O-octanoylthymidin 3

Man satte 1,2 ækvivalenter octanoylchlorid til 4 en opløsning af 3'-azido-3'-desoxythymidin i pyridin ved 5 0°C og tillod, at reaktionen nåede stuetemperatur.

6

Efter fuldstændig reaktion, kontrolleret ved hjælp af 7 23 DK 175122 B1 tic (CHCI3:MeOH;20:1, på silicagel) udhældte man opløsningen i isvand. Vandfasen blev fradekanteret. Den resulterende olie blev chromatograferet på silicagel med CHCl3:MeOH som elueringsmiddel. Forbindelsen, nævnt i 5 overskriften, blev tilvejebragt som en olie ved bortfordampning af opløsningsmidlet fra de relevante fraktioner.

CHN: beregnet: C:54,95, H:6,92, N:17,80 fundet s- C:54,82, H:6,96, N:17,66 10 67,46(d.lH,J5,6-lHz.6H), 66,13(t,IH,1'H), 64,5-4,2(m, 3H,3*H og 5'CH2) «4,0-3,8(m, IH,4‘H), 02,3-2,l(m,4H,2’H og (CH2H af octanoyl)), 15 61,81(d,3H,J5#6=1,OHz, 5CH3), 61, 5-0,6(m,13H,5’ octanoyl CH2)5CH3).

Eksempel 9 λ 5'-Acety1-31-azido-31-desoxythymidin 20 Man tilsatte 2,1 ækvivalenter acetylchlorid til en opløsning af 3'-azido-3*-desoxythymidin i pyridin (20 g i 50 ml) ved stuetemperatur. Reaktionen blev holdt under omrøring i 2 timer, og temperaturen blev i 20 timer holdt ved 0-5°C. Derefter blev reaktionsblandingen 25 udhældt på isvand under omrøring og vandfasen blev dekanteret fra. Det olieagtige produkt blev opløst i vand og ekstraheret med vand (5 gange), 0,5 N saltsyre, vand (2 gange) og tørret over magnesiumsulfat. Opløsningen blev filtreret og inddampet under vakuum. Remanensen, 30 en olie, blev opløst i chloroform, påsat en silicagel-søjle og flashchromatograferet med 2% methanol i chloroform som elueringsmiddel. Fraktioner, der indeholdt produkt, blev inddampet, og olien blev igen chroroatogra-feret med ethylacetat: hexan (6:4 v/v) som et eluerings-35 middel. Fraktioner, der indeholdt produkt, blev inddam- 24 DK 175122 B1 pet under vakuum under tilvejebringelse af et hvidt fast stof.

Smp. 96-98°C.

Beregnet: 0:46,60, H:4,89, N:22,65 5 Fundet s 0:46,67, H:4,94, N-.22.59

Eksempel 10

De følgende forbindelser blev fremstillet ifølge fremgangsmåderne i enten Eksempel 8 eller 9 fra det 10 relevante syrehalogenid eller syreanhydrid.

3' -Azido-5' -O-benzoyl-3' -desoxythymidin:

Beregnet: 0:53,68, H:4,77, N:18,41 Fundet : 0:53,81, H:4,72, N:18,46 15 Smp. 54-59°C.

3' -Azido-3' -desoxy-5 ‘ -O-pivaloylthymidin:

Beregnet: 0:51,27, H:6,03, N:19,93 Fundet : 0:51,07, H:6,05, N:19,83 20 Smp. 99-100°C.

3' -Azido-3' -desoxy-51 -0-(3-methylbutyryl)thymidin:

Beregnet: 0:50,24, H:6,13, N:19,53 Fundet : 0:50,27, H:6,ll, N:19,49 25 67,46{d,lH,J5#6=l, 2Hz,6H), 66,13 (t, IH, 1' H), 64, 55-4,15(m, 3H, 3' H og 5ΌΗ2), 63,8-4,15(m, 1H,4'H), 60,9(d,6H, J=6,4Hz, methylgrupper på 5'butyryl) 30 3 * -Azido-4* -desoxy-5' -0-palmitoylthymidin:

Beregnet: 0:61,67, H:8,57, N:13,85 Fundet : 0:61,85, H:8,59, N:13,75 67,45(d,lH, J5#6=l,OHz,6H), 66,12(t, IH, 1 Ή) , 35 64, 5-4, 05 (m, 3H, 3 ’ H og 5*CH2). 64.03-3,8(m, IH, 4Ή) 25 DK 175122 B1 62.35- 2«11(m, 4H,2'H og (CH2>1 af palmitoyl), 61,8 d, 3H, J5f 6=1,OHz, 5CH3) 61.35- 0, 6(m, 29H,5tpalmitoyl (CH2)i3CH3) 5 3' -Azido-31 -desoxy-5' -O-toluylthymidin:

Beregnet: C:56,10, H:4,97, N:l8,17 Fundet : C:55,88, H:5,00, N:18,09 Smp. 73°C

10 NMR optaget i DMSO-dg NMR: 67,95-7,29(m, 5H; bH,cH,6H), 66,16 (t,lH,l'H), 64,6-4,4 (m, 3H, 3Ή, 5‘H), 64,2-4,0 (m,lH,4’H), 62,39 (s,3H,dCH3), 61,63 (s,3H,5CH3) 15 3'Azido-3'-desoxythymidin-5' -0-(hydrogensuccinat):

Beregnet: 0:44,98, H:4,83, N:17,96 Fundet : 0:44,90, H:4,77, N:17,85 NMR optaget i DMSO-dg 20 NRM: 67,46 (s,lH,6H), 66,13 (ιη,ΙΗ,Ι'Η), 64,48-4,40 (m,lH,3'H), 64,34-4,20 (m,2H,5’H), 63,99-3,94 (πν, IH,4'H), 61,78 (s,3H,5CH3) 3' -Azido-3' -desoxy-5' -mesylthymidin: 25 Beregnet: 0:38,25, H:4,37, N:20,28, S:9,28 Fundet : 0:38,15, H:4,38, N:20,19, S:9,30 Smp. 253°C (destruktion) NMR optaget i DMSO-dg 30 NMR: 67,49 (d, IH, Jg, 5=1,0 Hz, 6H), 66,15 (t,IH, Jx . f 2· = 6,6 Hz, 1Ή), 64,54-4,41 (ro, 3H;3Ή, 5Ή), 64,14-4,02 (m,lH,4'H), 63,24 (s, 3H, 5'-roesyl CH3), 61,79 (d,3H,J5,6= 1,0 Hz, 5CH3) 1 3' -Azido-5' -0-( 3-chlorbenzoy 1) -3' -desoxythyroidin: DK 175122 B1 26

Beregnet: C:50,31, H:3,97, N:17,26, C:l-8,74 Fundet : C:50,16, H:4,03, N:17,13, C:l-8,66 NMR optaget i DMS0-d6 5 NMR: «11,37 (s,lH,3-NH), «7,98-7,43 (m,5H?5’-phenyl,6H), «6,17 (dd,lH; Jl'#2a,e®»^ Hz» ^l',2b,=^'2 Hz, løH), «4,68-4,48 (m,3H;3'H,5'H), «4,14-4,11 (m,lH,4'H), «2,48-2,41 (m, 2H, 2Ή), «1,64 (d,3H,Js,e= 1,2 Hz, 5CH3) 10

Referenceeksempel 3 * -Azldo-3* -de soxy thymidin a) 2,3* -Ånhydrothymidin

Man opløste thymidin (85,4 g, 0,353 nol) i 500 ml 15 vandfri DMF og tilsatte det til N-(2-chlor-l,l,2-tri- fluorethyl)diethylanin (100,3g, 0,529 mol) (fremstillet ifølge fremgangsmåden hoe D.B. Ayer, J. Med·

Chem. 6, 608 (1963)). Man ophedede denne opløsning til 70°C i 30 minutter og udhældte den derefter i 950 20 ml ethanol (BtOH) under kraftig omrøring. Produktet udfældedes fra denne opløsning og blev frafiltreret. Alkoholfiltratet blev isafkølet og derefter filtreret under tilvejebringelse af forbindelsen nævnt i overskriften.

25 Smp. = 228-230eC.

b) 3' -Azido-3 * -de sory thymidin 2,3'-Anhydrothymidin (25 g; 0,1115 mol) og Na#3- (29g; 0,446 mol) blev udeuspenderet i en blanding af 250 ml 30 OMF og 38 ml vand. Man holdt reaktionsblandingen un der tilbagesvaling i 5 timer og udhældte den derefter ill vand. Den vandige opløsning blev ekstraheret med EtOAc( 3 z 700 ml). EtOAc ekstrakterne blev tørret over Na2S04, filtreret, og EtOAc blev bortfordam-35 pet under vakuum under dannelse af en viskøs olie.

Denne olie blev udrørt med 200 ml vand under tilvejebringelse af forbindelsen nævnt i overskriften som et fast stof, som blev frafiltreret.

Smp. = 116-118°C.

DK 175122 B1 27

Eksempel T1

Mononatriumsalt af 31-azido-3'-desoxythymidin 1 g 3'-azido-3'-desoxythymidin blev opløst i 50 ml destilleret vand. pH blev bragt til 12 ved hjælp af _______ . -_5 IN NaOH. Omtrent halvdelen af opløsningen blev frysetør ret._Man tilvejebragte forbindelsen nævnt i overskriften som et lyofiliseret pulver.

Analyse beregnet for CioH12N5Na04*6/10 N2O Beregnet: C 40,03 H 4,43 N 29,34 Na 7,66 10 Fundet: C 39,88 H 4,34 N 23,23 Na 7,90

Eksempel 12

Fremstilling af 5' -monophosphat af 3' -azido-3' -desoxy-thymidin 15 Man opløste 3'-azido-3'-desoxythymidin (0,5 g, 1,87 mmol) i 5 ml triethylphosphat og afkølede blandingen til -5°C. Man tilsatte phosphoroxychlorid (0,685 ml, 7 mmol) på en gang til den hurtigt omrørte opløsning og opretholdt den derefter ved -10°C i 22 timer. Deref-20 ter udtog man en prøve og satte den til koncentreret ammoniumhydroxid. Analyse af denne prøve på TLC (cellulose, n-PrOH:H2« 7:3 v/v) viste intet udgangsmateriale til stede og viste en enkel fluorescerende plet med lavere mobilitet end nucleosidet. Man udhældte så reak-25 tionsblandingen på 20 ml is og vand. Derefter anbragte man den i et isbad og regulerede pH af opløsningen til 7,5 ved hjælp af 2 N NaOH. Den basiske blanding blev ekstraheret én gang med chloroform og én gang med ether. pH i det vandige lag blev igen tilpasset til 7,5 og man 30 indkoncentrerede i vakuum til fjernelse af rester af organisk opløsningsmiddel. Materialet blev opbevaret ved -10°C, indtil det kunne blive renset som følger:

Man fremstillede deaktiveret trækul ved at vaske kokosnødtrækul (50-200 mesh, lOOg) med 500 ml 1 N HC1, 3 35 1 vand, 35 ml 3% toluen i 95% ethanol, 600 ml 95% etha nol og til slut hurtigt med vand. Deaktiveret trækul (12 ml vådt bundfældet trækul) blev tilsat under omrø- 28 DK 175122 B1 ring til monophosphatopløsningen (0,72 g# 1,8 mmol, 30 ml). Man dekanterede fra og vaskede trækullet med 150 ml vand. Nucleotidet blev elueret fra trækullet ved vask med 120 ml 1,5 M ammoniumhydroxid i 50% ethanol* 5 Denne opløsning blev filtreret gennem et 0,22 mikronfil-ter, indkoncentreret under vakuum til 10 ml, filtreret gennem en Amico^Centriflo CF-25 membran og lyofiliseret under tilvejebringelse af diammonium 3'-azido-31-desoxy-thyraidin-5'-monophosphat som et fast stof. Denne for-10 bindelse blev karakteriseret som et nucleosid 5'-monophosphat, idet 5'-nucleotidase kunne nedbryde til nuc-leosidet.

1 5 Eksempel Ί 3 31 -Azido-5' triphosphat-3 * -desoxythymidin og 3 ’ -azido-5' -diphosphat-3' -desoxythymidin_ a) Bi s(tri-n-buty1ammonium)pyrophosphat

20 En søjle af DOW 50 ( Dowex® ionbytterharpiks - DOW

Chemical Laboratories) pyridinharpiks blev fremstillet, idet man hældte 40 ml harpiks i en søjle med diameter på 25 cm og vaskede med vand til gennemløbet ikke mere var farvet· Man opløste 25 pyrophosphatdecahydrat (1,12 g, 2,51 mmol) i 30 ml vand og satte det til søjlen« Søjlen blev elueret med vand. En 125 ml fraktion af gennemløbet, som indeholdt UV-absorberende materiale, blev indsamlet. Man reducerede rumfanget til 10 30 ml under vacuum og tilsatte tri-n-butylamin (1,2 ml). Rumfanget blev under vakuum reduceret, og remanensen blev tørret ved fire gange at blive inddampet sammen med pyridin. Man opbevarede produktet i en fryser (-5°C).

* 35 29 DK 175122 B1 b) Hydrogenform af S'-azido-S'-monophosphat-S'-des- oxythymidin_

Man fremstillede hydrogenformen af monophosphatet ved at lade ammoniumsaltet« tilvejebragt i Eksem- 5 pel 14« (0,1 g, 0,283 mmol) opløst i 6 ml vand, passere gennem en 1,5 ml (10 ækvivalenter) søjle, fyldt med DOW 50 H+.

c) Phosphormorpholidatderivat af 3*-azido-31 -desoxy- 10 thymidin_"_

Man opløste 0,283 mmol af hydrogenformen af monophosphatet, tilvejebragt i trin b) i 9 ml vand.

Man tilsatte morpholin (99 ni, 1,13 mmol, 4 ækvivalenter) og ophedede opløsning til tilbagesva-15 ling. Derefter tilsatte man dicyclohexylcarbodi- imid (0,234 g, 1,13 mmol, 4 ækvivalenter) opløst i t-butanol (5 ml) over en periode på tre timer. Reaktionen blev holdt under tilbagesvaling natten over. Reaktionsblandingen blev afkølet til stue-20 temperatur, filtreret, og man fjernede opløs ningsmidlerne under vakuum. Man tilsatte ethanol og inddampede under vakuum fire gange. Remanensen blev opløst i methanol og phosphormorpholida-tet udskilledes efter tilsætning af ether. Man 25 udrørte bundfaldet med ether fire gange og tørre de det ved roterende fordampning. Herved opnåedes titelforbindelsen.

d) 31 -Azido-31 -desoxythymidin-5' -triphosphat 30 Phosphormorpholidatderivatet tilvejebragt i trin c) blev tørret, idet man fjernede pyridin i vakuum fire gange. bis-(n-Bu)3N-pyrophosphatet, tilvejebragt i trin a) blev også tørret ved fjernelse af pyridin under vakuum. Man opløste 35 phosphormorpholidatet i 5 ml pyridin og satte det til den beholder, der indeholdt pyrophosphatrea-genset. Man lod reaktionen foregå natten over \ 30 DK 175122 B1 ved stuetemperatur. Pyridinen blev fjernet under vakuum. Man satte vand til remanensen og fjernede det under vakuum tre gange. Remanensen blev frossen.

5 Man optøede remanensen og opløste den i 50 ml vand. Opløsningen blev påsat en søjle (1 x 10 cm) af DEAE Sephadex°A-25, som var blevet bragt i ligevægt med-50 mmol ammoniumbicarbonat. Man udludede phosphaterne med en 300 ml lineær gradient 10 på 50-800 mmol ammoniumbicarbonat. Fraktio nerne, der indeholdt diphosphatnucleotidet blev sammenbragt, det samme gjaldt triphosphatnucleo-tidet. De sammenbragte diphosphat- og triphos-phatfraktioner blev tørret hver for sig i vakuum, 15 genopløst i vand, tørret igen, genopløst i vand og lyofiliseret.

Eksempel 14 20 Enzymsyntese af 3,-azido-5'-triphosphat-3'-desoxythymi- din_

5'-triphosphatet blev fremstillet ud fra 5'-di-phosphatet ved hjælp af pyruvatkinase og nucleosiddi-phosphatkinase. Reaktionsblandingen indeholdt: 6 mM

25 3'-azido TDP, 12 mM adenosintriphosphat, 40 mm MgCl2» 40 mM kaliumpiperazin-N-N1-bis(2-ethansulfonsyre) PIPES

puffer (pH 6,8), 30 mM phosphoenolpyruvat, 40 IU/ml nuc-leosiddiphosphatkinase og 100 iU/ml pyruvatkinase i et totalrumfang på 5 ml. Man lod reaktionsblandingen inku-30 bere i fem dage ved 37°C. Reaktionsblandingen blev påsat en søjle (2,5 x 10 cm) af DEAE Sephadex®A-25, som var blevet bragt i ligevægt med ammoniumbicarbonat. Nuc-leotiderne blev elueret med en gradient på 100-1000 mM bicarbonat. Fraktioner, der indeholdt triphosphatet, 35 blev sammenbragt og inddampet under vakuum til tørhed. Forbindelsen blev yderligere renset ved hjælp af en præparativ HPLC søjle (Whatman, Inc., Magnum 9 SAX) med en gradient på 10-100 mM kaliumphosphat, pH 3,5 som elue- \

DK 175122 B1 I

ringsmiddel. Den opnåede forbindelse blev yderligere I

renset ved hjælp af en DEAE Sephadex®A-25 søjle som I

ovenfor. Fraktionerne« der indeholdt tetraammonium-3* - I

azido-3'-desoxythymidin~5' -triphosphat blev sammenbragt, I

5 tørret under vakuum, genopløst i vand og lyofiliseret I

under tilvejebringelse af titelforbindelsen. I

Claims (15)

1. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som aktivt middel omfatter et farmaceutisk acceptabelt derivat af 3'-azido-3'-desoxythymidin og en 5 farmaceutisk acceptabel bærer, hvor præparatet omfatter en enhedsdosis på mellem 5 og 1500 mg af den aktive ingrediens .

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bæreren er en væske.

3. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at bæreren er en ikke vandig væske.

4. Præparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at bæreren er vand.

5. Præparat ifølge krav 3 eller 4, kende- 15 tegnet ved, at det er sterilt.

6. Præparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det er tilpasset indgivelse ved injektion.

7. Præparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er indeholdt i et lukket lille glas.

8. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bæreren er et ikke vandigt faststof.

9. Præparat ifølge krav l, 3 eller 8, kendetegnet ved, at det er tilpasset oral indgivelse.

10. Præparat ifølge et hvilket som helst af krave- 25 ne 1, 3 eller 8, kendetegnet ved, at det er på form af en tablet eller kapsel.

11. Præparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 3 eller 8, kendetegnet ved, at det giver forsinket frigivelse af den aktive ingrediens efter 30 oral indgivelse.

12. Præparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter et aromastof. DK 175122 B1 I

13. Præparat ifølge et hvilket som helst af krave- I ne 1 til 12, kendetegnet ved, at enhedsdosen I er på-mellem 10 og 1000 mg af den aktive ingrediens. .

14. Præparat ifølge et hvilket som helst af krave- I 5 ne 1 til 12, kendetegnet ved, at enhedsdosen I er på mellem 20 og 700 mg af den aktive ingrediens. H

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat I ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 14, k e η - I detegnet ved, at den omfatter at forene et far- I 10 maceutisk acceptabelt derivat af 3'-azido-3'- desoxythymidin med den nævnte farmaceutisk acceptable I bærer.