DE909085C - Verfahren zur Herstellung von Stoffen mit der Wirkung der Penicillinase - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von Stoffen mit der Wirkung der Penicillinase Es ist bekannt, daß die bakteriostatischen Eigenschaften des Penicillins durch ein Enzym, die Penicillinase, zerstört werden können. Für die technische Herstellung dieses Enzyms wählt man zweckmäßig Bacillus cereus wegen des hohen Ertrages an Enzym, der auf irgendeinem der üblichen Kulturmedien erhalten wird. Die Bildung des Enzyms geht an sich in den Zellen des Organismus vor sich, dasselbe wird jedoch in so großem Überschuß gebildet, daß es aus den Zellen in die umgebende Nährlösung tritt, aus der es ausgefällt werden kann. Die Fällung erfolgt zweckmäßig innerhalb eines isoelektrischen Bereiches bei einem PH-Wert von ungefähr ä bis ungefähr 5,4 durch Behandeln mit Aceton, Alkohol, Dioxan, Natriumwolframat oder gesättigter wäßriger Ammoniumsulfatlösung.
• Penicillinasepräparate spielen eine Rolle bei der technischen Herstellung von Penicillin. Sie werden hierbei zum Prüfen der Sterilität des Arzneimittels und für die chemische Prüfung seiner antibiotischen Wirksamkeit verwendet.
• Bei der Herstellung der Penicillinase wird naturgemäß ein hochwirksames Produkt angestrebt, welches außerdem noch sehr rein und steril sein soll. Es war bisher nicht möglich, diese erwünschten Eigenschaften bei der technischen Herstellung der Penicillinasepräparate in vollem Umfang zu erfüllen, und so stellten die bisher bekannten Penicillinasepräparate ein Kompromiß dar, bei denen entweder die Wirksamkeit bei guter Sterilität beeinträchtigt war oder aber bei gut wirksamen Präparaten Verunreinigungen in Kauf genommen werden mußten.
• Gemäß der Erfindung wird ein steriles, reines Penicillinasepräparat erhalten, welches eine den bisher bekannten Präparaten überlegene Wirksamkeit zeigt, höchstens ganz unbedeutende Mengen Puffersubstanzen enthält und eine weit höhere Stabilität gegen chemische Einflüsse aufweist.
• Erfindungsgemäß wird eine Penicillinase enthaltende, beliebig hergestellte, geklärte Fermentationsbrü'he mit ungefähr ro bis 3o Gewichtsprozent Ammonsulfat versetzt. Dadurch werden unerwünschte inerte Stoffe fraktioniert, niedergeschlagen und entfernt. Darauf wird eine weitere Jlenge Ammonsulfat zugegeben, bis die Lösung ungefähr 8o% der zu ihrer Sättigung erforderlichen Menge dieses Salzes enthält. Danach läßt man die Lösung kalt stehen, wobei sich ein Niederschlag bildet, welcher die Penicillinase enthält. Dieser Niederschlag wird abgetrennt und mit einer verdünnten wäßrigen Ammonsulfatlösung extrahiert. Die Ammonsulfatlösung löst die im Niederschlag enthaltene Penicillinase auf, und es entsteht eine Lösung, die pro Volumeinheit ungefähr die zehnfache Menge an Penicillinase der Ausgangsbrühe enthält. Die beschriebenen Arbeitsgänge werden zur weiteren Reinigung des Produktes gegebenenfalls wiederholt. Klan erhält so eine verhältnismäßig konzentrierte Penicillinaselösung, welche dann gegen klares Wasser dialysiert wird. Hierbei wird zur Abtrennung des Ammonsulfats eine halbdurchlässige Membran z. B. aus Cellophan benutzt. Darauf wird die Lösung mit Säure, vorzugsweise mit einer verdünnten Mineralsäure, auf ein pH zwischen 3,0 und 5,0, zweckmäßig auf ein PH 4,5 eingestellt.
• Die angesäuerte Lösung wird dann mit einem Reagens, wie Tannin oder Lignin, behandelt, das in der Lage ist, mit Penicillinase eine in der Reaktionsmischung schwer lösliche komplexe Verbindung zu bilden. Dabei reagiert die Penicillinase fast vollständig unter Bildung dieser Verbindung, welche sich aus der Lösung absetzt und leicht von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt werden kann. Als Fällungsmittel kommen gewisse kompli-.zierte organische Verbindungen pflanzlichen Ursprungs, wie Tannin oder Lignin, in Frage. Das Fällungsmittel wird in wäßriger Lösung mit der Penicillinaselösung vereinigt, wobei die Lösung des Fällungsmittels etwa denselben pH-Wert haben soll wie die Penicillinaselösung.
• Wird als Fällungsmittel ein Gerbstoff benutzt, so wählt man vorzugsweise Tannin aus Galläpfeln oder Gelbholz, und zwar in möglichst reiner Form. Es können auch Tannine anderen Ursprungs verwendet werden, z. B. solche aus der Rinde verschiedener Eichenarten, der Fichte, Mimose oder Sumach. Als Lignin kann das in der Zellstoffindustrie als Alkali-Soda-Lignin bekannte, durch saure Fällung aus Schwarzlauge gewonneneLignin erfindungsgemäß verwendet werden. Vorzugsweise wird die Konzentration der Penicillinaselösung und die der Lösung des Fällungsmittels so bemessen, daß das Volumen der Lösung des Fällungsmittels, das zur vollständigen Fällung der Penicillinase benötigt wird, ungefähr 2o% des Volumens der Penicillinaselösung beträgt. Jedoch läßt sich das Verfahren auch mit Volumina von 5 bis 50°/o durchführen. Die Lösung wird zweckmäßigerweise während des Fällungsvorgangs bei einer niedrigen Temperatur gehalten, z. B. zwischen ungefähr 5 bis zo°. Ferner soll die Lösung gerührt werden, um vollständige Einheitlichkeit der Mischung und vollständige Reaktion sicherzustellen.
• Der so hergestellte Penicillinase-Tannin- oder Penicillinase-Lignin-Komplex wird aus derLösung als flockiger Niederschlag bei einem pH von ungefähr 4.,5 abgeschieden. Nach völligem Absetzen des Niederschlages wird derselbe abfiltriert und in Wasser suspendiert. Das pH dieser Suspension wird durch Zusatz von Lauge, z. B. Natronlauge, auf 7,5 ein-gestellt. Dabei bildet sich eine echte Lösung, die zwecks Entfernung diffusionsfähiger Stoffe, die in dem Endprodukt als Puffersubstanzen auftreten könnten, gegen kaltes Wasser dialysiert wird. Die Lösung wird mit einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Gummis, z. B. Gummiarabikum, versetzt. Dies Gemisch kann entweder sofort für die chemische Prüfung vorn Penicillin benutzt werden oder der Gefriertrocknung unterworfen werden, wobei ein trockener lyophiler Stoff entsteht, der in wäßriger Lösung als Testsubstanz geeignet ist.
• Die erfindungsgemäß erhaltenen komplexen Tannin-Penicillinase- und Ligniii-Penicillinase-Präparate sind sowohl in Lösung als auch im trockenen Zustand den bekannten Penicillinasepräparaten hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Hitzebeständigkeit, Wirkungsspezifität, Widerstand gegen inaktivierende Einflüsse, ferner hinsichtlich ihrer Reinheit von Puffersubstanzen, die den Wert der Präparate bei der chemischen Prüfung von Penicillin beeinträchtigen, wesentlich überlegen. Dies trifft besonders für den mit Gummiarabikum stabilisierten Tannin-Penicillinase-Komplex gegenüber gefällter Penicillinase zu. Der Penicillinasekomplex kann in einem Druckkessel 2o Minuten lang einem Überdruck von etwa r Atm. bei r2o° ausgesetzt werden, wobei nur 5o0/e. der ursprünglichen Aktivität verlorengehen, während gefällte Penicillinase durch dieselbe Behandlung vollkommen inaktiviert wird. Die Wirksamkeit einer wäßrigen Lösung des Komplexes wird durch viermonatiges Lagern unter Kühlung kaum vermindert, während eine Lösung aus Penicillinase unter denselben Bedingungen innerhalb 2 bis 3 Monaten etwa die Hälfte ihrer Wirksamkeit einbüßt. Unter optimalen Bedingungen (Temperatur, pH-Wert, Verhältnis von Enzym zu Substrat) vermag r mg des Penicillinasekomplexes 6oo bis 700 mg Penicillin zu inaktiveren, während die gleiche Menge gefällte Penicillinase unter denselben Bedingungen höchstens 75 mg Penicillin zu inaktivieren vermag. Der Unterschied zwischen den neuen und den bekannten Präparaten fällt insbesondere beim Vergleich ihrer Titrationswerte gegen Alkali auf. t?m den pH-Wert von 6 auf 8 zu erhöhen, benötigt der Penicillinasekomplex höchstens nur o.o2 ccm o,o2 n-Ätzalkali, während o,2 ccm oder noch mehr benötigt «-erden, um dieselbe Änderung des pH-Wertes bei gefällter Penicillinase zu bewirken. Außerdem wird der Penicillinasekornplex durch eine vierstündige Bebrütung unter Zusatz von 2% benzoesaurem Natrium, sulfaminsaurem Ammoniak, Sulfanilsäure oder sulfanilsaurem Natrium bei 37° nicht inaktivert, während die bekannten Penicillinasepräparate unter denselben Bedingungen inaktiviert werden. Beispiel i Eine mit Bacillus cereus (Stamm NRRL B-569) bebrütete Fermentationsbrühe wird durch mehrere Lagen Filtertuch filtriert und ein oder mehrmals durch eine schnell laufende Zentrifuge gegeben, um die suspendierten Zellen u. dgl. zu entfernen. Die erhaltene Lösung hat dann einen Gehalt von etwa 8ooo Penicillinaseeinheiten pro Kubikzentimeter. Man setzt zu etwa 6o 1 dieser geklärten Brühe Ammonsulfat zu in einer Menge, daß eine etwa 2o%ige Salzlösung entsteht. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wird die Lösung nochmals filtriert, und man erhält ein klares braunes Filtrat mit ungefähr 8-loo Penicillinaseeinheiten pro Kubikzentimeter. Die Lösung wird dann durch Zusatz von weiterem Ammonsulfat gesättigt, wobei der Gesamtgehalt der Lösung etwa 7o6 g Ammonsulfat pro Liter sein soll. Man läßt dann unter Kühlung über Nacht stehen, wobei sich ein brauner Niederschlag abscheidet, welcher die wirksamen Stoffe enthält. Der Niederschlag wird abgesaugt und in etwa 2,5 bis 31 2%iger Ammonsulfatlösung gelöst. Das Volumen dieser Lösung beträgt etwa 1/2o des Volumens der geklärten Brühe, und der Gehalt an Penicillinaseeinheiten pro Kubikzentimeter beträgt etwa i io ooo. Man sättigt noch einmal mit Ammonsulfat und läßt nochmals über Nacht im Kühlschrank stehen und löst den entstandenen Niederschlag abermals in i 1 2%iger Ammonsulfatlösung. Man wäscht mit etwa 1/21 Ammonsulfatlösung und vereinigt die Waschwässer mit dem Filtrat. Die Lösung hat dann ein Volumen von i1/21 und einen Gehalt an Penicillinaseeinheiten pro Kubikzentimeter von 307 000. S-ie wird iai ein Dialysiergefäß mit einer Cellbphanmembran gebracht und gegen kaltes Leitungswasser dialysiert, bis die Prüfung auf Ammonionen negativ wird.
• Das pH dieser Lösung wird dann auf 4,5 eingestellt und eine 5%ige wäßrige Tanninlösung aus Galläpfeln oder Gelbholz zugesetzt. Das Volumen der Tanninlösung soll etwa 1/s des Volumens der Penicillinaselösung sein. Das gesamte Volumen der Mischung beträgt dann etwa 2230 ccm. Nach Zusatz der Tanninlösung wird der PH-Wert wieder auf .4,5 eingestellt. Man stellt dann die Mischung 1/2 bis i Stunde unter gelegentlichem Umrühren auf Eis, wobei sich der Penicillinase-Tannin-Komplex bildet und sich aus der Lösung abscheidet. Er wird abfiltriert, in 1/21 Wasser suspendiert und so viel io%ige Natronlauge zugesetzt, daß der pH-Wert 7,5 beträgt. Die Lösung wird gegen kaltes Leitungswasser 36 bis .48 Stunden dialysiert, um diffusionsfähige Verunreinigungen zu entfernen. Danach hat die Lösung ein Volumen von etwa 625 ccm und einen Gehalt an Penicillinaseeinheiten pro Kubikzentimeter von etwa 8oo ooo bis 1 200 000.
• Der so gewonnenen Lösung wird eine 2%ige Lösung von Gummiarabikum zugesetzt, wobei die Penicillinaselösung so weit verdünnt wird, wie es ihrem Verwendungszweck entspricht. DieseLösung kann dann direkt für die chemische Prüfung von Penicillin verwendet werden: Sie kann auch durch Gefriertrocknung eingetrocknet werden, wobei ein lvophiles Erzeugnis erhalten wird, welches dann für die Verwendung wieder gelöst wird.
• Das vorstehend beschriebene Verfahren kann in folgenden Einzelheiten abgewandelt werden: Zur Klärung der Fermentationsbrüh-e kann eine io- bis 4ogewichtsprozentige Ammonsulfatlösung verwendet werden. Die Fällung der wirksamen Substanz durch Zusetzen von Ammonsulfät zur geklärten Brühe kann auch so erfolgen, daß weniger Ammonsulfat zugesetzt wird, als zur vollständigen Sättigung der Lösung mit Ammonsulfat erforderlich ist, wobei als Grenze 8o% des Sättigungsgrades gelten können. Das ausgefällte tEnzym kann in einer Ammonsulfatlösung gelöst werden, deren Ammonsulfatgehalt zwischen i und io% liegt. Beispiel e Eine Fermentationsbrühe, welche Penicillinase enthält, wird wie im Beispiel i gewonnen, mit Ammonsulfat fraktioniert, gefällt, dialysiert, abgekühlt und auf ein PH von 4,5 eingestellt. Die gekühlte Lösung wird mit etwa 1/s ihres Volumens einer gekühlten wäßrigen Lösung von Alkalilignin vom pH 6 versetzt, worauf das p$ des Gemisches auf 4.,5 eingestellt wird. Das Gemisch wird 1/2 Stunde in Eis gekühlt, wobei sich ein Penicillinase-Lignin-Komplex bildet, der aus derLösung ausfällt und durch Filtration gewonnen wird. Der Rückstand wird in verdünnter Natronlauge wie im Beispiel i gelöst, worauf er bis zum PH 7,5 mit Säure versetzt wird. Die Lösung wird 36 bis 38 Stunden gegen gekühltes Leitungswasser dialysiert. Der dialysierten Lösung wird eine wäßrige Lösung von Gummiarabikum zugesetzt. Sie kann dabei auf die gewünschte Wirksamkeit verdünnt und (wie im Beispiel i) direkt verwendet werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Stoffen mit der Wirkung der Penicillinase, dadurch gekennzeichnet, daß eine konzentrierte wäßrige Lösung der Penicillinase, welche durch Dialysieren in an sich bekannter Weise gereinigt ist, bei einem pH-Wert von etwa 4,5 mit Tannin oder Lignin in wäßriger Lösung versetzt, der sich bildenide Penicillinase-Tannin- bzw. -Lignin-Komplex abgeschieden und demselben gegebenenfalls in wäßriger Lösung bei einem pg von etwa 7,5 ein hydrophiles Gummi, wie Gummiarabikum, zugesetzt wird.