DE944248C

DE944248C - Verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-11, 17ª‡, 21-triol-3, 20-dions bzw. von 21-Estern des 4-Pregnen-17ª‡, 21-diol-3, 11, 20-trions

Info

Publication number: DE944248C
Application number: DEU1740A
Authority: DE
Inventors: Herbert Charles Murray; Durey Harold Peterson
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1952-02-23
Filing date: 1952-07-09
Publication date: 1956-06-14
Also published as: DE937228C; DE954153C

Description

Verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-11, 17a, 21-triol-3, 20-dions bzw. von 21-Estern des 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trions Die Erfindung bezieht sich auf ein verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3,11, 2o-trions durch Acylierung eines durch biologische Oxydation von 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2o-dion mit einer Pilzart der Ordnung Mucorales, z. B. aus der Familie der Mucoraceae, wie der Gattung Rhizopus oder der Gattung Cunninghamella, z. B. den Arten Rhizopus nigricans, Rhizopus arrhizus oder Cunninghamella blakesleeana hergestellten 4-Pregnen-ii, i7a,-2i-triol-3, 2o-dions in bekannter Weise mit einem Acylierungsmittel bzw. die im Anschluß daran durch-

geführte Oxydation des erhaltenen 4-Pregnen-ii, i7a,-

2i-triol-3, 2o dion-2i-acylates mit Chromsäure in

ebenfalls.bekannter Weise.

Die nach dem erfindungsgemäßen verfahren er-

haltenen neuen Ester des 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-

3, 2o-dions, nämlich die 4-Pregnen-1ia, i7a, 21-triol-

3, 2o-dion-2i acylate, die 4-Pregnen-iia, 17a, 21-triol-

3, 2o-dion-ii, 2i-diacylateunddie4-Pregnen-iiß, 17a,

21-triol-3, 2o-dion-2i-acylate, sind leicht zu reinigende

Abkömmlinge der entsprechenden Trioxysteroide; sie

sind für die Synthese des Cortisons von Nutzen. Die

Mono- und Di-Ester des 4-Pregnen-iia, z7a, 2i-triol-3, 2o-dions sind auch für sich pharmakologisch wirksam.

Die für -das erfindungsgemäße Verfahren angewandte Ausgangsverbindung wurde durch mikrobiologische Oxydation von 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2odion mit einem Sauerstoff übertragenen Pilz der Ordnung Mucorales oder der daraus gewonnenen Sauerstoff übertragenden Enzyme hergestellt, Das so erhaltene 4-Pregnen-ii, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion wird sodann als rohes Gärungsprodukt, das frei ist von Verunreinigungen aus der wäßrigen Phase, ohne vorhergehende Reinigung oder .in gereinigter Form mit einem Acylierungsmittel, wie Keten, einem Keten einer Säure, einer Säure, einem Säurechlorid, einem Säureanhydrid oder einem andern bekannten Acylierungsmittel, zweckmäßig in einem Lösungsmittel wie Benzol, Toluol, Pyridin oder Äther bei Temperaturen zwischen o° und dem Siedepunkt der Lösung, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in bekannter Weise innerhalb einer halben bis ioo Stunden umgesetzt. Sowohl die Reaktionszeit als auch die Reaktionstemperatur, das Acylierungsmittel und das Verhältnis der Reaktionspartner können verändert werden. Das Reaktionsgemisch wird anschließend abgekühlt oder durch Vermischen mit Eis oder kaltem Wasser verdünnt, das Produkt in einem geeigneten Lösungsmittel aufgenommen, anschließend mehrmals mit schwach alkalischen Lösungen und Wasser gewaschen, bis die Lösung des Acylierungsproduktes neutral reagiert. Nach dem Trocknen dieser Lösung kann das acylierte 4-Pregnen i1, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion durch Verdampfen des Lösungsmittels abgetrennt werden. Der- Rückstand wird entweder direkt zum 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, =1, 2o-triOn-2i-acylat oxydiert 'oder zunächst nach üblichen Methoden, z. B. durch Umkristallisieren oder Chromatographieren, gereinigt.
Nach dem vorstehend beschriebenen Acylierungsverfahren erhält man sowohl die Mono- als auch Di-Ester in einem Mengenverhältnis, das vom Verhältnis des Acylierungsmittels zum 4-Pregnen-ii, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion abhängig ist. Bei Verwendung von etwa i Mol Acylierungsmittel auf i Mof des Ausgangssteroids entsteht vorwiegend das monoacylierte Produkt, hingegen besteht größere Neigung zur Bildung des diacylierten Produktes, wenn auf i Mol Steroid 2 oder mehr Mole Acylierungsmittel verwendet werden.
Unter den Estern, welche auf diese Weise hergestellt werden-können, werden besonders genannt das 4-Pregnen-iia, 17a, 2=-triol-3, 2o-dion-2i-propionat und das entsprechende =i a, 2i-dipropionat, das 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-propionat, das 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-trimethylacetat und das entsprechende na, 2i-ditrimethylacetat, das 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-ß-cyclopentylpröpionat und das entsprechende ==a, 2i-di-ß-cyclopentylpropionat, das 4-Pregneniia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-benzoat bzw. das entsprechende iia,.2i-dibenzoat. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren - herstellbaren 4-Pregnen-=ia, =7a, 2i triol-3, 2o-dion-2i-acylate bzw. die entsprechenden ==a, 2i-diacylate und die 4-PregnenxIß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acylate enthahzn in der Acylgruppe die Reste von Säuren mit = bis einschließlich 8 Kohlenstoffatomen, die zu den gesättigten oder ungesättigten aliphatischen, carbocyclischen, cycloaliphatischen Carbonsäuren sowie zu den Aryl-, Aralkyl-, MoGo-, Di- oder Polycaxbonsäuren gehören können. Die Estergruppen- enthalten außer den vorstehend genannten Resten beispielsweise Formyloxy-, Acetoxy-, Dimethylacetoxy-, But:iyryloxy-, Valeryloxy-, Hexanoyloxy-, Heptanoyloxy-, Octanoyloxy-, Phenylacetoxy-, Toluoyloxy-, Naphtoyloxy-, Cyclopentylformyloxy-, Acryloxy-, Cyclohexylformoxyreste; ebenso sind nach dem erfindungsgemäßen Verfahren z. B. die Mono- und -Diester der Malon-, Malein-, Bernstein-, Glutar- und Adipinsäure herstellbar. Die vorstehend genannten Säurereste können auch unter den Reaktionsbedingungen inerte Substituenten, wie Mono- öder Polyhalogen-, Chlor-, Brom-, Oxy- oder Methoxygruppen enthalten.
Zur Herstellung eines gemischten Esters mit zwei verschiedenen Acylgruppen z. B. des 4-Pregneniia, =7a, 2i-triol-3, 2o-dion-iia-propionat-2i-ß-cyclopensylpropionats kann man das 4 Pregnen-iia, =7a, 2z-triol-3, 2o-dion mit einem Acylierungsmittel teilweise verestern und den- entstandenen Monoester mit einem Acylierungsmittel, das eine andere Acylgruppe einführt, weiterbehandeln.
Die q.-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acylate oder 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2iacylate werden als Rohprodukt -oder in gereinigter Form mit Chromtrioxyd in essigsaurer Lösung zu den entsprechenden 2i-Estern des 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, i=, 2o-trions (Cortison) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren oxydiert; dabei - bleiben die jeweiligen 2i-ständigen Acyloxygruppen unverändert.
Für die Herstellung des Ausgangsstoffes wird im Rahmen vorliegender Erfindung Schutz nicht begehrt. Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel i 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion Es wurde eine Nährlösung hergestellt, die auf = 1 Wasser 2o g enzymatischen Auszug von Lactalbumin (bekanutunterdemHandelsnamennEdamine("), 3 g Maisquellwasser und 50 g technische Dextrose enthielt und deren p11-Wert auf 4,3 bis 4,5 eingestellt wurde. 4 1 dieser sterilisierten Lösung wurden mit Rhizopus nigricans geimpft, 24 Stunden bei einer Temperatur von 28° bebrütet und durch Rühren und Belüftung die Sauerstoffaufnahme auf eine Geschwindigkeit eingestellt, die entsprechend der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 5o4) 6,3 bis 7 Millimol Nag S03 je Liter und Stunde entsprach. Zu dieser Kulturlösung, die eine 24 Stunden alte Kultur von Rhizopus nigricans enthielt, wurden 2 g 4-Pregnen-i7 a, 2i-diol-3, 2o-dion (Reichsteins Verbindung S) in 5o ccm Aceton suspendiert. Nach weiterer 96stündiger Bebrütung unter denselben Temperatur- und Belüftungsverhältnissen wurden die Würze und das Mycel extrahiert. Das Mycel wurde zweimal filtriert, und zwar jedesmal mit etwa dem gleichen Volumen Aceton, gewaschen und sodann zweimal, und zwar jedesmal mit dem gleichen Volumen Methylenchlorid, extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridauszüge sowie das Lösungsmittel wurden mit dem Würzefiltrat vereinigt. Die vereinigten Auszüge des Würzefiltrates wurden nacheinander zweimal mit 0,5 Volumteilen Methylenchlorid und dann zweimal mit 0,2,5 Volumteilen Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylencnloridextrakte wurden zweimal mit o,i Volumteilen 2%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und auf die gleiche Weise mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Methylenchlorids mit ungefähr 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter Lösung und Filtrieren wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der halbkristalline Rückstand wog 4,988 gg und wurde viermal mit je 6 ccm eiskaltem Methylenchlorid verrieben. Als Rückstand wurden. 630 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von T94 bis 199° erhalten. Durch Umkristallisieren dieses Rückstandes aus einem Gemisch von 3 ccm Methanol und io ccm Äther erhielt man 4o4 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 2o5 bis 21o°. Zweimaliges Umkristallisieren aus demselben Lösungsmittelgemisch ergab 132 g 4-Pregneniia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion mit einem konstanten Schmelzpunkt von 2o9 bis 212° bzw. 217 bis 2i9°, der von der Kristallform abhängig ist; (1,568 in Methanol). Analyse Berechnet als C21 H3003:. C 69,58 0/0, H 8,35 %; gefunden: C 69,26%, H 8,34%. 4-Pregnen-iia, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acetat und -ii, 2i-diacetat Zu einer Lösung aus 500 mg 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-trio1-3, 2o-dion in 4 ccm Pyridin wurden 155 mg Essigsäureanhydrid tropfenweise zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, anschließend mit 70 ccm eiskaltem Wasser verdünnt und sodann zweimal mit je 50 ccm und zweimal mit je 25 ccm 12eth3#lencltlorid extrahiert. Der Extrakt wurde zweimal mit je 25 ccm 5%iger Salzsäure, dann mit 25 ccm io%iger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit Wasser neutral gewaschen. Der Auszug wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der ölige Rückstand wurde in 125 ccm Äthylendichlorid gelöst und an 8 g synthetischem Magnesiumsilikat (bekannt unter dem Handelsnamen @,Florisil«) chromatographiert. Die Entwicklungsflüssigkeiten kamen in folgender Reihenfolge zur Verwendung: i. und 2. Äthylendichlorid, 3. bis 5. Äthylendichlorid-Aceton, Volumverhältris 25: 1, 6. und 7. Äthylendichlorid-Aceton 15: 1, B. bis ii. Äthylendichlorid-Aceton 12: 1, 12. bis 14. Äthylendichlorid-Aceton io : 1, 15. bis 18. Äthylendichlorid-Aceton 8 : 1, i9. und 2o. Äthylendichlorid-Aceton 5 : i, 21. bis 23. Äthylendichlorid-Aceton 2 : 1, 24. und 25. Aceton.
Die chromatographischen Fraktionen 15 bis 2o wurdle-n vereint, und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels konnten 162 mg 4-Pregnen-iia, i7a, 21- triol - 3, 2o - dion - 21- acetat erhalten werden. F. = 95 bis ioo°; in CHC13 wurden-Absorptionsmaxima bei 2, = 1734, 1718, 1698, 1656 cm-' beobachtet.
Die Extrakte der. Fraktionen 8 bis ii nach der vorstehend beschriebenen chromatographischen Entwicklung wurden durch Verdampfen vom Lösungsmittel befreit, vereinigt und aus Aceton unter tropfenweiser Zugabe von Petroläther umkristallisiert. Nach dreimaligem Umkristailisieren wurden 35 mg 4-Pregnen-iia, 17a, 2i-tiio1-3, 2o-dion-ii, 2i-diacetat mit einem Schmelzpunkt von 198 bis 2o2° erhalten; (1,145 in Chloroform) ; für,1 240 ergab sich k = 33,33.
Analvse Berechnet nach C,Ha40a: C 67,240/0, H 7,670/0; gefunden: C 67,43%, H 7,94% 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion-2i-acetat (Cortisonacetat) 162 mg des vorstehend erhaltenen 4-Pregneni i a, 17a, 21- triol - 3, 2o - dion - 2i - acetats wurden in io ccm Eisessig gelöst und durch tropfenweise Zugabe einer Lösung von 30 mg Chromtrioxyd (Cr O,) in 0,5 ccm H20 und 2 ccm Essigsäure oxydiert. Nach 6stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde die grüne Lösung mit 2o ccm Methanol verdünnt 'und unter vermindertem Druck eingedampft. Der kristalline Rückstand wurde in 25 ccm io0/0iger Natriumbicarbonatlösung aufgeschlämmt und viermal mit je 25 ccm einer Mischung von 4 Volumteiien Äther und i Volumteil Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde dreimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Das erhaltene kristalline Oxydationsprodukt wog 166 mg. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton wurden 138,5 mg 4-Pregnen-17a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion-2i-acetat (Cortisonacetat) erhalten. Der Schmelzpunkt betrug 243 bis 245°, für A "..x = 238 ergab sich k = 36,33; (o,3657 in Chloroform).
Analyse Berechnet als C23Hao0s: C 68,61%, H 7,520/0; gefunden: C 68,520/0,H 7,610/0.

Beispiel e 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion Es wurde eine Nährlösung hergestellt, die 0,5/o Pepton, 2 0/0 Dextrose, -0,5 0/0 Sojabohnenmehl, o,5 0/0 KH2P04, 0,5% NaCl und 0,3% Hefeextrakt in Wasser gelöst enthielt. .20o ccm dieser sterilisierten Kulturflüssigkeit wurden mit Cunninghamella blakesleeana beimpft. Die Sporen werden zuerst aus einem Sporenbehälter in eine Fleischbrühe verpflanzt, und diese wurde sodann 24 bis 72 Stunden unter aeroben Bedingungen auf einer Schüttelmaschine bis zum Beginn vegetativen Wachstums bebrütet. Anschließend wurde die Kultur 48 Stunden bei 24° bebrütet, danach mit 66 mg 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2o-dion (Reichsteins Verbindung S; ii-Desoxyi 7-Oxycorticosteron) in möglichst wenig Äthanol gelöst, versetzt und die Bebrütung'weitere 7 Stunden bei 24° fortgesetzt. Die das Steroid enthaltende Würze wurde mit 8oo ccm Aceton verdünnt, eine Stunde auf der Schüttelmaschine geschüttelt und filtriert. Der Filterkuchen wurde in 500 ccm Aceton aufgeschlämmt, eine weitere Stunde geschüttelt und nochmals filtriert. Aus den vereinigten Filtraten wurde das Aceton unter vermindertem Druck bis 50° eingeengt. Wenn notwendig, wurde dann soviel Acetoxi zugegeben, daß eine 2o°/oige wäßrige Acetonlösung entstand, die anschließend fünfmal mit- je 1/3 Völurnteil Petroläther (bekannt unter dem Handelsnamen »Skellysolve B«) zwecks Entfernung fettiger Bestandteile extrahiert wurde. Diese Extrakte wurden zweimal mit j@ %o Volumteil 2o°/oigem wäßrigem Aceton ausgewaschen und die Waschflüssigkeiten mit dem Aceton-Hauptextrakt vereint. Diese vereinten Extrakte wurden sechsmal mit 1/4 Volumteil Äthylendichlorid extrahiert, wobei nach dem Verdampfen des Äthylendichlorids im Vakuum das Steroid als Rückstand erhalten wurde. Dieser Rückstand wurde in möglichst wenig Methylenchlorid aufgenommen und auf eine Kolonne gegeben, die mit 30 g Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagela) beschickt war, das vorher mit 21 ccm Äthylenglykol verrieben wurde. Anschließend wurden verschiedene mit Äthylenglykol gesättigte Entwicklungsmischungen durch die Kollone geschickt. Die Säule wurde am automatischen Schneidgerät für chromatographische Fraktionen nach Maßgabe der Verringerung der Lichtabsorption bei 2,40 mA, gemäß nachstehender Tabelle in Bänder zerschnitten.

Am automatischen Schneidgerät erhaltene chromatographische Fraktionen

Röhren Nr. Rohe

# Band Lösungsmittel (6o ccm) Feststoffe

"

in mg

i Cyclohexan . . . . .. . . . . . . .. . . . . ... . . . . . . . . . . . . x bis 4 11,0

2 Cycrohexan-Methylenchlorid 3 : _ . . . . . . . . . . . . . . . . 5 bis 13 6,4

.3-- Cyclohexan-Methylenchlorid i : _ . . . . . . . . . . . . . . . . 14 bis 16 - 3,0

4 Cyclohexan-Meihylenchlorid 2 : 3 : . . . . . . . . . . . . . . . z7 bis 23 ö,o

Cyclöhexan-Methylenchlorid i : 4 . . . . . . . . . . . . . . . . 24 bis 38 z2,2

6 Methylenchiorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 bis 59 4,8

Eine Menge von 7,7 mg aus Band 5 wurde in möglichst wenig Acetoxi aufgenommen und abgekühlt; bis sich Kristalle abschieden. Diese kalte Acetonmischung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette abgezogen. Auf die abgeschiedenen Kristalle wurden wenige Tropfen eiskalter Äther-Aceton-Mischung 3 : z zugefügt, geschüttelt, wieder zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgehebert. Diese Äther-Aceton-Waschung wurde- wiederholt. Die erhaltenen Kristalle wurden im Vakuum getrocknet; sie bestanden aus 3,3 mg reinem 4-Pregnen-. 11ß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion (KeAdallsVerbindung F; i7-Oxycorticosteron). Es werden nach vorstehend. beschriebenem Verfahren gleichzeitig erhebliche Mengen an 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, ii, 2o-trion (Kendalls Verbindung E; ir-Dehydro-i7-OXycorticosteron, Cortison) erhalten.

4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 2o-trion-21-acetat (Cortisonacetät) Eine Lösung aus 500 mg 4-Pregnen-iiß, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion in 5 ccm Pyridm wurde tropfenweise mit 150 mg Essigsäureanhydrid versetzt. Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 75 ccm eiskalten! Wasser 'verdünnt und dann zweimal mit je 50 ccm kaltem Äther und zweimal mit j e 25 ccm Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden zweimal mit j e ,25 ccm kalter 5 %iger Salzsäure, dann mit 25 ccm 2%iger Natrium- bicarbonatlösung und schließlich mit Wasser neutral gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Durch Umkristallisieren aus Aceton unter tropfenweiser Zugabe von Petroläther wurde das 4-Pregnen-iiß, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acetat erhalten, F. = 215 bis 223°; bis 166°; Absorptionsbanden bei A, mag = 24o bis 242 mu.
Durch Oxydation mit Chromsäure, wie im-Beispiel i beschrieben, wird das 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 11, 2o-trion-2i-acetat mit den dort genannten Kennzahlen erhalten.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung von Estern des 4-Pregnen-ii, i7q, 2i-triol-3, 2o-dions bzw. von 2i-Esterndes4-Pregnen-i7a, 2i-diäl-3, ii, 2o-trions, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch biologische Oxydation von 4-Pregnen-i7a,.,2i-diol-3, 2o-dion mit einer Pilzart der Ordnung Mucorales, insbesondere aus der Familie der Mucöraceae, insbesondere der Gattung Rhizopus. oder Gattung Cunninghamella hergestellte 4-Pregnenzi, i7a, 2i-triol-3, 2o-dion in bekannter Weise mit einem -Acylieruugsmittel verestert bzw. im Anschluß daran das gebildete 4-Pregnen-ii, i7a, 21-triol-3, 2o-dion-2i-acylat mit Chromsäure oxydiert.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man das 4-Pregnen-ii, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion-2i-acylat abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung mit einer i bis einschließlich 8 Kohlenstoffatome enthaltenden aliphatischen oder carbocyclischen Carbonsäure, einem Carbonsäurehalogenid oder einem Carbonsäureanhydrid, insbesondere Essigsäureanhydrid, Propionsäureanhydrid, ß-Cyclopentylpropionylchlorid oder Trimethylacetylchlorid, durchführt.