DE932150C

DE932150C - Verfahren zur Herstellung therapeutischer Reizstoffe

Info

Publication number: DE932150C
Application number: DEW11039A
Authority: DE
Inventors: Otto Dr Westphal
Original assignee: Wander AG
Current assignee: Wander AG
Priority date: 1952-05-21
Filing date: 1953-04-18
Publication date: 1955-08-25
Also published as: CH314792A

Description

Verfahren zur Herstellung therapeutischer Reizstoffe Es ist bekannt, daß eine Reihe somatischer Polysaccharide und Polysaccharid-Symplexe gramnegativer Bakterien starte Reizstoffe sind. Hiermit sind an der Bakterienzelle verankerte Polysaccharide gemeint. Sie sind wiederholt zur klinischen Anwendung bei der Reiztherapie vorgeschlagen worden. Es ist ferner bekannt, daß eine wesentliche Wirkung derartiger Bakterienpolysaccharide oder ihrer Symplexe darin besteht, daß sie eine Stimulierung der Hypophysen-Nebennierenrinden-Funktion hervorrufen. Injiziert man jedoch derartige Bakterienpolysaccharide oder ihre Symplexe in der Klinik zum Zwecke einer therapeutischen Nebennierenrinden-Stimulierung, so muß man im allgemeinen außer der erwünschten Wirkung eine Reihe von Nebenwirkungen in Kauf nehmen, wie das Auftreten starken Fiebers, Belastungen des Kreislaufs, erhebliche Verschiebungen im weißen Blutbild (Linksverschiebung) u. a. Am Tier läßt sich histologisch an den Nebennieren (z. B. bei Ratten) zeigen, daß nach der Injektion therapeutischer Dosen genuiner Bakterienpolysaccharide, ihrer Symplexe oder entsprechender bakterieller Vaccine das derart aktivierte Organ nach I bis 2 Tagen regelmäßig kleinere oder größere Necrosen aufweist, die nur langsam verschwinden.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, durch O-Acylierung geeigneter Bakterienpolysaccharide Stoffe zu erhalten - Acyl-polysaccharide -, welche in passender Dosierung nach intravenöser, intramuskularer oder kutaner Injektion eine kräftige Stimulierung des Hypophysen-Neben- nierenrinden-Systems bewirken, wobei Fieber-, Kreislauf- oder Leucocytenwirkungen minimal sind oder teilweise fehlen. Am Tier ergibt sich histologisch, daß auch bei therapeutischer Uberdosierung trotz starker Aktivierung keinerlei Necrosen in den Nebennieren auftreten.
Als Ausgangsmaterial zur Herstellung derartiger Acylpolysaccharide dienen vorzugsweise somatische Polysaccharide gramnegativer Bakterien. Man erhält diese durch Behandlung der Keime mit homogenen Phenol-Wasser-Mischungen in der Wärme und anschließende Kühlung und Trennung der Phasen in der wäßrigen Schicht. Der erhaltene wäßrige Rohextrakt wird durch Fraktionierung mit Alkohol gereinigt (0. Westphal u. Mitarbeiter, Zf. f. Naturf., 7b, I48 [1952]). Die so gewonnenen proteinfreien Polysaccharide werden anschließend der Acylierung unterworfen. Die Acylierung wird in an sich bekannter Weise angesetzt, z. B. mittels des Anhydrids der betreffenden organischen Säure (Acetanhydrid, Propionanhydrid u. a.), vorzugsweise mit Acetanhydrid und Pyridin mit wenig Wasser (vgl. G. G. Freeman, Biochem. J. 36, 340 [I942] ; H. P. T r e f f e rs, Science Io3, 387 [I946]) und/oder Formamid (I. F. C a r 5 0 n und W. D. Maclay, J.Am.Chem.Soc. 68, 115 [I946]).
Prinzipiell ist es auch möglich, die getrockneten Bakterien direkt zu acylieren. Aus dem Reaktionsprodukt kann die Acylpolysaccharid-Fraktion mit Hilfe von organischen Lipoidlösungsmitteln, wie Gemische von chlorierten Kohlenwasserstoffen, mit einfachen Alkoholen in Lösung gebracht werden, während die übrige bakterielle Substanz ungelöst bleibt. Aus der Lösung kann das Acylpolysaccharid in einfacher Weise isoliert werden.
Es hat sich nun überraschend gezeigt, daß die Gewinnung klinisch optimaler Präparate nicht so sehr von einem bestimmten Acylierungsgrad des Endproduktes als vielmehr von der Dauer des Kontaktes der Substanz im Acylierungsgemisch abhängt, indem außer der eigentlichen Acylierung noch eine Wirkung des Acylierungsgemisches auf das Reaktionsprodukt eintritt, wobei dieses sich nach und nach in das gewünschte Endprodukt verwandelt.
Beispielsweise ergibt die Acetylierung eines hochgereinigten Polysaccharid-Pyrogens aus Colikeimen mittels Pyridin, wenig Wasser und Essigsäureanhydrid bei stets gleichem Ansatz nach I, 5, I0, I7 und 24 Stunden Reaktionsdauer bei Zimmertemperatur fünf in Chloroform lösliche Acetylpolysaccharid-Produkte von praktisch der gleichen analytischen Zusammensetzung. Bei der Prüfung am Tier und am Menschen zeigen diese fünf Präparate indessen sehr verschiedene Wirksamkeit.
Das I-Stunden-Produkt übt auf den Menschen nahezu die gleichen Einflüsse aus wie das Ausgangspolysaccharid (das genuine Pyrogen) und zeigt schon bei der intravenösen Injektion von nur I ,ug starke, unerwünschte Nebenwirkungen (Übelkeit, Fieber, Kollapsneigung usw.). Die pyrogene Grenzdosis bei dem 5-Stunden-Produkt hat sich auf 25 bis 50,ug i. v., beim Io-Stunden-Produkt auf 50 bis I00,Ug, beim I6-Stunden-Produkt auf 300 bis 500,ug und beim 24-Stunden-Produkt auf I000 bis 1500 pg verschoben.
Die länger als 4 Stunden acetylierten Produkte zeigen bei den genannten Grenzdosen keine initiale Leucopenie und nur mäßige Leucocytosen nach 4 bis 8 Stunden, wenig oder gar kein Fieber, keine Ausschüttung von stabkernigen, wohl aber signifikante Eosinopenien. Die subjektiven Nebenwirkungen sind vergleichsweise gering. Über entsprechende Werte am gesunden Menschen orientiert Tabelle I.
Bei Patienten liegt die Dosis mitunter niedriger, z. B. bei der halben Dosis.

Tabelle I Wirkungen von Acetylpolysaccharid-Präparaten (Coli) nach intravenöser Injektion am Menschen (Mittelwerte von je drei Versuchen)

Präparat Max. Anstieg der Max. Abfall der Max. Körpertemp.

(Dauer der Dosis i. v. Leucocyten in °/0 Eosinophilen ill 0/o rektal

Acetylierung) (4-Stunden-Wert) (4-Stunden-Wert) (Spitze)

I Stunde 1 Iug g 85 Olo 76 0/, 38,2°

acetyliert (8-Stunden-Wert

215 010)

5 Stunden 50 U g - 95 Olo 62 0/0 37,8"

10 Stunden 100 µg 70 Olo 6I 01e 37,5"

17 Stunden 400 ,i g 62 0/o 8x 010 38,3 °

(8-Stunden-Wert

73 O/o)

24 Stunden I500 H g 80 0/, 82 O/o 37,4

(8-Stunden-Wert

76%)

An der Ratte zeigt das 5- bzw. Io-Stunden-Produkt mit Injektionsdosen bis zu 50 und Ioo Lrg/kg i. v. das histologische Bild einer starken Nebennierenrinden-Aktivierung ohne irgendwelche Necrosen. Während das genuine Coli-Polysaccharid schon in kleinen Dosen das Shwartzman-Sanarelli-Phänomen auslösen kann, beobachtet man das Phänomen auch nach hohen Dosen des passend acylierten Polysaccharids niemals.

Klinisch bewähren sich Präparate, welche in der beschriebenen Weise während wenigstens 5 Stunden im Acetylierungsansatz verblieben sind. Da mit der Dauer der Acylierung die klinische Grenzreizdosis der erhaltenen Präparate ziemlich rasch ansteigt, sind aus ökonomischen Gründen 5- bis I5-Stunden-Präparate zu bevorzugen. Derartige Coli-Acylpolysaccharide mit Acetylgehalten von 23 bis 27 °/o oder entsprechend acylierte Polysaccharid-Pyrogene anderer gramnegativer Bakterien können klinisch zur Behandlung aller Erkrankungen verwendet werden, die auch auf Corticalextrakte, Cortison oder ACTH (adrenocorticotropes Hormon) ansprechen, wie Asthma, Allergien, manche Rheumatiden u. a. Der Vorteil einer Therapie der Stimulierung körpereigener Hormonfunktionen gegenüber der Substitutionstherapie mit exogenen Hormonpräparaten besteht (abgesehen von den wesentlich höheren Kosten der letzteren) unter anderem darin, daß nach Absetzen der exogen zugeführten Hormone vielfach schwere Rückfälle beobachtet worden sind, während diese nach Acylpolysaccharid-Reizstoff viel seltener und dann niemals so rasch wie nach exogenen Hormonpräparaten eintreten.
Die beschriebenen Acylpolysaccharide zeigen im allgemeinen nur in sehr geringem Maße das Phänomen der Gewöhnung, das besonders für bakterielle Vaccine-Reizstoffe so typisch und klinisch unerwünscht ist. Eine Gewöhnung ist im allgemeinen nur nach der Erstinjektion deutlich; nach wenigen weiteren Injektionen können mit der gleichen Dosis im allgemeinen stets gleichbleibende klinische Reizwirkungen ausgelöst werden. Die Acylpolysaccharide lösen praktisch keine nachweisbaren präcipitierenden Antikörper aus. Sensibilisierungen sind nicht beobachtet worden. Unterbrechung der Behandlung und Wiederaufnahme nach wochen- oder monatelangen Intervallen sind unbedenklich.
Während die genuinen Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien oder die entsprechenden Vaccine bei subkutaner, intramuskulöser oder kutaner Injektion schon in Dosen von 0,5 bis 5 jug am Menschen starke, schmerzhafte lokale entzündliche Reaktionen ohne Allgemeinwirkungen verursachen, kann man von einem passenden Acylpolysaccharid, z. B. Coli- 1 o-Stunden-Produkt, bis zu 100 bis 200 Mg lokal injizieren, ohne daß entzündliche Reaktionen auftreten. Der Acylreizstoff diffundiert vielmehr langsam in die Zirkulation und ergibt dann protrahierte und flachere Wirkung kurven, welche vielfach klinisch erwünscht sind.
Daher ist die Applikationsart bei den Acylpolysacchariden nicht auf die intravenöse Injektion beschränkt, sondern kann auch auf verschiedene andere Weisen erfolgen. Bei passender Dosierung kann ein solcher Acylreizstoff auch ohne Gefahr ambulant appliziert werden. Die subjektiven Nebenwirkungen fehlen ganz oder sind (gelegentlich bei der Erstinjektion) so gering, daß eine ärztliche Überwachung des Patienten im allgemeinen nicht notwendig ist. Auch bei Überdosierung bis zur doppelten oder dreifachen pyrogenen Grenzdosis sind die unerwünschten Nebenwirkungen immer noch relativ gering, während Überdosierungen genuiner Polysaccharid-Pyrogene bekanntlich mitunter zu schweren Zwischenfällen führen können.
Die beschriebene Umwandlung eines Polysaccharid-Pyrogens in klinisch gut verträgliche Acylpolysaccharide mit selektiver Wirkung auf das Hypophysen-Nebennierenrinden-System durchAcylierung bei einer Mindestreaktionsdauer von 4 bis 5 Stunden bei Zimmertemperatur gilt allgemein für Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien und kann prinzipiell für jedes solcher Pyrogen nach dem gleichen Verfahren durchgeführt werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren dargestellten Acylpolysaccharide sind löslich in Lipoiden und Lipoidlösungsmitteln mit Ausnahme von Benzin, Benzol und Äther; sie sind dagegen schwerlöslich in Wasser. Es ist jedoch möglich, haltbare wäßrige Lösungen für Ampullen usw. herzustellen.
In hoher Verdünnung lassen sich nämlich stabile wäßrige Lösungen - speziell der Acetylpolysaccharide - erhalten, indem man zunächst das Präparat in möglichst wenig heißem Äthanol löst und die klare, noch warme Lösung rasch in viel kaltes Wasser einfließen läßt. Die sich bildende, nahezu klare Lösung kann nunmehr auf die gewünschte Endverdünnung gebracht werden, bei dem Coli-Io-Stunden-Produkt z. B. auf eine Konzentration von I00 ,ug/ccm. Derartige Lösungen sind in der Kälte und bei Zimmertemperatur jahrelang haltbar, sie flocken nicht aus und behalten ihre Aktivität unverändert.
Beispiel I Die hochgereinigten proteinfreien Polysaccharide der gramnegativen Bakterien, z. B. Coli-Polysaccharid, werden entsprechend nach den Angaben von 0. Westphal und Mitarb., Zf. f. Naturf., 7b, I48 (I952) dargestellt, indem man die Keime mit homogenen Phenol-Wasser-Mischungen in der Wärme behandelt, abkühlt und die entstandenen Phasen trennt. Der abgetrennte wäßrigeRohextrakt wird durch Fraktionierung mit Alkohol gereinigt.
1 g Polysaccharid-Pyrogen aus Colibakterien (am besten lyophil-getrocknetes Präparat) wird mit 4 ccm Wasser gut verrieben; es bildet sich eine viskose Masse, der größte Teil des Materials löst sich auf. Hinzu fügt man unter gutem Rühren mit einem Glasstab 50 ccm Pyridin. Es bildet sich eine viskoseLösung, welche nur wenig ungelöste Flocken enthält. Hierzu gibt man nach und nach, etwa im Laufe von 20 Minuten, 50 ccm Essigsäureanhydrid, wobei man durch gelegentliche Kühlung mit Eiswasser dafür sorgt, daß die Temperatur des Ansatzes nicht über 25 bis 300 C ansteigt. Nachdem kein Temperaturanstieg mehr erfolgt, läßt man über die gewünschte Reaktionszeit bei Zimmertemperatur (I8 bis 230 C) stehen, und zwar a) weitere 5 Stunden zur Darstellung des 5-Stunden-Produktes oder b), c) bzw. d) weitere I0, I7 bzw. 24 Stunden zur Darstellung des I0-, 7- bzw. 24-Stunden-Produktes.
Die Isolierung des Reaktionsproduktes erfolgt jeweils durch Zentrifugation des Ansatzes, wobei sich geringe Mengen (etwa 50 mg) ungelösten Materials niederschlagen, und Eingießen in 250 bis 300 ccm destilliertem Wasser. Ungeachtet des Auftretens von mehr oder weniger gefälltem Material wird der Ansatz gegen dest. Wasser dialysiert. Das trübe, teilweise flockige Innendialysat wird im Vakuum bei etwa 300 C auf ein Volumen von etwa 10 ccm eingeengt und anschließend lyophil-getrocknet. Man erhält jeweils I bis I,25 g Acetylpolysaccharid, das sich klar in Chloroform oder in heißem Methanol oder Äthanol löst. Das Produkt kann durch Lösen in Chloroform und fraktionierte Fällung mit trockenem Äther oder Petroläther wie folgt weitergereinigt werden: 1 g Acetylpolysaccharid wird in 20 cem Chloroform gelöst; hinzu fügt man 7 ccm Äther. Die sich bildende Fällung (25 bis 30 mg) wird abzentrifugiert und verworfen. Auf Zusatz von weiteren 21 bis 22 ccm Äther fällt das gereinigte Material nahezu vollständig aus (etwa 850 mg). Die so gewonnenen Acetylpolysaccharid-Präparate enthalten 23 bis 27 0/e Acetyl (COCH3-Gruppen).
Andere hochgereinigte, proteinfreie Polysaccharid-Pyrogene gramnegativer Bakterien, z. B. die somatischen Polysaccharid-Pyrogene der Salmonellen, Brucellen, Milchsäurebakterien u. a., dargestellt mit Hilfe des Phenol-Wasser-Verfahrens, können nach der gleichen Vorschrift in entsprechende Acetylderivate übergeführt werden. Für die Einhaltung bestimmter Acetylierungszeiten, vorzugsweise 5 bis 15 Stunden bei Zimmertemperatur, gelten hinsichtlich der klinischen Wirksamkeiten und Grenzdosen die gleichen Verhältnisse wie beim Colipolysaccharid.
Beispiel 2 I g Polysaccharid-Pyrogen~(Coli) wird in 40 ccm Formamid verrieben. Nach Zugabe von 20 ccm Pyridin entsteht eine klare Lösung. Nun fügt man nach und nach 20 ccm Essigsäureanhydrid hinzu, wobei vorübergehend Gasentwicklung beobachtet wird. Die klare Lösung wird I5 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man gießt in 300 ccm Wasser, dialysiert ungeachtet der auftretenden Fällung bis zum Verschwinden des Pyridingeruchs und engt im Vakuum auf etwa 10 ccm Volumen ein. Nach Lyophiltrocknung erhält man I,I g des Acetylpolysaccharids mit 23 bis 27 0/o Acetylgehalt als weißes, lockeres, in Chloroform lösliches Pulver.
Beispiel 3 10 g getrocknete Colibakterien, durch Abzentrifugation aus flüssigem Nährmedium (z. B. Hefe-Bouillon-Kultur), Waschen mit Wasser und Aceton und anschließendes Trocknen im Vakuum gewonnen, werden mit einem Gemisch von Chloroform-Äthanol (i : 1) mehrmals bei Zimmertemperatur extrahiert und anschließend wieder getrocknet. Das graubraune Pulver wird 5 Stunden lang mit 20 ccm Wasser gut verrührt. Dann fügt man 300 ccm Pyridin hinzu und schüttelt unter Zusatz von Glasperlen 1/2 Stunde auf der Schüttelmaschine. Nun werden unter gelegentlicher Kühlung nach und nach 300 ccm Essigsäureanhydrid hinzugefügt.
Der Ansatz wird 8 bis IO Stunden lang bei Zimmertemperatur geschüttelt. Dann wird in 2 1 eisgekühltes Wasser eingerührt, von den Glaskugeln abgegossen und die trübe, Flocken enthaltende Lösung dialysiert. Nach dem Einengen im Vakuum auf etwa 30 bis 40 ccm Volumen wird der gesamte Ansatz lyophil getrocknet. Ausbeute 9,5 g. Das so gewonnene Material wird I2 Stunden lang mit einem Gemisch von so ccm Chloroform und 120 ccm Äthanol geschüttelt. Nach Hinzufügen von weiteren 200 ccm Äthanol wird kurz auf 6c bis 700 C erwärmt und zentrifugiert. Der ungelöste Rückstand wird noch zweimal in gleicher Weise extrahiert. Es hinterbleiben 4,I5 g ungelöstes Material. Die vereinigten, schwach gelben Extrakte werden bei vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Den Rückstand nimmt man in 15 ccm Chloroform auf und entfernt wenig unlösliches Material durch Filtration oder Zentrifugation. Der Acetylpolysaccharid wird anschließend durch Äther und/oder Petroläther als grau weißes Pulver gefällt. Ausbeute: 550 bis 650 mag. Acetylgehalt: 22 bis 270/0.
Beispiel 4 I g Polysaccharid-Pyrogen (Coli) wird in 4 ccm Wasser gut verrieben. Man fügt 50 ccm Pyridin hinzu und erhält eine fast klare Lösung. Bei Zugabe von 50 cem Propionsäureanhydrid scheidet sich eine starke Fällung aus, welche sich nach weiteren 5 Minuten gelöst hat. Die Zugabe weiterer IO ccm Propionsäureanhydrid ergibt keine weitere Fällung. Der klare Ansatz bleibt IO Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird in I,51 eiskaltes Wasser eingegossen. Die ausgeschiedenen weißen Flocken werden auf einer Glasfilternutsche abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: I,I bis 1,3 g.
Propionylgehalt: 29 bis 35°/0. Das Präparat ist in den meisten organischen Lipoidlösungsmitteln leicht löslich.

Claims

PATENTANSPROCIRE: I. Verfahren zur Darstellung von Reizstoffen für Zwecke der klinischen und ambulanten Reiztherapie, dadurch gekennzeichnet, daß pyrogene Polysaccharide gramnegativer Bakterien der Acylierung unterworfen werden., 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung mit Hilfe des Anhydrids der betreffenden organischen Säure vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Ansprüchen I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung mit Acetanhydrid vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung in einem Gemisch von Pyridin mit Wasser vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung in Formamid-Pyridin vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung bei Zimmertemperatur durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung mit einer Reaktionsdauer von wenigstens 5 Stunden durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Ansprüchen I und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylierung mit einer Reaktionsdauer von 5 bis 15 Stunden durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die getrockneten und mit einem Lipoidlösungsmittel vorextrahierten Bakterien unmittelbar der Acylierung unterwirft und das gebildeteAcylpolysaccharid durch organische Lipoidlösungsmittel extrahiert und isoliert.

IO. Verfahren nach Ansprüchen I und 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Extraktion Gemische von chlorierten Kohlenwasserstoffen mit einfachen Alkoholen benutzt werden.