DK147198B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 9-hydroxyethoxymethylguanin-monophosphat eller salte deraf - Google Patents

Description

147198

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af 9-hydroxyethoxymethylguanin-monophosphat eller

salte deraf med formlen I

0H

i. N

L T >

H2N 1 I T

CH2.0.CH2.CH2.0-P-0Z 1 ow hvori W og Z er ens eller forskellige og hver betegner et hydrogenatom eller en farmaceutisk acceptabel kation.

2 147198 9-(2-Hydroxyethoxymethy1)-derivater af puriner vides at have antiviral virkning mod forskellige klasser af DNA- og RNA-virus både ved in-vitro- og in-vivo-forsøg, se beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3926/75. Navnlig er disse forbindelser aktive som antivirale midler mod vaccinia- og herpes-virus, herunder h. simplex, h. zoster og varicella hos pattedyr, hvilke virus forårsager sådanne sygdomme som herpetisk keratitis hos kaniner og her-petisk encephalitis hos mus.

Det har nu overraskende vist sig, at forbindelserne med formlen I og navnlig saltene på én gang udviser en forholdsvis høj antiviral virkning og en høj vandopløselighed, hvilken sidste egenskab er en i høj grad ønsket egenskab for terapeutiske forbindelser, navnlig forbindelser af den foreliggende type. Specielt gælder det, at det omhandlede 9-hydroxyethoxymethylguanin-monophosphat ved omdannelse til de omhandlede salte får forøget vandopløseligheden i langt betydeligere grad end tilfældet er for andre, sammenlignelige estere af 9-hydroxyethoxymethylguanin. For 9-hydroxyethoxymethyl-guanin-monophosphat gælder det desuden, at det har en meget større opløselighed i det mindste ved en pH-værdi på fra 1 til 7,5 sammenlignet med den tilsvarende uphosphorylerede forbindelse.

Den farmaceutisk acceptable kation kan være valgt fra gruppen natrium, kalium, lithium, calcium/2, magnesium/2, aluminium/3 eller ammonium. Forbindelser med formlen I, hvori Z er natrium, kalium eller ammonium, og W er hydrogen, foretrækkes, og forbindelser med formlen I, hvori Z er natrium eller ammonium, og W er hydrogen, er særlig foretrukne.

I den ovenstående definition for W og Z er de polyvalente kationer udtrykt som calcium/2, magnesium/2 og aluminium/3, hvilket skal betyde kationen divideret med dens valens, dvs. Ca /2, Mg /2 og Al+++/3. Dette skal angive, at calcium- eller magnesium-kationen foreligger i ionisk association med to phosphat-oxygenatomer og aluminium- kationen med tre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at man

(a) omsætter en forbindelse med formlen II OH

.iyV

. Λ.Α./ 2 ch2.o.ch2.ch2.oh 3 147198 med et phosphoryleringsmiddel til dannelse af en forbindelse med formlen I, hvori både W og Z er hydrogenatomer, eller

(b) ammonolyserer en forbindelse med formlen III

OH

xX> . ...

Cl I

CH2.0.CH2.CH2.O-P-OH

OH

til dannelse af en forbindelse med formlen I, hvori både W og Z er hydrogenatomer, eller (c) underkaster en forbindelse med formlen I, hvori det ene af eller begge symbolerne W og Z betegner en saltdannende kation, en ombytningsreaktion med en opløsning af et salt indeholdende den ønskede, farmaceutisk acceptable kation, hvorefter man om ønsket omdanner en forbindelse med formlen I, hvori W og Z begge er hydrogen, til en forbindelse, hvori det ene af eller begge symbolerne W og Z er en farmaceutisk acceptabel kation, ved omsætning med en base eller et salt indeholdende den ønskede kation.

Ved fremgangsmåde (a) foretrækkes der til phosphoryleringen derivater af phosphorsyre, hvori 1-3 hydroxygrupper er erstattet af halogenatomer, f.eks. chloratomer, såsom phosphoroxychlorid. Op til to af hydroxygrupperne kan også være erstattet af alkoxygrupper, der eventuelt bærer yderligere substituenter, f.eks. benzyloxy-grupper. Sådanne phosphorhalogenderivater eller phosphater anvendes under de sædvanlige neutrale eller alkaliske betingelser, idet de sidstnævnte fortrinsvis kræver aktivering med eksempelvis carbodi-imider, f.eks. dicyclohexylcarbodiimid, undtagen når det pågældende phosphat foreligger i form af anhydridet.

Når mindst to af hydroxygrupperne i phosphorsyrederivatet er erstattet af halogen, er det efter omsætning med forbindelsen med formlen II nødvendigt at fjerne halogenet ved-nogenlunde mild vandig hydrolyse, f.eks. under anvendelse af et molært askvi valent vand i et med vand blandbart opløsningsmiddel, såsom alkohol.

Substituerede eller usubstituerede alkoxygrupper, der er ind- 147198 4 ført med et phosphat, kan hydrolyseres i et egnet vandigt medium i nærværelse af baser i et efterfølgende trin. Aromatisk substituerede alkoxygrupper, såsom benzyloxygrupper, kan også underkastes hydrogeno-lyse, fortrinsvis i nærværelse af en katalysator, efter de sædvanlige metoder til reduktiv spaltning.

En foretrukken fremgangsmåde til phosphorylering af en forforbindelse med formlen II som defineret ovenfor indebærer omsætning med phosphoroxychlorid i nærværelse af et trialkylphosphat og fortrinsvis ved en temperatur på ca. 0°C eller mindre.

Andre anvendelige fremgangsmåder til fremstilling af monophos-phatet omfatter omsætning af en forbindelse med formlen II med phosphoroxychlorid i tørt pyridin.

Forbindelsen med formlen II kan betragtes som et mellemprodukt ved fremstillingen af forbindelser med formlen I og kan fremstilles ved de fremgangsmåder, der er beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3926/75.

Omdannelsen af en forbindelse med formlen III ved fremgangsmåde (b) kan gennemføres på flere måder, f.eks. kan omdannelsen af chloratomet til en aminogruppe ske som beskrevet i "Heterocyclic compounds - Fused Pyrimidinés Part II Purines", redigeret af D.J.

Brown (1971), publiceret af Wiley - Interscience.

Forbindelser med formlen III kan betragtes som mellemprodukter ved fremstillingen af forbindelser med formlen I og kan fremstilles på analog måde som ved fremgangsmåde (a).

Farmaceutisk acceptable salte af 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat kan fremstilles ved neutralisering af monophos-phatet i dets sure form med en ækvivalent (dvs. ækvinormal) mængde af en base, såsom et hydroxid, hydrogencarbonat eller carbonat, der indeholder den ønskede kation, dvs. natrium, kalium, ammonium, calcium, lithium, magnesium eller aluminium. De kan også fremstilles ved fremgangsmåde c) ifølge opfindelsen ved en cjtbytoingsreaktion, hvorved et salt af monophosphatet behandles med en opløsning, fortrinsvis en vandig opløsning, af et salt, der indeholder den ønskede kation. F.eks. behandles det tungtopløselige bariumsalt af 9—(2— hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat i vandig suspension med natriumsulfat til fjernelse af bariumet som det yderst uopløselige bariumsulfat, hvorved der bliver natrium-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat tilbage i opløsning.

147198 5

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat.

Phosphoroxychlorid (0,03 ml) sattes i én portion til en omrørt suspension af 2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin (20 mg) 1 triethylphosphat (0,3 ml) ved -8°C. Man lod temperaturen stige til 0°C i løbet af 30 minutter. Reaktionsblandingen omrørtes derefter ved 0°C i 40 minutter og ved +5°C i 50 minutter. Den hældtes derefter ud på is, og pH-værdien indstilledes på 7 med 2 N kaliumhydroxidopløsning. Den opnåede opløsning ekstraheredes 2 gange med chloro-form (2x2 ml). Den vandige fase indstilledes til pH 8-8,5 med 2 N kaliumhydroxidopløsning, og der tilsattes bariumacetat (105 mg). Det opnåede bundfald af bariumphosphat fjernedes ved filtrering.

Den overliggende væske behandledes med en stort overskud af ethanol, hvorved der udfældedes råt barium-2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin-monophosphat. Det faste stof opsamledes ved filtrering og suspenderedes i ethanol. Den ethanoliske suspension opvarmedes derefter på et dampbad i adskillige minutter, afkøledes og filtreredes. Det opsamlede bundfald vaskedes med vandfri ether og tørredes, hvorved der opnåedes barium-2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypo-xanthin-monophosphat (26 mg).

Ammoniumsulfat (3,96 mg) sattes til en omrørt suspension af barium-2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin-monophos-phat (7 mg) i vand (0,5 ml). Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 15 minutter og afkøledes derefter i et isbad. Det udfældede bariumsulfat fjernedes ved filtrering og vaskedes med vand (1 ml) og ethanol (10 ml). Det samlede filtrat og vaskevæsker inddampedes under formindsket tryk, og den opnåede remanens opløstes i methanol (3 ml). Den methanoliske opløsning overførtes til en bombe af rustfrit stål foret med Teflon, og desuden indførtes der methanol (8 ml) mættet med gasformig ammoniak ved isbadtemperatur i bomben. Den tæt tillukkede bombe anbragtes i en 122° varm ovn i 4 timer, afkøledes og åbnedes. Opløsningsmidlet afdampedes til opnåelse af et minimalt rumfang. Den tilbageværende reaktionsblanding blev anbragt som pletter på Eastman Chromatogram cellulose-TLC-ark, som derpå fremkaldtes i n-propanol:vand (70:30 vol/vol). Båndene ved Rf 0,16 og 0,34 blev udskåret og suspenderedes i tris-buffer (0,6 ml) med pH 8, og cellulosen fjernedes ved filtrering.

6 1Λ7198

Disse bånd eftervistes at indeholde 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat og 2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin-monophosphat ved enzymatisk dephosphorylering med alkalisk phospha-tase til dannelse af henholdsvis 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin og 2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin. Alkalisk phospha-tase (2 yl) fra E. coli sattes til filtratet, og blandingen opvarmedes til 32°C i 2 timer. Den undersøgtes derefter ved tyndtlags-chromatografi på Eastman Chromatogram celluloseark i tre opløsningsmiddelsystemer: (a) n-propanol:vand (70:30 vol/vol) (b) vand (c) n-propanol:kone. ammoniumhydroxid:vand (60:30:10 vol/vol) og der var to pletter til stede i hvert system svarende til 9—(2— hydroxyethoxymethyl)-guanin (A) og 2-chlor-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-hypoxanthin (B).

Opløsningsmiddelsystem Rf (A) Rf (B) Rf af reaktionsprodukt (a) 0,51 0,64 0,51 og 0,65 (b) 0,68 0,97 0,67 og 0,97 (c) 0,51 0,71 0,51 og 0,71

Eksempel 2 9-(2-Hydroxyethoxymethy1)-guanin-monophosphat.

Phosphoroxychlorid (0,76 ml) sattes til en omrørt, afkølet (-10°C) blanding af 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin (0,225 g) og triethylphosphat (5 ml). Man lod temperaturen af reaktionsblandingen stige til 0°C i løbet af 30 minutter, og reaktionsblandingen holdtes ved denne temperatur i 2 timer. Den hældtes derpå ud i en blanding af is og vand, og pH-værdien indstilledes på 7 med 2 n kaliumhydroxidopløsning. Den opnåede opløsning ekstraheredes 2 gange med chloro-form og 1 gang med ether. pH-Værdien af den tilbageværende vandige opløsning indstilledes på 7,1 med 2 N kaliumhydroxid, og opløsningen lyophiliseredes derpå. Det opnåede hvide faste stof opløstes i vand (7 ml), og der tilsattes methanol (7 ml) til udfældning af de uorganiske salte, som derpå fjernedes ved filtrering. Der sattes acetone (70 ml) til filtratet, hvorved der udfældedes et hvidt gummi -agtigt stof. Det gummiagtige stof opløstes i vand (7 ml), der tilsattes ethanol (7 ml), og blandingen filtreredes. Der tilsattes et 147198 7 stort overskud af acetone (70 ml), hvorved det gummiagtige stof udfældedes igen. Det gummiagtige stof opløstes i ethanol (ca. 20 ml), og opløsningsmidlet fjernedes ved momentan-fordampning, hvorved der opnåedes et hvidt pulver (2,6 g), som var en blanding af uorganiske salte og det ønskede phosphat. Det faste stof opløstes i vand (10 ml), hældtes på en Bio-Gel P-2 kolonne (200-400 mesh, 2,7 x 90 cm) og elueredes med vand. Efter at der var opsamlet 166 ml eluat, eluere-des størstedelen af monophosphatet i et volumen på 50 ml, som det påvistes ved tyndtlagschromatografi på Eastman Chromatogram cellulose i n-propanol:vand (70:30 vol/vol); Rf = 0,26 for 9-(2-hydroxyethoxy-methyl)-guanin-phosphat og Rf = 0,11 for kalium-9-(2-hydroxyethoxy-methyl)-guanin-phosphat. Eluatet lyophiliseredes til opnåelse af 0,28 g af et fast stof, som ved ultraviolet spektroskopi eftervistes at indeholde 0,2 g monophosphatprodukt.

Eksempel 3

Ammonium-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat.

9-(2-Hydroxyethoxymethyl)-guanin-phosphat (0,28 g) opløstes i vand (30 ml), og opløsningens pH-værdi indstilledes på 6 med 6 N saltsyre. Produktet adsorberedes på 14 ml pakket aktivt kul (Fischer 5-690B, 50-200 mesh, syrevasket og deaktiveret med toluen). Det aktive kul vaskedes godt med vand og elueredes med 70 ml 50%'s vandigt ethanol indeholdende 2% koncentreret ammoniumhydroxid. Opløsningsmidlet afdampedes under formindsket tryk til opnåelse af ammonium-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-monophosphat (0,048 g); Rf = 0,30 på Eastman cellulose i n-propanol:vand (70:30 vol/vol).

Eksempel 4

Dinatrium-9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-phosphat.

Phosphoroxychlorid (54 ml) sattes i løbet af et tidsrum på 3 timer til en omrørt, afkølet (-30 til -20°C) blanding af 9—(2— hydroxyethoxymethyl)-guanin (25 g) og triethylphosphat (250 ml).

Man lod reaktionsblandingens temperatur stige til 0°C i løbet af 45 minutter, og reaktionsblandingen holdtes ved denne temperatur i yderligere 45 minutter. Den hældtes derpå ud i en blanding af is og vand, og pH-værdien indstilledes på ca. 1 med 2 N natriumhydroxidopløsning. Den opnåede opløsning ekstraheredes 1 gang med chloroform og 1 gang med ether. pH-Værdien af den tilbageværende 147198 8 vandige opløsning indstilledesrpå 6,8 med 2 N natriumhydroxidopløsning og derefter på 7,3 med 10 N natriumhydroxidopløsning til opnåelse af et slutrumfang på 2,5 liter.

Den neutraliserede opløsning hældtes på en kolonne indeholdende 2000 g Dowex 1x8, som var var blevet ligevægtsindstillet med 50 mM KHCO^. Elueringen blev foretaget med en 30 1 lineær gradient af 50 til 500 mM KHC03 efterfulgt af 30 1 vaskevæske af 500 mM KHCOo. De produktholdige fraktioner hældtes sammen, og J + det meste af KHCO^'et fjernedes ved tilsætning af Dowex 50-H og fjernelse af CO2 under vakuum. Rumfanget formindskedes til 2 1 i vakuum, og produktet udfældedes ved 4°C ved tilsætning af 10 1 acetone. Det tørrede bundfald, der udgjorde 55 g, hældtes på en 10 x 110 cm Bio-Gel P-2 kolonne og elueredes med H^O. Der opnåedes 22 g fast stof. Materialet omkrystalliseredes ved 4°C son roonokaliumsaltet fra en opløsning af pH 3 i vand, og der opnåedes mere materiale fra moderluden ved krystallisation fra 20%’s ethanol ved pH 3.Monokaliumsaltet opløstes i et minimalt rumfang H20, som var indstillet på pH 8,5 med NaOH, og udfældedes med 2 rumfang ethanol ved 4°C. Dette bundfald opløstes i 100 ml H20 og udfældedes med 9 rumfang ethanol ved 4°C til opnåelse af 15,1 g 9-(2-hydroxyethoxymethyl)-guanin-mono-phosphat-dinatriumsalt-dihydrat.

Renheden bekræftedes ved elementæranalyse, højtryksvæske-chromatografi og UV-spektroskopi.

Empirisk formel: CgH^NjOgP · 2Na · 2H20 Beregnet: C 24,94%; H 3,66%; N 18,19%; P 8,04%

Fundet : 25,20%; H 3,63%; N 18,10%; ' P 7,89% UV-spektrer: Opløsningsmiddel λ max_ε λ min skulder 0,1M HC1 254 12970 225 272 pH 7 249 14060 219 266 0,lm NaOH 255-264 11760 228

Renhed bestemt ved højtryksvæskechromatografi = 99%. Base/phosphat-forhold = 1,00/1,01.

Claims (1)

147198 Analogifremgangsmåde til fremstilling af 9-hydroxyethoxymeth-ylguanin-monophosphat eller salte deraf med formlen I OH tV> h2n 1 I τ CH2.0.CH2.CH2.0-P-0Z a ow hvori W og Z er ens eller forskellige og hver betegner et hydrogenatom eller en farmaceutisk acceptabel kation, kendetegnet ved, at man (a) omsætter en forbindelse med formlen II OH j. N .JOO HjN I ch2.o.ch2.ch2.oh med et phosphoryleringsmiddel til dannelse af en forbindelse med formlen I, hvori både W og Z er hydrogenatomer, eller (b) ammonolyserer en forbindelse med formlen III OH i *N rr y o 111 C1 I I CH2.0.CH2.CH2.O-P-OH OH til dannelse af en forbindelse med formlen I, hvori både W og Z er hydrogenatomer, eller (c) underkaster en forbindelse med formlen I, hvori det ene af eller begge symbolerne W og Z betegner en saltdannende kation,