DK163022B

DK163022B - Fremgangsmaade til bestemmelse af en immunologisk bindedygtig analyt ved sandwichanalyse og maaling af tilbagedissociationshastighed

Info

Publication number: DK163022B
Application number: DK528286A
Authority: DK
Inventors: Klaus Peter Kaspar
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1985-11-05
Filing date: 1986-11-05
Publication date: 1992-01-06
Also published as: EP0227921B1; DK528286A; EP0227921A1; JPH0476628B2; DK163022C; DE3669078D1; DE3539215A1; US4966839A; KR870005248A; DK528286D0; JPS62112064A; ATE50459T1

Description

i

DK 163022 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde og et reagens til bestemmelse af en bindedygtig analyt efter den tosidige heterogene immunoanalyses princip.

Tosidige immunoanalyser (sandwich-test) har i sammenligning med de kompetitive immunoanalyser tydelige fordele med hensyn til nøjagtighed, følsomhed og hurtig gennemførlighed.

Ved ændring af reagenskoncentrationen, udgangsstofskoncentrationen eller prøvekoncentrationen gennemgår måleværdien jq et maksimum ved immunokemiske målemetoder. Denne effekt betegnes som Hook-effekten. Ved sandwich-immunoanalyser med anvendelse af fastfase observeres først ved stigende analyt-mængde et tilsvarende stigende målesignal, der ved yderligere forøgelse af analytten så igen kan aftage. I dette tilfælde 22 kan et bestemt måleresultat fremkomme ved to forskellige ana-lytmængder (se fig. 1). Denne af analytmængden afhængige effekt betegnes "high dose" Hook-effekt og begrænser anvendelsen af sandwich-analyser trods de ovenfor omtalte fordele. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Der angives forskellige grunde til Hook-effekten, såsom hetero 2 genitet af de i receptorerne tilstedeværende antistoffer eller 3 ufuldstændig vask (se D. Rodbard et al., Immunochemistry 1978, 4 vol. 15, s 77-82). Uafhængigt deraf må Hook-effekten imidlertid 5 nødvendigvis på baggrund af teoretiske overvejelser optræde 6 ved alle ettrins-sandwich-tests. Som ettrins-tests betegnes 7 her alle de tests, hvor analytten i samme opløsning bringes 8 til reaktion med to for denne specifikke receptorer, som dan 9 ner en "sandwich" med analytten, og derved eller derefter 10 fikseres til et uopløseligt bæremateriale, i modsætning til 11 den sekventielle reaktionsgennemførsel, ved hvilken ikke bundet 12 analyt efter omsætning af analytten med en første specifik 13 receptor og fiksering af det dannede kompleks til en fast 14 fase fjernes ved vask af den faste fase før omsætning med 15 en anden specifikt mærket receptor. I ettrins-sandwich-tes- 16 tene optræder Hook-effekten nødvendigvis, når begge specifikke receptorer er i underskud i forhold til analytten, så-

DK 163022 B

2 ledes at kun en del af analytten er bundet i kompleks med konjugat, og af disse komplekser fikseres også kun en del på den faste fase.

5 Også alle proteinbestemmelser v.h.a. DASP-sandwich-princippet, ved hvilken begge specifikke receptorer er opløselige, og deres kompleks med analytten er via en yderligere receptor fikseret til den faste fase, er i den ovennævnte betydning ettrinstests og udviser en Hook-effekt. Dette kan blandt andet ved tumormarkører, som fx AFP, CEA, hCG, IgE o.s.v. fejlagtigt give resultater i normalområdet hos allerede højpatologiske prøver. Derfor afvises·anvendelsen af ettrins-sandwichfremgangsmåder ofte principielt til medicinske bestemmelser. En forståelse af sådanne måleresultater, der p.g.a. Hook-effekten giver falske værdier, er et væsentligt fremskridt, da alle fordele ved ettrins-sandwich-metoden (reaktionstidsforkortelse, følsomhed, nøjagtighed o.s.v.) kan udnyttes uden risikoen for at få et falsk resultat p.g.a. Hook-effekten med i købet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35 K.L. Hoffmann et al. (Clinical Chemistry, vol. 30, nr. 9, 2 1499, (1984)) beskriver, at et stort antal forsøg blev foretaget 3 for at forhindre fremkomsten af Hook-effekten. Således blev 4 fx en trinvis analyse foreslået, hvorved analytten først omsæt 5 tes med en receptor på den faste fase, derefter vaskes den 6 faste fase omhyggeligt efterfulgt af en anden inkubation med 7 en opløselig mærket receptor, og til sidst vaskes endnu en 8 gang for at skille den bundne mærkede receptor fra den ubundne.

9

Derudover foreslås en formindskelse af prøvestørrelsen, gennem 10 førelse af testen med forskellige fortyndinger af analytten, 11 eller anvendelse af et lille område af kalibreringskurven.

Det anbefales også at anvende markører med ringe aktivitet for på denne måde at kunne anvende høje koncentrationer af mærkede receptorer, uden at aktiviteten (radio-, fluorescens-, enzym-, farvedannelsesaktivitet) derved bliver for stor.

DK 163022 B

3

Yderligere beskriver Hoffmann et al. (Clinical Chemistry, vol 30, nr. 9, 1499, (1984)) en bestemmelsesmetode til en ettrins-sandwich-test, hvorved forøgelsen af den til den faste fasebundne del af den mærkede receptor følges kinetisk, 5 og disse værdier lagres i en computer. Man beregner derpå reaktionshastigheden. Derved kan måleresultater, der fremkaldtes som følge af Hook-effekten, adskilles fra andre værdier, fordi de udviser væsentlig ringere kompleksbindingforøgelse. Denne metode har den ulempe, at der skal anvendes yderst omstæn-delige og med store omkostninger forbundne computermetoder for at erkende, om der ved bestemmelsen foreligger en Hook-effekt. Desuden er denne metode uegnet til enzymimmunologiske bestemmelser.

25 Det er derfor et formål med opfindelsen at anvise en fremgangsmåde, ved hvilken de p.g.a. Hook-effekten fremkomne falske måleresultater let kan erkendes, uden at de kendte fremgangsmåders iboende ulemper, såsom tab af følsomhed, nøjagtighed eller forhøjede arbejdsomkostninger, reagensomkostninger og 20 apparatomkostninger, derved må tages med i købet.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til bestemmelse af en bindedygtig analyt efter den heterogene immunoanalyses princip ved inkubation af en prøveopløsning, 25 der indeholder analytten, sammen med en specifik, i opløst fase foreliggende mærket første receptor, der kan binde analytten, og en i en fast fase foreliggende anden receptor, som ikke krydsreagerer med den første receptor, og som kan fiksere et kompleks, der indeholder analytten og den første recep-30 tor, adskillelse af faserne efter inkubationen og kvantitativ måling af den til den faste fase bundne markør, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bestemmer tilbagedissociationshastigheden for den til den faste fase bundne markør i den opløste fase og anvender kvotienten mellem tilbagedisso-35 ciationshastigheden og måleværdien som mål for rigtigheden

DK 163022 B

4 af forsøgsresultatet af den første måling.

I sædvanlige sandwich-tests bliver, efter fraskillelse af prøve- og reagensvæsken, det fastfase-fikserede sandwichkompleks 2 bestemt ved mængden af den bundne mærkede receptor (radioaktivt, enzymatisk, fluorometrisk eller på lignende måde mærket).

Ved denne fraskillelse og fjernelse af ikke bundet mærket receptor forstyrres analyt-receptor-bindingsligevægten, og der begynder en tilbagedissociation af sandwichkomponenten, som til sidst medfører tilstedeværelse af ikke-fastfasefikseret mærket receptormolekyler i den flydende fase. Tilbagedissociationsgraden kan fastslås (konstateres) ved bestemmelse af markøren og faseadskillelse i den faste eller fraskilte flydende fase. Som flydende fase kommer fx vaskevæsken og ved enzymimmunoanalyser substratopløsningen til enzymbestemmelsen på tale. I denne substratopløsning bestemmes ifølge opfindelsen først den på faseadskillelsestidspunktet fremkomne måleværdi (farvesignal) og dernæst kinetikken for den yderligere farvedannelse som mål for markørens tilbagedissociation.

20

Da den ved tilbagedissociationen af analyt-receptor-komplekset bevirkede frigivelse af en markørmængde forløber tilnærmelsesvis som en førsteordens reaktion, er den proportional med analytmængden eller det dertil hørende målesignal. Derfor 25 kan den frigivne markørmængde udtrykkes ved en kvotient α = forandring af måleværdien efter faseadskillelse per tidsenhed divideret med måleværdien. Det har overraskende vist sig, at når der optræder en Hook-effekt, ændres kvotienten α betydeligt i sammenligning med tilfælde, hvor der ikke optræder 30 en Hook-effekt.

Således kan det v.h.a. kvotienten α bestemmes, om en opnået måleværdi v.h.a. kalibreringskurven må omregnes til en ana-lytmængde, eller om måleværdien er fremkommet ved en Hook-effekt 35 og dermed må tilskrives en analytmængde ovenfor den øverste standard.

DK 163022 B

5

Analyt og receptor kan indenfor rammerne af fremgangsmåden ifølge opfindelsen principielt være alle stofpar, som er indbyrdes bindedygtige. I denne definition er indenfor opfindelsens rammer foruden immunologisk bindedygtige stofpar også ind-j- befattet sådanne stof par, som opfører sig analogt dermed.

Udover stofparret antigen-antistof (betegnelsen antistof omfatter her også de kendte immunologisk aktive fragmenter af såvel polyklon som monoklon oprindelse) som i første omgang kommer i betragtning, og som foretrækkes anvendt, hører herunder også stofparrene protein A-immunog lubo lin G, avidin-biotin, concanavalin A-lectin såvel som DNA-DNA (hybridbinding). Alle disse stofpar kan ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmes efter den heterogene immunoanalyses princip (sandwich-test) ved ettrins-inkubation.

15

Som receptor kommer indenfor opfindelsens rammer komponenterne af de ovennævnte specifikke bindedygtige stofpar som sådanne i betragtning eller derivater deraf, især de ofte som kon-jugat betegnede derivater af bindedygtige stoffer, som dannes 20 ved kovalent binding til et markørmolekyle. Et indenfor opfindelsens rammer foretrukket eksempel på en sådan receptor, der foreligger som konjugat, er et antistof eller et antistoffragment, som er bundet kovalent til et markørenzym. Der kan også som markørenzym anvendes farvestofmolekyler, farve-25 dannelseskomponenter, især fluorescensfarvestofmolekyler, eller der kan anvendes andre stoffer, der er egnet til et påvisningssystem. Et sådant konjugat kan også være mærket radioaktivt.

30 Alternativt kan antistoffet også selv indeholde radioaktive atomer som markering. I dette tilfælde består den mærkede første receptor fx af et radioaktivt antistof.

Den anden til den faste fase bundne receptor kan ligeledes 35 bestå af en partner fra de ovennævnte bindedygtige stofpar som et sådan eller som et derivat deraf. Den til den faste fase bundne anden receptor tjener ved sandwich-analyse til

DK 163022 B

6 at fiksere komplekset af analyt og første receptor til en fast fase, og således at gøre det let at fraskille fra den flydende fase. Med henblik herpå kan den anden receptor endvidere enten binde direkte med analytten, der skal bestemmes, 5 hvorved den i dette tilfælde er rettet mod en anden determinant hos analytten end den første receptor, og består som følge deraf fortrinsvis af et monoklonalt antistof eller et fragment deraf. Den anden receptor kan dog også være rettet mod en anden, ikke til selve analytten hørende, determinant hos kom-plekset af analyt og første receptor. I denne udførelsesform anvendes fortrinsvis yderligere en tredje receptor, som ligeledes er specifik for analytten, og som genkender en anden determinant end den første receptor. Analyt, første receptor og tredje receptor danner da et kompleks, og i dette tilfælde 15 anvendes som anden receptor fortrinsvis et antistof, som binder med den tredje receptor. I en særlig foretrukken udførelsesform indeholder den første specifikke receptor et antistoffragment, især et Fab-fragment, og den tredje receptor består af et komplet antistof, hvorved den tredje receptor 20 og antistofdelen af den første receptor i dette tilfælde er monoklonal. Den anden receptor er i dette tilfælde hensigtsmæssigt rettet mod en del af den tredje receptor, særligt foretrukket mod Fc-delen af den tredje receptor, når den første receptor indeholder et Fab-fragment. Det er også muligt at 25 derivatisere den tredje receptor og anvende en anden receptor, der er rettet mod dette derivatiserede sted.

Den for fremgangsmåden ifølge opfindelsen vigtige tilbagedissociationshastighed af den til den faste fase bundne mar-30 kør bestemmes af bindingsstyrken mellem en receptor, der er rettet mod analytten, og selve analytten. Ifølge en foretrukken udførelsesform af opfindelsen indstilles tilbagedissociationshastigheden for i det mindste en analytkoncentration på en middel værdi, d.v.s. at der hverken ønskes en for høj eller 35 en for lav tilbagedissociationshastighed. Såfremt hastigheden er for høj, bliver måleintervallerne nødvendigvis stadig kortere, hvilket fører til unøjagtigheder. En for lille dissocia-

DK 163022 B

7 tionshastighed forøger den til gennemførelse af fremgangsmåden nødvendige tid betydeligt og vanskeliggør erkendelsen af en formindsket tilbagedissociationsgrad, som den forekommer, når der foreligger Hook-effekt. Da fremgangsmåden fortrinsvis ^ gennemføres på konventionelle analyseautomater, kan analyseautomatens kapacitet ikke længere udnyttes fuldt ud.

Ved middelstor tilbagedissociationshastighed forstås en sådan, der muliggør måleintervaller mellem cirka 20 sekunder og cirka jø 60 minutter. En dissociationshastighed i dette område opnås ved passende udvælgelse af bindingsstyrken mellem en receptor og dens bindingspartner, analytten, altså f.eks. ved hensigtsmæssig udvælgelse af antistoffets bindingsstyrke og/eller ved hjælp af tilsætninger i reaktionsmediet, der påvirker 15 bindingsstyrken, såsom overfladeaktive stoffer og salte. Især anvendes hertil detergenter og/eller chaotrope ioner. Fortrinsvis afstemmer man derved de forskellige komponenter og det fastsatte måletidsrum således til hinanden, at i det mindste 10% af den til den faste fase bundne markør atter fradissocierer 20 ved mindst én analytkoncentration inden for dette tidsrum (måleinterval).

I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen under anvendelse af en enzymmærket første receptor inkuberer man hensigtsmæssigt, 25 efter inkubationen af alle komponenter og adskillelse af faserne, den fraskilte faste fase sammen med en opløsning af et farvereagens til bestemmelse af mærkningsenzymet, hvorefter farvereagensopløsningen atter skilles fra den faste fase, og tilbagedissociationshastigheden i den fraskilte opløsning 30 fastlægges ved mindst to målinger i bestemt tidsmæssig afstand. Denne udførelsesform beror på, at under kontakten mellem far-vereagensopløsning og fast fase bidrager den samlede mængde af det til den faste fase bundne mærkningsenzym og eventuelt under denne inkubation fradissocieret mærkningsenzym til farve-35 dannelsen. Efter faseadskillelse følger en yderligere farve-dannelse, som kun kan føres tilbage til fradissocieret mærk-

DK 163022B

8 ningsenzym. Den fradissocierede mængde mærkningsenzym (der svarer til den fradissocierede mængde kompleks fra analyt og første receptor) kan derfor let bestemmes ved to målinger.

5

Ifølge en yderligere udførelsesform for opfindelsen inkuberes den faste fase efter den første faseadskillelse i stedet for sammen med en substratopløsning, som i tilfælde af den enzymmærkede receptor, påny sammen med en flydende fase, og efter 2ø fornyet faseadskillelse bestemmes enten formindskelsen af markøren i den faste fase eller den til den flydende fase overgåede markør. Denne udførelsesform egner sig især til radioaktive markører eller farvemarkører eller fluorescensmarkører.

15

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan principielt anvendes til alle sandwich-testsystemer. Forudsætningen er blot en målelig tilbagedissociation af den mærkede første receptor efter fraskillelse af den ikke bundne, i den flydende fase 20 tilbageværende første receptor.

Rammebetingelserne for fremgangsmåden ifølge opfindelsen vælges således, at der forekommer godt måleligs tilbagedissociationer med og uden Hook-effekt.

25

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen i forbindelse med tegningen. På denne viser:

Fig. 1 en grafisk fremstilling af ekstinktionens (måleværdi) 30 afhængighed af analytkoncentrationen. Den markerede del af kurven viser kalibreringskurven til koncentrationsbestemmelsen af analytten.

Fig. 2 et indsatselement til en centrifugalanalyseautomat, 35 der er egnet til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

9

DK 163022 B

Eksempel 1 Bestemmelse af AFP

5 A) Fremstilling af reagensopløsningen 1) Substratpuffer 70 mmol/1 HEPES/NaOH pH-værdi = 7,0 10 154 ymol/1 natriumchlorid

3 g/1 kvægserumalbumin, pH

5 mmol/1 chlorphenolrødt-Ø-D-galactosid (fremstillet ifølge DE-patentskrift nr. 33 45 748) 2 g/1 "Tween" 20 (ikke-ionisk detergent) 15 2) Receptor-l-opløsning:

Som receptor 1 anvendes et monoklonalt mus-anti-AFP-antistof, som genkender en anden antigendeterminant end receptor 3.

20 En ascitetsvæske, der indeholder dette antistof, tilsættes ammoniumsulfat indtil 1,8 M/l. Præcipitatet optages i 15mM/l natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7,0, som indeholder 50 mM/1 natriumchlorid. Den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose. Det fuldstændige 25 antistof spaltes på i og for sig kendt måde til Fab-fragment.

De opnåede Fab-fragmenter kobles med β-galactosidase ifølge metoden beskrevet af E. Ishikawa, J. of Immunoassay 4 (1983), s. 209-327.

30 3) Receptor-2-opløsning: Får-anti-mus-Fcy-antiserum oprenses som angivet under 2) og underkastes ligeledes en passage over DEAE-cellulose.

35

DK 163022B

10 4) Receptor-3-opløsning:

Som receptor 3 anvendes et monoklonalt muse-anti-AFP-anti-stof, som genkender en anden determinant end receptor 1. En 2 ascitetsvæske, der indeholder disse antistoffer, tilsættes indtil 1,8 mol ammoniumsulfat. Bundfaldet optages i 15 mmol/1 natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7,0, der indeholder 50 mmol/1 natriumchlorid. Den således opnåede opløsning underkastes en passage over DEAE-cellulose.

10 B) Fremstilling af reagensbærere 1) Reagensbærer 1 £2 40 μΐ af en opløsning, der per liter indeholder 100 mmol natriumphosphat, pH-værdi 7,3 (37°C), 2 mmol magnesiumchlorid, 9 g natriumchlorid, 5 g kvægserumalbumin, 20 5 mg anti-AFP-monoklonalt antistof fra mus (receptor-3-opløs- ning), 2000 U anti-AFP-antistof-(mus)-Fab-fragment-8-galactosidase-konjugat (receptor-l-opløsning); aktivitet bestemt ved orto-nitrophenyl-|3-D-galactosid ved 25 37°C.

- dryppes på et flor, som består af kommercielt polyesterpapir. Derefter tørres ved stuetemperatur. Disse flor opbevares indtil deres anvendelse ved 4°C og en relativ luftfug-30 tighed på 20%.

2) Reagensbærer 2:

Til et cellulose-flor fikseres ifølge bromcyanaktiverings-35 fremgangsmåden (DE-offentliggørelsesskrift nr. 1768512) fåre- antistof mod Fcy-delen af muse-antistoffer (receptor-2-opløs-

DK 163022B

11 ning), hvorved der forekommer 10 yg antistof til fiksering per g fibermateriale. Ved vask fjernes ukoblet antistof, og floret tørres skånsomt ved stuetemperatur. Lagringen af således opnåede flor følger analogt med reagensbaerer 1.

5

Bestemmelsen v.h.a. disse to reagensbærere 1 og 2 udføres med det i DE-offentliggørelsesskrift nr. 3 425 008.5 beskrevne apparat til gennemførelse af analytiske bestemmelser (fig.

2).

10

Dette omhandler et rotorindsatselement til centrifugalanalyse-automater, hvilket indsatselement består af et formlegeme, som har et prøvepåføringskammer, der står i forbindelse med flere reagensfelter, som hver indeholder et med et bestemt ^5 reagens imprægneret sugedygtigt bæremateriale, mindst et blande-ventilkammer og et målekammer, som tilsammen danner en prøve-væsketransportvej, der fører fra radialt indre til radialt ydre, når indsatslegemet er fastgjort på rotoren, og som endvidere har mindst et yderligere kammer til optagelsen af en 20 væske og en transportvej, der fra dette kammer fører til målevejen og i det mindste delvis er identisk med prøvevæsketrans-portvejen. Derved fører prøvevæsketransportvejen fra et prøvepåfør ingskammer (P) via et med sugedygtigt materiale fyldt kammer (a), der indeholder puffer, et kammer (c) og et mellem 25 kammer (a) og (c) anbragt første ventilkammer (Vkl), til et andet ventilkammer (Vk2) og fra dette via kammeret (d) og via et opfangningskammer (AK) til målekammeret (K). Til optagelse af en yderligere væske findes et som pumpekammer udformet substratkammer (PK), som via en af doseringskammer 30 (DK) og kapillar (Kap) bestående doseringsindretning og et overløbskammer (UK) er forbundet med det andet ventilkammer (Vk2). Fig. 2 viser skematisk det anvendte rotorindsatselement.

Reagensbærer 1 placeres på felt c i rotorindsatselementet 35 og reagensbærer 2 på felt d. Derved pipetteres 40 yl prøve gennem en åbning i den øvre rand direkte på feltet a. Prøven er fortyndet i forholdet 1:5 med 0,9% NaCl-opløsning.

270 yl substratopløsning pipetteres i kammer PK. Ved hjælp 12

DK 163022 B

af et egnet centrifugeringsprogram, hvor høje omdrejningstal veksler med stilstand, transporteres prøve og substratopløsning derpå i retningen mod skillematrix og kuvette.

Derved elueres i løbet af programmet receptoren 1 og 3 v.h.a. prøvevæsken fra felt c, og den homogene blanding bringes derefter til reaktion. På felt d bindes det dannede kompleks til receptoren 2. Overførslen af prøven fra felt c efter felt d følger inden for meget kort tid.

10

Substratopløsningen deles v.h.a. doseringskammeret DK i portioner, hvoraf de første tjener til udvaskning af overskydende konjugat, der ikke har dannet kompleks.

^ Den via kompleksdannelse på d bundne β-galactosidaseaktivi- tet er proportional med den i prøven indeholdte AFP-mængde. Denne aktivitet bestemmes med en yderligere substratportion, hvorved substratet i løbet af en 5 minutters reaktion omsættes til farvede produkter. Den dannede farve og den yderligere 2Q farveudvikling/minut i den flydende fase måles i kuvetten ved 600 nm.

Under disse betingelser blev følgende resultater opnået: 25 1 35

DK 163022 B

13

AFP

Ιϋ/ml 0 60 135 200 50.000 100.000 200.000 500.000 1.000.000 Måleværdi (mE) 274 1516 2783 5363 >8.000 6587 4670 2782 2069

Stigning (¾ 19 131 217 305 - 48 40 30 32 min 10 afstigning/ måleværdi x 10C 6/9 8,6 7,8 5,7 - 0,7 0,9 1,1 1,5 15 --:----— -— Hook-Effekt! -

Alle målinger blev gennemført ved 600 nm ved en lagtykkelse 20 på 0,3 cm og omregnet til en lagtykkelse d = 1 cm.

Eksempel 2 (IgE-bestemmelse): 25

Der blev arbejdet analogt med eksempel 1 med følgende forskelle: a) Som receptor 3 anvendtes et mod human-IgE rettet monoklo-30 nalt mus-anti-IgE-antistof.

b) Som receptor 1 anvendtes endnu et mod IgE rettet monoklo-nalt mus-anti-IgE-antistof, der imidlertid genkender en anden antigendeterminant end receptor 3.

35 c) Ved fremstillingen af reagensbærer 1 benyttedes 12 mU/test til receptor-l-opløsning.

DK 163022B

14 d) Prøven fortyndes i forholdet 1:3 med NaCl-opløsning.

Under de tilsvarende betingelser blev følgende resultater opnået: 5 U/ml 0 52 90 182 278 383 4891* 12.2001* 29.750 64.500 118.000 Måleværdi (mE) 2) 88 604 1098 2050 2898 3646 4073 6445 4573 3151 2230 10 Stigning 2) 4 34 60 101 127 146 150 68 65 98 38 (mE/min) α = stigning 4,5 5,6 5,5 4,9 4,4 4,0 3,7 1,1 1,4 1,5 1,7

—Π---r. x 10C

måleværdi 25 Hook-Effekt 1) Ved koncentrationer mellem ca. 500 og ca. 12.000 U/ml var 2o fotometermåleområdet overskredet.

2) Alle målinger foregik ved 600 nm med en 0,3 cm kuvette, og ekstinktionerne blev derefter omregnet til 1 cm lysvej.

De sidste tre spalter viser værdier, som blev fremkaldt af 25 Hook-effekten og ikke kunne anvendes til en kvantitativ bestemmelse af analytten.

Eksempel 3 30 Mikrotiterplader (MTPs) belægges per fordybning med 200 μΐ af en opløsning af et monoklonalt mus-anti-AFP-antistof i receptor-2-opløsning i en koncentration på 1 yg/ml i puffer A (20mM carbonatpuffer, pH 9,6) i 1 time ved stuetemperatur (RT). Derefter mættes ikke-specifikke bindingssteder ved ef-35 terinkubation af MTPs med 300 yl puffer B (50 mM kaliumphos-phatpuffer, pH 7,5, 154 mM NaCl, 1% RSA, 1 g/1 "Tween" 20) i 1/2 time ved stuetemperatur.

DK 163022 B

15

Efter vask med 300 μΐ puffer C (100 mM HEPES/NaOH, pH 7,25, 154 mM NaCl, 2,5 g/1 fåre-normal-IgG, 0,5 mM Mg-L-aspartat, 2 g/1 "Tween" 20) tilsættes per fordybning 50 μΐ prøve og 200 μΐ af en enzym-antistof-konjugat-opløsning (receptor-1-5 opløsning; β-galactosidase-konjugatet af et Fab-fragment fra endnu et monoklonalt mus-anti-AFP-antistof, hvilket ikke hæmmer antistoffet fra receptor 2; 0,5 U/ml; måling af aktiviteten med o-nitrophenyl-6-D-galactosid ved 37°C) i puffer C og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur. Derefter bortkastes væsken ^0 fra MTP-fordybningen, fordybningerne vaskes med 300 μΐ puffer B og inkuberes derefter sammen med 250 μΐ substratopløsning (5 mM chlorphenolrødt-g-D-galactosid, 70 mM HEPES/NaOH, pH 7,0, 154 mM NaCl, 3 g/1 RSA, 2 g/1 "Tween" 20) i 2 1/2 time ved stuetemperatur.

15

Efter afslutningen af denne inkubationstid udtages 100 μΐ fra hver fordybning i mikrotiterpladen og overføres til skålene i en yderligere mikrotiterplade. Straks i tilslutning hertil foregår en absorptionsmåling (måling t^) med et i hande-20 len værende mikrotiterplade-måleudstyr ( = 570 nm, bichroma-tisk korrektion ved 630 nm), og efter en yderligere times inkubationstid ved stuetemperatur følger en anden absorptionsmåling (måling t^) under de samme betingelser som måling t^. Absorptionsforskellen mellem måling og t^ er proportio-25 nal med den med substratopløsningen overførte enzymmængde. Resultaterne af et typisk forsøg er vist i følgende tabel: (AFP) i lU/ml 1,5 10 40 156 625 2.500 10.000 40.000 30-------- mE.. 67 419 1720 >2) >2) >2) 1643 485 ti mE _-mE,. 32 171 540 . / / 141 51 35 t2 ti ^ α 1} 478 408 314 ^ ^ 86 105 16

DK 163022 B

De to sidste spalter viser, at der foreligger en Hook-effekt. mE -π® 1) α =-----------x 100 mEti 5 2) = over fotometer-måleområdet (2000 mE) 10 15 20 25 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en bindedygtig analyt g ifølge den heterogene immunoanalyses princip ved inkubation af en prøveopløsning, der indeholder analytten, sammen med en specifik, i opløst fase foreliggende mærket første receptor, der kan binde analytten, og en i en fast fase foreliggende anden receptor, som ikke krydsreagerer med den første receptor, og som kan fiksere et kompleks, der indeholder analytten og den første receptor, adskillelse af faserne efter inkubationen og kvantitativ måling af den til den faste fase bundne markør, kendetegnet ved, at man bestemmer tilbagedissociationshastigheden for den til den faste fase 15 bundne markør i den opløste fase og anvender kvotienten mellem tilbagedissociationshastigheden og måleværdien som mål for rigtigheden af forsøgsresultatet af den første måling.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at man konstaterer tilbagedissociationshastigheden ved hjælp af mindst én anden måling af den til den faste fase bundne markør i en bestemt tidsmæssig afstand fra den første måling.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg-25 net ved, at man anvender en enzymmærket første receptor, inkuberer den faste fase sammen med en opløsning af et farvereagens til bestemmelse af mærkningsenzymet, skiller derefter reagensopløsningen fra den faste fase og fastslår tilbagedissociationshastigheden i reagensopløsningen ved hjælp af mindst 30 to målinger i bestemt tidsmæssig afstand. 1 2 3 4 5 6 Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2,kendeteg 2 ne t ved, at man efter den første måling igen inkuberer 3 den faste fase sammen med en flydende fase og bestemmer til- 4 35 bagedissociationshastigheden ved måling af den i den faste 5 fase tilbageblevne markør, eller den til den flydende fase 6 overgåede markør. 18 DK 163022 B

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man tilsætter en tredje receptor, som er specifik for analytten, og som er rettet mod en anden determinant hos analytten end den første receptor, og at den 2 anden receptor kan bindes til den tredje receptor.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man som tredje receptor anvender et monoklonalt antistof, at den første receptor indeholder et Fab-fragment fra et mono- £ø klonalt antistof, og at den anden receptor kan bindes til Fc-delen af den tredje receptor.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at tilbagedissociationshastigheden for -^5 mindst en receptor i reagenset indstiles ved udvælgelse af antistoffet ifølge dets bindingskonstant og/eller ved tilsætning af detergenter og/eller chaotrope ioner.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, 20 at man udvælger tilbagedissociationshastigheden for mindst en receptor således, at mindst 10% af den til den faste fase bundne markør atter dissocierer ved mindst én koncentration af analytten i måletidsrummet. 25 1 35