DE932146C

DE932146C - Verfahren zur Herstellung von stabilisierten, waessrigen Hyaluronidase-Loesungen

Info

Publication number: DE932146C
Application number: DEA18306A
Authority: DE
Inventors: Harvey Eugene Alburn; Robert Ward Whitley
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1952-12-20
Filing date: 1953-06-27
Publication date: 1955-08-25
Also published as: CH334831A

Description

Verfahren zur Herstellung von stabilisierten, wäßrigen Hyaluronidase-Lösungen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilisierten wäßrigen Hyaluronidase-Lösungen, bei denen als stabilisierender Bestandteil Äthylendiarnintetra-essigsäure- ver-,vendet wird.
Hyaluronidase ist ein eiweißartiges Enzym, das die Eigenschaft besitzt, Hyaluro-nsäure- zu hydrolysieren. Hyaluronsäu.re- ist ein Mucopo:lysaechari#d mit hohem Molekulargewicht, das einen wesentlichen Bestandteilder Grundsubstanz oder Zem#entsu,bstanz des Gewebes bildet. Ihre wäßriggen Lösunge#n besitzen e'inehohe Viskosität. Auf Grund der höhen Viskosität der wäßrigen Lösungen der Hyalu-ronsäulre und der hydrol'ytischen Wirkung der Hyaluroni,dase auf die Säure hat die Hyaluronidase eine erfolgreiche klihische Anwendung bei der Förderung der Absorption von therapeutischen Flüssigkeiten d:urch Gewebe gefunden. Ihre günstige Wirkung scheintauf !die Verminderung der Viskosität der Geweibeflüssigkeiten durch ihre hydrolytische Wi-rkung auf Hyaluronsäti-re zurückzuführen zu sein. Die infolge dieser Hydrolyse verminderte Viskosität gestattet hierbei eine raschere Diffusion der eingeführten therapeutisehen Flüssigkeit. Beispietsweise kann bei einer Anwendungsform die intravenöse, Injektion bei Verwendung der Hyaluronidase. in vielen Fällen durch subkutane Infusion ersetzt werden, was gleichzeitig Vorteile für Patient und Arzt bietet. Die Hyaluroniidase kann auch mit Vorteil bei, der Lokalanästhesie. verwendet werden. AußeTdem sind noch andere Verwendungszwecke be-kannt.
Bisher war Hyaluronidase in fester Form im Handel, und zwar als Pul'v#,ii'n verschlossenen Ampullen, das Lactase als inerten TTäger zur Erleichterung der Handhabung enthielt. Wäßrige Lösungen der Hyaluronidase werden bei Zimmertemperatur in kurzer Zeit denaturiert.
Gegenstand der voTliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Hyaluronidaselösung, welche für -die parentrale Verwen#dung geeignet ist und -hinreichendee Stabilität besitzt, um sie als solche, beispielsweise bei Temperaturen von 15 bis 30', lagern und verabreichen zu können.
Gemäß -der vorliegenden Erfindung wird Natriumchlorid oder CaI.,ciumehlorid und Äthylendiamintetraessigsäure (H02C - Cii2)2N - CH2 - CH2 - N(CH2'CO-2H)2 odex ihre wasserlöslichen Salze als Stabilisierungsmittel verwendet. Der Lösung wird eine kleine Menge eines Puffers einverleibt, um sie- etwa neutral zu halten.
Äthylendiamintetraessigsäure, welche im folger#-den der Einfachh#eit halber als »EDTA« bezeichnet werden soll, wurde, bereits zur Stabilisierung verschiedener Arzneimittel auf Grund ihrer Fähigkeit verwendet, mit Schwermetallen Komplexe zu bilden, in denen das Metall, nicht mehr lortisiert ist. Auf diese, Weise kann sie bestimmte Produkte, welche gegenüber Schwermetallionen empfindlich sind, schützen.
Im vorliegenden Fall ist die Instabilität der wäßrigen Hyalüronidase-Lösung komplizierterer Natur -und, wird durch andere Faktoren als die Anwesenheit von Schwermetalfionen, welche nicht die die Stabilität steuernden Faktoren sind, grundlegend beeinträchtigt.
Der einzige biehenge Versuch zur Verwendung von »EDTA« mit Hyalu#ron-idase Üt in der Veröffentlichung von Meyer und Rapport (vgl. j. B#icdl. C-hem., 188, 485 bis 490 [1951]) beschrieben. Diese Autoren studierten die augenblickliche Inaktivierung von Hyalnroni,dase durch Schwermetallionen sowie ihre Reaktivierung und die Verhütung,der Inaktivierung duTchmeIhrere organisehe und anorganische Mittel. Sie betrachteten die Wirkun,g als Wettbewerb zwischen der l#yaluron-idase und dem gegen das SchwermetarBohn angewandte Schutzmittel. In dem Ausmaß, in dem,das Schutzmittel-in diesem Wettbewerb, vorherrscht, wird die Hyaluronidase geschützt. Unter den geprüften Schutzmitteln war auch »Versene«, eine Handelsform der »EDTA«. Die Autoren kommen zu dem Schluß, daß chelatbildende Mittel, wie »Oxine« und »Versene«,- ziemlich schlechte Konkurrenten des Enzyms für das Metall eind. -Es sei erwähnt, daß d.iese Autoren nur die augenblickliche und reversible Entaktivierung des Enzyms -und nicht dessen langdauernde Stabilität untersuchten.
Versuche, die zu-r vorliegenden Erfindung führten, haben gezeigt, daß hauptsächlich andere Faktoren als die Schwermetath-- für die Inaktivierung der Hyaluronidase verantwortlich sind. Beispielsweise ist das mittels Aussafzen- mit einem Kupfersalz gereinigte Enzym in wäßrigen Lösungen beständiger als das durch fTaktionierte Gewinnung mit Alkohol gereinigte Enzym, obwohl das erstere einen höheren Gehalt an Kupfer- und Eisenverunreinigungen aufweist. Die-,durch fraktionierte Gewinnung mit Al- kohol gereinigte Hyalüronid.ase wird jedoch vom klinischen Standpunkt wegen ihrer größeren Reinheit und vom Standpunkt der Erzeugung wegen der größeren Wirksamkeit des Alkoholreinigungsverfahrens bevorzugt. Die Oberflächenkräfte spielen ,bei der Inaktivierung der Hyaluro-nidase in wäßrige-r Lösung eine w-ibhtige Rolle. Es scheint, daß die Proteinmoleküle in der verdünnten eiweißartigen Enzynilösung die Neigung- besitzen, sich an der GrenzflächeLuft-Wasser zu konzentrieren. Unter diesen Bedingungen scheinen die nicht beanspruchten Oberflächenkräfte auf einige der schwachen Bindungen zwischen denAminosäureketteneinzuwirken und die teilweise Entflechtung der Proteinmoleküle und den Verfußt derb Enzymwirksamkeit zu verursachen. Durch Vergleichsversuche wurde festgestellt, daß eine Vergrößerung der Grenzfläche Luft-Wasser bei verdünnten wäßrigen Hyal-uronidase-Lösungen die Inaktivierungsgeschwindigkeit beträchtlich vergrößert. DieseInaktivierungstheorie ist jedoch nicht in allen Punkten gesichert. Daß die Inaktivierung nicht die Folge. einer Oxydation -ist, erwies sich dadurch, -daß kein Anwachsen der Inaktivierung gefunden wurde, wenn man derartige Lösungen mit Sauerstoff sättigte.
EDTA vermind4--rt die Inakeivierung von Hyaluronidase infolge der Oberflächenwirkung bereits beträchtlich.
Weiterhin wuTde gefunden, daß die Anwesenheit von Natrium- oder Calcium#dh.Iorid die Stabilität von verdünnten, wä3rigen Hya-llironidas---Lösungen weiter vorteilhaft beeinflußt. So werden durch Zusalz kleiner Mengen von Natrium- oder Calciumchilorid bei wäßiigen Hyaluronidase-Lösungen erheblidhe Steigerungen und mit den gleichen Zusätzen bei Hyalüronidase-EDTA-Lösungen sogar Spitzenwerte -der Stabilität der betTeffenden Lösungen erzielt.
Aus dem eben Gesagten wird ersichtlich, daß die Inaktivierung von Hyal-uronidase einen kompilizierten Mechanismus darstellt, bei dem die Anwesenheit von Schwermetallionen -eine verhältnismäßig untergeordnete Rolle- spielt. Es ist leicht möglich, daß bis jetzt noch nicht entdeckte Faktoren eine Rolle spiel#-,n. Es istsehr Überraschend und war nicht vorauszusehen, daß EDTA in Gegenwart der genannten Salze eine starke i#dh#i#bitorisch,- Wirkung auf al-le bekannten In-aktivierungsersch-einungen der Hyalur,oni,da-se ausübt. Ihre Verwendung ermöglicht die Erzeugung einer stabilen Hyaluronidase-Lösung, welche zur parenteralen Injektion geeignet ist.
Gemäß der Erfindung wird beispielsweise eine kleine Menge Hyaluronidase, z. B . :25 bis ioooTRU/,ccm in vorzugsweise von pyrogenen Stoffen freiem Wasser gelöst, daseine kleine Menge Natrium- oder Caleiumc'hlorid enthält, z. B. 0,15 M, und o,i bis i mg/ccm EDTA-Dinatriumsalz je Liter enthält. Die Reaktion der Lösung wird auf annähernde Neutrafität, z. B. pH 6 bis 8, eingestellt und kann durch Zugabe eines geeigneten Puffers, wie Phosphatpuffer mit o,oi Ionenstärke gesteuert werden. Vorteilhaft kann auch eine kleine Menge eines Konservierungsmittels, wie Natriumäthylmercurithiosa:licylat im Verhältnis i: io ooo vorhanden sein.
Durchschnittlich sind in einer Hyaluronidasezubereitung 15o TRU in o,2 mg enthalten. Deshalb sind in 0,033 mg 25 TRU undin 1,33 mg ioooTRU enthalten. Bei der allgemeinen therapeutischen An-,vendung ist eine Lösung von i5o bis 2oo TRUiccm zweckmäßig. Wo jedoch nur eine kleine Fläche oder ein kleines Volumen infiltriert werden soll, z. B. bei der Dentalanästhesie, #fst eine verdünnte Lösung, die nur :25 bis 3o TRU/ccm. enthält, vorteilhaft. Andererseits ist bei manchen Verwendungszwecken, z. B. bei der Behandlung von Nierensteinen, eine konzentrierte Lösung, die beispielsweise 6oo TRU/ccm oder mehr enthält, erwünscht.
Es wurde weiterhin gefunden, daß der Zusatz einer kleinen Menge einer einfachen Aminosäure, ,vie Glycin oder Arginin, in manchen Fällen die Schutzwirkung der EDTA verstärkt. Ein derartiger Zusatz ist jedoch nur zweckmäßig und für die bevorzugten Zusammensetzungen nicht un-bedingt erforderlich.
Die hier verwendeten Ausdrücke »Äthylendiamintetraessigsä-ulre« und »EDTA« sollen auch die einfachen, nicht toxisc1hen wasserlöslichen Salze umfassen, wie z. B. das Dinatriumsal#z, wobei das in der Lösung vorhandene Salz zum Tei1 durch das zugesetzte Salz als solches und zum Teil durch,den zur Einstellung des pi-Wertes verwendeten Puffer bestimmt wird. In den folgenden Beispielen wurde das Dinatriumsalz der EDTA verwendet. Das EDTA-Anion ist der ausschlaggebende Faktor. Der hier verwendete Ausdruck »TRU« gibt die »trübungsvermindernden Einheiten« (»turbidity redncing-units«) an, in dein S.inne, wie er bei den von Aburn und Whitley (vgl. j. Biol. Chem. 192, 379 bis 393 [1951]) beschriebenen Trübungstest verwendet wird. Die durch Aussalzen mit einem Kupfersalz gereinigte Hyaluronidase (im folgenden als kupfergereinigte Hyaluronidase bezeichnet) wurde aus frisch gefrorenen Stierhoden nach einer Methode,dieaufArbeitenvonHahn (vgl.Biochem. Zeitschrift 315, 83 bis 96 [19431) zurückgeht, hergestellt und diedurch fraktionierte Gewinnung m-it Alkohol gereinigte Hyaluronidase (im folgenden als alkoholgereinigte Hya;luronidase bezeichnet) wurde nach der Methode von Tint und Bogash (vgl. j. Biol. Chem. 184, 501 [19501) hergestellt. In den folgenden Beispielen beziehen sich die angegebenen Zahlen auf erfindungsgemäße Zusammensetzungen und auf Vergleichsversuche, die weiter oben allgemein besprochen wurden.
Die Prüfungen, welche die unten angegebenen Ergebnisse lieferten, wurden nach der Methode von A 1 b u r n und Wh i t 1 e y (a. a. 0.) durchgeführt.

Beispi,el i Beständigkeit von alkoholgereinigter Hyaluronidas,-in verschiedenen Medienbei 37' Die Lösungen wurden in i: ioooo wäßrigem Merthiolat hergestellt und, enthielten 192 TRU/ccm. Volumina von 5 cem wurden in 5-ccm-Ampullen bei 37' gegeben.

0/0 Wirksamkeits-

Lösung verlust

3o Tage i 6o Tage

Wasser ...................... WO ioo

o,oi m-Phosphatpuffer, pil 7 ... WO WO

o,i5 m-Natriumchlorid ........ 9 38

0,15 m-Calciumchlorid ......... --3 39

i mg/ccm E D TA - Na . ........ 75 94

i mg/ccm E D TA - Na2 + 0115 M-

NaC1 ..................... 4 1:0

Beispiel 2 Wirkung des Verhältnisses der Grenzfläche Luft-Wasser zu dem Volumen der Lösungohne Rühren Die Lösungen der alkoholgereinigten Hyalu#ronidase wurden in i: io ooo wäßrigem Merthiolat hergestellt und enthielten 192 TRU/ccm. 3 Ccm oder ioceni wurden in io-c#cm-Ampu.llen, wie angegeben, gegeben und ohne. Schütteln bei 37c) gelagert.

0/0 Aktivitätsverlust

3o Tage

Lösung 3 ccm gef üllte

in der Ampulle

Ampulle

0,15 m NaC1 ................. 35 14

i mg/ccm EDTA-Na. + o,i5m-

NaC1 ..................... 6 6

Beispiel; 3 Wirkungder Grenzfläche Luft-Wasser mit Rühren 5/1o-ccm-Lösu-ngen wurden wie im Beisp.iel'2, beschrieben hergestellt, die 17o TRU/ccm enthielten. Sie wurden in io-ccm-Ampullen gegeben, die horizontal am Umfang eines Kugelmühlenbehälters angebracht waren. Die Kugelmühlk- rotierte mit i2o Umdrehungen je Minute bei 37".

o/' Aktivitäts-

Lösung verlust

# 20 Stunden

0,15 m NaC1 ..................... 70

i mg/ccm EDTA -Na, + OJ5m NaCi ig

Beispiel 4 Vergleich der kupfergereinigten und der alkohdlgereinigten Hyal-uronidase Man lagerte Lösungen von kupfergereinigter Hyaluronidase, die 145 TRU/ccm. o,i5 m-Natriumchlbrid und o,oim-Phosphatpl-iffer in i:ioooowäßrigem Merthiolat bei PH 7 mit und ohne EDTA - Na2 enthielten, wiihrend der angegebenen Zeiten Beie 37'.

Lösung 0/0 Aktivitätsverlust

# 41 Tage go Tage

ohne EDTA ................ ig 33

i mg/ccm EDTA-Nag ..... ..

8 17

Lösungen von alkoholgereinigter Hyaluroni,dase,

wie oben, jedoch 192 TRU/ccm enthaltend.

Lösung 0/0 Aktivitätsverlust

# 15 Tage 1 32 Tage 6o Tage

ohne EDTA ......... 27 35 37

i mg/ccm EDTA-Na, 3 4 io

0/0 Metallverunreinigungen

in Hyaluronidase bei den

obigen Testen

CU Fe

Cu-gereinigt .......... 0,-- 0,03

alkoholgereinigt ...... 0,002 o,oi

Beispiel 5 La;ngda-ueTnde Sta;bilität von Hyaluronidase bei 37' Lösungen von kupfergereinigter Hyaluroni-dase mit einer Aktivität von 135o TRU/mg, die eine Enzymkonzentration von 145 TRU/ccm, o,i5 m-Natriumchlorid und einen Phosphatpuffer von o,oi-Ioi,iellstärke in i:ic)ooo-wäßr#igem Merthioilat enthielten, wurden bei 3 7' während der a:ngegebenen Zßit-,n gelagert.

Lösung 0/0 Aktivitätsverlust

1 41 Tage go Tage 136 Tage 6 Monate Monate

ohne EDTA ............................. ig 33 50 55 61

i mg/ccm EDTA-Na . ....................

8 17 32 28 34

- Erläuterungen zu den Beispielen i bis 5 Aus den obigen Angaben in den Beispielen i bis 5 können bestimmte Schlüsse gezogeh werden: i. Eine verdünnte Lösung von Hya;l-uroiiidase in Wasser ist äußerst unbeständig und verliert ihre gesamte Wirksamkeit in 15 Tagen bei 371. Durch Puffern auf Pii 7 mit Phosphatpuffer Wird keine Stabilisat-ion erreicht (Beispiel i).

2. Kleine Mengen von Natriumchlorid oder Caleium,chl-chrid verbessern die Stabilität (Beispiel i). 3. Eine Vergrößerung der Grenzfläthe Luft-Wasser beschleunigt die Inaktivierung (Beispiele:2 und 3).
4. Die Anwesenheit von Schwermetaillionen (Cu und Fe) ist offensichtlich kein steuernder Faktor (Beispiel 4).
5. Die Zugabe von EDTA ist wirksam, um die Inaktivierungsgeschwindigkeit in Gegenwart einer kleinen Mienge von Natrium- oder Calc-i-amchlorid während einer längeren Zeitdauer bei einer beschleunigenden Inaktivierungstemperatur (37') bei allen untersuchten sonstigen Bedingungen zu hemmen (Beispiele 1, 2, 3, 4 und 5).
Diese Ergebnisse sind überraschlend..Man nahm bisher an, daß die Äthylendiamintetraessigsäure lediglich durch Deionisieren der SchwermetaJ1verunreinigungen wirkte, und ihre Verwendung als Schutzmittel -,var auf derartige Fälle beschränkt. Tatsächlich wurde gemäß der einzigen Veröffentlichung von Meyer und Rapport (a. a. 0.) über ihre Verwendung mit Hyaluron.idase festgestellt, daß sie kein wirksamer Konkurrent mit dem Enzym für Kupfer- und Eiseenrionen wäre.
Es sei erwähnt,daß die Prüfungen der Beispiele i bis 5 beschleunigte Prüfungen waren, die bei 37' durchgeführt wurden. Der du#rchschnittliche Bereich der Lagerungstemperaturen kann bei 15 bis 30', am häufigsten bei 2o bis :25, angenommen werden. Da sich der Aktivitätsverlust für je 4' Temperaturanstieg etwa' verdoppelt, so. ist es durch die vorlieg-ende Erfindung möglich geworden, klinisch brauchbare verdünnte wäßrige Hyalu-ron.idase-Lösungen herzustellen, we-1,rJhe eine,adäquate Aktivität während mehrerer Monate- beibehalten.
Im folgenden ist ein Beispiel einer Durchführungsforra, welche für die klinische Anwendung geeignet ist, angegeben.
Bei-spiel 6 Zuerst wird eine Lösung hergestellt, die 8,5o g Natriumchlc#riid, o,io g Merthiolat und i g EDTA - Na2 im Liter enthält. In 1 1 dieser Lösung werden i2,2o.g wasserfreies Na2HPOP 2,329 NaH2P04-H20 und etwa, das zehnfache an geptflverter Hyaluronidase, welche in der endgültigen Lösung gewünscht wird, gelöst. Die Lösung wird durch ein BakterienfilteT bei Zimmertempexatur oder darunter filtriert und die sterile Lösung auf Aktivität geprüft. Diese Lösung wird dann mit einer weiteren Menge der zuerst hergestellten Lösung verdünnt und gibt,die, endgültige gewünschte Aktivität, z. B. i5o bis 175 TRU/ccm, für den allgemeinen Gebrauch. Der pff-Wert be, trägt ungefähr 7,3. Die fertiggestellte Lösung wird dann in Ampullen aus wenig löslichem Glas von solcher Größe gefüllt, daß die Grenzfläche Luft-Wasser auf einem Minfmum gehalten wird, und verschlossen. Die Ampullen können eine einfache Dosis von i ccm oder eine mehrfache Dosis von 5 ccm oder mehr fassen. Es wurde festgestellt, daß Mehrfachdosisampullen von 5 ccm Fassungsvermögen für eine konzentriertere Lösung, die 3ooo TRU oder 6oo'#RU/ectn enthalten, erwünscht sind.

Claims

PATENTANSPRÜCHE. i. Verfahren zur Herstellung einer stabilisierten Hyaluronidase-Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man Äthylendi,ani,intetraess-igsäu-re oder ein wasserlösliches Salz derselben und Natriumchlorid oder Caleiumchlorid als Stabilisierungsmittel verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hyalu-#ron,idase-Iösung verwendet, die :2 5 bis i ooo TRU/ccm enthält, daß man in dieser Lösung Äthylendiamintetraessigsäure oder ein lösliches Salz derselben in einer Menige von o,i bis i mg/ccm, ein Konservierungsmittel, Oj bis o,2 m-N.atr-iurnchlo,rid und einen nichttoxischen Puffer zur Schaffung einer Reaktion im pli-Bereich 6,o bis 8,o löst. 3. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man in dieser Hyaluron-idase-Lösung i mg/cemÄthylendiamintetraessigs#,ure-Dinatriumsalz, o,i5 m-.Natriumchlorid -und einen Phosphatpuffer zur Herstellung einer Reaktion von etwa Pii 7,3 löst, wobei das Lösungsmittel eine i: ioooo-Lösung von Natriumäthylmercurith#iosalicylat inpyrogenfre.ik#rn Wasser ist. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß#dieverwendeteHyal-uronidase-Lösung eine Aktivität von etwa, i5o TRU/ccm besitzt. 5. Verfahren nach Anspruch3, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Hyaluronidase-Lösung eine Aktivität von etwa 6ooTRU/ccrn besitzt. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadürch gekennzeichnet, daß man die stabilisierte Lösung bei Temperaturen. unter 20 0 steril filtriert und in Ampullen von solcher Größe füllt, daß ein Verhältnis der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit zu Volumen geschaffen wird.