DK151636B

DK151636B - Fremgangsmaade til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller det af denne producerede enzym

Info

Publication number: DK151636B
Application number: DK540681A
Authority: DK
Inventors: Donald Frederick Hershberger; Moshe M Sternberg
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1980-12-08
Filing date: 1981-12-07
Publication date: 1987-12-21
Also published as: FI77892B; FI813894L; CA1153965A; DE3161139D1; AR226913A1; JPS60241894A; EP0053764A1; DK540681A; DK151636C; FI77892C; IL63543A0; JPS57110190A; ATE4913T1; EP0053764B1; JPH0342076B2; US4337313A; JPS6149956B2

Description

DK 151636B

O

Anvendelsen af enzymer hidrørende fra mikrobielle celler til gennemførelse af specifikke kemiske omdannelser er velkendt. Ved gennemførelsen af sådanne omdannelser kan der som kilden til biokatalysator anvendes det cellefri en-5 zympræparat, sprængte celler eller hele celler. Det fri enzym eller cellerne kan anvendes effektivt ved processer af batch-typen, men er ikke anvendelige til kontinuerlige processer i industriel målestok. Denne vanskelighed har ført til en forøget interesse for fremstillingen af forskelli-10 ge former for immobiliserede enzymer.

I USA-patentskrift nr. 3.779.869 (patent udstedt d. 18. december 1973) beskrives stabiliseringen af glucose-isomeraseaktivitet ved behandling af hele bakterieceller med glutaraldehyd. Anvendelsen af glutaraldehyd til immo-15 bilisering af sprængte celler til tilvejebringelse af et kohærent, fast produkt med glucoseisomeraseaktivitet er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.980.521 (patent udstedt d. 14. september 1976).

USA-patentskrift nr. 4.060.456 (patent udstedt d.

20 29. november 1977) omhandler stabiliseringen af mikrobi elt cellemateriale med glucoseisomeraseaktivitet ved behandling heraf med et kationisk, polyelektrolyt-flokku-leringsmiddel, f.eks. en polyethylenimin eller polyvinyl-pyrrolidon. Anvendelsen af polyelektrolyter såsom polyami-25 ner og kationiske polyacrylamider ved stabiliseringen af mikrobielle celler med aktive enzymer associeret dermed er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.989.596 (patent udstedt d. 2. november 1976).

Ono et al, beskriver i Agric. Biol. Chem., 42 (10), 30 1847-1853 (1978) immobiliseringen af naringinase fra As pergillus niger ved adsorption af enzymet til tannin-amino-hexylcellulose fremstillet ved omsætning af aminohexylcel-lulose med cyanogenbromid-aktiveret kinesisk gallustannin.

35 Ohba et al. beskriver i Biotechnology and Bioengi neering, Vol. XX, pp. 665-676 (1978), at pullulanase med

O

DK 151636 B

2 held kan immobiliseres ved tilsætning af garvesyre til kurturfiltratet af thermofil Streptomyces flavochromo-genes til dannelse af et tannin-pullulanase-addukt, som derefter kan bindes til TEAE-cellulose.

5 I USA-patentskrift nr. 4.212.943 (patent udstedt d.

15. juli 1980) er der beskrevet et bakteriecelleaggregat med forøget partikelhårdhed, som fremstilles ved at bringe en bakteriecellemasse i kontakt med et tværbundet reaktionsprodukt af glutaraldehyd eller cyanursyrehalogenid 10 og en kationisk polymer fremstillet ved polymerisation af en epihalohydrin og en alkylenpolyamin.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller det af denne producerede enzym, og denne fremgangs-15 måde er ejendommelig ved, at man fremstiller et reaktionsprodukt på den· måde, at man (a) bringer et vandigt medium indeholdende enzymet eller en masse af bakterieceller med biokatalytisk aktivitet i kontakt med tannin, et kationisk flok-kuleringsmiddel i form af en langkædet polyamin og et tværbin-20 dingsmiddel, og at man (b) skiller reaktionsproduktet fra det vandige medium og, om ønsket, efterbehandler dette.

Den her omhandlede immobiliseringsteknik har vist sig at tilvejebringe et meget hårdere reaktionsprodukt end de relevante, kendte metoder, idet den biokatalyti-25 ske aktivitet af det immobiliserede materiale ikke påvirkes. Den uventede forbedring af fysisk styrke, som tilvejebringes med den foreliggende opfindelse, afbøder problemer, der opstår med svagere systemer, når disse anvendes i udstrakte tidsrum i en kolonnelagsreaktor, eftersom 30 materialer med mindre styrke har tendens til blødgøring eller opsvulmning, hvilket kan resultere i strømningsbegrænsning eller tilstopning og/eller kanaldannelse.

Det biokatalytiske materiale, der skal immobiliseres ved den her omhandlede fremgangsmåde, kan være et 35 helt fermenteringsudbytte eller et filtrat derfra eller et partielt renset materiale afledt deraf. Hele eller spræng-

DK 151636B

3

O

te celler samt fri enzymer kan immobiliseres under anvendelse af det her omhandlede system.

Det kationiske flokkuleringsmiddel i form af en langkædet polyamin kan hensigtsmæssigt omsættes med et overskud 5 af tværbindingsmiddel til dannelse af et tværbindingsmiddel--flokkuleringsmiddel-addukt inden deres kontakt med biokatalysatoren.

Egnede kationiske polyamin-materialer er polyacryl-amid, polyethylenimin, poly-(2-hydroxypropyl-l-N-methylammo-10 niumchlorid), poly-(2-hydroxypropyl-l,l-N-dimethylammonium-chlorid), poly-(N-(dimethylaminomethyl)-acrylamid), poly--(diallyldimethylammoniumchlorid), poly-(N,N-dimethylamino-ethyl-methacrylat) eller poly-(N-dimethylaminopropyl)-me-thacrylamid.

15 Et på grund af dets godtgjorte kompatibilitet med næringsmiddelbehandling foretrukkent flokkuleringsmiddel er en epihalohydrin-polyamin-copolymer, der er kommercielt tilgængelig under varemærket BETZ 1180 fra Betz Laboratories, Inc., Trevose, Pennsylvania. BETZ 1180 har en 20 molekylvægt på under 1 million, indeholder ca. 0,288 mil-limol aminogrupper pr. gram opløsning (baseret på en nin-hydrinbestemmelse) og markedsføres som en opløsning indeholdende 30 vægtprocent faste stoffer, beregnet på totalvægten af opløsningen. Denne forbindelse er beskrevet i 25 USA-patentskrifterne nr. 3.915.904 og nr. 953*330. Forbindelsen beskrives dér som en vandopløselig, kationisk polymer fremstillet ved polymerisation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin med formlen R-j^NRNI^, hvor R er en lavere alkylengruppe med fra 2 til ca. 6 carbonato-30 mer, og R^ og R2 hver for sig betyder en lavere alkyl-gruppe med fra ca. 1 til ca. 6 carbonatomer, idet molforholdet mellem epihalohydrin og polyamin ligger fra ca.

0,60:1 til ca. 2,7:1, hvorhos polymerisationen omfatter omsætning af alkylenpolyaminen med fra ca. 50 til ca. 90 35 procent af den mængde epihalohydrin, der skal polymerise-res, hvorpå reaktionen får lov at fortsætte, indtil reaktionsmediet når en praktisk taget ensartet viskositet, og

O

DK 151636 B

4 den resterende del af epihalohydrinen omsættes portionsvis til dannelse af den kationiske polymer, idet polymerisationstemperaturen ligger fra ca. 60 til ca. 120°C.

Egnede tværbindingsmidler omfatter multifunktio-5 nelle aldehyder såsom glutaraldehyd eller dialdehydstivelse, multifunktionelle organiske halogenider såsom cyanursyre-chlorid eller l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen, multifunktionelle anhydrider såsom pyromellitsyreanhydrid eller en ethylen-maleinsyreanhydrid-copolymer, multifunktionelle azo-10 forbindelser såsom diazobenzidin, multifunktionelle isocya-nater såsom hexamethylendiisocyanat, multifunktionelle iso-thiocyanater såsom 4,4'-3~diisothiocyanatobiphenyl-2,21-di-sulfonsyre og dehydrative kondensationsreaktionsmidler såsom ethylchlorformiat, Woodward's reagent K, N,N'-dicyclo-15 hexylcarbodiimid eller N-hydroxysuccinimid. Tværbinding kan gennemføres ved særskilt tilførsel af flokkulerings-midlet og tværbindingsmidlet til det biokatalysatorholdige medium, eller, som nævnt ovenfor, fortrinsvis ved en for--reaktion, ved hvilken der tilvejebringes et addukt til til-20 sætning til mediet. Reaktionspotentialet for det materiale, der skal immobiliseres, versus tværbindingsmidlet bør bestemmes , fordi ^overskud af tværbindingsmiddel kan resultere i tab af biokatalytisk aktivitet eller unødvendige omkostninger.

Når der anvendes et multifunktionelt aldehyd som tværbin-25 dingsmiddel, anvendes der en procedure betegnet formol-ti-trering til bestemmelse af reaktiviteten med aldehyd. Denne procedure, der indikerer mængden af let reagerbart amin-indhold i det materiale, der skal immobiliseres med aldehyd, udføres som følger: 30 En portion på 1 dl af materialet anbringes i et 250 ml bægerglas. Der tilsættes fra 50 til 75 ml vand til fortynding af materialet med henblik på let omrøring.

Der anvendes en magnetomrører, og materialet indstilles på en pH-værdi på 8,5 under anvendelse af et pH-meter og na-35 triumhydroxidopløsning. Når pH-værdien er stabil ved 8,5 (idet der gives nogle minutter til intracellulær udveks-

DK 151636B

5

O

ling), tilsættes der 3,0 ml 37%'s (vægt/vægt) formaldehyd af reagenskvalitet, stabiliseret med 10-15% (vægt/-vægt) methanol. pH-værdien falder derpå på grund af omsætning mellem de frie amingrupper med aldehydet.

5 Ved anvendelse af en standardopløsning af natri umhydroxid, f.eks. en 1,0 N opløsning, bringes pH-værdi-en tilbage til 8,5 og opretholdes, indtil den er stabil i 5 minutter (der kræves en samlet tid på ca. 20 til ca.

25 minutter). Den mængde alkali, der kræves, er formol-10 -titreringsværdien udtrykt som meq/dl.

Mængden af ønsket flokkuleringsmiddel til den maksimale aggregering af materialet bestemmes ved en foretruk-ken fremgangsmåde. Der anvendes en trinvis tilsætningstek-nik, og den maksimale flokkulering verificeres ved yder-is ligere tilsætninger til supernatanter opnået ved centrifugering af det flokkulerede materiale. En pH-værdi nær neutralpunktet er sædvanligvis bedst til denne bestemmelse, skønt nogen variation kan tillades, såfremt der er begrænsninger på grund af biokatalysatorens stabilitet.

20 Det materiale, der skal flokkuleres, kan være ma terialet som sådant eller efter tannin-tilsætning og/el-ler tilsætning af tværbindingsmiddel. Flokkuleringsmid-let kan være en polyamin eller reaktionsproduktet af po-lyaminen med tværbindingsmiddel. Den optimale fremgangs-25 måde bør være baseret på resultaterne af den følgende procedure til bestemmelse af flokkuleringsmiddel-krav til opnåelse af maksimal flokkulering og adskillelighed af den ønskede biokatalysator fra den uvedkommende væske.

Der udtages en portion på 500 ml af det materiale, 30 der skal flokkuleres, og dets pH-værdi indstilles på 7,0 med 2 N natriumhydroxidopløsning eller med 2 N saltsyreopløsning. Flokkuleringsmidlet tilsættes dernæst gradvis i en kendt mængde, idet pH-værdien holdes på 7. Der fortsættes med tilsætningen, indtil flokkulering opnås, og blan-35 dingen får lov at blive omrørt i ca. 10 minutter. Der udtages små prøver (to prøver på hver 1,7 ml), som centri- o 6

DK 151636 B

fugeres ved 10.000 G i 5 minutter. Supernatanterne hældes af i små reagensglas.

Der foretages en yderligere lille tilsætning af flokkuleringsmiddel til én af supernatanterne, idet der 5 blandes og observeres omhyggeligt. Såfremt der iagttages yderligere flokkulering, sættes der mere flokkuleringsmiddel til hovedportionen under omrøring og opretholdelse af en pH-værdi på 7 (denne tilsætning bør være 10 eller 20% af den først tilsatte mængde). Efter 10 minutters blan-10 ding gentages prøveudtagningen og centrifugeringen.

Denne proces gentages, indtil der ikke længere iagttages nogen yderligere flokkulering ved yderligere tilsætning af flokkuleringsmiddel til supernatanten. Når flokkuler ingsmidlet er i overskud, kan den anden udtagede prø-15 ve af supernatanten kontrolleres ved tilsætning af en lille mængde af de oprindelige materialer, der skulle flokku-leres, eller ved tilsætning af fortyndet tanninopløsning.

Ved denne procedure opnås der en god bedømmelse af den optimal mængde flokkuleringsmiddel, der skal an-20 vendes. Hvis biokatalysatoren er et opløseligt, extra-cellulært stof, kan proceduren varieres med hensyn til pH-værdi og kontrol af supernatanterne for biokatalytisk aktivitet, eftersom maksimal udfældning af biokataly- * satoren ikke behøver at falde sammen med maksimal aggre-25 gering af hovedparten af materialet.

Den her anvendte betegnelse "tannin" omfatter såvel den hydrolyserbare som den kondenserede type. Egnede tanninkilder er træet eller barken af kastanien og frøkappen af pekan samt mandelskaller. Quebracho er den fore-30 trukne kilde til tannin, hvilket skyldes økonomiske grunde. Udover qeubracho-tannin er garvesyre (molvægt 3100--3400), gambir-tannin (molvægt ca. 520) og myrobalan--tanniner (molvægt 1900) egnede.

Ved udvælgelse af den bestemte tannin, der skal an-35 vendes, er det ønskeligt at bestemme de relative støkiometriske forhold for det polykationiske flokkuleringsmid-

DK 151636B

7

O

del og tannin med hensyn til deres co-flokkulering og reaktivitet med tværbindingsmidlet.

Polyamin-flokkuleringsmidlets aktivitet med aldehyd kan bestemmes ved en lille modifikation af den for-5 an beskrevne formol-titreringsmetode. I stedet for en prøve på 1 dl af flokkuleringsmiddel skal der anvendes en portion på 3 ml (eller gram), og denne fortyndes med vand til 150-175 ml. Resten af proceduren er den samme, idet den endelige titer udtrykkes som meq/ml eller gram 10 flokkuleringsmiddel.

Co-flokkuleringsækvivalentet af tannin for flok-kuleringsmidlet bestemmes ved en modifikation af den o-venfor beskrevne procedure til bestemmelse af den optimale mængde flokkuleringsmiddel. 1 ml (eller gram) flok-15 kuleringsmiddel fortyndes til 500 ml med vand, og pH-vær-dien indstilles på 7 med 2 N natriumhydroxidopløsning eller med 2 N saltsyreopløsning. Under opretholdelse af en pH-værdi på 7 under omrøring foretages tilsætningen af en 4 g/dl-opløsning af tannin ud fra en kendt mængde, indtil 20 udfældning sker. Efter 10 minutter udtages der to prøver på hver 1,7 ml, og de centrifugeres ved 10.000 G i 5 minutter. Supernatanterne udhældes i små reagensglas, og der foretages yderligere små tilsætninger af fortyndet flokkuleringsmiddel eller af tanninopløsningen, idet 25 der observeres for udfældning til bestemmelse'af det materiale, der er i overskud i opløsningen, tannin eller flokkuleringsmiddel. Tilsætningerne fortsættes, indtil den yderligere tilsætning af tanninopløsning ikke giver nogen yderligere fældning. Den tilsatte mængde tannin kan 30 derpå udtrykkes som ækvivalent til co-flokkulering af 1 ml (eller gram) flokkuleringsmiddel.

Når flokkuleringsmidlet anvendes som dets reaktionsprodukt med tværbindingsmidlet, vil flokkulerings-styrken være noget reduceret i forhold til det uomsatte 35 materiale. Tanninækvivalentet kan bestemmes direkte ved anvendelse af reaktionsproduktet ved den ovenfor omtalte procedure.

O

DK 151636B

8

Anvendelsen af de ovenfor omtalte titreringsmetoder til bestemmelse af mængderne af reagens ville være ønskelige forud for immobiliseringen af kommercielt passende mængder af biokatalysatoren. Når deres anvendelse 5 ikke er praktikabel, kan der imidlertid opnås en tæt tilnærmelse til de optimale mængder ved anvendelse af 0,5--1,0 g tannin pr. liter, 1,0-1,5 g flokkuleringsmiddel pr. liter og 0,7-2,5 g tværbindingsmiddel pr. liter for hver 10 gram pr. liter af materiale, der kan udvindes 10 fra det vandige medium ved flokkulering.

Den her omhandlede fremgangsmåde til biokatalysator-immobilisering har vist sig at være effektiv, uafhængigt af, om biokatalysatoren er i form af hele celler, sprængte celler eller frit enzym. Enzymproducerende mikro-15 organismer (og af disse producerede enzymer), der kan iramo-biliseres ved fremgangsmåden, omfatter Streptomyces olivaceous, S.griseus, S.olivochromogenes, S.phaeochromoge-nes, Bacillus licheniformis, B.amyloliquefaciens, B.coa-gulans, B.awamori, B.subtilis, Aspergillus niger, A.

20 oryzae og Protaminobacter rubrum.

Den praktiske udførelse af den her omhandlede fremgangsmåde belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 pc

Biokatalysatorpartikler fra fermentationsfiltrat (opløseligt enzym)

Et rekonstitueret glucoamylase-filtrat fremstilles ved opløsning af 30 g pulverformigt glucoamylasepræparat 30 i 2000 ml vand. En portion på 1900 ml af den resulterende opløsning flokkuleres med 11 ml af en 5 g/dl-opløs-ning af polyethylenimin i vand ved en pH-værdi indstillet på 7 ved anvendelse af eddikesyre. Denne mængde polyethylenimin (PEI) er i 20%'s overskud i forhold til den

Ofi mængde, der er bestemt som værende nødvendig til flokkuler ing .

DK 151636B

9

O

Til den flokkulerede opslæmning sættes der 9,6 ml af en 4 g/dl-opløsning af garvesyre (NR-kvalitet) i vand.

Dette er den mængde garvesyre, der findes at være ækvivalent til flokkulering af det anvendte overskud af PEI.

_ Glutaraldehyd (3 meq) tilsættes som en fortyn- 0 ding af 0,6 ml 25%'s (w/w) glutaraldehydopløsning i ca. 100 ml vand. Denne mængde er baseret på det støkiometriske krav som bestemt ved formol-titrering.

Den endelige pH-værdi indstilles på fra 6,5 til 7,5 10 under anvendelse af en 1 N natriumhydroxidopløsning, og efter 1 times henstand ved stuetemperatur udvindes de aggregerede faste stoffer ved centrifugering ved ca.

10.000 x G i 15 minutter. De fugtige faste stoffer ekstruderes derpå, og de spaghettiformede partikler tørres 15 i en vakuumovn med en svag indtagning af luft ved 50°C i 16 timer. Det fremkomne, tørrede ekstrudat opbrydes i partikler. Partiklerne viser sig at indeholde den ønskede biokatalytiske aktivitet (glucoamylase), når de anbringes i en opløsning· af 1 g/dl af maltose i 0,1 M natriumace-20 tatpuffer ved en pH-værdi på 4,2 ved 50°C. Den biokatalytiske aktivitet bestemmes ved en forøgelse i koncentrationen af glucose i substratet som bestemt ved kontrol med DEXTROSTIX ^- reagensstrimler. Glucosekoncentrationen stiger fra ca. 0 mg/dl til 20 mg/dl i løbet af 2 minut-25 ter ved stuetemperatur i en blanding af 50 ml.substrat med 200 mg af biokatalysatoren. Blandingen inkuberes derpå under omrøring ved 50°C. Efter 40 minutter er glu-cosekoncentrationen større end 250 mg/dl.

Partiklerne filtreres, vaskes og overføres til en 30 frisk portion af det ovenfor beskrevne substrat, hvor de i-gen udviser den ønskede biokatalytiske aktivitet, ved hvilken glucosekoncentrationen forøges til mere end 250 mg/dl i løbet af 40 minutter. Et inkuberet kontrolsubstrat viser en værdi på ca. 0 mg/dl i løbet af 40 minut-35 ter. Ved fortsat ophold i substratet bibeholder partiklerne deres fysiske integritet uden signifikant blødgø-ring.

DK 151636 B

10 o

Eksempel 2

Biokatalysator-partikler fra hel fermentations-indhøstning 5 I dette eksempel anvendes der portioner af en fer mentering med en mutantstamme af Streptomyces olivaceous indeholdende intracellulær glucoseisomerase. Den tørre vægt af celleindhold er 7,5 g/liter. En formol-titer for reaktionen med formaldehyd ved en pH-værdi på 8,5 bestemmes 10 til at være 7,4 meq/liter.

Der foretages følgende tilsætninger til en portion på 1 liter af fennenteringen: ialt 1,0 g quebracho-ekstrakt-tannin tilsættes efter forudgående opløsning i vand i en koncentration på 4 g/dl. Dette gøres ved den 15 oprindelige pH-værdi på 5,15 for indhøstningen. pH-værdi-en instilles derpå på 9,0 med 2 N natriumhydroxidopløsning.

Et præparat af en epihalohydrin-polyamin-copoly-mer (BETZ 1180 fra Betz-Laboratories, Inc.), i det føl-20 gende betegnet som polyamin-flokkuleringsmiddel, blandes med glutaraldehyd ved tilsætning af polyaminen til en vandig opløsning af glutaraldehyd med en koncentration på ca.

3,5% (w/w). Polyaminen er i forvejen fortyndet i vand til et indhold på ca. 2% faste stoffer, og pH-værdien er ind-25 stillet på 9,0, som opretholdes under tilsætningen af aminen. Den endelige blanding er sammensat af 1,77 g/dl glutaraldehyd og 1,3 g/dl polyamin, der giver et overskud af aldehyd på 0,34 meq. Blandingen af glutaraldehyd og polyamin sættes til den til en pH-værdi på 9 ind-30 stillede fermenteringsindhøstning indeholdende tannin på et niveau på 112,5 ml pr. liter oprindeligt indhøstet rumfang. Dette findes at være det sædvanlige krav til flok-kulering af sådanne fermenteringer. Den endelige glutaral-dehydkoncentration er i overskud i forhold til det stø-35 kiometriske krav med 30 meq/liter.

DK 151636B

11

O

Efter tilsætning af polyamin-glutaraldehyd-adduk-tet indstilles pH-værdien igen på 9. Blandingen henstilles i ca. 3 timer/ og de aggregerede faste stoffer skilles fra ved filtrering under anvendelse af vakuum og opsam-5 les på papirskiver. Den fremkomne filterkage fjernes fra papiret og ekstruderes manuelt under anvendelse af en 10 cm plastsprøjte med en åbning med diameter på 1,5 mm. Ekstrudatet tørres i nogle få timer under et aftræk med moderat luftstrømning og derefter i en ovn med force-10 ret luftgennemstrømning ved 60°C i 8 timer.

Til sammenligning fremstilles der andre præparater, hvor ét af reagenserne er udeladt, eller hvor kun tanninet eller glutaraldehydet anvendes til udvinding af aggregatet. I disse tilfælde er de dannede aggregater of-15 te ikke let udvindelige ved filtrering og centrifugeres og dehydratiseres derfor til sammenlignelige fugtige filterkager ved presning mellem lag af papir. De øvrige betingelser for udvindingen forbliver de samme. Når enten po-lyaminen eller glutaraldehydet udelades, fremstilles ad-20 duktet ikke, men reagenserne anvendes i de samme fortyndinger som addukt-præparatet. Tannin selv evalueres også ved en pH-værdi på 7, hvilket giver bedre flokku-lering end ved en pH-værdi på 9.

De som ovenfor fremstillede tørrede materialer 25 formales forsigtigt manuelt med morter og pistil, og det formalede materiale ledes gennem en nr. 24 mesh Tyler--sigte eller en dermed ækvivalent sigte og opsamles på en nr. 28 mesh Tyler-sigte eller en dermed ækvivalent sigte. Materialet bedømmes for styrke efter rehydratisering i en 30 kompressionscelle, og den relative styrke bestemmes ud fra det arbejde, der er nødvendigt for at komprimere en prøve til en brøkdel af rumfanget af det oprindelige rehydra-tiserede rumfang.

Hårdheden udtrykkes i relation til modstandsdyg-35 tighed mod komprimering for bakteriecelleaggregatpartiklerne. Der anvendes en Instron Universal Tester Model

O

DK 151636 B

12 1102 på en måde svarende til den i USA-patentskrift nr.

3.935.069 beskrevne. Dette instrument kan fås fra In-stron Corporation, Canton, Massachusetts.

Den belastnings- eller prøvecelle, der anvendes 5 i den ovennævnte Instron Tester, består af en transparent acrylplastcylinder med en indre diameter på 4,37 cm, en ydre diameter på 6,54 cm og en højde på 21,8 cm. Bunddelen har et trin med en tykkelse på 0,635 cm med en åbning på 3,81 cm til dannelse af en understøtning for 10 et mikrofilter. Et bekvemt mikrofilter er en spindedyse, der anvendes ved tekstilspinding og har 14.500 åbninger med diameter ca. 0,2032 mm.

Et rustfrit stålstempel af type 304 med diameter 4,3 cm og længde 13,66 cm monteres således, at det kan 15 bevæge sig koaksialt i den nævnte cylinder. Passende tegn er anbragt langs belastningscellen til markering af en prøvedybde på 10,17 cm. Der forefindes også udstyr til påsætning af formindsket tryk eller vakuum ved bunden af belastningscellen og udstyr til opsamling af enhver væs-20 ke, der passerer gennem mikrofilteret.

Hvis en prøve af bakteriecelleaggregat anbringes i den ovennævnte belastningscelle, og der påsættes tryk på prøven gennem stemplet, komprimeres prøven.

Det tryk, der kræves til en given komprimering af 25 prøven, er et udtryk for prøvens hårdhed.

Resultaterne af dette forsøg fremgår af den følgende tabel I: 30 35 13

DK 151636B

O

Tabel I

Relativ

Prøve styrke

Den beskrevne behandling = 100 5 Tannin udeladt 68

Glutaraldehyd udeladt 49

Polyamin udeladt ingen*

Glutaraldehyd alene ingen*

Tannin alene (pH = 9) ingen* 10 Tannin alene (pH = 7) ingen* a disse prøver mister integritet i deres partikler ved rehydratisering og har utilstrækkelig styrke til egentlig afprøvning.

15 Alle de ovennævnte partikler udviser den ønskede biokatalytiske (glucoseisomerase)-aktivitet.

Eksempel 3

Biokatalysator-partikler fra fermenterings-ind- 20 høstning I dette eksempel på udvindingen af en fermentations--indhøstning fra en mutantstamme af Streptomyces olivaceous formindskes glutaraldehyd-overskuddet fra 30 meq/liter til 25 4 meq/liter i den endelige blanding.

Den anvendte metode er tilsætning af kun en del af polyamin-glutaraldehyd-adduktet, efterfulgt af mere polyamin (med samme fortynding) til fremkaldelse af flokkule-ring.

30 Der foretages garvesyretilsætninger på 0,5 g og 1,0 g pr. liter oprindelig indhøstning under anvendelse af en vandig opløsning med 4 g/dl. Andre udvindingsbetingelser er som i det foregående eksempel. De resulterende styrker af de rehydratiserede partikler fremgår af tabel II.

35

O

14

DK 151636 E

Tabel II

Relativ

Prøve styrke

Garvesyre udeladt = 100 5 1 g/liter garvesyrekoncentration 110 0,5 g/liter garvesyrekoncentration 111

Garvesyre udeladt, 30 meq/liter 94 aldehydoverskud 1 g/liter-niveauet for garvesyre er ækvivalent 10 med co-flokkulering af 27% af polyamin-glutaraldehyd-ad-duktet (13,5% for 0,5 g/liter-niveauet).

Alle partiklerne udviser den ønskede biokatalytiske (glucoseisomerase) aktivitet.

15 Eksempel 4

Biokatalysator-partikler fra fermenterings-ind- høstning

En fermenterings-indhøstning af en mutantstamme af 20 Streptomyces olivaceous er udgangsmaterialet ved dette forsøg. Det har et tørcelleindhold på 7,35 g/liter, en pH-værdi på 7,3 og en aldehyd-reaktiv kapacitet på 44,7 meq/liter ved en pH-værdi på 8,5.

En portion på 227 liter af fermenterings-indhøst-25 ningen behandles med 2,5 N natriumhydroxidopløsning til opnåelse af en pH-værdi på 9,0. 25 liter af et polyamin--glutaraldehyd-addukt fremstillet som i eksempel 2 tilsættes derpå gradvist under sammenblanding. Den endelige pH-værdi er 8,8. Efter 1 times forsigtig omrøring udvin-30 (jes (je aggregerede faste stoffer ved filtrering. Den af faste stoffer bestående·filterkage ekstruderes derefter, tørres i en forceret luftstrøm ved 60°C og formales til grove partikler.

På lignende måde sættes der til 257 liter af ind-35 høstningen 257 g quebracho-tanninekstrakt i form af en 3,9 g/dl-opløsning i vand. 1 time efter indblandingen indstilles pH-værdien fra 7,2 til 9,0 med 2,5 N natrium-

O

15

DK 151636B

hydroxidopløsning. Der tilsættes derpå 28,3 liter af po-lyamin-glutaraldehyd-adduktet gradvist og under sammenblanding.

Efter udvinding som ved den første portion uden 5 tannin bedømmes partikler af tilsvarende størrelse med hensyn til mekanisk styrke efter rehydratisering. Prøven uden tannin tildeles en relativ styrke på 100, medens prøven med tannin findes at have en relativ styrke på 190.

Disse partikler udviser den ønskede biokataly-10 tiske (glucoseisomerase) aktivitet.

Eksempel 5

Biokatalysator-partikler fra fermenterings-ind-høstning.

15

Der anvendes en anden fermentering af den i eksempel 4 beskrevne type, hvor tørcelleindholdet er 6,26 g/li-ter, og pH-værdien er 5,3. Indholdet af aldehyd-reaktivt materiale ved en pH-værdi på 8,5 er 32,1 meq/liter. Un-20 der anvendelse af en lignende procedure som i det foregående eksempel findes det, at mængderne af reagenser er som følger:

Portion 1: 200 liter indhøstet materiale 25 18,8 liter polyamin-glutaraldehyd

Portion 2: 189 liter indhøstet materiale 189 g quebracho-tanninekstratet 17,7 liter polyamin-glutaraldehyd 30

Portioner af hver batch med samme partikelstørrelse bedømmes for styrke efter rehydratisering.

Relativ

Prøve styrke 35 Uden tannin = 100

Med tannin-tilsætning_224

Partiklerne udviser den ønskede biokatalytiske (glucoseisomerase) aktivitet.

16

O

DK 1516361

Eksempel 6

Biokatalysator-partikler fra fermenterings-lnd- høstning 5 En fermenterings-indhøstning af en mutantstamme af

Bacillus licheniformis ATCC 31604 dekanteres til adskillelse deraf fra nogle ikke-cellulære, tætte faste stoffer. Det aldehyd-reaktive indhold, bestemt ved formol-titre-ring ved en pH-værdi på 8,5, er 91,3 meq/liter.

10 Der udtages en portion på 500 ml, og pH-værdien ind stilles på 8. Dernæst tilsættes der 150 ml af et polyamin--epihalohydrin og glutaraldehyd addukt som fremstillet i eksempel 2. Denne mængde udgør i nogen grad et overskud i forhold til den mængde, der kræves til den bedste flok-15 kulering. Der tilsættes derpå quebracho-tanninekstrakt i form af 10 ml af en 4 g/dl-opløsning. Efter henstand i 1 time isoleres de aggregerede faste stoffer ved centrifugering og ekstruderes derefter under anvendlese af en plast-sprøjte, og der tørres ved 60°C i en ovn med forceret luft-20 gennemgang.

Der fås partikler ved forsigtig formaling af det tørrede materiale. Når disse partikler rehydratiseres i en 40%'s (w/w) glucoseopløsning, bibeholder de deres fysiske integritet og biokatalytiske (glucoseisomerease) aktivitet 25 efter fortsat nedsænkning ved 70°C i 24 timer.

Eksempel 7

Immobilisering af biomasse Indeholdende palatinose- -dannende enzymaktivitet 30

Der udføres fermenteringsstudier i lille skala i to 14 liters Chemapec LF-14 fermenteringsbeholdere (arbejdsrumfang 10 liter). Hver fermenteringsbeholder er udstyret med apparatur til måling af opløst oxygen og pH og kobles periodisk via rørforbindelser til en Perkin-Elmer MGA-1200 procesgasanalysator til måling af C02, argon, oxygen, nitrogen, H20 og NH3 i den ved fermenteringen udviklede gas. C02 er naturligvis af primær interesse.

O

DK 151636B

17

Fermenteringsmediet består af roetyksaft i en koncentration på 5° Brix, suppleret med 0,1% (NE^j^HPO^ og 2,0% majstøbevæske.

Fermenteringsbeholderen podes med 100 ml af et Prot-5 aminobacter rubrum-podemateriale opnået ved dyrkning af en forrådskultur i det ovenfor beskrevne medium, som dernæst inkuberes ved 30°C under omrøring ved 290 o/min. i en roterende omrører i 24 timer inden podningen. Efter ca. 15 timer udvindes den biomasse, der er anvendt i det påfølgen-10 de stabiliseringsforsøg, fra fermenteringsbeholderen.

En immobiliseringsprocedure (metode 2), der falder inden for den foreliggende opfindelses rammer, og fire metoder, der falder uden for opfindelsens rammer, udføres med den ovenfor beskrevne fermenteringsvæske, hvis 15 formol-titreringsværdi er 0,61 meq/liter.

Immobiliseringsmetoder

Metode 1 500 ml hel fermenteringsvæske indstilles på en pH-20 -værdi på fra 6,5 til 4,95 med 1,0 N NaOH. Hertil sættes der 55 ml glutaraldehyd-polyamin-addukt, der er fremstillet som følger: 1. 11,67 g BETZ 1180 fortyndes til 100 ml i H20.

2. pH-værdien indstilles på 9,0.

25 3. 17,8 ml 25%' s glutaraldehyd fortyndes til 100 ml i H20.

4. BETZ 1180-opløsning sættes langsomt til glutaraldehyd.

5. pH-værdien genindstilles på 9,0.

Herefter får kombinationen lov at reagere ved 25°C 30 il time. ·

Metode 2

Til 500 ml hel fermenteringsvæske sættes der langsomt 12,5 ml af en 4,0 g/dl-opløsning af quebracho-tannin, 35 indtil der sker flokkulering af cellerne. Opløsningen holdes ved 25°C i 30 minutter, hvorpå opløsningens pH-værdi

DK 151636 E

O

18 indstilles på 6,5 med 1,0 N NaOH, og 65 ml af glutaralde-hyd-polyamin-opløsningen, fremstillet som under metode 1, tilsættes. Opløsningen holdes derpå ved 25°C i 1 time.

5 Metode 3

Til 500 ml hel fermenteringsvæske sættes der 12,5 ml 4,0%'s (w/v) quebracho-tannin. Efter indstilling af pH-værdien på 6,5 med 1,0 N NaOH tilsættes der 60 ml 1,67%'s glutaraldehyd, og opløsningen holdes ved 25°C.

10

Metode 4

Til 500 hel fermenteringsvæske sættes der 2,5 ml 10%’s polyethylenimin (PEI). Væsken holdes ved 25°C i 30 minutter. Opløsningens pH-værdi indstilles på 6,5 med 1,0 15 N NaOH, og der tilsættes 50 ml 1,67%'s (w/v) glutaraldehyd. Den fremkomne blanding holdes ved 25°C i 1 time.

Metode 5 500 ml hel femen teringsvæske titreres til en pH-20 -værdi på 5 med en opløsning af 10%'s PEI. Opløsningen holdes ved 25°C i 30 minutter, hvorpå der tilsættes 50 ml 1,67%'s (w/v) glutaraldehyd.

Ved alle de ovennævnte metoder får de flokkulerede celler lov at afsætte sig, og supernatanten dekanteres. Re-25 sten af opslæmningen centrifugeres ved 10.000 o/min. i 10 minutter ved 25°C i en Sorvall RC-2B-centrifuge under anvendelse af et centrifugehovede af typen GSA. Den fikserede, fældede biomasse ekstruderes derpå gennem en standard 100 ml-injektionssprøjte, idet man ved tryk med hånden presser 30 pastaen gennem sprøjteåbningen (1,1-1,5 mm) uden nogen nål eller kanyle påsat derpå. Det spaghetti-lignende ekstru-dat tørres ved 40°C i en tørreovn med forceret luftgennemgang og opbrydes i partikler af passende størrelse til y-derligere afprøvning. Resultaterne af de udførte afprøv-35 ninger er samlet i tabel III.

19

DK 151636B

O

p T3 0 o) a to 4J I p I tu IH I s H W p P Ό id P *

> X O' 0) H tn R

P O <P W ii OH ^

+j - > ld r- m »(ϋ -h ,3 g P S

ro +4 co in - - · ft P ,__g o\o 2 <M CM CM CO co P ^ DO O “i cd cd (0 O o .

+J,y Oj P P ^ 0) x O CD _ 0) P Ό ‘Η Ό ^ CM 94 CD r« -ri G £

i tn S P 3 A

01 P CD M ^

<D id P S ft«cd · S

(OH IS (« ft i! J

,-Ι p CD N Ό P P > CD P CD P C CD OD g g (0 > <D > Ό 0)

§ +J tJi H C! O

φ P 00 CO -¾1 CM fi Φ 0) M CD CD c P 3 P CM LO m cm tog T3 Φ Φ ® tlioio Γ' "Φ Μ1 O H 0) JH Μ -H U>

φ φ g · · σ · · 0' P CH S. O

co h 3. n co ld Η H 0+) 1) 3 Ή U " H p ,¾ cn ft P o S 4-1 P Η I CD O +i · H CD g H Mi<> CO CD c cppoci.cd η h cn Λ ft ti Ί3 CD o a CD w o q P Coi id to +j ® P S N g O}

Ph CO ΐί'ό > P P β CO ,g g +) φ & IH Dl O CD CD “ Μ (U ΛΗ id τί P ' P « <u

+) £2 £ H CD O ffl 1) ft CO

id o i φ o ti ts p p

Ό CD P P P 01 x H CD 3¾ J

3 P P +4 CD P +4 P P PgP^iog p +4 ft P ti ft P <D O Id <D G g

Pia id g -s cd g ti p ηοι·η®φ co o >p p >p c +4 id to to O ω w cdcd S ·η p d> η m

ej x > P cdOiDCD

c g ld cn p ft λ id > «d 3 5 i

• P >s Φ T1 P PP gCDÆP^CD

I (DldFiOCD'S^H

[I4 Td NCPpg^g

Hg OtTifiCDCDPldp^

l> J.H « ftQ 3_ I« H

e cn cn cn ft ti O

O Ό 01 D 3 · ® ® g p ro C O CO CD P φ Μ β P > ti 3.

P CD -P P CM CM I I I g 0) P P O

cn λ \ - - i i i gen φ ,G g ft “ <D o

G P P ft O O φ p in 0) G <D P O

H Iddil ΡΪ>·ΡΦΟΡΙ0φΡ

tnPPgcoGtlo φ uo φ P ra 3 3 P

p p Λ o p s. id ti cd

φ P O LO Η P CD

P φ Ό > fj P p ft cn p c ft +: o ρ g 3 O i φ pgg MPP-HaPCDCCO^ cd > ία σι p t" co co N ® M <d tn φ |z cn »Id P o r·' o h r" PgtdftiPOGQg c p ft - - *· - * οι idocdpo >

ft ·& co co CM CO CO Id CD CO ft U -Η P

OPH » P !> ®V E 3P « h pptd m cd m i d

CD ft ft Φ Ρ Φ G P PP (DCOCDWCDCD (D tdcDtn g P 3 - Pi > P

m P P P g CD P o\° (3 P

h c3tdCD(DPcnO'(d> o Gtstspp^pftp

+J H cm co M1 LO Id 33 COOiTd G G P

(D P P ft CD P CD G -ri Id X

S Ci)PidCQtn>(DC3g^

P CM CO

Claims

20 DK 151636 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller det af denne produce- 5 rede enzym, kendetegnet ved, at man fremstiller et reaktionsprodukt på den måde, at man (a) bringer et vandigt medium indeholdende enzymet eller en masse af bakterieceller med biokatalytisk aktivitet i kontakt med tannin, et kationisk flokkuleringsmiddel i form "•O af en langkædet polyamin og et tværbindingsmiddel, og at man (b) skiller reaktionsproduktet fra det vandige medium og, om ønsket, efterbehandler dette.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at det materiale, der immobiliseres, er et 15 frit enzym.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at det materiale, der immobiliseres, er i form af hele eller sprængte mikroorganismeceller.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n deteg-20 net ved, at der som det kationiske flokkuleringsmiddel anvendes polyacrylamid, polyethylenimin, poly-(2-hydroxy-propyl-l-N-methylammoniumchlorid), poly-(2-hydroxypropyl--1,1-N-dimethylammoniumchlorid), poly-(N-(dimethylamino-methyl)-acrylamid), poly-(diallyldimethylammoniumchlorid), 25 poly-(Ν,Ν-dimethylaminoethyl-methacrylat) eller poly-(N- -dimethylaminopropyl)-methacrylamid.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at der som flokkuleringsmidlet anvendes en vandopløselig, kationisk polymer fremstillet ved polymeri- 30 sation af en epihalohydrin med en alkylenpolyamin med formlen Rj^NRNI^f hvor R er en lavere alkylengruppe med fra 2 til ca. 6 carbonatomer, og R^ og R2 hver for sig er en alkylgruppe med fra 1 til ca. 6 carbonatomer,-idet molforholdet mellem epihalohydrin og polyamin ligger fra ca. 35 0,60:1 til ca. 2,7:1, hvorhos polymerisationen omfatter

21 DK 151636B O omsætning med alkylenpolyaminen af fra ca. 50 til ca. 90% af den mængde epihalohydrin, der skal polymeriseres, idet reaktionen får lov at fortsætte, indtil reaktionsmediet når en praktisk taget ensartet viskositet, og den 5 resterende portion af epihalohydrinen omsættes portionsvis til fremstilling af den kationiske polymer, hvorhos polymerisationstemperaturen ligger fra ca. 60 til ca. 120°C.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at der som tværbindingsmidlet anvendes et multifunktionelt aldehyd, et multifunktionelt halogenid, et multifunktionelt anhydrid, en multifunktionel azofor-bindelse, et multifunktionelt isocyanat, et multifunktionelt isotfiiocyanat eller et dehydrativt kondensationsreak-15 tionsmiddel.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at der som tværbindingsmiddel anvendes glutar-aldehyd.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg 20 net ved, at der anvendes quebracho-tannin.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at der som tannin anvendes garvesyre.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at det kationiske flokkuleringsmiddel og tvær- 25 bindingsmidlet for-reageres til dannelse af et addukt inden deres kontakt med biokatalysatoren.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegne t ved, at den enzymproducerende mikroorganisme er Streptomyces olivaceous, S.griseus, S.olivochromogenes,

30 S.phaeochromogenes, Bacillus licheniformis, B.amyloli-quefaciens, B.coagulans, B.awamori, B.subtilis, Aspergillus niger, A. oryzae eller Protaminobacter rubrum.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til immobilisering af Streptomyces olivaceous, kendetegnet 35 ved, at man i rækkefølge gennemfører følgende trin: O

22 DK 1516361 (a) tilvejebringelse af et vandigt medium indeholdende hele celler af mikroorganismen, (b) tilsætning af quebracho-tannin til det vandige medium, (c) tilsætning af et addukt af glutaraldehyd og en epi-5 halohydrin-polyamin-copolymer til det vandige medium til dannelse af et reaktionsprodukt, (d) fjernelse af reaktionsproduktet fra det vandige medium, og (e) tørring af reaktionsproduktet ved en forhøjet tempe- 10 ratur.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til immobilise ring af Bacillus licheniformis, kendetegnet ved, at man i rækkefølge gennemfører følgende trin: (a) tilvejebringelse af et vandigt medium indeholdende mi- 15 kroorganismecellerne, (b) tilsætning af glutaraldehyd og en epihalohydrin-poly-amin-copolymer til det vandige medium, (c) tilsætning af quebracho-tannin til det vandige medium til dannelse af et reaktionsprodukt, 20 (d) fjernelse af reaktionsproduktet fra det vandige medium, og (e) tørring af reaktionsproduktet ved en forhøjet temperatur.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til immobilisering 25 af Protaminobacter rubrum, kend etegnet ved, at den omfatter følgende trin: (a) tilvejebringelse af et vandigt medium indeholdende mikroorganismecellerne , (b) tilsætning af tannin til det vandige medium, 30 (c) tilsætning af et addukt af glutaraldehyd og en epiha- lohydrin-polyamin-copolymer til det vandige medium til dannelse af et reaktionsprodukt, (d) fjernelse af reaktionsproduktet fra det vandige medium, og 35 (e) tørring af reaktionsproduktet. O

23 DK 151636 B

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, k ende-tegnet ved, at der som tannin anvendes quebracho--tannin, og at dette sættes til det vandige medium inden adduktet. 5 10 15 20 25 30 35