DK149045B - Fremgangsmaade til rensning af sekretin - Google Patents

Description

149045 i o

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af sekretin.

Sekretin, et hormon af duodenum, er et heptacosa-peptidamid med formlen 5 H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Arg-Leu-

Arg-Asp-Ser-Ala-Arg-Leu-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu- -Val-NH2.

Det stimulerer bugspytkirtlens hydrogencarbonatproduk-tion og anvendes klinisk til undersøgelse af pankreasfunk-10 tionen.

Sekretin er hidtil blevet renset ved modstrømsfordeling (jf. J.Am. Chem. Soc. 8£, 6753 (1967)) og ionbytter-chromatografi på SP-Sephadex C 25 (jf. Chem. Ber. 105 (1972), side 2515). Efter den omstændelige modstrømsfordeling sam-15 menrøres de sekretinholdige prøver med en sur bytter ("al-genic acid") og frasuges. Det derved absorberede sekretin elueres med 0,2 N HC1, og på en svagt basisk bytter ombyttes saltsyren med eddikesyre. Det er således efter modstrømsfordelingen nødvendigt med yderligere to ionbytterchroma-20 tografier til oparbejdelsen.

Ved rensningen via ionbytterchromatografi på SP-Se-phadex C 25 elueres sekretin-acetat, der udvindes af råt sekretin ved behandling med en svagt basisk ionbytter (i acetatform), med ammoniumcarbonatpuffere med stigende mo-25 laritet og specielle pH-værdier. Elueringen varer relativt længe, og de fremkomne eluater indeholder foruden sekretin også ammoniumcarbonat, der ved syrning med eddikesyre skal omdannes til ammoniumacetat og fjernes ved gentagne frysetørringer .

30 Da sekretin i vandige opløsninger imidlertid ved varende mister biologisk ^aktivitet, kan der ved begge de kendte tidskrævende rensningsmetoder kun udvindes små mængder af højaktivt sekretin, for ved større mængder bliver opholdstiden for lang og dermed også aktivitetstabet for 35 stort.

2 149045

O

Det har nu overraskende vist sig, at sekretin som hydrochloric! eller hydrobromid kan renses ved Chromatogra-fi på en alkyleret dextrangel, når der elueres med vand eller stærkt fortyndet saltsyre eller hydrogenbromidsyre.

5 Til elueringen anvendes der fortrinsvis 0,001-0,005 N saltsyre eller hydrogenbromidsyre, da sekretins biologiske aktivitet ikke aftager så hurtigt i disse opløsninger som i rent vand.

- Fordelen ved denne metode består i, at det kun 10 er nødvendigt med en enkelt rensningsproces, og at sekretin kan fås saltfrit ved en enkelt frysetørring. Det sure elueringsmiddel kan også afpufres med op til ækvimolæ-re mængder af en aminosyre, som f.eks. cystein, alanin eller glycin. Selv i disse afpufrede opløsningsmidler holder 15 sekretinets biologiske aktivitet sig bedre end i rent vand.

Det således udvundne sekretin er kontamineret med den tilsatte aminosyre, hvilket eventuelt også kan være ønskeligt ved anvendelse af det rensede sekretin i præparater.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig 20 ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Sekretin anvendes som diagnostikum ved kontrollering af de ekskretoriske pankreasfunktioner og som terapeutikum ved Ulcus duodeni.

25 Eksempel Råt sekretin og sekretinrensning a) 1,69 g råt cysteinhydrochloridholdigt sekretin--hydrochlorid, der er fremkommet ved behandling af tert.-butylgruppe-beskyttet sekretin (1,5 g) med cysteinhydrochlo-30 rid, trifluoreddikesyre og saltsyre, opløses i ca. 10 ml 0,001 N cysteinhydrochlorid-opløsning og chromatograferes på en "Sephadex® LH-20"-søjle (200 x 4 cm). Der elueres med 0,001 N cysteinhydrochlorid-opløsning, og der opfanges fraktioner på 300 dråber. De gode sekretinfraktioner 35 er i den nedadgående gren af den første top (ca. 32.-37.

fraktion). De sekretinholdige fraktioner forenes og fryse- 1Λ9045 3

O

tørres, og der fås et udbytte på ca. 400 mg. I de efterfølgende fraktioner kan der yderligere udvindes ca. 80 mg let forurenet sekretin. Hovedfraktionen på 400 mg har ifølge aminosyreanalyse et peptidindhold på 65% og en biologisk 5 aktivitet på 2600 enheder pr. mg. Dette svarer til en aktivitet på 4000 enheder pr. mg peptidbase.

Udbytte henført til beskyttet sekretin: 22%. Foruden salte og vand indeholder det således isolerede sekretin yderligere ca. 5% cysteinhydrochlorid.

10 Aminosyreanalyse: Asp (2,0), Thr (1,9), Ser (3,1), Glu (3,0),

Gly (2,0), Ala (1,1), Cys (0,7), Val (1,1), Leu (6,0), Phe (1,0), His (1,0) og Arg (3,9).

1,328 g råt ikke-cysteinhydrochloridholdigt sekre-tin-hydrochlorid, der er fremkommet ved behandling af 15 tert.butylgruppe-beskyttet sekretin (1,5 g) med trifluor-eddikesyre og saltsyre, opløses i ca. 10 ml 0,005 N HC1 * og chromatograferes på en "Sephadex ® LH-20"-søjle (200 x 4 cm), og der elueres med 0,005 N HC1. Der opfanges fraktioner på 300 dråber. De gode sekretinfraktioner er i den 20 opadstigende gren af den anden top (ca. 34.-39. fraktion). Fraktionerne forenes og frysetørres, og der fås et udbytte på 419 mg. I de efterfølgende fraktioner kan der yderligere udvindes 296,5 mg forurenet sekretin. Hovedfraktionen på 419 mg har ifølge aminosyreanalyse et peptid-25 indhold på 70% og en biologisk aktivitet på 2600-2700 enheder pr. mg. Resultatet af aminosyreanalysen svarer til det i forsøg a) beskrevne, men omfatter dog ikke cystein.