DK156008B - Fremgangsmaade til fremstilling a glucagon i en transformeret gaerstamme - Google Patents

Description

2

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af glucagon i gær.

Glucagon er et polypeptidhormon, der udskilles fra de 5 Langerhanske øer i bugspytkirtlen. Det er et enkeltkædet polypep-tid, der består af 29 aminosyrer i følgende sekvens:

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-

Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr 10 (I)

Glucagon anvendes til behandling af hypoglykæmi på grund af dets metaboliske virkninger. Glucagon udviser også en spasmolytisk virkning på glat muskulatur og en inhiberende virk-15 ning på mavesyresekretionen.

Glucagon isoleres fra pancreasekstrakter. Ekstraktionen af glucagon fra pancreas fra slagtede dyr er en kompliceret proces og kræver store mængder pancreas. Da glucagon desuden er følsomt overfor proteolytisk nedbrydning, er produktet fra pan-20 creasekstraktionen inhomogent, og der opnås kun ca. 1/4 af gluca-gonindholdet fra pancreas.

I den foreliggende beskrivelse angiver tallene i parentes efter glucagon antallet og nummeret af aminosyrerne. Naturligt glucagon indeholder 29 aminosyrer og benævnes glucagon(1-29) 25 (eller blot glucagon). Glucagon(4-29) mangler de første 3 amino-syrerester af naturligt forekommende glucagon o.s.v.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en mere udbytterig økonomisk fremgangsmåde til fremstilling af glucagon ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknik.

30 Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at glucagon kan udtrykkes i høje udbytter som et homogent materiale i supernatanten fra dyrkning af en gærstamme, der er transformeret med en DNA-sekvens, der koder for glucagon.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremg-35 gangsmåde til fremstilling af glucagon i gær, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at en transformeret gærstamme indeholdende en replicerbar ekspressionsvektor omfattende et gen, der koder

3 DK 156008 B

for glucagon, dyrkes i et egnet næringsmedium efterfulgt af udvinding af glucagon fra dyrkningsmediet.

Genet, der koder for glucagon(1-29) kan være et syntetisk gen eller kan fås f^a en cDNA klon af glucagon eller en 5 genom klon af glucagon.

Glucagon fremstilles fortrinsvis ved indføring af et syntetisk gen, der koder for glucagon, i en egnet gær-DNA-eks-pressionsvektor, transformering af en egnet gærvært med ekspressionsvektoren og dyrkning af den transformerede gærstamme, hvorpå 10 glucagon udvindes fra dyrkningsmediet.

Ved transformering af en egnet gærstamme med en repli-cerbart ekspressionsvektor, der er i stand til at udtrykke glucagon i gær, opnås der høje udbytter af glucagon. Det var overraskende, at det dannede glucagon var meget homogent, og at der 15 ikke iagttoges en spaltning ved den dibasiske aminosyresekvens Arg-Arg ved position 17 og 18 i glucagon af enzymer, der produceres af gær under dyrkningen.

Dette er højst overraskende, eftersom det er kendt, at gær producerer endopeptidaseenzymer, som specifikt spalter ved et 20 sådant par basiske aminosyrer, jfr. Achstetter T. og Wolf D.H.,

The EMBO Journal, 4, januar 1985, 173-177 og Julius D. et al.,

Cell 32 (1984), 1075-1089. Da glucagon desuden er et linært molekyle, der ikke er "krøllet sammen" til en tertiær struktur af svovlbindinger, måtte det desuden forventes, at de to arginin-25 rester ville udgøre et særligt effektivt spaltningssted for gærens egne enzymer. I et lineært molekyle vil sådanne potentielle spaltningssteder nemlig ligge frit tilgængeligt på "overfladen" af molekylet, og det pågældende enzym må formodes let at kunne genkende stedet.

30 Opfindelsen skal yderligere illustreres under henvisning til tegningen, på hvilken 1 1 viser konstruktionen af plasmid pMT290, fig. 2 viser konstruktionen af plasmiderne pMT544, pKFN6 og 35 pMT612,

4 DK 156008 B

fig. 3 og 4 viser in vitro mutagenese af en bestemt sekvens fra plasmid pMT544, fig. 5 viser en analytisk HPLC profil af en gærsupernatant før og efter tilsætning af ren autentisk glucagon, og 5 fig. 6 viser en præparativ fraktionering af det koncentrere de DEAE-gennemløb.

Ud fra den ovennævnte aminosyresekvens (I) er der blevet konstrueret en syntetisk gensekvens, der koder for glucagon, ud fra et antal oligonucleotider ved anvendelse af aminosyrekodo-10 ner, der fortrinsvis anvendes til høj udtrykkelse af proteiner i gær (Bennetzen J.L. et al., (1982), The Journal of Biological Chemistry, 257, 3026 - 3031). Der er desuden blevet inkorporeret restriktionsenzymspaltningssteder på passende steder i molekylet, således at genet kan analyseres specifikt til hjælp for karakte-15 risering og mutagenese. Sekundære strukturer, der ville modvirke ligering og udfyldningsreaktioner, er ydermere forsøgt undgået.

Genet for glucagon kan også fremstilles fra en glucagon cDNA klon. Oksepancreaspræproglucagon cDNA er blevet isoleret og sekventeret (L.C. Lopez et al., (1983), Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 20 80, 5485-5489). Præproglucagon cDNA koder for et signal- eller præpeptid, et NH2 terminalt peptid, glucagon og to carboxytermi-nale glucagonlignende peptider (GLP-1 og GLP-2). Glucagonsekven-sen udskæres fra det syntetiserede cDNA og udstyres med en stop-kodon efter kodonen for Thr(29) ved site specifik mutagenese.

25 Glucagongenet ligeres herefter til en DNA-sekvens, der koder for et yderligere peptid, der har som funktion at tilvejebringe den nødvendige information til transport af det udtrykte protein ind i det periplasmiske hulrum og endelig over cellevæggen ud i kulturmediet.

30 Til dette formål anvendes normalt et såkaldt signal peptid. Der kan eventuelt også inkorporeres en leader-peptidse-kvens. Signal- og leaderpeptidet fraspaltes af gæren under secerneringen af det udtrykte proteinprodukt fra cellerne, hvilket sikrer en mere simpel isoleringsprocedure af glucagon. Et 35 velegnet signal-leader-peptidsystem for gær er Saccharomyces cerevisiae MFal signal-leadersekvensen eller en del deraf

5 DK 156008B

(Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943). Imidlertid kan der anvendes en hvilken som helst signal-leadersekvens, som tilvejebringer udskillelse i gær.

Som promoter anvendes fortrinsvis en promoter fra et 5 gærgen, f.eks. promoteren fra TPI-(triosephosphatisomerase)-genet. DNA-sekvensen for det ønskede produkt vil desuden være efterfulgt af en transskriptionsterminatorsekvens, fortrinsvis en terminatorsekvens fra et gærgen, f.eks. terminatoren fra TPI-genet eller MFal-genet.

10 DNA-sekvensen, der koder for glucagon forbundet med passende promotor-, signalleader- og terminatorsekvenser indsættes derpå i en ekspressionsvektor. Denne vektor er fortrinsvis et plasmid, der er i stand til at replicere i gær eller er i stand til at integreres i gærkromosomet. Plasmidet kan fortrinsvis 15 stabiliseres med hensyn til plasmidtab af værtsorganismen ved at· inkorporere et gen, der er essentielt for levedygtigheden eller normal vækst af værtscellerne, f.eks. et gen, der koder for celledeling, cellevægsbiosyntese eller proteinsyntese.

Det syntetiske gen for glucagon(1-29) blev konstrueret 20 ud fra et antal oligonucleotider ved ligering efterfulgt af enzymatisk udfyldning af en delvis dobbeltstrenget struktur. Oligo-nucleotiderne blev fremstillet på en automatisk DNA-synthesizer under anvendelse af phosphoramiditkemi på en silicabærer (S.L. Beaucage og M.H. Caruthers (1981) Tetrahydron letters 22, 1859-25 1869) eller ved semiautomatisk kolonnesyntese under anvendelse af phosphortriestermetoden med di- og trinucleotidblokke og en polystyrenbærer (H. Ito, Y. Ike, S. Ikata og K. Itakura (1982)

Nucleic Acids Res. 10, 1755-1769). Syntesen af oligonucleotider fra mindre enheder ved successive koblingsreaktioner er velkendt 30 inden for teknikken.

Et syntetisk gen, der koder for glucagon(1-29) blev fremstillet som følger:

DK 156008 B

6

En 33-mer (I) : GAGCACTCTCAGGGTACCTTCACTTCTGACTAC (I) blev ligeret til en 33 mer (II) TCTAAATACTTGGACTCTAGAAGAGCCCAAGAC (II) 5 ved hjælp af en 13 mer (III): ATTTAGAGTAGTC (III) resulterende i en 66-mer (I-II):

10 I II

I-1 I-1 I -1

III

15

Desuden blev en 73-mer fremstillet ved ligering af 13-meren (III), en 16-mer (V): CTTCTAGAGTCCAAGT (V) og en 44-mer (IV): 20 CCGAAGCTTAGGTGTTCATCAACCATTGGACGAAGTCTTGGGCT (IV) i nærværelse af 33-meren (II)

II

I-1 I—>11-II-1

25 III v IV

resulterende i en 73-mer (III-V-IV).

66-meren (I-II) og 73-meren (III-V-IV), hvis 3'-ender 30 er komplementære over 39 baser, blev sammenføjet, og 3'-enderne blev forlænget enzymatisk resulterende i et dobbeltstrenget DNA molekyle på 100 basepar vist i det følgende, hvor der også er vist restriktionssteder (store bogstaver: kemisk syntese, små bogstaver: enzymatisk forlængelse): 35 7

DK 156008 B

I II

,----II-

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 5

HgiAI Ddel Kpnl Hinfl Xbal MboII

GAG CAC TCT CAG GGT ACC TIC ACT TCT GAG TAG TCT AAA TAC TTG GAC TCT AGA AGA etc gtg aga gtc cca tgg aag tga aga CTG ATG AGA ΤΓΓ ATG AAC CTG AGA TCT TCT

I-II-11- ιο III v -1

Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-End 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 15 Banll Tthlll I Ddel Hindlll GCC CAA GAC ttc gtc caa tgg ttg atg aac acc taa gettegg

CGG GTT CTG AAG CAG GTT ACC AAC TAC TTG TGG ATT CGAAGCC

-1

20 IV

Kpnl-Hindlll-fragmentet fra det syntetiske gen blev indsat i et plasmid (pLaC48 skåret med Kpnl og Hindlll) ved hjælp 25 af T4 ligase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler. Efter retransformation blev der identificeret en transformant (pKFN4), der indeholder den korrekte sekvens for glucagon(4-29).

Det syntetiske gen, der koder for glucagon(1-29), blév 30 derpå konstrueret ved at indsætte glucagon(4-29)-genet i et gær-plasmid, der indeholder en syntetisk glucagon(1-3)-sekvens. Ligeringen skete ved KpnI-spaltningsstedet.

8 DK 156008 B

Plasmidkonstruktioner

Et syntetisk oligonucleotid, der koder for de første fire aminosyrer i glucagon og ender i et Kpnl-spaltningssted blev anbragt i en gærvektor efter MFal-signalleadersekvensen (J.

5 Kurjan og I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene MFa: A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-943. Det originale Hindlll spaltningssted ved enden af α-faktor leaderen blev ødelagt ved denne kobling. Koblingen er illustreret i det følgende: 10 α-faktor | glucagon 1-4 15 Glu Ala His Ser Gin Gly Thr "Hind III" Kpnl

AGCTCACTCTCAAGGTAC GTGAGAGTTC

20

Det resulterende plasmid pMT290 indeholdt begyndelsen af det strukturelle glucagongen anbragt umiddelbart efter Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala fra MFal leaderen og under TPI promotorkontrol. Dette plasmid er velegnet til indføring af sekvensen for 25 glucagon(4-29) fra plasmid pKFN4. Plasmidet indeholder imidlertid ikke noget gærsignal til terminering af transscriptionen. Sådanne termineringssteder er blevet rapporteret at kunne forøge udbyttet af et klonet protein med op til 10 gange (J. Mellor et al. Gene 24 (1983) 1-14). α-faktor transscriptionsterminatorsekvensen fra 30 pMT409 blev derfor i plasmidpMT544 anbragt efter glucagongenet.

Plasmid pMT544, der indeholder en sekvens, der koder for TPIp-MFal-leader-glucagon-MFalT, indeholder stadig en sekvens, der koder for den N-terminale Glu-Ala-Glu-Ala-forlængelse, der i disse konstruktioner kun fjernes af gæren i ca. 1/3 af 35 molekylerne. DNA-sekvensen, der koder for den C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala i MFal-leaderen blev fjernet fra pMT544 ved in vitro

9 DK 156008 B

deletionsmutagenese. Det fremkomne plasmid pKFN6 indeholder en sekvens, der koder for TPIp-MFal-signalleader(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-glucagon-MFalT· I en foretrukket konstruktion overførtes denne sekvens 5 til et stabilt, højkopital gærplasmid CPOT (ATCC nr. 39685), der kan selekteres for udelukkende ved tilstedeværelsen af glucose i vækstmediet. Det fremkomne plasmid blev benævnt pMT612.

10 Transformering

Plasmid pMT612 blev transformeret i S. cerevisiae stammer, der har deletioner i triosephosphatisomerase (TPI)-genet ved selektering for vækst på glucose. Sådanne stammer er normalt ude af stand til at vokse på glucose som den eneste carbonkilde, og 15 gror meget langsomt på et galactoselactatmedium. Denne defekt skyldes en mutation i TPI-genet opnået ved deletion og erstatning af en væsentlig del af dette gen med S. cerevisiae LEU 2 genet.

På grund af vækstdefekten sker der en stærk selektering for et . plasmid, der indeholder et gen, der koder for TPI. pMT612 inde-20 holder Schizo. pombe TPI-genet.

Plasmid pMT544 blev transformeret i en S. cerevisiae LEU 2 mutant ved selektering for leucinprototrophi (A. Hinnen, J.B. Hichs og G.R. Fink, "Transformation of Yeast"., Proc.Nat.Aca.Scc. 75 (1978) 1929).

25 En transformeret stamme M615, der indeholder plasmidet pMT612, blev deponeret af ansøgerne ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, d.

10. januar, 1985 og fik referencenummeret DSM 3184. DSM, der er et internationalt deponeringsinstitut, autoriseret under Buda-30 pesttraktaten af 1977, sikrer permanent deponering og offentlig adgang dertil i overensstemmelse med henholdsvis regel 9 og regel 11 i ovennævnte traktat.

DK 156008 E

10

Eksempel 1

Oligodeoxyribonucleotidsyntese

Beskyttede deoxyribonucleosid 3'-p-chlorphenylphospha-ter og beskyttede di- og trinucleot.id-3'-p-chlorphenylphosphater 5 blev fremstillet som beskrevet (G.R. Gough, K.J. Collier, H.L.

Weith, og P.T. Gilham (1979) Nucleic Acids Research 7, 1955-1964).

Pyridin blev gjort vandfrit ved refluks over og derpå distillation fra calciumhydrid.

10 Bæreren for oligonucleotidsyntesen ved hjælp af phos- photriestermetoden var fuldstændigt beskyttede deoxyribonucleosi-der bundet via en 3'-O-succinylgruppe til arninomethyleret 1% tværbundet polystyrenkugler (Bachem).

Syntesen af 33-mer (I) blev startet med 3 pmol DMTr-Bz 15 dA -polymer pakket i en kolonne (Omnifit, indre diameter 6,5 mm). Opløsningsmidler og reagenser blev tilført kolonnen ved hjælp af en HPLC-pumpe (Kontron LC pumpe 410) og et kontrolmodul (Kontron Programmer Model 200) ved hjælp af en pneumatisk aktiveret rotationsventil med seks ventiler (Rheodyne model 5011). Den 20 første cyclus bestod af fjernelse af dimethoxytritylgrupperne med 10% trichloreddikesyre i chloroform efterfulgt af vask med chloroform og pyridin. Koblingsreaktionen blev udført ved manuel injektion af 0,1 M dimethoxytritylthymidin-3'-O-p-chlorphenyl-phosphat, 0,3 M l-mesitylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol og 1 M 25 N-methylimidazol i vandfrit pyridin (B.S. Sproat og W. Banwarth (1983) Tetrahydron Letters £4, 5771-5774). Efter kobling ved stuetemperatur i 30 minutter blev polymeren vasket med pyridin og chloroform. Cyclustiden var 85 minutter. På lignende måde blev beskyttede di- og trinucleotid-3'-O-p-chlorphenylphosphater kob-30 let til den voksende oligonucleotid på bæreren. Beskyttelsesgrupper blev delvist spaltet fra den fuldt beskyttede 33-mer og denne blev spaltet fra bæreren ved behandling med 0,5 M tetra-methylguanidinium-pyridin-2-aldoximat i pyridin-vand (4:1) ved 37°C i 24 timer. (C.B. Reese, R.C. Titmas, og L. Yau (1978) 35 Tetrahydron Letters, 2727-2730). Basebeskyttelsesgrupperne blev fjernet ved behandling med koncentreret ammoniak ved 55°C i 24 timer. Til slut blev dimethoxytritylgrupperne fjernet ved behand-

11 DK 156008 B

ling med 80% vandig eddikesyre ved stuetemperatur i 30 minutter. 33-meren (I) blev renset ved HPLC på en C18 kolonne som beskrevet (H.J. Fritz, R. Belagaje, E. Brown, R.H. Fritz, R.A. Jones, R.G. Lees og H.G. Khorana (1978) Biochemistry Γ7, 1257-1267).

5 På lignende måde blev 13-meren (III), 16-meren (V) og 44-meren (IV) syntetiseret, og de to oligonucleotider (10-meren og 18-meren) blev anvendt som en syntetisk glucagon-(1-4)-linker til sammenføjning af α-faktor-leadersekvensen og glucagon(1-29)-genet. 33-meren (II) og den 26-mer mutagenesedeletionsprimer blev 10 syntetiseret på en automatisk DNA-syntesizer (Applied Biosystems Model 380A) under anvendelse af phosphoramiditkemi og kommercielt tilgængelige reagenser.

15 Eksempel 2

Syntese af et gen, der koder for glucagon(4-29)

Oligonucleotider blev mærket ved 5'-enden, som beskrevet (K. Norris, F. Norris, L. Christiansen og N. Fiil (1983)

Nucleic Acids Research 11, 5103-5112).

o 32 20 En blanding af 10 pmol af både I og 5'- P-mærket II og 20 pmol af III i 10 μΐ vand blev opvarmet til 60°C i 5 minutter

og derpå afkølet på is. 10 μΐ 132 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20 mM

MgC^/ 2 mMATP, 20 mM DTT, 100 μg/ml gelatine og 0,5 μΐ T4 ligase (200 enheder) blev tilsat. Ligeringsreaktionen blev udført ved 25 16°C i 2,5 timer, hvorefter ca 2/3 var ligeret. Den fremkomne 66-mer (I-II) blev renset ved polyacrylamidgelelektroforese under denaturerende betingelser efterfulgt af puffereluering.

På lignende måde blev 20 pmol af 5'- P-mærket V lige-32 ret med 20 pmol af 5'- P-mærket (III) og 20 pmol af IV i nærvæ-30 relse af 25 pmol af II ved 16°C i 2,5 timer. Den fremkomne 73-mer (III-V-IV) blev oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese under denaturerende betingelser efterfulgt af puffereluering.

2 pmol af både (I-II) og (III-V-IV) i 9 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgC^, 10 mM DTT og 50 μg/ml gelatine blev 35 opvarmet i 3 minutter ved 80°C og derpå afkølet i løbet af 30 minutter til 45°C. Efter opvarmning i 15 minutter ved 45°C blev reaktionsblandingen afkølet til 16°C, og der blev tilsat 1 μΐ

12 DK 156008 B

dNTP-blanding (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM af hver) og 1 μΐ DNA polymerase I, Klenow fragment (3,5 enheder). Udfyldningsreaktionen fik lov til at forløbe i 60 minutter ved 16°C, og derpå blev DNA isoleret ved phenolekstraktion og ethanoludfældning. DNA 5 blev fordøjet med Kpnl og Hindlll og ligeret til det store Kpnl-Hindlll fragment fra plasmid pLaC48 (et derivat af pBR322 indeholdende unikke Kpnl og Hindlll spaltningssteder).

Ligeringsblandingen blev overført til kompetente E. coli celler ved selektion for ampicillinresistens. Ved hjælp af 10 restriktionsenzymanalyse (Xbal, Kpnl og Hindlll) og DNA sekvent-ering (A. Maxam og W. Gilbert (1980) Methods Enzymol 65, 499-560) blev der identificeret en koloni, der indeholder et plasmid pKFN4, der indeholder det syntetiske glucagon(4-29)-gen.

15

Eksempel 3

Konstruktion af gærplasmider til udtrykkelse af glucagon(1-29)

Plasmid p285 blev skåret med restriktionsenzym Xbal og derpå forsynet med stumpe ender ved behandling med Klenow poly-20 merase og deoxyribonucleotidtriphosphater. Efter phenolekstraktion, ethanoludfældning og resuspension blev DNA skåret ved Hindlll, og et 10,5 kb fragment blev isoleret. Dette fragment indeholdt TPI promotoren (T. Alber og G. Kawasaki, J.Mol.

Applied.Genet., 1 (1982), 419-434) og MFal-signalleadersekvensen.

25 Plasmid p285 indeholder den indsatte sekvens TPIp-MFal-signal-leader-B-C-A-TPI^ og blev tilgængelig fra en deponeret gærstamme Z33 (ATCC nr. 20681). Plasmid pBoel 5 (pUC8 med en syntetisk Hindi, Hindlll sekvens indeholdende et Kpnl spaltningssted) blev skåret med restriktionsenzym Ndel, forsynet med stumpe ender ved 30 hjælp af Klenow polymerase som ovenfor og skåret med Kpnl, og til slut blev et 0,3 kb fragment isoleret. Disse to fragmenter blev ligeret ved hjælp af den syntetiske glucagon-(1-4)-linker fremstillet som beskrevet ovenfor, hvorved Kpnl spaltningsstedet i den i pUC8 indsatte sekvens blev forbundet til Hindlll spalt-35 ningsstedet ved position 263 i MFal-signalleader sekvensen. For at undgå indføringen af flere kopier blev linkeren ikke phospho-ryleret før ligering. Det oprindelige Hindlll spaltningssted

13 DK 156008B

ved enden af MFal-leaderen blev ikke gendannet ved hjælp af lin-keren. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. coli ved selektering for ampicillinresistens.

Et plasmid pMT290 (fig. 1), som indeholdt det ønskede 5 restriktionsmønster, blev opnået.

For at opnå et plasmid, der indeholder hele genet, der koder for glucagon(1-29) og også indeholder en transskriptionsterminer ingssekvens efter genet, blev et 6,5 kb Xhol-Kpnl frag.-ment fra pMT290 ligeret til et 5,1 kb Hindlll - Xhol fragment fra 10 pMT409 (pMTl83 med en 0,7 kb Xbal-BamHI deletion) og til det syntetiske Kpnl-Hind3 fragment, der koder for glucagon(4-29) fra pKFN4. Plasmid pMT183 er et derivat af YEP 13, der indeholder et indsat 2,1 kb SphI-BamHl fragment. Det indsatte fragment koder for udtrykkelse af MFal-genet fra S. cerevisiae under kontrol åf 15 alkoholdehydrogenasepromotoren fra Schizzosaccharomyces pombe. Fragmentet indeholder også i delen nær BamHI den sekvens fra MFal genet, der specificerer transskriptionstermineringen. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. coli ved selektion for · ampicillinresistens. En af de fremkomne plasmider, pMT544 (fig.

20 2), der udviser det forventede restriktionsmønster, koder for udtrykkelse af glucagon, men indeholder stadig den sekvens, der koder for den N-terminale Glu-Ala-Glu-Ala-forlængelse. Sekvensen, der koder for Glu-Ala-Glu-Ala, blev fjernet fra pMT544 ved in vitro mutagenese til dannelse af pKFN6. pMT544 blev lineariseret 25 ved skæring i det unikke Xbal spaltningssted i glucagongenet.

t 5'-mononucleotider blev fjernet fra 3'-enderne af det opnåede dobbeltstrengede DNA ved hjælp af Exo III nucleasebehandling. Exo III nucleasebehandlingen blev udført ved 23°C under betingelser, hvor ca. 250 nucleotider blev fjernet fra hver 3'-ende af det 30 lineariserede plasmid (L. Guo og R. Wu (1983), Methods in

Enzymology 100, 60-96). En kineret 26-mer mutagenesedeletions-primer d(CTTTGGATAAAAGACACTCTCAAGGT) blev hybridiseret til mutationsstedet (fig. 3). Et dobbeltstrenget cirkulært DNA blev fremstillet ved udfyldning med Klenowpolymerase og ligering med T4 35 ligase. Det oprindelige Xbal spaltningssted i glucagongenet blev ødelagt ved Klenowudfyldning og den efterfølgende ligering. Efter transformering af E. coli (MT172) blev mutanter identificeret ved 32

14 DK 156008 B

kolonihybridisering med 5'- P-mærket 26-mer-deletionsmutagenese primer. Plasmid fra otte mutanter blev analyseret ved Kpnl + PstI fordøjelse, hvorved den ønskede deletion af 12 baser blev bekræftet. Tre af de otte mutanter var "rene" mutanter, men plasmid fra 5 disse blev alligevel retransformeret i E. coli (MT172).

Det ødelagte Xbal spaltningssted i glucagongenet blev rekonstrueret ved ligering af et 4,4 kb BamHI - Xhol og et o,9 kb BamHI - Kpnl fragment (indeholdende glucagon(4-29)-genet) fra pMT544 med et 6,6 kb Xhol - Kpnl fragment fra plasmider fra to af 10 mutanterne med 12 bp deletionen (se fig. 4).

De to ligeringsblandinger blev anvendt til transformering af E. coli (MT 172), og plasmid isoleret fra transformanterne blev screenet for tilstedeværelsen af et Xbal spaltningssted (Xbal + EcoRI fordøjelse). Deletionen blev bekræftet ved DNA 15 sekventering (A. Maxam og W. Gilbert (1980) Methods in Enzymology 65, 499-560) af et Xbal-Sall fragment fra fire plasmider. Et plasmid, pKFN6, blev udvalgt til yderligere anvendelse.

Et 2,1 kb BamHI - Sphl (partielt fordøjet) fragment fra pKFN6 indeholdende TPIp-MFal signalleader-(minus Glu-Ala-Glu-20 Ala)-glucagon(1-29)-MFalT blev ligeret til et ca. 11 kb BamHI -Sphl fragment fra plasmid CPOT indeholdende S. pombe TPI-genet. Ligeringsblandingen blev anvendt til transformering i E. coli ved selektering for ampicillinresistens.

Det resulterende plasmid var pMT612 (se fig. 2).

25

Eksempel 4

Udtrykkelse af glucagon i gærstamme MF556 S. cerevisiae stamme 362 (leu 2) blev dyrket på et YPD 30 medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) til en OD^qq på. 2,1. 100 ml dyrkningsmedium blev høstet ved centrifugering, vasket med 10 ml vand, re-centrifugeret og resuspenderet i 10 ml af (1,2 M sorbitol, 25 mM Na^EDTA pH = 8,0, 6,7 mg/ml dithiotreitol). Suspensionen blev 35 inkuberet ved 30°C i 15 minutter og centrifugeret, og cellerne blev resuspenderet i 10 ml af (1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat pH = 5,8, 2 mg Novozym® 234). Suspensionen blev

15 DK 156008 B

inkuberet ved 30°C i 30 minutter, og cellerne blev samlet ved centrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 nM Tris (Tris = Tris(hydroxymethyl)-aminometan) pH = 7,5) og resuspenderet i 2 ml CAS. Til transfor-5 mering blev 0,1 ml CAS-resuspenderede celler blandet med ca. 1 μg plasmid pMT544 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. 1 ml af (20% polyethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris pH = 7,5) blev tilsat, og blandingen blev henstillet yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev centrifugeret, og 10 pillerne resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaC^f 14 μg/ml leucin) og inkuberet ved 30°C i to timer. Suspensionen blev derpå centrifugeret, og pillerne resuspenderet i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. 6 ml topagar (SC medium fra Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 15 1981) med leucin udeladt og indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar) ved 52°C blev tilsat, og suspensionen blev hældt ud ovenpå plader, der indeholder det samme agar-størknede, sorbitolholdige medium. Transformantkolonier blev udtaget efter 3 dage ved 30eC, reisoleret og anvendt til at starte flydende kulturer. En sådan 20 transformant MT556 (=MT 362/pMT544) blev udvalgt til yderligere karakterisering.

Stamme MT566 blev dyrket i et syntetisk komplet medium SC (Sherman et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) med leucin udeladt. En 1 liter kultur i 2 liter 25 rystekolber blev rystet ved 30°C til ODg00nm 7 til Kultu“ ren blev derpå centrifugeret, og supernatanten blev fjernet til yderligere analyse.

Glucagonlignende immunoreaktivt materiale (GLI) blev målt i supernatanten fra MT556 ved radioimmunoassay med antiglu-30 cagonserum K-6248 (Heding L.G., (1983) Handbook of Experimental Pharmacology, Glucagon I: P.J. Lefevre Ed. Springer Verlag pp. 189-202). Dette antistof genkender sekvensen i midten af gluca-gonmolekylet.

Udtrykkelsesniveauerne af immunoreaktivt glucagon(1-29) 35 i transformerede gærceller var 177 nmol/litér supernatant.

16 DK 156008 E

GLI-peptider blev udvundet fra MT556 supernatanten. Til 125 800 ml af supernatanten blev der sat I-mærket glucagon og 96% EtOH til opnåelse af en alcoholkoncentration på 5% (v/v). Supernatanten blev koncentreret på en Sep-Pak® kolonne (Waters) og 2/3 5 af koncentratet svarende til 533 ml supernatant blev oprenset på en antiglucagon immunoabsorptionskolonne.

Eluatet fra antiglucagonkolonnen blev fraktioneret ved HPLC på en 10 μ waters μBondopak C-18 kolonne (3,9 x 300 mm). A-og B-pufferne var henholdsvis 0,1% TFA i H20 og 0,07% TFA i MeCN.

10 Kolonnen blev ækvilibreret med 25% B (flow: 1,5 ml/minut), og peptiderne blev elueret med en lineær gradient af MeCN (1%/minut) og detekteret ved 276 nm.

Toppen svarende til GLI eluerer i samme område som pancreasglucagon(1-29) standard. Denne fraktion blev koncentre-15 ret, opløst igen og underkastet en aminosyresekvensanalyse. Sekvensanalysen af de isolerede peptider blev udført med en Gas Phase Sequencer (Moody, A.J., Thim, L., Valverde, I. FEBS Lett., 172 (1984), 142-148). De følgende resultater opnåedes: 20

Oprensning af GLI-peptider fra MT556 Trin Rumfang GLI (antistof K-6248) Udbytte _ml_nmol_%

Supernatant 800 142 100 25 Sep-Pak koncentrat 2 111 78

Antigluca- gon-kolonne 0,2 '29 20 HPLC 2,0 11 8 30

Fra sekventeringsresultaterne kunne det konkluderes, at de udtrykte produkter bestod af tre peptider: 35

17 DK 156008 B

Glu-Ala-Glu-Ala-Glucagon(l-29) 33%

Glu-Ala-Glucagon(l-29) og 33% glucagon(1-29) 33% 5 De tre peptider fandtes i de angivne relative mængder. Det kunne yderligere konkluderes, at Arg-Arg-sekvensen var intakt i alle tre peptider.

10 Eksempel 5

Udtrykkelse af glucagon i gærstamme MT615 S. cerevisiae stamme MT501 (a/a,Atpi/Atpi, pep4-3/pep4-3) blev transformeret med pMT612 som beskrevet i eksempel 4 med følgende modifikationer: 15 1) Før transformering blev stamme MT501 dyrket på YPGaL (1%

Bacto gærekstrakt, 2% Bactopepton, 2% galactose, 1% lactat) til ODgoo På 0,6. 2) SOS-opløsningen indeholdt YPGaL i stedet for YPD. En transformant MT615 (=MT501/pMT612) blev udvalgt til yderligere karakterisering. Stamme MR615 blev dyrket som beskrevet 20 for MT556, men på et YPD medium (Sherman et al., Methods in Yeast

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) til en OD,nr. på

o U U

15.

Glucagon blev isoleret fra MT615 supernatanten. To isoleringer blev udført. I den første blev peptiderne fra super- 25 natanten bundet til en Merck C18 kolonne, elueret med 60% ethanol og derpå fraktioneret på en Waters HPLC SP ionbytter. Denne meto- 125 de var kun en delvis succes, da det anvendte I-mærkede glucagon blev kvantitativt udfældet under fremstillingen af C18 elu-atet til fraskillelse på SP. I det andet forsøg blev peptider i 30 MT615 supernatanten bundet til SP Sephadex, elueret og fraktioneret ved reverse phase HPLC. Udvinding af GLI blev målt ved RIA (Heding L.G. (1971) Radiological determination of pancreatic and gut glucagon in plasma, Diabetologia 1_, 10-19) under anvendelse af antiglucagonserum K6248 og K5563 (der genkender C terminalde-35 len af glucagon), (Heding L.G., (1983) Handbook of Experimental Pharmacology, Glucagon I: P.J. Lefebvre, Ed. Springer Verlag, s. 189-202).

18 DK 156008 B

1. isolering 125 I-svmeglucagon blev sat til 900 ml MT615, batch 1, og 800 ml blev fraktioneret som følger. Prøven blev indstillet til 5% ethanol og påført en 4,8 x 1,5 cm kolonne af Merck Lichro- 5 prep C18 (25-40μ) med ca. 200 ml/time. Efter vask af kolonnen med 50 ml 5% ethanol i 25 mmol/liter ammoniumformiat, pH 3,5 og 15% ethanol i den samme puffer, blev de tilbageholdte peptider elue- ret med 60% ethanol i ammoniumformiat.

Ved fortyndning af de rå peptider i vand (til formind- 10 skelse af både ionstyrken og det procentvise indhold af organisk opløsningsmiddel) dannede der sig et voluminøst bundfald, der 125 indeholdt størstedelen af I-glucagonet. Dette udelukkede den planlagte anvendelse af en SP-ionbytter ved pH 3-5. Bundfaldet blev opløst ved pH 9,0 og genudfældet ved pH 4,0. Prøven blev 15 opløst i 2,5 mmol/liter ammoniumformiat, pH 7,5, i 20% acetoni- tril til fraktionering på en Waters DEAE ionbytter. Når prøven 12 5 blev påført, ville I-glucagonet ikke bindes. Gennemløbet fra DEAE kolonnen blev derpå koncentreret i vacuum, og peptiderne blev fraktioneret ved reverse phase HPLC på en 250 x 4,6 mm ko-20 lonne af Nucleosil 5 μ C18.

2. isolation

To gram SP Sephadex C25 (andre ionbyttere med lignende egenskaber kan anvendes) blev sat til 200 ml MT 615, batch 2, (pH 25 indstillet til 4,3) og suspensionen blev omrørt i 20 minutter ved stuetemperatur. SP Sephadex blev fraskilt ved filtrering i en glaskromatografikolonne med en diameter på 2,5 cm, vasket med 50 ml 25 mmol/1 ammoniumformiat, pH 3,5, og de bundne peptider blev elueret med 500 mmol/1 ammoniumformiat pH 8,4. Glucagon blev 30 isoleret fra dette eluat ved reverse phase HPLC på en 250 x 4,6 mm kolonne af Nucleosil C18.

Fordelingen af glucagonlignende immunoreaktivitet (GLI) under fraktioneringen blev målt ved RIA under anvendelse af antistoffer, der genkender glucagon(11-15) og den C-terminale del af 35 glucagon (henholdsvis K6248 og K5563).

19 DK 156008 B

Mængden af HPLC "glucagon" i fraktionerne blev bestemt ved HPLC. Den anvendte procedure blev anvendt til at analysere en prøve uden tilsat glucagon, og derpå til identificering af "glucagon" ved tilsætning af en international glucagonstandard.

5 uv af "glucagon" toppen blev derpå anvendt til at beregne mængden af HPLC "glucagon" i prøven. Basis-linien til bestemmelse af højden af toppen var uv sporstoffet stødende op til "glucagon" toppen. Det blev forudsat, at 1 mg (290 nmol) glucagon/ml har en absorption på 2,0 cm 1 ved 276 nm.

10

Resultater

Indholdet af HPLC "glucagon" og GLI i MT 615, batch 1 og 2, er angivet i tabel 1.

15 En analytisk HPLC profil af ubehandlet MT615 superna tant (Batch 1) alene (øverste felt), og efter tilsætning af 3 μg glucagon (nederste felt) er vist i fig. 5. Søjlen var en Macherey-Nagel Nucleosil 5 micron C18,250 x 4,6 mm ækvilibreret med 100 mmol/liter ammoniumformiat, pH 3,5, i 25% acetonitril ved 20 1.0 ml/min. Efter to minutter blev prøven elueret med en gradient af acetonitril i ammoniumformiat (25% til 30% i 3 minutter, derpå 30% til 40% i 35 minutter). Eluatets uv absorption blev målt ved 280 nm og en følsomhed på 0,08 absorptionsenheder på fuld skala. HPLC glucagon er skraveret i den øvre kurve. Det fremgår, at en 25 peptidtop (Rfc 20,38) forøgedes ved tilsætning af glucagon, og man antog, at dette materiale var HPLC "glucagon".

Den præparative fraktionering af det koncentrerede DEAE-gennemløb er vist i fig. 6. HPLC separationen blev udført som ved fig. 5 med undtagelse af, at uv absorptionen blev målt 30 ved 280 nm og en følsomhed på 1,28 absorptionsenheder på fuld skala. Den øverste kurve viser den præparative HPLC separation af koncentreret DEAE-gennemløb, og det nederste felt viser fordelingen af GLI i fraktionerne. Eluatet fra søjlen blev reduceret i vacuum, frysetørret og opløst i 0,1% eddikesyre i 60% ethanol til 35 GLI assay. "Glucagon" Rt20,51 er blevet fuldstændig sekventeret, og viste sig at være glucagon.

125

DK 156008B

Udbytterne fra MT615, batch 1, af I-glucagon, HPLC "glucagon" og GLI under fraktioneringen er angivet i tabel 2, og udbyttet af HPLC "glucagon" fra batch 2 er angivet i tabel 3.

Det blev konkluderet, at gærkonstruktionen MT615 frem-5 stiller glucagon i en mængde fra 250 - 1000 nmol/1 (vurderet ved HPLC).

Tabel 1 10 "Glucagon" i 2 batcher af MT615 GLI (nraol/1)

Batch_HPLC-Glucagon (nmol/1) K6248 K5563 MT615, batch 1 250 1516 557 15 MT615, batch 2 960 3708 2145

Tabel 2

Udbytte af "glucagon" fra MT615, batch 1 20 1?1- GLI (nmol)a

Prøve I-glucagon HPLC "glucagon" K6248 K5563 _%_(ranol)__ 25 Start (800 ml) 100 197 1212 446

Lichroprep 60% ethanol (30 ml) 81 91 (46%) 690 600 30 DEAE start (24 ml) 72 48 (24%) 421 448 DEAE BT (35 ml) 47 67 (34%) 287 404

PREP.HPLC

35 Start (2 ml) 35 31 (16%) 200 200 "Glucagon" (0,5 ml) ingen måling 44 (22%)_31 (3%) 43 (10%) a) en vis fortyndingseffekt i de fleste prøver og værdier er 40 givet som middelværdier af 2 eller 3 fortyndninger

21 DK 156008 B

Tabel 3

Udbytte af "glucagon” fra MT615, batch 2

Prøve_ HPLC glucagon (nmol) 5 Start (200 ml) 192 SP filtrat (215 ml) 40 (21%)a SP eluat (18 ml) 117 (61%) HPLC - C18 (1 ml) 118 (61%) 10 a) "Glucagon" top meget lille og vanskelig at kvantificere.

Claims (2)

22 DK 156008B 5 10

1. Fremgangsmåde til fremstilling af glucagon i gær, kendetegnet ved, at en transformeret gærstamme, der 15 indeholder en replicerbar ekspressionsvektor omfattende et gen, der koder for glucagon, dyrkes i et egnet næringsmedium efterfulgt af udvinding af glucagon fra næringsmediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g-20 n e t ved, at genet, der koder for glucagon, er et syntetisk gen.