DK162776B - Ekspressionsvektor indeholdende et amylasekodningsgen og fremgangsmaade til fremstilling deraf, genetisk konstruerede mikroorganismer med evne til massiv produktion af amylolytiske enzymer og fremgangsmaade til fremstilling af saadanne enzymer - Google Patents

Description

i

DK 162776 B

Opfindelsen vedrører gensplejsning og angår specifikt en ekspressionsvektor indeholdende et amylasekodningsgen og en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt udnyttelsen af denne ekspressionsvektor til at frembringe mikroorga-5 nismer med evne til massiv produktion af amylolytiske enzymer og en fremgangsmåde til fremstilling af amylase ved dyrkning af sådanne mikroorganismer.

Selv om betegnelsen "gensplejsning" ofte anvendes til at 10 beskrive en bred teknik til kunstig modifikation af en organismes genetiske information, anvendes den i denne beskrivelse med krav kun med hensyn til in vitro dannelsen af rekombinant-DNA ud fra en donormikroorganisme og en egnet vektor, hvorved man selekterer på basis af den 15 ønskede genetiske information og indfører den selekterede DNA i en egnet mikroorganisme (værtsmikroorganisme), således at den ønskede (fremmede) genetiske information bliver en del af værtens genetiske komplement. Betegnelsen "genetisk konstrueret mikroorganisme" skal i denne 20 beskrivelse og krav betyde en mikroorganisme fremstillet ved denne teknik.

Betegnelserne "amylase” og "amylolytisk enzym" er synonyme og henfører i denne beskrivelse med krav bredt taget 25 til de enzymer, som er i stand til at katalysere hydrolysen af stivelse, som a-amylase, Ø-amylase, isoamylase (herunder e-1,6-glucosidaserne, såsom pullulanase), glu-coamylase osv.

30 Der er selvfølgelig blevet skrevet en del om emnet gensplejsning i de senere år (blandt to af de mange udmærkede oversigter kan nævnes "DNA Cloning and the Analysis of Plasmid Structure and Function" af K. N. Timmis, S. N.

Cohen og S. C. Cabello, Prog. Molec. subcell Biol. 6, 35 (1978), side 1-58 og "Lamboid Phages that Simplify the

Recovery of in vitro Recombinants" af Noreen E. Murray, W. J. Brammar og K. Murray, Molec. gen. Genet. 150,

DK 162776B

2 (1977), side 53-56), herunder mange rapporter, som beskriver hidtil ukendte, genetisk modificerede mikroorganismer med værdifulde egenskaber. Det japanske fremlæggelsesskrift nr. SHO 52-76480 (fremlagt den 27. juni 5 1977, indleveret den 19. december 1975 som SHO 50-150641) angiver fremstillingen af høj-amylaseproducerende stammer af mikroorganismer ved in vivo-teknikken mutagenese, transduktion og transformation til akkumulering af flere genetiske træk til fremme af amylaseproduktion i en Ba-10 cillus-mikroorganisme. Denne teknik, som ikke omfatter gensplejsning som defineret ovenfor, er begrænset til en enkelt eller nogle få genetisk nært beslægtede mikroorganismer. Desuden er disse stammer ikke egnede til den genopformering (f.eks. ved hjælp af fag eller plasmid), som 15 anvendes ifølge den foreliggende opfindelse med henblik på højere enzymproduktion. I en ny artikel af Yuko Yone-da, Scott Graham og Frank E. Young med titlen "Cloning of a Foreign Gene Coding for Alpha-amylase in Bacillus sub-tilis", Biochemical and Biophysical Research Communica-20 tions 91, nr. 4, side 1556-1564 (den 28. december 1979), beskrives kloningen af et α-amylase-kodningsgen i en Bacillus subtilis ved binding af fraspaltet DNA fra Bacillus amyloquefaciens H med DNA fra skabelon-fagen phi 3T og efterfølgende transformation af amylase-manglende Ba-25 cillus subtilis celler. Artiklen angiver ikke, at genet kan opformeres med ledsagende massiv produktion af amyla-seenzymet, hvilket er hovedformålet med den foreliggende opfindelse.

30 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse fremstilles genetisk konstruerede mikroorganismer, som er i stand til under passende dyrkningsbetingelser at producere væsentligt større mængder af amylolytiske enzymer, end der kan produceres af donormikroorganismen. De således 35 producerede amylaser kan have en eller flere karakteristiske egenskaber, som gør dem særligt nyttige til industrielle enzymatiske stivelsehydrolyser (f.eks. til enzy-

DK 162776B

3 matisk smeltning og/eller saccharifleering af stivelse til fremstilling af klæbemidler, stivemidler, maltodex-triner, stivelsessirupper af forskellig sammensætning, maltose, dextrose osv.), såsom modstandsevne over for høj 5 temperatur, modstandsevne over for tungmetalforgiftning osv.

De omhandlede mikroorganismer fremstilles ved hjælp af ekspressionsvektoren ifølge opfindelsen, som er særegen 10 ved det der er angivet i den kendetegnende del af krav 1.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den omhandlede ekspressionsvektor er særegen ved det der er angivet i den kendetegnende del af krav 12.

15

Ved fremgangsmåden ifølge krav 12 ekstraheres først DNA fra en bakterie (donormikroorganismen), som er i stand til at producere mindst ét amylolytisk enzym. Denne DNA plus, som vektoren, DNA fra et derivat af fag λ spaltes 20 (med et passende restriktionsenzym), og de resulterende fragmenter kombineres og ligeres til dannelse af ekspressionsvektorer, hvoraf nogle vil indeholde et amylasekod-ningsgen. Ekspressionsvektorerne gøres derpå biologisk aktive ved indsætning i egnede værtsceller (f.eks. E. co-25 li) ved in vitro encapsidering eller transfektion.

De resulterende kloner screenes derpå for tilstedeværelsen af et amylasekodningsgen, og en eller flere positive kloner selekteres og formeres, hvorved der tilvejebringes 30 nye, genetisk konstruerede bakterier, som er i stand til under egnede dyrkningsbetingelser at producere væsentligt større mængder amylase, end der kan produceres af donormikroorganismerne. Eventuelt ekstraheres den nye fags DNA, spaltes og sub-klones ind i en anden vektor, som kan 35 være enten et plasmid eller en fag, og de nye kloner screenes og selekteres på basis af tilstedeværelsen af et amylasekodningsgen. Flere på hinanden følgende "sub-sub-

DK 162776 B

4 kloninger" kan også gennemføres.

Det særegne ved den genetisk konstruerede mikroorganisme ifølge opfindelsen er angivet i den kendetegnende del af 5 krav 8.

Foruden at frembringe nye, genetisk konstruerede mikroorganismer, som er "overproducenter" af amylase, har opfindelsen den yderligere fordel, at den hovedsageligt resul-10 terer i overførsel af genet for produktionen af et enkelt amylolytisk enzym, hvorved man i høj grad formindsker den rensning, som er nødvendig med kulturer af ikke-genetisk konstruerede mikroorganismer.

15 Når først den genetisk konstruerede mikroorganisme inde holdende den ønskede rekombinant-DNA er blevet frembragt, dyrkes mikroorganismen på en sådan måde, at rekombinant-DNA' en opformeres, hvorved der fremstilles amylase i væsentligt større mængder, end der kan fremstilles af do-20 normikroorganismen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af amylase er særegen ved det der er angivet i den kendetegnende del af krav 20.

25 Når vektoren er et derivat af fag λ, i hvilke tilfælde værtsmikroorganismen nødvendigvis vil være E. coli, kan opformering og enzymproduktion gennemføres som følger.

Hvis fagen er lytisk, dyrkes værtsmikroorganismen, dvs.

30 E. coli, først til formering af cellerne til den ønskede tæthed, derpå inficeres de med en egnet mængde af bakte-riofagen, og systemet dyrkes, indtil cellevæggene ødelægges, og amylasen undslipper ud i dyrkningsmediet.

35 Når vektor-vært-systemet er en passende λ-lysogen E. coli, dyrkes den inficerede værtsmikroorganisme først ved 32 °C for at formere bakteriecellerne til en passende

DK 162776 B

5 tæthed, hvorefter temperaturen hæves til 42 °C og holdes der i en vis tid for at inducere den lytiske cyclus og derpå bringes til 37 °C og holdes der for at frembringe opformering af det fremmede indførte DNA med ledsagende 5 produktion af store mængder amylase. Cellevæggene kan til sidst nedbrydes, afhængigt af betingelserne, i hvilke tilfælde amylasen undslipper ud i dyrkningsmediet.

Når vektoren er et multikopi-plasmid, såsom pBR 322 eller 10 pACYC 184, opnås opformering af den fremmede DNA i sig selv. Alternativt dyrkes den genetisk konstruerede mikroorganisme indeholdende plasmid-DNA først til formering af bakteriecellerne til den ønskede tæthed, hvorefter der tilsættes chloramphenicol. Eftersom antibioticumet inhi-15 berer proteinsyntese, forhindrer det yderligere celleformering og amylaseproduktion, men tillader formering (opformering) af plasmid-DNA1en i cellerne. Til sidst adskilles cellerne fra dyrkningsmediet og vaskes for at fjerne chloramphenicolet. Til amylaseproduktion dyrkes 20 cellerne derpå igen, selvfølgelig i fravær af chloramphenicol, til produktion af massive mængder amylase.

Det er naturligvis vigtigt ved ethvert gensplejsningsarbejde at være i stand til at "mærke" og derved selektere 25 disse kloner indeholdende den ønskede genetiske information. Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse kan dette let gennemføres ved udsåning på et medium indeholdende stivelse, hvis der søges α-amylase-, Æ-amylase- eller glucoamylase-aktivitet. Dyrkningsmediet farves derpå 30 med iod; kloner, der udviser amylaseaktivitet på et stivelsesholdigt medium, omgives af et hvidt område. En specifik, foretrukken farvningsmetode vil blive beskrevet i det følgende. Hvis der søges pullulanase-aktivitet, ud-sås klonerne på et BBL-trypticase-medium indeholdende 35 pullulan. Denne teknik er beskrevet mere detaljeret i det følgende.

DK 162776 B

6

Opfindelsen vil nu blive beskrevet mere detaljeret, herunder de bestemte materialer og teknikker, som er blevet anvendt i arbejdet. Det vil indses, at mange af de anvendte teknikker er "standard" og velkendte for fagfolk; 5 ikke desto mindre vil nogle af disse blive beskrevet i detaljer for at sikre tydelighed.

Donormikroorgani sme 10 Donormikroorganismen skal være en bakterie, som er i stand til at producere mindst én amylase (herunder selvfølgelig den ønskede amylase), og med fordel vil producere en amylase med egenskaber, som er ønskelige inden for den industrielle hydrolyse af stivelse, f.eks. modstands-15 evne overfor høj temperatur eller metalforgiftning. Antageligvis kunne donoren også være en eukaryotisk amylase-producerende mikroorganisme (f.eks. en svamp eller gær); men på grund af den relative simpelhed i arbejdet med en prokaryotisk kilde for DNA sammenlignet med eukaryoterne 20 er det foreliggende arbejde blevet afgrænset til bakterier, og opfindelsen er derfor begrænset til anvendelsen af en bakteriedonor. Som det vil ses af eksemplerne, er der med held blevet anvendt stammer af Bacillus megaterium, Bacillus coagulans. Bacillus cereus og Klebsiella pneumo-25 niae til fremstilling af gentisk konstruerede mikroorganismer, som er i stand til at producere massive mængder af henholdsvis a-amylase, varmeresistent α-amylase, 0-amylase og pullulanase.

30 Ligerings- og restriktionsenzymer I det foreliggende arbejde er der hele vejen igennem som ligeringsenzym anvendt T4-DNA-ligase, men det vil let indses, at ethvert DNA-ligerende enzym kan anvendes. De 35 specifikke restriktionsenzymer, som er anvendt i dette arbejde er anført i eksemplerne. Udvælgelsen af et egnet restriktionsenzym kan selvfølgelig foretages af fagmanden •

DK 162776 B

7 under anvendelse af velkendt teknik. Den her anvendte metode til udvælgelse af et restriktionsenzym til yderligere forsøg har været at spalte den fra donormikroorganismen ekstraherede DNA (donor-DNA'en) ved hjælp af de for-5 skellige restriktionsenzymer og udvælge det eller de mest egnede til yderligere forsøg på basis af enzymets evne til at udskære DNA'en i talrige fragmenter af størrelser på mellem 2 og 15 kilobaser.

10 Vektorer

Der er flere grunde til at derivater af fag λ er særligt effektive til kloning af den fra donoren ekstraherede DNA: 1) Deletionsmutanter af fag λ tillader indsætning af 15 fremmede DNA-fragmenter af forskellige størrelser (selv følgelig afhængigt af det bestemte λ-derivat) og tillader yderligere simpel identifikation af de kloner, som indeholder fremmed DNA. 2) Der er udviklet forskellige derivater af fag λ, som tillader anvendelsen af flere re-20 striktionsenzymer, hvilket forøger chancerne for gennem førelse af en heldig kloning. 3) Meget gode opformeringer af fremmede gener er mulige under anvendelse af passende derivater af fag λ. 4) Efter ligering foretages udvindingen af rekombinantkloner let ved transfektion eller in 25 vitro pakning. På grund af dens alsidighed, som ingen anden for tiden eksisterende vektor kan frembyde, anvendes ved udøvelsen af opfindelsen derivater af fag λ som vektor og E. coli som vært til den indledende kloning af den fra donoren ekstraherede dna.

30

Andre fordele ved anvendelse af en fag fremfor et plasmid til den primære kloning er følgende: (1) Procenten af re-kombinanter med indsætning af fremmed DNA er højere; (2) Bakterierne lyseres, hvorved cellernes indhold og dermed 35 al amylase frigøres til mediet, hvilket letter sporingen ved iodfarvningsteknikken; (3) En fags resistens overfor iod er højere end en levende bakteries.

DK 162776 B

8

Udvælgelsen af et egnet plasmid som vektor til en subklo-ning ligger inden for den kompetente genetikers fagmæssige kunnen, hvorved et kriterie selvfølgelig er eksistensen af et enkelt eller et begrænset antal restriktions-5 steder for det restriktionsenzym, som skal anvendes.

De plasmider, som anvendes i det meste af arbejdet, er pBR 322 og pACYC 184. I dets intakte tilstand medfører plasmid pBR 322 resistens overfor både ampicillin og te-10 tracyclin og indeholder et enkelt restriktionssted for hvert af enzymerne PstI, EcoRI, Hindlll, BamHI og Sall. Overskæring og indsætning ved PstI stedet ødelægger evnen til at medføre resistens overfor ampicillin, medens indsætning i BamHI og Sall stederne vil ødelægge resistensen 15 overfor tetracyclin. Indsætning i Hindlll stedet ødelægger somme tider resistensen overfor tetracyclin, forudsat at det klonede gen ikke har sin promotor.

I dets intakte tilstand medfører plasmidet pACYC 184 re-20 sistens overfor både tetracyclin og chloramphenicol og indeholder enkelte restriktionssteder for hvert af enzymerne EcoRI, Hindlll, BamHI og Sall. Overskæring og indsætning ved EcoRI stedet ødelægger evnen til at medføre resistens overfor chloramphenicol, medens indsætning i de 25 tre andre overskæringssteder for Hindlll, BamHI og Sall har de samme virkninger i plasmid pBR 322, da dette område er fælles for begge plasmider.

Til sub-kloning i Bacillus subtilis anvendtes plasmid pC 30 194 som vektor. Dette plasmid har et enkelt Hindlll sted og medfører resistens overfor chloramphenicol.

Værtsmikroorgani sme 35 Da derivater af fag λ kun kan udtrykkes i E. coli må denne selvfølgelig være værten for rekombinant-fag-DNA fremstillet ifølge opfindelsen. Når rekombinant-DNA'en er i

DK 162776 B

9 form af et plasmid, kan der på den anden side anvendes enhver mikroorganisme, som er i stand til at modtage og replicere sådant plasmid-DNA, f.eks. andre bakterier eller gærarter, såsom Saccharomyces cerivisiae.

5

Af praktiske grunde er der anvendt E. coli stammer (f.eks. HB101) i det meste af det foreliggende arbejde, fordi de er velkendte stammer fra et genetisk synspunkt og er modtagelige for infektion af kendte fager og plas-10 mider med deraf følgende forøget kapacitet til enzymoverproduktion.

Som beskrevet i eksempel II A kan et rekombinant-plasmid subklones ind i et plasmid, såsom pC 194, der er i stand 15 til at repliceres i B. subtilis.

Fremgangsmåde

Fremgangsmåden vil blive beskrevet med hensyn til et to-20 trins klonings forsøg, hvor det første trin (shotgun) anvender en fag, og det andet anvender et plasmid.

Efter at donormikroorganismen, restriktions- og ligeringsenzymerne og det specifikke derivat af fag λ er ud-25 valgt, ekstraheres DNA'erne, overklippes med restriktionsenzym, blandes, og de forenede stykker ligeres ved konventionel teknik.

DNA’en gøres derpå biologisk aktiv i en E. coli ved 30 transfektion eller in vitro encapsidering. I arbejdet med λ-DNA er der opnået meget gode resultater ved anvendelse af encapsideringsteknikken (B. Hohn and K. Murray, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3259-3263, 1977). De kloner, som har modtaget fremmet DNA, identificeres derpå ved 35 passende metoder. Hvis der er anvendt en indsætningsvektor, såsom λ-ΝΜ590 eller λ-ΝΜ607, giver de kloner, der indeholder fremmed DNA, klare pletter, medens de, der

DK 162776 B

10 ikke indeholder fremmed DNA, giver uklare pletter. Når der er anvendt en udskiftningsvektor, såsom λ-ΝΜ761 eller λ-ΝΜ781, kan identifikationen udføres ved udsåning på en E. coli lac amber recipient på lactose-indikator-medium, 5 f.eks. McConkey, EMB eller X gal.

Mange (flere tusinde) af klonerne, som har modtaget fremmed DNA, udsås derefter på medier indeholdende stivelse og screenes for tilstedeværelsen af et amylasekodningsgen 10 ved den tidligere nævnte iodfarvningsmetode. Man må selvfølgelig sørge for ikke at anvende så høj en koncentration af iod, at fagen dræbes, og dette kan være et problem, hvis iodet tilsættes i form af en opløsning. Den mest foretrukne farvningsteknik er at udsætte pladerne for iod-15 dampe i kort tid; denne teknik er blevet anvendt med stort held.

En foretrukken metode til sporing af kloner med pullula-nase-aktivitet, hvorved der ikke anvendes iodfarvning, 20 vil nu blive beskrevet. Fagerne udsås på petriskåle indeholdende BBL Trypticase plus pullulan i en koncentration på omkring 0,25%. Pullulanet i mediet omkring de "positive" pletter hydrolyseres til maltotriose af pullulanasen, hvilken maltotriose udnyttes af bakterierne. Derfor vok-25 ser de bakterier, som trives på maltotriose, bedre end de andre i udsåningen med den konsekvens, at pletterne, der producerer pullulanase, er omgivet af en opak ring af voksende bakterier og let kan spores. Denne teknik er beskrevet i detaljer i eksempel IV.

30

En positiv klon (eller flere) opsamles derpå og formeres.

Denne kan selvfølgelig udgøre den "endelige" genetisk konstruerede mikroorganisme, og den kan anvendes til at producere store mængder amylase ved passende dyrkning som 35 beskrevet tidligere. Alternativt kan klonen anvendes som en kilde for DNA til en anden kloning i et plasmid eller en anden, mere egnet fag. Fremgangsmåden med sub-kloning

DK 162776 B

11 i et plasmid vil nu blive beskrevet.

Igen ekstraheres DNA'en fra klonerne under anvendelse af standardteknik og spaltes med et restriktionsenzym, plas-5 midet spaltes på lignende måde, fragmenterne blandes, og de rekombinerede fragmenter ligeres. Når der anvendes plasmid pBR 322 udføres identifikationen af kloner, som har modtaget DNA indeholdende et amylasekodningsgen, ved at gøre DNA'en biologisk aktiv i en vært, såsom E. coli, 10 ved transformation i et dyrkningsmedium indeholdende am-picillin eller tetracyclin, afhængigt af det anvendte restriktionsenzym. Dyrkningsmediet vil også indeholde stivelse eller pullulan, og identifikationen af kloner indeholdende amylasekodningsgenet udføres ved én af de tidli-15 gere beskrevne teknikker. Positive kloner dyrkes derpå, og plasmid-DNA'en kan derpå opformeres ved hjælp af chloramphenicol som beskrevet tidligere.

Tegningen viser kort over bakteriofag-λ af vild type 20 (fig. 1, a) og alle anvendte vektorer og nye rekombinant-plasmider fremstillet i overensstemmelse med de følgende eksempler. Nærmere betegnet viser fig. 1 også kort over fagene λ-ΝΜ590 (b) og λ-ΝΜ781 (c), (Murray, N.E., Bram-mar, W.J., Murray, K., Molec. gen. Genet, 150 (1977), 53-25 61). Fig. 2 viser kort over plasmiderne pBR 322 (Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyne-ker, H.L., Boyer, H.W., Gene 2 (1977), 95-113) og pAYC 184 (Chang, A.C.Y., Cohen, S.N., J. Bact. 134 (1978), 1141-1156). Fig. 3 er et kort over det hidtil ukendte 30 plasmid pCP 1, og fig. 4 er et kort over det hidtil ukendte plasmid pCP 2. Fig. 5 belyser eksempel II A, idet • den viser plasmiderne pC 194, pCP 2.3 og det endelige hidtil ukendte plasmid pCH 1. Fig. 6 og 7 viser kort over plasmiderne henholdsvis pCP 3 og pCP 4. I alle kortene 35 over de hidtil ukendte rekombinant-plasmider er donor- DNA'en angivet ved en fuldstreg.

DK 162776 B

12

Eksemplerne tjener til nærmere belysning af opfindelsen: Procenter er beregnet på vægt, med mindre andet er anført. Alle forsøg blev gennemført ifølge NIH (U.S.A.) retningslinjerne for indeslutning.

5

EKSEMPEL I

Kloning af et alpha-amylase-gen 10 Der anvendtes følgende materialer:

Restriktionsendonuclase Hindlll.

T4-DNA ligase.

Fag λ-ΝΜ590. Fag-DNA'en blev fremstillet ved phenoleks-15 traktion ud fra højrensede fag-partikler. Plasmid pBR

322. Plasmid-DNA' en blev renset fra lysozym-lyserede E. coli celler i cæsiumchlorid-ethidiumbromiddensitetsgradi-enter.

Værtsmikroorganisme, E. coli HB 101.

20

Donormikroorganismen var en stamme af Bacillus megaterium med de følgende mikrobiologiske egenskaber: (1) Morphologi: stave (0,5-0,7 um x 2,0-5,0 um), 25 motil, Gram-positiv, sporer er terminale til subterminale.

(2) Næringsboullon: god vækst.

30 (3) Næringsagarbouillon: god vækst; kolonierne er tætte i midten og mere diffuse udenom.

(4) Mælk: peptonisering uden ændring af pH-værdi.

35 (5) Gelatine: ikke smeltet.

DK 162776 B

13 k (6) Reduktion af nitrater: negativ.

(7) Katalase-reaktion: negativ.

5 (8) Oxidase-reaktion: negativ.

(9) Cytochromoxidase-reaktion: negativ.

(10) Produktion af indol: negativ.

10 (11) Dannelse af f^S: negativ.

(12) Udnyttelse af carbonhydrater: udnytter arabinose, xylose, galactose, glucose, levulose, maltose, raf- 15 finose, saccharose, stivelse og producerer syre ud fra dem. Rhamnose, mannose, melibiose, inulin og sa-licin udnyttes ikke.

(13) Udnyttelse af polyoler: sorbitol og mannitol udnyt- 20 tes; adenitol, dulcitol og inositol ikke.

(14) Decarboxylase-reaktion på lysin: negativ.

(15) Ureolyse: svag.

25 (16) Modstandsevne over for tungmetaller: vokser direkte 4* 4* 4" på 500 ppm Cr (17) Natriumchlorid-væske: vækst ved NaCl-koncentration på 3,5%.

30

(18) Optimumtemperatur for vækst: 30-37 °C

Maksimumtemperatur for vækst: 40-50 °C Minimumtemperatur for vækst: 5-20 °C

35 (19) Oxygenkrav: aerob.

DK 162776 B

14

Mikroorganismen blev identificeret som Bacillus megateri-um på basis af dens mikrobiologiske egenskaber med henvisning til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition), R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, coedi-5 tors; published by the Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. Mikroorganismen er blevet deponeret i henhold til Budapest-traktaten i the National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIB), Torry Research Station, PO Box No. 31, 135 (Abbey Road, Aberdeen AB9 8 DG, 10 Scotland, den 12. februar 1980 og har fået NCIB nr.

11568.

Det følgende er en beskrivelse af den anvendte fremgangsmåde.

15 A. In vitro rekombination mellem λ og B. megaterium DNA'er

Omkring 7 ug B. megaterium DNA blev spaltet med 10 enhe-20 der HindiII ved 37 °C i 1 time i et volumen på 25 μΐ "Tris"-puffer ved pH 7,5. Omkring 2 ug -NM590 blev spaltet på lignende måde med det samme enzym. Reaktionen blev stoppet ved opvarmning til 75 °C i 10 minutter.

25 Der udførtes to prøvninger for at bestemme spaltningens effektivitet; %

DK 162776 B

15 næsten helt havde ødelagt fag-DNA’ens biologiske aktivitet.

De spaltede DNA*er blev blandet og inkuberet i 5 timer 5 ved 10 °C med 0,15 enheder T4-DNA-ligase for at tillade tilfældig gensammensmeltning og covalent forsegling af DNA-fragmenterne.

Ved enden af denne inkubation blev DNA'en blandet med et 10 in vitro encapsideringspræparat bestående af en blanding af to komplementære defekte fag-lysater (λ Dam og λ Earn) induceret fra ikke-undertrykkende stammer. I denne blanding kan ethvert DNA-molekyle, som har cos-enderne af λ-DNA og er af passende størrelse, inkorporeres i fagprote-15 in og således in vitro gendanne en biologisk aktiv fagpartikel, som er i stand til at inficere E. coli og producere et infektionscenter (plet).

For at bedømme effektiviteten af denne fremgangsmåde ud-20 førtes to kontroller: 1. En prøve af blandingen blev udpladet på E. coli, og 5 der fandtes 3 x 10 pletter pr. μg af den indførte λ-DNA.

Dette var omkring 100 gange mere, end der fandtes i det 25 spaltede præparat, hvilket indicerer en god effektivitet af ligase-behandlingen.

2. De således dannede pletter blev undersøgt visuelt. 70% af dem var klare i stedet for uklare, hvilket indicerer 30 tilstedeværelsen af et fragment af B. megaterium DNA, der er splejset ind i og derfor inaktiverer λ-genet Cl, som er ansvarlig for pletuklarhed.

Således kunne man påvise, at præparatet indeholdt en til-35 fældig prøve af alle mulige Hindlll fragmenter af B. megaterium DNA, som var forenelige med indsætning i fag λ-NM590.

DK 162776 B

16 B. Isolering af en fag λ-derivat bærende B. megaterium amylase

Resten af encapsideringsblandingen blev anvendt til at 5 indpode E. coli på et stort antal stivelsesholdige plader 3 med omkring 10 levedygtige partikler pr. plade. Efter vækst af den inficerede E. coli og dannelse af pletterne blev pladerne screenet for tilstedeværelsen af stivelsesnedbrydende pletter. Dette blev gjort ved udsættelse af 10 pladerne for ioddampe i kort tid; det var forventet, at de af en sådan fag dannede pletter ville være omgivet af et klart område stammende fra diffusionen og virkningen af amylase fra de lyserede celler. Der fandtes én sådan plet, og den fag, den indeholdt, blev øjeblikkelig opsam-15 let til dyrkning af en underkultur (en længere udsættelse for ioddampe ville have dræbt fagen). Afkommet af denne plet formerede sig konstant (amylaseproducerende) og er blevet betegnet som "λ-ΝΜ590 Amy 1". Fag λ-ΝΜ590 Amy 1 er blevet deponeret i henhold til Budapest-traktaten i NCIB 20 d. 12. februar 1980 som NCIB nr. 11569.

C. Genkloning af amylasegenet i plasmid pBR 322

Dette blev gennemført både for at opnå en overproduceren-25 de stamme og for let at fremstille en stor mængde DNA med amylasegenet.

1 ug DNA fra λ-ΝΜ590 Amy 1 og 0,3 ug plasmid pBR 322 DNA blev spaltet, blandet og behandlet med ligase som beskre-30 vet i afsnit A. Dette præparat anvendtes til at transformere (under anvendelse af sædvanlige metoder) stamme HB

101. Udvælgelsen skete med hensyn til ampicillin (ap)-resistens, en egenskab tilført cellerne ved tilstedeværelsen af dette plasmid. Dette plasmid tilfører normalt også 35 resistens over for tetracyclin (To). Imidlertid splitter indførelsen af fremmet DNA i dette plasmid tet-genet, således at mængden af tetracyclin-følsomme transformerede

DK 162776 B

17 kloner afspejler mængden af plasmider indeholdende klonet DNA. I dette tilfælde indeholdt 16% af klonerne et hidtil ukendt plasmid, som tilførte amylase-aktivitet til E. coli. (Ifølge den gængse internationale nomenklatur for 5 plasmider navngives de hidtil ukendte plasmider, som skal beskrives her, (pCP), og det specifikke plasmid i dette eksempel betegnes som (pCP 1).

Dette demonstrerer, at genkloning af et gen med det samme 10 enzym (i dette tilfælde Hindlll) er en meget effektiv 5 fremgangsmåde (16% i stedet for 1/10 ).

Den plasmidholdige mikroorganisme betegnes som E. coli CL 7001 (pCP 1) og er blevet deponeret i henhold til Buda-15 pest-traktaten i NCIB d. 12. februar 1980 som NCIB nr.

11570.

D. Opformering og enzymproduktion 20 Enzymproduktionen i plasmid (pCP l)-holdige celler blev forbedret på to måder som følger: 1. Mættede kulturer 25 Kulturer blev inkuberet natten over ved 37 °C på en roterende ryster i 5 liters med prelplader forsynede Erlen-meyer-kolber indeholdende 1 liter dyrkningsmedium (LB; gærekstrakttrypton).

30 2. Chloramphenicol-opformering

Kulturer blev inkuberet ved 37 °C på en roterende ryster i 5 liters med prelplader forsynede Erlenmeyer-kolber indeholdende 1 liter dyrkningsmedium (LB), indtil der var 35 nået en tæthed på 0,8 (650 nm), ved hvilket tidspunkt der tilsattes 150 ug/ml chloramphenicol. Dette forhindrede yderligere replicering af den kromosomale DNA; men ikke

DK 162776B

18 af det amylasegenholdige plasmid (pCP 1). Efter opformering (op til 3000 kopier) af plasmidet frem for kromosomal DNA blev chloramphenicolet fjernet for at tillade genoptagelse af proteinsyntesen.

5 Nærmere betegnet blev cellerne efter opformering adskilt fra mediet ved centrifugering, vasket for at fjerne chloramphenicol og dyrket igen til amylaseproduktion.

10 E. Enzymudvinding

Til udvinding af a-amylasen i meget ren form anvendtes "osmotisk chok" metoden. Denne fremgangsmåde, som er rapporteret af H. C. Neu og L.A. Heppel i J. Biol. Chem.

15 240, 3685-3692 (1965), var som følger.

Cellerne blev først dyrket natten over, hvorefter de blev suspenderet i en 25% opløsning af saccharose i 0,5 volumen kultur og rystet 10 minutter ved 24 °C, hvorved cel-20 lerne plasmolyserede. Derpå tilsattes EDTA til en slut-koncentration på 1 mM (for at gøre cellevæggene permeable), og materialet blev rystet i endnu 10 minutter ved 24 °C. Suspensionen blev centrifugeret, og cellerne blev hurtigt gensuspenderet i koldt (omkring 0 °C) vand og 25 rystet ved denne temperatur i 10 minutter. Suspensionen blev igen centrifugeret, og 96% af enzymet kunne udvindes fra supernatanten.

Til sammenligning blev mikroorganismen (Bacillus megate-30 rium) dyrket, og den enzymatiske aktivitet bestemt. Mængden af enzym pr. ml dyrkningsmedium blev målt ved DNS-me-toden, idet en enzymatisk enhed defineres som den mængde enzym, der producerer 1 mg reducerende sukker (der anvendes maltose som reference) pr. minut i en 10 minutters 35 inkubationstid. Substratet var meget ren amylose.

DK 162776B

19

Donormikroorganismen producerede 66,0 enzymatiske enhe-der/liter kultur. E. coli CL 7001 (pCP 1) mættede kulturer producerede 116,6 enheder/liter kultur, medens E. coli Cl 7001 (pCP 1) efter dyrkning (opformering) i 5 timer 5 med chloramphenicol efterfulgt af 15 timer uden chloramphenicol producerede 84,5 enheder/1. Dette viser, at den mættede dyrkningsmetode er tilstrækkelig til at give god forøgelse af enzymproduktionen.

10 Det enzym, som produceres af E. coli CL 7001 (pCP 1), der identificeres som en a-amylase, har de følgende egenskaber. Det spalter både amylose og amylopectin til glucose, maltose og maltotriose, hovedsagligt maltose, og det spalter både cyclodextrin og maltotriose til glucose og 15 maltose. Det spalter pullulan til panose og/eller isopa-nose, hvilken egenskab minder om et enzym, som fornylig er beskrevet af Mizucho Shimuzu, Mutsuo Kanno, Masaki Tamur a og Mikio Suekane "Purification and Some properties of a Novel Alpha-Amylase Produced by a Strain of Thermo-20 actinomyces vulgaris", Agric. Biol. Chem. 42, (9), 1978, side 1681-1688.

Den mikroorganisme, som i denne beskrivelse kaldes Bacillus megaterium, blev engang af opfinderne anset for at 25 være Bacillus circulans.

EKSEMPEL II

Kloning af et termoholdbart a-amylase-gen 30

Donormikroorganismen var en original stamme af Bacillus isoleret fra kompost og identificeret som Bacillus coagu-lans. Den producerer en termoholdbar α-amylase og har de følgende mikrobiologiske egenskaber.

35

DK 162776 B

20 (1) Morphologi: Stave (0,6-1 μπι x 2,5-5,0 μπι), motil, gram-positive og -negative. Sporer er centrale eller terminale, ikke deformerende.

5 (2) Næringsboullon: god vækst.

(3) Næringsagarskrå substrat: god vækst, filamentøs, spredende, flødeagtig hvid.

10 (4) Udnyttelse af organisk syre - citrat: positiv - malonat: negativ.

(5) Gelatine: Smeltning.

15 (6) Produktion af acetylmethylcarbinol (acetain): positiv.

(7) Ortho-nitrophenylgalactosid-hydrolyse: positiv.

20 (8) Reduktion af nitrater: positiv, gas kan produceres.

(9) Katalase-reaktion: positiv.

25 (10) Produktion af indol: negativ.

(11) Decarboxylase: - reaktion på - lysin: negativ - omi thin: negativ - arginin: negativ.

30 (12) Dannelse af I^S: negativ.

(13) Udnyttelse af carbonhydrater: udnytter arabinose, galactose, glucose, levulose, mannose, maltose, sac- 35 charose, stivelse, trehalose og producerer syre ud fra dem.

DK 162776 B

21 (14) Pullulan udnyttes på minimumsmedium.

(15) Udnyttelse af polyoler: glycerol, sorbitol, mannitol, inositol udnyttes; adonitol, dulcitol ikke.

5 (16) Ureolyse: negativ.

(17) Lecithinudnyttelse: negativ

10 (18) Optimumtemperatur for vækst: 50 °C

Maksimumtemperatur for vækst: 55-60 °C Minimumtemperatur for vækst: 15-25 °C

(19) Oxygenkrav: aerob og anaerob.

15

Stammen er blevet deponeret i henhold til Budapest-trak-taten i NCIB den 12. februar 1980, som NCIB nr. 11571.

DNA'en blev ekstraheret og udsat for virkningen for 20 EcoRI, Hindlll, PstI, Sall, BamHI og Bglll. Kun Bglll var 1 stand til at skabe mange fragmenter med et bredt område af molekylvægte. Det var imidlertid muligt at skabe fragmenter med EcoRI, når NaCl-koncentrationen blev sænket til 50 mM. Det blev derpå besluttet at anvende EcoRI til 25 at skabe fragmenter til kloning i en EcoRI λ-DNA-vektor (λ-ΝΜ781).

A. Restriktion af DNA'er fra B. coagulans og Λ-ΝΜ781 30 1,25 wg \-NM781-DNA blev overklippet med en enhed EcoRI i 25 al af den følgende puffer: 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 10 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM MgS04 og 100 mM NaCl.

35 2 μ g B. cuagulans DNA blev overklippet med det samme enzym i en lignende puffer, undtagen at NaCl-koncentration-

DK 162776 B

22 en var sænket til 50 mM. Inkubationen gennemførtes i 2 timer ved 37 °C, og reaktionen blev stoppet ved opvarmning til 75 °C i 10 minutter. Restriktionens fuldførelse blev kontrolleret ved elektroforese i 1% agarosegeler.

5 B. Ligering og udvinding af rekombinant-fager

De overklippede DNA-er blev blandet og ligeret under anvendelse af 2 enheder T^-DNA-ligase i en blanding inde-10 holdende 60 mM "Tris"-HCl (pH 8), 10 mM MgS04, 10 mM 2-mercaptorethanol og 0,1 mM ATP. Reaktionen fik lov at forløbe i 10-15 timer ved 10 °C. Efter ligeringen blev aliquots på 0,2 ug DNA blandet med ATP til opnåelse af en _2 slutkoncentration på 10 M. Disse aliquots blev under-15 kastet in vitro encapsidering og anvendt til at inficere stamme HB 101 af E. coli. Der blev opnået omkring 1,6 x 4 10 PFU (pletdannende enheder) pr. ug λ-DNA. Blandt disse fager udviste nogle amylaseaktivitet (med hensyn til sporing af amylaseaktivitet på petriskåle og med hensyn 20 udvinding og rensning af fagen se eksempel I).

Der blev iagttaget et temmeligt højt mængdeforhold af amylaseproducerende fager (1 pr. 400).

25 En blev udvalgt og betegnet som "λ-ΝΜ781 a Amy 1". Den er blevet deponeret i henhold til Budapest-traktaten i NCIB den 12. februar 1980, som NCIB nr. 11572.

C. Genkloning af amylasegenet fra λ-ΝΜ781 a Amy 1 i plas- 30 mid pBR 322 1 ug λ-ΝΜ781 a Amy 1 DNA og den samme mængde DNA fra plasmidet pBR 322 blev overklippet med EcoRI under anvendelse af de sædvanlige betingelser. Ligeringen og trans-35 formationen gennemførtes som forklaret i eksempel I. Kolonier af E. coli HB 101 indeholdende rekombinantplasmid blev sporet ved hjælp af deres amylaseaktivitet. En sådan •

DK 162776 B

23 koloni blev udvalgt og betegnet E. coli Cl 7002 (pCP 2).

Den er blevet deponeret i henhold til Budapest-traktaten i NCIB den 12. februar 1980, som NCIB nr. 11573.

5 D. Opformering af genproduktet

Opformeringen af det amylasekodende gen fra λ-ΝΜ781 o Amy 1 og amylaseproduktionen blev gennemført som følger. Værtsbakterien (E. coli HB 101) blev dyrket i LB-medium 10 med 2 mM MgC^ ved 37 °C, indtil der var nået en optisk tæthed på 0,3 (ved 650 nm). Derpå tilsattes A-NM781 a Amy 1, idet antallet af fager blev udregnet til at give en flerfoldighed af infektion på omkring 1-2, dvs. 1 eller 2 fager pr. bakteriecelle. Dyrkningen blev derpå fortsat 15 under kraftig omrøring ved 37 °C, og den faktiske tæthed blev fulgt indtil den begyndte at falde. Når den var faldet til under 0,5, blev kulturen indhøstet og sat på is. Kulturen blev centrifugeret, og supernatanten blev prøvet for amylaseaktivitet.

20

Opformeringen og enzymproduktionen med E. coli Cl 7002 (pCP 2) blev gennemført under anvendelse af både den mættede dyrkningsmetode og chloramphenicol-opformeringen som i eksempel I.

25

Amylaseaktiviteten blev bestemt under anvendelse af DNS-metoden både i faglysatet og i kulturer af E. coli indeholdende rekombinant-plasmidet. Tabel I viser de værdier, som blev opnået for amylaseaktiviteten i den oprindelige 30 stamme af B. coagulans og opdelingen mellem den ekstra-cellulære og den cellebundne aktivitet. Aktiviteterne opnået med rekombinant-fagen (A-NM781 a Amy 1) og stammen indeholdende rekombinant-plasmidet, E. coli CL 7002 (pCP

2), er også anført. Der blev iagttaget en forøgelse af 35 enzymproduktionen på omkring tre gange med rekombinant-fagen, og en endnu bedre forøgelse blev iagttaget med plasmidet (ca. 300 gange).

DK 162776 B

24 I tilfælde af fagen (λ-ΝΜ781 a Amy 1) frigøres alt enzymet efter cellelyse og er derfor til stede i dyrkningsmediet. I tilfælde af plasmidet er det meste af enzymet cellebundet (96%).

5 E. Genkloning i et derivat af fag λ, som er i stand til at lysogenere E. coli

For at belyse fremstillingen af et vektor-vært-system om-10 fattende en λ-lysogen E. coli gennemførtes det følgende forsøg.

Bakteriofagen λ T4 lig. Cl 857 Warn Eam Sam (λ-ΝΜ989) blev anvendt. Den er beskrevet i J. Mol. Biol. Vol. 132 15 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from

Bacteriophage T4. I.. Characterization of the Recombinants" af G.G. Wilson og Noreen E. Murray (side 471-491) og "II.. Amplification and Separation og the Gene Product" af Noreen E. Murray, S.A. Bruce og K. Murray (side 20 493-505).

Denne fag indeholder DNA-ligasegenet fra bakteriofag T4 og er i stand til at lysogenere E. coli. Den har endvidere et termofølsomt immunitetsgen og to amber-mutationer i 25 henholdsvis E-genet og S-genet. Mutationen af S-genet får bakterien til ikke længere af lyseres efter infektion med denne fag. Formålet med subkloningen var at erstatte DNA-ligasegenet med amylasekodningsgenet.

30 DNA fra fagen og plasmidet (pCP 2) blev overklippet med EcoRI, og fragmenterne ligeret. Den resulterende fag-DNA fra ligeringen blev derpå in vitro pakket, og pletterne gjort synlige ved udsåning på en stamme af E. coli Sup E Sup F. Pletterne, som viste amylaseaktivitet, blev opsam-35 let og fagen blev renset under anvendelse af den tidligere beskrevne teknik.

DK 162776B

25

Denne fag blev derpå anvendt til at lysogenere en stamme af E. coli C 600 (Cl 1205) under anvendelse af konventionel teknik. Lysogenkolonierne blev gjort synlige på et stivelseholdigt medium under anvendelse af iodfarvning.

5 Denne stamme er blevet navngivet E. coli CL 7003 (λα Amy 1) og er blevet deponeret i henhold til Budapest-trakta-ten i NCIB den 6. marts 1980, som NCIB nr. 11586.

Opformering af genproduktet blev gennemført på følgende 10 måde. Lysogenet blev dyrket ved 32 “C i LB-medium, indtil der var nået en optisk tæthed på 0,8 ved 650 nm. Derpå blev der centrifugeret, og cellerne blev suspenderet i frisk LB-medium, som var blevet forvarmet til 45 °C. Kulturen blev derpå inkuberet i et bad med 45 °C i 15 minut-15 ter for at inducere den lytiske cyclus (da immunitetsgenproduktet er termofølsomt).

Inkubationen fortsættes derpå under kraftig rystning ved 37 °C i 3 timer. Amylaseakti vi teten blev derefter målt i 20 supernatanten og i cellerne. Værdierne er rapporteret i tabel I.

Dette bestemte forsøg belyser en "subklonings"-teknik fra plasmidet ind i en ny λ fag. Det vil let forstås, at 25 DNA'en fra λ-ΝΜ781 a Amy 1 lige så let kunne have været subklonet ind i fag λ T4 lig. Cl 857 Warn Eam Sam. Alternativt kunne donor-DNA'en have være klonet direkte ind i den sidstnævnte fag, og et hvilket som helst antal variationer af den eksemplificerede fremgangsmåde er mulige.

30 F. Udvinding og karakterisering af den amylase, som produceres af λ-ΝΜ781 a Amy 1, E. coli CL 7002 (pCP 2) og E. coli CL 7003 (λα Amy 1) 35 Som i eksempel I anvendtes den osmotiske chok-metode til udvinding af enzymet. Da endvidere enzymet i dette eksempel er termostabilt, kunne det renses yderligere ved til-

DK 162776 B

26 sætning af 10 mM Ca++ til den vandige opløsning og opvarmning af opløsningen til 80 °C i 10 minutter; denne behandling udfælder alle E. coli proteinerne og tillader udvinding af «-amylasen i yderst ren form, hvor der prak-5 tisk taget ikke er noget nedbrydningsmateriale eller andre enzymer til stede.

α-amylasens specificitet blev bestemt; den er aktiv over for amylose og stivelse, hydrolyseprodukterne er glucose, 10 maltose og maltotriose med spor af mere høj molekylære komponenter. Dette enzym er ikke aktivt overfor cyclodex-trin. Enzymets termoresistens blev også undersøgt og vistes at være meget høj. Optimumstemperaturen for aktivitet med 0,5% amylose er mellem 80 og 90 °C. Med 8% op-15 løselig stivelse ligger optimet omkring 100 °C.

Det er muligt, at den mikroorganisme, som heri kaldes Bacillus coagulans, i virkeligheden er Bacillus licheniformis.

20 25 30 35 27

DK 162776 B

TABEL I

Amylase-aktivitet i enh. /liter i den oprindelige stamme af B. cuagulans og i rekombinantkloneme fra eksempel II 5

Forhøjelse

Super- Peri- af enzym _natant plasma Celler Total produktion 10 B. Cuagulans 42 - - 42 1 λ-ΝΜ781 a Amy 1 144 - - 144 3,431 15 E. coli CL 7002 (pCP 2) ** 1 med Cm-opformering 230 - 5700 5930 141,2 E. coli CL 7002 (pCP 2) "natten over” kulturer 276,2 12960 232 13467 320,61 20 E. coli CL 7003 (λ er Amy 1) 23 - 1162 1185 26,1 35 25 1 enhed defineres som den mægnde enzym, der giver 1 mg maltoseækvivalent pr. ml pr. minut ved 50 “C under anvendelse af 0,5% amylose som substrat.

Λ

Den osmotiske chok-metode blev ikke anvendt, men der 30 gennemførtes en lyse, således at denne værdi repræ senterer summen af amylaseaktiviteten i periplasmaet og cellerne.

DK 162776 B

28

EKSEMPEL II A

Subkloning af plasmid pCP 2 i plasmid pC 194 og udtryk-kelse af det nye plasmid i Bacillus subtilis 5

Dette eksempel belyser en teknik, hvorved rekombinant-DNA fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen kan udtrykkes i en anden værtsbakterie end E. coli, nemlig en stamme af Bacillus subtilis.

10

Plasmid pCP 2 fra eksempel II indeholder et 3,31 kb fragment fra B. cuagulans donoren; plasmidet er yderligere karakteriseret ved at tilføre ampicillin- og tetracyclin-resistens, og det indeholder to restriktionssteder for 15 hvert af EcoRI og Hindlll. Plasmidet pCP 2 blev spaltet i fire fragmenter med både EcoRI og Hindlll, behandlet med ligase og anvendt til at transformere HB 101 som i de forudgående eksempler.

20 Der blev dannet hidtil ukendte plasmidér, betegnet som pCP 2.3, indeholdende et 2,64 kb fragment af B. cuagulans DNA, hvilket fragment indeholder a-amylasekodningsgenet. pCP 2.3 har et enkelt sted for hvert af EcoRI og Hindlll og tilfører både ampicillin- og tetracyclin-resistens.

25

Til det næste trin udvalgtes plasmidet pC 194, som er et plasmid, der vides at være i stand til at replicere sig selv i Bacillus subtilis. pC 194 tilfører chlorampheni-colresistens, og det har et enkelt Hindlll sted.

30 Både pCP 2.3 og pC 194 blev åbnet med Hindlll, blandet og ligeret til dannelse af et nyt plasmid, betegnet som pCH 1, indeholdende β-amylasekodningsgenet og med både chlor-amphenicolresistens og ampicillinresistens, selv om ni-35 veauet for chloramphenicolresistens var lavt i E. coli.

Som før blev præparatet anvendt at transformere E. coli HB 101.

DK 162776 B

29

Mutantstammen af B. subtilis, betegnet som QB 1133 (modtaget fra Dr. Michael Steinmetz, Instut de Recherche en Biologie Moleculaire, Université Paris VII, Tour 43, 2

Place Jussiea, 75221 Paris Cedex 05), hvilken stamme ikke 5 har nogen α-amyiase-aktivitet, blev derpå behandlet i overensstemmelse med den teknik, som er angivet af S.

Chang og Cohen, Molec. Gen. Genet., 168, 111-115 (1979) til dannelse af protoplaster. Protoplasterne blev derpå transformeret med pCH 1 under anvendelse af den af Chang 10 og Cohen (samme sted) angivne polyethylenglycol-formidlede transformationsprocedure.

Protoplasterne blev derpå inkuberet i et rigt medium i 1,5 time for at tillade plasmidet i bakterien at udtrykke 15 modstandsevnen for chloramphenicol.

Protoplasterne blev derpå udpladet på et regenerationsmedium, hvortil der var sat chloramphenicol i en mængde på 20 ug/ml. Efter to dages inkubation ved 37 °C var der 20 fremkommet kolonier af transformerede celler; de kolonier, der havde α-amylase-aktivitet, blev sporet ved iod-dampfarvnings-teknikken. En klon, betegnet som B. subtilis CL8001 (pCH 1), blev deponeret den 13. januar 1981 i henhold til Budapest-traktaten, som NCIB nr. 11629. Den 25 oprindelige stamme QB 1133 blev også deponeret den 13. januar 1981 som NCIB 11628.

B. subtilis CL8001 (pCH 1) er kun stabil i nærvær af chloramphenicol. Den kan anvendes til at producere a-amy-30 lase ved dyrkning i et medium indeholdende chloramphenicol (20 ug/ml). a-amylasen kan let udvindes i dyrkningsvæsken.

Efter en dyrkning natten over i nærvær af chloramphenicol 35 blev den producerede mængde a-amylase bestemt som følger:

DK 162776 B

30

Supernatant Celler Total (U/L) (U/L) (U/L) 136 14 150

5 EKSEMPEL III

Kloning af 5-amylase

Donormikroorganismen var en stamme af Bacillus cereus, 10 som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1 466 009 tilhørende the Agency of Industrial Science & Technology (Japan). Den er blevet deponeret i the Fermentation Research Institute of Chiba-Shi, Japan den 20. december 1973, som FERM - P No. 2391 og blev også deponeret i Ame-15 rican Type Culture Collection som ATCC No. 31102 den 26. december 1974. Den vides at producere både 0-amylase og o-l,6-glucosidase.

A. Kloning af fl-amylasegenet i λ-ΝΜ781 20

De metoder, der anvendtes til restriktion, ligering og udvinding af rekombinant-fagene, var de samme som i eksempel II. DNA'en (2 ug) fra B. cereus blev overklippet under de normale betingelser ved hjælp af EcoRI restrik-25 t ionsenzymet. Fag-vektor-DNA' en (1,25 ug A-NM781) blev også overklippet med EcoRI. Ligeringen og emballeringen blev gennemført som tidligere beskrevet.

Der blev opdaget flere rekombinant-fager, som udviste 30 amylase-aktivitet (ca. 1 pr. 500). En af disse fager (betegnet som "A-NM781 Ø Amy 1" blev udvalgt; den er blevet deponeret i henhold til Budapest-traktaten i NCIB den 12. februar 1980 som NCIB nr. 11574.

35 31

DK 162776 B

B. Genkloning af fl-amylasegenet fra X-NM781 fl Amy 1 i plasmid pBR 322

For at forøge enzymproduktionen blev denne første Ø-amy-5 lase-klon anvendt som kilde for Ø-amylasekodnings-DNA til at subklone den i multikopiplasmidet pBR 322.

2 ug K-NM781 0 Amy 1 DNA og 1 ug pBR 322 blev overklippet med EcoRI, blandet og behandlet med T^-ligase. Ligering 10 og transformation blev gennemført som tidligere beskrevet.

En koloni blandt 200 ampicillin-resistente kolonier viste en stivelsenedbrydende aktivitet. En blev isoleret og be-15 tegnet E. coli CL 7004 (pCP 3); den blev deponeret i henhold til Budapest-traktaten den 15. september 1980 som NCIB nr. 11602.

C. Genkloning af g-amylasegenet 1 et derivat af fag λ, 20 som er i stand til at lysogenere E. coli

Den anvendte vektor var den termofølsomme λ T4 lig fag Cl 857 Warn Earn Sam (λ-ΝΜ989), beskrevet i eksempel II. Ca. 1 ug af plasmid-pCP-3-DNA'en og 0,5 ug af fag DNA blev 25 spaltet, hvorpå fragmenterne blev ligeret sammen, og de resulterende stykker af DNA emballeret in vitro. Fagpartiklerne, som udviste amylase-aktivitet blev isoleret og anvendt til at opnå lysogene kolonier ved den samme metode som før. Stammen E. coli C600, der var lysogen for 30 denne rekombinant-fag, blev isoleret og betegnet som E. coli CL 7005 (λ Æ-Amy 1); denne blev deponeret i henhold til Budapest-traktaten den 15. september 1980 som NCIB nr. 11603.

35

DK 162776 B

32 D. Opformering af amylasegenproduktet I alle kloner og subkloner blev amylase-aktiviteten sporet ved DNS-metoden. b-amylase-aktiviteten blev bekræftet 5 på tyndtlagskromatografer ved tilstedeværelsen af enkelt plet af maltose efter nedbrydning af amylose.

Opformering af /5 -amylasegenet i forskellige kloner blev gennemført som beskrevet ovenfor. Tabel II viser den en-10 zymatiske aktivitet i den oprindelige stamme sammenlignet med aktiviteten i de 3 kloner; denne aktivitet blev udvundet enten fra fag-lysatet eller ved den i eksempel II beskrevne metode med osmotisk chok.

15 TABEL II

Ektracellulære og cellebundet Ø-amylase-aktivitet i B. cereus og i rekombinant-kloneme 20 ____

Ekstracellulær (1) Cellebundet Total aktivitet aktivitet aktivitet

Enh./liter % Enh./liter % Enh./liter 25 B. cereus (2) ATCC 31102 1420 ikke bestemt 1420 A-NM781 Ø-Amy 1 80 80 30 E. coli CL 7004 (pCP 3) (3) 59 77,2 17,4 22,8 76,4 E. coli CL 7005 35 (λ£-Amy 1) (4) 19 44,2 24 55,8 43

DK 162776 B

33 (1) Cellebundet aktivitet: Behandling med lysozym til lyse af cellerne.

(2) Dyrkningen blev gennemført ved 30 °C natten over (1% 5 gærekstrakt, 1% bactotrypton, 0,5% NaCl).

(3) Dyrkninger natten over ved 37 °C (samme sammensætning af dyrkningsmedium).

10 (4) Dyrkning ved 32 °C -* 45 °C -♦ 37 °C, aktivitet målt i supematanten og i cellerne efter lyse, som for E. coli λ Ø-Amy 1 i eksempel II.

EKSEMPEL IV 15

Kloning af et pullulanasegen

Donormikroorganismen var en Klebsiella pneumoniae beskrevet af H. Bender i Biochem. Z. 334, side 79-95 (1961) og 20 deponeret i ATCC den 6. juni 1963 som nr. 15050. Den er også nævnt i GB patentskrift nr. 1 273 789.

t 2,25 ug donor-DNA blev ekstraheret og fragmenteret med EcoRI under anvendelse af standardbetingelser, og 1,25 ug 25 \-NM781-DNA blev overklippet med det samme enzym under de samme betingelser. Inkubationen gennemførtes i 3 timer ved 37 °C, hvorefter reaktionen blev stoppet ved opvarmning til 75 °C i 10 minutter. Fuldstændigheden af restriktionen blev bestemt som i eksempel II.

30

De overklippede DNA'er blev ligeret, udvundet og anvendt til at inficere stamme HB 101 af E. coli, alt som i 5 eksempel II. Der blev opnået 2 x 10 PFU pr. ug λ-DNA.

35 Efter 2 dages inkubation ved 37 °C på plader indeholdende BBL trypticase plus 0,25% pullulan viste nogle pletter pullulanase-aktivitet, dvs. de var omgivet af opake

DK 162776 B

34 ringe, som er karakteriseret for "overvoksende" bakterier. Mængden af pullulanase-producerende fager var af størrelsesordenen 1 pr. 2500.

5 En blev udvalgt og er blevet betegnet som λ-ΝΜ781 Pul 1; den blev deponeret i henhold til Budapest-traktaten i NCIB den 9. april 1980, som NCIB nr. 11593.

Pullulanase-aktivitet blev sporet ved DNS-metoden, og 10 fag-lysaternes hydrolyseprodukt af pullulan blev identificeret som maltotriose ved tyndtlagskromatografi.

λ-ΝΜ781 Pul 1 indeholder et stort fragment af DNA (fra Klebsiella pneumoniae) på 13,5 kilobaser; dette fragment 15 blev igen spaltet med EcoRl, hvilket førte til to fragmenter på henholdsvis 6,1 og 7,4 kilobaser. Underfragmentet på 6,1 kilobaser blev derpå genklonet i λ-ΝΜ781 og blev vist at indeholde pullulanasegenet. Denne nye rekom-binant-fag kaldes λ-ΝΜ781 Pul 2; den blev deponeret i 20 henhold til Budapest-traktaten den 15. september 1980 som NCIB nr. 11604.

6,1 kilobase undersættet blev yderligere subklonet i mul-

tikopi-plasmidet pACYC 184 (et derivat af pBR 322 med det R R

25 sidstnævntes Tc -gen og et Cm -gen med et EcoRl sted).

Denne nye klon kaldes E. coli CL 7006 (pCP 4); den blev deponeret i henhold til Budapest-traktaten den 15. september 1980 som NCIB nr. 11605.

30 En tredje subklon blev konstrueret ved indsættelse af 6,1 kilobase fragmentet i fag λ-ΝΜ989, som beskrevet i eksempel II. Denne klon kaldes E. coli CL 7007 (λ Pul 2); den blev deponeret i henhold til Budapest-traktaten den 15. september 1980 som NCIB nr. 11606.

Udtrykkelsesniveauet og opformeringen af pullulanasegenet blev undersøgt i alle kloner. Resultaterne er sammenfat- 35

DK 162776 B

35 tet i tabel III.

Som det kan ses af resultaterne, induceres pullulanaseak-ti vi teten af maltose, idet der er sat 0,04% maltose til 5 LB-mediet. Endvidere var en "Triton© X-100"-behandling af membranfraktionen nødvendig for at udvinde pullulanasen, hvilket indicerer, at aktiviteten er lokaliseret i membranerne .

10 TABEL III

Udnyttelse af Klebsiella pullulanasegenet i E. coli kloner. Aktiviteten udtrykkes som enheder af maltoseækvivalent for en 1 liters kultur 15 _

Forhøjelse

Super- Mem- af enzym- natant braner Total produktionen 20

Klebsiella pneumoniae + maltose 24 3,5 27,5 1 / NM 781 Pul 1 0,76 2,6 3,86 0,14 / NM 781 Pul 1 + maltose 2,2 9,84 12,04 0,44 / NM 781 Pul 2 9,6 23,8 32,9 1,19 25 / NM 781 Pul 2 + maltose 8,6 26,7 35,3 1,28

Ikke E. coli CL 7006 (pCP 4) sporet 3,4 3,4 0,123 E. coli CL 7006 (pCP 4) Ikke + maltose sporet 114 114 4,14 ** 30 E. coli CL 7007 (λ Pul 2) + maltose 47 93,5 140,5 5,13

Claims (24)

1. Ekspressionsvektor indeholdende et araylasekodningsgen, 5 fremstillet ved in vitro spaltning af DNA afledt fra en bakteriel donormikroorganisme og kombination af de resulterende DNA-fragmenter med en vektor, som er blevet spaltet på lignende måde, kendetegnet ved, at sidstnævnte vektor består af et plasmid eller DNA fra et 10 derivat af fag λ.

2. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den bakterielle donormikroorganisme er en Bacillus-stamme. 15

3. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den bakterielle donormikroorganisme er en stamme af Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus eller Klebsiella pneumoniae. 20

4. Ekspressionsvektor ifølge krav 1 eller 3, kendetegnet ved, at den bakterielle donormikroorganisme er Bacillus megaterium NCIB nr. 11568, Bacillus coagulans NCIB nr. 11571, Bacillus cereus ATCC nr. 31102 eller

25 Klebsiella pneumoniae ATCC nr. 15050.

5. Ekspressionsvektor ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at plasmidet er pBR 322, pACYC 184 eller pC 194. 30

6. Ekspressionsvektor ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at derivatet af fag λ er fag λ NM 590, λ NM 781 eller λ NM 989.

7. Ekspressionsvektor ifølge ethvert af kravene 1-4 eller 6, kendetegnet ved, at den er valgt blandt fagerne λ NM 590 Amy 1, NCIB nr. 11569; λ NM 781 e-Amy 1, DK 162776 B NCIB nr. 11572; λ NM 781 Ø-Amy 1, NCIB nr. 11574; λ NM 781 Pul 1, NCIB nr. 11593; λ NM 781 Pul 2, NCIB nr. 11604; eller varianter eller mutanter deraf med i det væsentlige samme egenskaber. 5

8. Genetisk konstrueret mikroorganisme, kendetegnet ved, at den indeholder en ekspressionsvektor ifølge ethvert af de forudgående krav.

9. Mikroorganisme ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er i stand til under egnede dyrkningsbetingelser at producere amylase i en væsentligt større mængde end den, der produceres af den oprindelige donormikroorganisme. 15

10. Mikroorganisme ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at den er en stamme af E.coli eller B.subtilis.

11. Mikroorganisme ifølge krav 8, 9 eller 10, kende tegnet ved, at den er E.coli CL7001 (pCP 1), NCIB nr. 11570; E.coli CL 7002 (pCP 2), NCIB nr. 11573; E.coli CL 7003 (λ α-Amy 1), NCIB nr. 11586; E.coli CL 7004 (pCP 3), NCIB nr. 11602; E.coli CL 7005 (λ Ø-Amy 1), NCIB nr. 25 11603; E.coli CL 7006 (pCP 4), NCIB nr. 11605; E.coli CL 7007 (λ Pul 2), NCIB nr. 11606; B.subtilis CL 8001 (pCH 1), NCIB nr. 11629; eller varianter eller mutanter deraf med i det væsentlige samme egenskaber.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af en ekspressionsvek tor ifølge krav 1, hvorved DNA'erne af en bakteriel donormikroorganisme, som er i stand til at producere amylase, og en vektor spaltes og sammenbindes, de indføres i en egnet vært, og de resulterende kloner screenes og se- 35 lekteres på basis af tilstedeværelsen af et amylasekod-ningsgen, kendetegnet ved, at sidstnævnte vektor består af DNA fra et derivat af fag λ, og at frem- DK 162776 B gangsmåden om ønsket, inkluderer et yderligere trin bestående af ekstraktion og spaltning af DNA'en fra en udvalgt klon, subkloning i en anden vektor og igen screening og selektion på basis af tilstedeværelsen af et amy-5 lasekodningsgen, hvorved den anden vektor er et plasmid eller DNA fra et andet derivat af fag λ, og denne subkloning eventuelt efterfølges af en eller flere yderligere subkloninger.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at screeningen gennemføres ved udpladning af klonerne på et stivelsesholdigt dyrkningsmedium og farvning af mediet med iod ved udsættelse af pladerne for ioddampe.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at amylasekodningsgenet er et pullulanasekodnings- gen, og at screeningen gennemføres ved udpladning af klonerne på et BBL Trypticasemedium indeholdende pullulan, hvorved positive kloner påvises ved at være omgivet af 20 opake ringe.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at donormikroorganismen er en stamme af Bacillus me-gaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus eller Kleb- 25 siella pneumoniae.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at donor mikroorganismen er Bacillus megaterium NCIB nr. 11568, Bacillus coagulans NCIB nr. 11571, Bacillus 30 cereus ATCC nr. 31102 eller Klebsiella pneumoniae ATCC nr. 15050.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den fag, hvortil donor-DNA'en bindes, er λ NM 590 35 eller λ NM 781. DK 162776 B

18. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvorved DNA'en fra de selekterede kloner sammenbindes med et plasmid, kendetegnet ved, at plasmidet er pBR 322, pACYC 184 eller pC 194. 5

19. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvorved DNA'en fra de selekterede kloner sammenbindes med DNA'en fra et andet derivat af fag λ, kendetegnet ved, at fagen er λ NM 989. 10

20. Fremgangsmåde til fremstilling af amylase, kendetegnet ved, at en genetisk konstrueret mikroorganisme ifølge ethvert af kravene 8-11 dyrkes under amy-laseproducerende betingelser. 15

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren er til stede i form af en lytisk fag, og at dyrkningen gennemføres i en inficeret bakterievært. 20

22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren er til stede i form af en fag i en lysogen E.coli, og at dyrkningen gennemføres således, at fag-opformeringen induceres ved varmebehand- 25 ling.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at ekspres s ions vektor en er til stede i den genetisk konstruerede mikroorganisme i form af et plasmid, og at 30 dyrkningen gennemføres ved vækst til den stationære fase.

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at plasmidet er et derivat af pBR 322 eller pACYC 184, og der gennemføres en opformering ved dyrkning i nærvær af 35 chloramphenicol før væksten til den stationære fase.