DK146937B - Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat for serinproteaser - Google Patents

Description

(19) DANMARK Æ φ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 146937 Β

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3127/76 (51) lnt.CI.3: C 07 C103/52 .... ... . . Λή. . _ 012 Q 1/34 (22) Indlevenngsdag: 09 Jul 1976 (41) Alm. tilgængelig: 12 Jan 1977 (44) Fremlagt: 20 feb 1984 (86) International ansøgning nr.: - (30) Prioritet: 11 Jul 1975 SE7507974 (71) Ansøger: AKTIEBOLAGET *KABI; S-104 25 Stockholm, SE.

(72) Opfinder: Bo *Thureeson af Ekenstam; SE, LeH Erik *Aurell; SE, Karl Goeran ‘Claeson; SE, Birgitta Gunilla ‘Karlsson; SE, Stig Ingemar ‘Gustavsson; SE, Gun Anita ‘Olausson; SE.

(74) Fuldmægtig: Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree_ (54) Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat for serinprote· aser

Den foreliggende opfindelse angår tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med god opløselighed og høj specificitet overfor serinproteaser.

Substraterne ifølge opfindelsen er særligt egnede til kvantitativ bestemmelse af ovennævnte serinproteaser, der er klassificeret som (EC 3.4.21), og som spalter peptidkæden på carboxyl-® siden af arginin eller lysin. Endvidere kan substraterne anvendes

Jj til studium af reaktioner, hvor de nævnte enzymer dannes, inhiberes Λ eller nedbrydes, eller til undersøgelse af faktorer, som influerer ίΓ på eller tager del i en sådan reaktion. Syntetiske substrater til r· ^ enzymbestemmelse har store fordele sammenlignet med de naturlige, ^ forudsat at de opfylder visse betingelser, såsom stor følsomhed og specificitet overfor enzymet, god opløselighed i vand eller i den 2 146937 biologiske testopløsning samt let påviselighed af nogle af spaltningsprodukterne .

Substrater, som er udmærkede til bestemmelse af f.eks. plasmin, thrombin, trypsin, kallikrein og urokinase er bl.a. beskrevet i beskrivelsen til svensk patent nr. 380.258 og er i princippet kromogene tripeptidderivater. Blandt de bedste substrater af denne type er sådanne, som har en benzoyleret N-terminalende og en kromofor gruppe koblet til den C-terminale ende, f.eks.: 12 3

Benzoyl - A - A - A - p-nitroanilid I 12 3 hvor A , A og A er aminosyrer.

Med specifikke aminosyresekvenser er det blandt de nævnte substrater muligt at finde sådanne, som har en særlig følsomhed overfor et vist eller visse enzymer. Under enzymatisk hydrolyse danner substraterne det kromofore produkt p-nitroanilin, som let kan detekteres spektrofotometrisk. Substraterne har imidlertid en begrænsning på grund af deres relativt ringe opløselighed (mindre end eller eventuelt lig med 1 mg/ml). En lav opløselighed nødvendiggør at man arbejder meget nær substratets mætningsgrænse for at opnå en tilfredsstillende substratkoncentration. Ved enzymbestemmelser i forskellige biologiske systemer kan det derfor ske, at enten substratet i sig selv eller en kombination af protein/substrat udfældes. De omtalte udfældninger forårsager misvisende spektrofoto-metriske aflæsninger og dermed fejlagtige enzymbestemmelser.

Fra ovennævnte svenske patentskrift nr. 380.258 er det endvidere kendt at benytte tripeptider med formlen Leu-Leu-Arg-pNA og β-cyclohexy1-Ala-Val-Arg-pNA, hvori det terminale leucin henholdsvis β-cyclohexylalanin har L-form, som diagnostisk substrat for serinproteaser. Ved således at erstatte den N-terminale benzoyl-gruppe i ovennævnte formel I med et hydrogenatom, opnås enzymsubstrater, som er betydeligt mere opløselige. Den frie protoniserede aminogruppe af aminosyren A^ forøger opløseligheden, men bevirker imidlertid også at hastigheden, hvormed enzymet spalter substraterne, aftager (jvf. tabel II). Endvidere kan substraterne nu i en biologisk testopløsning på en ikke ønsket måde nedbrydes fra N-terminal-enden af aminopeptidaser.

Ifølge den foreliggende opfindelse har det nu overraskende vist sig, at hvis man i tripeptider med den almene formel: 3 146937 1 2 3

Η - A - A - A - pNA

1 2 hvor A og A vælges blandt aminosyrerne Gly, Ala, Val, Leu, Ile, 2 3

Pip, Pro, Aze, og A endvidere kan være Phe, og A vælges blandt aminosyrerne Arg og Lys, erstatter L-formen af aminosyren A^ med D-formen, fås enzymsubstrater, som på den ene side er meget let opløselige, men som samtidig har en langt højere aktivitet som substrat for serinproteaser end de tilsvarende tripeptider, hvori aminosyren A^ har L-formen, ja ofte endog højere end de tilsvarende benzoylerede tripeptider. Den N-terminale frie D-aminosyre i de nye tripeptider hindrer endvidere også et ikke ønsket angreb af amino-peptidaser, eftersom disse er specifikke for L-aminosyrer.

Tripeptiderne ifølge opfindelsen er derfor ejendommelige ved, at de har følgende almene formel: H - D - A1 - A2 - A3 - NH —no2, 1 2 hvor A og A vælges blandt aminosyrerne Gly, Ala, Val, Leu, Ile, 2 3

Pip, Pro, Aze, og A endvidere kan være Phe, og A vælges blandt aminosyrerne Arg og Lys.

Ved synteserne af de nye tripeptider ifølge opfindelsen benyttes almindelig kendte beskyttelsesgrupper og koblingsmetoder, som alle er velkendte indenfor peptidkemien.

Som α-aminobeskyttelsesgruppen er det fordelagtigt at anvende carbobenzoxy eller t-butyloxycarbonyl eller nogle hermed beslægtede grupper såsom f.eks. p-metoxy-, p-nitro- eller p-metoxy-phenylazo-carbobenzoxy.

Det er fordelagtigt at benytte protonisering eller grupperne NO2 eller p-toluensulfonyl til beskyttelse af 6-guanidogruppen i ar-ginylgruppen.

Til beskyttelse af ε-aminogruppen i lysin er det fordelagtigt at benytte først og fremmest grupperne carbobenzoxy, t-bu-tyloxycarbonyl eller p-toluensulfonyl.

Som fraspaltelig α-carboxylbeskyttelsesgruppe er det passende at benytte methyl-, ethyl- eller benzylestergruppen.

Koblingen mellem to aminosyrer eller et dipeptid og en aminosyre opnås gennem aktivering af α-carboxygruppen. Det aktiverede derivat kan enten være isoleret eller dannet in situ og kan f.eks. være p-nitrophenyl-, trichlorphenyl-, pentachlorphenyl-, N-hydroxy-ravsyreimid-eller N-hydroxybenzotriazolester, symmetrisk eller asymmetrisk anhydrid eller syreazid.

4 146937

Aktiveringen til de ovenfor nævnte esterderivater opnås med fordel ved tilstedeværelsen af et carbodiimid f.eks. Ν,Ν'-di-cvclohexylcarbodiimid, som også kan tjene som aktiverende koblingsmiddel direkte mellem carboxy- og aminkomponenterne.

Princippet i peptidsynteserne er trinvis addering af aminosyrerne til den C-terminale arginylgruppe, som enten fra begyndelsen er forsynet med en koblet kromoforgruppe, som derefter virker som en carboxybeskyttelsesgruppe, eller er forsynet med en fraspaltelig carboxybeskyttelsesgruppe, og den kromofore gruppe kobles derefter til det beskyttede tripeptidderivat,eller alternativt er det i princippet muligt at vælge at syntetisere N-terminal-dipeptidfragmentet i sig selv, som senere kobles til arginylgruppen med eller uden en kromofor gruppe i princippet som diskuteret ovenfor.

Uafhængigt af den valgte fremgangsmåde er en rensning af mellem- og slutprodukterne ved gelfiltreringskromatografi hensigtsmæssig, eftersom denne metode muliggør et hurtigt syntesearbejde og giver maksimale udbytter.

Opfindelsen vil blive mere detaljeret beskrevet i de følgende ikke begrænsende specifikke eksempler.

Forkortelser

Aminosyrer (hvis ikke andet er angivet menes L-formen):

Arg = arginin

Aze a= 2-Azetidincarboxylsyre

Ala = Alanin

Gly = Glycin

Ile = Isoleucin

Leu = Leucin

Lys as Lysin

Phe s* Phenylalanin

Pip = Pipecolinsyre

Pro as Prolin

Val = Valin

AcOH = Eddikesyre

Bz = Benzoyl

Cbo- = Carbobenzoxy- DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid DMF = Dimethylf ormamid 5 146937

EtgN = Triethylamin

EtOAc = Ethylacetat GPC = Gelfiltreringskromatografi HBT = N-hydroxybenzotriazol HMPTA = Ν,Ν,Ν',N',N'1,N''-hexamethylfosforsyretriamid HONSu = N-hydroxyravsyreimid

MeOH = Methanol -OpNP = p-nitrophenoxy -pNA = p-nitroanilid tBoc = t-butyloxycarbonyl TFA = trifluoreddikesyre TLC = Tyndtlagskroraatografi

Reaktionstyper anvendt ved synteserne.

Ved syntese af de nye tripeptider, som er opsummeret i tabel II udføres de forskellige reaktionstrin stort set på samme måde. Af denne grund gives en generel beskrivelse af de forskellige reaktionstyper og siden i tabel I en oversigt over mellem- og slutprodukter i oparbejdningsmetoder, som er anvendt ved de forskellige reaktionstyper og visse fysiske data.

5®53S£i22§£YE®_ii

Kobling af den kromofore gruppe 20 mmol Na, N^-beskyttet arginin eller Na, N^-beskyttet lysin eller et på tilsvarende måde passende beskyttet findelt og veltørret peptidderivat opløses i 50 ml nydestilleret HMPTA ved stuetemperatur, hvorefter 20 mmol Et^N og 30 mmol p-nitroanilin i form af dets isocyanatderivat tilsættes under vandfrie betingelser og under omrøring. Efter 1 dags reaktionstid hældes reaktionsblandingen ned i 0,5 1 2% natriumbicarbonatopløsning under omrøring. Det dannede bundfald fjernes ved filtrering og vaskes godt med bi-carbonatopløsning, vand, 0,5 N saltsyre og atter vand. Fra bundfaldet ekstraheres det ønskede produkt med f.eks. methanol, visse biprodukter opløses ikke. Methanolekstrakten kan efter inddampning udkrystalliseres fra et egnet medium eller kan renses ved GPC.

6 146937

Reaktions tyge_2 Λ

Praspaltning af en carbobenzoxybeskyttelsesgruppe (Cbo-).

10 mmol af det veltørrede Cbo-derivat opslemmes i 25 ml tør AcOH,og 15 ml 5,6 N HBr i AcOH tilsættes under vandfrie betingelser ved stuetemperatur. Efter en reaktionstid på 45-6o min. ledes opløsningen dråbevis til 300 ml tør æter under kraftig omrøring. Æterfasen suges fra det dannede bundfald, som vaskes med 2-3 portioner æter pr. 100 ml. Det således dannede hydrobromid af den Na-deblokerede forbindelse tørres over NaOH-tabletter i vakuum véd 40°C i 3-16 timer.

Fraspaltning af en t-butyloxycarbonylbeskyttelsesgruppe (tBoc-).

10 mmol af det veltørrede tBoc-derivat opløses i 200 ml 25% TFA i CH2Cl2 under vandfrie betingelser ved stuetemperatur. Efter en reaktionstid på 20 minutter tilsættes opløsningen dråbevis ved 500 ml tør æter. Det dannede bundfald fjernes ved filtrering og vaskes rigeligt med æter. Det således dannede trifluoracetat · af den Na-deblo-kerede forbindelse tørres over NaOH-tabletter i vakuum ved 30°C i 2-3 timer.

5®akti°2§tYE®_åi

Koblingsreaktioner.

Frigørelse af α-aminogruppen.

Ved acylering af de dannede derivater efter reaktionstype .2 eller 3 skal α-aminogruppen være til stede som en fri base. Frigørelsen kan udføres på mange forskellige måder. Blandt andet er det muligt at tilsætte et ækvivalent af en tør tertiær amin (f.eks.

Et^N eller N-ethylmorfolin) til en til -10° C afkølet DMF-opløsning af HBr- eller TFA-derivatet. I tilfælde omfattende Et^N og HBr-deri-vater fjernes det udfældede Et3N*HBr ved filtrering. Alternativt kan HBr- eller TFA-derivatet opløses i en 5% natriumbicarbonatopløsning, fra hvilken det frigjorte derivat ekstraheres med f.eks. EtOAc eller butanol, hvorefter den organiske fase tørres og inddampes.

7 146937 a) Med Να beskyttet aktivt esterderivat.

Til en opløsning af 10 mmol peptid- eller aminosyrederi-vat frigjort ifølge det ovennævnte i 20-50 ml nydestilleret DMF ved -10°C tilsættes 11 mmol Na-beskyttet p-nitrophenyl- eller N-hydroxy-ravsyreimidesterderivat af den aminosyre, som skal kobles på. Efter en reaktionstid på 1 time ved -10°C pufres opløsningen med 5 mmol tertiær amin og får derefter lov til langsomt at indstille sig til stuetemperatur. Reaktionsforløbet følges passende med TLC-analyser.

Hvis det er nødvendigt,tilsættes yderligere 5 mmol base efter en ny afkøling. Når reaktionen er tilenddbragt inddampes opløsningen på en rotationsinddamper til en olieagtig remanens, som omrøres med et par portioner vand. Remanensen renses ved anvendelse af GPC eller ved rekrystallisation. Når GPC anvendes til rensning af koblingsproduktet, og dette har et elueringsvolumen, som helt eller delvis stemmer overens med elueringsvolumet for det aktive esterderivat af den koblede aminosyres, kan kontaminering af koblingsproduktet undgås, såfremt uforbrugt esterderivat efter endtreaktion men før inddampningen erstattes med et overskud (3-5 mmol) af en primær amin f.eks. n-butyl-amin gennem 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter udføres oparbejdningen som beskrevet ovenfor.

b) Med Na beskyttet aminosyre eller peptid og dannelse af aktiv ester in situ.

Til en opløsning af 10 mmol af det ovenfor nævnte frigjorte peptid eller aminosyrederivat i 20-50 ml nydestilleret DMF tilsættes 11 mmol af Na-beskyttet aminosyre eller på en tilsvarende måde beskyttet peptidderivat med en C-terminal fri carboxygruppe, 11 mmol HBT eller HONSu og 11 mmol DCCI ved -10°C. Efter 1-3 timer ved -10°C får reaktionsopløsningen lov at indstille sig til stuetemperatur. Reaktionsforløbet følges passende med TLC-analyser. Efter afsluttet reaktion tilsættes opløsningen under omrøring til 100-300 ml 5% NaHC03 (vandig).

Det dannede bundfald vaskes med vand efter filtrering eller dekantering. Remanensen renses ved GBP eller ved rekrystallisation.

8 146937 BSSiStionstyge^^

Fraspaltning af alle beskyttelsesgrupper, rensning og ionbytning.

I 0,2-1,2 mmol af det beskyttede peptidderivat indeholdende den kromofore gruppe fraspaltes beskyttelsesgrupperne ved hjælp af 5-20 ml tør HF i nærværelse af 0,2 - 1,0 ml anisol i et apparatur ifølge Sakakibara egnet til dette formål i 60 minutter ved 0°C. Efter endt reaktion og efter at alt HF er destilleret fra, opløses råproduktet i 33% vandig AcOH og renses ved GPC. Produktet isoleres ved frysetørring fra fortyndet AcOH og ledes til ionbytning på en kolonne (tj\ indeholdende en svag basisk ionbytterharpiks Sephadex' ' QAE-25 på chloridform, der er kvældet i MeOH:vand, 95:5, med samme medium som opløsnings- og som elueringsmedium. Det rene produkt frysetørres fra vand.

Gelfiltreringskromatografi.

Ved anvendelse af GPC på beskyttede peptid- eller amino- syrederivater, råprodukter eller inddampede moderlude efter krystallisation opnås en forenklet oparbejdningsprocedure samt optimale udbytter. Materialet opløses derved i MeOH og overføres til en kolonne af passende størrelse (vomunen 0,5-7,5 1, længde 100 cm) f R) pakket med Sephadex LH-20, som er kvældet i MeOH, og elueres med samme opløsningsmiddel. Eluatet fraktioneres med passende partielle volumener og dets UV-absorption (254 nm) undersøges kontinuerligt. Produktholdige gelfraktioner undersøges for renhed ved TLC og de rene samles og inddampes.

Til rensning af peptidderivaterne efter fraspaltning af beskyttelsesgrupperne med HF ifølge 5 ovenfor,overføres den 30% vandige AcOH-opløsning af råproduktet til en kolonne af passende stør- (R) relse (volumen 0,5-2,0 1, længde 60 cm) pakket med Sephadex G-15, som er kvældet i 30% vandig AcOH, og elueres med samme opløsningsmiddel. Efter fremgangsmåden ifølge det ovenstående frysetørres de produkt-holdige rene delfraktioner om ønsket efter en delvis inddampning på rotationsinddamper ved 25°C.

Tyndtlagskromatografi.

Til TLC-analysen anvendes glasplader præpareret med "Kiselgel ^254" (Merck) som absorberende middel. De benyttede opløsningssystemer (volumenforhold) er: 9 146937 A: n-butanol: AcOHs vand (3:2:1) p·*": chloroform: MeOH (9:1) P chloroform: MeOH (19:1)

Efter afsluttet kromatografering studeres pladen i UV-lys (254 run) og fremkaldes med Cl/o-toluidin reagens ifølge almindelig praksis. De anførte R^-værdier er resultaterne af separate kromato-graferinger.

Bestemmelse af serinproteaser med kromogene substrater.

De ifølge efterfølgende eksempler fremstillede substrater benyttes til bestemmelse af forskellige enzymer ifølge den neden for skitserede fremgangsmåde. Princippet i bestemmelsen er baseret på det faktum, at fraspaltningsproduktet dannet ved enzymatisk hydrolyse har et UV-spektrum, som er væsentligt forskelligt fra substratet. Således har alle p-nitroanilidsubstraterne ifølge opfindelsen absorptionsmaksima omkring 300 nm med en molar ekstinksionskoeffi-cient på omkring 12.000. Ved 405 nm er disse substraters absorption næsten ophørt. p-Nitroanilin, som fraspaltes fra substratet under den enzymatiske hydrolyse har et absorptionsmaksimum på 380 nm og en molar ekstinksionskoefficient på 13.200, som ved 405 nm kun er faldet til 9620. Ved spektrofotometriske bestemmelser ved 405 nm er det således let at følge mængden af det dannede p-nitroanilin, som er proportionalt med graden af enzymatisk hydrolyse, som igen er bestemt af den aktive mængde enzym. Tabel II viser en sammenligning mellem relative reaktionshastigheder for tidligere kendte substrater med formel I, deres ikke-benzoylerede former og substrater ifølge opfindelsen. Denne tabel viser tydeligt fortrinnene ved substraterne ifølge opfindelsen.

Det ses således, at substraterne ifølge opfindelsen er adskillige gange bedre end tilsvarende substrater med N-terminal L-a-minosyre og endvidere mindst lige så gode som de tidligere kendte bedste substrater som af de benzoylerede substrater med formel I. Endvidere er den større opløselighed af de nye substrater (ca. 20-300 gange større) en meget stor fordel ved enzymbestemmelser fremfor alt i biologiske systemer, i hvilke den dårligere opløselighed af tidligere kendte substrater forårsagede problemer dels på grund af det faktum, at substratmætning ikke kunne opnås, dels på grund af risikoen for uønskede udfældninger.

146937 ίο (R)

Den til gelfiltrering anvendte gel Sephadex G-15 er en (R) krydsbundet dextrangel. Gelen Sephadex LH-20 er en hydroxypropy- (R) peleret krydsbundet dextrangel. Den benyttede ionbytter Sephadex' QAE-25 er en krydsbundet dextrangel med diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethyl som funktionel gruppe. Gelerne er fra Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Sverige.

μ 146937 £ 3 11 η Ό +> C 4J 41 Μ Η φ Μ * I ΆΐΟ ™ I Η β Q) Η Η Ο 3 +ι ϋίίΉ- /*s Λ ι**"*· ^ ^ ^ ς^ ΡΊ OO CO Ο Ο 00 CO CN Μ Ο C0 ^ γογ^γμγογο^γο n^rvo^ νο co ^ a, ·» *. ^ *. ·* *» s *. ·* * *» ro η ih ΟΟΟΟΟΟΟ Ο Ο Ο ° Ο * ,ρν W ^ W W --- ' Ο Ρη«-- Η Η Η Η Η Η Η HH rlf Η ι-ΙΓ1 '

ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft C

^ P -» p O O O —S er -r ~ s Q ~ M· p — S O Q ~ «! CM P in ^ O CM CM O '-»'tf ^ —' — Η Γ-) — ,_, . LO - * *. ^ Γ- ^ U1 Γ- C~~ - “ I-

a o * m vo «3 ^ o «· * * r» r·* H

_i CNioomcNC'ic'inroojH'^c'i η h + i i+i i+i i + i i + i 'ti •rn n .p ffi -P B p b +> b

p ti ω O »O + CD O cn O

(0 β u >i+> U U U U U U >1 <D U U >1 >fp u fti-H ft PH ft ftft ftft ft P S ft ft Λ 5 Λ W ft 0 C O υ·—ϋ OU U U CJJ U'-'CD 0 0^0- o O)

P

p _q ro r^voinvorotn •m· m1 t" o t— 1¾ lo l£) m Γ'- 00 (M OD cr\ uj [-- r- a\ oo

D

1 X •H ti <D

0) & j_| 0 J-i cn p ti ti ti ti ti ja ti ti ja ti jQjdjto μ· m1 *3· ^ m· m* m* <· m1

Η -P ti C

ffl β H O **·»*·» ---- - rfj >i ·& ·Η Η H CM (Ί N CM CM CM CM Γ0 CO ΓΟ ΙΠ

Eh CD W +J

ft _ ft 2 B 2 _ <u 0, ft O O, ft B ft Η I Β I O 2 10202 ti WOOOftlftftft 0)10,1 O, •H o cn icn 2 hz 02 η h o 0) O ~

U | ·Η ·Η 0, ti 0, 10, H ti I H I H

0) ~H OH O > O Η O I > ti Η H O

p CM>1 Λ >1 I II til O I CD I ti g ti ocucoao,>ti ippiQ > g E 2 tu *—' a> J-ι i η ίο) oi i i i to '-Λ UlA ft O ft P H 000 P V£> tii ti o, >1 o, i ja i i i « ja o o i ** β Pl+Jftl-POUOOO PUftO 0 - ti <d CM« icMtija ja ja ja p w p h ti locootiu -uuu - - a u — Ό O 2 ti O 2 ti H HH - D ja I >, ft I >1 - Η - - - Η Η H - - >

U O, O P O, O H HH >H > > Η X X H

Η H

. H HH HH

p HH> HHHXXHH H

Z.H Η HH>>> >H X X X

(¾ ^ < < 2 ‘ sd 2 2 ft ti! 2 ft ft I ω 2 rtj Cl, ti I ti ! Cn ti ^>i w ft

<d 2 Oft >t I

2 ft 'Tm <; CM«! cm < c ja i ι-i ti ft I O I O I O I I U O I u

1 — 202ftS533 --¾ s C

O ^ M -w -H — CU CD cnft 0) I

cm ja tifttifttii-dft >ii pi o O U PI PIP 1 „ 1 ^ ® - I p <Z ^ rijHsdrijHPdriJ 0)fidHriJ IHriJ H<1 ft

“ CD I (02 I ti 2 I hz (02 3 HZ ti 2 I

+) ti >i 0>ftft>ftti Hft>ft 0) I ft >ft H

X U ft PIIHIICD 11 II ftPI II ti,

β rij i ft O— ft O— ft P O--' i I -r Q -—· > H

>t) I O I I CM I I (M | I CM I CM O O O 10 IU

o o o ooooooo O O O O O O Λ O ja P ft p ja ft jaja2J3jaSj3 oz.Q2 mftu jau i

ft U -P U U— U U — U ft ^ u— -p -p —' U ^ B CM

•P

y *—». r»-» *»“<. •''“N η rj w csj σι i-ι m σ> I -H ' Ό -P CN H CN CN CN Λ .

C +) 0) ι-irHi-lrHH 1A6937

•H (UP

i'd'dO r- *9* r-~ o in 1 ri C 1) * *· * *· “

H O 3 +> H CN H CO CN

CJ Xl U-J — i—l i—i i—I i—I i—! _ Λ Λ ^ ^ 00 cm cn Ofoo in omiO'S,mir>rr) r-i cn >n m n1 vo lf ' * ' " ' ' ' „ .. w < .. * O ° 0 O o o o o u Ή OOOOO'-''" — , —' . v , "" , w,

. "I pS *— —- — -— ’-' i—I i—1 i—i i—1 Η Η H rH

Eh — ri! ri! ri| ri! sC ft ft ft ® ft ft ft ft \ c <: c <; <; — g -c· "

^ -—' — — ^ —' Ω — O Q

<a< in cn r- io co — o ^ w C\jQ * v » * · O ** 00 Øl f—i rHoomiø^··* m - - a co in io id io cn co cn Ν' — i i i i i + i + + i Ό •n 0) · XX -P -P +» j_i tyi co 3 co 3 ω s cd 3 U U U O U >iO U >iO U U U >iO u ft-H ft ft ft ft ftJHOJft PØ ft ft ft PØ ft 03 OUUUUUSO U S o o u u s o d>

P

-p

>1 OP XX

Ό in in in cn ι-~ ιο o σ> oo in η 'θ' σι O oo r-- r-· r'- oo r'- oo eo oo oo r·* S ,i

Jj -Η cd 0 u 0) ft O 0) P >t JJj. α»α)ΐα cd cd cd cd cd cd (0 4J (jig 'tfitfld ^ 'S1 n1 H C H o N-

>1Ό· -H ** - - ‘“-“('J

ojih-p m in in m in cn cn ru cn cn cn cn W £ 9 % g 0 I o

^ Η H — — ftl ft 1 ft D ft I

cd r-. O —· Η H S id 3 3 30)3 3 •ri rH S Η O O & Η ft 0 ft PI ft 0) u o g o g g o «: o pi o i o pi 0) g g g g i i i i i q i i

+1 g CO g 0JQ >)Q 0 I H Q

(d m Γ- Η I Η I ft Η O Π) I

g o - oo eo cn ri! O O 03 Η A > O

CO CN O CN Η * I Λ I Λ ft I U I Λ

σι ~ ' o o CJ O UO 0-0 U

C O O O— Λ XX XX i-i XX

cd — H — — U 'ft u -O H ft u tn H H X 3 H HZ >

Ud HHXJHH^Hft*. X! * X ft ‘ X!

3 > > Η Χί X! H X! O H Xi H X O H X

Η H

HH Η Η > H

• > HHHX! Η H HH> > u H > > > > Η X! x: X! X!X!X! X!

3 ^ ^ Μ X ^ ^ X X X XXX X

c 3 a _ I tn I tn I tn i tn | | | | | ^ ^ ^ ^ ^ 5»| tntntnioco ηΐκΰ cm < cm< n < M5hP>i>iOI O I Ol Ol

sirfJrtJPIJiatd 3 >1 30) 3rH

I III I — rH — H — rH — cd CU3333tnrt! tn O tnH tn>

H 0) <U 0) 0) !H I Μ I

ft H PI Η 3H PI PI < ft) rtj (< 3 < << 3 <J rt| 3 ri! IUIUIUI I I H 3 I 0)3 I 0)3 I 0)3

Jj H® 0)3 HW OJH Η η id <lft >t Pia 0 Pift H Pift

Tf (d rH cd HU (d U H II H 11 H II Cd II

a > <N H CN > CN HW >® c Q —» u Q —» H Q— > Q

ή | . I . I . I . I I I (N I I CN I 1 CN I I CN

^ QrijQrijQriJ QrijQrfJOOO OriJ OO O ri! O O OriJOO

S 13 13 13 ·3 I 3 Λ Λ3 Λ3 Λ3 Λ3Λ3 XX Z XX Z

2 3 ft 3 ft K ft 3 ft K ft U U— U ft θ'-" U ft U— U ft U ^ 146937 JJ ..—* ·—X ·—* Λ

θ5| η , 00 Η <31 Η σ. O

P, 4. Μ PO H CM CM H

g 4J j Η Η Η Η Η H

•r| 0) C — I ro H3 C CM O Π VO CM 01 1 H d 0 **'*** ho 3+

Q lp r- ' 1—Ir—I rH i-H 1—I 1—I

1^1/) CM VO 00 Γ' CO 00 *# in rocoro γοι^-Γ'^^ι'^ο'λομο

Ql|_) *. «, % ·» * J Bi O O OOO OOO **·**-**

EC- ^ ^ —- OOOOOO

HH HHH ΗγΗΗ^^Γ^Γ!^^^Γ

Pr Pr Pr Pr Pr Pr Pi Pr <! *0 <1 (¾ >=4 f=5 V _ Λ _

r^r -—. <] S ^ ^ ^ O

CM Q Q " ' " <! (S

Jr ~ o o m O - ~ a Γ' »«.«.nho PL * cNH^mro- lo in o in η h

+ I I I I I I

Ό •I~l Q)

n -P O -P

uh ω ril tn K

3¾ α o o o o u>iO>rOuuuuyu

Qj-rl Pr pr Pr Pr Pr PrP-PPOPrPrPrgPrPr o β 00 3oo u ow as o a u o a o <u p

P

>1 «>

r-H o\ ro o h r~ HincMt'-cr.inocMO

4JJ3 vo r' oo co m cn vo io cor't^cor^H

d ca 1

-P 1 X

p -d n 0) o a) Pr >p a) p >.

— tn -P

Φοω (ΰο)(ΰ,Ρ(ΰ<ΰ<ΰΛ Η -P H d 'S1·^ ·μ< «sr -m· c h o J >,8..H - · v» - CM ' * pq U]tH p CM CM CM CM (N rOfO ιΠίΛίΛιΛιΟιΛ 03 Pi 2 M g I —

S I O CL. 0 H

0) Η II O Pr P r-' Λ o H Pr (0 (1.00. I B Pi Η H 6 (0 g > gPH PPrIHHOOB·-'

H Pil Pr Pr Pr 0) O O O O g g r-H

p o a 011 a 1 1 s § s s 10 o tu 11 iaa imogg +j o) o ω 1 1 a -d Λ inco*g ns νλ Λ O o iftumcoro-^o g 2α p. λ λ οι * * * ‘ w ** m 1 iaa-Pu-οοοο tn o - o aOH—· — — ^ H o d ΛΗΛ'* CQ Η ^ H — (t) a H Pr U XI X Pr * -P Η H > t1 £ ^ tn > g Η HB Η * X H H ri ^ ^

T3 kXO. »XXPrHHXKXXXXXX

13 Η XO Η X XO > Η XOX X X X X X

H

Η H HH

HH HH> HHHX

HH X H HHH>>>>H

• >> H X X XXX XXXXX

p XX XXX XXXXXXXXPl g XX XXX XXX xxxxxx 1 tn 1 tn tn tn 1 03

r-p ~ p p p — >1 i'LL'L

CNrf (N rtj 0 1-3 ^ Φ θ’* Φ Φ 01 011 ιλι bi bl b b b b go 2 o) o da a) >< < < < < «! c n “ a a ο — λ 1 1 1 1 1 1 td 2 ti Pr Pr r-3 03 Pr CtJ ►>( 0) H 0) 0) PI PI I I >ilj('-jHHtdNXi ri| H rij ri| 0 ri! Pr<| PC a OC ri| U H > ri| Pr

I (dB I P B ·Η B 0)21 P2 IH IH IH IH IH IH

.p a) >p, o) Pr pr P. P. PiPrO) PrPi da du da du hu oa

,¾ N II Xi II II I I Λ II HK 0) K 0)2 0) K Π) K P K

d < Q ^ p, Q — Q— Qr-C Pr C CM PI CM PI CM PI CM > CM Pr CM

Ό I I CM I I CM I CM I CM I I O I · I · I · I V, I · 1 · O O ri| O O O ri| O O O O O O O ril ΟΛ Ω rij a ri| Q ri! Q <| a ril Q ril

P Λ B ΛΒ ΛΒ ΛΒ Λ B ΛΒ 02 AO IB IB 12 IS IS IS

Pr a Pr a— u Pr a^ o" O'-' ffl o. a^ ko.ko.kPiKPtKPiKPt η o η i u ·. - * tJ --i η <n ™ 1Λ6937 β -p+' Η Η H l*iU30/ Η Φ fl --- B - I T3 T3 } O ίο H O o1 I Η fi C - u £

H O 3 α Η H CN rtjO

Ui Ή+ Η Η H C

<-· dP 3 o > **"*» in ~_r~ r* o U ·ν· in il f-5 ^ ^

Em O O o — — — < rfj rf! ' '

\ B

*<=r <! < C£ |

<M Q w —' S S

f*i rH O w «- ** *>. O il ^ CM Γ* -

Γ0 \D

111 S

i ""

Ti •n ·> <D fe XI g

Xi D> Q

(d C U U U

Λ·Η ft ft ft II

O C O U C3

Q

<1) +)

+1 H

>i OJ

^ X i» TJ

.jj rQ in c>i ro Ό

03 £3 ιο Γ·» ΙΟ H

to g +> I « Χι ι X cn

O -«H ctj <D C

iMi οι a -η

^ <D M >1 C

co +i w h <d 0) m "Θ.

+> Di G H

xi c -η o a M o ffl co <w +> m in in pC "· ^ o *»

Q) rH

i—i *—«» i—1 rH I

tf rH O O m *H O | Ϊ ^ φ i °

+> ΓΟ "T II

td cn *» *

g * © © O

CQ O w w ζΠ 'w' ·· C h > -sr

(d Η Η Η N Q

Di XXX r-’ Φ XXX d D XXX — m id

H

HH C

• Η Η Η Φ

X) XI XI XI W

la xxx h

(U

Di •s 10 u III d) D> D> ω Ό

Xi M >i C

pc Pi xi 3

1 I I

0) 3 Φ M

XI 0) X! O

a xi ft *w

I i—I IH IH

+> a a d u o a <d a4 -Htnoiffixitc -p 3 ft CN X! CN ft CN (d

Ό I · I I · Q

o Q Pi Q p< Q pi U I Z 12 12 N, d, «awawa x 146937 15

TABEL II

Substrat OpløseliqhecL , Relativ reaktionshastighed mg/ml pufferx/ "T-T^-ΡΪ-Kil -OK~

Bz-Val-Pro-Arg-pNA 0,3 6 60 15 H-Val-Pro-Arg-pNA 40 6 55 15 H-D-Val-Pro-Arg-pNA (XIII) 100 80 100 95

Bz-Val-Pip-Arg-pNA 4 45 30 H-Val-Pip-Arg-pNA 4 35 45 H-D-Val-Pip-Arg-pNA (XIV) 100 70 100

Bz-Val-Leu-Arg-pNA 0,2 100 H-Val-Leu-Arg-pNA 50 H-D-Val-Leu-Arg-pNA (XVI) 600 100

Bz-Val-Leu-Lys-pNA 0,5 100 H-Val-Leu-Lys-pNA 25 H-D-Val-Leu-Lys-pNA (XVIII) >100 100

Bz-Ile-Leu-Arg-pNA 0,2 55 100 H-Ile-Leu-Arg-pNA 10 20 H-D-Ile-Leu-Arg-pNA (XV) 4 75 100

Bz-Ile-Leu-Lys-pNA 1 130 H-Ile-Leu-Lys-pNA 35 H-D-Ile-Leu-Lys-pNA (XVII) 20 100 x/ puffer = Tris, pH=8,2, ionstyrke = 0,15 1 tabellen ovenfor er de relative reaktionshastigheder for de forskellige substrater angivet i relation til et referencesubstrat valgt for hvert enzym. Symboler, referencesubstrater og deres følsomhed overfor de respektive enzymer er som følger: 146937 16

Enzym(symbol) Referencesubstrat nr. Følsomhed (angivet mængde enzym som giver aktiviteten 0/1 nkat) AOD/min= 0,0254

Thrombin (T) XIV 0,06 NIH

Trypsin (Try) XIII 0,03 yg (Novo)

Plasmin (PI) XVIII 0,01 CU

Kallikrein (Kai) XVI 0,2 BE

Urokinase (UK) XIV 40 pe

Plasmakallikrein (pk) XL 0,002 PEU

Hvor: AOD = ændring af optisk densitet (absorbans) nkat= nanokatal; 1 katal er den mængde enzym, som omdanner 1 mol substrat pr. sekund

NIH = National Institute of Health, som har fastlagt thrombin-enheden NIH

CU = Casein Unit (Caseinenhed) BE = Bayer Einheit (Bayer-enhed) PE = PU = Plough Unit (Plough-enhed) PEU = Plasmaækvivalentenhed (d.v.s. så meget som findes i 1 ml aktiveret normalplasma).

17 146937

Supplerende eksempler til TABEL II

Substrat Relativ reaktionshastighed __Enzym___T Try PI Kai Pk

Ref.substrat (akt. =100) XIV XIII XVIII XVI XL

H-Ala-Ala-Arg-pNA 4 10 2 H-D-Ala-Ala-Arg-pNA (XXXV) 100 50 15 a-Leu-Gly-Arg-pNA 4 4 H-D-Leu-Gly-Arg-pNA (XXXVI) 60 15 H-Val-Aze-Arg-pNA 10 70 H-D-Val-Aze-Arg-pNA (XXXIX) 105 155 H-Pro-Phe-Arg-pNA 10 80 60 25 H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (XL) 20 130 90 100 H-Pip-Phe-Arg-pNA 15 60 60 20 H-D-Pip-Phe-Arg-pNA (XLI) 30 130 120 75 H-Pro-Phe-Lys-pNA 40 H-D-Pro-Phe-Lys-pNA (XLII) 130

Enzymbetegnelse; T = Thrombin

Try = Trypsin

Pi = Plasmin

Kai = Kallikrein

Pk = Plasmakaliikrein akt. = aktivitet (reaktionshastighed)