DK160840B - Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents
Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK160840B DK160840B DK336887A DK336887A DK160840B DK 160840 B DK160840 B DK 160840B DK 336887 A DK336887 A DK 336887A DK 336887 A DK336887 A DK 336887A DK 160840 B DK160840 B DK 160840B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gly
- asp
- val
- ala
- ser
- Prior art date
Links
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims description 101
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title claims description 89
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 65
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 17
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 7
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 101000775727 Bacillus amyloliquefaciens Alpha-amylase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims 2
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 claims 2
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 14
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 14
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 14
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 14
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 13
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 11
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 11
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 7
- -1 amyL Chemical class 0.000 description 7
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 6
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 6
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001134780 Bacillus acidopullulyticus Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 4
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 3
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108010075550 termamyl Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N N-[[(5S)-2-oxo-3-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)-1,3-oxazolidin-5-yl]methyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1O[C@H](CN1C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F VCUFZILGIRCDQQ-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000009923 sugaring Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007725 thermal activation Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
DK 160840 B
Denne opfindelse angår stivelseshydrolyseenzymer.
Mere specifikt angår den foreliggende opfindelse kimære a-amylaser og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne kimære a-amylaser.
5 Den generelle enzymatiske proces, der almindeligvis anvendes af producenter af høj-DX-sirupper ud fra stivelse, hvor udtrykket DX betyder vægtprocent dextrose (D-glucose) beregnet på grundlag af tørstofindholdet (DS) i siruppen, er en to-trinsproces: forflydigelse og forsukring. Det første 10 trin forflydigelse indebærer hydrolyse af stivelse til en blanding af oligosaccharider, de såkaldte maltodextriner.
Denne proces katalyseres af a-amylaser ved en temperatur på mindst 75°C, fortrinsvis ved ca. 90°C, eller ved en lyn-kogningsproces, hvor stivelsesopslemningen opvarmes i adskillige 15 minutter til 105 - 110°C, sædvanligvis med en enkelt dosis a-amylase og derpå holdes på ca. 90°C i mindst en time.
Til brug i forflydningsprocessen er forskellige mikrobielle, især bakterielle α-amylaser kommercielt tilgæn-
TM
gelige, f.eks. BAN (fra Bacillus amyloliquefaciens) og 20 TERMAMYL® (fra Bacillus licheniformis), begge kan fås hos NOVO Industri A/S, Danmark, og THERMOLASE™ (fra Bacillus stearothermophilus), som fås fra Enzyme Development Corporation, N.Y., U.S.A.
Medens BAN a-amylase kun er stabil op til ca. 85°C
25 og derfor næppe egnet til lynkogningsprocessen, er både
TM
TERMAMYL® og THERMOLASE enzymer godt tilpassede til denne næsten globalt foretrukne fremgangsmåde til stivelsesforflydning, da de er varmestabile.
Forsukringstrinnet, hvor maltodextrinerne omdannes 30 til dextrose, katalyseres oftest med et glucoamylaseenzym. Kommercielle glucoamylasepræparater, oftest hidrørende fra
Aspergillus- eller Rhizopusarter, kan fås hos forskellige
TM
producenter, f.eks. som AMG 200L, et produkt stammende fra Aspergillus niger og fremstillet af NOVO Industri A/S, 35 Danmark.
- 2 .-
DK 160840 B
Med henblik på yderligere at øge dextroseudbyttet fra 30 - 40 vægtprocent DS maltodextrinopløsninger er det blevet almindeligt at udføre forsukringsprocessen med gluco-amylase sammen med et afgreningsenzym for at lette hydrolysen 5 af forgrenede oligosaccharider hidrørende fra amylopektin-delen i stivelse. Et sådant afgreningsenzym med maksimumaktivitet indenfor de samme pH- og temperaturområder som gluco-amylase er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.
82302001.1 (publikation nr. 0063909). Afgreningsenzymet 10 forhandles af NOVO Industri A/S, Danmark, enten i ren tilstand eller som en blanding med passende tilsætning af glucoamylase under navnene henholdsvis PROMOZYME og DEXTROZYME.
Uheldigvis indebærer den ellers gunstige kombina-15 tion af B. licheniformis α-amylase til forflydning og gluco-amylase-PROMOZYME til forsukring i omdannelsen af stivelse til høj-DX-sirupper en ulempe. Man har iagttaget, at tilstedeværelsen af α-amylaserestaktivitet fra forflydningstrinnet har en negativ effekt på den maksimalt opnåelige DX ved 20 forsukring med glucoamylase-PROMOZYME. Problemet er størst for den termostabile B. licheniformis a-amylases vedkommende, som stadig er aktiv under de til forsukring foretrukne betingelser (pH og temperatur på henholdsvis ca. 4,6 og 60°C). Man har fundet en løsning, som består i inaktivering af a-amyla-25 sen inden forsukringen ved forsuring af den forflydigede stivelse til pH under 4,5, medens der opretholdes en temperatur på mindst 90°C. Efter inaktivering af α-amylasen indstilles temperaturen og pH på forsukringsbetingelser, hvilket betyder, at pH-værdien skal hæves til ca. 4,5. Denne yderli-30 gere pH-indstilling forøger uundgåeligt siruppens saltindhold, og dermed udgifterne i forbindelse med afsaltning af slutproduktet.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at afhjælpe de tidligere nævnte ulemper, som stadig knytter sig 35 til anvendelsen af B. licheniformis α-amylase under omdannelsen af stivelse til en høj-DX-sirup. Dette og andre formål,
DK 160840 B
som vil blive omtalt i det følgende, opnås ved at udføre forflydningsprocessen med en hidtil ukendt type kimær a-amylase.
De kimære α-amylaseenzymer ifølge opfindelsen er 5 ejendommelige ved, at de kan fremstilles ved dyrkning af en værtsorganisme, der er transformeret med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid a-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale aminosyrerester i Bacillus amyloliquefaciens α-amylase og fra 426 til 395 C-10 terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584(ATCC 27811) α-amylase, og at den har den almene formel II: Q'-R-L' (II) 15 hvor Q' er de 55 N-terminale aminosyrerester i B. amyloliquefaciens α-amylase med den almene formel Ib 20 5 10 15
Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Thr-Pro-Asn-Asp- 20 _ 25 30
Gly-Gln-His-Trp-Lys-Arg-Leu-Gln-Asn-Asp-Ala-Glu-His-Leu-Ser-Asp- 35 40 45 50 25 Ile-Gly-Ile-Tnr-Ala-Val-Trp-Ile-Pro-Pro-Ala-Tyr-Lys-Gly-Leu-Ser- 55
Gln-Ser-Asp-Asn-Gly-Tyr-Gly (Ib) 30 L·' er de 395 C-terminale aminosyrerester i B. licheniformis 584 (ATCC 27811) α-amylase med den almene formel Ic
DK 160840 B
90 95 100
Ser-Leu-His-Ser-Arg-Asp-Ile-Asn-Val-Tyr-Gly-Asp-Val- 105 110 115
Val-Ile-Asn-His-Lys-Gly-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Glu-Asp-Val-Thr- 5 120 125 130
Ala-Val-Glu-Val-Asp-Pro-Ala-Asp-Arg-Asn-Arg-Val-Ile-Ser-Gly- 1 135 140 145
Glu-His-Arg-Ile-Lys-Ala-Trp-Thr-His-Phe-His-Phe-Pro-Gly-Arg- 150 155 160 10 Gly-Ser-Thr-Tyr-Ser-Asp-Phe-Lys-Trp-His-Trp-Tyr-His-Phe-Asp- 165 170 175
Gly-Thr-Asp-Trp-Asp-Glu-Ser-Arg-Lys-Leu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Lys- 180 185 190
Phe-Gln-Gly-Lys-Ala-Trp-Asp-Trp-Glu-Val-Ser-Asn-Glu-Asn-Gly- 15 195 200 205
Asn-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Met-Tyr-Ala-Asp-Ile-Asp-Tyr-Asp-His-Pro- 210 215 220
Asp-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Lys-Arg-Trp-Gly-Thr-Trp-Tyr-Ala-Asn- 225 230 235 20 Glu-Leu-Gln-Leu-Asp-Gly-Phe-Arg-Leu-Asp-Ala-Val-Lys-His-Ile- 240 245 250
Lys-Phe-Ser-Phe-Leu-Arg-Asp-Trp-Val-Asn-His-Val-Arg-Glu-Lys- 255 260 265
Thr-Gly-L ys-Glu-Met-P he-Thr-Val-Ala-Glu-Tyr-Trp-Gln-Asn-Asp- 25 270 275 280
Leu-Gly-Ala-Leu-Glu-Asn-Tyr-Leu-Asn-Lys-Thr-Asn-Phe-Asn-His- 285 290 295
Ser-Val-Phe-Asp-Val-Pro-Leu-His-Tyr-Gln-Phe-His-Ala-Ala-Ser- 300 305 319 30 Thr-Gln-Gly-Gly-Gly-Tyr-Asp-Met-Arg-Lys-Leu-Leu-Asn-Ser-Thr- 315 320 325
Val-Val-Ser-Lys-His-Pro-Leu-Lys-Ala-Val-Thr-Phe-Val-Asp-Asn- 330 4 335 340
His-Asp-Thr-Gln-Pro-Gly-Gln-Ser-Leu-Glu-Ser-Thr-Val-Gln-Thr- 35 345 350 355
Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Ala-Tyr-Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Arg-Glu-Ser- 360 365 370 - 5 -
DK 160840 B
Gly-Tyr-Pro-Gln-Val-Phe-Tyr-Gly-Asp-Met-Tyr-Gly-Thr-Lys-Gly- 375 380 385
Asp-Ser-Gln-Arg-Glu-Ile-Pro-Ala-Leu-Lys-His-Lys-Ile-Glu-Pro- 390 395 400 5 Ile-Leu-Lys-Ala-Arg-Lys-Gln-Tyr-Ala-Tyr-Gly-Ala-Gln-His-Asp- ^05 410 415
Tyr-Phe-Asp-His-His-Asp-Ile-Val-Gly-Trp-Thr-Arg-Glu—Gly-Asp-420 425 430
Ser-Ser-Val-Ala-Asn-Ser-Gly-Leu-Ala-Ala-Leu-Ile-Thr-Asp-Gly-10 ,,, 435 440 445
Pro-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Met-Tyr-Val-Gly-Arg-Gln-Asn-Ala-Gly- 450 455 460
Glu-Thr-Trp-His-Asp-Ile-Thr-Gly-Asn-Arg-Ser-Glu-Pro-Val-Val- 465 470 475 15 He-Asn-Ser-Glu-Gly-Trp-Gly-Glu-Phe-His-Val-Asn-Gly-Gly-Ser- 480 483
Val-Ser-Ile-Tyr-Val-Gln-Arg (1c) 20 og R er en polypeptidrest med den almene formel (la) 58 60 70
Pro-Tyr-Asp-Leu-Tyr-Asp-Leu-Gly-Glu-Phe-XQ-Gln-Lys- .
O
80 25 Gly-Thr-Val-Arg-Thr-Lys-Tyr-Gly-Thr-Lys-XQ-Glu-Leu- y 88
Gln-X-^Q-Ala-Ile-Gly (la) hvor Xg er His eller Gin, X^ er Gly eller Ser, X^q er Ser 30 eller Asp.
Kort sagt tilvejebringer den foreliggende opfindelse hidtil ukendte a-amylaser med den almene formel I
DK 160840 B
- 6 - Q-R-L (I) hvor Q er en N-terminal polypeptidrest med den ovennævnte formel Ib svarende til de N-terminale aminosyrerester i 5 Bacillus amyloliquefaciens a-amylasen (Takkinen et al., 1983, J.Biol.Chem. 258:1007-1013); R er en polypeptidrest med den ovennævnte formel la, og L er en C-terminal polypeptidrest med den ovennævnte formel Ic svarende til de C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584 (ATCC 27811) a-10 amylase (Stephens et al., 1984, J.Bacteriol., 158:369-372).
På grund af relevansen af Takkinen et al., supra og Stephens et al., supra ved definitionen af aminosyresekven-serne af de af B. amyloliquef aciens og B. licheniformis producerede a-amylaser, hvoraf dele af sekvenserne er inde-15 holdt i de kimære amylaser ifølge opfindelsen skal der her henvises til disse i deres helhed.
Aminosyresekvenserne i de kimære enzymer beskrevet og vist ovenfor kan modificeres ved substituering, deletion eller tilsætning af aminosyrerester inden for sekvensen, der 20 giver en tavs ændring i molekylet, således at produktet bibeholder sin aktivitet. Sådanne aminosyresubstitutioner kan foretages på basis af lighed i polaritet, ladning, opløselighed, hydrophobicitet, hydrophili og/eller den amphipatiske natur hos de involverede rester. For eksempel omfatter sure 25 aminosyrerester (negativt ladet ved pH 6,0) aspartansyre og glutaminsyre, basiske aminosyrer (positivt ladet ved pH 6,0) lysin og arginin; aminosyrer med uladede polære hovedgrupper eller ikke-polære hovedgrupper med samme hydrophile egenskaber omfatter følgende: leucin, isoleucin, valin, glycin, 30 alan'in, asparagin, glutamin, serin, threonin, phenylalanin, tyrosin.
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af den hidtil ukehdte kimære α-amylase ifølge krav 1. 1
DK 160840 B
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er ejendommelig ved, at a) en værtsorganisme transformeres med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid α-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale 5 aminosyrerester i Bacillus amyloliquefaciens a-amylase og fra 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheni-formis 584(ATCC 27811) a-amylase, så den udtrykte a-amylase har den almene formel II: 10 Q'-R-L' (II) hvor Q', L1 og R er som defineret ovenfor, b) den transformerede værtsorganisme dyrkes i et egnet vækstmedium, og 15 c) den kimære a-amylase udvindes fra kulturen.
De omhandlede kimære a-amylaser kan iøvrigt fremstilles ved anvendelse af almindeligt kendte genmanipulationsteknikker såsom gensplejsning eller ved 20 anvendelse af in vivo rekombination som beskrives i det følgende eller ved kemiske synteseteknikker.
De omhandlede kimære α-amylaser kan anvendes på forflydningstrinnet i produktionen af høj-DX-sirupper, især i den tidligere omtalte lynkogningsproces.
25 De omhandlede kimære α-amylaser, viser overraskende
de udmærkede thermostabiliseringsegenskaber hos a-amylase fremkommet fra B. licheniformis, men på samme tid en mindsket negativ effekt på det maksimalt opnåelige DX uden at have været inaktiveret inden forsukringen. Opfindelsen skal her 30 illustreres ved eksempler, hvor et segment fra B. licheniformis α-amylase bestående af fra ca. aminosyrerestnummer 55 til ca. aminosyrerestnummer 85 beregnet fra den N-terminale ende af B. licheniformis a-amylase eller alternativt hele det N-terminale segment derfra udveks-35 les med det tilsvarende segment af B. amyloliquefaciens a-amylase. Restaktiviteten fra den kimære α-amylase har højst en ubetydelig negativ effekt på det maksimalt opnåelige DX
- 8 -
DK 160 840 B
ved forsukring med glucoamylase-PROMOZYME, medens den stadig bibeholder den udmærkede thermostabilitet, som er karakteristisk for B. licheniformis a-amylase.
De følgende udtryk har i denne beskrivelse den 5 nedenfor angivne betydning: DS = tørstof DX = vægtprocent dextrose (D-glucose).
10 Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningerne/ hvor fig. 1 viser gel-permeationskromatogrammer af a-amylaser fra B. licheniformis, B. amyloliquefaciens og en kimær α-amylase ifølge opfindelsen, 15 fig. 2 viser restriktionskortet over plasmid pDN1822, fig. 3 viser restriktionskortet over plasmid pDNl850, og fig. 4 viser restriktionskortet over plasmid 20 pDNl864.
Som tidligere angivet angår opfindelsen kimære a-amylaser med den almene formel II
Q'-R-L·' (II) 25 hvor Q', R og L' defineres som beskrevet ovenfor. Foretrukne formler er beskrevet i de følgende afsnit.
En foretrukken kimær α-amylase med den almene formel II er en sådan, hvor aminosyreresterne Xg, X^ og X^q i 30 R er henholdsvis Gin, Ser og Asp.
I yderligere en foretrukket kimær α-amylase med den almene formel II er aminosyreresterne Xg, Xg og X^q i R henholdsvis His, Gly og Ser.
Yderligere foretrukne kimære a-amylaser ifølge 35 opfindelsen er sådanne, hvor værtsorganismen er B.subtilis.
Især sådanne hvor plasmidet er et af plasmiderne pDNl851, pDNl858, pDNl859, pDNl860, pDNl861, pDNl862 eller pDNl864.
DK 160840 B
Amylaserne ifølge opfindelsen er kimære enzymer og kan fremstilles på forskellige måder som beskrevet i det følgende.
Naturligt forekommende enzymer kan modificeres 5 genetisk ved tilfældig eller målrettet mutagenese, eller en del af et enzym kan erstattes med en del af et andet, så der fremkommer et kimært enzym. Denne udskiftning kan komme i stand enten ved konventionel in vitro gensplejsningsteknikker eller ved in vivo rekombination eller ved kombinationer af 10 begge teknikker. Ved anvendelse af konventionel in vitro gensplejsningsteknik kan en ønsket portion af den a-amylase genkodende sekvens fjernes ved at der bruges passende stedsspecifikke restriktionsenzymer; den fjernede del af kodningssekvensen kan derpå erstattes ved indsættelse af en ønsket 15 del af en anden a-amylasekodende sekvens, således at der fremstilles en kimær nucleotidsekvens, der koder for en ny α-amylase.
In vivo rekombinationsteknikkerne afhænger af, at forskellige DNA-segmenter med yderst homologe områder (DNA-20 sekvensidentitet) kan rekombinere, d.v.s. spalte og udveksle DNA, og etablere nye bindinger i de homologe områder. Derfor vil rekombination af homologe sekvenser in vivo, når kodningssekvenserne for to forskellige men homologe amylase-enzymer anvendes til at transformere en værtscelle, resultere 25 i produktionen af kimære gensekvenser. Translation af disse kodningssekvenser i værtscellen vil resultere i produktion af et kimært amylasegenprodukt.
a-amylasegenerne fra Bacillus licheniformis (i det følgende benævnt amyL) og fra Bacillus amyloliquefaciens (i 30 det følgende benævnt amyQ) er homologe for ca. 70 procents vedkommende på DNA niveau og egnede til hybriddannelse ved in vivo gensplejsning.
I en anden udførelsesform kan det kimære enzym syntetiseres ved allerede kendte standardkemiske metoder (se 35 f.eks. Hunkapiller et al., 1984, Nature 310: 105-111). Derfor
DK 160840 B
- 10 - kan peptider med de ovenfor beskrevne aminosyresekvenser syntetiseres helt eller delvis og forenes til dannelse af de kimære enzymer ifølge opfindelsen.
Som tidligere nævnt har restaktiviteten fra anven-5 delsen af den termostabile α-amylase fra B. licheniformis på forflydningstrinnet en negativ effekt på det maksimalt opnåelige D-glucoseudbytte på forsukringstrinnet ved anvendelse af A. niger glucoamylase og B. acidopullulyticus pullulanase.
Årsagen til denne negative effekt er ikke fuldt ud 10 kendt, men man antager, at B. licheniformis α-amylase udvikler "grænsedextriner", som er dårlige substrater for B. acidopullulyticus pullulanase, ved at hydrolysere 1,4-a-glucoside bindinger tæt på grenpunkterne i amylopektin. Disse grænsedextriner, som indeholder for få glucoseenheder i en 15 eller flere af sidekæderne vil være mindre følsomme overfor angreb af B. acidopullulyticus pullulanase.
I fig. 1 er angivet virkningsmønstrene for B. licheniformis α-amylase, B. amyloliquefaciens α-amylase og den kimære QL1864 α-amylase på amylopektin ved hjælp af 20 gelpermeationskromatogrammer af amylopektinnedbrydninger efter 48 timer.
Af figuren ses det, at virkningsmønstret for B. licheniformis α-amylase på amylopektin er forskelligt fra B. amyloliquefaciens α-amylases virkningsmønster. B. lichenifor-25 misenzymet producerer hovedsageligt DPg, DPg og DP^ initialt.
Ved forlænget hydrolyse hydrolyseres DP^ fraktionen yderligere, og de vigtigste komponenter er DP5, DP^ og DP2 med DP5 som langt den vigtigste. Når B. amyloliquefaciens a-amylase anvendes er hovedbestanddelen DP,_.
b 30 Virkningsmønstret for de kimære a-amylaser ifølge opfindelsen eksemplificeret ved QL1864 a-amylasen på amylopektin er tydeligt forskellig fra begge de naturligt forekommende a-amylaser idet der hovedsageligt produceres DP2, DP^ og DP^ i omtrent lige stor mængde. Som det vises i 35 det følgende, har dette ændrede virkningsmønster overraskende
" U " DK 160840B
medført, at B. licheniformis a-amylasens negative effekt på D-glucoseudbyttet er fjernet, medens termostabiliteten er bibeholdt.
Som følge heraf konkluderedes, at de kimære a-5 amylaser ifølge opfindelsen kan anvendes særdeles effektivt til forflydigelse af stivelse.
Eksempel 1 10 Fremstilling af hybrid QL1864
Ved konventionel teknik blev amyL og amyQ fra de samme mikroorganismer som anvendt af Stephens et al. og Takkinen et al. klonet i B. subtilis. Restriktionsenzymkortet for de to gener var i overensstemmelse med offentliggjorte 15 DNA sekvenser for generne for B. licheniformis amylase (amyL) (Stephens et al., J.Bacteriol. 158: 369 (1984) og B. amylo-liquefaciens amylase (amyQ) (Takkinen et al., J.Biol.Chem.
258: 1007, 1983).
amyQ (amyQ+) og en C-terminal del af amyL (amyL ) 20 blev anbragt parallelt på plasmid pDNl822. Dette er et B.
subtilis plasmid baseret på kloningsvektor pUBllO (Jalanko et al., Gene 14:325-328(1981)) og indeholdende kloramphenicol- p resistensgenet (Cam ) (cat gen) fra kloningsvektor pCl94 (Horinouchi og Weisblum, J. Bacteriol. 150:815-825(1982)).
25 Restriktionskortet over pDNl822 er vist i fig. 2, hvor generne er angivet med pile. Den C-terminale del af amyQ på pDN1822 blev derpå deleteret ved fraskæring af et Pvul-Pvul- fragment, som vist ved skravering på fig. 2, til opnåelse af plasmid pDNl850 (fig. 3). pDNl850 er amylasenegativ (Amy ), 30 men indeholder en N-terminal del af amyQ og en C-terminal del af amyL. Imidlertid forekommer rekombination mellem amyQ og -4 amyL med en hyppighed på ca. 10 , hvilket resulterer i plasmider indeholdende et hybrid QL amylasegen (amyQL+) og med en amylasepositiv fenotype (Amy+).
35 Transformering med et plasmidpræparat af pDNl850 til en plasmidfri B. subtilis vært, B. subtilis DN497, beskrevet i dansk patentansøgning nr. 5719/85 s. 11-12, og
DK 160840 B
R
selektering for Cam i agarplader indeholdende stivelse 4 resulterede i ca. 1:10 transformanter, der fremstillede en aktiv amylase. Transformanterne var omgivet af en ring af nedbrudt stivelse, som kunne påvises med ioddamp. Disse Amy+ 5 transformanter indeholdt et QL hybrid amylasegen på plas-midet. Fra disse transformanter blev plasmiderne pDNl851 til pDNl865 isoleret, og man fandt, at transformanter indeholdende plasmider pDNl851, pDNl858 til pDNl862 og pDNl864 fremstillede a-amylaser, som opfylder opfindelsens formål. Ved 10 restriktionsenzymkortlægning af plasmid pDNl864 blev amyQLl864 genet karakteriseret (fig. 4) og vist at indeholde et Ava2 site fra amyQ, men ikke det nærliggende EcoRI site fra amyQ. Følgelig skete rekombination mellem amyQ og amyL mellem de kodoner, der koder for aminosyre nr. 58 og nr. 67 i 15 B. licheniformis a-amylasen, som vist ved det skraverede område på fig. 3. B. subtilis QL1864 fremstiller derfor en kimær amylase, sammensat af ca. 1/6 amyQ amylase ved den N-terminale ende og 5/6 amyL amylase ved den C-terminale ende.
I de følgende undersøgelser defineres enzym-20 enhederne som vist nedenfor:
En NU (NOVO Unit) a-amylaseaktivitet er den mængde enzym, som nedbryder 5,26 mg opløst stivelse i timen ved 37°C, pH 5,6 og 0,0043 M Ca++ over en reaktionsperiode på 7 -20 minutter.
25 En AG enhed glucoamylaseaktivitet er den mængde enzym, som hydrolyserer et micromol maltose pr. minut ved 25°C og pH 4,3.
En pullulanaseenhed (PUN) defineres som den mængde enzym, som under standardbetingelser (temperatur 40°C og pH . 30 5,0) hydrolyserer pullulan med en hastighed svarende til dannelsen af "reducerende grupper" svarende til 1 μπιοί glucose pr. minut.
Forsukringsforsøg 35 Som tidligere nævnt har det vist sig, at. tilstede værelsen af en B. licheniformis a-amylaserestaktivitet hidrørende fra forflydningstrinnet har en negativ virkning på
DK 160840 B
det maksimale D-glucoseudbytte på forsukringstrinnet, når B. acidopullulyticus pullulanase og A. niger glucoamylase anvendes sammen.
For at evaluere indflydelsen af en restaktivitet 5 fra de kimære α-amylaser ifølge opfindelsen på forsukringstrinnet, blev de sammenlignet med B. licheniformis a-amylase på følgende måde:
Forsukringssubstrater blev fremstillet ved genopløsning af DE 8 (DE= Dextrose Equivalent (%reducerende 10 sukkerarter udtrykt som D-glucose)) forstøvningstørret malto-dextrin i deioniseret vand og opfyldning til ca. 30% DS (tørstof). Forsukringseksperimenter blev udført ved standard laboratoriebatchreaktioner på 500 ml.
pH blev målt ved forsukringstemperatur med pH-15 elektrode og pH-meter kalibreret og justeret i puffer ved 60 °C.
Følgende standardbetingelser anvendtes: Substratkoncentration 28,2% (initialt) 30,8% (finalt)
Temperatur 60°C
20 pH (initialt, ved 60°C) 4,6
Enzymdosering:
glucoamylase 0,15 AG/g DS
pullulanase 0,33 PUN/g DS
a-amylase 60 NU/g DS
25
Resultaterne af prøverne er vist i tabel 1.
DK 160840 B
Tabel 1
Reaktionsbetingelser 5 α-amylase Tid (h) pH %DP1 %DP2 %DP3 %DP4 24 4,5 92,8 2,5 1,1 3,6 48 4,4 96,7 1,8 0,7 0,8 ingen 72 4,4 96,8 2,0 0,6 0,6 10 (kontrol)_96_4,4 96, 8 2,2 0,5 0,5 B. licheniformis 24 4,5 92,4 2,5 2,4 2,7.
48 4,5 95,9 1,8 1,5 0,9 72 4,4 96,2 2,0 1,1 0,7 _96_4,4 96,4 2,1 0,9 0,6 15 QL1864 24 4,6 92,1 2,8 1,9 3,2 48 4,5 96,3 1,7 1,2 0,9 72 4,5 96,5 2,0 0,9 0,7 _96_4,5 96,6 2,1 0,8 0,6 20 Af tabellen ses, at skønt tilstedeværelsen af QL1864 α-amylase reducerede det maksimalt opnåelige DX med 0,2% (i sammenligning med kontrollen), repræsenterer den en forbedring-i forhold til B. licheniformis α-amylase, hvor reduktionen er 0,4%.
25
Termoaktivering og termostabilitet
For at evaluere termoaktiveringen af de kimære a-amylaser fremstillet med.de transformerede stammer, blev de kimære a-amylaser underkastet følgende forsøg: 30
Substrat: Phadebas tabletter (Phadebas® amylase test,
Pharmacia Diagnostics, Sverige) en tværbundet blåfarvet stivelsespolymer uopløselig i vand.
35 Puffer: 0,1 M fosfat, pH 6,1 og TRIS puffer pH 9,5.
Enzym: α-amylase fortyndet til 1-2 NU/ml i 0,09 M
CaCl2, pH 6,1.
DK 160840 B
Temperaturer: 37°C og 85°C.
1 ml α-amylase- fortynding blandes grundigt med 5 ml puffer og inkuberes i et vandbad ved den ønskede tempe-5 ratur inden tilsætning af en Phadebas tablet.
Reagensglasset rystes i 15 sekunder i en rysteblander, inden det igen anbringes i vandbadet.
Efter nøjagtig 15 minutter standses reaktionen ved tilsætning af 1 ml 1 M NaOH. Efter blanding filtreres blan-10 dingen gennem et 9 cm Whatman® GF/A eller FG/C filter.
Filtratets optiske tæthed måles ved en bølgelængde på 620 nm og er lineært relateret til aktiviteten af den tilsatte a-amylase.
Resultaterne er vist nedenfor sammen med værdierne 15 fra prøver med ren B. licheniformis og B. amyloliquefaciens α-amylaserne.
Tabel 2 20 α-amylase Phadebas 37°C Phadebas pH 6,1 _pH 6,1:pH 9,5 75°C:37°C_ B. licheniformis (kontrol) 0,4 3,7 QL1864 2,5 2,5 25 QL1861 2,2 2,2 QL1851 2,1 2,1 QL1862 2,0 2,0 QL1858 2,0 2,0 B. amyloliquefaciens 30 _(kontrol)_8/7_0,01_
Af tabellen ses, at de kimære a-amylaser ifølge opfindelsen er ligeså termoaktiverede som B. licheniformis 35 a-amylasen, og mindre følsomme overfor alkalisk pH end B. amyloliquefaciens a-amylase.
DK 160840B
For at evaluere stabiliteten af a-amylaserne ifølge opfindelsen blev følgende stålrørsprøver udført:
En DE 7 maltodextrin genopløst i afioniseret vand 5 blev anvendt som substrat under følgende betingelser:
Substrat: 32 - 33 procent
a-amylasedosering: 120 NU/g maltodextrin Temperatur: 105°C
10 pH: 5,5
Calciumindhold: 60 ppm
Ved hver prøve anbringes 5 stålrør indeholdende reaktionsblandingen i et oliebad ved 105°C og udtages efter 15 henholdsvis 10, 20, 30, 40 og 60 minutter, og a-amylase-restaktiviteten blev målt ifølge den tidligere omtalte Phadebas metode. Halveringstiden, Τ^2· beregnes ved lineær regression af log (restaktivitet) versus tid.
20 Resultaterne er vist i tabel 3 herunder.
Tabel 3 g-amylase_minutter 25 B. amyloliquefaciens (kontrol) 5 QL1851 22 QL1858 25 QL1861 18 30 QL1862 22.
QL1864 24 B. licheniformis _(kontrol)_23_ 35 Af tabellen fremgår det tydeligt, at de hybride oc- amylaser ifølge opfindelsen har bibeholdt stabiliteten af B. licheniformis ot-amylasen.
Claims (8)
1. Kimær α-amylase kendetegnet ved, at den kan fremstilles ved dyrkning af en værtsorganisme, der er transformeret med et i værtsorganismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid α-amylasegen kodende for fra 55 15 til 85 N-terminale aminosyrerester i Bacillus amylolique-faciens α-amylase og fra 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheniformis 584(ATCC 27811) α-amylase, og at den har den almene formel II:
20 Q'-R-L' (II) hvor Q' er de 55 N-terminale aminosyrerester i B. amylolique-faciens α-amylase med den almene formel Ib 25 5 10 15 Val-Asn-Gly-Thr-Leu-Met-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Thr-Pro-Asn-Asp- 20 25 30 Gly-Gln-His-Trp-Lys-Arg-Leu-Gln-Asn-Asp-Ala-Glu-His-Leu-Ser-Asp- 30 35 40 45 50 Ile-Gly-Ile-Thr-Ala-Val-Trp-Ile-Pro-Pro-Ala-Tyr-Lys-Gly-Leu-Ser- 55 Gln-Ser-Asp-Asn-Gly-Tyr-Gly (Ib) L' er de 395 C-terminale aminosyrerester i B. licheniformis 584 (ATCC 27811) a-amylase med den almene formel Ic
18. DK 160840B i j 5 go 95 100 ! Ser-Leu-His-Ser-Arg-Asp-Ile-Asn-Val-Tyr-Gly-Asp-Val- 105 110 115 Val-Ile-Asn-His-Lys-Gly-Gly-Ala-Asp-Ala-Thr-Glu-Asp-Val-Thr- 120 125 130
10 Ala-Val-Glu-Val-Asp-Pro-Ala-Asp-Arg-Asn-Arg-Val-Ile-Ser-Gly- 1 135 140 145 Glu-His-Arg-Ile-Lys-Ala-Trp-Thr-His-Phe-His-Phe-Pro-Gly-Arg- 150 155 160 Gly-Ser-Thr-Tyr-Ser-Asp-Phe-Lys-Trp-His-Trp-Tyr-His-Phe-Asp- 15 165 170 175 Gly-Thr-Asp-Trp-Asp-Glu-Ser-Arg-Lys-Leu-Asn-Arg-Ile-Tyr-Lys- 180 185 190 Phe-Gln-Gly-Lys-Ala-Trp-Asp-Trp-Glu-Val-Ser-Asn-Glu-Asn-Gly- 195 200 205
20 Asn-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Met-Tyr-Ala-Asp-Ile-Asp-Tyr-Asp-His-Pro- 210 215 220 Asp-Val-Ala-Ala-Glu-Ile-Lys-Arg-Trp-Gly-Thr-Trp-Tyr-Ala-Asn- 225 230 235 Glu-Leu-Gln-Leu-Asp-Gly-Phe-Arg-Leu-Asp-Ala-Val-Lys-His-Ile- 25 240 245 250 Lys-Phe-Ser-Phe-Leu-Arg-Asp-Trp-Val-Asn-His-Val-Arg-Glu-Lys- 255 260 265 Thr-Gly-Lys-Glu-Met-Phe-Thr-Val-Ala-Glu-Tyr-Trp-Gln-Asn-Asp- 270 275 280
30 Leu-Gly-Ala-Leu-Glu-Asn-Tyr-Leu-Asn-Lys-Thr-Asn-Phe-Asn-His- 285 290 295 Ser-Val-Phe-Asp-Val-Pro-Leu-His-Tyr-Gln-Phe-His-Ala-Ala-Ser- 300 305 319 Thr-Gln-Gly-Gly-Gly-Tyr-Asp-Met-Arg-Lys-Leu-Leu-Asn-Ser-Thr- " 19 ' DK 160840B 315 320 325 Val-Val-Ser-Lys-His-Pro-Leu-Lys-Ala-Val-Thr-Phe-Val-Asp-Asn- 330 335 340 His-Asp-Thr-Gln-Pro-Gly-Gln-Ser-Leu-Glu-Ser-Thr-Val-Gln-Thr- 5 345 350 355 Trp-Phe-Lys-Pro-Leu-Ala-Tyr-Ala-Phe-Ile-Leu-Thr-Arg-Glu-Ser- 360 365 370 Gly-Tyr-Pro-Gln-Val-Phe-Tyr-Gly-Asp-Met-Tyr-Gly-Thr-Lys-Gly- 375 380 385
10 Asp-Ser-Gln-Arg-Glu-Ile-Pro-Ala-Leu-Lys-His-Lys-Ile-Glu-Pro- 390 395 400 Ile-Leu-Lys-Ala-Arg-Lys-Gln-Tyr-Ala-Tyr-Gly-Ala-Gln-His-Asp- 405 410 415 Tyr-Phe-Asp-His-His-Asp-Ile-Val-Gly-Trp-Thr-Arg-Glu-Gly-Asp- 15 420 425 430 Ser-Ser-Val-Ala-Asn-Ser-Gly-Leu-Ala-Ala-Leu-Ile-Thr-Asp-Gly- 435 440 445 Pro-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Met-Tyr-Val-Gly-Arg-Gln-Asn-Ala-Gly- 450 455 460
20 Glu-Thr-Trp-His-Asp-Ile-Thr-Gly-Asn-Arg-Ser-Glu-Pro-Val-Val- 465 470 475 Ile-Asn-Ser-Glu-Gly-Trp-Gly-Glu-Phe-His-Val-Asn-Gly-Gly-Ser- 480 483 Val-Ser-Ile-Tyr-Val-Gln-Arg dc) 25 og R er en polypeptidrest med den almene formel (la) 58 60 70
30 Pro-Tyr-Asp-Leu-Tyr-Asp-Leu-Gly-Glu-Phe-Xg-Gin-Lys- 80 Gly-Thr-Val-Arg-Thr-Lys-Tyr-Gly-Thr-Lys-Xg-Glu-Leu- 88 Gln-X10-Ala-Ile-Gly (Ia) 20' DK 160840 Β hvor Xg er His eller Gin, Xg er Gly eller Ser, X^g er Ser eller Asp. 5
2. Kimær α-amylase ifølge krav 1, k e n d e-tegnet ved, at værtsorganismen er Bacillus subtilis. 10
3. Kimær α-amylase ifølge krav 2, k endete g n e t ved, at plasmidet er et af plasmiderne pDN 1851, pDN 1858, pDN 1859, pDN 1860, pDN 1861, pDN 1862 eller pDN 1864. 15
4. Kimær α-amylase ifølge krav 1, k endete g n e t ved, at Xg er His, Xg er Gly og X-^g er Ser.
5 Q'-R-L' (II) hvor Q', L' og R er som defineret i krav 1 b) den transformerede værtsorganisme dyrkes i et 10 egnet vækstmedium, og c) den kimære α-amylase udvindes fra kulturen.
5. Kimær α-amylase ifølge krav 1, kend e-tegnet ved, at Xg er Gin, Xg er Ser og X-^g er Asp. 25
5 - 17 - DK 160840 B NYE PATENTKRAV 10
6. Fremgangsmåde til fremstilling af en kimær α-amylase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at a) en Værtsorganisme transformeres med et i værts- 30 organismen funktionsdygtigt plasmid omfattende et hybrid a-amylasegen kodende for fra 55 til 85 N-terminale aminosyre-rester i Bacillus amyloliquefaciens α-amylase og fra
21. DK 160840 B 426 til 395 C-terminale aminosyrerester i Bacillus licheni-formis 584(ATCC 27811) a-amylase/ så den udtrykte a-amylase har den almene formel II:
7. Fremgangsmåde til fremstilling af en kimær 15 α-amylase ifølge krav 6, kendetegnet ved, at værtsorganismen er Bacillus subtilis.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kende- 20. e g n e t ved, at plasmidet er et af plasmiderne pDN 1851, pDN 1858, pDN 1859, pDN 1860, pDN 1861, pDN 1862 eller pDN 1864. \
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK336887A DK160840C (da) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK311186A DK311186D0 (da) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | Enzymer |
| DK311186 | 1986-06-30 | ||
| DK336887 | 1987-06-30 | ||
| DK336887A DK160840C (da) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK336887D0 DK336887D0 (da) | 1987-06-30 |
| DK336887A DK336887A (da) | 1987-12-31 |
| DK160840B true DK160840B (da) | 1991-04-22 |
| DK160840C DK160840C (da) | 1991-10-07 |
Family
ID=26066895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK336887A DK160840C (da) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK160840C (da) |
-
1987
- 1987-06-30 DK DK336887A patent/DK160840C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK160840C (da) | 1991-10-07 |
| DK336887D0 (da) | 1987-06-30 |
| DK336887A (da) | 1987-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0252666B1 (en) | Chimeric enzymes | |
| US9487769B2 (en) | Alpha-amylase mutants | |
| CA2312053C (en) | Mutant bacillus licheniformis alpha-amylase | |
| KR100808517B1 (ko) | α-아밀라제 변이체 | |
| EP0938570B1 (en) | Mutant alpha-amylase comprising modification at residues corresponding to a210, h405 and/or t412 in bacillus licheniformis | |
| EP0942994B1 (en) | H mutant alpha-amylase enzymes | |
| CA2689635C (en) | Variants of an alpha-amylase with improved production levels in fermentation processes | |
| EP1131418B1 (en) | Alpha-amylase variants | |
| US8420370B2 (en) | Alpha-amylase variants | |
| US20110033882A1 (en) | Variants of the bacillus licheniformis alpha-amylase | |
| JP2001509389A (ja) | ジスルフィド結合が導入されている変異体αアミラーゼ | |
| US20150132823A1 (en) | Alpha-Amylase Variants | |
| US20020123124A1 (en) | Highly productive alpha-amylases | |
| US5234823A (en) | Chimeric enzymes | |
| DK160840B (da) | Kimaere alfa-amylaser og fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
| AU2005202164A1 (en) | Alpha-amylase variants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |