DE69334015T2 - Verwendung von Aspergillus niger catalase-R zur Wasserstoffperoxid-neutralisierung - Google Patents

Description

• Dies ist eine Teilanmeldung der europäischen Patentanmeldung 93 907 259.1.
• Gebiet der Erfindung:
• Die Erfindung betrifft die Anwendung von Aspergillus niger-Katalase-A-Enzym für die Neutralisierung von Wasserstoffperoxid in Lösung.
• Hintergrund der Erfindung
• Katalasen [Wasserstoffperoxid: Wasserstoffperoxidoxidoreduktasen (EC 1.11.1.6)] sind Enzyme, die die Umwandlung von Wasserstoffperoxid (H₂O₂) in Sauerstoff (O₂) und Wasser (H₂O) gemäß der folgenden Gleichung katalysieren.
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• Diese ubiquitären Enzyme sind aus einer Vielzahl von tierischen Geweben, Pflanzen und Mikroorganismen gereinigt worden (Chance und Maehly, 1955, Methods Enzymol. 2: 764-791; Jones und Wilson, 1978, in H. Sigel (Hrsg.), Metal Ions in Biolgical Systems, Band 7, Marcel Dekker Inc., New York). Nahezu alle Formen des Enzyms, die charakterisiert worden sind, bestehen aus vier Polypeptid-Untereinheiten, die jeweils ein Molekulargewicht von 50000 bis 60000 aufweisen und eine prosthetische Protohämin-Gruppe pro Untereinheit enthalten (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392; Hartig und Ruis, 1986, Eur. J. Biochem. 160: 487-490). Katalase aus Rinderleber ist die am intensivsten untersuchte Spezies dieses Enzyms gewesen [Schonbaum und Chance, 1976, in The Enzymes (P.D. Boyer, Hrsg.), 3. Auflage, Band 13, S. 363-408, Academic Press, New York]. Die vollständige Aminosäuresequenz und die dreidimensionale Struktur von Katalase aus Rinderleber sind bekannt (Schroeder et al., 1982, Arch. Biochem. Biophys. 214: 397-412; Murthy et al., 1981, J. Mol. Biol. 152: 465-499).
• Obwohl sie aus biochemischer und biophysikalischer Hinsicht weniger gut untersucht sind, haben Katalasen aus filamentösen Pilzen mehrere Eigenschaften, die sie von ihren Gegenstücken aus Säugetieren unterscheiden. Obwohl sie eine ähnliche Anzahl von Untereinheiten und einen ähnlichen Hämgehalt aufweisen, sind Pilz-Katalasen wesentlich größere Moleküle als jene aus anderen Organismen, wobei sie relative Molekulargewichte einer Untereinheit im Bereich von 80000 bis 97000 aufweisen (Vainshtein et al., 1986, J. Mol. Biol. 188: 63-72; Jacob und Orme-Johnson, 1979, Biochem. 18: 2967-2975; Jones et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta 913: 395-398; Mosavi-Mohavedi et al., 1987, Int. J. Biol. Macromol. 9: 327-332; Wassermann und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophy. 212: 385-392; Gruft et al., 1978, Can. J. Biochem. 56: 916-919; Kikuchi-Torii et al., 1982, J. Biochem. 92: 1449-1456). Noch wichtiger ist, daß Katalasen aus Pilzen wie Aspergillus niger gegenüber einer Proteolyse und einer Inaktivierung durch Glutaraldehyd, SDS stabiler sind als Katalase aus Rinderleber und eine geringere Affinität zu Katalaseinhibitoren, wie Cyanid, Azid und Fluorid, aufweisen (Wasserman und Hultin, 1981, Arch. Biochem. Biophys. 212: 385-392). Zusätzlich ist Katalase aus A. niger beträchtlich stabiler als Katalase aus Rinderleber, wenn sie Extrembedingungen von pH, Wasserstoffperoxid und Temperatur ausgesetzt wird (Scott und Hammer, 1960, Enzymologia 22: 229-237). Obwohl Pilz-Katalasen Stabilitätsvorteile bieten, haben die entsprechenden Enzyme aus Säugetieren, wie beispielsweise Katalase aus Rinderleber, im allgemeinen eine höhere katalytische Aktivität (Gruft et al., 1978; Can. J. Biochem. 56: 916-919). Traditionell ist Katalase aus Rinderleber das bevorzugte Enzym für diagnostische Zwecke und für mit Arzneimitteln in Beziehung stehende Anwendungen (z.B. Reinigung von Kontaktlinsen/Desinfektion/H₂O₂-Neutralisierung) gewesen. Jedoch haben unlängst festgestellte Ausbrüche einer Slow-Virus-Erkrankung, die als BSE („bovine spongiform encephalopathy"; spongiforme Rinder-Enzephalopathie) bekannt ist, in europäischen Rinderherden und die Angst, daß diese Erkrankung auf den Menschen übertragen werden könnte [Dealler und Lacey, 1991, Nutr. Health (Bicester) 7: 117-134; Dealler und Lacey, 1990, Food Microbiol. 7: 253-280], ein Interesse daran geweckt, Alternativen zu Katalase aus Rinderleber für diese Anwendungen zu finden. Da darüber hinaus die Enzymstabilität ein bedeutender Faktor bei der biotechnologischen Nutzung von Enzymen darstellt, gibt es ein beträchtliches Interesse an der Verwendung von Katalase aus A. niger in Anwendungen, die die Neutralisierung von hohen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid umfassen, und in für mit Arzneimitteln in Beziehung stehenden Anwendungen, in denen die Verwendung von Katalase aus Rinderleber ein Gesundheitsrisiko darstellen könnte.
• Obwohl es mehrere veröffentlichte Berichte gibt, die die biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase aus A. niger beschreiben, wurde bislang noch nicht offenbart, daß in diesem Organismus tatsächlich zwei Katalase-Enzyme anwesend sind. Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken haben wir Gene (catA und catR), die zwei unterschiedliche Katalase-Enzyme (Katalase-A und Katalase-R) aus A. niger kodieren, isoliert (Genencor International, Inc., nicht veröffentlicht). Das catA-Gen aus A. niger, das durch Kreuzhybridisierung mit dem CTAI-Gen aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) kloniert worden ist, kodiert ein Katalase-Enzym, das primär während eines Wachstums auf Fettsäuren induziert wird und vermutlich peroxisomal ist. Im Gegensatz zu den mitgeteilten Untereinheit von Katalasen im Berich von 80000 bis 97000 wurde gefunden, dass das Untereinheit-Molekulargeicht von Katalase A aus A. niger etwa 46000 beträgt, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Katalase-A aus A. niger ist weniger stabil (d.h. sie hat eine kürzere Halbwertszeit bei Lagerung), wird durch hohe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid schneller inaktiviert und ist bei niedrigem pH weniger aktiv als Katalase-R. Das catR-Gen aus A. niger kodiert ein lösliches zytoplasmatisches Enzym (Katalase-R), von dem wir entdeckt haben, daß es die Hauptaktivität in kommerziellen Katalasezubereitungen darstellt.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Es ist entdeckt worden, daß das A. niger-Genom zwei Katalasegene enthält, die als catA und catR bezeichnet werden. Zusätzlich wurde entdeckt, daß das catA- und catR-Genprodukt (Katalase-A bzw. Katalase-R) zwei unterschiedliche Katalase-Enzyme sind, die jeweils ihre eigenen charakteristischen Merkmale aufweisen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Katalase-A-Enzym für die Neutralisation von Wasserstoffperoxid in Lösung, das durch ein Untereinheit-Gewicht von etwa 46000, wie durch SDS-PAGE definiert, durch eine spezifische Aktivität von 6300 IE/mg und dadurch, dass seine Synthese durch die Anwesenheit von Fettsäuren induziert wird, gekennzeichnet ist.
• Figuren:
• 1 zeigt einen Vergleich der Katalase-A- und Katalase-R-Aktivität in verdünnter Wasserstoffperoxid-Lösung (100 ppm).
• 2 zeigt einen Vergleich von Katalase-A- und Katalase-R-Aktivitäten in konzentrierter Wasserstoffperoxid-Lösung (16,5 g/l).
• 3 veranschaulicht einen Vergleich der enzymatischen Aktivitäten von Katalase-A und Katalase-R bei unterschiedlichen pH-Werten.
• 4 zeigt Restriktionskarten des caGA- und catR-Gens von A. niger, das Katalase-A bzw. Katalase-R kodiert.
• 5 zeigt die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des catR-Gens von A. niger. Introne werden durch gestrichelte Linien bezeichnet.
• Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen:
• Ein Vergleich der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase-A und Katalase-R wird nachfolgend beschrieben. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird verstehen, daß verschiedene Veränderungen bei den folgenden Beispielen vorgenommen werden könnten. Dementsprechend sollen die Beispiele nicht beschränkend sein.
• 1. Vergleich der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase-A und Katalase-R.
• Zur Messung von biochemischen Parametern wie Enzymaktivität, Wasserstoffperoxidkonzentrationen, pH-Aktivitätsprofil und Enzymstabilität verwendete Techniken sind herkömmliche Techniken, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden.
• Reinigung von Katalase-R aus A. niger
• Katalase-R wurde aus einer kommerziell erhältlichen Zubereitung von A. niger-Katalase (Fermcolase 1000, Genencor International, Inc.) unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie an TrisAcryl Q-Harz (IBF Biotechnics, Inc.) gereinigt. Zuerst wurde die kommerzielle Enzymzubereitung an einer PD-10-Säule (Pharmacia-LKB) entsalzt, die in 10 mM Tris-HCl bei pH 8 äquilibriert worden war. Das Enzym wurde auf eine 2,5 cm × 5,5 cm TrisAcryl Q-Säule aufgetragen, die zuerst mit 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8, dann mit 200 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8, bei einer Fließgeschwindigkeit von 6,0 ml/min äquilibriert worden war. Ungebundene Proteine wurden durch Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl eluiert. Die verbleibenden Proteine wurden mit einem Gradienten von ansteigendem NaCl (0 bis 0,5 M in 10 mM Tris-HCl, pH 8) eluiert. Die Proteinfraktion, die das höchste A₄₁₀/A₂₈₀-Verhältnis aufwies, enthielt gereinigte Katalase. Eine SDS-PAGE-Analyse dieser Proteinfraktion zeigte eine einzige Bande, die mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 80000 wanderte.
• Reinigung von Katalase A aus A. niger
• Katalase-A aus A. niger wurde aus Myzelextrakten von Zellen gereinigt, die zwei Tage in Medium, das 1% Glucose als Kohlenstoffquelle enthielt, gezüchtet worden waren. Die Myzele wurden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen Pulver gemahlen. Das gefrorene Pulver wurde in 10 ml 100 mM Natriumformiat-Puffer, pH 7, suspendiert und eine Stunde auf Eis gehalten. Die unlöslichen Zellrückstände wurden durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde durch Ultrafiltration (Amicon) konzentriert. Der konzentrierte Extrakt wurde dann einer Chromatographie an Sephacryl S-100 unterzogen, und die Fraktionen mit Katalase-Aktivität wurden erneut einer Chromatographie an einer Ionenaustauschsäule, wie oben beschrieben, unterzogen. Zwei Peaks, ein größerer und ein kleinerer, die Katalase-Aktivität enthielten, wurden durch SDS-PAGE analysiert. Die in größerer Menge vorliegende Katalase-Fraktion lieferte eine vorherrschende Bande mit einem Molekulargewicht von 80000, und es wurde nachfolgend gezeigt, daß es sich dabei um Katalase-R handelte. Der in geringerer Menge vorliegende Bestandteil, Ka-talase-A, lieferte eine Bande mit einem Molekulargewicht von 46000.
• Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften von Katalase-A und Katalase-R aus A. niger.
• Tabelle I

  
• 2. Klonierung des catA- und cat-R-Gens von A. niger
• Die bei der Klonierung des catA- und catR-Gens von A. niger verwendeten Techniken sind herkömmliche Techniken, die in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind.
• Klonierung des catR-Gens von A. niger
• Aus gereinigter Katalase-R wurde durch Verdau des Proteins mit Bromcyan eine Reihe von proteolytischen Fragmenten erzeugt. Diese Peptid-Fragmente wurden einer Aminosäuresequenzanalyse unterzogen. Die Aminosäuresequenzinformation wurde eingesetzt, um synthetische DNA-Sonden für eine Identifizierung von catR-spezifischen cDNA-Sequenzen in einer λgt11-Bibliothek zu gestalten. Kurz gesagt, wurde das Peptidfragment Met-Phe-Trp-Asn-Ser-Leu-Ile-Pro-Ala-Glu-Gln-Gln-Met verwendet, um einen Pool von drei synthetischen Oligonukleotiden mit den folgenden Sequenzen zu gestalten:
  5' ATG TTC TGG AAC AGC CTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
  5' ATG TTC TGG AAC TCC CTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
  5' ATG TTC TGG AAC AGC TTG ATC CCC GCC GAG CAG ATG 3'
• Dieses Peptid wurde gewählt, da die Aminosäuren minimal degenerierte Codon-Auswahlmöglichkeiten liefern. Die Unterschiede zwischen den drei synthetischen Oligonukleotiden repräsentieren alternative Codonauswahlen, wo es keine starke Präferenz in dem bekannten Codonnutzungsmuster bei A. niger gab. Diese Position dieses proteolytischen Fragments entspricht dem in 2 gezeigten Peptid 3. Ein Klon, der ein partielles cDNA-Fragment enthielt, wurde durch Hybridisierung mit der synthetischen DNA-Sonde positiv identifiziert, und eine Nukleotidsequenzanalyse dieses Klons bestätigte, daß es Katalase-R kodierte. Dieses klonierte cDNA-Segment wurde verwendet, um eine Genbank von genomischer A, niger-DNA mittels Hybridisierung zu durchmustern. Nachfolgend wurde das vollständige catR-Gen einschließlich stromaufwärts und stromabwärts liegender Transkriptionskontrollelemente als ein 9,0 kb-HindIII-XhoI-Restriktionsfragment zusammengestellt. Die Nukleotidsequenz des kodierenden Bereichs von catR wurde bestimmt und ist in 5 angegeben.
• Klonierung des catA-Gens von A. niger
• Das catA-Gen von A. niger wurde durch Kreuzhybridisierung unter Verwendung des CTA1-Gens von S, cerevisiae als Sonde kloniert. Bereits früher sind die Katalasegene aus Hefe isoliert und ihre Sequenzen veröffentlicht worden (Cohen et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 159-163; Hartig und Ruiz, 1986, Eur. J. Biochem. 160: 487-490). Ein Fragment des CTA1-Gens aus Hefe wurde unter Verwendung von PCR (Perkin Elmer-Cetus) amplifiziert und in pUC18 kloniert. Eine Sequenzanalyse dieses Klons bestätigte, daß es das peroxisomale Katalasegen der Hefe war. Der Klon wurde dann verwendet, um Southern-Blots von genomischer A. niger-FS-1-DNA zu screenen, und es wurde festgestellt, daß er mit einer einzigen EcoRI-Bande von 3,2 kb hybridisierte. Die Sonde wurde dann verwendet, um eine λEMBL-Bibliothek von genomischer FS-1-DNA zu durchmustern, was zur Identifizierung von mehreren positiven Klonen führte, die jeweils das bereits früher identifizierte 3,2 kb-EcoRI-Restriktionsfragment enthielten. Einer dieser λEMBL-Klone (λEMBL3-1) wurde mit BamHI verdaut, und ein 9 kb-Fragment wurde in pUC18 subkloniert. Eine Restriktionskarte dieses Subklons ist in 4 angegeben. Eine DNA-Sequenzanalyse eines Abschnitts dieses Fragments, der mit dem CTA1-Gen aus Hefe hybridisierte, zeigte, daß der Klon eine Katalase kodierte, die sich von Katalase-R unterschied. Auf der Basis von dessen Homologie zu dem CTA1-Gen aus Hefe wurde ihm die Bezeichnung catA gegeben. Eine Cotransformation von A. niger-FS-1 wurde unter Verwendung des pUC18-catA-Plasmids und eines Plasmids vorgenommen, das ein Benomyfresistenz verleihendes β-Tubulingen enthielt. Benomyl-resistente Kolonien wurden hinsichtlich einer erhöhten Anzahl von integrierten catA-Genkopien durch Southern-Blotting durchmustert. Jene Transformanten, die mehr als eine catA-Genkopie zeigten, wurden in Schüttelkolbenkulturen ausgewertet. Eine Transformante, die als 208 bezeichnet wurde, zeigte ungefähr eine Verdopplung der gesamten zellulären Katalase-Aktivität.
• SEQUENZPROTOKOLL

  
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Claims (1)

1. Katalase A-Enzym, isolierbar aus Aspergillus niger, das durch ein Untereinheiten-Gewicht von etwa 46.000, wie durch SDS-PAGE bestimmt, eine spezifische Aktivität von 6300 IE/mg und dadurch charakterisiert ist, dass seine Synthese durch die Anwesenheit von Fettsäuren induziert wird.