DK162478B - Fremgangsmaade til fremstilling af en cellefri antigenoploesning, der er egnet til immunisering af heste mod streptococcus equi-bakterier - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af en cellefri antigenoploesning, der er egnet til immunisering af heste mod streptococcus equi-bakterier Download PDFInfo
- Publication number
- DK162478B DK162478B DK542585A DK542585A DK162478B DK 162478 B DK162478 B DK 162478B DK 542585 A DK542585 A DK 542585A DK 542585 A DK542585 A DK 542585A DK 162478 B DK162478 B DK 162478B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- streptococcus equi
- cell
- protein
- preparing
- detergent
- Prior art date
Links
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 13
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 8
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 4
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108010060371 endo-N-acetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- CDOUZKKFHVEKRI-UHFFFAOYSA-N 3-bromo-n-[(prop-2-enoylamino)methyl]propanamide Chemical compound BrCCC(=O)NCNC(=O)C=C CDOUZKKFHVEKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 241000272470 Circus Species 0.000 description 1
- 241000777300 Congiopodidae Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N N-acetyl-alpha-D-muramic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]1NC(C)=O MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N 0.000 description 1
- 244000258044 Solanum gilo Species 0.000 description 1
- 241001468181 Streptococcus sp. 'group C' Species 0.000 description 1
- 241000187436 Streptomyces globisporus Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 235000019329 dioctyl sodium sulphosuccinate Nutrition 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 201000003265 lymphadenitis Diseases 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/885—Streptococcus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 162478 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en cellefri antigenopløsning, der er egnet til immunisering af heste mod Streptococcus equi-bakterier.
Streptococcus equi er klassificeret som en Lance-5 field gruppe C - Streptococcus, jfr. f.eks. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, side 498 (1974). Bakterien er anerkendt som værende fremkalderen af en alvorlig respiratorisk lidelse hos heste, hvilken lidelse ofte betegnes kværke. Lidelsen er endemisk i de fleste dele af 10 verden og epidemisk i OSA. Væddeløbsheste og cirkus- og show-heste er særligt udsatte for gentagne infektioner på grund af rejse-stress og udsættelse for nye kontakter. Sygdommen begynder med mucopurulent næseudflåd, temperaturer på ca. 39,5 til ca. 41°C og alvorlig inflammation af den øvre 15 respiratoriske slimhinde. Sygdommen skrider til slut frem til lymphadenitis og abscesdannelse, der til tider er tilstrækkelig alvorlig til at begrænse luftindtagelsen og forårsage kvælning af dyret. Kværke resulterer i ekstensivt tab af kondition (vægttab), eftersom lidelsen ofte har et forløb 20 af en varighed på 4-6 uger.
På grund af de svækkende og i nogle tilfælde dødelige virkninger af Streptococcus egui-infektioner hos heste er der i årenes løb blevet gjort forsøg på at fremstille Streptococcus equi-vacciner, der kan anvendes til aktive immunise-25 ringer. Uheldigvis har det vist sig, at Streptococcus equi--præparater i visse tilfælde har affinitet til hudvæv, idet der dannes kraftige opsvulmninger og endog abscesser ved injektionsstedet. Disse kendte reaktiviteter har medført en tendens til ikke at gå videre med udviklingen og/eller den kom-30 mercielle anvendelse af immuniserende Streptococcus equi- -produkter. Der eksisterer imidlertid to kommercielt tilgængelige kværke-vacciner. Det første kommercielle produkt var en helkultur, nemlig et kemisk inaktiveret Streptococcus equi--præparat (leveret fra Ft. Dodge Corporation). Det andet 35 kommercielle produkt var en cellefri M-protein-vaccine (tilgængelig fra Burroughs Wellcome Co.), der er beskrevet som 2
DK 162478 B
"en koncentreret, aluminiumhydroxid-absorberet suspension af rensede antigener afledt af Streptococcus equi". Den metode, ved hvilken denne vaccine fremstilles, anses for beskrevet i US patentskrifterne 3.793.150 og nr. 3.852.420. Rensningen 5 af sådanne "M-lignende proteiner" fra Streptococcus equi er også beskrevet i en artikel af J.B. Woolcock, Infect, and Immun., juli 1974, side 116-122. Det her benyttede udtryk "M-lignende protein" skal betegne det eller de immunogene proteiner af Streptococcus equi-organismen, der viser sig 10 at have lignende molekylvægt og aktivitet som M-proteinet af gruppe A-Streptococci.
Den teori, at et protein på cellevæggen af Streptococcus equi-organismen, der betegnes som et M-lignende protein, er den antigene del af bakterien, er blevet diskuteret 15 i artikler af S.K.Srivastava og D.A. Barnum i Can.J.Comp.
Med. 46, 51-56 (1982) og i Am.J.Vet.Res. 44, 41-45 (1983) samt i artikler af E.D.Erickson og N.L.Norcross i Can.
J.Comp. Med, 3£, 110-115 (1975). Ved alle tidligere arbejder blev dette M-lignende protein ekstraheret fra Strep-20 tococcus equi-organismen ved udsættelse af organismen for betingelser med lavt pH (pH=2) og høje temperaturer (95--100°C) i et givet tidsrum (10-15 minutter). Dette er blevet betegnet som en "varme-ekstraktions "-metode til fremstilling af det M-lignende protein. Proteinet fældes under disse be-25 tingelser og opløseliggøres ved forøgelse af opløsningens pH-værdi til 7 eller mere.
Fra US patentskrift nr. 3.793.150 er det kendt at ekstrahere antigent materiale fra Streptococcus equi-bak-terier ved opvarmning ved lave pH-værdier.
30 Fra Chemical Abstracts, vol. 90 (1979), 182888j er det kendt, at M-protein fra celleomhylningen af gruppe A--Streptococcus pyogenes kan isoleres ved ekstraktion af proteinet med Triton X og Na-dodecylsulfat. Der omtales ikke ekstraktion af antigent materiale fra gruppe C-Strep-35 tococcus equi-bakterier og fremstilling af antigent aktivt materiale og beskyttelsesvacciner på basis deraf.
3
DK 162478 B
Fra US patentskrift nr. 3.852.420 er det kendt at fremstille vaccine mod kværke hos heste ved ekstraktion af antigent materiale fra Streptococcus equi-kulturer. Phag-associeret lysin nævnes som et hjælpemiddel ved fremstillin-5 gen af antigenerne, men der angives ingen nærmere enkeltheder .
Fra J. Exp. Med. 14i, 32-53 (1976), jfr. Chemical Abstracts, vol. 85 (1976), 92010j, er det kendt at ekstrahere M-proteiner fra gruppe A-Streptococci ved anvendelse af et 10 ikke-ionisk detergent.
Fra JP patentpublikation sho 57-209.228, jfr. Chemical Abstracts, vol. 98 (1983), 113700V, er det kendt, at et hæmolytisk Streptococcus M-protein kan fås ved behandling af bakteriekulturen med et cellevægopløsende enzym, der 15 ikke har nogen enzymatisk aktivitet med hensyn til protein, f.eks. endo-N-acetylmuramidase (mutanolysin). M-proteinet udsaltes derpå fra den ovenstående væske.
Der er nu ifølge opfindelsen blevet udviklet en forbedret fremgangsmåde til fjernelse af M-lignende protein 20 fra Streptococcus equi-organismer, idet det har vist sig, at antigent M-lignende protein effektivt kan fjernes fra en Streptococcus equi-kultur ved en totrinsmetode under anvendelse af mutanolysin-digestion efterfulgt af behandling med en anionisk detergent, og at den dannede ekstrakt kan anven-25 des til fremstilling af en vaccine, der er virksom til immunisering af heste mod infektion med Streptococcus equi.
Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås der antigent materiale til fremstilling af en beskyttende vaccine, der tåles godt af de vaccinerede dyr, og fremgangsmåden kan 30 udføres under betingelser, der er langt lettere at overholde end de i den kendte teknik beskrevne betingelser omfattende opvarmning under sure betingelser.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved, at man 35 (a) dyrker Streptococcus equi-bakterier under vækst inducerende betingelser, 4
DK 162478 B
(b) udsætter bakterierne fra trin (a) for mutanoly- sin, (c) ekstraherer immunogent M-lignende protein eller proteiner fra produktet fra trin (b) med en anionisk deter- 5 gent i den ovenstående væske, (d) adskiller den ovenstående væske med opløseligt, ekstraheret M-lignende protein fra bakterieceller og cellerester og (e) steriliserer produktet fra trin (d).
10 Fremgangsmåden til den her omhandlede enzymatiske ekstraktion af Streptococ-M-lignende protein omfatter således dyrkning af en Streptococ-kultur under vækstinducerende betingelser, f.eks. ved 37*C i et egnet medium, efterfulgt af koncentrering af cellerne, f.eks. ved centrifugering 15 eller filtrering. Cellekoncentratet fortyndes eller vaskes i en egnet puffer. Mutanolysin sættes derpå til cellekoncentratet, og der inkuberes ved en temperatur og i en tid, der er tilstrækkelig til, at der foregår enzymatisk lyse af en del af cellevæggen. Partiel lyse betyder lyse, der er 20 tilstrækkelig til at gøre M-proteinet tilgængeligt for påfølgende detergent-ekstraktion, men udén ødelæggende virkning på M-proteinet. Det har vist sig, at dette i almindelighed kan opnås ved at udsætte Streptococcus equi-kulturen for indvirkning af det lytiske enzym ved 37“C i ikke over ca.
25 24 timer ved en enzymkoncentration på fra ca. 1 til ca. 10 enheder pr. ml af det oprindelige kulturrumfang. Et anionisk detergent såsom natriumlaurylsulfat eller dioctylnatriumsul-fosuccinat sættes derpå til cellekoncentratet, og der inkuberes til fuldstændiggørelse af Streptococcus equi-eks-30 traktionsbehandlingen. Celler og cellerester fjernes derefter ved f.eks. centrifugering eller filtrering, og den endelige cellefri antigenopløsning steriliseres ved filtrering eller kemisk behandling. Den cellefri antigenopløsning er immunogen og anvendelig til immunisering af heste mod infektion med 35 Streptococcus equi-organismer og har følgende karakteristika: en molekylvægt i området fra 25.000 til 75.000 dalton, varme-
DK 162478 B
5 stabilitet op til ca. 95°c og trypsin-sensitivitet.
Det bakteriolytiske enzym, der anvendes ved den her omhandlede fremgangsmåde, er mutanolysin (N-acetylmuramidase) , der fås fra kulturfiltratet af Streptomyces globisporus 5 og er kommercielt tilgængeligt fra Sigma Chemical Co., st.
Louis, Mo. 63178, og fra Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Osaka, Japan. Undersøgelser under anvendelse af mutanolysin ved en metode til lyse af Streptococci-cellevægge er blevet udført til andre formål end opnåelse af M-lignende protein.
10 Artikler om disse undersøgelser er forfattet af K. Yohagawa et al. i Antimicrobial Agents and Chemotherapy, August 1974, side 156-165, G.B. Calendar og R.M. Cole, Infect, and Immun., Juni 1980, side 1033-1037, og B.J. DeCueninck et al., Infect, and Immun., Febr. 1982, side 572-582. Mutanolysin og andre 15 bakteriolytiske enzymer (glycosidaser), f.eks. æggehvide-lysozym, antages at virke på lineære sekvenser af N-acetyl-glucosaminer og N-acetylmuraminsyre-rester på bakterievæggene.
Fremgangangsmåden ifølge opfindelsen illustreres 20 nærmere i det følgende eksempel.
Eksempel 1. Der anvendes Streptococcus equi, der er deponeret 25 i American Type Culture Collection, Rockville, MD. 20852 under ATCC-nummer 39.506. Streptococcus equi dyrkes i et kemisk defineret medium (I. van de Rijn, Infect, and Immun., 27, 444-448 (1980)) ved 37°C i 16 timer.
2. Streptococcus equi-celler koncentreres 10-50 gange under anvendelse af tværstrømningsfiltrering. Cellerne vaskes ved tilsætning af 0,1 M Trizma-HCl-puffer med pH-værdien indstillet på 6,5 med NaOH.
3. De vaskede Streptococcus equi-celler koncentreres 20-100 gange under anvendelse af fværstrømningsfiltrering.
35 6
DK 162478 B
4. Mutanolysin sættes som en opløsning med 5000 enheder pr. ml til koncentrerede celler til opnåelse af en endelig enzymkoncentration på 5 enheder pr. ml oprindeligt kulturrumfang. Der inkuberes ved 37°C i 16 timer.
5 5. Der tilsættes 10% natriumlaurylsulfat til opnåelse af en s lutkoncentration på 0,05%, og der inkuberes ved 37°C i 30 minutter.
6. Streptococcus equi-celler og -cellerester fjernes ved tværstrømningsfiltrering eller centrifugering.
10 7. Den udstrømmende væske sterilfiltreres gennem et 0,2^,u filter og holdes ved 4°C.
Antigen, der er fremstillet ifølge dette eksempel, afprøves for virkning ved hjælp af en kendt muse-kombina-tionsstyrke-bestemmelse. Ved denne bestemmelse måles vac-15 cinens antigenicitet ved hjælp af forøgelsen i LD50 i forhold til LD50 for antiserum-kontrollen. Jo større denne forøgelse af LD50 er, desto større er vaccinens antigenicitet. Tabel I viser resultaterne opnået ved afprøvning af vacciner ved denne bestemmelsesmetode. Det bemærkes, at antigen, der er 20 fortyndet så meget som 1:200, stadig udviser kombinationsstyrke.
Tabel I
Muse-kombinationsstvrke-resultater for 25 vaccine-præparat
Antigen-fortynding LD5g-forøgelse i forhold anvendt til vacci- til antiserum-kontrol nefremstillingen Muse LD50 (Log) 30 1:100 8,0 4,6 1:150 6,5 3,1 1:200 4,7 1,3
Antiserum-kontrol 3,4
Negativ-kontrol 8,2 35 -- 7
DK 162478 B
Til godtgørelse af, at enzym-detergent-behandlingen er den nøglefaktor, der bidrager til antigen-opnåelse, udføres der følgende forsøg: 1. Der dyrkes en kultur af Streptococcus equi, og 5 cellerne indhøstes ved centrifugering.
2. Cellerne gensuspenderes i puffer, og aliquoter af suspensionen behandles på følgende måde (i alle tilfældene fjernes cellerne efter centrifugeringsbehandling, og de ovenstående væsker filtreres gennem et 0,2^u sterilfilter): 10 A. Suspensionen inkuberes ved 50°C i 16 timer, hvor på der tilsættes 0,05% natriumlaurylsulfat (SLS) , og suspensionen holdes ved 37°C i 30 minutter.
B. Suspensionen inkuberes ved 37°C i 30 minutter efter tilsætning af 0,05% SLS.
15 C. Suspensionen inkuberes ved 37°C i 16 timer efter tilsætning af 0,05% SLS.
D. Suspensionen inkuberes ved 50°C i 16 timer efter tilsætning af 5 enheder mutanolysin pr. ml.
E. Suspensionen inkuberes ved 50°C i 16 timer efter 2 Π tilsætning af 5 enheder mutanolysin pr. ml, efterfulgt af inkubation ved 37°C i 30 minutter efter tilsætning af 0,05% SLS.
F. Suspensionen opvarmes til 95°C i 15 minutter, efter at pH-værdien er indstillet på 2,0. Suspensionen af- 25 køles, og pH-værdien indstilles på 7,0.
Hvert af disse præparater (A-F) afprøves derpå ved muse-kombinationsstyrke-bestemmelsen til bestemmelse af den frigjorte mængde antigen. Resultaterne, jfr. tabel II, viser, at detergent alene eller i kombination med varme (A, B, C) 30 ikke fjerner antigen. Mutanolysin inkuberet ved 50°C (D) fjerner en minimal mængde antigen, sammenlignet med kombinationen af mutanolysin og detergent (E). Ved anvendelse af denne sidste metode (E) fjernes i virkeligheden antigen lige så godt som ved den varme syreekstraktionsmetode (varme-35 -ekstraktion) (F) , der er beskrevet i USA-patentskrifterne
DK 162478 B
8 nr. 3.793.150 og nr. 3.852.420, set på baggrund af de kombinationsstyrke-resultater, der fremgår af den følgende tabel .
5 10 15 20 25 30 35
9 DK 162478 B
O
Tabel II
Muse-kombinationsstyrke-resultater for antigen-præparat 5 LDgg-forøgelse
Fortynding i forhold til
Behandling af celler af præparat Muse-LD^Q antiserum-kon- trol (Log) A. 16 timer ved 50°C + 1:5 <5 <1/4 0,05% SLS - 30 min.
10 ved 37°C
B. 0,05% SLS - 30 min. 1:5 <5 <1,4
ved 37°C
C. 0,05% SLS - 16 timer 1:5 <5 <1,4
ved 37°C
15 D. 5 enheder mutanolysin 1:5 5,0 1,4 pr. ml 16 timer ved 50°C 1:10 <5 <1,4 E. 5 enheder mutanolysin 1:5 7,4 3,8 pr. ml 20 16 timer ved 50°C - 1:10 5,6 2,0
0,05% SLS - 30 min. ved 37°C
F. pH 2 - 95°C - 15 min. 1:5 7,5 3,9 1:10 5,5 1,9 25 Antiserum-kontrol - 3,6
Negativ-kontrol - 7,7
Yderligere arbejde med mutanolysin-detergent-me-30 toden har for nylig vist, at antigen-fjernelsen er endog mere effektiv ved 37°C end ved 50°C. Den almindeligvis anvendte metode til fremstilling af de vacciner, der er vist afprøvet i tabel I, er derfor blevet fastlagt til anvendelse ved denne foretrukne lavere temperatur på 37°C. Til bekræftelse 35 af antigeniciteten af vacciner som målt ved muse-kombinations- 10
DK 162478 B
o styrke-bestemmelsen gennemføres der en vaccine-effektivitetsundersøgelse for heste under anvendelse af de i tabel I angivne vacciner. Hestene gives to doser vaccine med intervaller på 3 uger og udsættes derefter for en virulent Strep-5 tococcus equi. Vaccinernes effektivitet måles ved hjælp af den virulente organisme. Kliniske indeksværdier tilskrives kværke-symptomer med det formål at opnå en bedømmelse af effektiviteten. Disse kliniske indeksværdier er vist i tabel III og tilskrives hver hest for hver dag, der iagttages 10 symptomer efter udsættelsen for organismen. Iagttagelsen af hestene foretages hver anden dag i 49 dage efter udsættelsen for mikroorganismen.
Tabel III 15 Værdier for klinisk indeks, der tilskrives kværke-symptomer _Symptom_Værdi for klinisk indeks_
Absces-dannelse 20 points Tælling af hvide blodlegemer 20 >50%'s forøgelse 5 points >100%'s forøgelse 10 points
Temperatur 38,9-39,1°C 1 point 39,2 - 39,9°C 5 points 25 >40°C 10 points Næseudflåd
Moderat 5 points
Kraftigt 10 points 30 35
O
DK 162478B
Resultaterne af vaccine-effektivitetsundersøgelsen er vist i tabel IV som akkumuleringen af kliniske indeksværdier anslået gennem den 49 dage lange observationsperiode. Formindskelsen i de kliniske indeksværdier er også 5 vist i tabel IV som procentvis formindskelse af indeksværdierne for vaccine-grupperne, sammenholdt med den ikke--vaccinerede kontrolgruppe. Disse data viser, at der kan fremstilles effektive vacciner ved enzym-detergent-ek-straktion af Streptococcus equi.
10 15 20 25 30 35
DK 162478 B
Tabel IV
12
O
Streptococcus equi-effektivitetsundersøgelse _Værdier for klinisk indeks__ 5
Klinisk Vaccine Vaccine Vaccine Ikke-vaccinerede symptom 1:100 1:150 1:200 kontroller
Total
Gruppetotal 819 1235 1586 2453
Middelværdi 28,2 42,6 56,6 81,8 % formindskelse 64% 46% 28% 15 Abscesser
Gruppetotal 180 420 680 1240
Middelværdi 6,2 14,5 24,3 41,3 % formindskelse 85% 65% 41% 20
Hvide blodlegemer ’ Gruppetotal 375 470 585 820
Middelværdi 12,9 16,2 20,9 27,3 % formindskelse 53% 41% 23%
Temperatur
Gruppe- 30 -total 179 230 211 222
Middelværdi 6,2 7,9 7,5 7,4 % formindskelse 16% 0% 0% Næseudflåd gg Gruppe-total 85 115 110 70
Middelværdi 2,9 4,0 3,9 2,3 % formind- 0% 0% 0% skelse
Claims (3)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af en cellefri antigenopløsning, der er egnet til immunisering af heste 5 mod Streptococcus equi-bakterier, kendetegnet ved, at man (a) dyrker streptococcus equi-bakterier under vækstinducerende betingelser, (b) udsætter bakterierne fra trin (a) for mutanoly- 10 sin, (c) ekstraherer immunogent M-lignende protein eller proteiner fra produktet fra trin (b) med en anionisk detergent i den ovenstående væske, (d) adskiller den ovenstående væske med opløseligt, 15 ekstraheret M-lignende protein fra bakterieceller og cellerester og (e) steriliserer produktet fra trin (d).
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-20 net ved, at udsættelsen for mutanolysin i trin (b) foretages ved 37*C i ikke over ca. 24 timer ved en enzymkoncentration på 1-10 enheder pr. ml oprindeligt kulturrumfang.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 25 net ved, at detergenten i trin (c) er natriumlaurylsulfat, og at ekstraktionen hermed sker ved 37* C i ikke mere end ca. 60 minutter ved en detergentkoncentration på 0,01-0,10%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US67444984 | 1984-11-23 | ||
| US06/674,449 US4582798A (en) | 1984-11-23 | 1984-11-23 | Preparation and use of enzyme-detergent extracted Streptococcus equi vaccine |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK542585D0 DK542585D0 (da) | 1985-11-22 |
| DK542585A DK542585A (da) | 1986-05-24 |
| DK162478B true DK162478B (da) | 1991-11-04 |
| DK162478C DK162478C (da) | 1992-05-11 |
Family
ID=24706645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK542585A DK162478C (da) | 1984-11-23 | 1985-11-22 | Fremgangsmaade til fremstilling af en cellefri antigenoploesning, der er egnet til immunisering af heste mod streptococcus equi-bakterier |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4582798A (da) |
| EP (1) | EP0182240B1 (da) |
| JP (1) | JPH0764752B2 (da) |
| AU (1) | AU582197B2 (da) |
| CA (1) | CA1250524A (da) |
| DE (1) | DE3567807D1 (da) |
| DK (1) | DK162478C (da) |
| ES (1) | ES8606485A1 (da) |
| NZ (1) | NZ214255A (da) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5316926A (en) * | 1983-11-25 | 1994-05-31 | Miles Inc. | Method for the microbiological production of non-antigenic hyaluronic acid |
| IE940698L (en) * | 1984-04-05 | 1985-10-05 | Univ Missouri | Vaccine and serum for endotoxin associated disease and method of preparing same as well as to methods of immunization and treatment of such disease and to a detoxified endotoxin and bacterial mutant |
| AR241545A1 (es) * | 1985-07-12 | 1992-08-31 | Cornell Res Foundation Inc | Un metodo para preparar una cepa de s. equi avirulenta a.t.c.c. 53186 para equinos. |
| US4944942A (en) * | 1987-08-27 | 1990-07-31 | Mobay Corporation | Intranasal vaccination of horses with inactivated microorganisms or antigenic material |
| US4946780A (en) * | 1988-10-12 | 1990-08-07 | Denkl Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for producing sodium hyaluronate by fermentation method |
| US5583014A (en) * | 1990-07-03 | 1996-12-10 | Bayer Corporation | Preparation and use of enzyme-detergent extracted Streptococcus zoopidemicus vaccine |
| JPH0490421U (da) * | 1990-12-18 | 1992-08-06 | ||
| CA2184132C (en) | 1995-09-21 | 2011-03-15 | Kristina J. Hennessy | An adjuvanted vaccine which is substantially free of non-host albumin |
| US6682746B2 (en) | 1995-09-21 | 2004-01-27 | Kristina J. Hennessy | Adjuvanted vaccine which is substantially free of non-host albumin |
| ZA97452B (en) * | 1996-01-25 | 1997-08-15 | Trinity College Dublin | Streptococcus equi vaccine. |
| AU745183B2 (en) | 1997-10-20 | 2002-03-14 | Bayer Corporation | Neospora vaccines |
| AUPQ137699A0 (en) | 1999-07-02 | 1999-07-22 | University Of New England, The | Control of acidosis |
| AU783861B2 (en) * | 1999-07-02 | 2005-12-15 | University Of New England, The | Control of acidosis |
| US6379930B1 (en) | 1999-07-30 | 2002-04-30 | Applied Gene Technologies, Inc. | Stabilization of nucleic acid amplification cocktails |
| DE102012101864A1 (de) * | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Gramme-Revit Gmbh | Mittel zur Behandlung von Allergien und anderen Erkrankungen |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3852420A (en) * | 1971-01-20 | 1974-12-03 | Richardson Merrell Inc | Equine strangles vaccine and method of preparing and using the same |
| US3793150A (en) * | 1971-01-20 | 1974-02-19 | Richardson Merrell Inc | Equine strangles vaccine and method of preparing and using the same |
-
1984
- 1984-11-23 US US06/674,449 patent/US4582798A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-11-11 DE DE8585114311T patent/DE3567807D1/de not_active Expired
- 1985-11-11 EP EP85114311A patent/EP0182240B1/en not_active Expired
- 1985-11-19 AU AU50224/85A patent/AU582197B2/en not_active Ceased
- 1985-11-20 NZ NZ214255A patent/NZ214255A/xx unknown
- 1985-11-22 CA CA000496002A patent/CA1250524A/en not_active Expired
- 1985-11-22 ES ES549200A patent/ES8606485A1/es not_active Expired
- 1985-11-22 JP JP60261603A patent/JPH0764752B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-11-22 DK DK542585A patent/DK162478C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES549200A0 (es) | 1986-04-01 |
| EP0182240B1 (en) | 1989-01-25 |
| DK542585D0 (da) | 1985-11-22 |
| DK162478C (da) | 1992-05-11 |
| US4582798A (en) | 1986-04-15 |
| AU5022485A (en) | 1986-05-29 |
| DE3567807D1 (en) | 1989-03-02 |
| JPH0764752B2 (ja) | 1995-07-12 |
| AU582197B2 (en) | 1989-03-16 |
| NZ214255A (en) | 1989-01-06 |
| DK542585A (da) | 1986-05-24 |
| JPS61143326A (ja) | 1986-07-01 |
| CA1250524A (en) | 1989-02-28 |
| ES8606485A1 (es) | 1986-04-01 |
| EP0182240A2 (en) | 1986-05-28 |
| EP0182240A3 (en) | 1986-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK162478B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af en cellefri antigenoploesning, der er egnet til immunisering af heste mod streptococcus equi-bakterier | |
| El‐Houadfi et al. | The isolation and characterisation of six avian infectious bronchitis viruses isolated in Morocco | |
| EP0068660B1 (en) | Protection against dental caries | |
| US5869064A (en) | Protein rib, a cell surface protein that confers immunity to many strains of the group B Streptococcus: process for purification of the protein, reagent kit and pharmaceutical composition | |
| Skerman et al. | Differentiation of Bacteroides nodosus biotypes and colony variants in relation to their virulence and immunoprotective properties in sheep | |
| HU218154B (hu) | Streptococcus suis fertőzés elleni vakcina | |
| PT90310B (pt) | Processo para a obtencao de preparacoes de adenilato-ciclase | |
| US5254340A (en) | Vaccine suitable for prophylaxis and control, respectively, of the pig disease caused by Haemophilus pleuropneumoniae and a method for obtaining extracellular proteinaceous material of Haemophilus pleuropneumoniae for use in such vaccines | |
| Björklind et al. | Occurrence of an extracellular serineproteinase among Staphylococcus aureus strains | |
| US3793150A (en) | Equine strangles vaccine and method of preparing and using the same | |
| Sellers et al. | The behaviour of strains of the virus of foot-and-mouth disease in pig, calf, ox and lamb kidney tissue cultures | |
| DK169707B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af en mutantstamme af Bordetella bronchiseptica | |
| JP2537042B2 (ja) | ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン | |
| KR100290059B1 (ko) | 보르데텔라로부터 세포-결합 단백질을 추출하는 방법 | |
| Munoz | I. IMMUNOLOGICAL AND OTHER BIOLOGICAL ACTIVITIES OF BORDETELLA PERTUSSIS ANTIGENS | |
| Percy et al. | Pasteurella multocida infection in the domestic rabbit: immunization with a streptomycin-dependent mutant | |
| James et al. | An improved method for the isolation of the major protein of the gonococcal outer membrane in an antigenically reactive form | |
| US4618493A (en) | Temperature sensitive strains of bovine viral diarrhoea virus, preparation thereof and vaccines containing them | |
| El‐Zein et al. | Preparation and testing of a goat pox vaccine from a pathogenic field isolate attenuated in cell culture | |
| US4714678A (en) | Temperature sensitive strain of bovine viral diarrhoea virus | |
| Van den Ende et al. | Experiments with the soluble antigen of rabies in suckling mouse brains | |
| Shwartzman | Alterations in pathogenesis of experimental lymphocytic choriomeningitis caused by prepassage of the virus through heterologous host | |
| Diena et al. | PREPARATION OF TYPHOID SOMATIC-ANTIGEN VACCINE: I. BIOLOGICAL STUDIES OF SALMONELLA TYPHI LYSATES | |
| MUNOZ | SYMPOSIUM ON RELATIONSHIP OF STRUCTURE OF MICROORGANISMS TO THEIR IM1IIUNOLOGICAL PROPERTIES'I. IMMUNOLOGICAL AND OTHER BIOLOGICAL ACTIVITIES OF BORDETELLA PERTUSSIS ANTIGENS | |
| Cameron | Preliminary studies on the administration of a staphyloccus aureus vaccine to sheep |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |