DK164840B - Fremgangsmaade til bestemmelse af en ukendt maengde analyt i en vaeske - Google Patents

Description

i

DK 164840 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en ukendt mængde analyt i en væske.

Forskellige bestemmelsessystemer, der er både hurtige og følsom-5 me, er blevet udviklet for at bestemme koncentrationen af et stof i en væske. Immunbestemmelser afhænger af bindingen af et antigen eller hapten til et specifikt antistof og har været særligt nyttige, fordi de giver en høj grad af specificitet og følsomhed. Disse bestemmelser anvender i almindelighed 10 et af de ovennævnte reagenser i mærket form, idet det mærkede reagens ofte omtales som sporstoffet. Immunbestemmelsesmetoder kan udføres i opløsning' eller på en fast bærer og kan være enten heterogene eller homogene. Heterogene bestemmelser kræver en adskillelse af bundet sporstof fra frit (ubundet) sporstof.

15 Homogene bestem: :-lser kræver ikke et adskillelsestrin og giver derfor en betydelig fordel med hensyn til hastighed, bekvemmelighed og let automatisering sammenlignet med heterogene bestemmelser.

20 Radioimmunbestemmelser (RIA), der anvender radioisotoper son mærker, giver en høj grad af følsomhed og reproducerbarhed og er egnede til automatisering til hurtig behandling af et stort antal prøver. Alle RIA-metoder kræver imidlertid et adskillelsestrin, fordi den målte parameter (kernehenfald) ikke kan kontrolleres 25 ved ændring af målebetingelser eller komponenter. Desuden er isotoper dyre, har forholdsvis kort holdbarhed, kræver dyrt og indviklet udstyr, og omfattende sikkerhedsforanstaltninger til deres håndtering og bortskaffelse må følges.

30 Enzymer er også blevet anvendt som mærker til immunbestemmelse. Enzymimmunbestemmelse (EIA) kan være homogen og kræver ikke forsigtighedsforanstaltninger mod radioaktivitet. Konjugation af et enzym med et protein er i reglen simpel, og det fremkomne protein-enzymkonjugat er i almindelighed stabilt. EIA afhænger 35 2

DK 164840 B

imidlertid af reaktionen af enzymkonjugatet med et substrat til frembringelse af en farve, som måles og kræver derfor det yderligere trin at tilvejebringe et enzymsubstrat. Desuden må man lade hengå tilstrækkelig tid til farveudvikling, og 5 der må haves et dyrt spektrofotometer til måling af farveændringen.

Nogle af de ovennævnte ulemper, der står i forbindelse med RIA eller EIA, er blevet overvundet ved anvendelse af fluoro-10 chromer som mærker ved immunbestemmelse. Fluoroimmunbestemmelse (FIA) giver direkte påvisning af mærket og kan let tilpasses til homogene målingsmetoder. Kendte homogene FIA-metoder, der anvender organiske fluorochromer, såsom fluorescein eller rhodaminderivater, har imidlertid ikke opnået samme høje føl-15 somhed som RIA eller EIA stort set på grund af lysspredning med urenheder suspenderet i bestemmelsesmediet og af baggrundsfluorescensemission fra andre fluorescerende materialer, der findes i bestemmelsesmediet. Spredning er særlig besværlig med fluorochromer, der har en kort (50 nm eller mindre) Stoke's 20 forskydning (forskellen mellem bølgelængden af absorptionen og emissionen). F.eks. er Stoke's forskydningen af fluorescein-isothiocyanat kun 20-30 nm. Baggrundsfluorescens er særlig besværlig, når bestemmelsesmediet er serum. Følsomheden af en bestemmelse i serum kan blive reduceret op til 100 gange 25 sammenlignet med en identisk bestemmelse i puffer.

Udviklingen af tidsopløst fluorimmunbestemmelse {TR-FIA) har bidraget til at overvinde disse problemer. Ved denne fremgangsmåde bliver et fluorochrommærke med forholdsvis lang henfalds-30 tid for fluorescensemissionen anslået med en lyspulsering, og fluorescensemissionen fra mærket måles efter en forud valgt forsinkelse. Baggrundsemission med kort henfaldstid (i almindelighed mindre end 10 ns) ophører i det væsentlige under forsinkelsen og generer derfor ikke måling af den specifikke 05 emission fra mærket. TR-FIA er mest effektiv, når det fluorescerende mærke har en henfaldstid på 100 til 1000 ns og en lang Stoke's forskydning (100 nm eller mere).

3

DK 164840B

En klasse mærker, der tilfredsstiller kravene til TR-FIA er lanthanidchelaterne. Lanthanidioner, især ioner af europium og terbium danner meget fluorescerende chelater med lang Stoke's forskydning (op til 250 nm) med organiske ligander, især med 5 β-diketoner. Liganddelen af chelatet absorberer stimuleringslys og overfører den absorberede energi til den chelaterede metalion. Metalionen udsender energien som fluorescens med særlig lang henfaldstid (1 ms). En diskussion af brugen af lanthanid-chelater i TR-FIA er anført 'i Analytical Biochemistry, 137 10 335 (1984). | US-patent nr. 4.058.732 beskriver en fremgangsmåde og et apparat til brug af lanthanidchelater og tidsopløsning til analytisk fluorescerende spektroskopi.

15 US-patent nr. 4.283.382 beskriver en forbedring af TR-FIA, ved hvilken et lanthanidchelatmærke inkorporeres i et polymert perlegitter for at eliminere vandinduceret udslukning af mærkets fluorescensemission.

20 US-patent nr. 4.374.120 beskriver forøget stabilitet af lanthanidchelater opnået med et 1:1:1 chelat af lanthanid, β-diketon og en aminopolycarboxylsyreanalog, der har en funktionel gruppe, der er nyttig til binding af chelatet til et protein.

25

Europæisk patentansøgning EP 0.064.484-A2 beskriver en TR-FIA-fremgangsmåde, ved hvilken stoffet, der skal bestemmes, kobles til et lanthanid med en aminocarboxylsyreanalog, og lanthanidet efter inkubation spaltes fra stoffet, der skal bestemmes og 30 chelateres til en β-diketon før påvisning.

De ovennævnte fremgangsmåder har forbedret FIA, men der er stadig et behov for en FIA med høj følsomhed, der kan udføres hurtigt uden at kræve en adskillelse af bundne og frie frak-35 tioner.

4

DK 164840 B

En side af den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fastfaseimmunbestemmelse af en analyt uden adskillelse af bundne og frie fraktioner. En anti-analyt bundet til overfladen af en fast bærer, bringes i kontakt med en væske inde-5 holdende analytten, et lysabsorberende materiale og et sporstof for analytten, som har et bundet mærke, der absorberer og udsender lys. Efter inkubation af bestemmelsesblandingen tilføjes stimuleringslys, og lysemission måles ved tidsopløsning. Størrelsen af lysemissionen sammenlignes med størrelsen 10 af lysemission målt, når en eller flere kendte mængder analyt måles under i det væsentlige identiske betingelser.

I en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mærket et fluorescerende farvestof med forholds-15 vis lang henfaldstid, og det lysabsorberende materiale er en UV-absorberende forbindelse, der har et absorptionsbånd, som overlapper sporstoffets absorptionsbånd.

I en særlig foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen er analytten en serumprøve, det lysabsorberende materiale er en arylaminonaphtalinsulfonsyre, sporstoffet er et lanthanidchelat inkorporeret i en polymer partikel bundet til analytten, og sporstoffet og analytten konkurrerer om et utilstrækkeligt antal anti-analytbindingssteder.

25 I en anden udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen r bindes i hovedsagen al analytten til både anti-analytten og sporstoffet ved en sandwichbestemmelse.

30 Ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres en fastfase TR-FIA, som ikke kræver en adskillelse af bundne og ubundne fraktioner, hvorved der opnås driftsmæssig enkelhed, hastighed og bekvemmelighed af homogene bestemmelser. Mærket påvises 35 5

DK 164840 B

direkte uden et yderligere substrat eller inkubationsperiode til udvikling af et påviseligt materiale. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver en meget følsom homogen bestemmelse, der i det væsentlige er fri for generende emission fra andre fluores-5 cerende materialer, hvorved en analyt, der findes i meget lav koncentration kan bestemmes nøjagtigt. Fordi fremgangsmåden er ekceptionelt let at udføre, er den velegnet til automatisering.

10 Opfindelsen er nærmere anskueliggjort på tegningen, hvor fig. 1 viser et glas og andre komponenter til brug i en kompe-titiv immunbestemmelse i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 15 fig. 2 er en standardkurve af en bestemmelse for digoxin i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og fig. 3 er en standardkurve af en bestemmelse for humant chorio-20 nisk ganadotropin (HGC) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Opfindelsen tilfredstilles af mange forskellige udførelsesformer men vil her blive beskrevet detaljeret i forbindelse med fore-25 trukne udførelsesformer med den forståelse, at beskrivelsen kun skal betragtes som eksempler på opfindelsens principper og ikke skal begrænse opfindelsen til de illustrerede udførelsesformer. Opfindelsens omfang måles af kravene og deres ækvivalenter.

30 I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan koncentrationen af et stof, der findes i en væske, bestemmes ved hjælp af en immunologisk reaktion. Stoffet, der i det følgende omtales som analytten, kan være et antigen, et 35 hapten eller et antistof og kan findes i enhver egnet væske.

F.eks. kan væsken være en puffer, saltvand eller en legems- 6

DK 164840 B

væske, såsom serum eller urin. I nogle tilfælde kan analytten isoleres fra en legemsvæske og derpå indføres i en anden væske, såsom en puffer med henblik på bestemmelse.

5 Ved udtrykket "immunologisk reaktion", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, menes en specifik bindingsreaktion af et antigen og et antistof, en hapten og et antistof eller enhver passende analog af et antigen, et antistof eller en hapten, som også bindes specifikt.

10

Den immunologiske reaktion i fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres på overfladen af en fast bærer. Som det er velkendt, kan den faste bærer være enhver bærer, der ikke generer bestemmelsen. Eksempler på faste bærere, der kan anvendes, er glas 15 og polymere materialer, såsom polyethylen, polystyren og lignende. Disse bærere kan fremstilles i enhver egnet form, såsom plader, fordybninger eller fortrinsvis rør eller glas. I den mest foretrukne udførelsesform ifølge opfindelsen udføres den immunologiske reaktion på indersiderne og bunden af et 20 glas, fortrinsvis et plastglas, hvis ene ende er lukket.

En anti-analyt bindes til overfladen af den faste bærer. Anti-analytten kan være et antigen eller et antistof, som reagerer specifikt med analytten, eller den kan være en passende analog 25 deraf, som reagerer specifikt med analytten. Binding af anti-analytten til den faste bærer kan udføres ved enhver sædvanlig fremgangsmåde, som f.eks. absorption eller kovalent binding. Disse fremgangsmåder er velkendte, og nærmere detaljer i så henseende anses for unødvendige for en fuldstændig forståelse 30 af opfindelsen.

Mængden af anti-analyt, der skal bindes til den faste bærer, afhænger af den type bestemmelse, som skal udføres. Ved en kompetitiv immunbestemmelse, som vil blive beskrevet først,

-5 C

bliver en begrænset mængde anti-analyt bundet, hvorved utilstrækkelige bindingssteder står til rådighed, og analytten 7

DK 164840 B

og et sporstof for analytten beskrevet nedenfor konkurrerer om de tilgængelige steder. Ved en sandwichbestemmelse, som derefter vil blive beskrevet, bliver overskud af anti-analyt bundet, hvorved i hovedsagen al analyt er bundet til anti-5 analytten.

Ved en kompetitiv bestemmelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen bliver anti-'analytten, som er bundet til den faste bærer, bragt i kontakt med en ukendt mængde analyt i en væske, 1° og bestemmelsesmediet inkuberes, som beskrevet nedenfor, for at inducere en immunologisk reaktion mellem analytten og anti-analytten. Et sporstof for analytten tilsættes så og en følgende inkubation udføres, således at bestemmelsesmediet indeholder fri analyt, frit sporstof, bundet analyt og bundet sporstof.

15 Alternativt og fortrinsvis tilsættes analytten og sporstoffet samtidig, og der udføres en enkelt inkubation. Analyt og sporstof bundet til anti-analytten på den faste bærer, omtales herefter som den bundne fraktion, og analyt og sporstof, som ikke er bundet til anti-analyten, omtales i det følgende som 20 den frie fraktion.

Sporstoffet giver et middel til at følge forløbet af den immunologiske reaktion og består ved en kompetitiv bestemmelse fortrinsvis af en kendt mængde af analytten eller en passende 25 analog heraf koblet til et mærke. Mærket kan være ethvert stof, som absorberer og udsender lys, og som kan være koblet til analytten. Det foretrukne mærke udsender lys med lang henfaldstid, mest foretrukket fluorescensemission med lang henfald, som muliggør påvisning af det bundne sporstof uden 30 nogen væsentlig genering fra andre lysudsendende materialer i bestemmelsessystemet. De mest foretrukne mærker absorberer stimuleringslys med bølgelængde ca. 280-375 nm, udsender fluorescens med bølgelængde ca. 580-630 nm og har en Stoke's forskydning fra ca. 200-250 nm. Henfaldstiden af fluorescensemissionen 3 5 af de mest foretrukne mærker er fra ca. 0,5 til 1,0 ms.

8

DK 164840 B

Flourescerende mærker med lang henfaldstid, der er nyttige til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er pyrenderivater og fortrinsvis lanthanidchelaterne. Den sidstnævnte klasse mærker består af en lanthanidion, såsom en ion af europium eller 5 terbium chelateret med en organisk ligand, som f.eks. en j3- diketon. Eksempler på β-diketoner, der kan anvendes, er benzoyl-acetone, dibenzoylmethan, thenoyltrifluoracetone, benzoyl-trifluoracetone, naphthoyltrifluoracetone, acetylacetone, trifluoracetylacetone, hexafluoracetylacetone og lignende. Chelatering af β-diketonen med lanthanidionen udføres rutinemæssigt ved at inkubere reagenserne i passende tid. Den mængde lanthanidchelat, der skal anvendes til fremstilling af sporstoffet, afhænger af den type bestemmelse, der skal udføres og mængden af analyt i væsken og er velkendt for fagfolk.

15

Lanthanidchelatmærket kan kobles direkte til analytten på sædvanlig måde til fremstilling af sporstoffet. Alternativt og fortrinsvis inkorporeres mærket i en partikel, og partiklen bindes til analytten til dannelse af sporstoffet. Partiklen 9 Π kan være en polymerpartikel, såsom en perle. Enhver polymer kan anvendes, der er i stand til at inkorporere mærket og binde til analytten. De foretrukne polymerer er i det væsentlige transparente for både stimuleringslyset og fluorescensemissionen og indgår ikke i noget væsentligt antal uspecifikke overflade- 2 5 reaktioner med andre proteiner end analytten, som f.eks. andre proteiner i serum. En særlig foretrukket polymer til inkorporering af mærket er et polyacrylat, som f.eks. polymethylmethacry-lat.

30 Mærket inkorpores i partiklen på sædvanlige mader. F.eks. kan en polymer partikel indeholdende mærket fremstilles ved emulsionspolymerisation af en monomer i en opløsning indeholdende mærket. Ligeledes bindes partiklen til analytten på sædvanlig måde, fortrinsvis ved kovalent kobling af passende funktio- 3 5 nelle grupper på analytten og på overfladen af partiklen.

De sædvanlige metoder til inkorporering af mærket i partiklen 9

DK 164840 B

og binding af partiklen til analytten er velkendte og anses for at ligge inden for en fagmands kunne og nærmere enkeltheder med hensyn til disse dele af fremgangsmåden er unødvendige for en fuldstændig forståelse af opfindelsen.

5

Bestemmelsesmediet indeholdende den bårne anti-analyt, væsken indeholdende analytten og sporstoffet kan inkuberes ved enhver temperatur og enhver tidsperiode, der er egnet til at lette den immunologiske reaktion og derved give de førnævnte bundne 10 og frie fraktioner. Inkubationen kan udføres ved en temperatur fra ca. 0 til 50°C, fortrinsvis fra ca. 30 til 40°C og kan, men behøver ikke, resultere i ligevægt mellem disse fraktioner.

Et lysabsorberende materiale sættes til bestemmelsessysternet 15 enten før eller efter den immunologiske reaktion og det kan være ethvert materiale, som har et absorptionsbånd, som overlapper sporstoffets absorptionsbånd, og som ikke generer den immunologiske reaktion. Egnede absorberende materialer eksemplificeres af, men begrænses ikke til stilbener, benzoxazoler, 20 naphthalener og derivater deraf. En foretrukken gruppe er arylaminonaphthalensulfonsyrerne, som f.eks. 2-(p-anisidinyl) naphthalen-6-sulfonsyre eller l-anilinonaphthalen-8-sulfonsyre (1,8-ANS). Koncentrationen af absorberende materiale i bestem- -*2 "*6 melsesmediet kan være fra ca. 10 til 10 M, fortrinsvis 25 fra ca. 10 ^ til 10 ^M.

Bundet sporstof påvises ved at anvende stimuleringslys og måle lysemissionen fra mærket i nærværelse af det lysabsorberende materiale. Stimuleringslyset har fortrinsvis en bølgelængde 30 i absorptionsintervallet for det anvendte mærke. Når mærket er et lanthanidchelat har stimuleringslyset fortrinsvis en bølgelængde fra ca. 280 til 375 nm, mest foretrukket ca. 343 nm og er diskontinuerligt, dvs. lyspulseringer skifter med perioder, hvor lyskilden er slukket. Lyspulseringerne kan 35 være fra ca. 0,1 til 10 ijs, fortrinsvis ca. 3 με i varighed. Perioderne, hvor lyskilden er slukket, kan være fra ca. 0,1 til 2,0 ms, fortrinsvis ca. 0,9 ms.

10

DK 164840 B

Lysemissionen måles fortrinsvis ved tidskanalisering efter en forsinkelse på ca. 0fl til 0,5 ms, fortrinsvis ca. 0,5 ms fra afslutning af en pulsering. Bølgelængden af lysemissionen afhænger af det anvendte mærke. Når mærket er et lanthanid-5 chelat, er emissionsbølgelængden i almindelighed fra ca. 580 til 630 nm. Mest foretrukket måles emissionen ved en bølgelængde på ca. 614 nm.

Måling af lysemission ved tidskanalisering i overensstemmel-10 se med den foretrukne fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan udføres i et sædvanligt spektrofotometer, som f.eks. et Spex L-lll fluorimeter (SPEX Industries, Inc., Edison, New Jersey) udstyret med en fotondetektor med lukkemekanisme. Emission kan måles i enhver vinkel med strålen af stimuleringslys.

15 Fortrinsvis måles emission i en vinkel på 2 til 20° fra strålen af stimuleringslys.

Det lysabsorberende materiale i væskefasen i bestemmelsessystemet absorberer alt stimuleringslys og/eller emissionslys, 20 som går igennem væskefasen og forhindrer derved effektivt påvisning af emission fra frit sporstof. På den anden side absorberer bundet sporstof og udsender bagefter påviseligt lys, som ikke har passeret gennem væskefasen.

25 Fremgansmåden og komponenterne til opfindelsen er vist på fig. 1, hvori et bestemmelsessystem 10 indbefatter et fortrinsvis polystyren gi as 13, der har en åben ende 11 og en lukket ende 12. Glasset 13 indeholder en bundet fraktion 15 og en væskefase 17. Den bundne fraktion 15 indbefatter anti-analyt 30 19 bundet til indersiderne af glasset 13 og bundet analyt 21 og bundet sporstof 23. Bundet sporstof 23 omfatter bundet analyt 21, som har vedhængende polymer partikel 25 med inkorporeret fluorescerende farvestofmærke 27. Væskefasen 17 indbefatter fri analyt 21a, frit sporstof 23a og lysabsorberende ^ materiale 29.

11

DK 164840 B

Stimuleringslys, der er skematisk vist med linien 31, passerer gennem glasset 13 og absorberes af materialet 29, eller det kan passere gennem glasset og blive absorberet af bundet sporstof 23 eller frit sporstof 23a. Fluorescensemission fra bundet 5 sporstof 23 indbefatter emission 33a ind i væskefasen 17, hvor den absorberes af materialet 29 og emissionen 33b ud ad gennem glasset 13 uden at passere gennem væskefasen 17, hvor den påvises med et fluorimeter 35. Emissionen 33c fra frit sporstof 23a ind i væskefasen 17 absorberes af materialet 10 29.

Stimuleringslys reflekteret fra den faste bærer generer ikke måling af emission fra bundet sporstof, fordi emission måles, når lyskilden er slukket. Baggrundslysemission med kort hen-15 faldstid, der står i forbindelse med serum eller andre fluorescerende materialer i bestemmelsesmediet inklusive det, der står i forbindelse med den faste bærer selv, elimineres i det væsentlige ved tidsopløst måling af emission. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er den eneste lysemission, der påvises, derfor 20 fra sporstof bundet til overfladen af den faste bærer.

Ved en kompetitiv bestemmelse, som ovenfor beskrevet, er størrelsen af lysemissionen direkte proportional med mængden af bundet sporstof og derfor omvendt proportional med mængden 25 af analyt, der findes i væsken. Koncentrationen af analytten i væsken kan bestemmes ved at sammenligne størrelsen af lysemission målt ved bestemmelse af analytten med emissionen, der måles efter bestemmelse af et interval af kendte mængder af analytten bestemt under i hovedsagen identiske betingelser.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan tilpasses til en fastfase sandwichbestemmelse. Denne type bestemmelse er særlig nyttig til bestemmelse af en makromolekylær analyt, som f.eks. et protein. Enhver modifikation af fastfasesandwichbestemmelse 35 kan anvendes. F.eks. kan anti-analytten være bundet til den faste bærer i tilstrækkelig mængde til at binde i det væsentlige al analytten gennem en første determinant på analytten. Den

DK 164840 B

t 12 bårne anti-analyt kan inkuberes med analytten, det lysabsorberende materiale og et sporstof, hvori sporstoffet omfatter en mærket ligand, der er specifik for en anden determinant på analytten. Liganden kan være et antigen, et antistof eller 5 et bundet kompleks af antigen og antistof.

Det foretrukne mærke og lysabsorberende materiale og den foretrukne metode til stimulering og påvisning af emission kan være, som beskrevet ovenfor, for den kompetitive bestemmelse.

10 Ved sandwichbestemmelsen i denne udførelsesform ifølge opfindelsen er koncentrationen af analytten, der findes i væsken imidlertid direkte proportional med størrelsen af lysemissionen.

Et reagensudstyr eller en pakke materialer kan anvendes 15 til udførelse af en bestemmelse af en analyt i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Udstyret kan indbefatte en fast bærer, som har bundet dertil en anti-analyt, der er specifik for analytten, et lysabsorberende materiale og et sporstof for analytten, som har bundet dertil 20 et mærke, der er i stand til at absorbere stimuleringslys og udsende påviseligt lys. Udstyret kan også indbefatte standarder for analytten, som f.eks. en eller flere analytprøver med kendt koncentration, eller det kan indbefatte andre reagenser, såsom andre mærkede eller umærkede specifikke antigener, 25 antistoffer eller komplekser deraf, der er nyttige til udførelse af bestemmelsen. Komponenterne i udstyret kan leveres i separate beholdere, som f.eks. flasker, eller to eller flere af komponenterne kan være forenet i en enkelt beholder.

30 De følgende eksempler på et modelsystem og en bestemmelse for digoxin anføres for nærmere at beskrive opfindelsen.

35 13 EKSEMPEL 1

DK 164840 B

Polymethylmethacrylatperler på ca. 150 nm indeholdende ca.

1% naphthoyltrifluoracetone-europiumchelat (NTFA^Eu) blev 5 suspenderet i vand og sprøjtet på overfladen af polystyren- kuvetter. Kuvetterne blev tørret natten over ved omgivelsernes temperatur, hvorved perlerne klæbede til overfladen og ikke blev fjernet ved vask med vand. De således belagte kuvetter blev anvendt til at repræsentere den bundne fraktion af en 10 TR-FIA, dvs. den faste bærer med dertil bundet anti-analyt og sporstof.

En vandig suspension af ca. 1 x 104 perler per ml blev sat til alle kuvetter for at repræsentere væskefasen i en TR-FIA indeholdende 15 frit sporstof.

i

Vandige opløsninger af 1,8-ANS af de koncentrationer, der er anført i tabel I blev sat til kuvetterne. En kontrolkuvette fik kun vand.

20

Under anvendelse af et SPEX L-lll fluorimeter udstyret med en fotondetektor med lukkemekanisme, blev der tilført stimuleringslys af 343 nm vinkelret på kuvetterne. Fluorescensemissionen ved 614 nm blev målt efter en forsinkelse på 0,5 ms 25 i vinkler på 11° og 90° med stimuleringslysstrålen. Resultaterne er anført i tabel I og viser virkningen af 1,8-ANS-koncentra-tionen på fluorescensemissionen af de suspenderede perler.

TABEL I 30

Koncentration af 1,8-ANS Antal påviste fotoner (mol per liter) 11° 90° 0 31.500 32.300 35 1 x 10"2 1.300 45 1 x 10-3 1.300 876 1 x 10"4 27.200 31.400 14

DK 164840 B

-3

Det ses, at 1,8-ANS med en koncentration på 1 x 10 M eliminerede al emission med undtagelse af den, der tilskrives de bundne perler.

5 EKSEMPEL 2

To grupper på hver tre kuvetter blev overtrukket, som beskrevet i eksempel 1 med to forskellige koncentrationer af perler.

En kuvette i hver gruppe modtog vand og repræsenterede den 10 bundne fraktion i en TR-FIA. En anden kuvette i hver gruppe modtog en suspension af perlerne og repræsenterede den bundne og frie fraktion i en TR-FIA. Den tredje kuvette i hver gruppe _3 modtog en suspension af perlerne indeholdende 5 x 10 M 1,8-ANS.

15 Stimulering og måling af fluorescensemission ved 11° blev udført, som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne er anført i tabel II.

TABEL II

20

Antal påviste fotoner Kuvette 1 Kuvette 2

Belagt kuvette + vand 2.300 40.0Q0 25 (bundet fraktion)

Belagt kuvette + suspenderede perler 32.400 71.000 (bundet og frie fraktioner)

Belagt kuvette + suspenderede 2.700 38.000 perler + 5 x 10 ^m 1,8-ANS 30 (bundet og frie fraktioner og lysabsorberende materiale)

Det ses, at i nærværelse af det absorberende materiale, blev perlerne på kuvetteoverfladen (bundet fraktion) selektivt 35 stimuleret, og deres fluorescensemission påvist i nærværelse af et stort overskud af perler i suspension (fri fraktion).

DK 164840B

15 EKSEMPEL 3 A. Fremstilling af de fluorescerende polymerpartikler.

5 En polymerperle bestående af butylmethacrylat:glycidylmethacry-lat:sulfoethylmethacrylat i forholdet 92:6:2 og indeholdende 1% NTFA^Eu blev fremstillet på følgende måde. Bismethylen-acrylamid (0,05 g) og polyethylenoxid (0,1 g) blev opløst i afioniseret vand (25 ml) og acetone (4 ml). Der blev fremit) stillet en anden opløsning, som indeholdt butylmethacrylat (0,78 ml) sulfoethylmethacrylat (0,2 g) glycidylmethacrylat (0,5 ml) og NTFA^Eu (25 mg). De to opløsninger blev sammenblandet, og pH-vaerdien indstillet til 5,5 med 1 N NaOH. Efter god omrøring under ^ blev blandingen bestrålet i 12 timer 15 ved 7,50 Mr/time. Den hvide emulsion blev centrifugeret i en centrifuge med gradvis stigende hastigheder. Pillen, der blev samlet ved 30.000 omdrejninger per minut, blev vasket tre gange med 0,1% polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) i saltvand med phosphatstødpude (PBS 0,01 M blanding af 20 momo- og dinatriumphosphat i 0,15 M NaCl). Pillen blev til sidst suspenderet i en 10% opløsning af 1,3-diaminopropan, hvori pH-værdien blev indstillet til 10 med 1 N HC1. Suspensionen blev omrørt natten over og så vasket tre gange og suspenderet i 30 ml PBS.

25 B. Fremstilling af PSA-diqoxin partikelkonjuqatet.

En prøve (1,0 ml) af partikelsuspensionen beskrevet i A blev aktiveret ved tilsætning af glutaraldehyd ved en slutkoncen-30 tration på 1%. En 4 timers inkubation blev fulgt af tre vask-ninger i PBS. Til 1 ml af de aktiverede perler blev sat 5 mg af et okseserumalbumin (BSA)-digoxinkonjugat. Blandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Perlerne blev vasket tre gange, suspenderet i 25 ml PBS og lagret ved 4°C.

35

DK 164840 B

16 C. Overtrækning af polystyrenkuvetter med kaninanti-digoxin-immunoglobulin.

En totusindeganges fortynding af kaninanti-digoxinimmunoglobu-5 lin blev fremstillet i 0,1M carbonatstødpude, pH 9,5. Denne opløsning blev pipetteret til 3 ml niveauet i kuvetterne.

Efter inkubation ved stuetemperatur i 4 timer blev kuvetterne udsuget og vasket i rækkefølge med en 2% BSA-opløsning i PBS og til slut i PBS. Kuvetterne blev tørret og lagret ved 4°C.

10 D. Bestemmelse af en standardkurve for digoxin i phosphat-stødpude.

Duplikerede fortyndingsrækker af digoxin blev fremstillet i PBS indeholdende BSA (2%) og Tween 20 (0,5%) i intervallet fra 1 til 10.000 ng/ml, og derefter blev 3 ml af hver af disse opløsninger og en blindprøve af PBS pipetteret i kuvetterne, der forud var belagt, som beskrevet i C. Til hver af disse kuvetter blev sat 30 μΐ af BSA-digoxinpartikelkonjugatet frem-stillet i afsnit B. Kuvetterne blev inkuberet ved 37°C i 40 minutter. Til hver af kuvetterne blev sat 0,1M 1,8-ANS (30 μΐ) og fluorescensemission ved 614 nm blev målt efter en forsinkelse på 0,5 ms i en vinkel på 11° med stimuleringslysstrålen. Resultaterne er vist i tabel III og fig. 2.

25

TABEL III

Diqoxinkoncentration (ng/ml) Intensitet (fotoner) 0 8700 30 1 8700 10 8200 100 7000 1000 6100 10000 4500 35 EKSEMPEL 4 17

DK 164840 B

A. Fremstilling af anti-HCG immunoglobulinpartikelkonjugat.

5 En prøve (1,0 ml) af partikelsuspensionen beskrevet i eksempel 3A blev aktiveret ved tilsætning af glutaraldehyd ved en slut-koncentration på 1%. En 4-timers inkubation blev fulgt af tre vaskninger i PBS. Til 1 ml af de aktiverede perler blev sat 50 μΐ af en 1 mg/ml opløsning i PBS af et monoklonalt 10 antistof betegnet HCG-13 udviklet på sædvanlig måde mod HCG.

Blandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Perlerne blev vasket tre gange, suspenderet i 25 ml PBS og lagret ved 4°C.

15 b. Belægning af polystyrenkuvetter med monoklonalt anti-HCG-4 immunoglobulin.

En femtusindeganges fortynding af et andet monoklonalt antistof udviklet mod HCG betegnet HCG-4 blev fremstillet i 0,1M 20 carbonatstødpude, pH 9,5. Denne opløsning blev pipetteret til 3 ml-niveauet i kuvetterne. Efter inkubation ved stuetemperatur i 4 timer blev kuvetterne udsuget og vasket i rækkefølge med en 2% BSA-opløsning i PBS og til slut PBS. Kuvetterne blev tørret og lagret ved 4°C.

25 C. Bestemmelse af en standardkurve for HCG i phosphatstødpude.

Duplikerede fortyndingsrækker af HCG blev fremstillet i PBS

af 10-dobbelt koncentration i intervallet fra 0,15 til 1,5 5 30 x 10 mIU/ml. Disse opløsninger og en blindprøve af PBS blev pipetteret i kuvetterne, der var blevet belagt som beskrevet i B. Efter en 1-times inkubation ved 37°C blev mikroperlerne (50 μ1) beskrevet i A tilsat, og inkubationen blev fortsat i 1 time til. Til hver af kuvetterne blev sat 0,1M 1,8-ANS 35 (30 μ1), og fluorescensemission ved 614 nm blev målt efter en forsinkelse på 0,5 ms i en vinkel på 11° med stimuleringslysstrålen. Resultaterne er anført i tabel IV og fig. 3.

Claims (26)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ukendt mængde analyt i en væske, kendetegnet ved, at 35 (a) der fremstilles en blanding ved at bringe en antianalyt bundet til overfladen af en fast bærer i kontakt med en væske indeholdende en ukendt mængde analyt, et lysabsorberende mate- 19 DK 164840 B riale og et sporstof for analytten, hvilket sporstof indeholder et fluorescerende farvestof og vælges fra en gruppe sporstoffer, der udgøres af et antigen, et antistof og et bundet antigen-anti stofkompleks, hvorhos det fluorescerende farvestof 5 er bundet dertil, og sporstoffet reagerer specifikt med analytten , (b) blandingen inkuberes, 10 (c) blandingen udsættes for en exciterende lyspuls, idet in tensiteten og varigheden af lyspulsen er tilstrækkelig til at exciteringslyset delvis vil blive absorberet af sporstoffet, (d) f1uorescensstrå1 i ngen fra det bundne sporstof iagttages, 15 hvilken emission klinger af i løbet af et tidsrum, der er tilstrækkelig langt til at emissionen kan iagttages efter afslutning af lyspulsen, og al lysemission hidrørende fra de andre komponenter i blandingen udover det bundne sporstof er klinget af, og (e) mængden af analyt i væsken bestemmes ved at sammenligne fluorescensemissionen med fluorescensemissionen for en kendt mængde analyt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten vælges fra en gruppe af analytter omfattende antigener, haptener og antistoffer, og antianalytten vælges fra en gruppe antianalytter omfattende antigener og antistoffer.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sporstoffet yderligere omfatter analytten, at det fluorescerende farvestof er bundet dertil, og at sporstoffet reagerer spec i fikt med antianalytten.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at en begrænset mængde antianalyt, der er bundet til bæreren, samt analytten og sporstoffet bindes kompetitivt til antianalytten . 20 DK 164840 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at i hovedsagen al anal ytten bindes til antianalytten, og at sporstoffet bindes til analytten.

6. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at det f1uorescerende farvestof er et 1anthanidchelat.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at 1anthanidche1atet indkorporeres i en polymerpartikel. 10

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at væsken er et serum.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 15 at det 1ysabsorberende materiale har et absorptionsbånd, som overlapper sporstoffets absorptionsbånd.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det lysabsorberende materiale er en arylaminonaphthalensul- 20 fonsyre.

10 En fremgangsmåde ifølge opfindelsen til fastfasefluorimmun- bestemmelse indbefatter således tilsætning af et lysabsorberende materiale til væskefasen i bestemmelsessystemet. Det lysabsorberende materiale absorberer al stimuleringslys og/eller snitteret lys med undtagelse af det, der absorberes af og ud-I5 sendes fra bundet sporstof, hvorved emissionen fra bundet sporstof kan påvises og måles i nærværelse af et stort overskud af frit sporstof. Adskillelse af den bundne og den frie fraktion undgås således, og der fås en enkel og bekvem homogen bestemmelse. Ved måling af lysemission fra det bundne sporstof under 20 anvendelse af tidsopløsning kan interferens fra reflekteret stimuleringslys og fra lysspredning og baggrundsemission minimeres, hvorved der kan opnås en højere følsomhed af bestemmelsen. Fremgangsmåden kan let tilpasses til alle modifikationer af fastfasekompetitive bestemmelsessystemer og systemer af 2® sandwichtypen. Opfindelsen indbefatter et udstyr af målemate rialer, der kan anvendes til enten manuel bestemmelse eller automatiseret bestemmelse. Patentkrav. 30 --------------------

11. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at intensiteten af pulsen er fra 1 x 10 40 til 2 x 104^ fotoner . 25

12. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at pulsens varighed er ca. 1 - 10 ps.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 30 at pulsens bølgelængde er ca. 280 - 375 nm.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at fluorescensemissionens bølgelængde er ca. 580 - 630 nm.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at fluorescensemissionens afklingningstid er ca. 0,5 - i,o ms. 21 DK 164840 B

16- Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at f1uorescensemissionen måles mellem på hinanden følgende pulser.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fluorescensemissionen måles mellem 0,5 og 0,75 ms og en puls.

18. Fremgangsmåde ifølge krav l, k e n d e t e g n e t ved, 10 at fluorescensemissionen måles fra en vinkel, som afviger fra 2 til 20° fra retningen af den exciterende lyspuls.

19. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ukendt mængde analyt i en væske, kendetegnet ved, at 15 (a) der fremstilles en blanding ved at bringe en antianalyt, der er bundet til overfladen af en fast bærer, i kontakt med væsken, som indeholder en ukendt mængde analyt, et lysabsorberende materiale og et sporstof for analytten, hvilket sporstof 20 indeholder et påviseligt mærkestof, der er i stand til at absorbere og emittere lys, (b) man lader en tilstrækkelig tid gå til at analytten og sporstoffet kan bindes til anti analytten, 25 (c) blandingen udsættes for det exciterende lys, (d) lysemissionen fra det bundne sporstof iagttages i forhold til tiden, og 30 (e) mængden af analyt i væsken bestemmes ved sammenligning af den iagttagede lysemission med lysemissionen, som er opnået med en kendt mængde analyt.

20. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ukendt mængde analyt, der findes i en serumprøve, kendetegnet ved, at DK 164840B 22 (a) der fremstilles en blanding ved at bringe en antianalyt, som er bundet til overfladen af en fast bærer, idet antallet af tilgængelige bindingssteder hos antianalytten er utilstrække ligt til at binde hele analytten, i kontakt med en serumprø-5 ve indeholdende en ukendt mængde analyt, en arylaminonaphtha-lensulfonsyre og et sporstof for analytten, hvilket sporstof indbefatter analytten, hvortil der er bundet en partikel, hvori et lanthanidchelatmærkestof er inkorporeret, 10 (b) blandingen inkuberes, (c) blandingen udsættes for en exei terende lyspuls med bølgelængden ca. 280 - 375 nm og intensiteten 1 x 1040 - 2 x 1040 fotoner samt varigheden 1-10 με, 15 (d) fluorescensemissionen fra det bundne sporstof med bølgelængden ca. 580 - 630 nm og afkl ingningstiden ca. 0,5 - 1,0 ms iagttages, hvilken emission måles mellem på hinanden følgende excitat ionspu1 ser fra en vinkel, som afviger 2 - 20° fra 20 retningen af pulsen, og ca. 0,50 - 0,75 ms efter en afsluttet puls, og (e) mængden af analyt i serumprøven bestemmes ved at sammenligne fluorescensemissionen med den fluorescensemission, som 25 iagttages, når en blanding indeholdende en kendt mængde af analyt bestemmes i overensstemmelse med trinene (a) til (e).

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at partiklen er en polymerpartikel. 30

22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at 1 anthanidehelatet er en europium- eller terbiumion, som er blevet chelateret med en /3-diketon.

23. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ukendt mængde analyt i en serumprøve, kendetegnet ved, at 23 DK 164840 B (a) der fremstilles en blanding ved at bringe en antianalyt, som er bundet til overfladen af en fast bærer, idet antallet af tilgængelige bindingssteder hos antianalytten er tilstrækkeligt til at binde i væsentlige hele analytten, i kontakt med 5 en væske indeholdende en ukendt mængde analyt, en arylamino-naphthalensulfonsyre og et sporstof for analytten, hvorhos der i sporstoffet indgår en ligand, som er specifik for analytten, og der til liganden er bundet en partikel, hvori et lanthanid-chelatmærkestof er inkorporeret, 10 (b) blandingen inkuberes, (c) blandingen udsættes for en exciterende lyspuls med bølgelængden ca. 280 - 375 nm og intensiteten 1 x 10*° - 2 x 10^0 15 fotoner samt varigheden 1-10 μs, (d) fluorescensemissionen fra det bundne sporstof med bølgelængden ca. 580 - 630 nm og afklingningsti den ca. 0,5 - 1,0 ms iagttages, hvilken emission måles mellem på hinanden følgende 20 exe i tat ionspu1 ser fra en vinkel, som afviger 2 - 20® fra retningen af pulsen, og ca. 0,5 - 0,75 ms efter en afsluttet puls, og (e) mængden af analyt i serumprøven bestemmes ved at sam-25 menligne fluorescensemissionen med den fluorescensemissionen, som iagttages, når en blanding indeholdende en kendt mængde analyt bestemmes i overensstemmelse med trinene (a) til (e).

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, 30 at partiklen er en polymerpartikel.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 23, k e n d e t e g n e t ved, at liganden vælges fra en gruppe ligander omfattende antigener, antistoffer og bundne antigen-anti stofkomp1ekser. 35

26. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at lanthanidehelatet er en europin- eller terbiumion, som er chelateret med en jS-diketon.