DK147109B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK147109B DK147109B DK057480AA DK57480A DK147109B DK 147109 B DK147109 B DK 147109B DK 057480A A DK057480A A DK 057480AA DK 57480 A DK57480 A DK 57480A DK 147109 B DK147109 B DK 147109B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- insulin
- leu
- gly
- amino acid
- thr
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims description 41
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 29
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 25
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 25
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 13
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- -1 L-threonine ester Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 6
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 claims 1
- 101000878595 Arabidopsis thaliana Squalene synthase 1 Proteins 0.000 claims 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 95
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 28
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 28
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 28
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 18
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 9
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 9
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 3
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000798396 Bacillus licheniformis Phenylalanine racemase [ATP hydrolyzing] Proteins 0.000 description 2
- 101000644385 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 101710114386 Insulin-like protein Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000623377 Terminalia elliptica Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 description 2
- TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-(n-(4-methylphenyl)sulfonylanilino)propanoic acid Chemical group C=1C=C(C)C=CC=1S(=O)(=O)N([C@@H](C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 TWADEBCIPVNACR-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical group Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N N-benzoyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012442 analytical experiment Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000004648 butanoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002031 ethanolic fraction Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005924 transacylation reaction Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Forklifts And Lifting Vehicles (AREA)
Description
1 147109
Til behandlingen af diabetes mellitus har man sædvanligvis anvendt insulinpræparater, der er fremstillet på grundlag af svine- eller okseinsulin. Okseinsulin, svineinsulin og humant insulin udviser mindre forskelle med hensyn til amino-5 syresammensætningen, og forskellen mellem humant insulin og svineinsulin er begrænset til én enkelt aminosyre, idet den C-terminale aminosyre i B-kæden i humant insulin er Thr, hvorimod den tilsvarende aminosyre i svineinsulin er Ala. Man kunne imidlertid mene, at det ideelle insulinpræparat til behandling 10 af mennesker ville være insulin, som har præcis samme kemiske struktur som humant insulin.
Konventionelt okse- eller svineinsulin indeholder forskellige urenheder såsom insulinlignende proteiner med en molekylvægt på ca. 9000, f.eks. proinsulin, splitproinsulin, 15 desdipeptidproinsuliner og desnonapeptidproinsulin, foruden insulinlignende bestanddele med en molekylvægt på ca. 6000, f.eks. arginininsuliner og diarginininsuliner, jfr. R. Chance:
In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 - 305, udgiver: R.R. Rodriquez & J.V.-Owen, Excerpta 20 Medica, Amsterdam. Til fremstilling af et insulinpræparat, som udviser ingen eller meget lav antigenicitet, har det vist sig at være nødvendigt at fjerne disse forskellige urenheder, f.eks. ved anvendelsen af gelfiltrering og ionbytterchromato-grafering, jfr. britisk patent nr. 1.285.023 og 1.285.024.
25 Det har nu overraskende vist sig, at insulin og insu linderivater med nedenstående almene formel I, som omfatter ovennævnte insulinlignende proteiner og bestanddele, ved en simpel kemisk omsætning kan omdannes til estere af humant insulin, hvilke på kendt måde kan omdannes til humant insulin. Den 30 foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til
fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere med den almene formel III
ThrB30(R5)-OR4-h-In (III) hvor -h-In betegner humant des-(ThrB3^)-insulinyl, R4 betegner 5 35 en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en 2 147109
hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt eller kompleks deraf, kendetegnet ved, at én forbindelse med den almene formel i og forskellig fra humant insulin eller flere forbindelser med den almene formel I
5 S-——S
1 1 I 2 I 3 R -Q -Cys-Cys-Q -Cys-Q -Cys-Asn (A-kæde) I I (21) S S (I) 10 I /
S
2 4 I 5 I (22) (23) (29) .
r _q -cys-Q -Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-R
(B-kæde) 1 2 15 hvor Q betegner -Gly-Ile-Val-Glu-Gln-, Q betegner -Thr-Ser-
Ile-, betegner -Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-, Q4 beteg- 5 ner -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-, Q betegner -Gly-Ser-His-Leu-
Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-, R1 betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 amino- 20 syrer i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosy-2 re, R betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et peptid- 3 fragment med en C-terminal basisk aminosyre, og R betegner en aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer i R"*" plus 3 1
25 antallet af aminosyrer i R ikke er større end 36, eller R
3
sammen med R betegner en peptidbinding eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosyre, eller komplekser eller salte deraf omsættes med en L-threoninester med den almene formel II
30 Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand og ét eller flere organiske opløsningsmidler og i nærværelse af trypsin eller et aktivt tryp-35 sinderivat, hvorefter beskyttelsesgruppen eller -grupperne om ønsket fjernes.
3 147109
Anvendelige threoninestere med formlen II er sådanne, i hvilke R4 er en carboxylbeskyttelsesgruppe, som kan fjernes fra den humane insulinester med formlen III under betingelser, som ikke medfører irreversible ændringer i insulinmolekylet.
5 Som eksempler på sådanne carboxylbeskyttelsesgrupper kan angives methyl, ethyl, tert.butyl, diphenylmethy1, substituerede benzylgrupper såsom p-methoxybenzyl og 2,4,6-trimethylbenzyl og grupper med den almene formel -Ci^-Cl^-X, hvor X betegner -S+(R6)(R7), -SO-R6, -N+(R6)(R7)(R8) eller -P+(R6)(R7)(R8), 6 7 ^8 10 hvor R , R og R er ens eller forskellige, og hver betegner lavere alkyl såsom methyl, ethyl, propyl og n-butyl. Egnede hydroxylbeskyttelsesgrupper R er sådanne, som kan fjernes fra de humane insulinestere med formlen III under betingelser, som ikke medfører irreversible ændringer i insulinmolekylet. Som et 15 eksempel på en sådan gruppe kan angives tert.butyl.
Threoninestere med formlen II kan være de frie baser eller egnede salte deraf såsom acetater, propionater og butyra-ter.
Som eksempler på basiske aminosyrer i R og R i 20 formlen I kan angives lysin og arginin.
Som eksempler på forbindelser med den almene formel I
kan angives svineinsulin, hundeinsulin, finhvalinsulin eller 12 3 kaskelotinsulin (R og R er hydrogen, og R er -Ala), kaninin-12 3 sulin (R og R er hydrogen, og R er -Ser), svinediargininin-12 3 25 sulm (R og R er hydrogen, og R er -Ala-Arg-Arg), svineargi-12 3 mnmsulin (R og R er hydrogen, og R er -Ala-Arg), svinepro- 2 13 insulin (R er hydrogen, og R er sammen med R -Ala-Arg-Arg-
Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-
Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- 30 Arg-, hvor den N-terminale alanyl er knyttet til Lys529, og den C-termmale arginyl er knyttet til Q ), hundepr oinsul in (R er 1 3 hydrogen, og R er sammen med R -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-
Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-Arg-, hvor den N-terminale alanyl er knyt- B29 i 35 tet til Lys , og den C-terminale arginyl er knyttet til ςρ), svmesplitproinsulin (R er hydrogen, R er Ala-Leu-Glu-Gly-
Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-, og R3 er -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn- 4 147109
Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu), desdipeptidproinsulin (R1 og R2 er hydrogen, og R er ~Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-5 Gly-Pro-Pro-Gln), humant proinsulin (R2 er hydrogen, og R3" er sammen med R3 -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln~Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-, hvor den N-terminale threonyl er knyttet til Lys° , og den C-terminale arginyl er 10 knyttet til Q1), og abeproinsulin (R2 er hydrogen, og R1 er 3 sammen med R -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-).
Som eksempler på aktiverede trypsinderivater kan an-15 gives acetyleret trypsin, succinyleret trypsin, giutaraldehydbehandlet trypsin og immobiliserede trypsinderivater.
Som eksempler på et kompleks eller salt af en forbindelse med formlen I kan angives et zinkkompleks eller -salt.
Formelt kan fremgangsmåden ifølge den foreliggende 20 opfindelse betragtes som en transacyleringsreaktion, i hvilken carbonylgruppen i Lys i forbindelsen med formlen I og carbo- nylgruppen i en eventuelt tilstedeværende arginyl- eller lysyl-1 2 gruppe R eller R eller i en arginyl- eller lysylgruppe, som er den C-terminale aminosyre i et eventuelt tilstedeværende 1 2 25 peptidfragment R eller R , overføres til aminogruppen i forbindelser med formlen II. Fremgangsmåden kan udføres ved at opløse 1) en forbindelse med formlen I, 2) en threoninester med formlen II og 3) trypsin i en blanding af vand og mindst ét organisk opløsningsmiddel. Som eksempler på organiske opløsnings-30 midler kan angives Ν,Ν-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid, N-methylpyrrolidon, hexamethylphosphortriamid, ethanol, metha-nol, 2-propanol, dioxan og acetonitril. Afhængigt af hvilket eller hvilke organiske opløsningsmidler der anvendes, er indholdet af organisk opløsningsmiddel sædvanligvis over ca. 40%, 35 fortrinsvis over 50%, og mindre end ca. 80%, fortrinsvis mindre end ca. 75% (rumfang/rumfang).
5 147109 Såfremt der anvendes et immobiliseret trypsinderivat, suspenderes det i mediet. Der kan tilsættes syrer såsom eddikesyre, propionsyre og smørsyre eller baser såsom pyridin, TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethan), N-methylmbrpholin og N-ethyl-5 morpholin til opnåelse af et egnet puffersystem. Fremgangsmåden udføres ved en temperatur på ca. 0 - 50°C, fortrinsvis ved ca.
37°C. Der kan tilsættes ioner, som stabiliserer trypsin, såsom kalciumioner. Afhængigt af den anvendte mængde trypsin og af de øvrige reaktionsbetingelser er reaktionstiden sædvanligvis un-10 der 24 timer.
Humant insulin kan fremstilles ud fra ovennævnte humane insulinestere med formlen III ved fjernelse af beskyttel- 4 sesgruppen R og en eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgrup- 5 pe R under anvendelse af kendte metoder eller i og for sig 15 kendte metoder, såfremt R4 er methyl, ethyl eller en gruppe med formlen -CH2-CH2-X, hvor X har ovennævnte betydning, kan den pågældende beskyttelsesgruppe fjernes under milde basiske betingelser i et vandigt medium, fortrinsvis ved en pH-værdi på ca. 8 - 12, f.eks. ved ca. 9,5. Som base kan anvendes ammoniak, 20 triethylamin eller hydroxider af alkalimetaller såsom natriumhydroxid. Såfremt R4 er tert.butyl, substitueret benzyl såsom p-methoxybenzyl eller 2,4,6-trimethylbenzyl eller diphenyl-methyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acidolyse, fortrinsvis med trifluoreddikesyre. Trifluoreddikesyren kan være 25 ikke-vandig eller kan indeholde noget vand, eller den kan være fortyndet med et organisk opløsningsmiddel såsom dichlormethan. Såfremt R^ er tert.butyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acidolyse, jævnfør ovenfor.
Foretrukne forbindelser med formlen III er forbindel- 5 30 ser, hvor R er hydrogen.
Nogle forbindelser med formlen II er kendte forbindelser, og de øvrige forbindelser med formlen II kan fremstilles analogt med fremstillingen af kendte forbindelser eller analogt med kendte metoder.
35 Ved en foretrukken udførelsesform for den foreliggen de opfindelse omsættes urent svineinsulin indeholdende én eller flere af følgende forureninger: proinsulin, arginininsulin, 6 147109 diarginininsulin, splitproinsulin, desdipeptidproinsuliner og desnonapeptidproinsulin eller et salt eller kompleks deraf med en forbindelse med formlen II eller et salt deraf under oven- 4 nævnte betingelser, hvorefter beskyttelsesgruppen R og en 5 5 eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgruppe R fjernes. Ved denne fremgangsmåde omdannes svineinsulinet til humant insulin.
En af fordelene ved denne fremgangsmåde er, at også ovennævnte urenheder omdannes til humant insulin. Det var tidligere nødvendigt at fjerne og kassere de omhandlede urenheder for at 10 fremstille insulinpræparater med ingen eller meget lave antigene egenskaber. Nogle antigene urenheder omdannes derfor til humant insulin.
Den nødvendige mængde af humane pankreaskirtler til fremstilling af naturligt, humant insulin er ikke til stede.
15 I lille skala og med meget store omkostninger har der været fremstillet syntetisk, humant insulin, jævnfør Helv.Chim.
Acta _57, 2617, og 60_, 27. Semisyntetisk, humant insulin har været fremstillet ud fra svineinsulin på langsommelige måder, jævnfør Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 356, 1631, og Nature 20 280, 412. Den foreliggende opfindelse angår imidlertid en frem gangsmåde, som i industriel målestok kan anvendes til fremstilling af humant insulin.
USA-patentskriftet nr. 3.276.961 påstås at angå en fremgangsmåde til fremstilling af semisyntetisk, humant insu-25 lin. Der opnås imidlertid ikke humant insulin ved fremgangsmåden, idet fremgangsmåden udføres i vand, under hvilke betingel-ser trypsin forårsager en spaltning af Arg -Gly -bindingen (jævnfør formel I), jævnfør J.Biol.Chem. 236, 743.
En kendt semisyntetisk fremgangsmåde til fremstilling 30 af humant insulin omfatter følgende tre trin: Først omdannes B3 λ svineinsulin til svine-des-(Ala )-insulin ved behandling med carboxypeptidase A, jævnfør Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 359, BO Λ 799. I det andet trin underkastes svine-des-(Ala )-insulin en trypsinkat aly seret kobling med Thr-OBu*", hvorved der dannes hu-B3 q 35 man insulin-Thr -tert.butylester. Derefter behandles den på gældende ester med trifloureddikesyre, hvorved fås humant insulin, jævnfør Nature 280, 412. Ved det første trin sker der 7 147109 -Al imidlertid en delvis fjernelse af AsnA , hvorved fås des- (AlaB^,AsnA^)-insulin. Dette derivat giver efter de to efter- følgende reaktioner anledning til forurening af des-(Asn )- insulin i det fremstillede semisyntetiske, humane insulin, 5 hvilket er en forurening, som ikke kan fjernes ved kendte, præ- A21 parative metoder. Des-(Asn )-insulin udviser lav biologisk aktivitet (ca. 5%), jævnfør Amer.J.Med. 4£, 750.
Fra Biochem.Biophys.Res.com. 9j2, 396 - 402, kendes en metode til fremstilling af humant insulin, ved hvilken man i B30 10 første trin fremstiller svine-des-(Ala )-insulin ud fra svineinsulin med Achromobacter-protease I i vandigt medium og i andet trin kobler des- (AlaB^) -insulinet med Thr-OBu*" med Achromobacter-protease I som katalysator til fremstilling af B3O-esteren af humant insulin i et medium indeholdende ét eller 15 flere organiske opløsningsmidler. I modsætning hertil fås B30-esteren af humant insulin ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse direkte i ét trin.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse udviser følgelig følgende fordele i sammenligning med den kendte 20 teknik:
1) Den enzymatiske hydrolyse med carboxypeptidase A
udelades.
2) Isoleringen af mellemproduktet, nemlig svine-des- B3 g (Ala )-insulin, er unødvendig.
A21 25 3) Forureningen med des-(Asn )-insulinderivater undgås.
4) Proinsulin og andre insulinlignende urenheder, som er angivet ved formel I, og som er til stede i råinsulin, omdannes ved fremgangsmåden ifølge foreliggende opfindelse til 30 humant insulin, hvorved udbyttet forøges.
5) Der fås et produkt med meget lav eller ingen anti-genicitet, idet proinsulinet og de ovennævnte mellemprodukter omdannes til humant insulin.
De anvendte forkortelser er i overensstemmelse med de 35 regler, som i 1974 blev godkendt af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, jævnfør Selected Tentative Rules & 8 147109
Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2. udgave, Maryland 1975.
Analytiske undersøgelser;
Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til 5 humane insulinestere kan demonstreres ved DISC PAGE (polyacryl-amidgelelectrophorese) i 7,5% polyacrylamidgel i en puffer bestående af 0,375 M TRIS, 0,06 HCl, og 8 M urinstof. Pufferens pH-værdi er 8,7. Estere med formlen III, hvori estergruppen ikke har nogen ladning, vandrer med en hastighed på 75% af 10 svineinsulinets hastighed. Svineinsulin, som vandrer med 55% af svineproinsulins hastighed, omdannes ved fremgangsmåden ifølge foreliggende opfindelse til det samme produkt. Identificeringen af omdannelsesproduktet som forbindelser med formel III bygger på følgende kriterier: 15 a) Den electrophoretiske vandring af humane insulin estere med formel III i sammenligning med svineinsulinets svarer til tabet af én negativ ladning for uladede estergrupper og til tabet af to negative ladninger for estergrupper, som har én positiv ladning.
20 b) Aminosyresammensætningen af de farvede proteinbånd i gelen, som svarer til forbindelser med formel III er identisk med humant insulins aminosyresammensætning, nemlig 3 mol threo-nin og 1 mol alanin pr. mol insulin, og sammensætningen af svineinsulin er 2 mol threonin og 2 mol alanin pr. mol insulin.
25 Metoden til analysering af aminosyresammensætninger i proteinbånd i polyacrylamidgeler er beskrevet af Sundby & Markussen,
Eur.J.Biochem. 25, 147.
c) Beviset for, at det indføjede threonin-er placeret som C-terminal aminosyre i B-kæden, fås ved oxidativ sulfito- 30 lyse af S-S-broerne i insulin i 6 M guanidin-hydrochlorid efterfulgt af separering af A- og B-kæderne ved ionbytnings-chromatografi på "SP Sephadex" (registreret varemærke,
Pharmacia AB, Sverige). Ved fordøjelse af B-kæde-S-sulfonatet med carboxypeptidase A frigøres kun den C-terminale aminosyre.
35 Denne teknik er beskrevet af Markussen i Proceedings of the 9 U7109
Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12.
- 14. juli 1978, (udgiver: Baba, Kaneko & Yaniahara)
Int.Congress Series nr. 468, Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. Analysen udføres, efter at estergruppen er spaltet fra forbin-5 delser med formlen III.
Disse 3 analyser beviser klart, at der er sket en omdannelse til humant insulin.
Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til humane insulinestere kan følges kvantitativt ved HPLC (høj-10 tryksvæskechromatografering) på omvendt fase. Der anvendes en 3 x 300 mm '^Bondapak C^g column" (Waters Ass.) og elueringen udføres med en puffer indeholdende 0,2 M ammoniurasulfat (indstillet på en pH-værdi på 3,5 med svovlsyre) og indeholdende 26 -50% acetonitril. Den optimale acetonitrilkoncentration afhænger 15 af, hvilken ester med formlem III man ønsker at separere fra o 4 5 o svineinsulin. Såfremt R er methyl, og R er hydrogen, opnas separering i 26% (rumfang/rumfang) acetonitril. Svineinsulin og B3 0
Thr -OMe-h-In (Me er methyl) elueres efter henholdsvis 4,5 og 5,9 kolonnerumfang som godt separerede symmetriske toppe. Før 20 påføringen på HPLC-kolonnen udfældes proteinerne i reaktionsblandingen ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Bundfaldet isoleres ved centrifugering, tørres i vacuum og opløses i 0,02 M svovlsyre.
Fremgangsmåden til fremstilling af humane insulin-25 estere og humant insulin belyses ved følgende eksempler. Eksemplerne angiver nogle foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Eksempel 1 200 g urent svineinsulin, som er krystalliseret én 30 gang, opløses i 1,8 ml 3,33 M eddikesyre. Der tilsættes 2 ml af en 2 M opløsning af Thr-OMe (Me er methyl) i N,N-dimethylaceta-mid og 20 mg trypsin opløst i 0,2 ml vand. Efter 18 timers henstand ved 37°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 40 ml acetone, og bundfaldet isoleres ved centrifugering. Supernatan-35 ten kasseres. Ved analyse af bundfaldet ved HPLC under anven- 10 U7109 delse af 26% acetonitril (jævnfør Analytiske undersøgelser) fås en 60% omdannelse af svineinsulin til Thr -OMe-h-In. Bundfaldet opløses i 8 ml friskt afioniseret 8 M urinstof, pH-værdien indstilles på 8,0 med 1 M ammoniak, og opløsningen sættes på en 5 2,5 x 25 cm kolonne, som er pakket med "QAE A-25 Sephadex", der er ækvilibreret med en 0,1 M ammoniumchloridpuffer, som indeholder 60% (rumfang/rumfang) ethanol, og hvis pH-værdi er indstillet på 8,0 med ammoniak. Elueringen udføres med den samme puffer, og der opsamles fraktioner på hver 15 ml. Thr -OMe-10 h-In findes i fraktionerne nr. 26 - 46, og uomsat svineinsulin findes i fraktionerne nr. 90 - 120. Fraktionerne nr. 26 - 46 B3 q forenes, ethanolet afdampes i vacuum, og Thr -OMe-h-In krystalliseres i en citratpuffer som beskrevet af Schlichtkrull et al., Handbuch der inneren Medizin, 7/2A, 96, Berlin, Heidel-15 berg, New York 1975. Udbyttet er 95 mg krystaller med samme rhombiske form som svineinsulinkrystaller, der er krystalliseret på samme måde. Aminosyresammensætningen findes at være identisk med aminosyresammensætningen for humant insulin. Ved yderligere analytiske forsøg, som er beskrevet i ovennævnte af-20 snit: Analytiske undersøgelser, vises det, at det resulterende produkt er ThrB^®-OMe-h-In.
Eksempel 2 100 mg svineinsulin, som opfylder de renhedskriterier, der er angivet i britisk patentskrift nr. 1.285.023, oplø-25 ses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes derefter 1 ml af en 2 M opløsning af threoninmethylester i Ν,Ν-dimethylformamid og 12 mg TPCK-behandlet (TPCK er tosylphenylalaninchlor-methylketon) trypsin opløst i 0,1 ml vand. Efter inkubering i 24 timer ved 37°C standses omsætningen ved tilsætning af 4 ml 1 B3 0 30 M phosphorsyre. Den vundne Thr -OMe-h-In separeres fra uomsat svineinsulin ved ionbytterchromatografering på en 2,5 x 25 cm kolonne af "SP Sephadex” med en eluent indeholdende 0,09 M na- triumchlorid og 0,02 M natriumdihydrogenphosphat (pH-værdien af pufferen er 5,5) i 60% ethanol. Fraktioner indeholdende B3 q 35 Thr -OMe-h-In opsamles, ethanolet fjernes i vacuum, og -,-, 147109 produktet krystalliseres analogt med beskrivelsen i eksempel 1.
B3 0
Udbyttet er 50 mg Thr -OMe-h-In.
Eksempel 3 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi- B3 0 o o 5 kesyre og omdannes til Thr -OMe-h-In og renses på analog måde som beskrevet for svineinsulin i eksempel 1. Omdannelsen af B3 0 proinsulin til Thr -OMe-h-In findes ved HPLC-analysen af ace- B3o tonebundfaldet at være 73%. Udbyttet af krystallinsk Thr -h-In er 54 mg.
10 Eksempel 4 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand og omsættes på analog måde som beskrevet i eksempel 2. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en R? Π 15 omdannelse til Thr -OMe-h-In på 70%.
Eksempel 5 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N-methylpyrrolidon.
Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4, B3 0 20 og omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 20%.
Eksempel 6 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i HMPA (hexa-methylphosphortriamid). Omsætningen udføres på analog måde som 25 beskrevet i eksempel 4. Omdannelsen til Thr-OMe-h-In er 80%.
12 147109
Eksempel 7 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4.
D“3 Q
5 Omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 80%.
Eksempel 8 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid.
Der tilsættes derefter 200 enheder trypsinaktivitet (målt mod 10 substratet BAEE (alfa-N-benzoyl-L-argininethylester)), som er immobiliseret på 1 g glasperler, og efter inkubering ved 37°C i 24 timer frafiltreres det til glasset bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til 15 ThrB3®-OMe-h-In på 40%.
Eksempel 9 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylacetamid.
Der tilsættes derefter 300 enheder trypsin (aktivitet målt med 20 substratet BAEE), som er immobiliseret på 200 μg "Sephadex G-115" med glutaraldehyd. Efter inkubering ved 37°C i 24 timer frafiltreres det til "Sephadex" bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen fældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til 25 ThrB30-OMe-h-In på 70%.
Eksempel 10
Den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde gentages med t t det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu (Bu er con tert.butyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr -30 OBu^-h-In er 80%.
Eksempel 11 147109 13
Den i eksempel 8 beskrevne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu^ i N,N-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr -OBut-h-In er 30%.
5 Eksempel 12
Den i eksempel 9 beskrevne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBut i N,N-dimethylacetamid. Omdannelsen til Thr^^-OBu^-h-In er 70%.
Eksempel 13 10 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksem- B3 ø pel 4. Omdannelsen til Thr -OMe-h-In er 80%.
Eksempel 14 15 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta- mid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på analog o B3 0 måde som beskrevet i eksempel 10. Omdannelsen til Thr -OMe- h-In er 40%.
20 Eksempel 15 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-acetamid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til 25 ThrB30-OMe-h-ln er 70%.
14 147109
Eksempel 16 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu*" i N,N-dimethylaceta-mid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksem-5 pel 4. Omdannelsen til ThrB3B-OBut-h-In er 80%.
Eksempel 17 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu** i N,N-dimethylaceta-mid. Blandingen behandles med trypsin, som er immobiliseret på 10 glasperler, på analog måde som beskrevet i eksempel 10. Omdannelsen til ThrB30-OBut-h-In er 40%.
Eksempel 18 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi- t * kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu i N,N-dimethylaceta-15 mid. Blandingen behandles med trypsin, som er immobiliseret på CNBr-aktiveret "Sephadex G-150", på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til ThrB30-OBut-h-In er 70%.
Eksempel 19 100 mg svineinsulin opløses i 0,5 ml 6 M eddikesyre, 20 og der tilsættes 1 ml 1 M Thr-OTmb (Tmb er 2,4,6-trimethylben-zyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Der tilsættes yderligere 0,5 ml Ν,Ν-dimethylacetamid og 5 mg TPCK-behandlet trypsin i 0,1 ml vand. Reaktionsblandingen lades henstå ved 32°C i 44 timer. Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne ved tilsæt-25 ning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en om- DO Λ dannelse til Thr -OTmb-h-In på 50%.
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere med den almene formel III ThrB30(R1)-OR4-h-In (III) 15 hvor -h-In betegner humant des-(ThrB3^)-insulinyl, R4 betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R3 betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt eller kompleks deraf, kendetegnet ved, at én forbindelse med den almene formel I og forskellig fra humant insulin eller flere forbindelser med den 20 almene formel I S-S
1. I 2^3 R -Q -Cys-Cys-Q -Cys-Q -Cys-Asn (A-kæde) I I (21)
25. S (I)
2. I 5 I (22) (23) (29) - R -Q -Cys-Q -Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-R 30 (B-kæde) 16 147109 1. hvor Q betegner -Gly-Ile-Val-Glu-Gln-, Q betegner -Thr-Ser- Ile-, Q3 betegner -Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-, Q4 betegner -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-, Q5 betegner -Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-, R1 betegner hydrogen, en basisk 5 aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk amino-2 syre, R betegner hydrogen, en basisk aminosyre eller et pep- O tidfragment med en C-terminal basisk aminosyre, og R betegner en aminosyre eller et peptidfragment indeholdende højst 36 ami- 10 nosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer i R1 plus 3 1 antallet af aminosyrer i R ikke er større end 36, eller R sammen med R3 betegner en peptidbinding eller et peptidfragment indeholdende højst 36 aminosyrer, i hvilket den C-terminale aminosyre er en basisk aminosyre, eller komplekser eller salte 15 deraf omsættes med en L-threoninester med den almene formel II Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand og ét eller flere organiske opløs-20 ningsmidler og i nærværelse af trypsin eller et aktivt trypsin-derivat, hvorefter beskyttelsesgruppen eller -grupperne om ønsket fjernes.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 1 2 en eventuelt tilstedeværende basisk aminosyre R og/eller R og 25 den C-terminale aminosyre i et eventuelt tilstedeværende pep-tidfragment R og/eller R er lysin eller arginin.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at summen af aminosyrer i R^ og R3 eller antallet af 1 3 aminosyrer, som er til stede i R og R , såfremt de danner et 30 peptidfragment, ikke er over 34.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at Rb er hydrogen.
5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at R"*- er hydrogen eller Ala-Leu- 2 3
35 Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-Arg-, R er hydrogen, R er -Ala, -Ser,
Priority Applications (27)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK147437D DK147437A (en) | 1980-02-11 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
| ES499238A ES499238A0 (es) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Un procedimiento para la preparacion de insulina humana o esteres de insulina. |
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
| MX10157581U MX6686E (es) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Procedimiento para preparar esteres de treonina b30 de insulina humana |
| FI810385A FI77876C (fi) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. |
| JP1758081A JPS56135452A (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Manufacture of insulin ester |
| NZ196224A NZ196224A (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Threonine b30 esters of human insulin:preparation thereof and use as intermediates in preparation of human insulin |
| SE8100926A SE427025B (sv) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Gaffeltruck |
| IT19620/81A IT1195038B (it) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Procedimento per la preparazione di esteri della insulina |
| GB8104114A GB2069502B (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Process for preparing insulin esters |
| PT72485A PT72485B (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Process for preparing insulin esters |
| AR284258A AR231277A1 (es) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Un procedimiento para la preparacion de esteres de insulina |
| NO810443A NO156247C (no) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Fremgangsmaate for fremstilling av humaninsulin eller treoin b30-estere av humaninsulin eller et salt eller kompleks derav. |
| US06/233,051 US4343898A (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Process for preparing esters of human insulin |
| CA000370483A CA1162868A (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Process for preparing insulin esters |
| IE251/81A IE50892B1 (en) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Process for preparing insulin esters |
| SE8100928A SE451143B (sv) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Forfarande for framstellning av insulinderivat |
| NLAANVRAGE8100624,A NL178797C (nl) | 1980-02-11 | 1981-02-10 | Werkwijze voor het bereiden van threonine(b30)-esters van menselijke insuline of een daarvan afgeleid zout of complex, alsmede werkwijze voor het daaruit bereiden van menselijke insuline. |
| GR64097A GR73844B (da) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | |
| DE3104949A DE3104949C2 (de) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Verfahren zur Herstellung von Threonin↑B↑↑3↑↑0↑-Estern des Humaninsulins, demgemäß hergestellte Threonin↑B↑↑3↑↑0↑-Ester des Humaninsulins sowie Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin unter Verwendung derartiger Threonin↑B↑↑3↑↑0↑-Ester des Humaninsulins |
| CH910/81A CH655949A5 (de) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Verfahren zur herstellung von einem threonin(b30)-ester des humaninsulins, einem salz desselben oder einem metallkomplex desselben, sowie diesen ester und eine verwendung desselben. |
| AT0063681A AT399881B (de) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Verfahren zur herstellung von threoninb30-estern von menschlichem insulin |
| ZA00810898A ZA81898B (en) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Process for preparing insulin esters |
| BE6/47396A BE887480A (fr) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Procede de preparation d'esters d'insuline |
| FR8102716A FR2475542B1 (da) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | |
| AU67180/81A AU541528B2 (en) | 1980-02-11 | 1981-02-11 | Process for preparing insulin esters |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK57480 | 1980-02-11 | ||
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK57480A DK57480A (da) | 1981-08-12 |
| DK147109B true DK147109B (da) | 1984-04-09 |
| DK147109C DK147109C (da) | 1986-12-08 |
Family
ID=8095095
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK147437D DK147437A (en) | 1980-02-11 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK147437D DK147437A (en) | 1980-02-11 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56135452A (da) |
| AR (1) | AR231277A1 (da) |
| AU (1) | AU541528B2 (da) |
| BE (1) | BE887480A (da) |
| CA (1) | CA1162868A (da) |
| CH (1) | CH655949A5 (da) |
| DE (1) | DE3104949C2 (da) |
| DK (3) | DK147109C (da) |
| ES (1) | ES499238A0 (da) |
| FI (1) | FI77876C (da) |
| GB (1) | GB2069502B (da) |
| GR (1) | GR73844B (da) |
| IT (1) | IT1195038B (da) |
| NL (1) | NL178797C (da) |
| NO (1) | NO156247C (da) |
| NZ (1) | NZ196224A (da) |
| PT (1) | PT72485B (da) |
| SE (2) | SE451143B (da) |
| ZA (1) | ZA81898B (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| AU551174B2 (en) * | 1981-09-15 | 1986-04-17 | Nordisk Insulinlaboratorium | Enzymatic preparation of human insulin or b-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| EP0087238A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-31 | Biogen N.V. | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| DK182483A (da) * | 1982-04-23 | 1983-10-24 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Fremgangsmaade til semi-syntese af humant insulin og alkalisk protease til anvendelse derved |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3334407A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | In position b 30 modifizierte insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| US5157021A (en) * | 1985-03-15 | 1992-10-20 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
| DK119785D0 (da) * | 1985-03-15 | 1985-03-15 | Nordisk Gentofte | Insulinpraeparat |
| SE449472B (sv) * | 1985-10-15 | 1987-05-04 | Mth Gruppen Ab | Utrustning vid facklager |
| NZ223630A (en) * | 1987-02-25 | 1989-11-28 | Novo Industri As | Insulin derivative and pharmaceutical compositions |
| DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
| FI96503C (fi) * | 1994-08-26 | 1996-07-10 | Hymatic Ltd Oy | Menetelmä ja laitteisto maston ohjaamiseksi |
| AU2005209199B2 (en) | 2004-01-16 | 2008-09-11 | Biodel Inc. | Sublingual drug delivery device |
| US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
| US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US7713929B2 (en) | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US7718609B2 (en) | 2006-04-12 | 2010-05-18 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK146482C (da) * | 1979-04-13 | 1986-10-06 | Shionogi & Co | Fremgangsmaade til fremstilling af et b30-threonin-insulin |
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
-
0
- DK DK147437D patent/DK147437A/da unknown
-
1980
- 1980-02-11 DK DK57480A patent/DK147109C/da not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-02-09 DK DK54081A patent/DK147437C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-02-09 ES ES499238A patent/ES499238A0/es active Granted
- 1981-02-10 PT PT72485A patent/PT72485B/pt not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 IT IT19620/81A patent/IT1195038B/it active
- 1981-02-10 CA CA000370483A patent/CA1162868A/en not_active Expired
- 1981-02-10 GB GB8104114A patent/GB2069502B/en not_active Expired
- 1981-02-10 SE SE8100928A patent/SE451143B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 SE SE8100926A patent/SE427025B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 FI FI810385A patent/FI77876C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 AR AR284258A patent/AR231277A1/es active
- 1981-02-10 NO NO810443A patent/NO156247C/no unknown
- 1981-02-10 NZ NZ196224A patent/NZ196224A/en unknown
- 1981-02-10 JP JP1758081A patent/JPS56135452A/ja active Granted
- 1981-02-10 NL NLAANVRAGE8100624,A patent/NL178797C/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 ZA ZA00810898A patent/ZA81898B/xx unknown
- 1981-02-11 GR GR64097A patent/GR73844B/el unknown
- 1981-02-11 BE BE6/47396A patent/BE887480A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 AU AU67180/81A patent/AU541528B2/en not_active Ceased
- 1981-02-11 DE DE3104949A patent/DE3104949C2/de not_active Expired
- 1981-02-11 CH CH910/81A patent/CH655949A5/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK147109B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf | |
| US4343898A (en) | Process for preparing esters of human insulin | |
| Gutte et al. | The synthesis of ribonuclease A | |
| KR100574580B1 (ko) | 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린유도체를 수득하는 방법 | |
| Gerber et al. | Partial primary structure of bacteriorhodopsin: sequencing methods for membrane proteins. | |
| Bhown et al. | Structural studies on ε-prototoxin of Clostridium perfringens type D. Localization of the site of tryptic scission necessary for activation to ε-toxin | |
| Loret et al. | An anti-insect toxin purified from the scorpion Androctonus australis Hector also acts on the. alpha.-and. beta.-sites of the mammalian sodium channel: sequence and circular dichroism study | |
| KR880001107B1 (ko) | 인체 인슐린 및 그의 유도체의 제조방법 | |
| Lai et al. | Chemistry of cholera toxin: the subunit structure | |
| Svendsen et al. | Isolation and characterization of the folate-binding protein from cow's milk | |
| US3883500A (en) | Process for the manufacture of insulin, analogs and derivatives thereof | |
| US3883496A (en) | Process for the manufacture of insulin, analogs and derivatives thereof | |
| Koide et al. | Sequence of the amino-terminal 349 residues of rabbit muscle glycogen phosphorylase including the sites of covalent and allosteric control | |
| CA1195273A (en) | Process for converting preproinsulin analogs into insulin | |
| EP0180921A2 (en) | Process for the preparation and purification of peptides | |
| Vita et al. | Synthesis of charybdotoxin and of two N‐terminal truncated analogues: Structural and functional characterisation | |
| EP0087066B1 (en) | Process for purifying secretin | |
| Carré-Eusèbe et al. | Processing of the precursor of protamine P2 in mouse. Peptide mapping and N-terminal sequence analysis of intermediates | |
| Nix et al. | Semisynthetic analogs of cytochrome c reconstructed from natural and synthetic peptides | |
| Sampieri et al. | Amino acid sequence of toxin XI of the scorpion Buthus occitanus tunetanus. Evidence of a mutation having an important effect upon neurotoxic activity | |
| RU2045535C1 (ru) | Способ получения проинсулина человека | |
| Caputo | N and C terminal groups of highly purified Bence-Jones protein | |
| LU83197A1 (de) | Verfahren zur herstellung von threonin b30-estern menschlichen insulins sowie threonin b30-ester menschlichen insulins | |
| Bodanszky et al. | Partial Synthesis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |