DK157264B - Middel til undersoegelse af biologiske vaev og/eller vaesker - Google Patents

Description

DK 157264 B

Opfindelsen angâr et særligt middel, der er vel- egnet til undersogelse af biologiske væv og/eller væsker, dvs. til at kontrollere tilstedeværelsen af særlige indholdsstoffer i dem, af den type, der indeholder et farvestof valgt blandt xanthen-, azin-, 5 oxazin- eller acridinfarvestofferne eller vandoplose- lige diazofarvestoffer eller triphenylmethan-farve- -5 -4 stoffer i en koncentration af hele midlet pâ 10 -10 M, og en vandig, fysiologisk saltopl0sning, som er isotonisk og forenelig med det biologiske væv og/eller væske. Den angâr ogsâ anvendelsen af det nævnte middel til undersogelse af biologiske væv og/eller væsker. Til fuldstændig forstâelse af den omhandlede opfindelses omrâde og hensigt er det fordelagtigt at betragte visse almene begreber, der udgor det ^ teoretiske grundlag for det betragtede omrâde.

Nâr et stof absorberer synligt eller ultraviolet lys, er det kendt, at en elektron deri gâr fra dens grundtilstand til en exciteret "singlet" tilstand.

Derpâ kan der forekomme intersystematiske over-2° gange med dannelsen af metastabile "triplet" tilstande, hvori elektronen forbliver fangede, indtil deexcitering finder sted ved en st0dproces (ved sammenst0d med et andet molekyle) eller ved lysudsendelse (phosphorescens) eller ved andre processer, der aile er relativt langsom-25 me.

Disse fænomener bestemmes let hos forskellige kategorier naturlige og syntetiske farvestoffer.

En fremgangsmâde der er aiment anvendt til studium og kvantitativ bestemmelse af disse fænomener 30 er £en sâkaldte flash-fotolysemetode, hvori pr0ven der indeholder det stof, der skal unders0ges, udsættes for strâlingen fra en pulslyskilde (flash), der bringer et diskret antal farvede molekyler i den exciterede elektrontilstand.

35 De ovennævnte procèssers for10b observeres ved at bestemme pr0vens absorption af en kontinuert mono-chromatisk lysstrâle, idet denne registreres mod tiden af et passende elektronisk apparat (oscilloskop etc.).

DK 157264 B

2

Denne type fremgangsmâde har de senere âr gen-nemgâet betydelige fremskridt med hensyn til st0rre f01somhed, der kan opnâs ved at anvende pulserede lase-re som exciteringskilden.

Det er ikke kendt at anvende fremgangsmâder af 5 den ovennævnte type til at studere og karakterisere bio^ogiske væv og/eller væsker med den bemærkelses-værdige undtagelse af det tilfælde, hvori vævet, der unders0ges, indeholder en stor mængde fotosensitivt naturligt stof som i tilfældet med pigmenterne fra 10 chlorofylfotosyntese, rhodopsin og carboxyhæmoglobin.

I denne henseende undergâr flashlyset i tilfældet med et væv, der kun er let farvet,fortrinsvis diffusionsprocesser fremfor absorption. Imidlertid kan vævet farves med syntetiske farvestoffer som det 15 er kendt fra observationsmetoder med optisk mikroskop.

I denne henseende betyder det faktum, at det lykkes farvestoffet at farve et væv, at det pâ en eller anden mâde bindes til det.

Der er imidlertid mindst to grundlæggende pro-20 blemer ved anvendelse af flash-fotolyseteknikker i denne sammenhæng i pr0ver med stærke diffusionsvirk-ninger.

For det f0rste,eftersom de bundne farvestofkon-centrationer er temmelig smâ/ har det været tvivlsomt 25 om der=kunne opnâs signifikante signaler ved denne fremgangsmâde. For det andet var det ikke tidligere forudsigeligt, at signaler der stammer fra absorptions-karakteristika i farvestoffets metastabile tilstande ville være forskellige i tilfældet med et farvestof, 30 der er bundet til et særligt væv, fra de der stammer fra molekyler i opl0sning eller er bundet anderledes.

„ Der kendes forskellige freipgangs-mâder til undersogelse af biologiske materialer ved farvning, bestrâling og mâling af spektraldata.

Fra US patentskrift nr. 3.899.297 kendes en fremgangsmâde til karrakterisering af organiske,

DK 157264 B

3 . kemiske forbindelser under anvendelse af biologisk farvning. Ved denne fremgangsmâde udsættes den kemiske forbindelse samtidig for en blanding af mindst 2 forskellige farvestoffer, som bindes til den kemiske forbindelse med forskellige bindingsenergier. Dernæst 5 exciteres en spektralreaktion i den farvede forbindelse ved bestràling, og denne reaktion observeres ved mindst to forskellige bolgelængdebând i spektret, til opnâelse af forskelle i bindingsintensiteter, der er karakteristiske for denne forbindelse.

ΤΟ I US patentskrift nr. 4.094.745 beskrives en fremgangsmâde til hurtig farvning af mikroorga-nismer .med fluorochrome farvestoffer for at gore dem synlige ved U.V.-bestràling og betragtning under mikroskop. Ved denne fremgangsmâde modificeres farve-T5 stofreceptorstederne i mikroorganismer ved behand- ling med phosphat, hvorefter der farves med fluoro-chromfarvestof, der bindes til receptorstederne via phosphatbindeled. Ved denne fremgangsmâde kan man uspecifikt taslle mikroorganismer og desuden 20 skelne levende fra dode organismer.

I B. Romeis, Mikroskopische Technik, 16. udgave, 1968, side 185-93/gives en oversigt over metoder til farvning af levende væv og celler med henblik pâ observation i mikroskop. De omtalte elektive 25 farvemetoder, dvs. farvning af bestemte væv, bygger pâ at visse farvestoffer under visse betingelser bindes til bestemte væv. Disse metoder er derfor besvaerlige og ofte ikke særlig nojagtige.

Der er sâledes behov for en hurtig og effektiv 30 fremgangsmâde til karakterisering af de individuelle celler, der er tilstede i et væv eller en væske; ved hvilken de ovennævnte problemer i forbindelse med flash-fotolysemetoden undgâs.

Det har nu overraskende vist sig 25 at dette opnâs ved at fremstille addukter af det pâgældende indholdsstof i det biologiske væv og/eller vaeske med et farvestof, der er syntetisk eller 4

DK 157264 B

i det mindste ikke til stede i fysiologiske væsker eller opl0sninger, ved at bringe en pr0ve, der skal unders0ges, i kontakt med midlet if0lge opfindelsen, der er ejen-dommeligt ved, at det ogsâ indehglder et stof, der nâr det m0der farvestofmolekylerne er i stand til hurtigt 5 at deexcitere dem (quencher),·og som bestar af kalium- iodid, natriumiodid eller et sait af et paramagnetisk overgangsmetal, idet denne forbindelse foreligger i en koncentration pâ 0,01 til 0,2M.

Som anf0rt bestar præparatet, der danner adduk- ^ tet med det fysiologiske indholdsstof af: a) et farvestof valgt blandt azin-, oxazin-, acridin-eller xanthenrækker- ne eller blandt visse vandopl0selige farvestoffer fra ,,diazo"-rækken eller triphenylmethan, b) et medium, der er foreneligt med det fysiologiske indholdsstof,og som bestâr af en vandig opl0sning, der indeholder forskelli-15 ge salte sâsom NaCl, CaC^ og lignende i en koncentration, sâledes at det er isotonisk med den fysio logiske komponent (0,1 til 1 vægt%) og andre komponen-ter i smâ andele, sâsom glucose, pufferblandinger etc., 2Q der er tilsat for at betinge de tilstedeværende cellers vitalitet, idet mediets pH kan variere i en vis grad omkring neutral (fra pH 4,5 til pH 9,5),og idet der kan tilsættes smâ mængder organiske opl0sningsmidler for at for0ge farvestoffets opl0selighed, samt c) en quencher (dvs. som forârsager hurtig deexcitering af farvestof- molekylerne, nâr de to molekyler st0der sammen), der kan _2 være kalium-(eller natrium·) iodid (fra 10 til 0,2 M) , eller saltet af et paramagnetisk overgangsgruppemetal (fra 10 ^ til 0,2 M Co, Fo, Ni, valgt i form af CoC^ eller lignende), muligvis i nærværelse af et chelateren-de stof sâsom ethylendiaminotetraeddikesyré (EDTA).

Midlet, der er anf0rt ovenfor, anvendes til at udf0re en unders0gelsesmetode for biologiske væv og/eller væsker.

35 5

DK 1S7264 B

Denne fremgangsmâde bestâr i, at pr0ven med stof, der skal unders0ges, f0rst behandles med præparatet, derefter udsættes det resulterende stof for strâling med en f0rste strâle pulslÿs, derefter gennemlyses den 5 sâledes behandlede pr0ve med en anden strâle monochroma-tisk lys, og derefter analyseres den udgâende optiske intensitet af denne sidste som funktion af tiden.

Det har pâ denne mâde vist sig, at de signaler, der stammer fra absorptionen af metastabile tilstande 10 i farvestofmolekyler, der er bundet i de celler, der skal unders0ges, er afgjort forskellige i amplitude og/eller tidsvariation fra de,der stammer fra moleky-lerne i opl0sning eller fra andre celler.

Det lykkes derved ved fremgangsmâden at karakte-15 risere de individuelle celler, der er til stede i væ- vet.

Denne fremgangsmâde har vist sig sasrlig egnet til at unders0ge gærcellekulturer, til at skelne d0de celler fra levende celler,og gærcellerne fra bakterie-20 celler samt ved den kvantitative analyse af blodleuco-cytter.

Fremgangsmâden er pâ den ene side i stand til at give automatiske mâlinger (der blot tager nogle fâ sekunder) som erstatning for lange og besværlige 25 rutineprocedurer, der er n0dvendige i tilfældet med optisk mikroskopi. Den er ogsâ i stand til at angive karakteristika, der ikke kan skelnes med 0jet,angâende farvestoffets specifikke molekylære vekselvirkning med nogle af celleindholdsstofferne.

30 Den kan derfor anvendes til unders0gelser, der for nuværende ikke kan udf0res, eller som kun er rnulige under anvendelse af meget mere komplicerede fremgangs-mâder. Især er det let at forudse dens anvendelse ved tumordiagnose pâ grund af muligheden for kvantitativt 35 at bestemme DNA-farvestofvekselvirkningen.

6

DK 1 ;i 7 2 6 4 B

Figurfortegnelse 5 Fig. 1 viser som et eksempel et diagram af apparatet, der er blevet anvendt ved disse unders0gelser.

Fig. 2 er en graf, der viser resultatet af en mâling af antal dode celler ved hjælp af et middel ifolge opfindelsen angivet ved den transiente absorption 10 som funktion af tiden.

Fig. 3 er en graf, der viser amplityden som funktion af antallet af dode celler ved en mâling som nævnt i forbindelse med fig. 2.

Fig. 4 er en graf, der viser resultatet af 15 en mâling af DNA-mængden i væv under anvendelse af et middel ifolge opfindelsen, angivet ved amplityden som funktion af tiden.

Fig. 5 er en graf, der viser amplityden som funktion af DNA-indholdet ved mâlingen nævnt i forbind-20 else med figur 4.

Fig. 6 er en graf, der viser resultatet af en mâling af monocytantal i blod under anvedelse af et middel ifolge opfindelsen. Grafen viser amplityden som funktion af tiden. AV er propertional med mono-25 cyttallet.

Fig. 7 er en graf, der viser resultatet af en mâling af leucocytantallet i blod under anvendelse af et middel ifolge opfindelsen. Grafen viser amplityden som funktion af tiden og bredden af trinnet svarende 30 til excitationen af triplettilstanden i farvestof-fet har korrelation til leucocytantallet.

35

DK 157264 B

7 I fig. 1 er en, kviksolvlampe, og S2 er en laserstrâ-le. , 1^2 r og er kvartslinser. og M2 er spejle, og D1 og D2 er faststofdetektorer, der registrerer laserpulsen. MC er en h0jlysstyrkes mono-5 chromator. S angiver pr0vens placering, og PM er en fotomultiplikator. Filtre og blændere er udeladte af hensyn til overskueligheden.

Den pulserede lysstrâle blev opnâet fra en Nd-laser, nemlig en kommerciel YAG (Chromatix mod.

10 1000), der udsender lyspulser pâ 0,1 til 0,5 mJ med ca. 150 ns længde og med en gentagelsesfrekvens pâ ca.

50 Hz.

Laserfarven er variabel fra blâ (λ = 473 nm) til nær infrar0d. Observationsstrâlen blev fremstillet 15 med en passende filtreret h0jtrykskviks0lvlampe. Begge strâlerne blev fokuseret i et omrâde af pr0ven med ca.

0,2 mm's diameter, sâledes at der blev dannet en vinkel pâ ca. 15° mellem dem. Pr0vecellen var 2 mm tyk.

Lysen fra lampen paserede gennem en monochromator med 20 stor âbning og blev f0rt til en fotomultiplikator (Philips XP 1113). Det elektriske udgangssignal fra fotomultiplikatoren blev registreret komtinuert som middelværdien og blev ogsâ f0rt til en forforstærker med et bândpas mellem 0,5 kHz og 30 MHz og derpâ for-25 stærketj registreret pâ et digitalt lager og lagret i en lille computer (LABEN 70).

Signalet, der blev opnâet fra en enkelt puis, blev registreret og adderet til det fra hundreder ana-loge puiser. Sâledes blev der opnâet en signalmiddel-30 værdi, hvori st0jen var reduceret med en faktor pâ mere end 10 i forhold til det signal, der fremkominer fra en enkelt puis. Eftersom pulsernes gentagelsesfrekvens var relativt h0j, blev resultatet af mâlingen opnâet pâ blot nogle fâ sekunder. Oplagringen i compu-35 teren gjorde reproduktion og behandling af signalet mulig under anvendelse af magnetbând, plottere osv.

Det lagrede signal indeholder en betydelig mængde data, sâsom absorptionens amplitude ved forskellige

DK 157264 B

8 observationsb0lgelængder og dens variation med tiden.

Hvis denne amplitude er V (λ, t) , er det i almindelighed muligt at fastlægge λ og t sâledes, at: V (λ , t ) = k-, + k» n , hvor n er antallet af ο ο 1 2 c' c 5 celler, der er relevante til formâlet, og k^ og k^ er konstanter, der kan opnâs ved en kalibrering, dvs. ved at indf0re en pr0ve med kendt sammensætning i apparatet.

Eksempel 1

Unders0gelse af cellekulturer. Vitalitetsunders0gelse.

10 Fremgangsmâden anvendes pâ gærkulturer af Saccha romyces- typen, sâsom Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis eller lignende.

ünders0gelsen giver et kvantitativt mal for antallet af d0de celler, der er til stede under gæringen.

15 Eksperimentelt:

Cellepr0ven, der skal unders0ges blandes med -4 en blanding, der indeholder 10 Trypan Blue sammen med,for hver liter,0,1 g NaN3, 6,8 g KI^PO^ indstillet til pH 7,2 med KOH, og 8,76 g NaCl. Der tilsættes CoCl9 o “2 ^ 20 til en endelig koncentration pâ 10 Mi nærværelse af en ligesâ stor kocentration EDTA. Blandingen omr0res i nogle fâ minutter og mâles derpâ med apparatet, der er beskrevet ovenfor.

Pr0ven belyses i en 2 mm celle under anvendelse 25 af den pulserede laser ved λ 659 nm, og absorptions-variationerne ved λ = 405 og 435 nm observeres efter et mikrosekunds forsinkelse fra laserpulsen. Kalibrering er n0dvendig for at mâle den observerede amplitude imod laserpulsens amplitude, den optiske indstilling 30 osv. Til dette formâl anvendes en suspension, hvori gærcellerne tælles og derpâ aile dræbes ved kogning i nogle fâ minutter.

Resultater: I fig. 2 angiver ordinaten den transiente absorp-35 tion (i mV) obeserveret ved λ = 435 nm, nâr en suspension, der indeholder delvist dræbte Saccharomyces lactis celler og Trypan Blue,udsættes for pulseret strâ-

DK 157264 B

9 ling ved λ 659 nm soin beskrevet ovenfor. Abscissen an-giver tiden i mikrosekunder (με).

I fig. 3 angiver ordinaten den transiente amplitude (i mV) observeret efter 1 ys fra begyndelsen af 5 laserpulsen. Abscissen angiver det procentvise indhold af d0de celler i suspensionen aflæst pâ konventionel vis, dvs. ved tælning med optisk mikroskop.

Korrelationen er meget god og muligg0r, at an-tallet af d0de celler kan mâles automatisk pâ blot 10 nogle fâ sekunder. Den opnâelige f01somhed kan variere 3 omkring 100 til 1000 celler/mm , dvs. mindre end 1% af den totale population, der er til stede i gæringsvæsken.

Eksempel 2

Unders0gelse af cellekulturer.

15 Forurening med forskellige stammer.

Det samme middel, der blev anvendt til reak-tionsblandingen i eksempel 1, og som indeholder Trypan Blue/muligg0r, at forskellige typer celler i en gæring kan skelnes. For to forskellige gær af Saccharomyces 20 typen har transienten, der observeres ved λ = 435 nm/ en forskellig variation med tiden, f.eks. er halverings-tiden (dvs. det tidsrum, hvori den transiente amplitude reduceres med en faktor 2) 2,3 μδ for Saccharomyces lactis og 1,7 ps for Saccharomyces fragilis.

25 Der observeres ingen transient hos d0de bakterie- celler af Arthrobacter typen. Fremgangsmâden er derfor velegnet til at unders0ge gærforurening i bakteriekul-turer eller til at skelne mellem forskellige gær. Til dette formâl udtages pr0ven, der skal analyseres, aile 30 cellerne, der er til stede,dræbes ved kogning i nogle fâ minutter, pr0ven behandles derpâ med blandingen, der indeholder farvestoffet, og derefter udf0res mâlinger af amplituden og henfaldstiden for den registrerede transient ved λ = 435 nm, nâr pr0ven belyses med puiser 35 med λ = 650 nm.

DK 15 7 2 6 4 B

·- 10

Eksempel 3 Mâling af DNA mængden, der er til stede i væv.

Fremgangsmâden er egnet til kvantitativ mâling af nucleinsyrer, der er til stede i humane celler. Til 5 denne unders0gelse blev der anvendt hvide blodceller i forskellige præparater.

Pr0ver, der indeholder forskellige celler med let mâlelige mængder DNA, opnâs fra epariniseret humant blod ved kendte. fremgangsmâder, der omfatter centrifu-10 gering i en Ficoll-gradient. En lineær Ficoll-gradient fra 18 til 15% anvendes, cellerne, der er lagdelt pâ gradienten, centrifugeres i 5 minutter ved 50 x g og i 7 minutter ved 250 x g. Der opnâs forskellige bând, der, nâr de renses,indeholder lymfocytter, monocytter 15 og granulocytter med smâ mængder r0de blodlegemer.

De sâledes opnâede hvide celler tælles og analyseres pâ strips med et mikroskop under anvendelse af sædvan-lige metoder. Dette muligg0r, at der kan udf0res en kvantitativ bed0mmelse af det DNA, der findes i pr0-20 ven, eftersom det gennemsnitlige indhold af chromatin i hver type celle er kendt.

De forskellige opnâede fraktioner farves bâde separat og sammenblandet i kendte andele.

For at farve dem centrifugeres cellerne og sus- -5

25 penderes i en opl0sning, der indeholder 5 x 10 M

acridinorange i en fysiologisk opl0sning, der indeholder 0,05 M phosphatpuffer ved pH 7,2 og som ogsâ indeholder 10^2 M CoCl2 og 10~2 M EDTA.

Den opnâede suspension pulsbelyses under anven-30 delse af det tidligere beskrevne apparat ved en b0lge-længde mellem λ = 473 og λ = 532 nm.

Den observeres med kontinuert lys ved λ = 435 nm.

Den samme procedure f01ges for en pr0ve, der indeholder de samme reagenser men uden farvestoffet.

35 Denne sidste operation er n0dvendig eftersom smâ tilste-deværende mængder carboxyhæmoglobin kunne bidrage til den transiente absorption.

Transienten, der opnâs under anvendelse af pr0-

DK 157264 B

' 11 ven uden farvestoffet, subtraheres fra den der opnâs med den fuldstændige blanding til opnâelse af resultatet, der er vist i fig. 4.

Ordinaten angiver transientens amplitude (i mV) 5 og abscissen tiden i us,

Den transiente absorptionsvariation observeres ved λ = 435 nm under belysning af en suspension , der indeholder humane granulocytter og acridinorange ved λ = 532 nm som beskrevet tidligere.

10 Pulsens amplitude 1 μs efter belysning med lase- ren er proportional med pr0vens DNA-indhold som vist i fig. 5. I denne figur vises transientens amplitude (i mV) som funktion af DNA-indholdet (udtrykt som mg/1) for forskellige typer celler, nemlig lymfocytter og 15 monocytter i forskellige forhold,eller monocytter alene, eller granulocytter alene,eller udelukkende leucocytter.

Pr0verne indeholder variable mængder erythrocyt-ter og stammer fra forskellige donorer.

Det faktum, at denne proportionalitet opnâs 20 for forskellige indhold af forskellige celler, der er indsamlet fra forskellige individer, g0r det sandsyn-ligt, at fremgangsmâden ogsâ med tillid kan anvendes til biologisk væv af anden oprindelse sâsom epitel-væv etc.

25 Mâlingen af DNA-indholdet sammen med mâlingen af antallet af celier,der er til stede i vævet kunne være væsentlig ved den tidlige diagnose af cancertilstan-de.

Eksempel 4 30 Karakterisation af leucocytter i humant blod.

Fremgangsmâden anvendes til blodpr0ver, der er blevet gjort ikke-klumpende.

Fremgangsmâden giver en kvantitativ bed0mmelse af det totale antal leucocytter og antallet af granulo-35 cytter, monocytter og lymfocytter.

Eksperimentelt.

En pr0ve humant veneblod, der er blevet gjort

DK 157264 B

12 ikke-klumpende med heparin i en koncentration pâ 0,1 til 0,2 mg/ml blod,eller med natrium-EDTA i en koncentration pâ 1 mg/ml,tilsættes en 3,5% opl0sning af dextran (molvægt 250.000) indtil en endelig koncentra-5 tion pâ 1,5%, blandingen holdes derpâ i en termostat ved 37°C i 20 minutter. Den 0verstliggende væske fjer-nes, hvilken væske indeholder de hvide celler og ca.

1% af de r0de celler, og der tilsættes destilleret vand for at sænke saltkoncentrationen til 0,25 °/oo (tusinde-10 dele). Efter n0jagtig 30 sekunder genoprettes den iso-toniske karakter ved tilsætning af 3,5 °/oo vandig NaCl.

Cellerne opsamles ved centrifugering ved 400 g (tyngdeacceleration) i 5 minutter og opslemmes derpâ i vandig 0,9% NaCl eller phosphatpuffer pH 7,1, 0,1 M 15 i et sâdant rumfang, at antallet af lymfocytter er 3 omkring 8000 pr. mm . Udvindingen af leucocytterne er ca. 95% med en procentvis sammensætning, der ikke kan skelnes fra blods, de r0de celler, der bliver tilbage, findes i et forhold pâ ca. 1:1 med de hvide celler.

20 Mâlingerne udf0res pâ 200 mikroliter cellesuspension i en celle med 2 mm's optisk vej, hvortil der tilsættes farvestof og en st0ddonor; cellerne kan være fikserede forinden.

Mere specielt er de f0lgende indfarvningstek- 25 nikker blevet anvendt.

Til cellesuspensionen sættes CoCl2“EDTA-st0ddono- ren plus Brilliant Green i en endelig koncentration pâ -2 -4 henholdsvis 10 og 9 x 10 M. En anden indfarvnings-teknik er at fiksere cellerne med éthanol ved en ende-30 lig koncentration pâ 12 °/oo (tusindedele). Efter 1 minut tilsættes CoCl^-EDTA og Brilliant Cresyl Blue ^ o —2 i en endelig koncentration pâ henholdsvis 10 og 5 x —5 10 M. En tredie indfarvningsmetode, der viste sig anvendelig, er som den anden der er beskrevet her, men 35 farvestoffet er Nile Blue ved 8 x 10 ** M.

De sâledes opnâede pr0ver belyses derefter med det pulserede lasersystem, der er beskrevet i den ind-ledende del af denne beskrivelse,ved λ = 659 nm og ob-

DK 157264 B

13 serveres med monochromatisk lys ved λ = 435 nm og der-efter λ = 547 nm. Med to forskellige indfarvningstek-nikker kan der sâledes opnâs fire forskellige transien-ter, hvis karakteristika er sâledes, at de korreleres 5 med de st0rrelser, der skal mâles.

Resultater:

Observationen af de sâledes behandlede blodpr0-ver korreleres med det der opnâs med de konventionelle metoder, dvs. ved mikroskopiske observationer af hel-10 blodsstreger.

I fig. 6 og 7 er der som eksempel anf0rt nogle fâ sâdanne transienter. Nærmere viser fig. 6 amplituden i mV,som observeret ved λ = 547 nm,i pr0ven, der var farvet med Brilliant Cresyl Blue og fikseret med etha-15 nol, abscissen viser tiden i ys. Amplituden AV som mâlt i figuren mellem toppen og værdien efter lang tid er proportional med det totale antal monocytter. Det b0r bemærkes, at i dette eksempel er tilstedeværelsen af Co-EDTA væsentlig for at bestemme oph0ret af signa-20 lerne, der kommer fra andre celler eller fra de frie farvestoffer. Fig. 7 viser transienten,som observeret ved λ = 435 nmri pr0ven, der var farvet med Brilliant Green (ordinaten er i mV og abscissen i ys som i det foregâende tilfælde). Bredden af det trin, der svarer 25 til excitationen af triplettilstanden i farvestoffet, der formodentlig er bundet til den cellulare kerne, som observeret pâ mikroskopet,kan korreleres godt med det totale antal leucocytter.

Henfaldets udvikling er endvidere tof aset, som 30 det ses i figuren. Det hurtige trin, der bekvemt mâles bâde ved λ = 435 nm og λ = 547 nm(.er# endeligt, propor-tionalt med antallet af lymfocytter. Sâledes er aile de tre uafhængige paramétré (antallet af lymfocytter (1), antallet af monocytter (n) og antallet af granu-35 locytter (g)) blevet bestemt,idet det totale antal leucocytter (n) er lig med summen af de tre, dvs. n = 1+m+g.

Det b0r bemærkes, at kun en lille del af den information, der er indeholdt i de registrerede kurver

Claims (2)

1. Midd'el til undersogelse af indholdsstoffer 10 i biologiske væv og/eller væsker indeholdende: a) et farvestof valgt blandt xanthen-, azin-, oxazin-eller acridinfarvestofferne eller vandoploselige diazofarvestoffer eller triphenylmethan-farvestoffer -5 -4 i en koncentration af hele midlet pa 10 -10 M, og 15 b) en vandig, fysiologisk saltoplesning, soin er isotonisk og forenelig med det biologiske væv og/eller væske, kendetegnet ved, at det ogsâ inde-holder et stof, der,nâr det moder farvestofmole-kylernefer i stand til hurtigt at deexcitere dem 20 (quencher), og som bestâr af kaliumiodid, natriumiodid eller et sait af et paramagnetisk overgangsmetal, idet denne forbindelse foreligger i en koncentration pâ 0,01 til 0,2M.

2. Anvendelse af midlet ifelge krav 1 til 25 undersogelse af biologiske væv og/eller væsker. 30 35