DK169951B1 - Partikelformet immobiliseret lipasepræparat, fremgangsmåde til fremstilling deraf og anvendelse deraf - Google Patents

Description

DK 169951 B1

Opfindelsen angår et partikelformet immobiliseret mikrobielt lipasepræparat, en fremgangsmåde til fremstilling heraf, samt anvendelse heraf.

Man har udført omfattende forskningsarbejder for at tilvejebringe immobiliserede lipasepræparater, i betragtning af de voksende anvendelses-5 muligheder for immobiliserede lipaser til omestring. Nogle af de første industrielt anvendelige immobiliserede lipasepræparater til omestring er beskrevet i US patent nr. 4,275,081, spalte 7, linierne 28-35, hvoraf det fremgår, at de immobiliserde lipasepræparater fremstilles ved acetonefældning af en vandig lipaseopløsning på Ceiite® diatoméjord.

10 Halveringstiden af disse immobiliserede lipasepræparater er imidlertid relativt lille. Desuden er den opnåelige specifikke I i paseakt i vitet relativt lille. Hertil kommer, at der foreligger et støvproblem under opbevaring og indfyldning i søjlerne, og at solventer er nødvendige under anvendelse af disse kendte immobiliserde lipasepræparater.

15 Forskningsarbejderne har således mere eller mindre været fokuseret på immobilisering af lipase på bærere med hydrofobe bindingspositioner. Der kan henvises til Biotechnology and Bioengineering, bind XXIV, side 1007-1013 (1982), hvoraf det fremgår, at det sædvanligvis antages, at en bærer med hydrofobe bindingspositioner mere eller mindre var en nødvendig betingelse ved fremstillingen 20 af immobiliserede lipasepræparater med høj halveringstid og høj aktivitet til industriel anvendelse. Der kan også henvises til dansk fremlæggelsesskrift nr. 152763, som beskriver et immobiliseret lipasepræparat med en bærer bestående af en partikelfor-met makroporøs svag anionbytter af harpiks, f.eks. en harpiks hørende til Duolite® serien. Bærerharpikser af denne art har hydrofobe bindingspositioner, og præpara-25 terne udviser en høj halveringstid og er velegnede til industriel omestring.

Selv disse anionbytterharpikser har ulemper. For det første er de meget dyre, og dette har stor indflydelse på prisen for de immobiliserede lipasepræparater. Under anvendelse i organiske medier har det for det andet vist sig, at ekstraherbare bestanddele fra anionbytterharpikserne overføres til det organiske medium, og selv 30 om mængden af de ekstraherbare bestanddele er lille, repræsenterer dette ofte en alvorlig ulempe, især hvis det er tilstræbt, at slutproduktet ved den enzymatiske DK 169951 B1 2 proces skal være til human konsumption. Det er muligt at vaske harpikserne med organiske solventer før immobiliseringen, men dette er et dyrt trin.

Der foreligger således et behov for et billigt, immobiliseret lipasepræparat med høj halveringstid og mulighed for opnåelse af høj specifik aktivitet, i forbindelse 5 med hvilket muligheden for overføring af ekstraherbare bestanddele fra bæreren til en organisk fase kan udelukkes.

Det har nu ifølge opfindelsen vist sig, at det før angivne formål kan blive opfyldt, hvis man - imod den fordom, der er skabt i forbindelse med den før angivne bærer af diatoméjord - anvender en bærer, der er udvalgt fra en omhyggeligt 10 defineret klasse af uorganiske bærere.

Det partikelformede immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen, der er af den i indledningen til krav 1 angivne art, er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.

Af en artikel i Advances in Colloid and Interface Science, 25 (1986) 235-15 248, "Macroporous Silica in Chromatography and Immobilization of Biopolymers'1 fremgår det, at den maksimale kapacitet for immobilisering af enzymer forefindes i forbindelse med silica-materialer, som har gennemsnitlige porestørrelser på 5-10 gange størrelsen af proteinmolekylerne. Det har overraskende vist sig, at den maksimale kapacitet for immobilisering af lipaser forekommer med silica-materialer 20 eller silicater med porestørrelser på mellem 10 og 45 gange størrelsen af lipase-molekylerne. Denne artikel fokuserer ikke på lipase overhovedet, men angår enzymer i almindelighed, endog proteiner i almindelig. Opfindelsen er udelukkende rettet på partikelformede immobiliserede lipaser, og lipaser er helt enestående enzymer i den forstand, at den enzymatiske aktivitet fungerer på en mellemflade mellem to faser, 25 hvilket betyder, at immobiliseringen af lipaserne er et meget følsomt problem, hvilket i høj grad begrænser anvendeligheden af kendte immobiliseringsteknikker på det , område, der omfatter lipaseimmobilisering, jfr. J. Lavayre et al, Preparation and Properties of Immobilized Lipases, Biotechnology and Bioengineering, bind XXIV, * side 1007-1013 (1982) John Wiley & Sons.

30 Betegnelsen "makroporøs" betyder, at diameteren af porerne er mindst 250 Å. Porediameteren måles ved hjælp af B.ET.-metoden.

DK 169951 B1 3 Bærermaterialet, der anvendes til den immobiliserede lipase ifølge opfindelsen, består af mindst 65 vægt-% silica og/eller silicater, fortrinsvis mindst 90 vægt-% silica og/eller silicater. Endvidere skal der ved "silica eller silicater" i denne beskrivelse med krav forstås en genuint silica eller genuine silicater, d.v.s silica eller 5 silicater, der ikke af deriverede.

Diameteren af lipasemolekylerne kan måles ved hjælp af røntgenstrålediffraktionsanalyse og andre metoder, som angivet i "Biochemistry" af Albert L. Lehninger, 1970, Worth Publishers Inc., side 142-143.

Diameteren af lipasemolekylet er sædvanligvis omkring 50 Å. De 10 partikelformede silicageler, som beskrives i Grace informationsbladet SG BC1 E/juni 1978 (fra Grace, Grace Plaza, 1114 Avenue of the Americas, New York, N.Y. 10036-7794), er således velegnede til opfyldelse af opfindelsens formål, fordi de alle har porediameter over 500 Å. Selv om det af informationsbladet fremgår, at silicagelerne kan anvendes til immobilisering af celler og enzymer, er der overhovedet Ikke nogen 15 indikation i informationsbladet for, at silicagelerne kan anvendes til immobilisering af lipaser, og lipaser er exceptionelle enzymer, der i sammenligning med andre enzymer udviser enestående egenskaber hvad angår immobilisering, jfr. den forklaring, som er fremsat i det foregående.

Det har vist sig, at det uorganiske pulver, der anvendes i det før citerede 20 US patent nr. 4.275.081 (spalte 12, linie 48), ikke kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (jfr. partikelstørrelsesbegrænsningen i krav 1), og at acetonebundfældning med alle de ledsagende ulemper synes at være den eneste vej til at fiksere lipasen på det Celite® pulver, der anvendes i US patent nr. 4.275.081.

Af den tidligere citerede artikel i Biotechnology and Bioengineering, bind 25 XXIV, side 1007-1013 (1982) fremgår det, at lipaser kan immobiliseres på en bærer af deriveret Spherosil®, hvilket er en hydrofob, porøs bærer med en porediameter på 1250 - 3000 Å. Sphaerosil® er imidlertid meget dyr. Et af de vigtigste aspekter i forbindelse med den partikelformede immobiliserede lipase ifølge opfindelsen er muligheden for fremstilling af et billigt, partikelformet immobiliseret lipase- præparat, 30 i forbindelse med hvilket derivering af bæreren er unødvendig.

DK 169951 B1 4 I europæisk patent nr. 147,914 beskrives et immobiliseret lipasepræparat, c 1 hvilket lipase er immobiliseret på en glasbærer med en partikelstørrelse på 30-45 mesh og en gennemsnitlig porestørrelse på 400 Å. Det fremgår dog også af europæisk patent nr. 147,914, at det er nødvendigt at anvende et koblingsmiddel af * 5 organotitanattypen til fremstilling af det immobiliserede lipasepræparat.

I Applied Microbiol. Biotechnol. 28, s. 527-30 beskrives et lipasepræparat, der er immobiliseret på en glasbærer PG 700-80 med en partikelstørrelse på 20-80 mesh og en porediameter på 700 Å. Dog fremgår det af side 528, at vandet blev fjernet totalt, og dette gør, at det kendte immobiliserede lipasepræparat ligger 10 udenfor omfanget af denne opfindelse, fordi den immobiliserede lipase ifølge opfindelsen indeholder 1 -20% vand. Denne forskel gør, at ydeevnen af det kendt produkt er ringere end ydeevnen af den immobiliserede lipase ifølge opfindelsen.

Af en artikel i Enzyme Microbial Technology, 1984, bind 6, oktober, 443-446, fremgår det, at man kan anvende forskellige kvaliteter af diatoméjord som 15 bærere for den immobiliserede lipase, der er tiltænkt som middel til enzymatisk omestring af fedtstoffer. Disse bærere har imidlertid porestørrelser, som er langt større end porestørrelserne af bærermaterialet i det partikelformede, immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen. Dette betyder, at aktiviteten for hver indført LU er betydelig lavere end ved opfindelsen på grund af det betydeligt mindre specifikke 20 overfladeareal af det kendte immobiliserede lipasepræparat. Ved det kendte immobiliserede lipasepræparat foreligger der således et multilag af lipase på bæreren, hvorimod der ved det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen forligger et monolag af lipase på bæreren.

En foretrukken udførelsesform for det immobiliserede lipasepræparat 25 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af det i krav 2 angivne. Hvis partikelstørrelsen er under 200 øm, vil tryktabet i en søjle have tendens til at blive for stort, og hvis partikelstørrelsen er over 800 øm, vil diffusionsin-hiberingen have tendens til at blive for stor. *

En foretrukken udførelsesform for det immobiliserede lipasepræparat 30 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 3 DK 169951 B1 5 angivne. I dette interval for porestørrelser er den udtrykte lipaseaktivitet, målt i BlU/g, særligt høj.

En foretrukken udførelsesform for det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 5 angivne. På denne måde kan den immobiliserede lipase anvendes i søjler, som arbejder ved høj temperatur, hvorved man mindst kan opnå to fordele. For det første er det muligt at anvende den immobiliserede lipase, f.eks. til omestring, uden et solvent, på grund af den relativt lave viskositet af reaktionsblandingen, for det andet vil reaktionshastigheden være relativ høj, og for det tredje vil diffusionshastigheden 10 af substrat og produkter inden i porerne blive større.

En foretrukken udførelsesform for det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 5 angivne. Disse lipaser har været undersøgt, og de dermed opnåede resultater ved høj temperatur i en søjle har alle været gode.

15 Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til fremstilling af et partikelformet, immobiliseret lipasepræparat ifølge opfindelsen, og denne er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 6 angivne. Det har vist sig, at en vask af den partikelformede immobiliserede lipase mellem separationen deraf fra den vandige fase og tørringen deraf er fordelagtig.

20 Det tidsrum, som er tilstrækkeligt til at binde den ønskede mængde lipase til bærermaterialet, varierer fra lipase til lipase, og det kan ligge mellem nogle få minutter og nogle få dage.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 7 angivne. Hvis ladningen 25 er under 10.000 LU/g bærermateriale, har hastigheden af den flydende reaktionsblanding, som strømmer igennem søjlen, tendens til at blive for lille, og det er meget vanskeligt at opnå en ladning over 500.000 LU/g bærermateriale.

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 8 angivne. Derved er den 30 udtrykte lipaseaktivitet, målt i BlU/g immobiliseret lipase, så stor som muligDer kan henvises til figur 1, som vil blive forklaret mere detaljeret i det følgende.

DK 169951 B1 6

En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 9 angivne. Dette er den simpleste og billigste måde til udførelse af separationen.

Opfindelsen omfatter også en anvendelse af det immobiliserede 4 5 lipasepræparat ifølge opfindelsen, og denne anvendelse er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 10 angivne. I forbindelse med denne anvendelse er det ikke nødvendigt at anvende noget solvent, men man kan om ønsket anvende et solvent. Anvendelsen kan gennemføres kontinuerligt, f.eks. i søjler, eller diskontinuerligt.

10 Den immobiliserede lipase ifølge opfindelsen kan også anvendes til hydrolyse affedtstoffer ved, at en emulsion af triglycerider og vand bringes i kontakt med det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen. Det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen kan også anvendes til syntese af triglycerider eller andre fedtsyreestere ved, at en blanding af glycerol eller substitueret glycerol eller 15 andre typer af alkoholer og frie fedtsyrer bringes i kontakt med det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen. I forbindelse med disse anvendelser er det ikke nødvendigt at anvende noget solvent, men man kan om ønsket anvende et solvent. Anvendelserne kan gennemføres kontinuerligt, f.eks. i søjler, eller diskontinuerligt.

Lipaseaktivitetsenheden (LU) bestemmes som beskrevet i publikationen 20 AF 95.1/2-GB af 83-01 -03, som kan rekvireres fra Novo Nordisk A/S, Novo Allé, 2880 Bagsværd, Danmark.

Lipaseaktiviteten udtrykti BIU (Batch Interesterification Units) bestemmes som beskrevet i publikationen AF 206-2, som kan rekvireres fra Novo Nordisk A/S,

Novo Allé, 2880 Bagsværd, Danmark.

25 Fig. 1 illustrerer afhængighedsforholdet mellem udtrykt lipaseaktivitet (BlU/g) og pH under ladning af en lipase fra Humicola lanuginosa (se nedenfor) på . bærermaterialer med forskellige porestørrelser.

Fig. 2 viser logaritmen til strømningshastigheden versus tid for en lipase fra Humicola lanuginosa (se nedenfor) på bærermaterialer med forskellige 30 porestørrelser.

DK 169951 B1 7

De på fig. 1 viste data fremkom på følgende måde. Silica-bæreren, som er et bærerprodukt fra Grace beskrevet i Biocatalyst Supports SG BC 1E/juni 1987 vaskes med stødpude ved det pH, der skal anvendes under det følgende lipaseadsorptionstrin, d.v.s. ved pH 4, 4,5, 5, 6 og 7, jfr. fig. 1, i en halv time, 5 hvorefter der filtreres. Den ønskede lipasemængde, som er den lipaseaktivitet, der er tilstrækkelig til frembringelse af en ladning af 186.000 LU/g, opløses i 5 ml afioniseret vand og tilsættes til 1 g bærer. Lipasen fremstilles som angivet i eksempel 1 i DK patentansøgning nr. 4117/86, dvs. ved hjælp af Humicola lanuginosa. pH-værdien indstilles, og bæreren og lipaseopløsningen omrøres langsomt ved rotation 10 i 2 timer, efterfulgt af vacuumfiltrering. Filtratet analyseres for hydrolytisk aktivitet (LU/ml) for at bestemme mængden af adsorberet (ladet) lipase. Den immobiliserede lipase lufttørres, fugtighedsindholdet indstilles til 10 vægtprocent, og prøven analyseres for diskontinuerlig omestringsaktivitet (BIU/g). Det fremgår tydeligt af figuren, at silicabæreren med porestørrelse 1500 A (d.v.s. 25 gange diameteren af 15 lipasemolekylet, altså inden for det i hovedkravet angivne interval for porestørrelser) udviser en udmærket udtrykt lipaseaktivitet ved det optimale pH.

På fig. 2 blev de tre af de fire immobiliserede lipasepræparater fra fig. 1, som ligger indenfor opfindelsens omfant undersøgt i en søjle på følgende måde.

Man monterede et system bestående af en forsøjle indeholdende 20 ionbytterharpiks mættet med vand og en enzymsøjle (indeholdende 4,5 g immobiliseret lipase-præparat) i serie. Funktionen af forsøjlen var mætning af substratet med vand. En olieblanding bestående af 28,6% (w/w) laurinsyre og 71,4% (w/w) sojabønneolie blev pumpet gennem søjlerne. Temperaturen i søjlerne blev holdt ved 60°C. Strømningshastigheden blev indstillet for at holde en konstant 25 konvertering af 14% inkorporeret laurinsyre i sojabønneolien. Der blev udtaget prøver 3-5 gange per uge, og de analyseredes ved at fjerne de frie fedtsyrer og partielle glycerider ved hjælp af søjlechromatografi og ved at methylere triglyceriderne, efterfulgt af kapillær gaschromatografi af methylesterne. Strømningshastigheden, som er proportional med aktiviteten, blev derpå afbildet mod tiden når kon-30 verteringen var 14% ± 1% inkorporeret laurinsyre.

DK 169951 B1 8 På basis af figuren kan man bedømme følgende halveringstider og initiale aktiviteter: %

Type af bærer Initial strømningshastighed halverings- (aktivitet) (g TG*/g lipase- tid, 5 præparat) timer GRACE 4 3,6 700 GRACE 5 8,0 750 GRACE 6 12,0 850 10 _ * TG er en forkortelse for triglycerid.

Også i dette tilfælde fungerer siiicabæreren med porestørrelse 1500 Å udmærket hvad angår den initiale strømningshastighed.

For at vise betydningen af varierende vandindhold i det immobili-15 serede lipasepræparat udførte man følgende forsøg. Immobiliserede lipasepræparater blev fremstillet med Grace 6 som bæreren. Lipasen var Humicola lanuginosa lipasen. Med undtagelse af tørringen blev de immobiliserede præparater fremstillet som vist i forbindelse med fig. 1, ved pH 4,5.

20 Nedenstående aktiviteter blev fundet.

Aktivitet % vand j————— _ BlU/g_ % af maksimum 0 15 29 _1^05__24__47_ 1 35 69 * 2 48 94

Ifølge 5 48 94 opfindelsen 10 51 100 12 50 98 15 49 96 __20 46 90 DK 169951 B1 9

De følgende eksempler illustrerer yderligere det immobiliserede lipasepræparat ifølge opfindelsen. Eksempel 1, 2 og 7 er produktionseksempler; eksempel 3,4,5 og 6 er anvendelseseksempler og eksempel 8 er 5 et sammenligningseksempel.

EKSEMPEL 1 2 g bærer (Grace, porediameter 700 Å, partikelstørrelse 0,5-1 mm) vaskes i 0,2M acetatstødpude ved pH 4,5 i en halv time og vakuumfiltreres.

400.000 LU (0,17 g Rhizomucor miehei lipase fremstillet som angivet i 10 europæisk patentskrift nr. 238,023 og med en aktivitet af 2,4 x 10® LU/g) opløses i 8 g afioniseret vand og tilsættes til bæreren. pH-værdien indstilles på 4,5, og opslemmingen af bærer og enzymopløsning omrøres langsomt ved rotation i to timer ved stuetemperatur, efterfulgt af vakuumfiltrering.

Filtratet indeholder 2,7 x 105 LU svarende til en adsorption på 32%. Det 15 immobiliserede lipasepræparat tørres i en vakuumovn ved 25°C natten over, og fugtighedsindholdet indstilles på 10%. Prøven blev analyseret til 26 BlU/g.

EKSEMPEL 2 1 g bærer (Grace 4, porediameter 500 Å, partikelstørrelse 0,5-1 mm) vaskes i 0,2 M acetatstødpude med pH 4,5 i en halv time og 20 vakuumfiltreres. 50.000 LU (0,35 g lipase med en aktivitet af 1,4 x 105 LU/g) af Candida antarctica lipase, der var fremstillet som angivet i europæisk patentansøgning nr. 0287634, blev opløst i 5 ml afioniseret vand og tilsat til bæreren. pH-værdien blev indstillet på 4,5, og opslemmningen af bærer og lipaseopløsning blev omrørt langsomt ved rotation i 12 timer ved stue-25 temperatur, efterfulgt af vakuumfiltrering. Filtratet indeholder 19.000 LU svarende til en adsorption på 62%. Den immobiliserede lipase blev lufttørret, og fugtighedsindholdet indstillet på 10%. Prøven blev analyseret til 24 BlU/g (60°C analyse uden solvent).

DK 169951 B1 10 EKSEMPEL 3 a

A

Hvdrolvse med immobiliseret lipase 2,5 g immobiliseret lipase fremstillet som angivet i eksempel 1 i dansk patentansøgning nr. 4117/86 (dvs. ved hjælp af Humicola lanuginosa) 5 blev ved pH 4,5 tilsat til en kolbe indeholdende sojaolie og vand og rystet ved 50°C. Prøver blev udtaget, og indholdet af frie fedtsyrer (hydrolysegrad) blev målt ved titrering med KOH. Forsøgene blev udført ved 25%, 50% og 75% sojaolieindhold. Den totale mængde olie og vand var hele tiden 50 g.

Resultaterne fremgår af fig. 3. Det ses, at den højeste hydrolysegrad blev 10 opnået med det største vandindhold.

EKSEMPEL 4

Estersvntese med immobiliseret lipase 0,05 mol (10 g) laurinsyre og 0,05 mol alkohol blev blandet med 5% (w/w) immobiliseret lipase, fremstillet som beskrevet i eksempel 3. Reaktio-15 nen blev udført ved 60°C ved at omrøre kolben indholdende substratet og enzym. Fire forskellige alkoholer blev anvendt: laurylalkohol, pentanol, isopropanol og propanol. Resultaterne fremgår af fig. 4. Forsøget med laurylalkohol blev udført under et reduceret tryk (ca. 50 mbar). Det fremgår af figuren, at den største konvertering opnås med laurylalkohol, og at 20 enzymet ikke kan esterificere sekundære alkoholer.

EKSEMPEL 5

Kontinuerlig drift i fast leie med immobiliseret lipase

Man pakker to søjler, hver indeholdende 60 g immobiliseret lipase, , fremstillet som beskrevet i eksempel 3. Søjlerne blev opstillet i serie, og 25 temperaturen i søjlerne var 60°C. Et tilsvarende søjlesystem blev opstillet parallelt, indeholdende 2 gange 60 g Lipozyme® (en kommercielt tilgængelig DK 169951 B1 11 immobiliseret lipase fra Novo Nordisk A/S) i stedet. Ren sojabønneolie blev pumpet gennem systemerne og recirkuleret. Højden i lejet i de to systemer blev målt ved tiden nul. Man anvendte en fixeret gennemstrømshastighed i 3 dage, hvorefter trykfaldet over søjlerne lejehøjden af søjlerne blev målt.

5 Derefter anvendte man en ny gennemstrømshastighed, og de nye værdier blev målt efter 3 dage osv. Resultaterne fremgår af fig. 5. Det fremgår af resultaterne, at lipasen på en silicabærer er et bedre enzympræparat end det kommercielt tilgængelige Lipozyme®, da trykfaldet er lavere ved samme gennemstrømshastighed. Det blev også iagttaget, at lejet indeholdende 10 silicabæreren ikke blev komprimeret, selv efter mere end 300 timers drift, hvorimod søjlerne indeholdende Lipozyme® blev komprimeret i et omfang af ialt 13 mm.

EKSEMPEL 6 5 g bærer (Grace 6, porediameter 1500 Å, partikelstørrelse 0,5-1 15 mm) blev blandet med en opløsning indeholdende 250.000 LU af B-komponenten fra Candida antarctica, som beskrevet i international patentansøgning nr. 88/02775, side 9. pH-værdien blev indstillet til 4,5 og opslemningen af bærer og lipaseopløsning blev langsomt omrørt ved rotation i 4 timer ved stuetemperatur efterfulgt af tørring under vakuum.

20 Ladningen af partiklerne var 28.100 LU/g tørt bærermateriale. 125 mg (på tørstofbasis) af den immobiliserede lipase indeholdende ca. 2% vand blev anvendt til esterificering af 40 mmol propanol og myristinsyre ved 60°C. Indenfor 20 minutter blev der dannet 29,2% ester.

EKSEMPEL 7 25 1 g af silicatbæreren Manville R-648 (med gennemsnitlig porediame ter 1400 Å) blev vasket i 0,2M acetatstødpude ved pH 4,5 i en halv time og 12 DK 169951 B1 vakuumfiltreret. 186.000 LU (0,06 g lipase med en aktivitet på 3,1 x 10® LU/g) af lipase, fremstillet som angivet i eksempel 1 i dansk patentansøgning nr.

4117/86, dvs. ved hjælp af Humicola lanuginosa, blev opløst i 5 ml afioniseret vand og tilsat til bæreren. pH blev indstillet til 4,5 og opslem- ft 5 ningen af bærer og lipaseopløsning blev omrørt langsomt under rotation i to timer efterfulgt af vakuumfiltrering. Filtratet indeholdt 34.000 LU svarende til en adsorption på 82%. Den immobiliserede lipase blev lufttørret og fugtighedsindholdet indstillet til 10%. Prøven blev analyseret til 14 BIU.

EKSEMPEL 8 10 Dette eksempel er et sammenligningseksempel, da porediameteren af bæreren er mindre end 5 gange diameteren af lipasemolekylerne.

1 g bærermateriale Amicon Matrex™ silica Si Chromatography medium (porediameter 100 Å, partikelstørrelse 190-300 μηη) blev vasket i 0,2M acetatstødpude med pH 4,5 i en halv time og derefter vakuumfiltreret.

15 186.000 LU (0,06 g lipase med en aktivitet af 3,1 x 106 LU/g) lipase

(fremstillet som angivet i eksempel 1 i dansk patentansøgning nr. 4117/86) blev opløst i 5 ml afioniseret vand og tilsat til bæreren. pH blev indstillet til 4,5 og opslemningen af bærer og lipaseopløsning blev omrørt langsomt ved rotation i 2 timer efterfulgt af vakuumfiltrering. Filtratet indeholdt 50 LU

20 svarende til en adsorption på 100%. Den immobiliserede lipase blev lufttørret og fugtighedsindholdet indstillet til 10%. Prøven blev analyseret til 6 BIU. Den lave BlU-værdi viser, at den immobiliserede lipase er af ringe kvalitet.

*

Claims (10)

1. Partikelformet immobiliseret mikrobielt lipasepræparat immobiliseret på et makroporøst bærermateriale, der består af mindst 65% silica eller silicater, kendetegnet ved, at over 90% af partiklerne har en partikelstørrelse 5 på mellem 100 og 1000 μπ\, at over 80% af porerne i partiklerne udviser en diameter på mellem 10 og 45 gange diameteren af lipasemolekylerne, og at vandindholdet af den partikelformede immobiliserede lipase ligger på mellem 1 og 20%, fortrinsvis mellem 2 og 20%, især mellem 5 og 20%.

2. Partikelformet immobiliseret lipasepræparat ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at over 90% af partiklerne har en størrelse på mellem 200 og 800 jtim, fortrinsvis mellem 200 og 400 /im.

3. Partikelformet immobiliseret lipasepræparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at over 80% af porerne i partiklerne udviser en diameter på mellem 12 og 40 gange diameteren af lipasemolekylerne.

4. Partikelformet immobiliseret lipasepræparat ifølge krav 1 - 3, kendetegnet ved, at lipasen er en termostabil lipase.

5. Partikelformet immobiliseret lipasepræparat ifølge krav 1 - 4, kendetegnet ved, at lipasen fremstilles ved dyrkning af en mikroorganisme, som indeholder et gen, der koder for og udtrykker en lipase afledet af en 20 stamme af en Humicola art, Candida antarctica eller Rhizomucor miehei. DK 169951 B1

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et partikelformet immobiiiseret v lipasepræparat ifølge krav 1 - 5, kendetegnet ved, at en vandig opløsning af en mikrobiel lipase bringes i kontakt med et partikelformet makroporøst bærermateriale, som består af mindst 65% silica eller silicater, hvori over 90% . . 5 af partiklerne har en størrelse på mellem 100 og 1000 μπ\, og hvor over 80% af porerne i partiklerne udviser en diameter på mellem 10 og 45 gange diameteren af lipasemolekylerne, i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at binde den ønskede mængde lipase til bærermaterialet, hvorefter det således dannede partikelformede immobiliserede lipasepræparat separeres fra den 10 vandige fase og det separerede immobiliserede lipasepræparat tørres til et vandindhold på mellem ca. 1 og 20%, fortrinsvis mellem 2 og 20%, især mellem 5 og 20%.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at forholdet mellem mængden af den vandige opløsning af den mikrobielle lipase og vægten af 15 bærermateriale svarer til 10.000 - 500.000 LU/g af bærermateriale (tørvægt).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at pH under kontakten mellem bærermateriale og vandig opløsning ikke afviger mere end 1 pH-enhed fra det optimale ladnings-pH af den pågældende lipase hvad angår udtrykt lipaseaktivitet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 - 8, kendetegnet ved, at separationen gennemføres ved simpel filtrering.

10. Fremgangsmåde til omestring af fedtstoffer, kendetegnet ved, at , flydende fedtstoffer eller fedtblandinger, inklusive frie fedtsyrer eller fedtsyreestere, bringes i kontakt med det immobiliserede lipasepræparat ΐ 25 ifølge krav 1 - 5.