DK160304B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre-derivater samt salte og metalkomplekser deraf. - Google Patents

Description

i

DK 160304B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 2—(3 *-hydroxy-pyrid-2’-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre-derivater med formlen 6J_1' _ S_ 5 5'<C COOR2 (I) 4' X i w' XR 3 ..

RJ

5 i racemisk eller optisk aktiv form, hvori R^ betyder fri, forethret eller forestret hydroxy, R^ betyder hydrogen eller en aliphatisk, carbocyclisk eller carocyclisk-ali-phatisk gruppe med 1-12 carbonatomer, og R^ betyder hydrogen eller en usubstitueret aliphatisk gruppe med 1-7 car-10 bonatomer, og salte af disse forbindelser eller metalionkomplekser af sådanne forbindelser, hvori gruppen COOR2 betyder en fri carboxylgruppe, hvis sure proton eventuelt er fraspaltet.

De ovenfor nævnte forbindelser med formlen I adskiller sig 15 både strukturelt og med hensyn til deres farmakologiske virkning fra teknikkens standpunkt.

USA-patentskrift nr. 3.592.905 beskriver thiazolidin-4-carboxylsyrederivater med betændelseshæmmende virkning. Disse derivater indeholder ingen thiazolinring med C=N-20 dobbeltbinding som forbindelserne med den ovennævnte formel I. De konkret som enkeltforbindelser nævnte thia-zolidinderivater indeholder heller ingen pyridylring, hverken en usubstitueret eller en i 2-stillingen bundet og i 3-stillingen med den ovenfor definerede gruppe R1 sub-25 stitueret pyridylring, og adskiller sig således stærkt fra forbindelserne med den ovennævnte formel I. USA-patentskrift nr. 3.592.905 giver heller ingen holdepunkter eller ledetråde for en tankemæssig kombination af de

DK 160304 B

2 talrige substituentbetydninger, der er mulig ifølge den brede generiske åbenbarelse, således at der i det mindste tankemæssigt ville resultere forbindelser med lignende 5 struktur som forbindelserne med den ovennævnte formel I.

USA-patentskrift nr. 3.852.293 beskriver 2-(3-pyridyl)-thiazolderivater med betændelseshæmmende virkning, som især kan anvendes til undgåelse af granulomdannelse. Disse derivater har i sammenligning med thiazolinderivaterne med 10 den ovennævnte formel I en yderligere C=N-dobbeltbinding i thiazolinringen, hvorfor substituenten i den ovennævnte formel I mangler, pyridylringen er bundet til thiazolinringen i 3-stillingen og ikke i 2-stillingen som hos forbindelserne med den ovennævnte formel I, og en som i den 15 ovennævnte formel I defineret gruppe mangler.

Forbindelserne med den ovennævnte formel I danner in vivo stabile komplekser med tungmetalioner og kan anvendes til udskillelse af tungmetaller,· især jern, af organismen.

Forethret hydroxy R^ betyder i første række ved forethring 20 beskyttet hydroxy og/eller eventuelt substitueret aliphatisk, carbocyclisk eller carbocyclisk-aliphatisk hydrocarbyloxy eller heterocyclyloxy med 1-12 carbonatomer. En aliphatisk hydrocarbyloxygruppe R1 indeholder i første række 1-12, fortrinsvis 1-7 og især 1-4 carbonatomer og betyder først og 25 fremmest tilsvarende usubstitueret eller substitueret alkoxy, især usubstitueret alkoxy, f.eks. methoxy.

Carbonhydriddelen i en carbocyclisk hydrocarbyloxygruppe er i første række en cycloaliphatisk gruppe med 3-8, især 5 eller 6 ringled, først og fremmest en sådan usubstitue-30 ret eller substitueret cycloalkylgruppe, især en usubstitue-

DK 160304B

3 ret eller med lavalkyl substitueret cycloalkylgruppe, eller en aromatisk mono- eller bicyclisk gruppe med 6 henholdsvis 10 ringcarbonatomer, f.eks. en phenylgruppe, i allerførste række phenyl. En carbocyclisk-aliphatisk hydrocarbyloxy-5 gruppe R^· er i første række aliphatisk hydrocarbyloxy defineret som ovenfor, som er substitueret med mindst én af de ovenfor definerede, carbocycliske grupper.

Heterocyclyl i en heterocyclyloxygruppe R1 betyder fortrinsvis usubstitueret eller substitueret, mættet eller umættet 10 monocyclisk 5- eller 6-leddet heterocyclyl med et nitrogenatom, oxygenatom eller svovlatom som ringled, især mættet heterocyclyl, først og fremmest mættet eller usubstitueret heterocyclyl, hvis fri valens er i nabostilling til hetero-atornet, f.eks. 2-tetrahydropyranyl.

15 Forestret hydroxy R^" kan afledes af en organisk eller uorganisk syre.

Blandt de uorganiske syrer kan nævnes svovl- og phosphorsyrer .

Forestret hydroxy r\ der er afledt af en organisk syre, 20 er først og fremmest acyloxy med 1-12 carbonatomer eller sulfonyloxy. Acyloxy kan betyde formyloxy, men er fortrinsvis eventuelt substitueret hydrocarbylcarbonyloxy eller hydrocarbyloxycarbonyloxy. I dette tilfælde er hydrocarbyl en aliphatisk gruppe med 1-11, især 1-6, først og fremmest 25 1-3 carbonatomer, en carbocyclisk gruppe, dvs. en cyclo- aliphatisk gruppe med 3-8 , især 5 eller 6 ringled, eller en mono- eller bicyclisk aromatisk gruppe med 6 henholdsvis 10 ringled, eller en tilsvarende carbocyclisk-aliphatisk gruppe. De ovennævnte cycloaliphatiske 30 henholdsvis aromatiske grupper er fortrinsvis usubstituere-de eller substituerede cycloalkylgrupper, især usubstitue-rede eller med lavalkyl substituerede cycloalkylgrupper henholdsvis phenylgrupper, f.eks. phenyl.

DK 160304 B

4

Sulfonyloxy betyder især aromatisk, fortrinsvis monocyclisk aromatisk sulfonyloxy med 1-12 carbonatomer, f.eks. toluen-sulfonyloxy, eller aliphatisk sulfonyloxy med 1-12, fortrinsvis 1-7, i første række 1-4 carbonatomer, især usub-5 stitueret eller halogeneret alkylsulfonyloxy.

Forestret hydroxy kan især også betyde ved forestring beskyttet hydroxy.

En aliphatisk, carbocyclisk eller carbocyclisk-aliphatisk 2 gruppe R betyder fortrinsvis en carboxylbeskyttelses-10 gruppe og/eller har en af følgende betydninger.

2

En aliphatisk gruppe R har i første række 1-12, fortrinsvis 1-7 og især 1-4 carbonatomer og betyder først og fremmest tilsvarende usubstitueret eller substitueret alkyl, i første række usubstitueret alkyl, f.eks. methyl.

2 15 En carbocyclisk gruppe R er i første række en cycloalipha-tisk gruppe med 3-8, især 5 eller 6 ringled, først og fremmest en sådan usubstitueret eller substitueret cycloalkyl-gruppe, især en usubstitueret eller med lavalkyl substitueret cycloalkylgruppe eller en aromatisk mono- eller bicyc-20 lisk gruppe med 6 henholdsvis 10 ringcarbonatomer, f.eks. en phenylgruppe, såsom f.eks. i allerførste række phenyl.

2

En carbocyclisk-aliphatisk gruppe R er i første række en aliphatisk gruppe, der er defineret som ovenfor, og som er substitueret med mindst én af de ovenfor angivne carbo-25 cycliske grupper, f.eks. benzyl.

3

En usubstitueret aliphatisk gruppe R er først og fremmest lavalkyl, i første række methyl, og desuden over et mættet carbonatom bundet lavalkenyl.

DK 160304B

5

De ovenfor og/eller i det følgende anvendte almene definitioner har indenfor rammerne af den foreliggende beskrivelse fortrinsvis følgende betydninger: "Lav" refererer til en gruppe med 1-7 carbonatomer. Lavalkyl 5 er eksempelvis methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl eller tert-butyl, endvidere n-pentyl, neopentyl, n-hexyl eller n-heptyl. Lavalkenyl er f.eks. allyl eller 2-butenyl. Cycloalkyl indeholder fortrinsvis 3-8, i første række 5 eller 6 ringatomer og er f.eks. cyclopentyl 10 eller cyclohexyl. Phenyllavalkyl er eksempelvis benzyl, 1- eller 2-phenylethyl eller 3-phenylpropyl. Halogen betyder især brom, men kan dog også betyde chlor eller iod, endvidere fluor. Lavalkoxy er f.eks. methoxy, endvidere ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy eller tert-butoxy.

15 Lavalkanoyloxy er f.eks. acetoxy, eller propionyloxy. Lav-alkoxycarbonyl er f.eks. methoxycarbonyl eller ethoxycarb-onyl. Lavalkoxycarbonyloxy er f.eks. methoxycarbonyloxy eller ethoxycarbonyloxy. 5- eller 6-leddede heterocycliske 20 grupper med et oxygen-, nitrogen- eller svovlatom som ringatom er f.eks. tetrahydropyranyl, pyridyl, thienyl eller furyl.

Substituenter i f.eks. aromatiske forbindelser er eventuelt substitueret lavalkyl eller eventuelt, f.eks. med lav-25 alkyl, nitro, lavalkoxy og/eller halogen, substitueret phenyl eller funktionelle grupper, f.eks. basiske grupper, såsom en eventuelt substitueret aminogruppe, eller sure grupper, såsom eventuelt funktionelt omdannet'./ f.eks. fores tret carboxy, f.eks. carboxy eller lavalkoxycarbonyl, 30 eller eventuelt forethret, forestret eller beskyttet hydroxy eller oxo.

Monocyclisk aromatisk sulfonyloxy er eksempelvis p-toluen-sulfonyloxy eller benzensulfonyloxy.

Lavaliphatisk sulfonyloxy er eksempelvis methansulfonyloxy.

DK 160304 B

6

Beskyttelsesgrupper, f.eks. for 3'-hydroxy-gruppen, samt indføringen og fraspaltningen af disse er eksempelvis beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London, New York 1973, samt i "Methoden der Organi-5 schen Chemie", Houben-Weyl, 4. udgave, bind 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Det er karakteristisk for beskyttelsesgrupper, at de let kan fraspaltes, dvs. uden at der foregår uønskede sidereaktioner, f.eks. ved solvolyse, reduktion, fotolyse eller også under fysiologiske betingelser.

10 Hydroxybeskyttelsesgrupper er eksempelvis acylgrupper, såsom eventuelt, f.eks. med halogen, substitueret lavalkanoyl, såsom 2,2-dichloracetyl, eller acylgrupper af kulsyrehalv-estere, især tert-butyloxycarbonyl, eventuelt substitueret benzyloxy-carbonyl, f.eks. 4-nitro-benzyloxycarbonyl, eller diphenyl-15 methoxycarbonyl, eller 2-halogen-lavalkoxycarbonyl, såsom 2,2,2-trichlorethoxycarbonyl, endvidere trityl eller formyl, eller organiske silyl- eller stannylgrupper, endvidere let fraspaltelige forethrende grupper, såsom tert-lavalkyl, f.eks. tert-butyl, 2-oxa- eller 2-thia-aliphatiske eller 20 -cycloaliphatiske carbonhydridgrupper, i første række 1-lavalkoxy-lavalkyl eller 1-lavalkylthio-lavalkyl, f.eks. methoxy-methyl, 1-methoxyethyl, 1-ethoxy-ethyl, 1-methylthiomethy1, 1- methylthioethyl eller 1-ethylthioethyl, eller 2-oxa- eller 2- thiacycloalkyl med 5-6 ringatomer, f.eks. tetrahydrofuryl 25 eller 2-tetrahydropyranyl, eller tilsvarende thiaanaloge, samt eventuelt substitueret 1-phenyllavalkyl, såsom eventuelt substitueret benzyl eller diphenylmethyl, idet phenyl-grupperne kan være substitueret med f.eks. halogen, såsom chlor, lavalkoxy, såsom methoxy,og/eller nitro.

30 Carboxylgrupper er sædvanligvis beskyttet på forestret form, idet sådanne estergrupper let kan spaltes under skånsomme betingelser. På denne måde beskyttede carboxylgrupper inde- 2 holder som forestrende grupper, såsom gruppen R , i første række i 1-stillingen forgrenede eller i 1- eller 2-stillin-35 gen passende substituerede lavalkylgrupper. Foretrukne, i forestret form foreliggende carboxylgrupper er blandt andet

DK 160304 B

7 tert-lavalkoxycarbonyl, f.eks. tert-butyloxycarbonyl, aryl-methoxycarbonyl, med en eller to arylgrupper, som er eventuelt med lavalkyl, såsom tert-lavalkyl, f.eks. tert-butyl, lavalkoxy, såsom methoxy, hydroxy, halogen, f.eks. chlor, 5 og/eller nitro, mono- eller polysubstituerede phenylgrupper, såsom eventuelt, f.eks. som anført ovenfor, substitueret benzyloxycarbonyl, f.eks. 4-nitro-benzyloxycarbonyl eller 4-methoxy-benzyloxycarbonyl, eller eventuelt, f.eks. som anført ovenfor, substitueret diphenylmethoxycarbonyl, f.eks.

10 diphenylmethoxycarbonyl eller di-(4-methoxyphenyl)-methoxy-carbonyl, 1-lavalkoxylavalkoxycarbonyl, såsom methoxymethoxy-carbonyl, 1-methoxyethoxycarbonyl eller 1-ethoxymethoxycarb-onyl, 1-lavalkylthiolavalkoxycarbonyl, såsom 1-methylthio-methoxycarbonyl eller 1-ethylthioethoxycarbonyl, aroylmeth-15 oxycarbonyl, hvori aroylgrupperne eventuelt er f.eks. med halogen, såsom brom, substitueret benzoyl, f.eks. phenacyl-oxycarbonyl, 2-halogenlavalkoxycarbonyl, f.eks. 2,2,2-tri-chlorethoxycarbonyl, 2-brpmethoxycarbony1 eller 2-iodethoxy-carbonyl, eller 2-(trisubstitueret silyl)-ethoxycarbonyl, 20 hvori substituenterne hver for sig betyder en eventuelt substitueret, f.eks. med lavalkyl, lavalkoxy, aryl, halogen og/eller nitro substitueret, aliphatisk,araliphatisk, cyclo-aliphatisk eller aromatisk carbonhydridgruppe, såsom tilsvarende, eventuelt substitueret lavalkyl, phenyllavalkyl, 25 cycloalkyl eller phenyl, f.eks. 2-trilavalkylsilylethoxy-carbonyl, såsom 2-trimethylsilylethoxycarbonyl eller 2-(di-n-butyl-methyl-silyl)-ethoxycarbonyl, eller 2-triaryl-silylethoxycarbonyl, såsom 2-triphenylsilylethoxycarbonyl.

De ovenfor anførte organiske silyl- eller stannylgrupper 30 indeholder fortrinsvis lavalkyl, især methyl, som substi-tuenter ved silicium- eller tinatomerne. Tilsvarende silyl-eller stannylgrupper er i første række trilavalkylsilyl, især trimethylsilyl, endvidere dimethyl-tert-butylsilyl, eller tilsvarende substitueret stannyl, f.eks. tri-n-35 butylstannyl.

Foretrukne beskyttede carboxylgrupper er tert-lavalkoxycarb-

DK 160304 B

8 onyl, såsom tert-butoxycarbonyl, og i første række eventuelt, f.eks, som anført ovenfor, substitueret benzyloxycarbonyl, såsom 4-nitro-benzyloxycarbonyl, eller diphenylmethoxycarb-onyl, først og fremmest 2-(trimethylsilyl)-ethoxycarbonyl.

5 Saltene af de omhandlede forbindelser er i første række farmaceutisk anvendelige, ugiftige salte, såsom salte af forbindelserne med formlen (I) med sure grupper, f.eks. med en fri carboxylgruppe. Sådanne salte er i første række indre salte, idet en i molekylet tilstedeværende basisk gruppe, 10 f.eks. et basisk nitrogenatom, f.eks. i pyridingruppen eller i en eventuelt tilstedeværende fri aminogruppe, er protoneret med en fra et molekyle med formlen (I) stammende hydrogenion, desuden også metal- eller ammoniumsalte, såsom alkalimetal- eller jordalkalimetalsalte, f.eks. na-15 trium-, kalium-, magnesium- eller calciumsalte, samt ammoniumsalte med ammoniak eller egnede organiske aminer, idet der til saltdannelsen i første række anvendes aliphatiske, cycloaliphatiske, cycloaliphatisk-aliphatiske eller aralipha-tiske primære, sekundære eller tertiære mono-, di- eller 20 polyaminer, samt heterocycliske baser, såsom lavalkylaminer, f.eks. triethylamin, hydroxylavalkylaminer, f.eks. 2-hydr-, oxyethylamin, bis-(2-hydroxyethyl)-amin eller tris-(2-hydroxyethyl)-amin, basiske aliphatiske estere af carboxylsyrer, f.eks. 4-aminobenzoesyre-2-diethylaminoethylester, 25 lavalkylenaminer, f.eks. 1-ethyl-piperidin, cycloalkylaminer, f.eks. dicyclohexylamin, eller benzylaminer, f.eks. N,N‘-di-benzyl-ethylendiamin, endvidere baser af pyridintypen, f.eks. pyridin, collidin eller quinolin. Forbindelserne med formlen (I) kan også danne intermolekylære (i modsætning til de 30 intramolekylære, dvs. amfoioniske) syreadditionssalte, f.eks. med uorganiske syrer, såsom saltsyre, svovlsyre eller phosphor-syre, eller med egnede organiske carboxyl- eller sulfonsyrer, f.eks. trifluoreddikesyre, samt med aminosyrer, såsom arginin og lysin. Ved tilstedeværelse af flere sure eller basiske 35 grupper kan der dannes mono- eller polysalte. Ved forbindelser med formlen (I) med en sur gruppe, f.eks. en fri carboxylgruppe, kan også en del af molekylet foreligge som indre salt og en anden del som normalt salt.

9 DK 160304 B

Til isolering eller rensning kan der også anvendes farmaceutisk uegnede salte. Til terapeutisk anvendelse kan kun anvendes de farmaceutisk anvendelige, ugiftige salte, som derfor foretrækkes.

5 Forbindelserne med formlen I med fri carboxylgruppe, hvor carboxylgruppens proton kan være fraspaltet, kan danne stabile komplekser med metalioner, såsom tungmetalioner. Blandt tungmetalionerne skal især nævnes sådanne med oxidationstrinet 3+, såsom Al^+ eller Cr +, i første række dog Fe^+.

10 Tilsætning af 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin- 4-carboxylsyre til et jern(III)-ethylendiamintetraeddikesy-re-dinatrium-salt-kompleks (log K = 21,6) fører til en om-kompleksering, hvis forløb kan følges polarografisk til bestemmelse af log K af kompleksdannelseskonstanten K for 15 2-(3'-hydroxy-pyrid-2-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxyl- syre-jern(III)-komplekset til 32,7 og dets ligandtal p til 3.

Forbindelserne med formlen (I) har farmakologisk værdifulde egenskaber.

20 På grund af deres evne til at danne stabile komplekser med tungmetalioner, især sådanne i oxidationstrinet 3+, såsom 3+ 3+ 3+

Al eller Cr , først og fremmest Fe , forhindrer forbindelserne med formlen I med fri 4-carboxygruppe, f.eks.

2-(31-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-carboxylsy-25 re, f.eks. aflejringen af jernholdige pigmenter i væv, eller de bevirker en udskillelse af jernet i tilfælde af jernaflejring i organismen, f.eks. ved hæmokromatose og hæmosiderose samt ved levercirrhose. Forbindelserne kan

DK 160304 B

ίο også anvendes til udskillelse af andre tungmetaller, f.eks. de ovenfor anførte eller af kobber fra organismen. Eksempelvis bevirker subkutan applikation af 10 mg/kg 2-(3'-hydroxy-pyrid-21-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre til rot-5 ter en i urinen påviselig udskillelse af ferrithiocin.

Den terapeutiske dosis for sidstnævnte forbindelse som middel til fjernelse af jern udgør for varmblodede dyr med en legemsvægt på ca. 70 kg, f.eks. mennesker, 100-1000 mg, især 300-700 mg, f.eks. 500 mg daglig. Fortrinsvis indgives den-10 ne dosis fordelt på flere, f.eks. tre, enkeltdoser, f.eks. oralt,men også subkutant.

Til udskillelse af tungmetalioner, f.eks. af jern(III)ioner, kan man også anvende forbindelser med formlen (I) med for-estret 4-carboxygruppe, hvis estergruppe let forsæbes under 15 fysiologiske betingelser .(prolægemiddel-former) .

På den anden side kan de jernholdige komplekser i visse tilfælde anvendes som jerndonatorer, f.eks. i husdyr.

Eksempelvis kan jernkomplekset af 2-(3'-hydroxy-pyrid-2’-yl)- 4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre anvendes til profylakse 20 og terapi af jernmangelanæmi hos pattegrise. Til dette formål indgives to doser, som tilsammen svarer til et jernindhold på 100 mg pr. pattegris, efter den 11. og 16. levedag i form af en finfordelt suspension i 40 ml 0,6 M phosphatpuf-fer med pH-værdi 7,4 ved hjælp af en gummisonde direkte i 25 maven. Fødselsvægten for pattegrisene er gennemsnitligt 1,7 kg, efter 11 levedage 3-4 kg, efter 16 levedage 3,7-5,1 kg og efter 22 levedage 4,5-6,5 kg. Bestemmelse af hæmoglobinkoncentrationen efter 11 forsøgsdage (22 levedage) giver signifikant forøgede værdier i sammenligning med en negativ kontrol 30 (tilsvarende pufferopløsning uden virksomt stof).

DK 160304 B

11

Ved afprøvningen for akut toksicitet på mus (5 dyr på 20-25 g) er 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre fuldstændig forenelig ved en dosis på 100 mg/kg såvel ved peroral som ved subkutan indgift.

5 Forbindelser med formlen (I), hvori de funktionelle grupper er beskyttede, anvendes i første række som mellemprodukter ved fremstillingen af sådanne forbindelser med formlen (I), hvori de funktionelle grupper foreligger i fri form.

Især skal nævnes forbindelser med formlen (I), hvori 10 R·*· betyder fri hydroxy, hydrocarbyloxy, hydrocarbylcarbonyl- oxy eller hydrocarbyloxycarbonyloxy, idet hydrocarbyl betyder en aliphatisk gruppe med 1-7 carbonatomer, en cyclo-aliphatisk gruppe med 5 eller 6 ringatomer, en phenylgrup-pe eller en med mindst én sådan cycloaliphatisk gruppe el-15 ler phenylgruppe substitueret aliphatisk gruppe med 1-7 carbonatomer, eller hvori«. R^ betyder monocyclisk 5- eller 6-leddet heterocyclyloxy med et nitrogen-, oxygen- eller svovlatom som ringatom eller monocyclisk aromatisk eller 2 lavaliphatisk sulfonyloxy, hvori R betyder hydrogen, en 20 aliphatisk gruppe med 1-7 carbonatomer, en cycloaliphatisk gruppe med 5 eller 6 ringatomer, en phenylgruppe eller en aliphatisk gruppe med 1-7 carbonatomer, som er substitueret med mindst én sådan cycloaliphatisk gruppe eller phenylgrup- 3 pe, og hvori R betyder hydrogen eller lavalkyl.

25 I første række skal nævnes forbindelser med formlen (I) , hvori R^ betyder fri hydroxy, alkoxy med 1-12 carbonatomer, monocyclisk aromatisk sulfonyloxy, lavalkylsulfonyl-oxy, hydrocarbylcarbonyloxy eller hydrocarbyloxycarbonyloxy, hvor hydrocarbyl betyder lavalkyl, cycloalkyl med 3-8 carbon- 30 atomer, en monocyclisk aromatisk carbonhydridgruppe eller 2 phenyllavalkyl, og hvori R betyder en sådan hydrocarbylgrup- 3 pe eller hydrogen, og R betyder hydrogen eller lavalkyl.

Forbindelser med formlen (I) foretrækkes, i hvilke R1 betyder fri hydroxy, lavalkoxy, lavalkanoyloxy el-

DK 160304 B

12 ler usubstitueret eller med halogen, lavalkyl eller lav- 2 alkoxy substitueret phenyloxy eller benzyloxy, og hvori R betyder hydrogen, lavalkyl eller en phenyl- eller phenyl- 3 lavalkylgruppe, og R betyder hydrogen eller lavalkyl.

5 Især foretrækkes forbindelser med formlen (I), hvori R^ be- 2 tyder fri hydroxy eller lavalkoxy, R betyder hydrogen eller 3 lavalkyl, og R betyder methyl, og salte af disse forbindelser samt jernionkomplekser af sådanne forbindelser med fri 4-carboxygruppe.

X

10 Fremhæves skal forbindelserne med formlen (I), hvori R be- 2 tyder hydroxy eller methoxy, R betyder'hydrogen eller meth- 3 yl, og R betyder hydrogen eller methyl, samt deres salte.

Især skal fremhæves de ovenfor anførte forbindelser med form-2 len (I), hvori R betyder hydrogen eller en under fysiologi-15 ske betingelser fraspaltelig, farmaceutisk acceptabel gruppe, og deres salte, i første række farmaceutisk anvendelige salte, samt jernkomplekser, især jern(III)-komplekser.

Helt specielt foretrækkes forbindelser med formlen (I), 3 hvori R betyder methyl, og deres salte.

20 I første række foretrækkes de i eksemplerne beskrevne forbindelser med formlen (I), deres salte, især farmaceutisk anvendelige salte, i første række 2-(3'-hydroxy-pyrid-2’-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre, fortrinsvis i den ifølge eksempel 2 fremstillede optisk aktive form.

25 Forbindelserne med formlen (I) og salte af disse forbindelser samt metalkomplekser af sådanne forbindelser, 2 hvori gruppen COOR betyder en fri carboxylgruppe, hvis sure proton eventuelt er fraspaltet, kan fremstilles ved kemisk syntese på i og for sig kendt måde. Forbindelserne fremstil-30 les eksempelvis ved, at man omsætter et picolinsyrederivat med formlen

DK 160304 B

13 .-N .

<C >-R (1I>

V

hvori R^ betyder fri, forethrer eller forestret hydroxy, idet dog hydroxygrupper eller andre funktionelle grupper 4 eventuelt foreligger i beskyttet form, og R betyder en 5 cyano- eller carboxylgruppe, eller et reaktivt funktionelt 3 derivat deraf med et 2-amino-3-mercapto-2-R -propionsyre-derivat med formlen HS- H2N--COOR2 (III) R3 hvori substituenterne har de ovenfor angivne betydninger, 10 med det forbehold, at en eller flere af de i forbindelsen tilstedeværende funktionelle grupper eventuelt foreligger i beskyttet form, eller med et reaktivt funktionelt derivat deraf og, om ønsket, fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper og/eller i en fremstillet forbindelse 15 med formlen I forestrer eller forethrer en 3'-hydroxy-grup- pe eller overfører en forestret eller forethret hydroxygrup- pe i en fri hydroxygruppe og/eller forestrer en carboxylgrup- 2 pe med et forestringsmiddel indeholdende gruppen R eller forsæber en forestret carboxylgruppe og/eller overfører 20 forbindelserne med formlen (I) i deres syreadditionssalte eller forbindelserne med formlen (I) med fri carboxylgruppe i deres metalsalte eller i tungmetalkomplekser og, om ønsket, adskiller racemater i de optisk aktive former.

4

Et reaktivt funktionelt derivat af en carboxylgruppe R er 25 eksempelvis et syreanhydrid, en aktiveret ester eller et aktiveret amid.

DK 160304 B

14

Blandt anhydriderne er de blandede anhydrider særligt velegnede. Blandede anhydrider er eksempelvis sådanne med uorganiske syrer, såsom hydrogenhalogenidsyrer, dvs. de tilsvarende syrehalogenider, f.eks. -chlorider eller -bromider, 5 endvidere med hydrogenazid, dvs. de tilsvarende syreazider, med en phosphorholdig syre, f.eks. phosphorsyre, diethylphos-phorsyre eller phosphorsyrling, eller med en svovlholdig syre, f.eks. svovlsyre, eller med hydrogencyanid. Andre blandede anhydrider er eksempelvis sådanne med organiske 10 carboxylsyrer, såsom med eventuelt, f.eks. med halogen, såsom fluor eller chlor, substituerede lavalkancarboxylsyrer, f.eks. pivalinsyre eller trichloreddikesyre, eller med halvestere, især lavalkylhalvestere af kulsyre, såsom ethyl- eller isobutylhalvesteren af kulsyre, eller med or-' 15 ganiske, især aliphatiske eller aromatiske, sulfonsyrer, f.eks. p-toluensulfonsyre.

Som eksempler på aktivereide estere kan. nævnes: estere med vinyloge alkoholer (dvs. enoler, såsom vinyloge lavalkenoler), eller iminomethylesterhalogenider, såsom dimethyliminometh-20 ylesterchlorid (fremstillet ud fra carboxylsyren og eksempelvis dimethyl-(1-chlor-ethyliden)-iminium-chlorid med Φ Θ formlen (CH3)3N =C(Cl)CH3 Cl , som eksempelvis kan fremstilles ud fra Ν,Ν-dimethyl-acetamid og phosgen), eller aryl-estere, såsom fortrinsvis egnede, f.eks. med halogen, såsom 25 chlor, og/eller nitro substituerede phenylestere, f.eks.

4-nitro-phenyl-, 2,3-dinitrophenyl- eller 2,3,4,5,6-penta-chlor-phenylester, N-heteroaromatiske estere, såsom N-benz-triazol-, f.eks. l-benztriazolester, eller N-diacyliminoeste-re, såsom N-succinylimino- eller N-phthalyliminoester.

30 Egnede aktiverede amider er f.eks. især imidazolider, endvidere 1,2,4-triazolider, tetrazolider eller 1,2,4-oxadi-azolinonider.

4

Aktiveringen af en carboxylgruppe R i picolinsyrederivatet kan også foretages in situ.

DK 160304 B

15

Et reaktivt funktionelt derivat af et 2-amino-3-mercapto-2-R -propionsyrederivat med formlen (III) er en forbindelse, hvori amino- og/eller mercaptogruppen er aktiveret til reaktionen med carboxylgruppen i en forbindelse med formlen 5 (II), dvs. foreligger i nucleofil form. Aminogruppen er eksempelvis aktiveret ved omsætning med et phosphit.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er omsætningen af en forbindelse med formlen 4 (II), hvori R betyder cyano, med et cysteinderivat med 10 formlen (III), der eksempelvis gennemføres som beskrevet i udførelseseksemplerne.

4

Omsætningen af en fri carboxylgruppe R med det ønskede cysteinderivat gennemføres fortrinsvis i nærværelse af et egnet kondensationsmiddel eller under vandfjernende betin-15 gelser, f.eks. fjernelse af reaktionsvandet ved azeotrop destillation. Gængse kondensationsmidler er f.eks. carbo-diimider, eksempelvis N,Ν'-diethyl-, Ν,Ν'-dipropyl-, Ν,Ν’-dicyclohexyl- eller N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, egnede carbonylforbindelser, såsom carbonyl-20 diimidazol, eller 1,2-oxazoliumforbindelser, f.eks. 2- ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-31-sulfonat og 2-tert-butyl- 5-methylisoxazolium-perchlorat, eller en egnet acylaminofor-bindelse, f.eks. 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydro-quinolin. Kondensationsreaktionen gennemføres fortrinsvis 25 i et vandfrit reaktionsmedium, fortrinsvis i nærværelse af et opløsningsmiddel eller et fortyndingsmiddel, f.eks. meth-ylenchlorid, benzen eller tetrahydrofuran, og, om nødvendigt, under afkøling eller opvarmning og/eller i en indifferent gasatmosfære.

3 30 Forbindelser med formlen (I), hvori R betyder lavalkyl, fremstilles på i og for sig kendt måde, idet man i en for- 3 bindelse med formlen (I), hvori R betyder hydrogen, og 1 2 hvori R og R har den i forbindelse med formlen (I) angivne betydning, idet dog tilstedeværende funktionelle grup-35 per om ønsket foreligger i beskyttet form, fjerner en proton

DK 160304 B

16 i 4-stillingen med en base og omsætter det dannede mellemprodukt med et alkyleringsmiddel til indføring af gruppen 3 R , hvor alkylcarbonatomet, som indgår i den nye binding/ bærer en positiv delladning/ og om ønsket fraspalter even- 5 tuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper og/eller i en fremstillet forbindelse med formlen (I) forestrer eller for- ethrer en 31-hydroxy-gruppe eller overfører en forestret eller forethret hydroxygruppe i en fri gruppe og/eller forestrer en carboxylgruppe med et forestringsmiddel inde- 2 10 holdende gruppen R eller forsæber en forestret carboxylgruppe og/eller overfører forbindelserne med formlen (I) i deres syreadditionssalte eller forbindelserne med formlen (I) med frie carboxylgrupper i deres metalsalte eller i tungmetalkomplekser og, om ønsket, adskiller racemater i 15 de optisk aktive former.

Egnede baser er eksempelvis metalliseringsreagenser, såsom usubstituerede eller substituerede alkalimetalamider, f.eks. natriumamid, lithiumamid eller fortrinsvis sterisk hindrede lithiumamider, f.eks. lithium-trimethylsilyl-amid, 20 lithium-isopropyl-cyclohexyl-amid eller lithiumdialkylamider, såsom lithiumdiisopropylamid, eller alkalimetallavalkylforbin-delser, såsom methyl-, n- eller tert-butyllithium, samt tillige alkalimetalhydrider, såsom natriumhydrid.

Når omsætningen gennemføres under faseoverføringsbetingel-25 ser eller i nærværelse af egnede kompleksdannere for base-kationen, såsom kroneethere, f.eks. 18-krone-6, er også svagere baser egnede, såsom alkalimetalhydroxider, f.eks. kaliumhydroxid.

3

Egnede alkyleringsmidler til overføring af gruppen R er 30 f.eks. lavalkyl- eller lavalkenylforbindelser med en nucleo-fil fraspaltningsgruppe, f.eks. halogenider, såsom chlorider, bromider eller først og fremmest iodider, f.eks. methyliodid. eller allylbromid, eller sulfonsyre- eller svovlsyreestere af usubstituerede aliphatiske alkoholer med 1-7 carbonato-35 mer, f.eks. toluensulfonsyreisopropylester, methylsulfonsy-rebutylester eller diethylsulfat.

DK 160304 B

17

Den med de ovennævnte alkalimetalamider, -hydrider eller -lavalkylforbindelser gennemførte metallisering foretages i et indifferent, aprotisk opløsningsmiddel og under en beskyttelsesgas, f.eks. i et carbonhydrid, f.eks. hexan, 5 benzen, toluen eller xylen, en svagt polær ether, f.eks. diethylether, tetrahydrofuran eller dioxan,eller et syreamid, f.eks. hexamethylphosphorsyretriamid, eller blandinger deraf. Reaktionstemperaturen ligger mellem ca. -80°C og ca. stuetemperatur afhængigt af først og fremmest op-10 løsningsmidlets eller opløsningsmiddelblandingens smeltepunkt og af reaktiviteten af det pågældende metalliseringsreagens i det valgte opløsningsmiddel, men også af opløseligheden og reaktiviteten af substratet.

Alkyleringen foregår ved langt højere temperatur end me-15 talliseringen og gennemføres i reglen på den måde, at al-kyleringsmidlet efter endt metallisering sættes til reaktionsbeholderen, som man derpå lader opvarme.

Yderligere enkeltheder vedrørende gennemførelsen af metalliserings- og alkyleringsreaktioner, som er analoge med de 20 ovenfor beskrevne, er eksempelvis beskrevet i Houben-Weyl, Methoden der Organischen Ghemie, bind XIII/1, Thieme Verlag, Stuttgart 1970.

En anden fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne med formlen (I), hvori R^ betyder en fri hydroxygruppe, 2 25 og/eller R betyder hydrogen, er ejendommelig ved, at man i en forbindelse med formlen (I), hvori betyder en be- 2 skyttet hydroxygruppe,og/eller COOR betyder en beskyttet hydroxylgruppe, fraspalter mindst én beskyttelsesgruppe.

3

Forbindelser med formlen I, hvori R betyder en methylgrup-30 pe, og de øvrige substituenter har de i forbindelse med formlen (I) angivne betydninger, og de ovenfor omtalte salte og metalkomplekser af disse forbindelser kan man også fremstille ifølge en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at

DK 160304 B

18 man aerobt dyrker stammen Streptomyces antibioticus Waksman et Henrici Tu 1998 (DSM 1865) eller en 2— (3 * — hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre-dannende mutant af denne stamme i en vandig næringsopløs-5 ning indeholdende en carbonkilde og en nitrogenkilde samt uorganiske salte og fra næringsopløsningen isolerer 2—(3 * — hydroxy-pyrid-21-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre eller et stabilt tungmetalkompleks af denne syre og, om ønsket, frigør 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-10 thiazolin-4-carboxylsyren eller et salt deraf fra tungmetalkomplekset og, om ønsket, forestrer eller forethrer en 31-hydroxy-gruppe eller overfører en forestret eller en forethret hydroxygruppe i en fri gruppe og/eller forestrer en carboxylgruppe med et forestringsmiddel indeholdende 2 15 gruppen R eller forsæber en forestret carboxylgruppe og/eller overfører forbindelserne med formlen (I) i deres syreadditionssalte eller forbindelserne med formlen (I) med fri carboxylgruppe i deres metalsalte eller i tungmetalkomplekser.

20 Der kan muligvis også fremstilles forbindelser med formlen I på den ovenfor nævnte mikrobiologiske måde, hvori R har de andre ovennævnte betydninger, idet man sætter cystein eller tilsvarende cysteinderivater til næringsopløsningen.

Stammen Streptomyces antibioticus Tu 1998 er deponeret under 25 betegnelsen DSM 1865 den 16. juni 1980 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen.

Stammen er karakteriseret på følgende måde:

Sporerne er ellipsoide, 0,6-1,4 μ x 0,5-1,2 μ i størrelse, og har en glat til let knopret, overflade (eventuelt som føl-30 ge af præpareringen). Luftmyceliet er i begyndelsen hvidgråt og bliver med tiltagende alder gråt til askegråt.

Sporekæderne er monopodialt forgrenede og kun let bølgede.

På peptonholdige substrater, først og fremmest "pepton-jernagar" , danner stammen et mørkt melaninagtigt pigment. Sub

DK 160304 B

19 stratmyceliet er mørkt til brunrødt. Som følge af de på nogle substrater samtidigt dannede rubromyciner fremtræder substratet med vinrød til brunrød farve.

Mutanter, som danner antibiotikumet, kan eksempelvis frem-5 bringes ved indvirkning af ultraviolette stråler eller røntgenstråler eller ved påvirkning af kemiske mutagener, f.eks. N-methyl-N1-nitro-N-nitroso-guanidin.

Som eksempler på carbonkilder kan nævnes assimilerbare carbonhydrater, f.eks. glucose, saccharose, lactose, mannitol, 10 stivelse og glycerol. Som nitrogenholdige næringsstoffer kan nævnes aminosyrer, peptider og proteiner samt deres nedbrydningsprodukter, såsom pepton eller trypton, endvidere kødekstrakter, vandopløselige bestanddele af korn fra kornsorter, såsom majs og hvede, af destillationsremanenser fra 15 alkoholfremstilling, af gær, bønner, især fra sojaplanten, af frø, eksempelvis fra bpmuldsplanten, o.s.v., men også ammoniumsalte og nitrater. Blandt andre uorganiske salte kan næringsopløsningen eksempelvis indeholde chlorider, carbonater, sulfater og phosphater af alkali- eller jord-20 alkalimetaller, af magnesium, jern, zink og mangan.

Dyrkningen gennemføres aerobt, altså eksempelvis i en hvilende overfladekultur eller fortrinsvis submerst tinder rystning eller omrøring med luft eller oxygen i rystekolber eller de kendte fermenteringsbeholdere. Der kan anvendes tem-25 peraturer på fra mellem 18 og 40°C, fortrinsvis ca. 27°C. Sædvanligvis udviser, næringsopløsningen en væsentlig antibiotisk virkning efter 3 til 7 dage. Fortrinsvis gennemføres dyrkningen i flere trin, dvs. at man først fremstiller en eller flere forkulturer i et flydende dyrkningsmedium, som 30 derpå podes på det egentlige produktionsmedium, f.eks. i forholdet 1:20.

Fortrinsvis dyrker man forkulturen på det samme substrat og lader den vokse i ca. 48 timer. Producentstammen udskiller 2-(31-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxyl-

DK 160304 B

20 syren (jernfri) i dyrkningsvæsken.

Ved den omhandlede fermentering dannes foruden 2-(3*-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre også andre produkter, blandt hvilke der kan identificeres 5 β- og γ-rubromyciner, der oprindeligt er beskrevet som metaboliter af Streptomyces collinus Lindenbein [H. Brock-mann og K.H. Renneberg, Naturwiss. 40, 59-60 (1953), H. Brockmann, W- Lenk, G. Schwanthe og A. Zeeck, Tetrahedron Letters 1966, 3525, og H. Brockmann og A. Zeeck, Chem. Ber.

10 103, 1709-1726 (1970)].

Isoleringen af 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazoiin- 4-carboxylsyre kan gennemføres på i og for sig kendt måde under hensyntagen til antibiotikumets kemiske, fysiske og biologiske egenskaber. Fortrinsvis sætter man ved en pH-værdi 15 omkring neutralpunktet, f.eks. ved pH-værdien 7,5, til kulturen en til kompleksering af antibiotikumet tilstrækkelig mængde af et tungmetalsalt, som danner stabile isolerbare komplekser med antibiotikumet, f.eks. jern(III)chlorid-hexahydrat eller andre jern(III)salte.

20 Ved tilsætning af jern(III)salte dannes et karakteristisk farvet jernkompleks ("ferrithiocin"), der ved neutral pH-værdi og mætning med kogsalt kan ekstraheres med ethylacetat. Ekstraktionen kan også gennemføres med methylenchlorid/iso-propanol (85:15) ved en pH-værdi på 8,5 ifølge Extrelut -25 fremgangsmåden [J.Breiter, Kontakte Merck, 3, 9-14 (1977)], hvorved der er tilstrækkeligt med jernioner fra fyldmaterialet i ekstraktionssøjlen til kompleksdannelse. Rensningen af ekstrakten foretages ved ekstraktion af de lipofile bestanddele med methylenchlorid fra vand og kromatografering 30 på Sephadex LH-20. Det således isolerede jernkompleks ferrithiocin kan uden yderligere rensning krystalliseres fra methanol/acetonitril/toluen.

Ved mild oxidation af dette jernkompleks med kaliumpermanganat i vandig natriumhydroxidopløsning dannes et oxidationsprodukt

DK 160304 B

21 med en molekyliontop m/z = 192. Som følge af massespektret ned høj opløsningsevne tillægges det sumformlen CgHglS^OS.

I ^H-NMR-spektret for oxidationsproduktet optræder i stedet for AB-systemet for den oprindelige methylengruppe en ole-5 finisk singlet ved 6,94 ppm. Samtidig forskydes singletten for den tertiære methylgruppe efter lavere felt til 2,48 ppm.

På grund af disse data er oxidationsproduktet 3-hydroxy-2-(4'-methyl-thiazol^'-yl)-pyridin med formlen 1 1' 6^——. N 2 , S-.5' 5<C ^2 _1.41 4 3X)H 3 * XCH3 @ 10 Ved behandling af jernkomplekset ferrithiocin med OH -ioner i tilstrækkelig koncentration, fortrinsvis i form af alkali-metalhydroxidopløsning, f.eks. med 1 N natriumhydroxidopløsning, frafiltrering af jernhydroxid og syrning til pH-vær-dien 3 fås 2-(3*-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-15 4-carboxylsyre i form af svovlgule,fiItrede nåle. Massespektret viser en molekyliontop med m/z = 238, som ved hjælp af kraftig opløsning tillægges sumf ormlen C^qH^q^O^S . Mikro-analysen passer bedst på en forbindelse med et molekyle vand, som ved kraftig tørring imidlertid atter forsvinder. I IR- 20 absorptionsspektret indicerer de brede absorptionsbånd mel- -1 -1 lem 3600 og 2200 cm samt et carbonylbånd ved 1695 cm til- 13 stedeværelsen af en carboxylgruppe. I C-NMR-spektret tillægges signalet ved 180 ppm carboxyl-carbonatornet. Det tredie oxygenatom tillægges en phenolisk, hydrogenbrobundet 0H-25 gruppe. I IR-spektret findes det dertil hørende bånd ved 3550 cm "', og i ^H-NMR-spektret for den tilsvarende 4-carb-oxylsyre-methylester og det ovenfor anførte oxidationsprodukt 3-hydroxy-2-(41-methyl-thiazol-21-yl)-pyridin en med DO udbyttelig singlet ved 12 ppm. En tertiært bundet methyl-1 1 30 gruppe giver i H-NMR-spektret en singlet ved 1,61 ppm og en methylengruppe et AB-system ved 3,30 og 3,75 ppm med J = 13 22

DK 160304 B

12 Hz. I C-NMR-spektret finder man de tilsvarende signaler som kvartet ved 25,5 ppm og som triplet ved 40,7 ppm. De ifølge bruttoformlen tilbageblevne tre hydrogenatomer er bundet til en aromat (signaler ved 7,45 ppm, 2 H, og 8,18 5 ppm, 1 H, i ^H-NMR, dubletter ved 126,0, 128,1 og 141,1 ppm 13 i C-NMR-spektrum).

Oplysninger vedrørende arten og substitutionsmønsteret for den aromatiske ring i den ved behandling af ferrithiocinet med natriumhydroxidopløsning fremstillede jernfri forbindel-10 se opnås ved ved hjælp af sur hydrolyse. Efter behandling med 6 N saltsyre ved 90°C i 1 time isolerer man ved hjælp af præparativ tyndtlagskromatografi en aromatisk carboxylsyre (CgHj-NO^, M+ 139) , hvoraf man ved forestring med diazo-methan får en forbindelse, der identificeres som 3-hydroxy-15 picolinsyremethylester. Strukturen fremgår af massespektret: M+ = 253, m/z 223 (M+-CH2=0, Mac Lafferty-omlejring), 221 (M+-CH30H) , 95 (M+-CH2=C0;) o.s.v., samt af ^NMR- og IR-spek-trene,der stemmer overens med en autentisk prøve af denne forbindelse.

20 En anden komponent fra den sure hydrolyse, som kan farves på tyndtlagskromatograferingsplader med nitroprussid-natrium [jvf. G. Tonnies og J.J. Kolb, Anal. Chemistry 23_, 823 (1951)], o <s> kan isoleres ved kromatografering pa CM Sephadex C-25 i pyridin/acetatpuffer med pH-værdi 5.

25 Denne forbindelse er kun stabil ved lave temperaturer (-20°c) og under nitrogen. Et stabilt derivat, som ifølge tyndtlags- kromatograferxng og NMR-spektroskopi ikke udelukkende består af ét stof, med formlen CH- I 3 HS-CH -C-COOCH-

NH-CHO

30 fremstilles ved behandling af råproduktet med diazomethan i absolut dimethylformamid under tilsætning af BF^-etherkom-

DK 160304 B

23 pleks og efterfølgende rensning på præparative tyndtlagskro-matograferingsplader. I ^H-NMR-spektret finder et methylester-signal ved 3,78 ppm og ved 1,67 ppm singletten for en tertiær methylgruppe. Ved 1,35 ppm fremkommer en dobbeltdublet svaren-5 de til med en koblingskonstant J på 8 og 10 Hz, som forsvinder ved tilsætning af D20. Dette signal tilskrives en primær SH-gruppe. Koblingspartneren, en vicinal CH^-gruppe, kan konstateres ved to dobbeltdubletter ved 2,96 ppm med J på 10 og 14 Hz samt ved 3,55 med J på 8 og 14 Hz. Denne 10 signalgruppe formindskes ved tilsætning af D20 til to dubletter med J på 14 Hz. En N-formylgruppe konstateres på baggrund af en dublet med J på 2 Hz ved 8,17 ppm samt det brede signal fra en amidproton ved 6,6 ppm. Åbenbart er under de valgte reaktionsbetingelser formylgruppen i opløsningsmidlet DMF 15 overført til nitrogenet i nedbrydningsproduktet. På baggrund af disse signaler tilskrives dette nedbrydningsprodukt den ovenfor anførte struktur (N-formyl-2-methylcysteinmethyl-ester). Massespektret udviser ganske vist ikke nogen mole- kulartop (C-H..NO-S, molekylvægt 177), men de konstaterede o 11 o 20 fragmenter passer godt på strukturen: m/z 132 (M -HN=CH-0H,

Mac Lafferty-omlejring, 100% Int.), 118 (M+- COOCH-J , 100 (M - -NH=CH-0H og CHgOH). Dette nedbrydningsresultat henviser til et thiazolinderivat.

Forbindelser med formlen (I), i hvilke 4-carboxygruppen er 25 forestret (jvf. nedenfor) eller f.eks. fjernet ved mild oxidation med kaliumpermanganat, giver med FeCl^-opløsning stadig en farvereaktion, men danner ikke længere noget iso-lerbart kompleks. Dette viser, at den frie 4-carboxy-gruppe er essentiel til kompleksdannelsen.

30 De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser med formlen (I) kan på i og for sig kendt måde overføres i andre forbindelser med formlen (I).

I forbindelserne med formlen (I), hvori R"*- betyder en fri hydroxylgruppe, kan denne på i og for sig kendt måde for-35 ethres eller forestres. En fri 4-carboxy-gruppe kan forestres.

DK 160304B

24

Egnede midler til forethring af 3'-OH-gruppen og til forestring af carboxylgruppen er eksempelvis tilsvarende diazofor-bindelser, såsom eventuelt substituerede diazolavalkaner, f.eks. diazomethan, diazoethan, diazo-n-butan eller diphenyl-5 diazomethan. Disse reagenser anvendes i nærværelse af et egnet indifferent opløsningsmiddel, såsom et aliphatisk, cyc-loaliphatisk eller aromatisk carbonhydrid, f.eks. hexan, cyc-lohexan, benzen eller toluen, et halogeneret aliphatisk carbonhydrid, f.eks. methylenchlorid, eller en ether, såsom en di-10 lavalkylether, f.eks. diethylether, eller en cyclisk ether, f.eks. tetrahydrofuran eller dioxan, eller en opløsningsmiddelblanding og alt efter diazoreagenset under afkøling ved stuetemperatur eller under svag opvarmning, endvidere, om nødvendigt, i en lukket beholder og/eller under en indiffe-15 rent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Behandler man eksempelvis 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4- methylthiazolin-4-carboxylsyre ved 0°C med diazomethan, får man 4-carboxylsyremethylesteren, hvis IR-spektrum (CHCl,) ved 1735 cm ^ har et bånd fra en aliphatisk ester J1 20 og i H-NMR-spektret en yderligere singlet svarende til · 3 H ved 3,77 ppm. Gennemfører man den samme reaktion fuldstændigt ved stuetemperatur, methyleres også den phenoliske 3'-hydroxygruppe, hvilket fremgår af, at signalet ved 12 ppm forsvinder, og der dannes en singlet ved 3,88 ppm i ^H-NMR-25 spektret.

Andre egnede midler til forethring af 3'-OH-gruppen og til forestring af carboxylgruppen er estere af tilsvarende alkoholer, i første række sådanne med stærke uorganiske eller organiske syrer, såsom mineralsyrer, f.eks. hydrogenhalogenid-30 syrer, såsom hydrogenchloridsyre, hydrogenbromidsyre eller hydrogeniodidsyre, endvidere svovlsyre, eller halogen-svovlsyre, f.eks. fluorsvovlsyre, eller stærke organiske sulfon-syrer, såsom eventuelt, f.eks. med halogen, såsom fluor, substituerede lavalkansulfonsyrer, eller aromatiske sulfon-35 syrer, såsom f.eks. eventuelt med lavalkyl, såsom methyl, halogen, såsom brom, og/eller nitro substituerede benzen-

DK 160304 B

25 sulfonsyrer, f.eks. methansulfonsyre, trifluormethansulfon-syre eller p-toluensulfonsyre. Sådanne estere er blandt andet lavalkylhalogenider, dilavalkylsulfater, såsom dimethyl-sulfat, endvidere fluorsulfonsyreestere, såsom fluorsulfon-5 syrelavalkylestere, f.eks. fluorsulfonsyremethylester, eller eventuelt halogen-substituerede methansulfonsyre-lavalkyl-estere, f.eks. trifluormethansulfonsyremethylester. De anvendes sædvanligvis i nærværelse af et indifferent opløsningsmiddel, såsom et eventuelt halogeneret, såsom chlore-10 ret, aliphatisk, cycloaliphatisk eller aromatisk carbon-hydrid, f.eks. methylenchlorid, en ether, såsom dioxan eller tetrahydrofuran, eller en blanding. Man anvender fortrinsvis egnede kondensationsmidler, såsom alkalimetal-carbonater eller -hydrogencarbonater, f.eks. natrium- el-15 ler kaliumcarbonat eller -hydrogencarbonat (sædvanligvis sammen med et sulfat), eller organiske baser, såsom gængse sterisk hindrede trilavalkylaminer, f.eks. N,N-diisopropyl-N-ethylamin (fortrinsvis aammen med halogensulfonsyre-lav-alkylestere eller eventuelt halogensubstituerede methansul-20 fonsyrelavalkylestere),idet omsætningen gennemføres under afkøling, ved stuetemperatur eller under opvarmning, f.eks. ved en temperatur på fra ca. -20 til ca. 50OC, og,om nødvendigt i en lukket beholder og/eller i en indifferent gas-25 atmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Ved faseovergangskatalyse [jvf. Dehmlow, Angewandte Chemie, bind 5, side 187 (1974)] kan den ovenfor beskrevne for-ethringsreaktion fremmes væsentligt. Som faseovergangskatalysatorer kan anvendes kvaternære phosphoniumsalte, især 30 kvaternære ammoniumsalte, såsom eventuelt substituerede tetraalkylammoniumhalogenider, f.eks. tetrabutylammonium-chlorid, -bromid eller -iodid, eller benzyltriethylammmo-niumchlorid, i katalytiske eller op til ækvimolære mængder.

Som organisk fase kan anvendes et vilkårligt af de med vand 35 ikke blandbare opløsningsmidler, f.eks. et af de eventuelt halogenerede, såsom chlorerede, lavaliphatiske, cycloali-phatiske eller aromatiske carbonhydrider, såsom tri- eller tetrachlorethylen, tetrachlorethan, Carbontetraehlorid,

DK 160304 B

26 chlorbenzen, toluen eller xylen. De som kondensationsmidler egnede alkalimetalcarbonater eller -hydrogencarbonater, f.eks. kalium- eller natriumcarbonat eller .-hydrogencarbonat, alkalimetalphosphater, f.eks. kaliumphosphat, og alkalime-5 talhydroxider, f.eks. natriumhydroxid, kan ved basefølsomme forbindelser i reaktionsblandingen tilsættes titrimetrisk, f.eks. ved hjælp af en tritrerautomat, således at pH-vær-dien under forethringen forbliver mellem ca. 7 og ca. 8,5.

Andre midler til forethring af 31-OH-gruppen eller til for-10 estring af 4-carboxylgruppen er tilsvarende trisubstituere-de oxoniumsalte (såkaldte Meerweinsalte) eller disubstituerede carbenium- eller haloniumsalte, hvor substituenterne er de forethrende grupper, f.eks. trilavalkoxoniumsalte, såsom dilavalkoxycarbenium- eller dilavalkylhaloniumsalte, 15 især de tilsvarende salte med komplekse fluorholdige syrer, såsom de tilsvarende tetrafluorborater, hexafluorphos-phater, hexafluorantimonater eller hexachlorantimonater.

Sådanne reagenser er f.eks. trimethyloxonium eller triethyl-oxonium-hexafluorantimonat, -hexachlorantimonat, -hexafluor-20 phosphat eller -tetrafluorborat, dimethoxycarbeniumhexafluor-phosphat eller dimethylbromoniumhexafluorantimonat. Man anvender disse forethringsmidler fortrinsvis i indifferente opløsningsmidler, såsom en ether eller et halogeneret carb-onhydrid, f.eks. diethylether, tetrahydrofuran eller methyl-25 enchlorid, eller i en blanding deraf, om nødvendigt i nærværelse af en base, såsom en organisk base, f.eks. en fortrinsvis sterisk hindret trilavalkylamin, f.eks. N,N-di-isopropyl-N-ethylamin, samt tinder afkøling, ved stuetemperatur eller under svag opvarmning, f.eks. ved fra ca.

30 -20°C op til 50°C, om nødvendigt i en lukket beholder og/el- ler i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Andre forethringsmidler er endelig tilsvarende 1-substitue-rede 3-aryltriazenforbindelser, hvori substituenten betyder 35 den forethrede gruppe, og aryl fortrinsvis betyder eventuelt substitueret phenyl, f.eks. lavalkylphenyl, såsom 4-methyl-

DK 160304 B

27 phenyl. Sådanne triazenforbindelser er 3-aryl-l-lavalkyl-triazener, f.eks. 3-(4-methylphenyl)-l-methyl-triazen, 3-(4-methylphenyl)-1-ethyl-triazen eller 3-(4-methylphenyl)- 1- isopropyl-triazen. Disse forbindelser anvendes sædvanlig-5 vis i nærværelse af indifferente opløsningsmidler, såsom eventuelt halogenerede carbonhydrider eller ethere, f.eks. benzen, eller opløsningsmiddelblandinger, og under afkøling, ved stuetemperatur og fortrinsvis ved forhøjet temperatur, f.eks. ved fra ca. 20°C op til ca. 100°C, om nødvendigt i 10 en lukket beholder og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære.

Omdannelsen af frit carboxyl i en forbindelse med formlen (I) til forestret carboxyl kan endvidere eksempelvis gennemføres ved, at man omsætter en forbindelse med formlen 15 (I), hvori andre, eventuelt tilstedeværende funktionelle grupper eventuelt foreligger i beskyttet form, eller et reaktionsdygtigt funktionelt carboxyderivat, herunder et salt deraf, med en tilsvarende alkohol eller et reaktionsdygtigt funktionelt derivat deraf.

20 Forestringen af frit carboxyl med den ønskede alkohol gennemføres i nærværelse af et egnet kondensationsmiddel. Almindelige kondensationsmidler er eksempelvis carbodi-imider, eksempelvis N,N'-diethyl-, Ν,Ν'-dipropyl-, N,N'-dicyclohexyl- eller N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-25 carbodiimid, egnede carbonylforbindelser, eksempelvis carbonyldiimidazol eller 1,2-oxazoliumforbindelser, f.eks.

2- ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3'-sulfonat og 2-tert-butyl- 5-methyl-isoxazolium-perchlorat, eller en egnet acylamino-forbindelse, f.eks. 2-ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydro- 30 guinolin. Kondensationsreaktionen gennemføres fortrinsvis i et vandfrit reaktionsmedium, fortrinsvis i nærværelse af et opløsningsmiddel eller fortyndingsmiddel, f.eks. methylenchlorid, dimethylformamid, acetonitril eller tetra-hydrofuran, og, om nødvendigt, under afkøling eller opvarm-35 ning og/eller i en indifferent gasatmosfære.

DK 160304 B

28

Egnede reaktionsdygtige funktionelle derivater af carboxyl-forbindelserne med formlen (X), som skal forestres, er eksempelvis anhydrider, især blandede anhydrider, og aktiverede estere.

5 Blandede anhydrider er eksempelvis sådanne med uorganiske syrer, såsom hydrogenhalogenidsyrer, dvs. de tilsvarende sy-réhalogenider, f.eks. -chlorider eller -bromider, endvidere hydrogenazid, dvs. de tilsvarende syreazider, samt phosphor-holdige syrer, f.eks. phosphorsyre, diethylphosphorsyre el-10 ler phosphorsyrling, eller svovlholdige syrer, f.eks. svovlsyre, eller hydrogencyanid. Blandede anhydrider er endvidere eksempelvis sådanne med organiske carboxylsyrer, såsom med eventuelt, f.eks. med halogen, såsom fluor, eller chlor, substituerede lavalkancarboxylsyrer, f.eks. pivalinsyre el-15 trichloreddikesyre, eller med halvestere, især lavalkylhalv-estere af kulsyre, såsom ethyl- eller isobutylhalvéstere af kulsyre, eller med organiske,især aliphatiske eller aromatiske sulfonsyrer, f.eks. p-toluensulfonsyre.

Egnede aktiverede estere til reaktion med alkoholen er 20 f.eks. estere med vinyloge alkoholer (dvs. enoler), såsom vinyloge lavalkenoler, eller iminomethylesterhalogenider, såsom dimethyliminomethylesterchlorid (fremstillet ud fra carboxylsyren og dimethylchlormethyliden-iminium-chlorid ø ø med formlen [ (CH^)2N=CHC1] Cl ), eller arylesteré, såsom 25 pentachlorphenyl-, 4-nitrophenyl- eller 2,3-dinitrophenyl-ester, heteroaromatiske estere, såsom benztriazol-, f.eks. 1-benztriazolester, eller diacyliminoestere, såsom succin-ylimino- eller phthalyliminoestere.

Acyleringen med et sådant syrederivat, såsom et anhydrid, 30 især med et syrehalogenid, gennemføres fortrinsvis i nærværelse af et syrebindende middel, f.eks. en organisk base, såsom en organisk amin, f.eks. en tertiær amin, såsom trl-lavalkylamin, f.eks. trimethylamin, triethylamin eller ethyldiisopropylamin, eller Ν,Ν-dilavalkyl-anilin, f.eks.

35 Ν,Ν-dimethylanilin, eller en cyclisk tertiær amin, såsom

DK 160304 B

29 en N-lavalkyleret morpholin, såsom N-methylmorpholin, eller en base af pyridintypen, f.eks. pyridin, en uorganisk base, eksempelvis et alkalimetal- eller jordalkalimetalhydroxid, -carbonat eller -hydrogencarbonat, f.eks. natrium-, kalium-5 eller calciumhydroxid, -carbonat eller -hydrogencarbonat, eller en oxiran, eksempelvis et lavere 1,2-alkylenoxid, såsom ethylenoxid eller propylenoxid.

Et reaktionsdygtigt funktionelt derivat af den forestrende alkohol er i første række en tilsvarende ester, fortrinsvis 10 med en stærk uorganisk eller organisk syre, og er især et tilsvarende halogenid, f.eks. chlorid, bromid eller iodid, eller en tilsvarende lavalkyl- eller aryl-, såsom methyl-eller 4-methylphenylsulfonyloxyforbindelse.

En sådan reaktionsdygtig ester af en alkohol kan omsættes 15 med den frie carboxylforbindelse med formlen (I) eller et salt deraf, såsom et alkalimetål- eller ammoniumsalt, idet man ved anvendelse af den frie syre fortrinsvis arbejder i nærværelse af et syrebindende middel.

De ovenfor omtalte forestringsreaktioner gennemføres i et 20 indifferent, sædvanligvis vandfrit opløsningsmiddel eller en opløsningsmiddelblanding, f.eks. i et carboxylsyreamid, såsom et formamid, f.eks. dimethylformamid, et halogeneret carbonhydrid, f.eks. methylenchlorid, carbontetrachlorid eller chlorbenzen, en keton, f.eks. acetone, en ester, 25 f.eks. ethylacetat, eller et nitril, f.eks. acetonitril, eller blandinger deraf, om nødvendigt under afkøling eller opvarmning, f.eks. i et temperaturområde på fra ca. -40 op • til ca. 100°C, fortrinsvis ved fra ca. -10 til ca. 40°C, og/eller i en indifferent gasatmosfære, f.eks. i en nitro-30 genatmosfære.

Endvidere kan syrederivatet om ønsket dannes in situ.

Således fremstiller man f.eks. et blandet anhydrid ved behandling af carboxylsyreforbindelsen med tilsvarende beskyttede funktionelle grupper eller et egnet salt deraf,

DK 160304 B

30 såsom et ammoniumsalt, f.eks. med en organisk amin, såsom piperidin eller 4-methylmorpholin, eller et metalsalt, f.eks. alkalimetalsalt, med et egnet syrederivat, såsom det tilsvarende syrehalogenid af en eventuelt substitueret lavalkan-5 carboxylsyre, f.eks. trichloracetylchlorid, med en halvester af et kulsyre-halvhalogenid, f.eks. chlormyresyrehalvester eller -isobutylester, eller med et halogenid af en dilav-alkylphosphorsyre, f.eks. diethylphosphorbromidat, og anvender det således fremstillede blandede anhydrid uden isole-10 ring.

Til forestring kan man omdanne hydroxygruppen til en acyloxy-gruppe ved behandling af udgangsmaterialet med formlen (I) med et acyleringsmiddel, som indfører den ønskede acylgrup-pe af en organisk carboxylsyre. Hertil anvender man den til-15 svarende carboxylsyre eller et reaktionsdygtigt derivat deraf, især et anhydrid, herunder et blandet eller indre anhydrid af en sådan syre. Blandede anhydrider er eksempelvis sådanne med hydrogenhalogenidsyrer, dvs. de tilsvarende sy-rehalogenider, især-chlorider, endvidere med hydrogencyanid, 20 eller sådanne med egnede kulsyrehalvderivater, såsom tilsvarende -halvestere (såsom de eksempelvis med en halogen-myre-syrelavalkylester, såsem chlornyresyre-ethylester eller isobutylester, dannede blandede anhydrider, eller med eventuelt substituerede, f.eks. halogen, såsom chlor, indeholdende 25 lavalkancarboxylsyrer (såsom de med pivalinsyrechlorid eller trichloreddikesyrechlorid dannede blandede anhydrider). Indre anhydrider er eksempelvis sådanne af organiske carboxylsyrer, dvs. ketener, såsom keten eller diketen, eller sådanne af carbamin- eller thiocarbaminsyrer, dvs. isocyana-30 ter eller isothiocyanater. Andre reaktionsdygtige derivater af organiske carboxylsyrer, der kan anvendes som acylerings-midler, er aktiverede estere, såsom passende substituerede lavalkylestere, f.eks. cyanmethylester, eller passende substituerede phenylestere, f.eks. pentachlorphenyl eller 4-nitrophenyl-35 ester. Forestringen kan om nødvendigt gennemføres i nærværelse af egnede kondensationsmidler, ved anvendelse af frie carboxylsyrer f.eks. i nærværelse af carbodiimidforbindel-

DK 160304 B

31 ser, såsom dicyclohexylcarbodiimid, eller carbonylforbindel-ser, såsom diimidazolylcarbonyl, og ved anvendelse af reaktionsdygtige syrederivater f.eks. i nærværelse af basiske midler, såsom trilavalkylaminer, f.eks. triethylamin, eller 5 heterocycliske baser, f.eks. pyridin. Acyleringsreaktionen kan gennemføres i fraværelse eller i nærværelse af et opløsningsmiddel eller en opløsningsmiddelblanding, under afkøling, ved stuetemperatur eller under opvarmning og, om nødvendigt,! en lukket beholder og/eller i en in-10 different gasatmosfære, f.eks. en nitrogenatmosfære. Egnede opløsningsmidler er eksempelvis eventuelt substituerede, især eventuelt chlorerede, aliphatiske, cycloaliphatiske eller aromatiske carbonhydrider, såsom benzen eller toluen, idet man også kan anvende egnede forestringsreagenser, såsom 15 eddikesyreanhydrid, som fortyndingsmidler.

En med en organisk sulfonsyre, f.eks. en lavalkansulfonsyre, såsom methansulfonsyre, eller en aromatisk sulfonsyre, såsom p-toluensulfonsyre, forestret hydroxygruppe kan man fortrinsvis danne ved behandling af udgangsmaterialet med form-20 len (I) med et reaktionsdygtgit sulfonsyrederivat, såsom et tilsvarende halogenid, f.eks. chlorid, om nødvendigt i nærværelse af et syreneutraliserende basisk middel, f.eks. en uorganisk eller organisk base, f.eks. på samme måde som de tilsvarende estere med organiske carboxylsyrer.

25 I en fremstillet forbindelse med formlen (I), hvori en eller flere funktionelle grupper er beskyttede, kan disse, f.eks. beskyttede carboxyl- og/eller hydroxygrupper, frigøres eventuelt trinvis eller samtidigt på i og for sig kendt måde ved solvolyse, især hydrolyse, alkoholyse eller acidolyse, eller 30 i nogle tilfælde også ved forsigtig reduktion. Silylbeskyt-telsesgrupper fraspaltes fordelagtigt med fluorider, f.eks. tetraethylammoniumfluorid.

Salte af forbindelser med formlen (I) med saltdannende grupper kan fremstilles på i og for sig kendt måde. Således kan 35 man fremstille salte af forbindelser med formlen (I) med

DK 160304 B

32 sure grupper, f.eks. ved behandling med metalforbindelser, såsom alkalimetalsalte af egnede organiske carboxylsyrer, f.eks, natriumsaltet afa-ethyl-capronsyre, eller med uorganiske alkalimetal- eller jordalkalimetalsalte, f.eks. na-5 triumhydrogencarbonat, eller med ammoniak eller en egnet organisk amin, idet man fortrinsvis anvender støkiometriske mængder eller kun et lille overskud af det saltdannende middel. Syreadditionssalte af forbindelser med formlen (I) fremstiller man på sædvanlig måde, f.eks. ved behandling.med en 10 syre eller et egnet anionbytterreagens. Indre salte af forbindelser med formlen (I), som eksempelvis indeholder en fri carboxylgruppe, kan f.eks. dannes ved neutralisering af salte, såsom syreadditionssalte, til det isoelektriske punkt, f.eks. med svage baser, eller ved behandling med flydende 15 ionbyttere.

Salte kan på sædvanlig måde overføres i de frie forbindelser, metal- og ammoniumsalte f;.eks. ved behandling med egnede syrer, og syreadditionssalte eksempelvis ved behandling med et . egnet basisk middel.

20 Komplekserne af forbindelserne med formlen (I), hvori grup-2 pen COOR betyder en fri carboxylgruppe, hvis sure proton eventuelt er fraspaltet, fremstilles eksempelvis ved, at man bringer et salt af det tilsvarende tungmetal, f.eks. et halogenid, såsom chlorid, sammen med en forbindelse med form- 2 25 len. I,, hvori gruppen COOR. betyder en fri carboxyl gruppe, eller med et egnet salt af denne syre, f.eks. et alkalimetalsalt, såsom et natrium- eller kaliumsalt, fordelagtigt i et polært opløsningsmiddel eller en polær opløsningsmiddelblanding, f.eks. i vandig eller alkoholisk, f.eks. methanolisk 30 opløsning, som har en egnet pH-værdi. Reaktionstemperaturen ligger sædvanligvis mellem smeltepunktet og kogepunktet ved normaltryk for det anvendte opløsningsmiddel eller den anvendte opløsningsmiddelblanding, i reglen mellem 15 og 50°C, f.eks. mellem 20 og 40°C, f.eks. ved 37°C.

35 Da kompleksforbindelserne er ustabile såvel under 33

DK 160304 B

stærkt sure betingelser, f.eks. ved pH-værdien 1, som ved stærkt basiske betingelser, f.eks. ved pH-værdien 12, holdes reaktionsopløsningens pH-værdi fordelagtigt mellem 3 og 10, især mellem 5 og 8, f.eks. omkring en fysiologisk 5 pH-værdi, såsom 7,5. De nøjagtige grænser for pH-området, hvor kompleksdannelsen er mulig, afhænger først og fremmest af arten af kompleksdannelsespartneren, f.eks. af arten af metalionen og opløseligheden af dens hydroxid(er). Under de nævnte optimale betingelser forløber kompleksdannelsen 10 meget hurtigt, således at ligevægten mellem komplekset og udgangsstofferne indstilles i løbet af nogle minutter eller timer.

Blandinger af isomere kan adskilles i de enkelte isomere på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fraktioneret kry-15 stallisation, kromatografering o.s.v.

Racemater kan spaltes på i og for sig kendt måde, f.eks. efter overføring af de optiske antipoder i diastereomere, f.eks. ved omsætning med optisk aktive syrer eller baser.

Udgangsforbindelserne er handelsprodukter og/eller er kend-20 te eller kan fremstilles på kendt måde.

De farmaceutisk anvendelige forbindelser med formlen I kan eksempelvis anvendes til fremstilling af farmaceutiske præparater, som indeholder en effektiv mængde virksomt stof sammen med eller i blanding med uorganiske eller organiske, faste el-25 ler flydende, farmaceutisk anvendelige bærestoffer.

Disse farmaceutiske præparater er sådanne til enteral, såsom oral, samt parenteral, såsom subkutan, indgift til varmblodede dyr, og som indeholder den farmakologisk virksomme V.

DK 160304 B

34 forbindelse alene eller sammen med et farmaceutisk anvendeligt bæremateriale. Doseringen af det virksomme stof afhænger af den pågældende varmblodede dyreart, alderen og den individuelle tilstand, den sygdom, som skal behandles, 5 samt af indgiftsmåden.

De farmaceutiske præparater indeholder fra ca. 10 til 95, fortrinsvis fra ca. 20 til 90% virksomt stof. Farmaceutiske præparater kan eksempelvis foreligge i dosisenhedsform, såsom dragéer, tabletter, kapsler, suppositorier eller ampul-10 ler.

De farmaceutiske præparater fremstilles på i og for sig kendt måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle blande-, granulerings-, dragérings-, opløsnings- eller lyofiliserings-fremgangsmåder. Farmaceutiske præparater til oral anvendel-15 se kan fremstilles ved, at man blander den virksomme forbindelse med faste bærestoffer, eventuelt granulerer den fremstillede blanding og forarbejder blandingen eller granulatet, om ønsket eller om nødvendigt efter tilsætning af egnede hjælpestoffer, til tabletter eller dragékerner. Derved kan 20 de også indbygges i kunststofbærematerialer, hvorfra de virksomme stoffer afgives eller diffunderer i kontrolleret mængde.

Egnede bærestoffer er især fyldstoffer, såsom sukkerarter, f.eks. lactose, saccharose, mannitol eller sorbitol, cellu-25 losepræparater og/eller calciumphosphater, f.eks. tricalcium-phosphat eller calciumhydrogenphosphat, endvidere bindemidler, såsom stivelsesklister under anvendelse f.eks. majs-, hvede-, ris- eller kartoffelstivelse, gelatine, traganth, methylcellulose, hydroxypropyl-methylcellulose, natrium-carboxymethylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon, og/el-30 ler, om ønsket, desintegreringsmidler, såsom ovennævnte stivelsesarter, endvidere carboxymethylstivelse, tværbundet polyvinylpyrrolidon, agar, alginsyre eller et salt deraf,

DK 160304 B

35 såsom natriumalginat. Hjælpemidler er i første række strømningsreguleringsmidler eller smøremidler, f.eks. kiselsyre, talkum, stearinsyre eller salte deraf, såsom magnesium- eller calciumstearat, og/eller polyethylenglycol. Dragéker-5 ner forsynes med egnede, eventuelt mavesaftresistente overtræk, idet man blandt andet anvender koncentrerede sukkeropløsninger, der eventuelt indeholder arabisk gummi, talkum, polyvinylpyrrolidon, polyethylenglycol og/eller titandioxid, lakopløsninger i egnede organiske opløsningsmidler eller op-10 løsningsmiddelblandinger eller, til fremstilling af mavesaftresistente overtræk, opløsninger af egnede cellulosepræparater, såsom acetylcellulosephthalat eller hydroxypropyl-methylcellulosephthalat. Tabletterne eller dragéovertrækkene kan tilsættes farvestoffer eller pigmenter, f.eks. til 15 identificering eller til angivelse af forskellige doser af virksomt stof.

Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler, hvor smeltepunkter er bestemt i åbne kapillarrør og ikke er korrigerede, UV-spektre er optaget på et Perkin-Elmer-20 spektrometer 402, angivelser af Xmay er nm (log ε), IR-spektre er optaget på et Perkin-Elmer-spektrometer 157 G, og angivelserne er i cm \ ^HMR-spektrene er optaget på et Varian-spektrometer HA-100 (100 MHz), og de kemiske forskydninger er anført i 5 [ppm] med tetramethylsilan (TMS) som 25 standard. C-NMR-spektrene er optaget på et Varian-spektrometer XL-100 (25,3 MHz), og den kemiske forskydning er angivet i δ [ppm] med TMS som standard (i parentes opspaltning i off-resonans-spektret). MS: intensitet i % af basistoppen.

Ved tyndtlagskromatografering er anvendt kiselgel-60-færdig-30 plader F254 Merck, og lokaliseringen af pletterne er sædvanligvis foretaget ved iagttagelse i UV-lys eller fremkaldelse i ioddamp.

DK 160304 B

36

Eksempel 1.

Stammen Streptomyces antibioticus Tu 1998 dyrkes i en 10-li-5 ter fermenteringsbeholder (New Brunswick, model F 14) i 90 timer ved 27°C, 4 liter luft/minut og 220 orndr./minut, på et flydende substrat med følgende sammensætning! 2% fedtholdigt sojamel og 2% mannitol i vand, idet det flydende substrats pH-værdi inden steriliseringen er indstillet på 10 pH-værdien 7,5 med natriumhydroxidopløsning. Som podemateriale anvendes 5% af en 48 timer gammel forkultur, der er dyrket på samme substrat. Til oparbejdningen sættes ved uforandret pH-værdi 12 g jern-(III)-chlorid-hexahydrat.til væsken, og der filtreres under tilsætning af 1,2% cellit. Filtratet 15 indstilles på pH-værdien 7 med natriumhydroxidopløsning, mættes med kogsalt og ekstraheres med fire gange 2,5 liter ethylacetat. Ekstrakterne inddampes i vakuum til en brun sirup, som opløses i 50 mi vand og ekstraheres fire gange med methylenchlorid til fjernelse af lipofile bestanddele.

20 Den vandige fase inddampes i vakuum til et tørt pulver, som opløses i 10 ml chloroform/methanol (1:1), hvorpå der kro- eg) matograferes på Sephadex LH 20. De fraktioner, som ved tyndtlagskromatografering optræder som ét stof, oparbejdes til jernkomplekset af 2-(3,-hydroxy-pyrid-2'-yl)-methyl-25 2-thiazolin-4-carboxylat (ferrithiocin) som et mørkebrunrødt pulver.

Til analyse omkrystalliseres det amorfe pulver fra methanol/ acetonitril/toluen til små, sammenfiltrede nåle, smp. 160°C (sønderdeling).

30 DC: Rf 0,27 i chloroform/methanol/vand 65:25:4. [<x] =

_ «λ JJ

578 (c = 6,4-10 i H20). UV (c = 1%, H20) 207 (2,82), 227 skulder (2,71), 268 skulder (2,4), 325 (2,48), 405 (2,04), 460 skulder (1,9).

47,4 mg af det fremstillede ferrithiocin opløses i 2 ml

DK 160304 B

37 vand, hvorefter pH-værdien indstilles på 10 med 1 N natriumhydroxidopløsning, og der tilsættes dråbevis en mættet vandig kaliumpermanganatopløsning med en sådan hastighed, at opløsningen hele tiden kun har en svagt violet farve. Så 5 snart udgangsproduktet er fuldstændigt omsat (DC), frafil-treres brunsten og jernhydroxid, og der ekstraheres med to gange 10 ml chloroform. Ved inddampning af ekstrakterne i vakuum fås hvidt råt 3-hydroxy-2-(4'-methyl-thiazol-2'-yl)-pyridin, der krystalliseres af acetone/vand til farve-10 løse nåle.

DC: Rf 0,41 i CHC13, smp. 115°C.

IR (CHC13): 1580, 1525, 1450, 1025.

1H-NMR (CDC13) : 6=2,48 (s, 3H) , 6,94 (s, IH) , 7,1-7,46 (m, 2H) , 8,15 (dd, ^=2Ηζ, J2= 4 Hz, IH), 12,02 (br. s, -OH).

15 MS: Bl.a. 194 (6), 193 (14), 192,0357 (M+, ber. for CgH^QS: 192,0357, 100), 1.64 (22), 72 (33), 57 (26).

Eksempel 2♦

Til 97 mg ferrithiocin sættes 3 ml 1 N natriumhydroxidopløsning, det udskilte jernhydroxid frafiltreres ved hjælp af 20 · celit, og filtratet indstilles på pH-værdien 3 ved 0°C med koncentreret saltsyre. Derved krystalliserer 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre i form af svovlgule nåle, som vaskes med isafkølet vand. En analyseprøve omkrystalliseres fra varmt vand/methanol.

25 DC: Rf 0,17 i CHCl3/methanol/vand 65:25:4, srrp. 90-92°c, [α]β = + 30,1° (c = 1,01 methanol).

UV (H20): 200 (4,18), 235 skulder (3,73), 308 (3,79), 382 (3,33).

1H-NMR (100 MHz, dg-DMS0): 6 = 1,61 (s> 3H), 3,30 (d, J = 30 12Hz, IH), 3,75 (d, J = 12Hz, IH), 7,45 (d, J = 3Hz, 2H), 8,18 (t, J = 3Hz, IH), 12-14 (br., 2H).

13C-NMR (25 MHz, CD30D): 6 = 25,5 (q), 40,7 (t), 87,3 (s), 126,0 (d), 128,1 (d) , 135,3 (s), 141,1 (d) , 156,7 (s), 172,8 (s), 180,0 (s).

35 MS: Bl.a. 240 (M+ + 2,3), 238,0404 (M+ ber. for.

DK 160304 B

38 C10B10N2°3S: 238'0412' 26), 193 (82), 121 (19), 92 (86), 91 (100) , 65 (27) , 39 (26) .

C10H10N2°3S *H2° i256'05) Beregnet C 46,86, ,-H 4,72, N 10,93, S 12,53

Fundet C 46,58, H 4,77, N 10,74, S 12,51.

5 Ud fra 124 mg ferrithiocin fremstilles på den ovenfor beskrevne måde 2-(3’-hydroxy-pyrid-2’-yl)-4-methyl-2-thiazolin- 4-carboxylsyre, som hydrolyseres i en time ved 90°C i 2 ml 6 N saltsyre under en nitrogenatmosfære. Inddampningsrema-nensen indeholder ifølge DC i chloroform/methanol/vand 10 65:25:4 to hovedprodukter med Rf 0,17 (ioddamp og nitroprussid-

Na positiv, karakteristisk for -SH-forbindelser [S. Tonnies og J.J- Kolb, Anal. Chemistry J23, 823 (1951) ] og Rf 0,32 [fluorescensudslukning]. Sidstnævnte kan renfrerastilles ved præparativt DC i samme løbemiddelsystem, og man får 3-hydroxy-15 picolinsyre i form af et farveløst pulver med smp. 219-2230C (sønderdeling). , .

IR (KBr): 3430 br., 1635, 1605, 1455.

1H-NMR (CD30D): 7,9 (br., 2H), 8,18 (br., IH).

13C-NMR (CD30D): 129,0 (d), 130,7 (d), 134,0 (s), 139,0 (d), 20 160,1 (s), 173,0 (s).

MS: Bl.a. 139 (M+, CgH5N03, 9), 121-(7), 95 (100), 93 (15), 67 (19), 44 (54).

Forbindelsen opløses i 2 ml absolut dimethylformamid, hvorpå den methyleres under tilsætning af 2 dråber BF3~etherkompleks 25 med etherisk diazomethanopløsning. Derpå fortyndes med 10 ml vand, hvorpå der ekstraheres to gange med ethylacetat. Ekstrakterne vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum. Remanensen krystalliserer fra ethylacetat/hexan i farveløse nåle med smp. 72-73°C. Forbindelsen viser sig 30 ved direkte sammenligning (blandingssmeltepunkt DC, IR og ^H-NMR) som identisk med en autentisk prøve af 3-hydroxy-picolinsyremethylester. 1 H—NMR (CDC13): 4,02 (s, 3H), 7,3-7,45 (m, 2H), 8,18-8,32 (m, IH), 10,58 (s, IH),

DK 160304 B

39 MS: Bl.a. 153 (M+, C7H?N03, 84), 123 (73), 95 (95), 93 (100).

40 mg (0,168 mmol) 2-(31-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methy1-2-thiazolin-4-carboxylsyre hydrolyseres på den ovenfor beskrevne måde, og inddampningsremanensen kromatograferes 5 i en pufferopløsning med pH-værdi 5 (pyridin/iseddike 65:35 (§) rumfang/rumfang pr. 0,1 M) på CM Sephadex G-25. Fraktionerne, som kan farves med nitroprussid-Na, og som ved tyndtlags-kromatografering optræder som ét stof, inddampes i vakuum og methyleres med etherisk diazomethanopløsning i absolut 10 dimethylformamid under tilsætning af BF^-etherkompleks. Råproduktet udrystes med ethylacetat, ekstrakterne vaskes flere gange med vand, tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum, hvorved man får N-formyl-2-methyl-cystein-methylester i form af en farveløs olie. DC: Rf 0,41 i CHCl^/ 15 ethylacetat 1:1 (med spor af urenheder).

IR (CHC13): 3390, 2850, 1735, 1690.

1H-NMR (CDC13): δ = 1,35 (dd, = 8 Hz, J2 = 10 Hz, SH), 1,67 (s, 3H) , 2,96 (dd, J = 10 Hz, J2 = 14 Hz, IH), 3,55 (dd, Jx = 8 Hz, J2 = 14 Hz, IH), 3,78 (s, 3H), 6,6 (br., IH), 20 8,17 (d, J = 2 Hz, IH).

Ved tilsætning af D20 forsvinder signalerne ved 1,35 og 6,6 ppm, dobbeltdubletterne bliver dubletter med J = 14 Hz, og dubletten ved 8,17 ppm til singlet.

MS: Bl.a. 178 ([M+ + 1] + , CgH-^NO^, 1), 146 (3), 132 (100), 25 118 (21), 102 (29), 100 (62), 73 (22), 42 (54).

Eksempel 3.

Til 70 mg (0,294 mmol) 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre sætter man i løbet af 20 minutter ved 0°C etherisk diazomethanopløsning i methanol/vand.

30 Ved inddampning i vakuum, udrystning med chloroform fra vand og præparativ tyndtlagskromatografering (kiselgel, chloroform/methanol 40:1) fås 2-(3'-hydroxy-pyrid-2’-yl)- 4-methyl-2-thiazolin-carboxylsyremethylester som en bleggul

DK 160304 B

40 olie.

DC: Rf 0,79 i chloroform/methanol 40:1.

UV (ethanol): 210 (4,22), 238 (3,82), 313 (4,01).

IR (CHC13): 1735, 1590, 1450, 980.

5 ‘Sl-NMR (CHC13) : δ = 1,68 (s, 3H) , 3,18 (d, J = 12 Hz, IH) , 3,77 (s, 3H), 3,80 (d, J = 12 Hz, IH), 7,18-7,4 (m, 2H), 8,1-8,25 (m, IH), 12,0 (br.s. OH) MS: Bl.a. 252 (M+, C^H^N^S:, 24), 193 (100), 165 (4), 121 (14), 73 (23) .

10 Eksempel 4.

45 mg (0,189 mmol) 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre behandles ved stuetemperatur i methanol/vand med etherisk diazomethanopløsning til blivende gulfarvning. Efter inddampning i vakuum, udrystning med 15 chloroform fra vand og kr.omatografering på Sephadex LH 20 med chloroform/methanol 1:1 fås 2-(3'-methoxy-pyrid-2'-yl)- 4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyremethylester som en farveløs olie.

DC: Rf 0,83 i chloroform/methanol/vand 65:25:4.

20 IR (CHC13): 1730, 1600, 1580, 1465, 1430, 960.

1H-NMR (CDC13) :’ δ = 1,66 (s, 3H) , 3,17 (d, J = 12 Hz, IH), 3,74 (d, J = 12 Hz, IH), 3,77 (s, 3H), 3,88 (s, 3H), 7,32 (d, J = 3Hz, 2H), 8,23 (t, J = 3Hz, IH).

MS: Bl.a. 266 (M+, C^H^N^S, 10), 219 (12), 207 (100), 25 192, (25), 166 (10), 135 (28), 73 (22).

Eksempel 5.

Stammen Streptomyces antibioticus Tu 1998 (DSM 1865) dyrkes i 6 dage ved 28°C på et agarmedium med følgende sammensætning: 30 Gærekstrakt (Difco) 4 g/1

Maltekstrakt (Difco) 5 g/1

Glucose 4 g/1

Agar (Difco) 20 g/1

DK 160304 B

41

En 500 ml Erlenmeyer-kolbe uden chikaner med 100 ml flydende substrat bestående af 2% fedtholdigt sojamel og 2% mannitol, pH-værdi 7,5, podes med den fremstillede skrårørskultur og inkuberes ved 28°c i 48 timer på et rysteapparat 5 med 250 omclr./minut og udsving på 50 mm.

Det andet forkulturtrin gennemføres i Erlenmeyer-kolber med en kapacitet på 2 liter med 4 chikaner. Til disse kolber sættes 500 ml af det ovenfor beskrevne flydende sojamel-mannitol-substrat og 2,5% (rumfang/rumfang) podemateriale 10 fra den første rystekolbekultur. Dyrkningen gennemføres på et rysteapparat med udsving på 50 mm og 120 omdr./minut ved 28°C. Efter 48 timer har denne forkultur en pH-værdi på 6,7, og den anvendes i en koncentration på 5% (rumfang/rumfang) til podning af en 50 liter fermenteringsbeholder med 15 30 liter frisk flydende sojamel-mannitol-substrat.

Et lille fermenteringsapparat med en kapacitet på 50 liter forsynet med 4 chikaner og en seksbladet omrører med diameter på 115 mn forsynes med 30 liter af det ovenfor beskrevne flydende substrat, hvorpå der steriliseres ved 134°C. Efter 20 tilsætning af 1,5 liter podemateriale fra Erlenmeyer-kolbekul turen foretages fermenteringen i 48 timer under følgende betingelser:

Omrøring: 600 omdrejninger pr. minut.

Overtryk: 0,5 bar.

25 Luftning: 1 liter pr. liter substrat pr. minut.

Temperatur: 28°C.

Efter 48 timer har dyrkningssubstratet en pH-værdi på 6,4 og en centrifugerbar cellemasse på 23% (rumfang/rumfang), og det anvendes til podning af en produktionsfermenterings-30 beholder.

Til produktionsdyrkninger anvendes en fermenteringsbeholder med en kapacitet på 500 liter forsynet med 4 chikaner og en seksbladet turbineomrører med en diameter på 230 mm.

DK 160304 B

42 300 liter af samme substrat, som anvendes ved forkulturerne, steriliseres i fermenteringsbeholderen, og der podes med 15 liter forkultur fra den lille fermenteringsbeholder. Dyrkningen gennemføres under følgende betingelser: 5 Omrøring: 400 omdrejninger pr. minut.

Overtryk, luftning og temperatur som ved dyrkning i den lille fermenteringsbeholder.

Efter 77 timer opnås den maksimale produktion af 2-(3'-hydr-oxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre (salt), 10 hvorefter fermenteringen afbrydes. På dette tidspunkt har dyrkningsopløsningen en pH-værdi på 6,6 og et centrifugerbart mycelierumfang (p.m.v.) på 24% (rumfang/rumfang). Til oparbejdning frafiltreres cellematerialet på en filterpresse under tilsætning af 2% Decalite som filterhjælpemiddel, 15 hvorpå der eftervaskes med lidt vand. Fra to parallelle produktionsdyrkninger fås 630 liter dyrkningsfiltrat.

Til 600 liter betående af det fremkomne dyrkningsfiltrat og en vaskeopløsning sættes 600 g jern(III)chlorid-hexahydrat, og efter indstilling af pH-værdien på 7,0 koncentreres blan-20 dingen på en rotationsfordamper under formindsket tryk til et rumfang på 70 liter. Efter syrning til pH-værdien 2,5 frafiltreres et brunrødt bundfald. Det klare filtrat sættes til en søjle, som indeholder 70 liter makropartikelformig harpiks XAD-2 (Rohm and Haas). Efter adsorption med en gen-25 nemstrømningshastighed på 70 liter pr. time eftervaskes med 140 liter deioniseret vand. Vaskningen og den efterfølgende eluering med 50%‘s vandigt 2-propanol foretages med en gennemstrømningshastighed på 100 liter pr. time. De første 60 liter praktisk taget farveløst eluat kastes bort. 220 liter 30 eluat med rødbrun farve koncentreres under formindsket tryk og lyofiliseres, hvorved der fås 22,5 g remanens.

Den ovenfor fremkomne remanens og det frafiltrerede bundfald (166 g) opløses i tre portioner i 1 M. phosphatpuf-fer med pH-værdi 8,8 (i alt 4 liter). pH-Værdien indstilles 35 på 8,0 ved tilsætning af 2 N natriumhydroxidopløsning. Efter

DK 160304 B

43 mætning med natriumchlorid ekstraheres flere gange med meth-ylenchlorid, indtil den vandige fase har mistet den røde farve. Den organiske fase vaskes med mættet natriumchlorid-opløsning og inddampes til tørhed på en rotationsfordamper.

5 Den fremkomne gennemkrystalliserede remanens (56,6 g) opløses i 350 ml methanol og sættes til en søjle (7 x 160 cm) pak-ket med 1500 g Sephadex LH-20 i methanol. Elueringen foretages med methanol med en gennemstrømningshastighed på 1 li-ter/time. Fra det første eluatrumfang på 3 liter fraskilles 10 27,9 g gult fast stof, og de efterfølgende 0,65 liter indeholder 6,05 g farveløs olie. De efterfølgende 5 fraktioner å 0,25 liter indeholder ferrithiocin, som er forurenet med et olieformigt biprodukt. Rent ferrithiocin elueres i de efterfølgende ti fraktioner på i alt 2,5 liter, og efter ind-15 dampning fås produktet på krystallinsk form. Den yderligere rensning af den med olie forurenede fraktion giver en yderligere mængde ferrithiocin, som ved tyndtlagskromatografe-ring opfører sig som ét stof.

Til den tyndtlagskromatografiske karakterisering anvendes 20 Merck kiselgelplader med en lagtykkelse på 0,25 mm. Løbe-middelsystemer: chloroform/methanol 4:1, chloroform/methanol/ vand 130:50:8. Påvisning af rød egenfarve i UV-lys eller ved farvning med iod.

Til 1 g rent ferrithiocin sættes 30 ml isafkølet 1 N na-25 triumhydroxidopløsning. Det udskilte jernhydroxid frafil-treres efter tilsætning af filterhjælpemiddel (Hyflo) og eftervaskes med lidt vand. Filtratet indstilles ved 0°C ved forsigtig tilsætning af koncentreret saltsyre på en pH-værdi på nøjagtigt 3,0. De udskilte gule krystaller fra-30 filtreres efter 1 time ved 0°C, vaskes med lidt isvand og tørres ved stuetemperatur i højvakuum, hvorved fås 2—(3 * — hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre i form af lysegule, små, saramenfiltrede nåle. De lyofili-serede moderludsfraktioner opløses i varmt vand, hvorpå 35 der tilsættes methanol, hvorved der fås yderligere 50 mg

DK 160304B

44 let rødligt farvet produkt. Krystallerne fra den første fraktion tørres i 24 timer ved stuetemperatur over phosphorpent-oxid: Smp. 115-166°C/ Ea]+32° - 1° (c - 0,715% i methanol).

Eksempel 6.

5 2,283 g (13 mmol) L-cysteinhydrochlorid-monohydrat (FLUKA

puriss.) opløses under skylning med nitrogen i 45 ml afluftet destilleret vand, hvorpå pH-værdien indstilles på 8 med ca. 10 ml 2 N natriumhydroxidopløsning. Derpå tilsættes under omrøring en opløsning af 1,2 g (10 mmol) 3-hydroxy-picolin-10 syrenitril i 70 ml methanol (Merck p.A.). Efter 1 1/2 times reaktionstid ved stuetemperatur mider en nitrogenatmosfære og udelukkelse af lys syrnes med 10 ml 2 N saltsyre. Reaktionsblandingen opbevares i 4 timer i et køleskab. Det udfældede svagt gule bundfald frafiltreres under en nitrogen-15 atmosfære, vaskes med en smule isafkølet 50%'s vandigt methanol og tørres i højvakuum under udelukkelse af lys ved stuetemperatur .

Filtratet koncentreres i vakuum og lyofiliseres. Den fremkomne remanens opløses i mindst muligt50%’s vandigt methanol.

20 Ved henstand natten over i et køleskab dannes et noget stærkere gult farvet bundfald af 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre, som frafiltreres og tørres på den ovenfor beskrevne måde.

Det anvendte 3-hydroxy-picolinsyrenitril fremstilles ud fra 25 furfural ifølge en syntesemetode af Niels Clauson-Kaas og medarbejdere (Acta Chemica Scandinavica 19, 1965 1147-1152).

Eksempel 7.

Den isomere 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)—2-thiazolin-4-carb-oxylsyre fremstilles analogt med den i eksempel 6 beskrevne 30 fremgangsmåde ud fra 0,526 g (4,4 mmol) 3-hydroxy-picolin-syrenitril og 1,0 g (5,7 mmol) D-cysteinhydrochlorid-mono-hydrat (FLUKA puriss.).

DK 160304 B

45

Eksempel 8.

Analogt med den i eksempel 6 beskrevne fremgangsmåde omsættes 2,05 g (13 mmol) D,L-cysteinhydrochlorid (purum, FLUKA) med 1,2 g (10 mmol) 3-hydroxy-picolinsyrenitril, hvorved der 5 i godt udbytte fås den optisk inaktive 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre.

Eksempel 9.

2-(31-Methoxy-pyrid-2'-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre fremstilles ved omsætning af 3-methoxy-picolinsyrenitril med 10 1/3 molækvivalenter D,L-cysteinhydrochlorid analogt med den i eksempel 8 beskrevne fremgangsmåde. 3-Methoxy-picolinsyre-nitril fremstilles ved tilsætning af overskud af en etherisk diazomethanopløsning til en methanolisk opløsning af 3-hydr-oxy-picolinsyrenitril ved stuetemperatur. Efter henstand 15 natten over inddampes reaktionsblandingen i vakuum til tørhed, og remanensen anvendes uden yderligere rensning til den ovenfor beskrevne omsætning.

Eksempel 10.

Analogt med den i eksempel 6 beskrevne fremgangsmåde omsæt-20 tes 1 g (5,83 mmol) a-methyl-D,L-cystein-hydrochlorid med 0,585 g (4,86 mmol) 3-hydroxy-picolinsyrenitril. Reaktionsopløsningen syrnes med 2 N saltsyre, og efter 1 time ved stuetemperatur fjernes methanolet ved reduceret tryk, og opløsningen sættes til en søjle med 200 ml XAD-2-harpiks fra fir-25 maet Rohm and Haas. Der elueres med destilleret vand, derpå med 10%'s vandigt isopropanol og til sidst med 50%'s vandigt isopropanol. Ved koncentrering af eluatet under formindsket tryk og lyofilisering af den vandige remanens fås 2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsy-30 re.

Fremstillingen af α-methyl-cystein er beskrevet i Ph.D. Dissertation af John F.G. Diderich, University of Windsor,

DK 160304 B

46

Canada (1966). Endvidere henvises til R. Thiberk, J.F.G. Diderich og K.G. Rutherford, Can. J. Chem. 43, 206 (1965).

På analog måde får man, idet man går ud fra en af de optiske antipoder af a-methyl-D,L-cystein, hvilken optiske 5 antipode kan fremstilles på i og for sig kendt måde ved racematspaltning, henholdsvis (D)- og (L)-2-(3'-hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre.

Eksempel 11.

0,24 g (1 mmol) 2-(3'-methoxy-pyrid-2'-yl)-2-thiazolin-10 4-carboxylsyre opvarmes med 0,485 g (1,5 mmol) Ν,Ν'-di-cyclohexy1-0-(2-trimethylsilylethyl)-isourinstof og 5 ml absolut dioxan i 14 timer.til 50°C. Efter afkøling i et køleskab frafiltreres udfældet N,N1-dicyclohexylurinstof. Filtratet inddampes til tørhed, og remanensen renses ved 15 kromatografering på kiselgel under anvendelse af chloroform med stigende indhold af methanol. Fraktionerne, som ved tyndtlagskromatografering opfører sig som ét stof, hældes sammen og inddampes til tørhed, hvorved man får 2-(3*-methoxy-pyrid-2’-yl)-thiazolin-4-carboxylsyre-3-(trimeth-20 ylsilyl)-ethylester.

Den anvendte forbindelse N,N*-dicyclohexyl-0-(2-trimethyl-silyl-ethyl)-isourinstof fremstilles på følgende måde:

En blanding af 780 mg (3,79 mmol) Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodi-imid, 0,6 ml (4,17 mmol, 1,1 ækvivalent) 2-trimethylsilyl-25 ethanol og 60 mg kobber(I)chlorid omrøres i 105 minutter ved stuetemperatur, fortyndes med 3 ml petroleumsether og filtreres over en søjle med neutralt aluminiumoxid (under eftervaskning med petroleumsether). Efter fordampning af opløsningsmidlet fås det nævnte isourinstofderivat som en svagt 30 grønlig olie. En lille prøve af dette materiale destille- rer i en kravekolbe ved ca. 125°C/0,09 mm Hg (badtemperatur).

DK 160304 B

47

Eksempel 12.

0,41 g (1,2 mmol) af den rå, amorfe β-trimethylsilylethyl-ester, som er fremstillet under anvendelse af den i eksempel 11 beskrevne fremgangsmåde, opløses i 5 ml absolut tetra-5 hydrofuran under en nitrogenatmosfære, og opløsningen afkøles til -78°C. Under grundig omrøring tilsætter man langsomt 2,9 ml af en frisk fremstillet opløsning af lithium-N-iso-propylcyclohexylamid (1,3 mmol) i absolut tetrahydrofuran fremstillet ud fra n-butyllithium og N-isopropyl-cyclohexyl-10 amin. Efter en reaktionstid på 10 minutter ved -78°C tilsættes 2 ml 30%'s opløsning (vægt/rumfang) af methyliodid i absolut tetrahydrofuran, hvorefter man lader reaktionsopløsningen langsomt opvarme til -25°C. Derpå fortynder man med 50 ml methylenchlorid og 30 ml kold 1 M phosphatpuffer 15 med pH-værdi 5,0. Den isolerede organiske fase vaskes med frisk phosphatpuffer og med vandig natriumchloridopløsning, tørres over natriumsulfat og inddampes under formindsket tryk til tørhed. Efter rensning af det amorfe råprodukt ved kromatografering på en søjle af 100 g syrevasket kiselgel 20 og under anvendelse af methylenchlorid med stigende indhold af isopropanol til elueringen, får man 2-(3'-methoxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre-(β-trimethylsilyl-ethyl)-ester.

Eksempel 13.

25 0,53 g (1,5 mmol) af den ifølge eksempel 12 fremstillede amorfe 2-(3'-methoxy-pyrid-21-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre-(β-trimethylsilyl-ethyl)-ester, der ved tyndt-lagskromatografering opfører sig som ét stof, opløses med 6 ml 0,5 N opløsning af tetraethylammoniumfluorid i abso-30 lut dimethylformamid, og opløsningen opvarmes i 1 time til 30°C. Derpå fortyndes reaktionsblandingen med 30 ml 2 M phosphatpuffer med pH-værdi 4,0, hvorpå den sættes til en søjle med 400 ml XAD-2-harpiks. Søjlen elueres med destilleret vand, derpå med 10%1 s vandigtisopropanol og til sidst 35 med 50%'s vandigtisopropanol. Elueringens forløb kontrolle-

DK 160304B

48 ‘res ved måling af ledningsevnen og UV-absorptionen ved 254 nm i gennemstrømningsceller. Fraktionerne, som indeholder det ønskede produkt, koncentreres under formindsket tryk og lyofiliseres. Remanenserne analyseres ved tyndtlagskroma-5 tografering på kiselgelplader (opløsningsmiddel: chloroform/ methanol/vand 65:25:4). Fraktionerne, der optræder som ét stof, optages i absolut dioxan og hældes sammen. Efter lyo-filisering fås 2-(31-methoxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin- 4-carboxylsyre.

10 Eksempel 14.

Fremstilling af 1000 kapsler indeholdende 260 mg aktiv bestanddel pr. kapsel:

Sammensætning.

2—(3 *-Hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin-15 4-carboxylsyre * 260 g

Talkum 36 g

Hvedestivelse 24 g

Magnesiumstearat 16 g

Lactose . 4 g 20 340 g

Fremstilling:

De pulverformige stoffer sigtes gennem en si med en maskevidde på 0,6 mm og blandes grundigt. Blandingen på 340 g sættes til en kapselpåfyldningsmaskine, hvor den fyldes i 25 gelatinekapsler.

Eksempel 15.

Fremstilling af 1000 kapsler indeholdende 105 mg aktivt stof pr. kapsel:

DK 160304 B

49

Sammensætning.

2-(31-Hydroxy-pyrid-2'-yl)-4-methyl-2-thiazolin- 4-carboxylsyre 105 g

Ethylcellulose 3 g 5 Stearinsyre 3 g 111 g

Fremstilling.

Ethylcellulosen og stearinsyren opløses i 120 ml methylen-chlorid, hvorefter antibiotikumet tilsættes, og massen pres-10 ses gennem en sigte med en maskevidde på 0,6 mm ved en temperatur på ca. 40°c, hvorved methylenchloridet fordamper.

Ved hjælp af en kapselpåfyldningsmaskine fyldes 156 mg af det fremstillede granulat i en gelatinekapsel til 0,5 ml.

4

Claims (10)

1. R betyder fri hydroxy eller lavalkoxy, R betyder hydrogen eller lavalkyl, og R betyder methyl, eller salte af disse forbindelser eller jernion-komplekser af sådanne forbindel- 30 ser med fri 4-carboxy-gruppe.

1. Analogi fremgangsmåde =til fremstilling af 2— (3 * — liydroxypyrid-2'-yl)-2-thiazolin-4-carboxylsyre-derivater med formlen % 6' 1' S 5

2. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man omsætter et picolinsyrederivat med form- 4 5 len (XI), hvori R betyder cyano, med et propionsyrederi-vat med formlen (III), hvori mercaptogruppen og aminogrup-pen foreligger i fri form.

3. Fremgangsmåde ifølge krav lb), kendetegnet ved, at man som base anvender et sterisk hindret, 10 v.ed nitrogenatomet substitueret alkalimetalamid.

4. Fremgangsmåde ifølge krav ld), kendetegnet ved, at man gennemfører dyrkningen ved en temperatur mellem 18 og 40°C i 3-7 dage.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendeteg-15 net ved, at man vælger udgangsforbindelserne således, at man får forbindelser med formlen (I) ifølge krav 1, hvori R1 betyder fri hydroxy, lavalkoxy, lavalkanoyloxy eller usubstitueret eller med halogen, lavalkyl eller lav- 2 alkoxy substitueret phenyloxy eller benzyloxy, og hvor R 20 betyder hydrogen, lavalkyl eller en phenyl- eller phenyl- 3 lavalkylgruppe, og R betyder hydrogen eller lavalkyl, eller salte af disse forbindelser eller tungmetalionkomplek-ser af sådanne forbindelser med fri 4-carboxygruppe.

5. TI/coor2 (i) N-<3' 4’ X 1 - NR 3 ^ R i raeemisk eller optisk aktiv form, hvori R^ betyder fri, 2 forethret eller forestret hydroxy, R betyder hydrogen eller en aliphatisk, carbocyclisk eller carbocyclisk-alipha- 3 tisk gruppe med 1-12 carbonatomer, og R betyder hydrogen 10 eller en usubstitueret aliphatisk gruppe med 1-7 carbonato- mer, eller salte af disse 'forbindelser eller metalionkomplek- 2 ser af sådanne forbindelser, hvori gruppen COOR betyder en fri carboxygruppe, hvis sure proton eventuelt er fraspaltet, kendetegnet ved, at man 15 a) omsætter et picolinsyrederivat med formlen <I^f (II) hvori R betyder fri, forethret eller forestret hydroxy, idet hydroxy- eller andre funktionelle grupper eventuelt 4 foreligger i beskyttet form, og R betyder en cyano- eller carboxygruppe eller et reaktivt funktionelt derivat deraf, 3 med et 2-amino-3-mercapto-2-R -propionsyrederivat med formlen HS- Η N--COOR2 (III) H3 DK 160304 B hvori substituenterne har den ovenfor angivne betydning, idet en eller flere af de i forbindelsen tilstedeværende funktionelle grupper eventuelt foreligger i beskyttet form, eller med et reaktivt funktionelt derivat deraf og, om ønsket, fra-5 spalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, eller, 3 b) til fremstilling af en forbindelse med formlen I, hvori R 3 betyder lavalkyl, i en forbindelse med formlen (I), hvori R 1 2 betyder hydrogen, og hvori R og R har den i forbindelse med 10 formlen (I) angivne betydning, idet dog deri tilstedeværende funktionelle grupper, om ønsket, foreligger i beskyttet form, fjerner en proton i 4-stillingen med en base og omsætter det fremstillede mellemprodukt med et alkyleringsmiddel, der over- 3 fører gruppen R , og hvori alkylcarbonatomet, som indgår den 15 nye binding, bærer en positiv delladning, og, om ønsket, fraspalter eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrupper, eller c) til fremstilling af en forbindelse med formlen I, hvori R·*" 2 betyder fri hydroxy, og/eller· R betyder hydrogen, i en forbindelse med formlen (I), hvori R^ betyder en beskyttet hydroxy-20 gruppe, og/eller COOR betyder en beskyttet carboxygruppe, fraspalter mindst én beskyttelsesgruppe, eller 3 d) til fremstilling af en forbindelse med formlen I, hvori R betyder methyl, dyrker stammen Streptomyces antibioticus Waksman et Henrici Tu 1998 (DSM 1865) eller en 2-(31-hydroxy-pyrid-2'-yl)- 25 4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyredannende mutant af denne stamme aerobt i et vandigt medium indeholdende en carbon-og nitrogenkilde samt uorganiske salte og fra mediet isolerer 2-(3'-hydroxy-pyrid-2 r-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre eller et stabilt tungmetalkompleks af denne syre 30 og, om ønsket, fra tungmetalkomplekset frigør 2-(3'-hydroxy-pyrid-2 ' -yl) -4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre eller et salt deraf og, om ønsket,forestrer eller forethrer en 3'-hydroxygruppe eller overfører en forestret eller forethret 3'-hydroxy-gruppe i en fri gruppe og/eller forestrer en 4-35 carboxy-gruppe med et forestringsmiddel indeholdende grup-pen R eller forsæber en forestret 4-carboxy-gruppe og/eller overfører forbindelserne med formlen (I) i deres syreadditionssalte eller forbindelserne med formlen (I) med fri 4-carboxy-gruppe i deres metalsalte eller i tungmetalkomplekser eller adskiller racemiske blandinger i de optisk DK 1603Q4B aktive former eller overfører en fremstillet optisk aktiv forbindelse i antipoderne.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendeteg-25 net ved, at man vælger udgangsforbindelserne således, at man får forbindelser med formlen (I) ifølge krav 1, hvori

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man fremstiller forbindelser med formlen DK 160304 B (I) ifølge krav 1, hvori R^" betyder hydroxy eller methoxy, 2 3 R betyder hydrogen eller methyl, og R betyder hydrogen eller methyl, eller deres salte.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendeteg- 5 net ved, at man vælger udgangsforbindelserne således, at man får forbindelser med formlen (I) ifølge krav 1 el- 2 ler 5-7, hvori R betyder hydrogen, eller salte deraf.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4,kendeteg-10 net ved, at man vælger udgangsforbindelserne således, at man får en forbindelse med formlen (I) ifølge krav 1, 3 5 eller 7-8, hvori R betyder methyl, eller et salt deraf.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man vælger udgangsforbindelserne således, 15 at man får en forbindelse med formlen (I) ifølge krav 1, nemlig 2-(3'-hydroxy-pyrid-21-yl)-4-methyl-2-thiazolin-4-carboxylsyre.