DE960816C - Verfahren zur Herstellung oxydierter Steroide - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung oxydierter Steroide Die Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in das Steroidmolekül. Sie bezieht sich insbesondere auf ein aerobes Gärungsverfahren, bei dem die Gärung und eine Oxydierung von Steroiden mittels Pilzen der Gattung Neurospora mindestens in fi-Stellung durchgeführt wird.
• Die Einführung von Sauerstoff in das Steroidmolekül, insbesondere in ii-Stellung, zur Erzeugung von bei der Herstellung therapeutischer Verbindungen nützlichen Zwischenprodukten oder zur Herstellung solcher Verbindungen selbst ist bekannt. Bei diesen Zwischenprodukten oder Pharmazeutika, unter denen z. B. Corticosteron, ii-Dehydrocorticosteron (Kendalls Verbindung E, Cortison) und 17-Oxycorticosteron (Kendalls Verbindung F) zu nennen sind, handelt es sich um oxydierte, insbesondere in ii-Stellung sauerstoffhaltige Verbindungen. Derartige Ergebnisse wurden bisher nur durch sehr verwickelte organische Synthesen mit einer beträchtlichen Anzahl von Verfahrensstufen erreicht.
• Es wurde nun gefunden, daß Pilze der Gattung Neurospora, z. B. Neurospora sitophila und Neurospara crassa, bei der Oxydation von Steroiden einschließlich ii-Desoxysteroiden nützlich sind, obwohl bei ihrer Verwendung nicht notwendigerweise die gleichen Ergebnisse erzielt werden wie bei Verwendung der Ordnung Mucorales.
• Es wurde gefunden, daß ii-Desöxysteroide leicht in hohen Ausbeuten in die entsprechenden oxydierten Steroide umgewandelt werden können, wenn man die Steroidverbindungen der. Einwirkung einer Fungusart der Gattung Neurospora unterwirft. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein wirksames, wirtschaftliches und kommerziell zufriedenstellendes Verfahren zur Einführung von Sauerstoff in die ii-Stellung eines ii-Desoxysteroids dar.
• Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch in anderen Stellungen als in der ii-Stellung des Steroidmoleküls durch die Wirkung des Fungus Umbildungen auftreten; diese Umbildungen sind jedoch nicht als unerwünscht zu betrachten, da die Einführung von Sauerstoff in andere Teile des Steroidmoleküls wertvolle therapeutische Produkte oder Zwischenprodukte, z. B. in i7-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltende Produkte, ergeben kann. Falls diese weiteren Gruppen nicht erwünscht sind, stehen Verfahren zur leichten Entfernung dieser Gruppen zur Verfügung: Falls in dem Molekül eines zu oxydierenden Steroids zu Ketogruppen oxydierbare Hydroxylgruppen anwesend sind, so können diese nötigenfalls, so z. B. wenn die Gewinnung außerordentlich hoher Ausbeuten an ii-Oxysteroid angestrebt wird, vor verschiedenartigstem Angriff einschließlich Angriff durch die oxydierend wirkenden Pilze durch Umwandlung, z. B. durch Veresterung, Verätherung, Halogenierung u. dgl., in eine Gruppe, die sich in eine Hydroxylgruppe zurückverwandeln läßt, geschützt werden. Ein derartiges Verfahren ist jedoch keine Voraussetzung für die Einführung von Sauerstoff, insbesondere von Sauerstoff in ii-Stellung in ein Oxysteroid nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
• Erfindungsgemäß wird eine Art des Gattung Neurospora auf einem vorzugsweise flüssigen Nährboden gezüchtet, der Kohlehydrate, Proteine, mineralische Bestandteile und, falls erwünscht, Vitamine und Auxine sowie Suspensions- oder Mycelträger enthält. Einer solchen Pilzkultur oder daraus erhältlichen, oxydierend wirkenden Enzymen wird das Desoxysteroid zugesetzt, dann wird es unter Belüftung bei den üblichen Temperaturen des Pilzwachstums i bis 72 Stunden bebrütet. Anschließend wird das oxydierte Steroid durch txtraktion aus dem Gärungsgemisch gewonnen.
• Im einzelnen kann bei dem erfindungsgemäßen V erfahren nach den im Patent 936 2o7 angegebenen Verfahrensbedingungen -gearbeitet werden.
• Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren der vorliegenden Erfindung. Beispiel Eine aus 30 g Dextrose, 2o g Getreideweichflüssigkeit, 12 g Natriumnitrat, 12 g Natüumacetat und i g K H2 P 04 bestehende Kulturflüssigkeit, die mit Leitungswasser auf 11 verdünnt worden war, wurde auf einen pH-Wert von 7 gestellt. Nach der Sterilisation betrug der p,1-Wert 6,7. 121 dieser Kulturflüssigkeit wurden auf einer Temperatur von 25° gehalten und mit Neur-)spora* sitophila (ATCC 9278) geimpft. Die Belüftung wurde auf 11 pro Minute und das Rühren auf Zoo Umdrehungen pro Minute eingestellt. Nach 24stündigem Wachstum wurden 3 g in 150 ccm Aceton gelösten Progesterons (Verbindung I) zugesetzt und die Gärung 48 Stunden durchgeführt. Das Mycel wurde aus der Brühe mittels Abpressen durch Gaze vollständig entfernt. Das abgetrennte Mycel wurde zweimal mit je einem dem Volumen des Mycels annähernd gleichen Volumen Aceton extrahiert und abermals zweimal mit je einem dem Volumen des Mycels annähernd gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridextrakte einschließlich Lösungsmittel wurden dem Brühenfiltrat zugesetzt. Das Gemisch aus Extrakten und Brühenfiltrat wurde dann viermal mit je 31 Methylenchlorid extrahiert. Der vereinigte Methylenchloridextrakt wurde zweimal mit je einem zehntel Volumen einer 2°[oigen wäßrigen Lösung von Natriumbicarbonat und danach zweimal mit je einem ze'?ntel Volumen Wasser gewaschen. Der Methylencbloridextrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann auf einem Dampfbad auf ein kleines Volumen konzentriert.
• Der lösungsmittelfreie, konzentrierte Extrakt wog 4,796 g. Dieser Rückstand wurde in 300 ccm Benzol gelöst und unter Verwendung von Mengen von je 300 ccm der in Tafel I aufgeführten entwickelnden Lösungsmittel über 150 g Tonerde (mit Salzsäure sowie mit Wasser gewaschen und 4 Stunden bei 12o° getrocknet) chromatographisch getrennt. Unter Verwendung eines Toluol-Propylenglykol-Systems und eines Methylcyclohexancarbitolsystems wurde durch papierchromatographische Analyse die Anwesenheit neuer Steroide nachgewiesen. Fraktion 12 wurde in 3 ccm Methylenchlorid gelöst, filtriert und auf einem Dampfbad auf 0,5 ccm konzentriert.

  Tabelle I

  Chromatographische Analyse

  Fraktion Lösungsmittel Feststoff-

  eluate in mg

  1 Benzol 105

  2 desgl. 64

  3 Benzol-Äther 2o: 1 56 .

  4 desgl. 159

  5 Benzol-Äther io : x 83

  6 desgl. 26

  7 . Benzol-Äther i : 1 33

  8 desgl. 129

  9 Äther 381

  io desgl. 193

  11 Äther-Chloroform 2o : 1 398

  12 desgl. 517

  13 Äther-Chloroform io : 1 791

  14 desgl. 444

  15 Äther-Chloroform i : 1 169

  16 desgl. 28

  17 desgl. 22

  18 desgl. i9

  i9 Chloroform 10

  20 desgl. 48

  21 desgl. 48

  22 -desgl. 32

  23 Chloroform-Aceton 2o: r 50

  24 Aceton 257

  25 Methanol 254

  26 desgl. 14

  Nach Zusatz von 5 ccm Äther zum Konzentrat wurden Kristalle ausgefällt, die filtriert und dreimal mit je 2 ccm Äther unter Zurücklassung von 203 mg Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 155 bis i73° gewaschen wurden. Durch Umkristallisation aus Methylenchlorid mit Äther wurde eine Ausbeute an i2o mg Kristallen der Verbindung II, einem Oxyprogesteron, erzielt, das einen Schmelzpunkt von 165 bis i72° hatte.
• Die Verbindung II läßt sich mit Cr 03 in Eisessig zu einer Verbindung III oxydieren, aus der durch umkristallisieren aus Äthylacetat-Petroläther eine kristalline Verbindung IV vom Schmelzpunkt von i68 bis i76° erhalten wurde. Wie durch Infrarotspektren nachgewiesen wurde, hat diese Verbindung, im Vergleich zu Progesteron, eine Hydroxylgruppe sowie eine zusätzliche nicht konjugierte Ketogruppe behalten.
• Durch Acetyherung der Verbindung II erhält man nach dem Umkristallisieren aus Aceton-Äther eine Verbindung VI vom Schmelzpunkt 188 bis 2o5°. Durch Infrarotspektren wurde die Veresterung bestätigt.
• Die Verbindungen II, IV und VI wiesen Progesteron-Wirksamkeit auf. Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren können z. B. auch 17a, 2i-Dioxyprogesteron, Pregnan-3, 2o-dion, 4-Pregnen-2i-o1-3, 2o-dion, i6-Dehydroprogesteron und 17a-Oxyprogesteron, in die entsprechenden oxydierten Steroide übergeführt werden.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung oxydierter Steroide durch Bebrütung von Desoxysteroiden mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen im Kohlenstoff-Kohlenstoff-Gerüst mit der Kultur eines oxydierend wirkenden Pilzes oder den daraus erhältlichen oxydierend. wirkenden Enzymen unter aeroben Bedingungen und gegebenenfalls Abtrennung der erhaltenen oxydierten Steroide, dadurch gekennzeichnet, daß man als oxydierend wirkenden Pilz einen solchen der Gattung Neurospora verwendet. .
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man ein 3-Ketosteroid, insbesondere Progesteron, als Ausgangsverbindung verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Neurospora sitophila als oxydierend wirkenden Pilz verwendet.