DK145827B - Fremgangsmaade til fremstilling af et proteolytisk enzym,samt anvendelse af dette enzym til enzymatisk afhaaring af animalske skind - Google Patents

Description

(19) DANMARK

|j| 02) FREMLÆGGELSESSKRIFT <id 145827 B

DIREKTORATET FOR PATENT. 00 VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 3734/77 (51) Int.CI.3 C 12 N9/52 (22) Indleveringsdag 23- aug. 1977 C1AC1/06 (24) Løbedag 23- aug. 1977 (41) Aim. tilgængelig 25· feb. 1978 (44) Fremlagt 1 4. mar. 1 983 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 24. aug. 1976, 7625631, FR

(71) Ansøger RHONE-POULENC-INDUSTRIES, 75008 Paris, FR.

(72) Opfinder Andre Belloc, FR: Jean Florent, FR: Jean Lunel, FR:

Jean-Claude Palla, FR: Denise Maney, FR.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et proteolytisk enzym, samt anven= delse af dette enzym til enzyma^ tisk afhåring af animalske skind.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et proteolytisk enzym betegnet 24 199 RP, samt dets anvendelse specielt inden for garvning til afhåring af huder og _ skind.

OQ

N Det omhandlede enzym fremstilles ifølge opfindelsen ved dyrkning

DO

af mikroorganismen Streptomyces caligosus DS 14 486 (NRRL 8195) under de i krav l's kendetegnende del anførte betingelser, r— )£ Enzymet 24 199 RP er et protein, der foreligger i form af et brunt 3 2 145827 til sort pulver, er rimeligt opløseligt i vand, tungtopløseligt i koncentrerede vandige opløsninger af neutrale salte (f.eks. ammoniumsulfat) og i vand/alkohol- og vand/acetoneblandinger og praktisk taget uopløseligt i vandfri alkoholer og ketoner.

Dets molekylvægt er ca. 27000 og dets isoelektriske punkt pH 3,7.

Enzymet 24 199 RP’s proteolytiske virkning udøves på et stort antal substrater med proteinkarakter såsom casein, hæmoglobin, fibrin (opløsning af koageler) og mælk (koagulering).

Virkningen på casein måles ved en teknik beslægtet med den af M.Kunitz, J. Gen. Physiol., 30, 291 (1947) beskrevne. De ved hydrolysen frigjorte peptider, som er opløselige i trichloreddikesyre, måles enten ved spektrofotometri ved 280 nm, hvorved aktiviteten udtrykkes i Kunitz-enheder (U.K.), eller ved kolorimetri efter den af O.H. Lowry et coll., J. Biol. Chem. 193, 265 (1961) beskrevne metode, hvorved aktiviteten udtrykkes i mg tyrosin dannet pr. minut under analysebetingelserne.

Mælkekoaguleringsaktiviteten bestemmes ved en metode, der er inspireret af den af N.J. Berridge, Biochem. J., 39, 179 (1945) beskrevne, og kan udtrykkes ved løbeenheder (UP), hvilken enhed defineres som følger; En løbeenhed (UP) er den mængde enzym, som på 100 sekunder koagulerer 10 cm^ rekonstitueret mælk.

Den fibrinolytiske aktivitet måles på et standard fibrinkoagel frembragt ved thrombinindvirkning på fibronogen, og den kan udtrykkes ved lytiske enheder (UL), der er defineret som følger; En opløsning måler 100 lytiske enheder pr. cm^ (100 UL/cm^), dersom den opløser et standard-fibrinkoagel på 30 minutter.

Aktiviteten af enzym 24 199 RP fremstillet ifølge opfindelsen over for forskellige substrater er angivet i tabel I.

5 165827

TABEL I

Substrat Omsætning Aktivitet

Casein Proteolyse (a) 1 470 UK/g Mælk Koagulation (b) 14 500 UP/g

Fibrinogen Opløsning af fibrin- koagel (c) 4 920 UL/mg (a) udført ved pH 7,5 og ved 37° G - koncentration i substrat 5 g/1.

(b) udført ved pH 6,35 og ved 32° C - på rekonstitueret mælk (c) udført ved pH 7,5 og ved 370 C.

I tabel II er angivet resultaterne opnået ved hydrolyse af casein ved forskellige pH-værdier.

TABEL II

Proteolytisk aktivitet over for casein véd 37° C

pH i reak- udtrykt som mg dannet tyrosin Pr· 9 enzym tionssubstrat 3,5 220 4.0 410 4.5 900 5.0 1 370 5.5 1 540 6.0 1 510 6.5 1 930 7.0 2 140 7.5 2 270 8.0 2 180 8,5 1 990 9,0 660

Enzymets specifikke virkning overfor keratinerne i huder og skind og glycoproteineme i hårsække og animalske hår kan ikke fastlægges entydigt ud fra de på klassiske substrater som ovenfor angivet målte aktiviteter; men de kan km påvises ved faktiske afhåringsforsøg, så- 4 145827 ledes som de er beskrevet i efterfølgende eksempler 4 og 5.

Enzym?24 199 RP udviser aktivitet over et bredt pH-område: Den optimale pH-værdi for caseinhydrolyse er tæt ved 7,5, og enzymet bevarer mindst 60 % af sin maximalaktivitet i pH-området mellem 5 og 8,5.

I tabel III er angivet resultaterne opnået ved hydrolyse af casein ved forskellige temperaturer.

TABEL III

Temperatur i Proteolytisk aktivitet overfor reaktionssub- casein ved pH 7,5 stratet C udtrykt som-mg dannet tyrosin pr. g. enzym 25 1 360 30 1 740 40 2 230 45 2 250 50 1 770 55 680 60 200

Den optimale aktivitet for enzym 24 199 RP forekommer ,ve.d temperaturer tæt ved 45° C, og aktiviteten aftager meget hurtigt, såsnart temperaturen overstiger 50° C.

I tabel IV er angivet resultater, der viser caseinhydrolysekine- 3 tikken for enzym 24 199 RP i en koncentration på 10 ^ug/cm . Aktiviteten er udtrykt i mg dannet tyrosin.

TABEL IV

Hydrolyse- mg tyrosin i reaktions - tid i minutter substratet_ 5 0,100 15 0,300 20 0,370 30 0,380 60 0,850 90 1,130 5 145827

Den organisme, som producerer det proteolytiske enzym 24 199 RP, er en Streptomycesstamme, som er blevet isoleret udfra en jordprøve, og som er blevet tildelt nr. DS 14 486. En prøve af denne stamme er blevet deponeret hos Northern National Research Laboratory under U.S. Department of Agriculture i Peoria, Illinois, U.S.A., hvor den er indregistreret under nummer NRRL 8 195·

Denne organisme, som udviser karakteristika, som ikke gør det muligt at identificere den som en allerede beskrevet art, bør betragtes som en ny art, og er blevet betegnet med navnet Streptomyces caligosus, DS 14 486. Isoleringen er udført efter den almindelige fremgangsmåde, som består i at bringe en lille mængde jord i suspension i sterilt destilleret vand, at fortynde suspensionen ned til forskellige koncentrationer og at udsmøre et lille volumen af hver fortynding på overfladen af petriskåle indeholdende et agar-næringssubstrat. Efter in-kubering i nogle dage ved 26° C, hvilket tillader mikroorganismerne at udvikle sig, udtages de kolonier, som man ønsker at isolere for nærmere undersøgelse, og omplantes på agar-substrat med det formål at opnå mere rigelige kulturer af dem.

Streptomyces caligosus DS 14 486 danner cylindriske sporer, som måler 0,8 - 1,0 ^um x 0,6 - 0,8 ^um. Den udviser klaseformede sporophorer. Sporekæderne er almindeligvis ret lange omfattende op til flere dusin sporer, og de er oprullet i tætte spiraler mere eller mindre langagtige, med i almindelighed 2 til 5 vindinger, men ofte op til 6 eller 8 eller endda ca. 10 vindinger. Ved sin form for sporedannelse kan Streptomyces caligosus DS 14 486 henføres til gruppen "Spira" ifølge Pridham’s klassifikation.

Streptomyces caligosus DS 14 486 udvikles godt ved 26° C, dårligt ved 37 °C og slet ikke ved 50 °C. Den har et sporedannende luftmycelium med grå farve. Farven på dens vegetative mycelium går afhængigt af dyrkningssubstratet fra mere eller mindre mørkebrunt til sortbrunt. På organiske substrater og specielt på det særlige tyrosin-gærekstrakt-agar efter Waksman ("melanin-dannende substrat") producerer den almindeligvis rigeligt melanin-pigment, hvilket giver substratet et mørkt skær. På en række syntetiske substrater er den i stand til at producere et opløseligt, sortagtigt pigment i større eller mindre udstrækning.

6 145827

Ved dyrkning udført ved 26° C viser den følgende biokemiske forhold: - melanindannelse : positiv - HgS dannelse : positiv - tyrosinase : positiv - gelatinesmeltning : positiv - celluloseudnyttelse : positiv - nitritdannelse ud fra nitrater : ingen på bouillon med tilsat nitrat, men positiv på syntetiske substrater - stivelseshydrolyse : positiv - skummetmælksdyrkning : peptonisering uden koa gulation .

Streptomyces caligosus DS 14 486’s dyrkningskarakteristika er samlet i nedenstående tabel. De henfører til kulturer i god udvikling, d.v.s. efter ca. 3 uger ved 26° C, med mindre andet er angivet. Disse karakteristika er iagttaget på de agar-substrater og bouilloner, der almindeligvis anvendes til fastlæggelse af Streptomycesstammemes morfologiske egenskaber, idet agar-kulturerne er udført på skrå substrater.

Et vist antal af de anvendte substrater er fremstillet ud fra formuleringer angivet i "The Actinomycetes", S.A. Waksman, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950. I disse tilfælde er dette angivet med et "W" efterfulgt af det nummer, der er tildelt i "The Actinomycetes". Henvisningerne eller sammensætninger af andre næringssubstrater er som følger: - Ret. A - "Hickey and Tresner’s Agar" - T,G. Pridham et al

Antibiotics Annual, 1956 - 1957» p. 950 - Ref„ B - "Bennett’s Agar - S.A. Waksman

The Actinomycetes, vol. 2, p. 331, nr. 30 -The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 - Ref. C - Formel W - 23, tilsat 2 % agar - Ref. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. Pridham et al.

Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950 - Ref. E - Tomato Paste "Oatmeal Agar" - T.G. Pridham et al.

Antibiotics Annual, 1956 - 1957, p. 950 - Ref. F - "Melanin formation medium" - S.A. Waksman -

The Actinomycetes, vol. 2, p. 333 - nr. 42 -The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961 7 145827 - Ref. G- W.E. Grundy et al. - Antibiotics and Chem.

2, 401, 1952 - Ref. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham et al. - Antibiotics Annual, 1956 - 1957» p. 951 - Ref. I - svarer til formel ¥-1, hvori 3 % saccharose er erstattet med 1,5 % glucose.

- Ref. J - svarer til formel ¥-1, hvori 3 % saccharose er erstattet med 1,5 % glycerol - Ref. K - svarer til formel ¥-18, hvori 3 % saccharose er erstattet med 1,5 % glucose - Ref. L - svarer til formel ¥-18, hvori saccharosen er ude ladt og erstattet med små strimler filtrerpapir delvis neddyppet i væsken - Ref. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of

Bacteria" - Society of American Bacteriologists Geneva, N.Y. - II 50-18 - Ref. N - "Plain Gelatin" - fremstillet ifølge anvisningen i "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" Society of American Bacteriologists -Geneva, N.Y. II 50-18 - Ref. P - Skummetmælkspulver - handelsvare - rekonstitueret - Ref. Q - Substrat anvist til undersøgelse af E^S-dannelse af: H.D. Tresner og F. Ganga - Journal of Bacteriology, 76, 239 - 244, 1958.

8 145827 i 'h i Η ω o » cd ft <d bo ftg g 6 00 ri d ra ø ? ? ·η g p ø ø

g Η H W 0 g P g H

<d i o ø»ø co g d ω δ ø bOffiil Λβ'# ^ØSBgPgø 3 ,¾ g ra O O g K O 'g •Η Ο Ο -Hg *· O ftH g d 3 ·Η H g © r-ι I ,? · M 0 ri S P d«D ft g ·ΡΗ·Η

g ø 3 i >x> o ø ø 0 0 S

$ P jy ή ·> - g ra bon g ggio HgoooOøriHHg 0 0 ·Η >» 0 ^ ftH ø ? ft 0

fflra fi UhQiiWMHlHOH

&o p bo

•Hg -P H

H-P 3 g -P

øg g 3 bO

ra ø P gPP ø-P ,, „ I-B

SS P p ø & P 3 -P -p -p S

Η δ g °0 bOg gp g g g P

α·Η o gøsog o o og

OPi CQ C5 S S CQPI 0 oi CQP

1 I g g >1 0 0 g g — P o p a

g 0 01 H 1 I

ø p -h d £ JL ' '

(j hn IJ d £ TJ Ή iH iH i JJ

øøo -π is PØ f æ+> f g-P .øcriP

Cnd dø ØH cn P ·> P ΐ5* gøøø gdS -h>P PØP -hS tn H t? H ι-n vj rrj h oøø > 0 >0 p g g 0) ΡΛ «-Pil Iø3 PP-H p -H - H dOØ P 0 H ØH Λ ,ug WPh ·Λ·ϋΙϋ “0 bpyj -H ‘H g g bO t> g bO > -h tn ra > øøø P P Η P jp > ,P Ji 2 ;Psø > -H 0 d PPO 0 tn!> CDH> W ΡΉ SS? SS? øln^iS? g 1 ø i G) j—i >—i

Oh Ej >> 0 M -

a —p - K bO

tå« 1-p 13 •H.øfig C Η ? H Øg C ?»? P i>00? 0 ? g ? 0? 0 H g_

ø'-'ddg laSOrOSo dg d p bO

p -rH 0 -H tO -H ~ 0 0 -H P -H 0 ØgtDØøP H) Øil * 0+5 0 -P J £< bf ø cn g Cng tn ø g S g O'1 g Cn g g Ø-høøøO øgs · S øo øo .· s

> p P P ffl ω WPS > S CQ 0 «0 > S

0

bO

ri .

•Η d i—1 I o

yj 0 bO P -P

Hd g 0 0 > ø d d s bO bod bOd d dg O o ø-H øoøo o

jdbOt? t5 EhH SbOSbO bO

3 p ø r ri oi bos p o

fit øø b0i4 P

? PP O ø ft rag g g ,J4d g g 0^ raøbo ø ø øh rapø fti>- iiopo^· p^p^g g·-' h rap i i ? H gc ΉΡΐϋ <H rio PftQ Ø^PSH ø |3 H øisø ØP 0 o ra Søøø rav-> ri øri· o· ra · P g · ®P, ΐ,· o ii g^rap gfl'H ggH ø ø H gøgdH og g øoøø ø g 0 øøø gpø !> S ø H ø ? ø

>, ω·Η gø boøei bOSff: 8 Hoc! 0 O bO g D? H bO

Q CKEh'-' •aiPQ'-' <! C5 0·^ MP®^ Oø 9 a Z . 145827 P · d I Tl o \ d ω η ΰ d rj I I bD O Φ d PrH ·Ρ •H £3 W d ^ « IQ O ffl S © C -Η Η ·Η Φ η · td ft Λ Μ ί3 □ SL, S f-ι d SH ra Φ d ra >>

Η ω ω d <D o Η P ,¾ -P Φ Φ H

Φ EB -P © W PrH Η M O

SH'H ·Η B-PCOH M8HH · d <ΗΦΜ H „ ™ t ω 2? £ Έ £_, cd d H Φ OD O d P ί> h >> O'__-p φ -Ω ,!3·>ΦΗΗΦΗ-ΡΓΡ

ίπ Sh 2 p tQOHd, in -P Ή M

φ $ φ H Η Η O <Η -P Φ CO W Φ ^ f> m«h+5^-n o i> fn Φ -P* ^ os oj S o ra > •rirld-p ?h ra h ·θ Φ P<, ‘“i , * P· 1-1'il -p φ P cd φ -p -p dScopdHda) P-p •η d ·η Μ d ·γΙ ·ηο ·>^φ3φΜο ί> η ra 3 d d S Η © HHOO-ddHSM ·ΗΜ slwa la eixsi&s^ii· så , s §

(j0 $h I H

•p -P -p bO I I Φ -P H -P

Hfl -p Mg -P-P -p-p u °P

op p d id 3 d°P d°P °cd P p © d d O !> d Od O ί ή 8 P t? 3,3 CQ co,o CO bo CO bo OS,© pq ra

P I

& P © i i—I Η -P

P ©d A τ) φ η -P <d , ^ ώ .. 3 -p > -p-p -p m •r-l P Q) H |“j s 1 2 3 4 -PCD Cl)

,'Η S£ ©£ Λ Λ-μ Ti 4J -P Ό P

•p, 2 m 3 0 tn^· Φ C7>0 (U

OvH -P ©p CPP-H ·Ρ·Ηη -PEH

•P® 4J e+, -PW HgS H M

H 'Pifn d hn >H -P Ό T3 -H

^ pi d £P .2 S? η »rb .—! !> H »id k, :P »id > "dn "S ”2^Φ ΡΡΌ > d H >PT3 £<H &ΐθ Η &&H W ^ 3 M013

i—J

P

I I ·> ^ J, £ B^dd β CB+) K ^ S Η ·Η -p-SSm S - sB s£ a Ura gj°© %t §»*ShS ££ >•1 >·^ fillb «S «i^S5 «£ 60

-p-P -P-P *P

cd cd cd P Η H

Pn?H-Pfa-PfH Q © φ φ Φωωω 2 p >p bOTb bOTd S Ti Ti o O ΦΟ0)Ο O Φ O 2j g s gass OHM g 2 u di 3

p ·Ρ Η ^ I

I bo bO p d K -P

4

P 1>5 P d CD P

(rt|X) I Pd d d 2^,* h

i db -P© cd P d'H'H -P

d dl cd c · Cdd bp P. ·Ρ©Φ

p EB bO-H'H Η ·Ρ P & Oi ζ* S

bo bOPdd) Cdp d ©w i } H

p I -P in Dd i d^ Ή I J 0) P φ J

5 dS^-=- |mc5 a φ^ »»g bO ·Η P η) P P^ Η P cd H'— d^-' tQdpP *H d · ίϊ(Μ O S5 L5 2^r •H LT\ O -P ω θΦ*Η HH Od >-Po f>d

dl d W Η Η-ΡΦ PI Ped ·ΗΗ·Η HP

EB |5 >5rici J ® pCHff! >|3 H bO -PPd -PbO

S—> Η Φ +j d O Φ^ O'—' C5 P CO ω CM CO P

10 145827 i <f α> I 60 P C\l MO Ή d H d ftlDTi k d d d id d d tid®o

δ δ -P +3 > ο P d P +3 P

•Η ·Η P P P P &0 & P P

4J 4J !>jdP P rl ho® O IS

£ S p P -¾ H O d P

p p >3 pm 3 ο ,ω o d 3 o xJ dS o Ό g. 3 d^ ο o ©ft P *3 S 3d 5

d d ffl · d H O d ©P

Q.|> ft > o > d ft >· ftO P P

p P P P Η P O P P Ο P P W

HP ·ΗΡ P P P P P “p o d

d P d P Η P P d d “P "S "d t3 S

PM pm H w,k PM dddS

p o P o <d o p p <D o © p d p

s Pi Sft O ΡΛ S d CQ S Cd AJ -P

p P ? ω i d

3¾¾ p3 3¾ ω $ I || -P

ill il si i i t il i

"φ d ~ HIP

H p <D p Ό S POO

<, d d & wdodd S +311-1 φ φ ρφ p d d © o . p u d d > Φ®cdP d d P d Φ-Η 3 3 T3d -d u ιιριΡ,φο peh> f f ipa^rf ;Hd ι.·§ 3¾ 51¾ « as «>,W3 38 «ΐβ! 2” H P Pd d P^CdMO Hd Pb0>

rrj c fpS i—IS Η Φ Φ Η P .O xJ τΗ H

2 5 -Hd »cdd «tdTd ω °cdi>Hd, P °d w ω

>o >o do do d dd®olH > P d tvH

m £ £; p δ<Η OS H a ddd (d Pd cd OHH

tr>

•H

I I G d Ό d i c ω i c ω tn d d p R m P P .-h dd dPCnpP (dd +ί κϊ ' Si, ωωη dd d p m d -p pq λ H .d d 3 PP Dl d XI d Mffl pbp d p P ° g d HH p pcd^cd . oi ,«ω .¾ > S s c[d d ΰ Hd Η P · G P d>i P rd -P ? ddm d 0) dddP'd Si—) PH P M 83*>d ω d $ &rø 5o o d ο h φ ω p -p -p

£2 3 P W d G W Wd £0 d d hn ,g S

• rn d · ω · ,Ω © d © WbOf-i bOH ΰ bp -dii SHtnd S Bu s H ocd Ό H 3 P Td d°{d dd ^dfe

• P (ri d · td G · P d -η P d SB P d MH d d d P * O

!>Pffl>o i> £i ίτ> t> p MraPP Eh m Sow b M did >PS

&o ω ω p p p -d p -p Η Η Η Φ aj Φ φ Φ Odd d as i φ φ φ

Tj SO § Ti SO Ό Ti Ό Ο ΦΟ ΦΟ ΦΟΟ o o

O Eh bO Eh b0 EKI S S S

d P^ d H S d do d d dm O H o d

ΦΜ Φ Φ d Η Η P Η P

ωοΛ ω ,¾ yjd^i pi h^i d^i η h COdO ΦΦΦ ΦΡΦ p ϊέ ΡΦ Ο Φ p d

® Pi W ft d ft dv->' 3 ft "SB* 3 "B H

iiilcd j^oco jsjoco i od od od H

WON MO N^ Μ o Ni··'-' Φ d P Nfi ra N^· P Φ

POO P d O H P >iO H WO ΦϋΜ OOH w P S H

Pd PH PH Η H W H MP 's-τ' OWd'-' φ &0 d · ® bod · OH Od · d d f * °£r P ΦΗ P OP P ΟΉ >P OOP HOP t’-j'1-1 i3^1 dOPi d'dpo dHPo Pd dpo '“'ί3^ SJ.

p^oP!3 >>oppi Eloped po η p cd oPcd J ® d .¾ ^ rag®C cqso^ mso^· rap O o^ o o«-* S S^ 11 145827 cd 5 ft. -μ *h ·ηρ ra bo ο ο ra ft. ø d d 3 ·> ø o s d •Η Ο) ΛΙ ω P.H ft.

d tj d°0 'd ω +3 o I ·Η ft so ft! -p H ft. pj p · to wifti'cim -h d ø ft.

i ft! o ft! ·> Η ω'Η cu ra -h-pjbvo ^hoifttio 0 ft. P _ ·Η d ,o d

d > ø 0 E H

Η-H ran P.H E ft! , ft! -P *p τίρ -pti ora^ra 0 -Η P bOP 0 I S 0Ή h ra ftcd-diOift! cqh-p> 0 O 0 Ο H -°0 cMH'Hd C5 ft ft ,¾ HUP a !UC 0 s 0

-P X

ft! ft.

3 & ft. a p

0 P P

X 0 d P

ft. M3 ft.

S 0 ft. o

g W

d d ft! 0 0 0 &o ω w) d d d HH Η a P°0 ·

0 ft!> bO

0+3 .

a a; d _ °oa

Η Φ d ft. P

ω u

0 ·Η 0 ft. &D O

d > H P *H W

d'd'H 0 H P

p 3 ft. λ d ω · d η η φ ft. 3d a 3 3 0 !> $ ft. -Η -ft.

g > o a m ft. >p

-P P

0 0 ft. ft.

0 0

Tp 'ό tS

o o o ϋ g g

/-N

1 ^ a

0 S

H ,¾

0 · H ft. MH

bOH ffi 0 O 0 0 a^ p cd dft! P ft p ftt^ 0^ 0 0 0 ft. a · dø 0 a Pi ft. ra bo d 3¾ gJ ω d CM -H XPd bo ft. 0

HP CQ'T-- <!HP

12 165827

Streptomyces caligosus DS 14 486 udviser en række egenskaber, der ikke er nøjagtigt sammenfaldende med nogen allerede beskrevet stamme, og det er derfor, man bør betragte den som en ny art.

Blandt de arter, der er beskrevet i Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology" (7. udgave, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) såvel som i "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. Waks-man, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961), er den art, som Streptomyces caligosus DS 14 486 synes mest nærliggende, Streptomyces noboritoensis. Ligesom sidstnævnte danner den melanin-pigmenter på organiske substrater, på størstedelen af sine dyrkningssubstrater danner den et vegetativt mycelium, der er mere eller mindre mørkebrunt til sort, ganske særligt på kartofler, hvor den danner et meget mørkebrunt vegetativt mycelium og udviser et sporedannende luft-mycelium af grå farve. Ikke destomindre bør den betragtes som værende forskellig derfra, idet Streptomyces noboritoensis ikke danner regelmæssigt spiralsnoede sporekæder, ikke smelter gelatine, eller kun gør det i ringe omfang, ikke danner opløseligt pigment eller blot danner et svagt brunligt opløseligt pigment på glucose-asparagin-agar, på næringsagar danner et mørkt rødbrunt opløseligt pigment, mens omvendt Streptomyces caligosus DS 14 486 danner sporekæder, der oprulles regelmæssigt i tætte spiraler, smelter gelatine, danner et opløseligt sort pigment på glucose-asparagin-agar og giver et opløseligt gråligbrunt pigment på næringsagar. Streptomyces noboritoensis danner også på syntetisk saccharose-nitrat-agar et farveløst vegetativt mycelium, mens Streptomyces caligosus DS 14 486 på dette substrat danner et tæt gråligt til brunligt vegetativt mycelium. Yderligere udnytter Streptomyces noboritoensis hverken rhamnose eller saccharose og kim i meget begrænset omfang arabinose, inositol og xylose, mens Streptomyces caligosus DS 14 486 udnytter alle disse carbonkilder særdeles godt.

Man har anvendt den af Pridham og Gottlieb (J. of Bact.56, 107-114, 1948: angivne principielle metode til at bestemme Streptomyces caligosus DS 14 486’s evne til at udnytte forskellige carbon- og nitrogenkilder til sin udvikling. Udviklingsomfanget er blevet observeret på det grundsubstrat, som forfatterne angiver, under udbytning af henholdsvis glucose med diverse carbonkilder og af med di verse nitrogenkilder.

145827 13

Resultaterne af de således undersøgte stoffer ses i følgende tabel:

Carbonkilder Udnyttelse Nitrogenkilder Udnyttelse undersøgt_undersøgt d~ribose positiv NaNO^ positiv d-xylose positiv NaNO£ positiv i-arabinose positiv (NH^^SO^ positiv 1-rhamnose positiv (NH^^HPO^ positiv d-glucose positiv adenin positiv d-galactose positiv adenosin positiv d-fructose positiv uracil positiv men langsomt d-mannose positiv urinstof positiv 1-sorbose negativ 1-asparagin positiv lactose positiv glucosamin positiv maltose positiv glycocol positiv saccharose positiv sarcosin positiv trehalose positiv d,l-alanin positiv cellobiose positiv d,l-valin positiv raffinose positiv d,l-asparaginsyre positiv dextrin positiv 1-glutaminsyre positiv inulin positiv 1-arginin positiv stivelse positiv 1-lysin positiv glycogen positiv d,l-serin positiv glycerol positiv d,l-threonin positiv erythritol negativ d,l-methionin positiv adonitol negativ taurin negativ dulcitol negativ d,l-phenylalanin positiv d-mannitol positiv 1-tyrosin positiv d-sorbitol positiv d,l-prolin positiv inositol positiv 1-histidin positiv salicin begrænset 1-tryptophan positiv betain

Dyrkning af Streptomyces caligosus DS 14 486 kan gennemføres efter enhver aerob dyrkningsmetode,· det være sig på overfladen eller neddykket, men den sidstnævnte metode er den foretrukne udfra bekvem- 14 U5827 melighedshensyn. Man anvender til dette formål de i gæringsindustrien almindeligt anvendte forskellige typer udstyr og podnings- samt gæringsteknik.

Gærings substratet bør i princippet indeholde carbonkilder og kilder for assimilerbart nitrogen, mineralsalte og eventuelt vækstfaktorer, og disse bestanddele kan tilføres i form af veldefinerede for-• bindeiser eller af komplekse blandinger, som man finder dem i biologiske produkter af forskellig oprindelse.

Som assimilerbare carbonkilder kan man udnytte kulhydrater såsom glucose, saccharose, maltose, dextrineme, stivelse eller carbon-holdige stoffer som sukkeralkoholer (glycerol) eller visse organiske syrer (mælkesyre, citronsyre). Visse animalske eller vegetabilske olier som hvaltran eller sojaolie kan med fordel erstatte disse forskellige carbonkilder eller bruges som tilskud dertil.

Bekvemme kilder for assimilerbart nitrogen er uhyre forskelligtartede. De kan være ganske enkle kemiske forbindelser som uorganiske eller organiske salte af ammonium, urinstof eller visse aminosyrer. De kan også tilsættes i form af komplekse forbindelser, der i hovedsagen indeholder nitrogenet i proteinagtig form: casein, lactalbumin, gluten og dettes hydrolysater, sojamel, jordnøddemel, fiskemel, kødekstrakt, gærekstrakt, "distillers solubles", "corn-steep" (de to sidstnævnte er former for bærme).

Blandt de tilsatte mineralsalte kan visse have en puffer- eller neutraliserende virkning, såsom alkalimetal- eller jordalkalimetal-phosphateme, eller calcium- eller magnesiumcarbonat. Andre tilfører den ionligevægt, som er nødvendig for udviklingen af Strepto-myces caligosus DS 14 486 og for dannelsen af enzym 24 199 RP, såsom chlorider og sulfater af alkali- og jordalkalimetaller. Endelig virker visse mere specifikt som aktiverende på stofskiftet hos Streptomyces caligosus DS 14 486, det drejer sig om saltene af zink, cobalt, jern, kobber og mangan.

Vækstfaktorerne er vitaminagtige naturprodukter såsom riboflavin, folinsyre og pantotensyre.

145827 15 Gæringssubstratets pH ved dyrkningens begyndelse bør være 5,8 - 7,8 fortrinsvis 6,2 - 7,4. Den for fermenteringen optimale temperatur er 25 - 30 °C; men der kan opnås en tilfredsstillende produktion ved 23 - 33 °C. Lufttilførslen til fermenteringen kan varieres mellem ganske store værdier. Man har imidlertid fundet, at en beluftning på 0,3 - 3 liter luft pr. liter bouillon pr. minut passer særlig godt. Det maximale udbytte af enzym 24 199 RP opnås efter 2-8 dages dyrkning, idet tidsrummet i hovedsagen er afhængigt af det anvendte substrat.

Enzym 24 199 RP kan isoleres fra fermenteringsurten på følgende måde: - fermenteringsurten kan filtreres, eventuelt i nærvær af filterhjælp, ved et pH, som almindeligvis er det ved slutningen af produktionsfasen rådende. Det udvundne filtrat koncentreres til ca.

1/5 af udgangsvolumenet, og enzym 24 199 RP udfældes ved tilsætning af et dertil dårligt opløsningsmiddel, såsom acetone.

- råproduktet kan oprenses ved fraktioneret fældning ved hjælp af faste uorganiske salte eller ud fra koncentrerede vandige opløsninger, såsom ammoniumsulfat og/eller for enzym 24 199 RP dårlige opløsningsmidler såsom acetone. Produktet kan også oprenses ved dialyse gennem en membran, fortrinsvis en regenereret cellulosemembran.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes anvendelsen af det proteolytiske enzym 24 199 RP, fremstillet som nævnt ovenfor, i garveindustrien, hvor det kan anvendes til afhåring af animalske skind med henblik på læderfremstilling.

Fremgangsmåden til enzymatisk afhåring af animalske skind er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende del anførte.

Ved denne særlige anvendelse af enzym 24 199 RP kan det anvendes i ren tilstand, men det skal bemærkes, at tilsvarende resultater kan opnås med enzymet i delvis renset form.

Afhåring udføres helt op til vore dage ved velkendte metoder. Den mest almindeligt anvendte består i at behandle skindene ved hjælp U5827 16 af reducerende alkaliske bade eller pastaer, særligt sådanne bestående af kalk og natriumsulfid. Denne fremgangsmåde frembringer ikke en fjernelse af hårene ved at ødelægge disses bindinger med huden, men en opløsning af disse i behandlingsbadet, som skal fornys efter hver behandling. Man skal således skaffe sig af med et spildevand stærkt belastet med svovl og organiske stoffer, hvis kemiske og biologiske iltbehov (COD og BI) er betydelige. Op til vore dage er dette spildevand blevet udledt til det bestående kloaksystem, hvorved det førte til en meget stor forurening af floder, strømme o.s.v. Naturligvis er omfattende rensningsprocesser i stand til at nedsætte BI og COD; men installation og drift heraf er meget kostbar og gør denne løsning lihensigtsmæssig. En af de vigtigste fordele ved den foreliggende opfindelse er en formindskelse til ca. halvdelen af den forurening, der stammer fra den klassiske afhåring. Afhåring af skind ved hjælp af enzymer, som angriber den del af overhuden, som binder håret til huden, muliggør genvinding af dette hår ved simpel filtrering af badet uden forurening til følge.

En anden fordel ved afhåringen ifølge opfindelsen i forhold til kendte fremgangsmåder til enzymatisk afhåring er, at den tillader at genvinde hårene intakt uden forringelse af huderne. Den enzymatiske afhåring, som den nuomstunder udføres, fører til en betydelig nedbrydning af overhuden og endda af selve læderhuden i de behandlede skind, hvilket resulterer i huder af dårlig kvalitet. Dette er i hovedsagen grundet den kendsgerning, at fagmanden indtil nu ikke har rådet over et enzym, hvis virkning var specifikt rettet mod bindingen hår-hud. Under disse omstændigheder reagerer enzymet lige så vel med proteinerne i de dybere lag, således at den resulterende hud efter slutbehandlingen fremstår med narven beskadiget, året og med gruber.

Denne fordel er af speciel interesse, når det drejer sig om afhåring af får eskind.

Sammenlignet med den klassiske afhåringsfremgangsmåde ved svedning af fåreskind tillader den enzymatiske afhåring ifølge opfindelsen nemlig opnåelse af såvel intakt hud som intakt uld.

Efter en almindelig udførelsesform består den enzymatiske afhåring ifølge opfindelsen, når man behandler oksehuder, i at bringe huden 145827 17 i kontakt med enzymet i en afhåringsbeholder, i hvilken procentandelen af vand i forhold til huden befinder sig mellem 10 og 45 volumenprocent, fortrinsvis mellem 20 og 25 %. Behandlingen varer fra 3 til 24 timer, badets temperatur bør fortrinsvis være mellem 24 og 30° C, og badets pH bør svare til enzymets maximale proteoly-tiske aktivitet, d.v.s. befinde sig mellem ca. 7 og 8,5, idet pH fra begyndelsen holdes konstant under behandlingen ved anvendelsen af en pufferopløsning, normalt bestående af trinatriumphosphat eller borax. Man kan iøvrigt betragte 0,3-1 vægtandel enzym pr. 100 vægtdele huder som en størrelsesforholdsskala inden for hvilken effektivitetsbetingelserne og omkostningerne er gunstigst.

Ved behandlingen af skind går man i praksis i almindelighed frem enten ved nedsænkning i en opløsning indeholdende mellem 10 og 30 g/l enzym 24 199 RP, hvis styrke er ca. 290 UK/g, eller ved påføring med sprøjtepistol af en opløsning indenoldende mellem 1 og 10 g/l enzym 24 199 RP, hvis styrke er ca. 290 υκ/g, når det drejer sig om fåreskind.

Både ved oksehuder og fåreskind er det anvendte enzym*s aktivitet ved optimum, når koncentration og styrke befinder sig inden for de ovenanførte rammer.

Afhåringsbeholderen kan være en tank eller en valkemaskine, som den anvendes ved den kendte teknik. Den kan med fordel udstyres med et omrøringsorgan til intermitterende drift, som fremmer reagensets fordeling på skindene. Omrøringshastigheder på ca. 3/4 o/min. har ført til særligt gode resultater.

For at fjernelsen af hårene fra skindet kan blive fuldstændig, bør enzymindvirkningen almindeligvis ledsages af eller efterfølges af en mekanisk ruskning af hårene udført med et hvilkensomhelst bekvemt udstyr. Det kan helt enkelt bestå i hudernes gensidige gnidning mod hverandre under omrøringen ved behandlingen, eventuelt udbygget med en afhåring tilvejebragt i løbet af en kort tids mere intensiv omrøring. Det kan ligeledes bestå i at føre de ved fremgangsmåden i henhold til opfindelsen behandlede huder gennem en hårmaskine, som tillader opsamling af hårene i intakt og ikke filtret stand.

U5827 18

Afhåringen ifølge opfindelsen kan følge efter og/eller blive efterfulgt af et stort antal supplerende behandlinger. Vaskning af skindene før afhåringen er ønskværdig. Den kan bestå i en vandvask i valkemaskine eller haspel med det hovedformål at befri skindene for det salt, hvormed de er imprægneret af opbevaringshensyn, Vaskningen kan efterfølges af en affedtning ved hjælp af klassiske aromatiske eller chlorerede opløsningsmidler eller af detergenter i vandig opløsning. Denne behandling tillader elimineringen af et stort antal organiske ( såsom fedtstoffer) og uorganiske urenheder, som tilsmudser skindet og blokerer hårsækkene. Affedtningen kan med fordel følges af en ny vandvask, hvorved opnås et skind, der er såvidt som muligt fri for urenheder og rensemidler.

Efter disse forberedende behandlinger af skindene kan det være nyttigt at udføre en forgarvning, som styrker beskyttelsen af hudlaget mod enzymernes dybdevirkning. Denne forgarvning bør være meget svag for ikke at fiksere hårene. Mono- eller dialdehyder som f.eks. formalin er særligt egnede.

Efter at skindene er afhåret, vaskes de og drypper af. Vaskevandet indeholder de intakte hår samt enzymet, og disse kan adskilles ved enhver kendt metode såsom dekantering eller filtrering.

Normalt bliver skindene så anbragt i en kalkkule med rent kalk, som hydrolyserer dem. Dette kalkbad kan genanvendes flere gange, fordi de deri anbragte skind er næsten rene og kun tilsmudser det ganske lidt.

Efter kalkgrubebehandlingen ser man, at skindenes narv ikke er beskadiget og hæfter fint til læderhuden, mens et skind, der er blevet afhåret med kendte enzymer, såsom "Rapidelase No. 7" ^markedsført af firmaet "Société-Rapidase", frembyder en beskadiget narv, der føles gelatineagtig, som er stedvis løsnet fra læderhuden, og som i sig selv er angrebet.

De ved den egentlige afhåring dannede forurenende affaldsprodukter er væsentligt reducerede i omfang. Dette gælder ganske særligt for svovlforbindelser og opløste hår, som man ikke finder spor af i vaskevandet, mens de forefindes i rigt mål i resterne stammende fra afhåring gennemført ved opløsning af hårene. Derudover bliver enzymet, som let lader sig genvinde ved filtrering, ikke bortledt 145827 19 med spildevandet. . . :

Efter behandlingen af skindene ved afhåringen ifølge opfindelsen kan man gennemføre alle de klassiske garveribehandlinger såsom f*eks. afkalkning, bejdsning, chromgarvning, savning og spaltning, gengarvning, berigelse, tørring, glitning og afpudsning.

Det således fremstillede læder udviser en meget fin narv af bedre kvalitet end den med svovlkalk opnåede, ingen åredannelse, og særdeles god vedhæftning af narven, selv på stykker stammende fra dyrets flanke.

I det følgende anføres en sammenlignende tabel over de resultater, der er opnået ved afhåring af oksehuder ved de følgende 3 fremgangsmåder: - A) Afhåring ifølge opfindelsen: anvendelse af enzym 24 199 RP i overensstemmelse med nedenfor anførte eksempel 4 - B) Afhåring under anvendelse af kendte enzymer, illustreret ved "Rapidelase No. 7"® - C) Afhåring ved opløsning af hårene i et bad indeholdende kalk og natriumsulfid (svovlkalk).

145827 20

CAB

Afhåring med Fremgangsmåde Afhåring med svovlkalk ifølge opfin- "Rapidalase delsen enzym No. 7"© _24 199 RP_

Narvegenskaber: - hårsække rene meget rene kun lidt rene - overflade afskåret afrundet meget afskåret

Greb smidig lidt fast lidt fast

Smidighed god god god

Opkradsningsmodstand på sidestykkerne ringe god middel

Vedhæftning af narven dårlig på meget god dårlig på sidestykkerne overalt sidestykkerne

Trækbrudstyrke i kg/mm^ 1,4 1,5 1,5

Brudforlsngelse % 59 65 66

Trykbøjning til revnedannelse i mm 7,2 7,4 7,5

Trykbøjning til revnedannelse målt på et Lastometer kendetegner et skinds evne til at tåle foldninger i spændt tilstand.

Følgende eksempler illustrerer de forskellige aspekter af opfindelsen. Enzymprodukternes aktivitet er angivet i Kunitz enheder (U.K.) som ovenfor defineret. Aktiviteten er udtrykt i UK/cm , når det drejer sig om et produkt i opløsning, og i UK/g, når det drejer sig om et fast stof.

EKSEMPEL 1 - Fermentering I en fermenteringsbeholder på 170 1 tilsættes: pepton 1 200 g gærekstrakt 600 g agar 240 g vand op til 105 1 21 145827

Mediets pH er 6,55. Der steriliseres ved gennembobling af 122° C varm-damp i 40 minutter. Efter nedkøling er bouillonens volumen 115 1 grundet kondensatdannelse under sterilisationen. Der fyldes efter til 120 1 ved tilsætning af 5 1 steril vandig opløsning indeholdende 1200 g glucosemonohydrat.

Mediets pH er 6,80. Der podes nu med 200 cm Streptomyces Caligosus DS 14 486 kultur som er dyrket under omrystning i Erlenmeyer-kolber, som ovenfor beskrevet. Kulturen udvikles ved 27 C i 23 timer under rystning og luftning med steril luft. Den er sa klar til podning på produktionskulturen.

Produktionskulturen dannes i en fermenteringsbeholder på 800 1, hvortil er sat følgende ingredienser: "distiller's solubles" (bærme) 16 kg saccharose 6 kg sojaolie 4 1 manganosulfat 0,08 kg vand 370 1 pH justeres til 7,30 ved tilsætning af 850 cm 10 N NaOH, derpå steriliseres substratet ved gennembobling af 122 °C' varm damp i 40 minutter. Efter nedkøling er bouillonens volumen 400 1 grundet kondensatdannelse under sterilisationen, og pH er 6,60.

Man poder derpå med 40 1 podekultur fra fermenteringsbeholderen på 170 1 som ovenfor beskrevet. Kulturen udvikles ved 27°C i 94 timer under omrøring ved hjælp af en omrører, der drejer 205 °/m, og ved at belufte med 20 m^/h steril luft. Kulturens pH er nu 7,30, og urtens volumen er 400 1. Den proteolytiske aktivitet i urten ved pH 7 og ved 37° C er på 3,7 UK/cm3.

EKSEMPEL 2 - Ekstraktion

Man filtrerer 11 1 urt som fremstillet i eksempel 1, derpå vasker man filterkagen med 4 1 destilleret vand. Filtratet og vaskevandet forenes og inddampes til 2 1 under vacuum ( 5 mm Hg) uden at temperaturen overstiger 30 °C. Derpå tilsættes hurtigt til det til + 4 °C nedkølede koncentrat under omrøring 2,4 1 acetone forud afkølet til -10 °C.

22 145827

Man fortsætter omrøring i 2 minutter, og derpå fracentrifugeres den uopløselige rest, der er dannet, ved +4 'C og 5000 G i løbet af 10 minutter. Den uopløselige rest ekstraheres først med 450 cm^ og derpå med 150 cm^ vand ved + 4° C i 2 timer, og hver gang fracentrifugeres det uopløselige ved + 4° C og 5000 G i 10 minutter. Man opnår >i alt 800 cm vandig ekstrakt med pH mellem 7 og 7,5.

Denne ekstrakt holdes ved + 4° C, og man tilsætter under omrøring 344 g krystallinsk ammoniumsulfat. Der omrøres yderligere 15 minutter efter tilsætningen, henstand i 1 time, og derpå isoleres den uopløselige aktivsubstans ved centrifugering ved + 4° C og

O

10 000 Gi 10 minutter. Det' uopløselige opløses i 500 cm vand under omrøring i 1 time, idet man justerer pH til 7-7,5, og den derved opnåede opløsning dialyseres ved + 4° C i 17 timer mod destilleret vand.

. 3

Man opnar herved 920 cm dialyseret ekstrakt, i hvilket man hurtigt under omrøring indhælder 1,1 1 acetone nedkølet til -10° C. Det udskilte enzym fracentrifugeres ved + 4° C og 5000 G i 10 minutter, og tørres dernæst ved + 4° C under vacuum i nærvær af et afvandingsmiddel (P2O5).

Til slut får man 9,5 g enzym 24 199 RP, hvis enzymatiske aktiviteter er følgende: peptiserende aktivitet 1 470 UK/g koagulerende aktivitet 14 500 UP/g fibrinolytisk aktivitet 4 920 UL/g EKSEMPEL 3 360 1 urt fremstillet som i eksempel 1 filtreres på filterpresse under anvendelse af 25 kg filterhjælp. Til 200 1 af det resulterende filtrat tilsættes 400 1 methanol nedkølet til - 10° C. Efter nedkøling af blandingen til ca. - 10° C fracentrifugeres det opnåede bundfald i kulden og tørres under vacuum ved 35° C.

23 145827

Man opnår 229 g rå 24 199 RP med en styrke på 290 UK/g.

EKSEMPEL 4 - Anvendelse ved afhåring af oksehuder 100 kg saltede, ugarvede oksehuder afsaltes først 2 gange under omrøring i 30 minutter med 200 % rent vand (procentandelene er angivet i forhold til vægten af saltede huder), og derpå fortsætter man med udblødningen.

De afsaltede huder bevæges langsomt i 20 timer ved en temperatur på mellem 20 og 25° C i 200% rent vand tilsat 0,2 % NaOH i skælform og 0,05 % alkalisk protease S 1 200. Huderne befris derpå for kødtrævler, og man fortsætter med afhåringen.

De afskrabede huder anbringes i en time i en valkemaskine, der drejer rundt 3-4 gange i minuttet. Man tilsætter 20-25% vand og 300-400 g enzym 24 199 RP med styrken 290 UK/g. Temperaturen i valkens indre justeres til 30° C. Man bevæger på ovenfor anførte måde i 1 time og derpå med afbrydelser i 8 til 9 timer. Hårene kan derpå fjernes fuldstændigt ved skrabning med bagsiden af en kniv.

Selve afhåringen kan derpå foretages i en hvilken som helst i garveriteknikken normalt anvendt maskine.

Det således fremstillede, udblødte skind er praktisk taget helt af-håret bortset fra nogle meget korte dunhår, som er undsluppet knivens mekaniske bearbejdning.

Huderne behandles derpå på sædvanlig måde i 200% kalkbad forsynet med 3% kalk og 1,5% Na2S. Ved denne behandling har man til hensigt at opnå fuldstændigt afhårede huder, som kan underkastes garveriteknikkens senere bearbejdninger.

Kalkbadet, som er meget lidt belastet, kan recirkuleres. Huderne, som man får efter garvning, færdiggarvning og afpudsning, har et smukt udseende, en flot narv, hel og skinnende, og helt vedhæftende modsat huder, der har været normalt proteasebehandlet.

EKSEMPEL 5 - Anvendelse ved uldf.jernelse fra fåreskind 24 145827

Efter udblødning, valkning og tørring ved vridning af fåreskindene tilfører man med sprøjtepistol på kødsiden af hvert skind 150 cnr af en vandig opløsning indeholdende 5-6 g/l enzym 24 199 RP med styrken 290 UK/g puf ret til pH 8,5 med dinatriumphosphat. Skindene stables kødside mod kødside i et lukket rum, hvori den relative luftfugtighed ikke bør overstige 85 %, og hvori temperaturen bør holdes mellem 24 og 26° C. Efter 16 til 20 timer kan uldfjernelsen særdeles let udføres med de sædvanlige midler.

Den udvundne uld er af særdeles god kvalitet, ligesom det tilbageblevne skind ikke har mistet sin narv i modsætning til de skind, man får ved "svedningsprocessen". Skindet kan derpå underkastes en grubegarvning, hvorpå det bliver garvet og færdigbehandlet med de sædvanlige bearbejdningsprocesser.

Claims (6)

145827 25 Patentkrav :

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et proteolytisk enzym betegnet 24199 RP, kendetegnet ved, at man dyrker Streptomyces caligosus DS 14486, (NRRL 8195), aerobt under sædvanlige betingelser på et passende substrat indeholdende assimilerbare carbonkilder og nitrogenkilder, mineralsalte og eventuelt en vækstfaktor, og at man fraseparerer det i løbet af dyrkningen dannede enzym.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet har begyndelses-pH 5,8-7,8, fortrinsvis 6,2-7,4.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres ved en temperatur på 23-33 °C.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at dyrkningssubstratet beluftes med 0,3-3 liter luft pr. liter dyrkningsbouillon pr. minut.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at dyrkningen varer 2-8 dage.

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-5, kendetegnet ved, at enzymet isoleres ved filtrering af fermenteringsvæsken og opkoncentrering af det således opnåede filtrat til 1/5 af dets volumen og påfølgende udfældning ved tilsætning af for enzymet dårlige opløsningsmidler, fortrinsvis acetone, samt ved eventuel påfølgende rensning af det således isolerede enzym ved fraktioneret udfældning.