DK156925B - Analytisk multilagsmateriale, dets fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

1 DK 156925 B

0

Opfindelsen angâr et analytisk multilagsmateriale, dets fremstilling og anvendelse.

Opfindelsen angâr sâledes det omrâde af teknikken, der omfatter analytiske testmaterialer og -metoder af den art, der 5 anvendes i manuelle og automatiserede diagnostiske systemer, navnlig analytiske multilagsmaterialer, der kan anvendes til den kvalitative og kvantitative bestemmelse af legemsvæskebe-standdele og medikamenter, der er til stede i sâdanne legems-væsker.

10 Testmaterialer i form af teststrimler og lignende ana lytiske materialer pâ fast form er blevet almindelige ved ana-lysen af forskellige typer pr0ver, især biologiske fluida. Teststrimler, der er udformet til detektering af klinisk sig-nifikante stoffer i biologiske fluida, f.eks. sérum og urin, 15 har været fordelagtige ved diagnosen af sygdomme.

Teststrimler af forskellige typer har været kendt og an-vendt i mange âr pâ et stort antal omrâder, lige fra de mest almindelige pH-testpapirmaterialer til diagnostiske in vitro--materialer til detektering af forskellige urin- og biodbe-20 standdele, f.eks. glucose, protein og okkult blod, f.eks. som beskrevet i USA-patentskrifterne nr. 3.164.534, 3.485.587 og 3.012.976. De reagensmaterialer, der findes i sâdanne teststrimler, har ofte begrænset sensitivitet, reagerer med be-standdelen eller -delene, som skal bestemmes, ved direkte ke-25 misk reaktion, og anvendes til detektering af stoffer, der er til stede i flydende pr0ver i koncentrationer i det millimolæ-re omrâde eller derover.

(a) Analytiske multilagsmaterialer 30 Et grundlæggende intégrait analytisk multilagsmateriale er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.092.465. I sâdanne multilagsmaterialer anvendes der en absorberende fibr0s bærer im-prægneret med et eller flere reagenser, typisk omfattende en farvedanner, hvorover der som overtræk er anbragt en semiper-36 meabel membran. Ved kontakt med en testvæske passerer der ana-lyt gennem membranen og ind i den fibr0se bærer til frembringel-se af farve i en mængde, der er relateret til analyt-koncentra- 0 2

DK 156925 B

tionen. Membranen hindrer passage og absorption af visse in-terfererende bestanddele sâsom r0de blodlegemer, der kunne hindre n0jagtig aflæsning af den farve, der fremkommer som et testresultat.

5 André intégrale analytiske multilagsmaterialer er be- skrevet i USA-patentskrift nr. 3.992.158. Sâdanne materialer kan modtage en flydende pr0ve og sprede pr0ven i et spred-ningslag i materialet til opnâelse deri af en tilsyneladende ensartet koncentration af analyt, anden passende pr0vebestand-10 del eller analytprodukt, og der fremkommer i nærværelse af analyt et analytisk résultat, der kan mâles kvantitativt med automatiske apparater under anvendelse af f.eks. spektrofoto-metri eller fluorometri. Sâdanne materialer kan omfatte spred-ningslag og reagenslag, der indeholder et reaktivt eller pâ 15 anden mâde interaktivt materiale, der pâ grund af sin aktivi-tet fremmer en radiometrisk detekterbar ændring, f.eks. en far-veændring, i materialet.

I USA-patentskrift nr. 4.042.335 er der beskrevet et materiale med (1) et reagenslag, der reagerer med analyten til dan-20 nelse af et diffusibelt, detekterbart produkt, (2) et ikke-fi-br0st strâleblokerende lag, der er permeabelt for det detek-terbare produkt og indeholder et opakiseringsmiddel, og (3) et ikke-fibr0st, strâlingstransmitterende registreringslag, i hvil-ket det detekterbare produkt detekteres. Aflæsningen pâ mate-25 rialet foretages sâledes fra neden.

I USA-patentskrift nr. 4.066.403 (Re 30.267) er der beskrevet et materiale, der omfatter (1) et reagens, der reagerer med analyten til dannelse af et nedbrydningsprodukt, og (2) et reagens, som reagerer med nedbrydningsproduktet eller et in-30 termediat til fremkaldelse af en detekterbar ændring, idet der som en forbedring findes et barrieremateriale, der adskiller reagens (1) fra reagens (2) og er i det væsentlige ensartet -permeabelt for nedbrydningsproduktet og i det væsentlige impermea-belt for interfererende stoffer. Der er sâledes taie om indf0-35 ring af et "filtreringslag" mellem "reagenslaget" og "registre-rings laget" .

DK 156925 B

0 3 I USA-patentskrift nr. 4.144.306 er der beskrevet et ma-teriale, i hvilket reagenslaget indeholder et ikke-diffusibelt materiale omfattende en i forvejen dannet, detekterbar del, som frig0res og bliver diffusibel i nærværelse af analyten. Regi-5 streringslaget modtager det diffusible produkt. Lag inden i materialet er sâledes sammensat, at den i forvejen dannede, detekterbare del, der frig0res fra reagenslaget, kan detekte-res selektivt inden i materialet.

I USA-patentskrift nr. 4.166.093 er der beskrevet et ma-10 teriale med (1) et strâlingstransmitterende reagenslag, der rea-gerer med en analyt til frembringelse af et detekterbart produkt, og (2) et por0st, strâlingsblokerende lag, som er permea-belt for analyten. Som en forbedring indeholder materialet og-sâ (3) et strâlingstransmitterende lag, der inhiberer migrais tionen af detekterbart produkt, mellem reagenslaget og det po-r0se, strâlingsblokerende lag. Laget, der inhiberer migratio-nen, er permeabelt for analyten og inhiberer migrationen af det detekterbare produkt til det strâlingsblokerende lag.

20 (b) Specifikt bindingsbestemmelsesmateriale

Testmaterialer med fast fase er blevet anvendt i forbin-delse med heterogene specifikke bindingsbestemmelser i fors0g pâ at overvinde ubekvemmelighederne og ulemperne ved det n0d-vendige adskillelsestrin. Et almindeligt anvendt materiale med 25 fast fase af denne type omfatter en ikke-por0s overflade, f.eks. de.n indre overflade af et reagensglas eller en anden beholder, hvortil antistof er fastgjort, eller hvorpâ antistof er over-trukket ved adsorption eller covalent kobling. USA-patentskrif-terne nr. 3.826.619, 4.001.583, 4.017.597 og 4.105.410 vedr0-30 rer anvendelsen af med antistof overtrukne reagensglas ved ra-dioimmunobestemmelser. Testmaterialer med fast fase er ogsâ blevet anvendt ved heterogene enzym-immunobestemmelser, jfr. USA--patentskrifterne nr. 4.016.043 og 4.147.752, og ved heterogene fluorescens-immunobestemmelser, jfr. USA-patentskrifterne 35 nr. 4.025.310 og 4.056.724 samt britisk patentskrift nr.

1.552.374.

0 4

DK 156925 B

Anvendelsen af sâdanne heterogene specifikke bindings-bestemmelses-testmaterialer eksemplificeres ved fremgangsraâden if0lge USA-patentskrift nr. 4.135.884, der vedr0rer en sâkaldt "gamma stick". Testmaterialet inkorporeres med antistofreagen-5 set og bringes i kontakt med den flydende pr0ve eller med de resterende reagenser i reaktionssystemet, f0rst og fremmest mærknings-konjugatet. Efter en inkubationsperiode fjernes ma-terialet med den faste fase fysisk fra reaktionsopl0sningen, og mærkningen mâles enten i opl0sningen eller pâ testmaterialet.

10 Lignende materialer, hvor antistof-reagenset er inde- sluttet i en matrix/ sâsom en gel eller et papirvæv, er beskrevet i USA-patentskrifternes nr. 3.925.017, 3.970.429, 4.138.474, 3.966.897, 3.981.981 og 3.888.629 og DE-OS 2.241.646. Ligele-des kendes der materialer til anvendelse ved heterogene speci-15 fikke bindingsbestemmelser, hvori antistofreagenset er fikseret til en matrix, der holdes i en gennemstr0mningskolonne, jfr. USA-patentskrifterne nr. 41036.947, 4.039.652, 4.059.684, 4.153.675 og 4.166.102. Testmaterialet er sædvanligvis inkor-poreret med mindre end aile de n0dvendige reagenser til udf0-20 relse af bestemmelsen og er blot et middel til at g0re det n0d-vendige adskillelsestrin mere bekvemt at udf0re.

Endelig er der blevet beskrevet heterogene specifikke bindingsbestemmelses-testmaterialer, i hvilke de fleste eller aile de n0dvendige reagenser er inkorporeret med det sairane bæ-25 remateriale, og hvori reagens/pr0ve-kontakter og adskillelse af de frie og bundne faser udf0res ved kapillær migration langs bærematerialet, jfr. USA-patentskrifterne nr. 3.641.235, 4.094.647 og 4.168.146. De materialer, der er beskrevet i disse patentskrifter, betragtes almindeligvis som vanskelige at frem-30 stille og som tilb0jelige til ikke-reproducerbarhed pâ grund af den komplekse natur af de mange kemiske og fysiske interak-tioner, der finder sted langs bærematerialet under udf0relsen af en bestemmelse. Et yderligere fors0g pâ at tilvejebringe et heterogent immunobestemmelsesmateriale er eksempelvis angivet 35 i EP-ans0gning nr. 0.013.136.

0 5

DK 156925 B

Anvendelsen af homogène specifikke bindingsbestemmel-ses-reagenssystemer i forbindelse med testmaterialer med fast fase ville give store fordele for den, der rutinemæssigt anven-der sâdanne bestemmelsessystemer. Bestemmelsen af ligander, der 5 forekommer i meget lave koncentrationer i flydende pr0ver, ville blive forenklet til de trin, der omfatter kontakt mellem ma-terialet og pr0ven, samt mâling, enten ved visuel iagttagelse el-ler ved hjælp af instrumenter, af det resulterende signal. Rea-genser ville kunne anvendes i fast form uden n0dvendigheden af 10 at opbevare, dispensere eller blande flydende reagenser som pâkrævet ved anvendelse af de test-sæt, der er omfattet af den kendte teknik. Materialer med fast fase ville ogsâ være langt mere egnede til automatisering end de fra teknikkens stade kendte flydende systemer.

15 X britisk patentskrift nr. 1.552.607 er der beskrevet homogène specifikke bindingsbestemmelsessystemer under anvendelse af forskellige nye mærkninger, herunder kemoluminiscerende mærkninger, enzymsubstrat-mærkninger og coenzym-mærkninger. Pâ side 23, linie 12 ff. i dette patentskrift foreslâs det at in-20 korporere bestemmelsesreagenserne med forskellige bærere, herunder væskeholdige beholdere eller uopl0selige, por0se og for-trinsvis absorberende matricer, fiberskind, eller flokkulerende materialer, geler og lignende. Der er ikke taie om nogen detal-jeret angivelse af, hvorledes man kan anvende homogène speci-25 fikke bindingsbestemmelses-reagenssystemer i forbindelse med testmaterialer i fast tilstand.

I DE-A 2.537.275 er der beskrevet et homogent specifikt bindingsbestemmelses-reagenssystem, og der er taie om muligheden for at anvende plader eller strimler inkorporeret med antistof 30 til udf0relse af bestemmelsen. If0lge dette forslag blandes mærkningskonjugatet f0rst med pr0ven, hvorpâ det med antistof inkorporerede testmateriale bringes i kontakt med reaktiçns-blandingen. Efter en passende inkubationstid foreslâs det, at testmaterialet skylles med puffer og t0rres, hvorefter signa-35 let (fluorescens) mâles. Den nævnte publikation omhandler sâle- 0 6

DK 156925 B

des et testraateriale og en bestemmelsesmetode, der meget lig ner de materialer og metoder, der allerede er kendt i forbin-delse med heterogene specifikke bindingsbestemmelsesmetoder, hvor testmaterialet neddyppes i den flydende reaktionsblanding, 5 inkuberes og derpâ fjernesog vaskes, og aflæsning foretages. Des-uden indeholder det foreslâede testraateriale ikke aile bindings-bestemmelses-reagenserne i bærematerialet. Specielt foreslâs det, at kun antistoffet inkorporeres med bærematerialet, idet mærk-ningskonjugatet sættes særskilt til pr0ven, der skal bestemmes, 10 inden kontakt med det foreslâede testmateriale.

Problemer, der eksisterer i forbindelse med materialerne if0lge den kendte teknik, er blevet erkendt og undgâet eller overvundet med det analytiske multilagsmateriale if0lge den fo-religgende opfindelse. Blokeringslag, der anvendes i materialer 15 if0lge den kendte teknik, skal være permeable for liganden, reagenser fra reagenslaget eller produkter fra deres indbyrdes reaktion, eftersom materialets respons aflæses fra materiale-overfladen bort fra reagenslaget, dvs. overfladen af underst0t-ningslaget.

20 Problemet er, at elektromagnetisk strâling som den, der udsendes i reflektans- og fluorescens-systemer, pâvirkes af un-derst0tningslag, f.eks. polystyren- eller polyesterlag, gennem hvilke strâlingen skal passere i disse materialer h0rende til den kendte teknik. En del af den elektromagnetiske strâling, 25 f.eks. lys, der passerer gennem underst0tningslaget, opfanges inden i laget. Det virker sâledes i virkeligheden som en fiber-optik. Mængden af elektromagnetisk strâling som sâdan, f.eks. lys, der detekteres, viser ikke n0jagtigt den mængde, der er et résultat af den reaktion, der har fundet sted i materialet. Do-30 sis-respons-resultater og lignende repræsenterer derfor ikke fuldstændigt mængden af elektromagnetisk strâling fra det af-givne respons i liganden i reagenslaget. I tilfælde af materialer, for hvilke der foretages aflæsning under anvendelse af fluorescens-systemer, opfanges der en konstant mængde emitteret 35 lys, og dette problem har sâledes en mere udtalt virkning pâ pâ- 7 0

DK 156925 B

lideligheden af resultater opnâet ved lave ligandkoncentratio-ner. I tilfælde af materialer, for hvilke der aflæses under anvendelse af reflektans-systemer, er problemet mere alvorligt ved h0je ligandkoncentrationer.

5 Disse problemer undgâs eller overvindes i det analytiske multilagsmateriale if01ge den foreliggende opfindelse. Ved overvindelsen af disse problemer udsender materialet if0lge op-findelsen et for0get elektromagnetisk respons eller signal, sammenlignet med materialerne if0lge den kendte teknik. Det er 10 endnu mere bemærkelsesværdigt, at forholdet S/B mellem signalud-strâling (S) og baggrundudstrâling (B) for0ges derved, at in-terfererende baggrundstrâling undgâs, med en faktor pâ i det mindste en st0rrelsesorden (10 gange) som illustreret i de f0lgende eksempler.

15 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse til- vejebringes der sâledes et analytisk multilagsmateriale til de-tektering af en ligand i eller ligandbindingskapaciteten af en flydende pr0ve, hvilket materiale er af den type, der har et reagenslag med inkorporerede reagenserder giver respons pâ 20 liganden i eller ligandbindingskapaciteten i pr0ven til afgi-velse af et detekterbart respons, et strâlingsdiffuserende, og -blokerende lag samt et underst0tningslag, og dette mate-riale er if01ge opfindelsen ejendommeligt ved, at det strâlingsdif fuserende og -blokerende lag er (a) indskudt mellem 25 reagenslaget og underst0tningslaget, er (b) impermeabelt for liganden, reagenser nærværende i reagenslaget og produkter fra deres interaktion, er (c) indifferente over for liganden, reagenser nærværende i reagenslaget og produkter fra deres interaktion, (d) har en tykkelse mellem 0,0005 og 0,05 cm 30 og (e) er opakt og indeholder et for strâling impermeabelt pigment.

Fremgangsmâden til fremstilling af multilagsmaterialet if01ge opfindelsen er ejendommelig ved, at denne omfatter f01gende trin: 35 8 0

DK 156925 B

(1) fiksering af en overflade af underst0tningslaget til en overflade af et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, der er: (a) impermeabelt for liganden, reagenser i reagenslaget 5 og produkter fra deres interaktion og er (b) indifferent over for liganden, reagenser i reagenslaget og produkter fra deres interaktion, samt (c) fiksering af en overflade af reagenslaget til den modsatte overflade af det strâlingsdiffuserende og 10 -blokerende lag.

Fremgangsmâden if0lge opfindelsen til detektering af en ligand i eller ligandbindingskapaciteten af en flydende prrtve, ved hvilken fremgangsmâde man bringer pr0ven i kontakt med,. et analytisk multilagsmateriale af den type, der har et reagenslag med inkorporerede reagenser, der giver respons 15 pâ liganden i eller ligandbindingskapaciteten af pr0ven til frembringelse af et detekterbart respons, et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag samt et underst0tningslag, er ejendommelig ved, at der anvendes et analytisk multilags-materiale if0lge opfindelsen.

Pâ tegningen viser fig. 1-2 grafiske afbildninger af data, der er fremkommet ved de fors0g, der er beskrevet i eksempel 1.

Fig. 3 illustrerer den fremgangsmâde, der anvendes til at fremstille konjugatet som anvendt i eksempel 2.

Fig. 4 viser et billede i tværsnit af et analytisk theophyllin-materiale, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 2.

Fig. 5-6 viser grafiske afbildninger af data, der er opnâet ved de fors0g, der er beskrevet i eksempel 2.

35

9 DK 156925 B

0 1. Ligander.

Betegnelsen "ligand" anvendes til at betegne legemsvæske--bestanddele og medikamenter eller andre stoffer, der er til ste-de i sâdanne legemsvæsker. I de fplgende eksempler er der angi-5 vet et antal sâdanne mulige ligander.

Der kendes reagensmaterialer for blod-, plasma- eller sérum-ligander, f.eks. ascorbinsyre, galdesyrer, bilirubin, cholestérol, creatinin, glucose, mælkesyre, phospholipider, tri-glycerider, urinstof-nitrogen (BUN) og urinsyre. Vigtig er ogsâ 10 .bestemmelsen af blodkemiske enzym-ligander sâsom amylase, cho linestérase, creatinin-phosphokinase (CPK), dehydrogenaserne (hydroxysm0rsyre, isocitronsyre, mælkesyre og æblesyre), lipase, phenylalanin, transaminaserne (glutaminsyre-oxaleddikesyre og glutaminsyre-pyrodruesyre), sure og alkaliske phosphataser, 15 gamma-glutamyl-transpeptidase, leucin-aminopeptidase og erythro-cyt-enzymerne (glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 6-phosphoglu-conat-dehydrogenase, glutathion-reductase og pyrubat-kinase). Afpr0vning er ogsâ mulig for blodprotein-ligander sâsom albumin, cryoglobiner, komponenter af koagulationssystemerne og de fi-20 brinolytiske systemer, komplementfaktorer og de cellulære og sérum-immun-effektorer sâsom interferon og immunoglobiner, hvil-ket er nærmere omhandlet i det f0lgende i forbindelse med homogène specifikke bindingsbestemmelser.

Der kendes ligeledes reagensmaterialer til urinkemiske 25 bestemmelser. Inden for urinkemien omfatter sâdanne ligander almindeligvis ascorbinsyre, albumin, creatin, creatinin, glucose, galdesyrer, bilirubin, protein, ketoner, okkult blod, nitrit, amylase og phenylpyrodruesyre.

Det her omhandlede bestemmelsesmateriale kan ogsâ an-30 vendes til detektering af enhver ligand, for hvilken der fin-des en specifik bindingspartner, samt omvendt til detektering af kapaciteten af et flydende medium til binding af en ligand (sædvanligvis pâ grund af nærværelsen af en bindingspartner for liganden i mediet). Liganden er almindeligvis et peptid, 35 polypeptid, protein, carbonhydrat, glycoprotein, steroid el- i 10 0

DK 156925 B

1er et andet organisk molekyle, for hvilket der eksisterer en specifik bindingspartner i biologiske systemer, eller for hvil-ke en sâdan kan syntetiseres. Funktionelt udtrykt udvælges li-ganden sædvanligvis fra gruppen omfattende antigener og anti-5 stoffer dertil, haptener og antistoffer dertil, samt hormoner, vitaminer, metaboliter og farmakologiske midler og deres re-ceptorer og bindingsstoffer. Sædvanligvis er liganden et iirotm-nologisk aktivt polypeptid eller protein raed en molekylvægt mellem 1.000 og 10.000.000, f.eks. et antistof- eller antigent 10 polypeptid eller protein, eller et hapten med en molekylvægt mellem 100 og 1500.

Repræsentâtive polypeptid-ligander er angiotensin I og II, C-peptid, oxytocin, vasopressin, neurophysin, gastrin, secretin, bradykinnin og glucagon.

15 Repræsentative protein-ligander omfatter klasserne af protaminer, mucoproteiner, glycoproteiner, globuliner, albumi-ner, scleroproteiner, phosphoproteiner, histoner, lipoprotei-ner, chromoproteiner og nucleoproteiner. Eksempler pâ specifik-ke proteiner er præalbumin, α^-lipoprotéin, human serumalbumin, 20 α^-glycoprotein, transcortin, thyroxin-bindende globulin, hap-toglobin, hæmoglobin, myoglobin, ceruloplasmin, c^-lipoprotein, c^-macroglobulin, β-liproprotein, erythroprotein, transferrin, homopexin, fibrinogen, immunoglobulinerne sâsom IgG, IgM, IgA,

IgD og IgE og deres fragmenter, f.eks. F og F , , komplement-25 faktorer, prolactin, blodkoagulationsfaktorer sâsom fibrinogen og thrombin, insulin, melanotropin, somatotropin, thyreotropin, follikelstimulerende hormon, leutiniserende hormon, gonadotro-pin, thyreoidstimulerende hormon, placentalt lactogen, intrisic faktor, transcobalamin, serumenzymer sâsom alkaliske phospha-30 taser, cholinestérase, glutaminsyre-oxaleddikesyre-transamina-se, glutaminsyre-pyrodruesyre-transaminase, uropepsin, endor-phiner, encephaliner, protamin, vævsantigener, bakterielle antigener og virale antigener sâsom hepatitis-associerede antigener, f.eks. HB Ag, HB AG og HB Ag.

S C 6 35 11 0

DK 156925 B

Repræsentative hapten-ligander omfatter f.eks. de generelle klasser af lægemidler, metaboliter, hormoner og vitaminer. Hapteniske hormoner omfatter thyroxin og triiodthyronin. Vitaminerne omfatter vitamin A, B, s f.eks. * C, D, E og K, folinsyre og thiamin. Lægemidlerne omfatter antibiotica sâsom aminoglycosider, f.eks. gentamycin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin samt netilmecin, penicillin, tetracyclin, terramycin, chlormycetin og actinomy-cetin, endvidere nucleosider og nucleotider sâsom adenosindi-10 phosphat (ADP), adenosintriphosphat (ATP), flavinmononucleotid (FMN), nicotinamid-adenindinucleotid (NAD) og dets phosphatde-rivât (NADP), thymidin, guanosin og adenosin, prostaglandiner, steroider sâsom estrogenerne, f.eks. estriol og estradiol, ste-rogener, androgener, digoxin, digitoxin og adrenocorticoide 15 steroider samt andre sâsom phénobarbital, phenytoin, primidon, ethosuximid, carbamazepin, valproat, theophyllin, caffein, propranolol, procainamid, quinidin, amitryptilin, corticol, desipramin, diisopyramid, doxepin, doxorubicin, nortryptilin, methotrexat, imipramin, lidocain, procainamid, N-acetylprocain-20 amid, amphetaminerne, catecholaminerne og antihistaminerne.

Det flydende medium, hvori der skal foretages en bestemmelse, kan være en naturligt forekommende eller kunstigt dannet væske, der antages at indeholde liganden, og den er sædvanligvis en biologisk væske eller en fortynding deraf. Biologiske væsker, 25 i hvilke der kan foretages bestemmelser, omfatter sérum, plasma, urin, spyt og amniotiske og cerebrospinalvæsker.

2. Strâlingsdiffuserende og -blokerende lag.

Anbringelsen af det strâlingsdiffuserende- og blokerende 30 lag i forhold til reagenslaget eller -lagene og underst0t- ningslaget er kritisk for den foreliggende opfindelse. De ka-rakteristiske egenskaber ved det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag skriver sig fra de bestanddele, ud fra hvilke laget fremstilles, og disse karakteristika er ligeledes kri-35 tiske for opfindelsen.

DK 156925 B

12 0

Det her omhandlede strâlingsblokerende lag er et strâ-lingsdiffuserende og -blokerende lag, der er indskudt mellem reagenslaget eller -lagene og underst0tningslaget. Der kan væ-re direkte kontakt med en overflade af reagenslaget eller -la-5 gene. Det signal, der udsendes fra reagenslaget, aflæses derpâ fra den anden overflade af reagenslaget eller -lagene. Strâ-lings signal et soin sâdant beh0ver ikke at passere gennem noget , lag eller materiale f'0r detektering andet end det reagenslag, fra hvilket signalet udsendes. Nâr reagenslaget ikke bindes 10 godt til det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, er det til tider muligt at behandle eller aktivere overfladen af det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag ved en passende be-handling, f.eks. behandling med natriumhydroxid, til forbedring af den binding, der opnâs mellem reagenslaget og det strâlings-15 diffuserende og -blokerende lag. Alternativt kan der anbrin-ges et særskilt mellemlag mellem det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag og reagenslaget eller lagene til forbedring af bindingen eller vedhængningen af reagenslaget.

De karakteristiske egenskaber for det strâlingsdiffu-20 serende og -blokerende lag bestâr i, at det er opakt, forholds-vis tyndt og bâde impermeabelt og indifferent i forhold til li-ganden, reagenser i reagenslaget og produkter fra deres indbyr-des reaktion. Det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag in-deholder et hvidt eller lyst farvet, for strâling impermeabelt 25 pigment, fortrinsvis ensartet fordelt gennem hele laget eller i det mindste overfladen af lager, der st0der op til reagenslaget eller det særskilte mellemlag. Nærmere bestemt kan det strâ-lingsdiffuserende og -blokerende lag omfatte ethvert strâ-lings-impermeabelt pigment inkorporeret i enhver egnet har-30 piks eller ethvert egnet polymert materiale, der er foreneligt med substratet eller underst0tningsmaterialet pâ den ene side og med reagenslaget eller mellemlaget pâ den anden side. Sâ-fremt det har polymer natur, kan det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag være en homopolymer eller copolymer. Det strâ-35 lingsdiffuserende og -blokerende lag har som allerede nævnt en tykkelse mellem 0,0005 og 0,05 cm.

n DK 156925 B

Ο

Eksempler pâ for strâling imperméable pigmenter, der kan anvendes, omfatter titandioxid, bariumsulfat, zinkoxid, magne-siumoxid og zirconiumdioxid. Normalt vil den 0vre grænse for mængden af tilstedeværende pigment være mindre end 40%'s 5 faststofindhold, og den nedre grænse vil ligge over 2%'s indhold af fast stof.

Eksempler pâ egnede harpikser, der kan anvendes til det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, er anhydridharpikser, der omfatter methylvinylether-maleinsyreanhydrid-copolymer, 10 ethylen-maleinsyreanhydrid-copolymer, octadecenyl-l-maleinsyre-anhydrid-copolymer, octadecyl-vinylether-maleinsyreanhydrid-co-polymer og styren-maleinsyreanhydrid-copolymer.

Eksempler pâ andre polymère materialer, der kan anvendes til det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, er polyvinyl-15 acetat, polyvinylmethacrylat, polybutadien, polychloropren og polyvinylpyrrolidon.

3. Homogène specifikke bindingsbestemmelser.

Reagenser til ethvert homogent specifikt bindingsbestem-20 melsesSystem kan inkorporeres i det her omhandlede testmateria-le. I almindelighed er homogène specifikke bindingsbestemmelses-metoder baseret pâ den specielle interaktion mellem (1) et kon-jugat af en bindingskomponent og en mærkning og (2) en bindings-partner til bindingskomponenten i konjugatet, idet et karakteri-25 stikum ved mærkningen er forskellig, nâr mærkningskonjugatet er bundet af bindingspartneren, sammenlignet med det tilfælde, hvor et konjugat ikke er sâledes bundet. Det pâvirkede karakte-ristikum ved mærkningen kan være af enhver mâlelig natur, f.eks. en kemisk eller fysisk egenskab ved mærkningen. I nogle til-30 fælde er det pâvirkede karakteristlkum en kemisk reaktivitet ved en forudbestemt reaktion, der involverer dannelsen af eller opbrydningen af kemiske bindinger, der kan være covalente eller ikke-covalente. I andre tilfælde er den pâvirkede egenskab en fysisk egenskab ved mærkningen, som kan mâles uden ke-35 misk reaktion.

14 0

DK 156925 B

I hovedparten af tilfældene vil det her omhandlede test-materiale være inkorporeret med homogène specifikke bindings-bestemmelsesreagenser, der reagerer med liganden i eller dens bindingskapacitet i pr0ven pâ immunologisk mâde. Dette bety-5 der, at der vil være en antigen-antistof- eller hapten-anti-stof-relation mellem reagenser og/eller liganden eller dens bindingskapacitet i pr0ven. Sâdanne bestemmelser betegnes der-for som immunobestemmelser, og den specielle interaktion mellem mærkningskonjugatet og dets bindingspartner er en immuno-10 kemisk binding. I sâdanne tilfælde er bindingskomponenten i mærkningskonjugatet sâledes et hapten eller antistof (eller et fragment deraf), og bindingspartneren er dens korresponderen-de immunokemiske bindingspartner. André bindings-interaktioner mellem mærkningskonjugatet og bindingspartneren kan tjene som 15 basis for homogène specifikke bindingsbestemmelser, herunder bindings-interaktioner mellem hormoner, vitaminer, metalbo-liter og farmakologiske midler, og deres respektive recep-torer og bindingsstoffer.

Nâr pr0ven unders0ges til bestemmelse af nærværelsen 20 eller mængden af en bestemt ligand deri, omfatter reagenserne til den homogène specifikke bindingsbestemmelsesteknik i det sædvanlige tilfælde (1) et mærkningskonjugat sammensat af liganden, eller en bindingsanalog deraf, kemisk koblet til mærkningen, (2) en bindingspartner for liganden, f.eks. et 25 antistof eller et fragment deraf eller et naturligt receptor-protein, og (3) aile hjælpereagenser, der er n0dvendige for at kunne mâle mærkningsstoffet i mærkningskonjugatet. En begrænsende mængde af bindingsstoffet indf0res sâledes, at enhver ligand i pr0ven vil konkurrere med mærkningskonjugatet 30 til binding til bindingspartneren. Fordelingen af mærkningen mellem den bundne type og den frie type vil derfor bestemme st0rrelsen af det detekterbare respons fra mærkningen, hvilket igen vil være en funktion af tilstedeværelsen af liganden. En anden metode til bestemmelse af en ligand anvendes, nâr mærk-35 ningskonjugatet er sammensat af en mærket bindingspartner i liganden, og mærkningen ved binding til liganden pâvirkes med hensyn til dens detekterbare respons. Nâr ligandbindingskapa-

DK 156925 B

15 0 citeten af pr0ven er under bestemmelse, vil mærkningskonjuga-tet være sammensat af liganden, eller en bindingsanalog dertil, kemisk koblet til mærkningen, hvorved pr0vens kapacitet til binding af mærkningskonjugatet, f.eks. pâ grund af tilstedevæ-5 relsen af en bindingspartner for liganden i pr0ven, bestemmer den effekt, der ud0ves pâ det detekterbare signal fra mærkningen.

Der kendes allerede adskillige homogène specifikke bindingsbestemmelsessystemer. De f0lgende systemer er an-10 f0rt i overensstemmelse med arten af den anvendte mærkning.

(a) Mærkninger med enzym-prosthetiske grupper.

I dette System er mærkningen en prosthetisk gruppe af et enzym, og et katalytisk inaktivt apoenzyms evne til kombi-15 nation med den prosthetiske gruppemærkning til dannelse af et aktivt enzym (holoenzym) pâvirkes af bindingen af mærkningskon-jugatet med dets bindingspartner. Den resulterende holoenzym-aktivitet kan mâles med konventionelle detekteringssystemer til opnâelse af et endeligt detekterbart signal. Bestemmelsessyste-20 mer af denne type er beskrevet i britisk patentskrift nr. 2.023.607.

Ved en særlig foretrukken bestemmelsesmetode under anven-delse af en mærkning med en prosthetisk gruppe benyttes der fla-vin-adenin-dinucleotid (FAD) som mærkning og apoglucoseoxida-25 se som apoenzym. Den resulterende glucoseoxidase-aktivitet kan mâles ved hjælp af et kolorimetrisk detekteringssystem in-deholdende glucose, peroxidase og et indikatorSystem, der frem-bringer en farveændring som respons pâ hydrogenperoxid.

Ved denne foretrukne bestemmelsesmetode har FAD-mærk-30 ningskonjugatet fortrinsvis formlen:

NH—R-L

35 j

Ribof lavin-^Phos-^-Ribose

DK 156925 B

16 0 i hvilken Riboflavin—£—Phos )^- Ribose repræsenterer riboflavin --pyrophosphat-ribose-resten i FAD, R er en forbindende gruppe, og L er bindingskomponenten, f.eks. liganden eller en analog dertil. Et eksempel pâ et sâdant konjugat er FAD-theophyllin-5 -konjugatet som beskrevet i EP 51.213 A.

(b) Enzymsubstrat-mærkninger.

I dette System er mærkningen valgt sâledes, at mærknings-10 konjugatet er et substrat for et enzym, og enzymets evne til at virke pâ det substrat-mærkede konjugat pâvirkes enten i po-sitiv eller negativ forstand ved binding af mærkningskonjuga-tet med dets bindingspartner. Ved indvirkning af enzymet pâ det substrat-mærkede mærkningskonjugat frembringes et produkt, 15 der kan skelnes ved hjælp af et eller andet træk, sædvanligvis en kemisk eller fysisk egenskab sâsom kemisk reaktivitet ved en indikatorreaktion, eller et træk af fotometrisk karakter, f.eks. fluorescens eller lysabsorption (farve). Bestemmelses-systemer af denne type er beskrevet i DE 2.618.511 A 'og US 20 patent nr. 4.279.992, samt i Anal. Chem., 48, 1933 (1976), Anal.

Biochem., 77, 55 (1977) og Clin. Chem., 23, 1402 (1977).

Ved en særlig foretrukken substrat-mærknings-bestemmel- sesmetode anvendes der et mærkningskonjugat med strukturform-len 2g Lii90li

HO

π. WT

30 R-L

i hvilken R er en forbindende gruppe, og L er bindingskomponen-ten, f.eks. liganden eller en analog dertil, idet evnen for enzymet β-galactosidase til spaltning af konjugatet til dannelse af et produkt, der kan skelnes ved hjælp af dets fluorescens, 35 inhiberes ved binding af konjugatet med dets bindingspartner.

DK 156925 B

17 0 (c) Coenzym-mærkninger.

Mærkningskonjugatet i dette System er i mærkningsdelen sammensat af en coenzym-aktiv funktionalitet, og en sâdan co-enzym-mærknings· evnetil at deltage i en enzymatisk reaktion pâ- 5 virkes af bindingen af mærkningskonjugatet med dets bindings-partner. Graden eller hastigheden af den resulterende enzymati-ske reaktion kan mâles med konventionelle detekteringssystemer til opnâelse af et endeligt detekterbart signal. Bestemmelses-systemer af denne type er beskrevet i DE 2.618.511 A og i Anal.

10 Biochem., 27, 271 (1976),Anal. Biochem., 72, 283 (1976) og i Anal. Biochem., 76, 95 (1976).

(d) Enzymmodulator-mærkninger.

Mærkningskonjugatet i dette System er i mærkningsdelen 15 sammensat af en enzym-modulerende funktionalitet, sâsom en en-zyminhibitor eller -stimulator, og en sâdan modulatormærknings evne til at modulere aktiviteten af et enzym pâvirkes af bindingen af mærkningskonjugatet med dets bindingspartner. Graden eller hastigheden af den resulterende erizymatiske reaktion 20 kan mâles med konventionelle detekteringssystemer til frem-bringelse af et endeligt detekterbart signal. Bestemmelsessy-stemer af denne type er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.134.792.

25 (e) Enzym-mærkninger.

I dette System er mærkningen et enzym, og aktiviteten af enzym-mærkningen pâvirkes af bindingen af mærkningskonjugatet med dets bindingspartner. Resulterende enzymaktivitet kan mâles ved hjælp af konventionelle detekteringssystemer 30 sâledes, at der fâs et endeligt detekterbart signal. Bestem-melsessystemer af denne type er beskrevet i USA-patentskrif-terne nr. 3.817.837 og nr. 4.043.872.

35

DK 156925 B

18 0 (f) Undertrykkelige fluorescerende mærkninger.

Mærkningskonjugatet i dette System er i dets mærknings-del sammensat af fluorescerende stof, hvis fluorescens under-trykkes i nogen mâlelig grad, nâr mærkningskonjugatet bindes 5 af dets bindingspartner, sædvanligvis et protein sâsom et an-tistof. Den fluorescerende mærkning mâles direkte, idet dens fluorescens er det detekterbare signal. Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.160.016 og i J. Clin. Path., 30, 526 (1977).

10 (g) Fluorescens-polarisations-mærkninger.

Mærkningen i dette System er ogsâ et fluorescerende stof, men evnen for den fluorescerende mærkning til at blive kemisk aktiveret til en energitilstand, i hvilken den fluorescerer, pâ-15 virkes af bindingen af mærkningskonjugatet til dets bindingspartner. Kemisk aktivering af mærkningen udf0res sædvanligvis ved udsættelse af fluoréscerings-mærkningen for en in situ dannet forbindelse med h0j energi. Bestemmelsessystemer af denne type er beskrevet i DE 2.952.498 A.

20 (i) Mærkninger med sterisk hindrede dobbelte antistoffer.

Et andet bestemmelsessystem er dobbelt antistof-immuno-bestemmelsessystemet som beskrevet i USA-patentskrifterne nr.

3.935.074 og 3.998.943. Mærkningskonjugatet omfatter to epi-25 toper, hvoraf den ene deltager i den immunologiske reaktion med liganden og anti-ligand-antistof, og hvoraf den anden kan bindes af et andet antistof, men med den begrænsning, at de to antistoffer er hindrede i samtidig binding til mærkningskonjugatet. Den anden epitop kan være et fluorescerende stof, hvis 30 fluorescens undertrykkes af den anden antistofbinding, eller som kan deltage i en st0ttende kompetitiv bindingsreaktion med en mærket form af den anden epitop til binding til det andet antistof. Forskellige detekteringssystemer er mulige i et sâdant System som beskrevet i de ovennævnte patentskrifter. Be-35 slægtede bestemmelsessystemer er beskrevet i USA-patentskrifterne nr. 4.130.462 og 4.161.515 samt i britisk patentskrift nr. 1.560.852.

DK 156925 B

19 0 (j) Energioverf0rings-mærkninger.

I dette System er mærkningen den ene del af et energioverf 0rings-donor-acceptor-par, og bindingspartneren er kon-jugeret med den anden del af dette par. Nâr mærkningskonjuga- 5 tet sâledes er bundet af bindingspartneren, ændres energiud-trykket for donorbestanddelen af parret ved overf0ring til accpetor-bestanddelen. Sædvanligvis er donoren et fluoresce-rende stof, og acceptoren er en undertrykker deraf, hvilket undertrykkende middel eventuelt ogsâ kan være et fluoresce-10 rende stof. I en sâdan udf0relsesform er det detekterbare signal en fluorescens, men andre detekteringssystemer er ogsâ mulige. Sâdanne bestemmelsessystemer er beskrevet i USA-pa-tentskrifterne nr. 3.996.345, 4.174.384 og 4.199.559 samt i britisk patentskrift nr. 2.018.424.

15 (k) Andre mærkninger.

Andre homogène specifikke bindingsbestemmelsessystemer, der er beskrevet, og som kan anvendes i forbindelse med opfin- delsen, omfatter anvendelsen af sâdanne anærkninger som: 20 (i) ikke-enzymatiske katalysatorer, f.eks. elektronoverf0rings- midler, jfr. USA-patentskrift nr. 4.160.645, (ii) ikke-enzymatiske kemoluminiscerende midler, jfr. det ovennævnte DE 2.618.511 A.

(iii) "kanaliserings"-mærkninger, jfr. britisk patentskrift 25 nr. 2.018.986, (iv) "partikel"-mærkninger, jfr. britisk patentskrift nr. 2.019.562, og (v) mærkede liposompartikler, jfr. USA-patentskrift nr.

4.193.983.

30 4. Underst0tningslaget.

Som nævnt i det foregâende omfatter de intégrale analy-tiske materialer en underst0tning eller bærer. Underst0tningen kan være opak, delvis gennemsigtig eller transparent for lys 35 eller anden form for energi. En 0nsket underst0tning til et be-stemt materiale vælges uafhængigt af den tilsigtede metode til signal-detektering. Foretrukne underst0tninger omfatter sâdanne af polystyren eller lignende formstoffer.

DK 156925 B

20 0 5. Fremstilling af multilagsmateriale.

If01ge opfindelsen tilvejebringes der endvidere en fremgangsmâde til fremstilling af det analytiske multilagsmateriale, og denne fremgangsmâdes art og det for denne 5 fremgangsmâde ejendommelige er allerede angivet i det fore-gâende.

I en udf0relsesform omfatter fikseringen af en overflade , af underst0tningslaget til en overflade af det strâlingsdiffu-serende og -blokerende lag dannelse af det nævnte lag pâ over-10 fladen af underst0tningslaget. I en anden udf0relsesform omfatter fiksering af en overflade af underst0tningslaget til en overflade af det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag dannelse af det nævnte lag og derefter fiksering af en overflade af det sâledes dannede strâlingsdiffuserende og -blokerende 15 lag til en overflade af underst0tningslaget.

6. Detekterbart respons.

Som allerede nævnt giver mange af de i den seneste tid udviklede homogène specifikke bindingsbestemmelsessysieme^ 20 eller kan let tilpasses til at give, et detekterbart respons sâsom en farveændring, kemoluminiscens eller fluorescens rela-teret til nærværelsen eller mængden af den ligand, der bestem-mes i den flydende pr0ve.

Betegnelserne "detekterbare materialer" og lignende her 25 anvendte udtryk refererer til atomer, kemiske grupper, dvs. en del af et molekyle, eller kemiske forbindelser, der selv di-rekte eller indirekte er detekterbare, og betegnelsen "detekterbart respons" og lignende her anvendte udtryk refererer til den detekterbare manifestation af nærværelsen af de nævnte ma-30 terialer. Eksempler er elektromagnetiske strâlingssignaler sâsom fluorescens, phosphorescens, kemoluminiscens, en ændring i lysabsorption eller reflektans i det synlige spektrum, hvorved der tilvejebringes en synlig farveændring, en ændring i lysabsorption eller reflektans udenfor det synlige omrâde, f.eks. i 35 det ultraviolette eller infrar0de omrâde. Som det vil være klart for en fagmand, skal det her anvendte udtryk "detekterbart respons" opfattes i dets bredeste forstand. Foruden elek-

DK 156925 B

21 0 tromagnetiske strâlingssignaler skal udtrykket "detekterbart respons" ogsâ omfatte enhver iagttagelig ændring i en System-parameter, f.eks. en ændring i eller fremkomsten af en reak-tant, iagttagelig fældning af enhver bestanddel i fors0gspr0~ 5 ven eller enhver ændring i enhver anden parameter, enten i reagenssystemet eller i fors0gspr0ven. Sâdanne andre former for detekterbare respons omfatter elektrokemisk respons og kalorimetrisk respons. Endvidere er det detekterbare respons et sâdant, der kan iagttages direkte gennem sanserne eller ved 10 anvendelse af hjælpedetekteringsmidler, f.eks. et spektrofoto-meter, udstyr til mâling af ultraviolet lys, et fluorometer, et spektrofluorometer og andre lignende organer. Det er 0nskeligt, at detekterbarheden bekvemt kan udnyttes for den fulde mængde af detekterbart materiale uden pâvirkning af mængden af diffu-15 sibelt produkt, der resulterer fra analyt-interaktionerne, der er basis for den tilsigtede analyse.

Efter at det analytiske résultat er opnâet som en detek-terbar ændring, mâles denne, sædvanligvis ved at lede testma-terialet gennem en zone, hvori der finde's passende apparatur 20 til reflektions-, transmissions- eller fluorescensfotometri.

Sâdant apparatur tjener til tilvejebringelse af en strâle af energi sâsom lys. Lyset reflekteres derpâ fra materialet til-bage til en detektor. Det analytiske résultat detekteres i et omrâde af materialet, der befinder sig totalt inden for det 25 omrâde, i hvilket resultatet tilvejebringes. Anvendelsen af reflektions-spektrofotometri kan være fordelagtig i nogle si-tuationer, eftersom man effektivt undgâr optisk interferens fra mulige remanenser sâsom blodceller eller urinsediment, der er blevet efterladt pâ eller i lagene i materialet, eller fra 30 atypiske urinfarver. Der kan ogsâ anvendes konventionel fluores-cens-spektrofotometrisk teknik. Almindeligvis har elektromagne-tisk strâling i omrâdet fra ca. 200 nm til ca. 900 nm vist sig nyttig til sâdanne mâlinger, omend der kan anvendes enhver strâling, for hvilken reagenslaget eller -lagene er permeabel, og 35 > 22 0

DK 156925 B

soin kan kvantisere det produkt, der dannes i materialet. Der kan anvendes forskellige kalibreringsmetoder til tilvejebrin-gelse af en kontrol af analysen. Soin et eksempel kan det næv-nes, at en pr0ve af en standardopl0sning af den ligand, der 5 skal bestemmes, kan pâf0res op til det areal, hvor drâben af pr0ven anbringes, for at tillade anvendelsen af différentielle mâlinger ved analysen.

Eksempler 10 I de f0lgende eksempler beskrives der fors0g, der er ud- f0rt ved udviklingen af den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1

Sammenligning af modelsystemer 15

Til bed0mmelse af virkningen af det blokerende lag, der anvendes i materialet if0lge opfindelsen, fremstilles der materialer bâde med og uden det omhandlede strâlings-diffuserende og -blokerende lag mellem reagenslaget og un-derst0tningslaget. Reagenslaget i dette modelsystem er 20 udstyret med en reagensopl0sning, der selv udsender et detekterbart respons, nemlig fluorescens. Dette eksempel omfatter sâledes en sammenligning, der ikke er begrænset til nogen bestemt ligand.

25

Materialefremstilling

Materialerne af begge typer fremstilles under anvendel-se af underst0tningslag, hvoraf nogle er en polyester, og an-dre er gelbundet film, idet aile har dimensionerne 0,5 x 1,0 cm.

30 Materialerne A og B har underst0tningslaget mellem det strâ-lingsdiffuserende og -blokerende lag og reagenslagene, medens materiale B har et multizone-reagenslag. I materiale C befin-der reagenslaget sig mellem underst0tningen og de strâlings-diffuserende og -blokerende lag. Materiale D har det strâlings-35 diffuserende og -blokerende lag mellem reagens- og underst0t-ningslagene og er et eksempel pâ materialet if0lge opfindelsen.

23 DK 156925 B

0

Materialet A fremstilles ved udst0bning af et reagens- lag i form af en film af et agarosemateriale pâ en overflade af underst0tningslaget og et TiC^-pigmenteret materiale pâ den an- den overflade til dannelse af et strâlingsdiffuserende og --blo~ 5 kerende lag. Agarosematerialet har f0lgende sammensætning:

Bestanddel Mængde

Agarose 1,5 grana (g)

Triton X-100 (10% vægt/vol.) 500,0 mikroliter 1 M (molær) Bicin (pH 8,3) 10,0 liter 10 1^0 40,0 milliliter

Triton er et varemærke for en række syntetiske organiske overfladeaktive midler, der sælges af Rohm & Haas, Philadelphia,

Pa. Bicin er Ν,Ν-bis-(2-hydroxyethyl)-glycin.

Det med T1O2 pigmenterede materiale har f0lgende sammen-15 sætnmg:

Bestanddel Mængde T1O2 2,5 g PVP 2,5 g 20 Chloroform 44,5 g

Dioctylphthalat 0,5 g

Fremstillingen af materiale B er identisk med fremstil-lingen af materiale A som beskrevet ovenfor, men med den til-f0jelse, at et polyvinylpyrrolidon (PVP)-materiale udst0bes 25 som en film pâ overfladen af agarosefilmen modsat fra overfla-den i kontakt med underst0tningslaget. PVP-materialet danner en film, som kombineres med agarosefilmen til dannelse af et multizonereag:enslag, og sammensættes som f0lger:

Bestanddel Mængde 30 PVP 5,0 g

Chloroform 45,0 g

Materiale C fremstilles ved udst0bning af en reagens-lagfilm af et agarosemateriale pâ en overflade af underst0tnings-laget. Agarosematerialet er identisk med det, der anvendes i 35 materialerne A og B. Det samme Ti02-materiale, som anvendes til materialerne A og B, anvendes derpâ til udst0bning af en film pâ overfladen af agarosefilmen modsat fra overfladen i kontakt med underst0tningslaget.

24 0

DK 156925 B

Materiale D fremstilles ved udst0bning af et Ti02“pig_ menteret materiale, der er identisk med det, der anvendes i de andre materialer, pâ et underst0tningslag til dannelse af et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, hvorpâ der udst0-5 bes et agarosemateriale, der er identisk med det, der anvendes i de andre materialer, pâ overfladen af agaroselaget mod-sat det, der er i kontakt med underst0tningslaget.

Desuden sammenlamineres 0,5 x 1,0 cm stykker af Whatman 31 ET filtrerpapir (Whatman, Inc., Clifton, N.J. 07014) og re-flekterende Mylar-polyester (3M Company, St. Paul, Mn 55144) til dannelse af materiale E. Der er intet reagens til stede i de fremstillede materialer.

15 Analysefremgangsmâde

De som ovenfor beskrevet fremstillede materialer ind-sættes hver i en mekanisk holder egnet til horisontal anbrin-gelse af materialerne i et fluorometer. En 30 mikroliter (pl) drâbe af en vandig 7-hydroxy-coumarin-3-carboxanilid-'opl0sning 20 (HCC) anbringes pâ hvert materiale netop inden anbringelsen af materialet i fluorometeret. Hver af de anvendte HCC-opl0snin-ger har en koncentration i omrâdet fra 0,2 til 2,0 mikromo-lær (pM).

Fluorometeret er justeret til tilvejebringelse af en 25 excitationslyskilde med en b0lgelængde pâ 405 nanometer (nm), der ranimer materialets overflade under en vinkel pâ 90°C fra overfladens plan, og til detektering af lys emitteret ved en b0lgelængde pâ 450 nm. En frontflademâling af fluorescens ud-f0res ved en vinkel pâ 90° fra materialeoverfladens plan.

30 Fluorescensen af hver pr0ve mâles derefter.

35 25 0

DK 156925 B

Resultater

Signalet-baggrunden (R) og forholdet mellem signalet og baggrunden (S/B) for hver HCC-pr0ve bestemmes, idet der anvendes udtrykkene henholdsvis (1) og (2): 5 (1) R = Fm-Fb og (2) S/B = F^/F^ hvor og F^ er fluorescenssignalet for en blindpr0ve, henholdsvis for en HCC-opl0sning.

De opnâede data under anvendelse af materialerne A og B fremgâr af bâde figur 1 og 2 ved hjælp af den kurve, der er 10 tegnet med en punkteret Unie. De data, der opnâs ved anvendelse af materialerne C og D er i bâde figur 1 og 2 vist ved hjælp af kurven tegnet med fuldt optrukken Unie. De data, der opnâs ved anvendelse af materiale E, er i bâde figur .1 og 2 repræsenteret ved den kurve, der er tegnet med stiplet linie.

15 Figur 1 illustrerer en afbildning af R som en funk- tion af HCC-koncentrationen for hvert system. Bortset fra What-man 31 ET (materiale E) iagttages der to tydelige respons for TiC>2~systemerne. Materialerne TiO^ under underst0tningen (materiale A og B), uanset gelbinding eller polyester, viser et lavere omrâde end materialerne med TiO^ oven pâ underst0tnin-gen (materialerne C og D), uanset gelbinding eller polyester, i kontakt med HCC-opl0sningerne. Whatman 31 ET (materiale E) viser et bedre omrâde end TiC^-systemerne.

Det samme fænomen mellem materialerne A og B pâ den 25 ene side og materialerne C og D pâ den anden side iagttages, nâr signal-baggrunds-forholdene (S/B) afsættes mod HCC-koncen-trationer som vist i fig. 2. Materialerne med TiC>2 oven pâ under st0tningen, og som afskærmer det lag, der modtager HCC-op- l0sningerne, udviser store S/B-forhold. Materialerne med TiO„ 30 ^

under underst0tningerne udviser smâ forhold, og Whatman 31 ET

(materiale E) ligger midt imellem.

35

26 DK 156925 B

0

Eksempel 2

Substrat-market fluorescens-immunobestemmelsesmateriale for theophyllin

Theophyllin (1,3-dimethylcanthin, jfr. The Merck Index, 5 9. udgave, side 1196 (1976)), er et lægemiddel, der er nyttigt ved behandlingen af asthma. Hos de fleste patienter ligger det terapeutiske omrâde for serumkoncentrationen mellem 10 og 20 mi-krogram pr. milliliter (pg/ml), medens toksicitet næsten uden undtagelse viser sig ved blodniveauer over 35 -pg/ml.

10

Konjugatfremstilling β-galactosyl-umbelliferon-mærket theophyllin (3-GUT)-kon-jugater fremstilles if0lge det reaktionsskema, der er vist i figur 3. Denne syntesevej eksemplificeres ved hjælp af den i 15 det f0lgende beskrevne metode til fremstilling af 8-(3-(7-β- -galactosylcoumarin-3-carboxamido)-propyl)-thiophyllin (4), n=3.

8-(3-Aminopropyl)-theophyllin (2)

En blanding af 2,66 g (0,01 mol) 8-(3-carboxypropyl)-20 -theophyllin (1) (Cook et al, Res. Commun. Chem. Path. Pharma-col., 13(3), 497-505 (1976)), 20 ml chloroform og 3 ml koncen-treret svovlsyre omr0res ved 50°C under argonatmosfære. Her-til sættes der 1,3 g fast natriumazid portionsvis over et tidsrum pâ 90 minutter (jfr. Organic Reactions, 47,28 (1967)).

25 Reaktionsblandingen afk0les, og opl0sningsmidlet fjernes under formindsket tryk. Remanensen kombineres med tilstrække-lig natriumbicarbonatopl0sning til at bringe pH-værdien pâ 7,5. Der tilsættes ÎO g Celite (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvania), og vandet fordampes. Celite er et vare-30 mærke for visse diatoméjordprodukter. Den imprægnerede Celite anbringes i toppen af en kolonne af 200 g silicagel (E. Merck & Co., Darmstadt, Vesttyskland) i 9:1 (vol./vol.) éthanol: 1 mo-lær vandig triethylammoniumbicarbonat. Kolonnen elueres med dette opl0sningsmiddel, og der opsamles 15 ml-fraktioner. Frak-35 tionerne 171 til 225 kombineres og inddampes, hvorved der fâs 500 mg af et hvidt pulver. Dette stof rechromatograferes pâ en 0 27

DK 156925 B

kolonne af CM-Sephadex pâ ammonium-form (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA), idet der elueres med 0,5 molær ammoniumbicarbonatopl0sning„ Lagrumfanget er 3 cm x 50 cm, og der opsamles 10 ml fraktioner. Fraktionerne 65-110 5 kombineres og inddampes, hvorved der fâs 250 mg af et hvidt, fast stof. Dette optages i fortyndet saltsyre, hvorpâ der igen inddampes.

Remanensen omkrystalliseres fra methanol, hvorved der fâs 90 mg (3%'s udbytte) af hydrochloridsaltet af (2) i form 10 af bleg-gulbrune nâle, der ikke smelter under 300°C.

Analyse, beregnet for 0-^^Η^^Ν^0102: C = 43,88, H = 5,89, N = 25,59%.

Fundet: C - 43,77, H = 5,88, N = 25,49%.

Infrar0dt spektrum (KC1): 1695 cm ^ og 1655 cm ^ (amid-carbonyler). 15 8-(2-(7-p-galactosylcoumarin-3-carboxamid)-propyl)-theophyllin (4) Der fremstilles en reaktionsblanding indeholdende 24 g kaliumhydroxid, 80 ml vand, 240 ml methanol og 20 g (0,035 mmol) ethyl-7-3-galactosyl-coumarin-3-carboxylat, jfr. Burd et al., 20

Clin. Chem., 23, 1402 (1977). Reaktionsblandingen omr0res ved 50°C i 15 timer. Nâr den er kold, fjernes methanolen under formindsket tryk. Den koncentrerede vandige opl0sning syrnes til en pH-værdi pâ 2,0 med koncentreret saltsyre. Den hvide fældning opsamles, vaskes med koldt vand og omkrystalliseres 25 fra varmt vand. Krystallerne opsamles, vaskes med acetone og t0rres ved 80°C i 1 time. Der fâs 12 g 7-3~galactosylcoumarin- -3-carboxylsyre i form af hvide krystaller med smp. 250-255°C.

En blanding af 1,45 g (0,004 mol) 7-p-galactosylcouma-

rin-3-carboxylsyre, 404 mg (0,004 mol) triethylamin og 40 ml 30 , O

t0rt dimethylformamid (DMF) afk0les til -10 C under omr0ring under argon. Til blandingen sættes der 546 mg (0,004 mol) iso-butyl-chlorformiat (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) til dannelse af det blandede anhydrid (3). 10 Minutter senere sættes der til den anvendte kolbe yderligere 404 mg triethylamin og 949 mg (0,004 mol) 8-(3-aminopropyl)-theophyl-lin (2). Efter omr0ring i 30 minutter ved -10°C fâr reaktionsblandingen lov at varme op til stuetemperatur. Den kombine- 35 0 28

DK 156925 B

res med 10 g silicagel, og DMF fjernes under h0jvakuum. Den imprægnerede silicagel anbringes i toppen af en kolonne med 170 g silicagel, og kolonnen elueres med vandfri éthanol, og der opsamles 15 ml-fraktioner. Fraktionerne 41-475 kombineres 5 og inddampes, hvorved der fâs 545 mg af et gult, fast stof.

Dette opl0ses i vand, og der filtreres og koncentreres til et rumfang pâ 20 ml. Der dannes en ringe mængde af en fældning, som kasseres. Filtratet chromatograferes pâ en 2,5 x 57 cm kol-lonne af Sephadex LH-20-gel (Pharmacia Fine Chemicals, Piscat-10 away, New Jersey), idet der elueres med vand og opsamles 15 ml--fraktioner. Sephadex er et handelsnavn for et hydrofilt, uop-l0seligt chromâtografisk molekylsigtemedium, der er fremstil-let ved tværbinding af dextran. Fraktionerne 18-23 kombineres og inddampes, og remanensen omkrystalliseres fra vand, 15 hvorved der fâs 55 mg (2%'s udbytte) af mærkningskonjugatet (4) i form af et lysegult fast stof med smp. 190-192°C.

Analyse, beregnet for C26H29N5°11: C = 53,15, H = 4,98, N = 11,92%.

Fundet: C = 52,65, H = 5,'01, N = 11,80%.

20

Den ovenfor beskrevne syntese af (3-galactosyl-coumarin- -theophyllin-konjugatet (4), n=3, kan modificeres til at give mærkningskonjugater, hvori n=2-6/ ved erstatning af udgangsma- terialet 8-(3-carboxypropyl)-theophyllin (1), n=3, med de til- svarende 8-(eu -carboxyalkyl)-theophylliner som f0lger: 25 n Alkylen 2 Ethylen 4 Butylen 5 Pentylen 6 Hexylen 30

Fremstilling af antiserum

Antiserum opsamles fra kaniner, der er immuniseret med et theophyllin-immunogen-konjugat fremstillet som beskrevet af Cook et al, Res. Comm. Chem. Path., Pharmacol., 13, 497- -505 (1976).

35

29 DK 156925 B

0

Fremstilling af materiale

Det materiale, der anvendes ved disse fors0g, har dsn i figur 4 viste konfiguration. Underst0tningslaget 2 er af poly-styren. Det imperméable strâlingsdiffuserende og -blokerende 5 lag 4 har en sammensætning svarende til f0lgende: Styren/maleinsyreanhydrid 10 g (50/50-copolymer, MW 50.000)

Polyethylenglycol (MW 1.000) 6 g

Titandioxid 10 g 10 Acetone 34 g

Dette materiale udst0bes pâ polystyren-underst0tnings-laget 2 til en vâdtykkelse pâ ca. 0,5 mm og fâr lov at t0rre ved stuetemperatur.

Et gelatine-mellemlag 6 adhærerer til overfladen af det 15 strâlingsdiffuserende og -blokerende lag 4 og danner en zone af multizone-reagenslaget 12. Mellemlaget er baseret pâ et materiale med f0lgende sammensætning: Gélatine 5 g 0,1 M Bicin-puffer (pH = 11,1) 45 g 20

Dette materiale udst0bes pâ laget 4 til en vâdtykkelse pâ ca. 0,13 mm og t0rres ved 37°C.

Et antistof- og enzymholdigt lag 8 fremstilles ud fra et materiale med f0lgende sammensætning:

25 4% (vægt/vol) Agarose LGT i 0,8 M

Bicin-puffer (pH = 8,5) 1,5 ml 10% Triton X-100 (vægt/vol) 30 ul 1 M Bicin, 0,1 M mg Cl^, pH = 8,5 300 ul

Antisera til theophyllin 464 ul 3Q β-Galactosidase (177 U/ml) 430 pl

Dobbeltdestilleret vand 276 pl

Agarose LGT er et agarosemateriale med en lav "grilling”--temperatur pâ under 40°C og sælges af Research Products Division of. Miles Laboratories, Inc., P.O. Box 2000, Elkhart, ïn-35 diana 46515. Dette materiale udst0bes pâ et lag 6 til en vâdtykkelse pâ ca. 0,5 mm og t0rres ved 37°C. Det er den interme-diære zone af multizone-reagenslaget 12.

0

30 DK 156925 B

Laget 10 indeholdende et konjugat fremstilles ud fra et materiale med f0lgende sammensætning: β-GUT-konjugat 69,2 ul 6% (vægt/vægt) PVP (MW 360.000) 5 i CHC13 (1,93 ml) 2,90 g

Triton X-100 5 pl

Materialet udst0bes pâ et lag 8 til en vâdtykkelse pâ ca. 0,13 mm og t0rres ved stuetemperatur. Det er den 0verste zone af multizone-reagenslaget 12. Den frie 0vre overflade af laget 10 er den overflade, pâ hvilken pr0ven pâf0res, og fra hvilken der foretages aflæsninger.

Analysefremgangsmâde

Aliquoter pâ 35 mikroliter (ul) lægemiddelopl0sning ud-15 pipetteres pâ den frie overflade af de analysematerialer, der er beskrevet ovenfor.

Den fluorescens, der frembringes ved stuetemperatur, mâles under et tidsrum pâ 5 minutter i et fluorometer udstyret med en mekanisk holder egnet til horisontal anbringelse af 20 det analytiske materiale. Fluorometeret er indstillet til at tilvejebringe en excitations-lyskilde ved 405 nm, der rammer overfladen under en vinkel pâ 90°, og til at detektere lys, der udsendes ved en b0lgelaengde pâ 450 nm. En frontflademâling af fluorescensen udf0res under en vinkel pâ 90° fra materiale-25 puden.

De ved fors0g afpr0vede koncentrationsomrâder er f0l- gende:

Omrâde Theophyllin

Terapeutisk omrâde: 10-20 ug/ml 30 '

Dosis-respons-omrade unders0gt: 0-41 pg/ml

Det unders0gte dosis-respons-omrâde dækker det terapeu- tiske omrâde.

35 31 0

DK 156925 B

Resultater

De data, der opnâs ved den ovenfor beskrevne procedure, er illustreret grafisk i figur 5. Fluorescensen (ordinaten) er udtrykt i millivolt (mV), hvor en millivolt er en tusindedei 5 volt. En dosis-respons-kurve, jfr. figur 6, udarbejdes ud ira de data, der er vist i figur 5 ved tre (3) minutters punktet (ordinaten repræsenterer relativ fluorescens).

Konklusion 10 De fremkomne data viser, at intégrale analytiske mate- rialer, der er fremstillet if0lge opfindelsen, giver kvantita-tivt detekterbare signaler, der udg0r respons pâ koncentrations-omrâderne af den tilstedeværende theophyllin. For0gede koncen-trationer af theophyllin resulterer i en af lægemidlet afhængig 15 formindskelse af fluorescensen af de respektive analytiske ma-terialer.

20 25 30 35

Claims (8)

32 DK 156925 B 0 Patentkrav.

1. Analytisk multilagsmateriale til detektering af en ligand i eller ligandbindingskapaciteten af en flydende pr0ve, hvilket materiale er af den type, der har et reagenslag med g inkorporerede reagenser, der giver respons pâ liganden i eller ligandbindingskapaciteten af pr0ven til frembringelse af et detekterbart respons, et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag samt et underst0tningslag, kendeteg-n e t ved, at det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag 10 er (a) indskudt mellem reagenslaget og underst0tningslaget, er (b) impermeabelt for liganden, reagenser nærværende i reagenslaget og produkter fra deres interaktion, er (c) indifferent over for liganden, reagenser nærværende i reagenslaget og produkter fra deres interaktion, (d) har 15 en tykkelse mellem 0,0005 og 0,05 cm og (e) er opakt og indeholder et for strâling impermeabelt pigment.

2-Analytisk multilagsmateriale if0lge krav 1, kendetegnet ved, at det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag udg0res af en anhydridharpiks. 20

3, Analytisk multilagsmateriale'if0lge krav 1'eller 2, kendetegnet ved, at reagenslaget indeholder reagenser til et homogent specifikt bindingsbestemmelses-system, der frembringer et detekterbart respons, soin er en funktion af nærværelsen af liganden i eller ligandbindingska-25 paciteten af pr0ven.

4. Analytisk multilagsmateriale if0lge krav 3, ken -detegnet ved, at det homogen.e specifikke bindingsbe-stemmelsessystem omfatter en mærkning, der deltager i en en-zymatisk reaktion.

5. Analytisk multilagsmateriale if0lge ethvert af OU kravene 1-4, kendetegnet ved, at reagenslaget omfatter et reagensmateriale indeholdende: (i) et antistof, der binder liganden, (ii) et konjugat af liganden eller en bindingsanalog dertil samt en mærkning og 35

33 DK 156925 B 0 (iii) et detekteringssystem, der reagerer med mærkningen til tilvejebringelse af et detekterbart respons, der er for-skelligt, nâr mærkningskonjugatet er bundet til antistof-fet, sammenlignet med det tilfælde, hvor det ikke er sàle-5 des bundet, hvorhos det detekterbare respons er en funktion af nærværelsen af liganden i den flydende pr0ve.

6. Analytisk multilagsmateriale if0lge krav 3-5, k e n-detegnet ved, at 10 (1) reagenslaget omfatter (a) reagenser til et homogent specifikt bindingsbestemmelses-system, der giver et detekterbart respons, soin er en funktion af nærværelsen af liganden i eller ligandbindingskapa-citeten af pr0ven, og 15 (b) en fast bærer inkorporeret med reagenserne, samt (2) at det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag indeholder et for strâling impermeabelt pigment inkorporeret i en anhydridharpiks, hvilket lag er: (a) indskudt mellem reagenslaget og underst0tningslaget, 20 (b) impermeabelt for liganden, reagenser i reagenslaget og pro- dukter fra deres interreaktion, samt er (c) indifferent over for liganden, reagenser i reagenslaget og produkter fra deres interreaktion.

7. Fremgangsmâde til fremstilling af et analytisk mul-25 tilagsmateriale if0lge krav 1-6, kendetegnet ved, at denne omfatter f0lgende trin: (1) fiksering af en overflade af underst0tningslaget til en overflade af et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag, der er 30 (a) impermeabelt for liganden, réagenser i reagenslaget og produkter fra deres interreaktion og er (b) indifferent over for liganden, reagenser i reagenslaget og produkter fra deres interreaktion, samt (2) fiksering af en overflade af reagenslaget til den modsat- 35 te overflade af det strâlingsdiffuserende og -blokerende lag. 0 DK 156925 B .

8. Fremgangsmâde til detektering af en ligand i eller ligandbindingskapaciteten af en flydende pr0ve, ved hvilken fremgangsmâde man bringer pr0ven i kontakt med et analytisk multilagsmateriale af den type, der har et reagenslag med in-5 korporerede reagenser, der giver respons pâ liganden i eller ligandbindingskapaciteten af pr0ven til frembringelse af et detekterbart respons, et strâlingsdiffuserende og -blokerende lag samt et underst0tningslag, kendetegnet ved, at der anvendes et analytisk multilagsmateriale if0lge ethvert 10 af kravene 1-6. 15 20 25 30 35