DE69331100T2

DE69331100T2 - Verwendung von p97 in der diagnose von morbus alzheimer

Info

Publication number: DE69331100T2
Application number: DE69331100T
Authority: DE
Inventors: R Food; A Jefferies; L Mcgeer; Sylvia Rothenberger; Tatsuo Yamada
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1992-07-10
Filing date: 1993-07-09
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2013-07-10
Also published as: CA2139862C; EP0651768A1; AU4553793A; WO1994001463A1; EP0651768B1; EP1143253A1; DE69331100D1; EP1018343A1; CA2139862A1

Description

Gebiet der Erfindung

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft p97 mit einem GPI-Anker, eine sezernierte p97-Form und Derivate davon; Verfahren zur Verwendung von p97 bei der Modulation des Eisentransportes, bei der Medikamentenabgabe und zur Behandlung von Zuständen, bei denen der Eisenmetabolismus gestört ist; sowie Verfahren zur Behandlung und Diagnose der Alzheimer- Krankheit.

Hintergrund der Erfindung

Alle Zellen benötigen Eisen, eine grundlegende Komponente, zum Wachstum und für normale physiologische Prozesse (Crichton, R. R. und Charloteaux-Wauters, M. Eur. J. Biochem. 164: 485-506 und Ponka, P. et al., Iron Transport and Storage, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor and Boston, 1990). Schnell proliferierende Zellen haben einen höheren Eisenbedarf als ruhende Zellen. Beim Menschen wird der Eisenbedarf durch die Bindung von Eisen an das Haupt- Eisentransportprotein im Serum, Transferrin, gestillt. An Eisen gebundenes Transferrin kann als Komplex an den Transferrinrezeptor binden, der auf der Plasmamembran exprimiert wir (Ponka, P. et al., Iron Transport and Storage, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor and Boston, 1990). Der Eisen-Transferrin-Transferrinrezeptor-Komplex bleibt nach der Bindung an der Membran gebunden, wird konzentriert und dann über endozytotische Vesikel endozytotisch verdaut. Die Endosomen werden angesäuert, und das Eisen wird aus dem Komplex innerhalb der Zelle freigesetzt, das Apotransferrin bleibt am Rezeptor gebunden und wird zur Oberfläche rezykliert, wo es freigesetzt wird und an der Aufnahme von weiterem Eisen in die Zelle beteiligt ist (Kulm, L. C. et al., in Iron Transport and Storage, CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor and Boston, 1990, S. 149).
Durch eine Unterbrechung der Blutzirkulation verarmen die Zellen an Sauerstoff und Eisen, was zum Zelttod führen kann. Die Ablagerung von Eisen beim Zelttod, bspw. bei ischämischer Verletzung, kann zur Bildung von hochreaktivem und toxischem Superoxid oder freien Hydroxylradikalen führen, wodurch das Gewebe weiter geschädigt wird. Die Häufigkeit und Verfügbarkeit von Eisen kann das Überleben beschädigter Gewebe stark verändern. Rasch proliferierende Zellen, wie maligne Zellen, haben einen erhöhten Eisenbedarf und müssen effiziente Mechanismen zur Aufnahme von Eisen aufweisen. Ein Einschränken der Eisenaufnahmefähigkeit maligner Zellen kann ein Verfahren zum Abtöten von Tumorzellen oder zum Modulieren ihres unkontrollierten Zellwachstums darstellen.
Die zelluläre Eisenaufnahme wird zwar hauptsächlich nur durch den Transferrinrezeptor vermittelt (Doering, T. L. et al., J. Biol. Chem. 265: 611-X14, (1990), jedoch ist ein nicht über Transferrin laufender Stoffwechselweg am Eiseneinbau in Zellen, einschließlich leukämischer Zellen, beteiligt (Basset, P. et al., Cancer Res. 46: 1644- 1647, 1986), HeLa-Zellen (Sturrock, A. et al., J. Biol. Chem. 265: 3139-3145, 1990), Hepatozyten (Thorstensen, K., J. Biol. Chem. 263: 16837-16841, 1988) und Melanomzellen (Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1053: 1-12, 1990; Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1091: 294-302, 1991a und Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1093: 20-28, 1991a).
Das ebenfalls als Melahotransferrin bekannte p97, ein menschliches melanomassoziiertes Antigen, war einer der ersten Zelloberflächen-Marker, die mit menschlichem Hautkrebs einhergehen (Hellstrom, K. E. und Hellstrom, I. (1982) in Melanoma Antigens and Antibodies, Hrsg. Reisfield, R. und Ferrone, S. Plenum Press, New York, S. 187- 341). p97 ist ein monomeres membranassoziiertes Protein mit einer Molekülmasse von 97000 Dalton (Brown, J. P. et al., J. Immunol. 127: 539, 1981). Es wurde als melanomspezifischer Marker vorgeschlagen (Estin, C. D. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 1052-1056, 1988). p97 ist mit der Zelloberfläche von Melanomen und anderen Tumoren und Zeltlinien assoziiert (Brown, J. F. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 539, 1981). Es kommt jedoch auch in bestimmten fötalen Geweben vor (Woodbury, R. G. et al., Int. J. Cancer 27: 145, 1981) und seit neuem weiß man, dass es sich auf Endothelzellen der menschlichen Leber befindet (Sciot, R. et al., Liver 9: 110, 1989).
Die Primärstruktur von p97, die von dessen mRNA- Sequenz hergeleitet wurde, zeigt, dass es zu einer Gruppe nahe verwandter eisenbindender Proteine gehört, die in Vertebraten vorkommen (Rose, T. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 1261, 1986). Diese Familie umfasst Serumtransferrin, Lactoferrin und Eiweiß-Ovotransferrin bei Vögeln. Menschliches p97 und Lactoferrin weisen 40% Homologie zueinander auf (Baker, E. N. et al., Trends Biochem. Sci. 12: 350, 1987), jedoch ist p97 im Gegensatz zu anderen Molekülen der Transferrin-Familie das einzige Mitglied, das direkt mit der Zellmembran assoziiert ist. Die abgeleitete Sequenz von p97 hat neben einer transferrinartigen Domäne ein hydrophobes Segment an seinem C-Terminus, welches ermöglicht, dass das Molekül in der Plasmamembran verankert wird (Rose, T. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 6114, 1980).
In Detergenz solubilisiertes p97 bindet Berichten zufolge an Eisen (Doering, T. L. et al., J. Biol. Chem. 265: 611-614, 1990). Die Rolle von p97 am Eisentransport ist jedoch noch nicht ganz klar. Die Eisenbindung an p97 an der Plasmamembran wurde noch nicht nachgewiesen, und trotz zahlreicher Untersuchungen gibt es bisher noch keinen Beweis für eine Beteiligung von p97 am Eisentransport. Neueren Untersuchungen zufolge spielt p97 keine Rolle beim Eisentransport (Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1103: 275-280, 1992; Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1093: 20-28, 1991 und; Richardson, D. R. und Baker, E. Biochem. Biophys. Acta. 1091: 294-302, 1991). Die physiologische Rolle von p97 in normalen und malignen Zellen ist noch unbestimmt.
Die Alzheimer-Krankheit ist aufgrund des Anstiegs der Anzahl und Langlebigkeit älterer Leute zu einem signifikanten Gesundheitsversorgungsproblem geworden. Für die nahe Zukunft wird prognostiziert, dass ein erheblicher Anteil der älteren Bevölkerung betroffen sein wird. Die Häufigkeit der Alzheimer-Krankheit steigt von 1% bei einem Alter von 65 Jahren stark an auf über 20% bei einem Alter von 80 Jahren. Oberhalb von 85 Jahren treffen die Diagnosekriterien für Alzheimer-Krankheit für fast die Hälfte der Bevölkerung der Vereinigten Staaten zu (Evans et al., J. A. M. A. 262: 2551-2556, 1989).
Es gibt zwei alternative "Kriterien", die zur klinischen Diagnose von Alzheimer-Krankheit verwendet werden: die DSM-IIIR-Kriterien und die NINCDS-ADRDA-Kriterien (die Akronyme sind für National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke (NINCDS) und die Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (AR- DRA); siehe McKhann et al., Neurology 34: 939-944, 1984). Zusammengefasst umfassen die Diagnosekriterien für Alzheimer-Krankheit unter DSM-IIIR (1) Demenz, (2) schleichender Beginn mit generell progressiv schlechter werdendem Verlauf, und (3) Ausschluss sämtlicher anderer spezifischer Ursachen für Demenz durch Krankengeschichte, physische Untersuchung und Labortests. Unter den DSM-IIIR-Kriterien versteht man unter Demenz "einen facettenreichen Verlust der intellektuellen Fähigkeiten, wie Gedächtnis, Urteilsfähigkeit, abstraktes Denken, und andere höhere kortikale Funktionen und Persönlichkeits- und Verhaltensänderungen." (DSM-1IR, 1987).
Die NINCDS-ADRDA-Kriterien legen drei Kategorien der Alzheimer-Krankheit fest, einschließlich "wahrscheinliche", "mögliche" und "bestimmte" Alzheimer-Krankheit. Die klinische Diagnose der "möglichen" Alzheimer-Krankheit erfolgt auf der Basis eines Demenz-Syndroms bei Fehlen anderer neurologischer, psychatrischer oder systemischer Störungen, die Demenz verursachen können. Die Kriterien für die klinische Diagnose der "wahrscheinlichen" Alzheimer- Krankheit umfassen (a) Demenz, festgestellt durch klinische Untersuchung und belegt durch einen Test, wie den Mini-Mental-Test (Foldstein et al., J. Psych. Res. 12: 189- 198, 1975); (b) Defizite bei zwei oder mehr Wahrnehmungsbereichen; (c) fortschreitende Verschlechterung des Gedächtnisses und anderer kognitiver Funktionen; (d) keine Bewußtseinsstörung; (e) einen Beginn zwischen 40 und 90 Jahren, oft nach 65 Jahren; und (f) ein Fehlen systemischer Ordnung oder andere Gehirnerkrankungen, die für Demenz verantwortlich sein könnten. Die Kriterien für bestimmte Alzheimer-Krankheit, umfassen einen durch Biopsie oder nach der Autopsie erhaltenen histopathologischen Beweis. Da die Bestätigung für bestimmte Alzheimer-Krankheit eine histologische Untersuchung einer Gehirn-Biopsie-Probe erfordert (die sich oft schwer erhalten lässt), wird diese selten zur Frühdiagnose der Alzheimer-Krankheit verwendet.
Die neuropathologische Diagnose der Alzheimer- Krankheit beruht üblicherweise auf der Anzahl der Plaques und Verflechtungen im Neurocortex (Frontal-, Temporal- und Parietal-Lappen), Hippocampus und in der Amygdala (Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097-1105; Esiri, "Anatomical Criteria for the Biopsy diagnosis of Alzheimer's Disease, "Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (Hrsg.), S. 239-252, 1990). Eine Diagnose der Alzheimer-Krankheit nur auf der Grundlage neuropathologischer Kriterien ist jedoch oft schwierig, da eine signifikante Anzahl von Plaques and Verflechtungen im Neurocortex, Hippocampus und in dev Amygdala bei normalen älteren Personen vorkommt. Zudem ist die Dichte der neocortikalen Plaques und Verflechtungen nur grob mit dem Ausmaß der Demenz korreliert.
Einige Forscher haben die Verwendung der quantitativen elektroenzephalographischen Analyse (EEG) zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit vorgeschlagen. Dieses Verfahren nutzt die Fourier-Analyse der Beta-, Alpha-, Theta- und Delta-Banden zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit (Riekkinen et al., "EEG in the Diagnosis of Early Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (Hrsg.), S. 159-167, 1990). Dieses Verfahren erzeugt jedoch Ergebnisse, die sich ohne Kontrolldaten (wie eine Routine-EEG) des gleichen Patienten vor dem Beginn der Alzheimer-Krankheit schwierig interpretieren lassen.
Andere Forscher versuchten die Alzheimer-Krankheit zu diagnostizieren, indem sie das Ausmaß der neuralen Atrophie bestimmten, da eine solche Atrophie gewöhnlich als Folge der Alzheimer-Krankheit akzeptiert wird. Beispiele für diese Verfahren umfassen Computertomographie (CT) und Kernspinresonanztomographie (MRI) (Leedom und Miller, "CT, MRI and NMR Spectroscopy in Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (Hrsg.), S. 297-313, 1990). Diese Verfahren sind zwar erfolgversprechend, jedoch lassen sich damit Alzheimer-Patienten nicht verlässlich von normalen älteren Personen unterscheiden (Bird, Frog. Neurobiol. 19: 91-115, 1982; Wilson et al., Neurology 32: 1054-1057, 1982; Yerby et al., Neurology 35: 1316-1320, 1985 Luxenberg et al., J. Neurol. Sci. 13: 570-572, 1986; und Friedland et al., Ann. Int. Med. 109: 298-311, 1988).
Andere Forscher haben entdeckt, dass der cerebrale Blutfluss oder Metabolismus im posterioren temporoparietalen cerebralen Cortex bei Patienten mit Alzheimer-Krankeit oft gesenkt ist. Diese Forscher versuchten daher, einen verminderten Blutfluss oder Metabolismus durch Positrönenemissionstomographie (PET) (Parks und Becker, "Positron Emission Tomographie and Neuropsychological Studies in Dementia", Alzheimer's Disease's, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giaobini (Hrsg.), S. 315-327, 1990), Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) (Mena et al., "SPECT Studies in Alzheimer's Type Dementia Patients", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (Hrsg.), S. 339-355, 1990) und Xenoninhalationsverfahren (Jagust et al., Neurology 38: 909-912; Prohovnik et al., Neurology 38: 931-937 und Waldemar et al., Senile Dementias: II International Symposium, S. 399-407, 1988) zu messen. Diese Verfahren sind jedoch anscheinend unempfindlich gegenüber Beschädigungen von Strukturen, wie Hippocampus und Amygdala, die wahrscheinlich die Stellen für Schäden in den frühesten Stadien der Alzheimer-Krankheit sind. Die Patienten können daher einen erheblichen Gedächtnisverlust und dennoch keine Anomalien im cerebralen Blutstrom oder Metabolismus aufweisen.
Verschiedene Forscher versuchten ebenfalls, die Alzheimer-Krankheit immunologisch zu diagnostizieren (Wolozin, "Immunochemical Approaches to the Diagnosis of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (Hrsg.), S. 217- 235, 1990). Wolozin und seine Mitarbeiter (Wolozin et al., Science 232: 648-650, 1986) erzeugten einen monoklonalen Antikörper "Alz50", der mit einem 68 kDa Protein "A68" reagiert, das in den Plaques und Nervenknäueln von Alzheimer-Patienten exprimiert wird. Durch Verwendung des Antikörpers Alz50 und Western-Blot-Analyse wurde A68 in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) einiger Alzheimer-Patienten und nicht im CSF normaler älterer Patienten nachgewiesen (Wolozin und Davies, Ann. NeuroI. 22: 521-526, 1987). Dieses Verfahren ist z. Zt. als bestimmtes Verfahren zum Diagnostizieren von Alzheimer-Krankheit nicht geeignet, da nachweisbare Mengen A68 in keinem Patienten mit "wahrscheinlicher" Alzheimer-Krankheit (wie vorstehend definiert) gefunden werden konnte.
Einige Forscher versuchten, genetische Marker für Alzheimer-Krankheit zu identifizieren. Die genetische Anomalie wurde in einigen Familien zwar Chromosom 21 zugeordnet (St. George Hyslop et al., Science 235: 885-890, 1987), jedoch wurden diese Marker auf Chromosom 21 nicht bei anderen Familien mit frühem und spätem Beginn der Alzheimer-Krankheit gefunden (Schellenberg et al., Science 241: 1507-1510, 1988).
Andere versuchten, neurochemische Marker für die Alzheimer-Krankheit zu identifizieren. Neurochemische Marker, die mit Alzheimer-Krankheit einhergehen, umfassen reduzierte Acetylcholinesterase-Spiegel (Giacobini und Sugaya, "Markers of Cholinergic Dysfunction in Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker und Giacobini (Hrsg.), S. 137-156, 1990), reduziertes Somatostatin (Tamminga et al., Neurology 37: 161-165, 1987), ein negatives Verhältnis zwischen Serotonin und 5-Hydroxyindolessigsäure (Volicer et al., Arch. Neurol. 42: 127-129, 1985), einen größeren, durch Probenecid induzierten Anstieg der Homovanillinsäure (Gibson et al., Arch. Neurol. 42: 489-492, 1985) und reduzierte nervenspezifische Enolase (Cutler'et al., Arch. Neurot. 43: 153-154, 1986). Keiner dieser Marker ist jedoch empfindlich oder spezifisch genug, dass eine Frühdiagnose der Alzheimer-Krankheit gestellt werden kann (siehe Elby, "Early Diagnosis of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease: Current Research in Early Diagnosis, Becker und Giacobini (Hrsg.), Taylor & Francis (Veröff.), N.Y., S. 19-30, 1990).
Alzheimer-Krankheit lässt sich nicht nur schwer diagnostizieren, sondern auch schwer behandeln. Die Entdeckung, dass die Acetylcholinesterase-Spiegel im Cortex und Hippocampus bei Alzheimer-Patienten erheblich reduziert sind (Bowen et al., Brain 99: 459-496, 1976) hat die Entwicklung einer Anzahl pharmazeutischer Verbindungen ergeben, die die cholinerge Funktion wiederherstellen oder ersetzen. Beispiele für solche Verbindungen umfassen Tacrin (THA) (Summers et al., N. Eng. J. Med. 315: 1241-1245); die orale Verabreichung von Cholin und Lecithin (Etienne et al., Neurology 31; 1552-1554, 1981); Huperzin A und B (Tank et al., "Studies an the Nootropic Effects of Huperzine A and B: Two Selective AChE-Inhibitors", Current Research in Alzheimer's Therapy, Giacobini and Becker (Hrsg.); S. 289-393, 1988); Galanthamin (Domino, "Galanthamine: Another Look at an Old Cholinesterase Inhibitor", Current Research in Alzheimer's Therapy, Giacobini and Becker (Hrsg.), S. 295-303, 1988); Methansulfonylfluoride (bloss et al., "Methansulfonyl Fluoride: A CNS Selective Cholinesterase Inhibitor", Current Research in Alzheimer's Therapy, Giacobini and Becker (Hrsg.), S. 305- 314, 1988); Physostigmine, an irreversible inhibitor of Acetylcholinesterase (Johns et al., Banbury Report 15: 435-449, 1983); und Physostigmin-Derivate (Brufani et al., "From Physostigmine to Physostigmine Derivatives as New Inhibitors of Cholinesterase", Current Research in Alzheimer's Therapy, Giacobini and Becker (Hrsg.), S. 343-352, 1988). Diese Verbindungen waren gewöhnlich jedoch nur eingeschränkt erfolgreich.
Bei der steigenden Zahl an Alzheimer-Patienten ist es wichtig, dass neue Verfahren zur Beobachtung und Behandlung der Erkrankung entdeckt werden. Die Erfindung stellt Verfahren zur Beobachtung der Alzheimer-Krankheit, sowie Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung derselben bereit. Diese Verfahren und Zusammensetzungen überwinden die Nachteile der Verfahren und Zusammensetzungen des Standes der Technik und stellen andere damit einhergehende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben überraschend entdeckt, dass p97 ein Protein mit GPI-Anker ist. Das GPI-Anker-Protein lässt sich mit einem Enzym umsetzen, das den GPI-Anker spal et, so dass man ein gespaltenes GPI-Anker-p97-Protein erhält. Das gespaltene p97 lässt sich mit einem neuen semikontinuierlichen Verfahren herstellen. Andere gespaltene GPI- Ankerproteine können auch mit dem neuen semikontinuierlichen Verfahren hergestellt werden.
Die Erfinder haben ebenfalla unerwarteterweise eine lösliche p97-Form entdeckt, die hydrophil ist und nach der Triton X-114-Phasentrennung ausschließlich in der wässrigen Phase vorliegt. Sie enthält kein Ethanolamin und besitzt eine langsamere Transportgeschwindigkeit als das p97 mit GPI-Anker. Die lösliche p97-Form kann in biologischen Flüssigkeiten, wie der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), im Blut oder Urin zugegen sein.
Die Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass p97 am Eisentransport beteiligt ist. Das auf der Zelloberfläche exprimierte p97 mit GPI-Anker bindet Eisen und das gebundene Eisen wird nach Phospholipase-Behandlung freigesetzt. p97 und Transferrin wird ebenfalls in den Endothelzellen der Gehirnkapillaren in normalen Kontrollen sowie in pathologischen Gehirnen exprimiert. Der Großteil des p97-Moleküls ist intrazellulär, und seine Expression erfolgt gleichzeitig mit dem Transferrinrezeptor. Die EM Zeit ebenfalls, dass p97 die Blut-Hirnschranke überwindet. Es bindet ebenfalls an eine lösliche Form des Transferrinrezeptors. Die Ergebnisse der Affinitätschromatographie-Experimente lassen darauf schließen, dass es einen Rezeptor gibt, der p97 und den Transferrinrezeptor gleichzeitig erkennt.
Diese Befunde belegen, dass sich p97 zur Modulation der Eisenaufnahme in Zellen verwenden lässt. Die Eisenaufnahme in Zellen konnte durch Verändern der p97- Konzentration, Hemmung der p97-Bindung an Eisen oder den Transferrinrezeptor oder Hemmung der Bindung an den Rezeptor, der p97 und den Transferrinrezeptor gleichzeitig erkennt, moduliert werden. Folglich sind p97 und Stimulantien, Agonisten oder Antagonisten von p97 zur Behandlung von Zuständen geeignet, bei denen der Eisenmetabolismus gestört ist. Diese Substanzen eignen sich zur Behandlung von Zuständen, wie Hämochomatose, neurodeyenerativen Erkrankungen, ischämischer Gewebeschädigung, einschließlich ischämischem Schlaganfall oder Trauma, Herzerkrankung, und Tumore, insbesondere Hautkrebs.
Der Entdeckung einer Funktion von p97 beim Eisentransport, und insbesondere der Befund, dass p97 die Blut- Hirnschranke durchquert, legen nahe, dass p97 zum Transportieren von Substanzen, wie Therapeutika, über die Blut- Hirnschranke verwendet werden kann.
Die Erfinder haben ebenfalls entdeckt, dass reaktive Mikrogliazellen, die mit senilen Plaques bei Alzheimer- Krankheit einhergehen, p97 und den Transferrinrezeptor exprimieren. p97 und der Transferrinrezeptor lassen sich zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit verwenden. Der Befund, dass Amyloid-Protein ablagernde Mikrogliazellen einen hohen Spiegel an Proteinen aufweisen, die bei der Eisenbeschaffung wirken, legt ebenfalls Verfahren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit nahe, die auf der Verarmung von Eisen aus diesen Zellen beruht, wobei Substanzen, wie p97, Transferrin und Eisenchelatoren verwendet werden, wie Lactoferrin, Ferritin, und Ovotransferrin.
Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Diagnostizieren und Beobachten der Alzheimer-Krankheit bereit, sowie Zusammensetzungen und Verfahren, die sich zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit eignen. Innerhalb eines Aspektes der Erfindung werden Verfahren zum Beobachten der Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend das Nachweisen des Vorliegens von löslichem p97 in einem Patienten. Bei verschiedenen Ausführungsformen kann p97 in verschiedenen Körperflüssigkeiten, einschließlich bspw. Urin, Blut und Cerebrospinalflüssigkeit, nachgewiesen werden. Verschiedene Verfahren lassen sich zum Nachweisen von p97 verwenden, wie bspw. mit Radioimmungssays, Kompetitionsassays und ELISA (enzyme linked immunosorbant assays), wie dem Sandwich-Assay. Unter weiteren Aspekten der Erfindung werden Verfahren zum Beobachten der Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend das Nachweisen von vorhandenen Transferrinrezeptoren, und/oder das Nachweisen von vorhandenem p97 auf Mikrogliazellen, die in einem Patient mit Amyloid-Plaques einhergehen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Es zeigt/zeigen:
Fig. 1 die Struktur eines GPI-Ankers.
Fig. 2A-F die Nukleinsäuresequenz von p97.
Fig. 3 schematisch pWJ218.
Fig. 4 schematisch Plasmid D5-9 (+).
Fig. 5 eine Reihe von Schaubildern, welche die Freisetzung von p97 durch PI-PLC-Behandlung mittels Durchflusszytometrie zeigen.
Fig. 6 zwei Western-Blots; welche die Wirkung von bakteriellem PI-PLC auf p97 veränschaulicht, das an der Oberfläche von SK-MEL-28 Zellen und bei einer Zelllinie exprimiert wird, die mit menschlicher p97-cDMA transfiziert ist.
Fig. 7, ein Western-Blot, die Ergebnisse der Markierung von p97 mit [³H]-Ethanolamin.
Fig. 8, ein Western-Blot, die Ergebnisse der Markierung von p97 mit [³H]-Ethanolamin.
Fig. 9, ein Western-Blot, die Ergebnisse einer Phasentrennung von p97 und TR in Triton-X-114-Lösung.
Fig. 10 eine Reihe von Schaubildern, die eine FACS- Analyse von SK-MEL-28-, WTB p97aWTBc 3- und TRVb-1- Zelllinien darstellen, die ohne Primärantikörper (Kontrolle), L235, und OKT9 gefärbt sind.
Fig. 11 eine Reihe von Autoradiogrammen, welche die Wirkung der Biosynthese-Markierung auf SK-MEL-28-, WTB, und p97aWTBc 3-Zellen zeigen.
Fig. 12, ein Autoradiogramm, die Ergebnisse eines [³&sup5;S] Methionin-Pulse-Chase-Experimentes.
Fig. 13, ein Autoradiogramm, den Erwerb einer Resistenz gegenüber Endo-H-Spaltung beim Transport von p97 und TR in SK-MEL-28-Zellen.
Fig. 14, ein Autoradiogramm, dass in Triton-X-114 die sezernierte p97-Form in die wässrige Phase verteilt wird.
Fig. 15, ein Autoradiogramm, die Ergebnisse der biosynthetischen Markierung von p97 mit [³H]-Ethanolamin und anschließender Triton-X-114-Trennung.
Fig. 16, ein Autoradiogramm, dass die auf der Zelloberfläche exprimierten membranassoziierten TR- und p97-Moleküle nicht freigesetzt werden.
Fig. 17, eine Reihe von Photographien von menschlichen Gehirnschnitten, eine immunohistochemische Färbung auf p97, Transferrin und den Transferrinrezeptor.
Fig. 18, elektronenmikroskopische Aufnahmen, mit L235-Antikörper markierte menschliche Hirnschnitte.
Fig. 19A, ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der mit anti-p97 und anti-β, Amyloid- Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19B, ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Erkrankung, der mit anti-p97-Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19C, ein Foto eines Schnittes eines negativen Kontroll-Gehirns, der mit anti-p97-Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19D, ein Foto eines Schnittes von Endothelien aus einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit, der mit antip97-Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19E eine Vergrößerung von Fig. 19D.
Fig. 19F ein Foto eines Schnittes von Mikrogliazellen, das mit anti-p97-Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19 G eine Vergrößerung von Fig. 19F.
Fig. 19H ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der mit anti-p97 und anti-β-Amyloid- Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19I ein Foto eines benachbarten Schnitts des in Fig. 19H gezeigten Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der mit anti-HLA-DR- und anti-β-Amyloid-Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19J ein Foto eines Schnittes, das mit anti-p97- Antikörpern gefärbt wurde.
Fig. 19L ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der mit anti-p97-Antikörpern und ohne PI-PLC-Behandlung gefärbt wurde.
Fig. 19M ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der vor dem Färben mit anti-p97- Antikörpern mit PI-PLC behandelt wurde.
Fig. 19N ein Foto eines Schnittes eines Gehirns mit Alzheimer-Krankheit, der mit adsorbiertem anti-p97, antip97-Antikörpern (d. h. nicht reaktiv mit p97) gefärbt wurde.
Fig. 20 zwei Western-Blots von Membran- und Cytoplasmaproben aus einem Gehirn mit Alzheimer-Krankheit, und SK-MEL-28, WTB und p97aWTBc3-Zellen, die entweder mit L235-Antikörper oder ohne Erstantikörperkontrolle gefärbt wurden.
Fig. 21, eine Reihe von Autoradiogrammem, den Nachweis von p97 in Cerebrospinalflüssigkeit von Alzheimer- Patienten.
Fig. 22, eine Reihe von Autoradiogrammen, lösliches und membrangebundenes p97 und den Transferrinrezeptor.
Fig. 23 eine Fluoreszenzmarkierung von CHO-Zellen, die mit L235 und fluoreszierendem Sekundärantikörper markiert wurden.
Fig. 24, ein Schaubild einer Batch-Anzucht von CHO- Zellen, die Zeltkonzentration und den Glucose-Verbrauch als Funktion der Zeit anzeigt.
Fig. 25, ein Schaubild, die Batch- Zellproteinexpression als Funktion der Zeit.
Fig. 26, ein Schaubild, die Beseitigung von p97 von der Zeltoberfläche als Funktion der PI-PLC-Konzenzration.
Fig. 27, ein Schaubild, die Gewinnung von p97- Expression nach der PI-PLC-Behandlung.
Fig. 28, ein Schaubild, die kumulative zeltspezifische Proteinfreisetzung durch PI-PLC als Funktion des Erntezyklus.
Fig. 29, ein Schaubild, die Zeltlebensfähigkeit, Zeltdichte, geerntetes zeltspezifisches p97 und die zeltspezifische Glucoseaufnahmegeschwindigkeit, die am Ende jedes 48 stündigen Erntezyklus beurteilt wurde.
Fig. 30, ein Schaubild, die p97-Gewinnung in PI-PLC- Lösung für den 48 stündigen Erntezyklus.
Fig. 31, ein Foto eines SDS-Polyacrylamidgels, das mit PI-PLC gewonnene p97 und das direkt in das Medium freigesetzte p97.
Fig. 32, ein Schaubild, die Zählimpulse pro Minute von [&sup5;&sup5;Fe], assoziiert mit den TRVB-, TRVB-1- und p97TRVB- Zelllinien.
Fig. 33, zwei Schaubilder, die Zählimpulse pro Minute von [&sup5;&sup5;Fe], assoziiert mit den TRVB-, TRVB-1- und p97TRVB-Zeltlinien vor (A) und nach (B) der PI-PLC- Behandlung.
Fig. 34, ein Autoradiogramm, die Reinigung von p97 durch Affinitätschromatographie.
Fig. 35, ein Autoradiogramm, dass p97 gegenüber Endo-H-Spaltung resistent ist.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben wie vorstehend beschrieben überraschend entdeckt, dass membrangebundenes p-97 ein Protein mit GPI-Anker ist. Die Erfindung stellt folglich p97 mit GPI-Anker bereit, das mit der Plasmamembran verbunden ist. Das p97 mit GPI-Anker ist dadurch gekennzeichnet, dass es gegenüber Enzymen, von denen bekannt ist, dass sie die Membrananker spalten, empfindlich ist. Daher kann mit Enzymen, wie bakteriellem PI-PLC, eine gespaltene p97-Form von der Membran freigesetzt werden. Die Erfindung stellt somit auch ein Verfahren zum Isolieren einer mit Phospholipase gespaltenen p97-Form von der Zeltoberfläche durch Spaltung mit einem Enzym bereit, das einen GPI-Anker spalten kann, und zwar vorzugsweise PI-PLC. Das Vorhandensein des GPI-Ankers kann durch Sensitivität gegenüber PI-PLC, Insensitivität gegenüber Pronase, Verteilungsverhalten in der Detergensphase von Triton X-114 und durch metabolische Markierung mit [³H]-Ethanolamin gezeigt werden.
Die Erfinder haben ebenfalls überraschend eine lösliche p97-Form entdeckt. Die lösliche p97-Form kommt ausschließlich in der wässrigen Phase nach der Triton-X114- Phasentrennung vor und enthält keinen GPI-Anker oder Ethanolamin. Die Zeltoberflächen-Biotinylierung von membrangebundenem p97 bestätigte, dass p97 mit GPI-Anker nicht in das Medium abgegeben wird und dass p97 in zwei unterschiedlichen Formen vorkommt, und zwar einer membrangebundenen und einer löslichen Form. Die überraschende Entdeckung einer löslichen p97-Form lässt darauf schließen, dass lösliches p97 an der Bindung von Eisen in Lösung und der anschließenden Vermittlung seiner Aufnahme über ein Rezeptorsystem ähnlich dem Transferrinrezeptorsystem beteiligt ist.
Die biologische Aktivität der membrangebundenen löslichen und mit Phospholipase gespaltenen Formen von p97 und deren Derivaten, lässt sich leicht vom Durchschnittsfachmann vornehmen, bspw. durch Eisenbindungsassays. Die biologische Aktivität von löslichem p97 lässt sich durch Titrieren von Aliquots von Eisen (Eisen(III)nitrilotriacetat oder "FeNTA") in Lösungen mit 1,2 mg/ml eisenfreiem p97 in 0,025 M Tris-HCl, 0,01 M NaHCO&sub3;, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,8 bestimmen. Die Eisenbindung an lösliches p97 lässt sich durch einen Anstieg der Extinktion (gemessen bei 420 nm) bestimmen. Bei einer anderen Ausführungsform kann die biologische Aktivität von p97, das in der Zellmembran verankert ist, ebenfalls bestimmt werden (siehe Brown et al., Nature 296: 171-173, 1982). Zusammengefasst werden bei einer Ausführungsform Melanomzellen (bspw. SK-MEL-28) dreimal mit 25 ml phosphitgepufferter Saline (PBS), pH-Wert 7,2, gewaschen und 1 Std. bei 37º mit 10 ul PBS, das 2 mM NaHCO&sub3;, 1 mM Natriumcitrat und 10&sup7; cpm &sup5;&sup9;FeCl&sub3; oder &sup5;&sup5;FeCl&sub3; enthält, inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und dann in 40 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 100 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,5~ Nonidet- P40 enthält und mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid angereichert ist, lysiert und anschließend 1 Std. bei 4ºC und 300000 g zentrifugiert. Ein anti-p97-Antikörper (bspw. L235 oder 96.5 wie vorstehend beschrieben) wird zum Lysat bei einer Konzentration von etwa 5 ug/ml dazugegeben, was dann wiederum durch eine 0,2 ml Protein-A-Sepharose-CL-4B- Säule bei 4ºC geschickt wird. Die Lösung wird dann gewaschen und mit 2 ml 100 mM Citratpuffer (pH-Wert 5), der 0,5% Nonidet P40 enthält, eluiert. Das Festhalten von &sup5;&sup9;Fe oder &sup5;&sup5;Fe in der Säule zeigt die Bindung von p97 an Eisen an.

HERSTELLUNG VON P97

Unter einem Aspekt der Erfindung werden wie vorstehend beschrieben Verfahren zum Herstellen einer gespaltenen p97-Form bereitgestellt, umfassend den Schritt Inkubieren einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche p97 exprimiert, mit einem Enzym, das Phospholipidanker spaltet. Vor der Erfindung war es einfach äusgedrückt unbekannt, dass das p97-Protein über einen Glycosylphosphatidylinositol- (GPI)-Anker an der Zeltoberfläche verankert ist (siehe Fig. 1). Verschiedene Enzyme zeigen eine Spezifität gegenüber GPI-Bindungen. Diese lassen sich erfindungsgemäß zur Spaltung des GPI-Ankers verwenden. Beispiele dafür umfassen bakterielle Phosphatidylinositol-Phospholipase Cs (PI- PLCs) (siehe Ikezawa et al., Methods Enzymol. 71: 731-741, 1981: Taguchi et al., Arch. Biochem. Biophys. 186: 196- 201, 1978; Low, Methods Enzymol. 71: 741-746, 1981), eukaryotische GPI-PLCs (siehe Ferguson et al., J. Biol. Chem. 260: 4963-68, 1985; Bulow et al., FEBS Lett. 187: 105-110, 1985), und eukaryotische Phospholipase Ds (GPI-PLD2 oder "PLD") (siehe Malik et al., Biochem. J. 240: 519-527, 1986) (siehe allgemein in Ferguson und Williams, "Cell- Surface Anchoring of Proteins via Glycosyl- Phosphatidylinositol Structures, "Ann. Rev. Biochem. 57: 285-320, 1988).
Ein besonders bevorzugtes GPI-Enzym ist Phospholipase C (PI-PLC), das sich entweder aus bakteriellen Quellen gewinnen lässt (siehe Low, "Phospholipase Purification and Quantification" The Practical Approach Series: Cumulative Methods Index, Rickwood and Hames, Hrsg. IRC Press, Oxford, N.Y., N.Y., 1991 Kupe et al., Eur. J. Biochem. 185: 151-155, 1989 Volwerk et al., J. Cell. Biochem. 39: 315- 325, 1989) oder aus rekombinanten Quellen (Koke et al., Protein Expression and Purification 2: 51-58, 1991; und Henner et al., Nuc. Acids Res. 16: 10383, 1986).
p97 kann von der Oberfläche einer Anzahl von Zellen gespalten werden, einschließlich bspw. SK-MEL-28-Zellen (American Type Culture Collection Nr. HTB 72) (siehe ebenfalls Real et al., PNAS USA 85: 3965-3969, 1988; und Real et al., Can. Res. 45: 4401-4411, 1985), sowie Zellen, die mit einem Vektor infiziert oder transfiziert wurden, der p97 exprimiert (siehe unten). Das gespaltene (solubilisierte) p97 kann wünschenswerterweise dann mit Verfahren gereinigt werden, die ebenfalls eingehender unten beschrieben sind; wie u. a. Affinitätschromatographie.
Die lösliche p97-Form lässt sich herstellen durch Züchten von Zellen, welche das lösliche p97 enthalten, durch die log-Phase des Zellwachstums und Ernten des Überstandes. Der Überstand wird vorzugsweise gesammelt, bevor die Zellen Konfluenz erreichen. Lösliches p97 kann dann wie nachstehend beschrieben gereinigt werden, damit isoliertes lösliches p97 gewonnen wird. Verfahren zum Reinigen des löslichen p97 lassen sich dann auf der Grundlage der Hydrophilie des löslichen p97 auswählen. Lösliches p97 lässt sich z. B. leicht durch Triton-X-114-Phasentrennung erhalten.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung lassen sich p97 oder Derivate davon rekombinant erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann p97 codierende DNA durch Amplifikation über Polymerasekettenreaktion (PCR) der p97-Sequenz erhalten werden (siehe allgemein US-Patente 4 683 202, 4 683 195 und 4 800 159; siehe ebenfalls PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplifikation, Erlich (Hrsg.) Stockton Press, 1989). Zusammengefasst wird doppelsträngige DNA aus Zellen, die p97 exprimieren (bspw. SK-MEL-28-Zellen) durch Erhitzen denaturiert in Gegenwart wärmestabiler Taq-Polymerase, seqeunzspezifischer DNA- Primer, wie 5' GCGGACTTCCTCGG 3' (Sequenz-ID-Nr. 4) und 5' TCGCGAGCTTCCT 3' (Sequenz-ID-Nr. 5), ATP, CTP, GTP und TTP. Doppelsträngige DNA wird erhalten, wenn die Synthese beendet ist. Dieser Zyklus kann mehrmals wiederholt werden, was zu einer faktoriellen Amplifizierung von p97-DNA führt. Die amplifizierte p97-DNA lässt sich dann wie nachstehend beschrieben leicht in einen Expressionvektor einbringen.
Alternativ kann DNA, die p97 codiert, isoliert werden, indem die von Brown et al. in der UK-Patentanmeldung GB 2188 637 beschriebenen Klonierungestechniken verwendet werden. Klone, die Sequenzen enthalten, welche p97-cDNA codieren, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter den Hinterlegungsnummern CRL 8985 (PMTp97b) und CRL 9304 (pSVp97a) hinterlegt.
Erfindungsgemäß können p97 und dessen Derivate verschiedene Strukturformen des Primärproteins umfassen, die die biologische Aktivität beibehalten. Ein p97-Protein kann bspw. in Form saurer oder basischer Salze oder in neutraler Form zugegen sein. Zudem können einzelne Aminosäurereste durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein. Darüber hinaus können an den Aminosäure- oder DNA- Nukleinsäuresequenzen verschiedene Substitutionen, Deletionen, oder Additionen vorgenommen werden, deren Nettowirkung die Beibehaltung der biologischen p97-Aktivität ist. Aufgrund des degenerierten Codes kann es bspw. eine erhebliche Abweichung bei Nukleotidsequenzen geben, die die gleiche Aminosäuresequenz codieren.
Andere erfindungsgemäße p97-Derivate umfassen Konjugate von p97 mit anderen Molekülen, wie Proteinen oder Polypeptiden. Dies erfolgt bspw. durch Synthese von Nterminalen oder C-terminalen Fusionsproteinen, wodurch die Reinigung oder Identifizierung von p97 erleichtert wird (siehe US-Patent 4 851 341, sowie ebenfalls Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988). Somit lassen sich Fusionsproteine herstellen, indem der N-terminale oder C- terminale oder andere Abschnitte von p97 mit der Sequenz eines selektierten Proteins mit einer gewünschten biologischen Funktion mittels Rekombinationstechniken fusioniert wird. Die resultierenden Fusionsroteine enthalten p97 oder einen Abschnitt davon, der mit dem selektierten Protein fusioniert ist. Beispiele für Proteine, die sich zur Herstelung von Fusionsproteinen auswählen lassen, umfassen Lymphokine, wie Gamma-Interferon, Tumornekrosefaktor, IL- 1, IL-2, IL-3, Il-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF. Besonders bevorzugte Moleküle sind u. a. Nervenwachstumsfaktor und der Fc-Teil von Immunoglobulin-Molekülen.
Sequenzen, die die vorstehend beschriebenen Moleküle codieren, können gewöhnlich von einer Reihe von Quellen erhalten werden, wie bspw. von Hinterlegungsstellen, welche Plasmide enthalten, die Sequenzen codieren, wie von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockwille, Maryland) und der British Biotechnology Limited (Cowley, Oxford England). Beispiele für solche Plasmide umfassen BBG 12 (mit dem GM-CSF-Gen, das das reife Protein mit 127 Aminosäuren codiert), BBG 6 (mit Sequenzen, die reifes Gamma- Interferon codieren), ATCC Nr. 39656 (mit Sequenzen, die TNF codieren), ATCC Nr. 20663 (mit Sequenzen, die alpha- Interferon codieren), ATCC Nr. 31902 und 39517 (mit Sequenzen, die Beta-Interferon codieren), ATCC Nr. 67024 (mit einer Sequenz, die Interleukin-1β codiert), ATCC Nr. 39405, 39452, 39516, 39626 und 39673 (mit Sequenzen, die Interleukin-2 codieren), ATCC Nr. 59399, 5939$ und 67326 (mit Sequenzen, die Interleukin-3 codieren), ATCC Nr. 57592 (mit Sequenzen, die Interleukin-4 codieren), ATCC Nr. 59394 und 59395 (mit Sequenzen, die Interleukin-5 codieren) und ATCC NR. 67153 (mit Sequenzen, die Interleukin-6 codieren.
Bei einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird p97 in einen Expressionsvektor als Fusionsgen mit der konstanten Region von menschlichem Immunglobulin γ1 kloniert. Die Expressionvektoren pNUTΔGH und pVL1393 werden zum Klonieren vorbereitet durch SmaI- Spaltung und anschließende Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm. Das lineare Produkt wird nach Agarosegelelektrophorese isoliert. Die p97-Gene werden dann durch Polymerasekettenreaktion erzeugt, wobei die klonierte p97-cDNA als Matrize verwendet wird. Die Fusion p97 wird insbesondere aus WJ47 synthetisiert, wobei die 5'-Primer die Koordinaten 36 bis 60 umfassen (wobei die Koordinaten auf der cDMA-Karte beruhen) und zudem eine SnaBI-Restriktionsstelle enthalten. Die Sequenz von WJ47 ist 5'-GCG C CT CGA GGC CCC AGC CAG CCC CGA CGG CGC C-3' (Seq.-ID-Nr. 10). Der 3'-Primer für die Fusion p97, WJ46 umfasst die Koordinaten 2172 bis 2193 und enthält zusätzlich eine BclI-Restriktionsstelle. Die Sequenz von WJ46 ist 5'-CGC GTA CGT A CC CGA GCA CTG CTG AGA CGA C-3' (Seq.ID-Nr. 9). Das erhaltene amplifizierte p97- Produkt hat nicht die hydrophobe Domäne von p97. Nach der Amplifizierung wird dieses Produkt mit SnaBI und BclI gespalten.
Der konstante Bereich des menschlichen γ1-Gens wird dann aus dem pUCB7Ig-Promotor hergestellt. Das CH-Gen wird zusammengefasst isoliert durch Spaltung mit XbaI, das am 3'-Ende des Gens spaltet, und anschließender Behandlung mit E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart von allen 4 dNTPs, so dass ein stumpfes Ende ensteht. Das Plasmid wird dann mit BclI gespalten, welches am 5'-Ende des Gens spaltet. Das Fragment, das das Schwere-Ketten-Gen enthält, wird nach Elektrophorese in einem Agarosegel isoliert.
Das amplifizierte p97-Fusionsfragment wird in jeden vorbereiteten Vektor zusammen mit dem Schwere-Ketten- Fragment eingebracht. Die Orientierung des resultierenden Plasmids wird durch PCR bestimmt mit einem Priming- Oligonukleotid, das mit der Vektorsequenz hybridisiert, und einem weiteren Priming-Oligonukleotid, das mit der Insertionssequenz hybridisiert. Geeignete Restriktionsspaltungen lassen sich zur Verifizierung der Orientierug durchführen. Die Sequenz des Fusions-p97/Immunglobulin- Kontanter-Bereich-Gen lässt sich durch DNA-Sequenzierung verifizieren.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden verkürzte p97-Derivate bereitgestellt. Zum Beispiel kann stellengerichtete Mutagenese mit dem Oligonukleotid WJ31 5'-CTCAGAGGGCCGCTGCGCCC-3' (Seq.-ID. Nr. 6) durchgeführt werden, damit die C-terminale hydrophobe Domäne hinter Nukleotid 2219 (siehe Fig. 2) deletiert wird, oder mit dem Oligonukleotid WJ32 5'-CCA GCG CAG CTAGCGGGGGCAG -3' (Seq.-ID. Nr. 7), damit eine Nhe I-Stelle und ein Stop- Codon in den Bereich der Nukle~ötide 1146-1166 eingebracht wird, und dadurch ebenfalls eine verkürzte Form von p97 konstruiert wird, die nur die N-Terminale Domäne umfasst. Entsprechend kann die Mutagenese auch mit p97 durchgeführt werden, so dass nur die C-terminale Domäne exprimiert wird. Bei einer Ausführungsform werden die Xho-Stellen durch Mutagenese mit dem Oligonukleotid WJ 5' ACAC- CAGCGCAGCTCGAGGGGCAGCCG -3' (Seq.-ID. Nr. 8) in die Nterminale und die C-terminale Domäne eingebracht, was die anschließende Deletion der Nterminalen Domäne ermöglicht. Verschiedene andere Restriktionsenzyme können ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden, damit man Deletions- oder verkürzte Derivate von p97 herstellt, bspw. EcoRI.
Mutationen der Nukleotidsequenzen, die für die Expression der p97-Derivate konstruiert wurden, müssen das Leserater der codierenden Sequenzen bewahren. Die Mutationen schaffen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die hybridisieren könnten und sekundäre mRNA-Strukturen erzeugen könnten, wie Schleifen- oder Haarnadel- Strukturen, die die Translation der Rezeptor-mRNA beeinträchtigen könnten.
Mutationen lassen sich lassen sich an bestimmten Stellen durch Synthese von Oligonukleotiden einbringen, die eine mutierte Sequenz enthalten. Diese wird von Restriktionsstellen flankiert, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Derivat, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, -Substitution oder Deletian aufweist.
Alternativ können wie vorstehend erwähnt oligonukleotidgerichtete stellenspezifische Mutagenese-Prozeduren verwendet werden, damit ein verändertes Gen mit bestimmten Codons, die entsprechend der geforderten Substitution, Deletion oder Insertion verändert wurden. Deletions- oder verkürzte Derivate von p97 können ebenfalls konstruiert werden, indem geeignete Restriktionsendonukleasestellen neben der gewünschten Deletion verwendet werden. Nach der Restriktion können Überhänge aufgefüllt werden, und die DNA kann religiert werden. Beispielhafte Verfahren zur Erzeugung der vorstehend genannten Veränderungen sind offenbart von Sambrook et al. (Molecular cloning. A Laboratory Manual, z. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird p97 in einen Expressionsvektor als verkürztes Gen kloniert. Kurz gesagt werden die Expressionvektoren pNUTΔGH und pVL1393 zum Klonieren vorbereit, und zwar durch Spaltung mit SmaI und anschließende Dephosphorylierung durch alkalische Phosphatase aus Kälberdarm. Das lineare Produkt des Vektors nach der Agarosegelelektrophorese isoliert. Das p97-Gen wird dann durch Polymerasekettenreaktion (PCR) mit der klonierten p97-DNA als Matrize erzeugt. Das verkürzte p97 wird aus WJ47 synthetisiert, wobei der 5'-PCR-Primer die Koordinaten 36 bis 60 (die Koordinaten beruhen auf der cDMA-Karte) umfasst, und zudem eine SnaBI-Restriktionsstelle enthält. Die Sequenz von WJ47 ist 5'-GCG C CT CGA GGC CCC AGC CAG CCC CGA CGG CGC C-3' (Seq.-ID.-Nr. 10). Der 3'-Primer WJ48 umfasst die Köordinaten 2172 bis 2193 und enthält zudem ein TGA- Terminations-Codon und eine SnaBI-Restriktionsstelle. Die DNA-Sequenz von WJ48 ist 5'-CGC G TG ATC ATC AGC CCG AGC ACT GCT GAG ACG AC-3' (Seq.-ID-Nr. 11). Nach der Amplifizierung wird das verkürzte p97-Produkt mit SnaBIgespalten und in pNUTΔGH und pVL1393 durch eine T4-DNA- Ligasereaktion eingebracht. Die Orientierungen der resultierenden Plasmide lassen sich durch PCR mit einem Priming-Oligonukleotid bestimmen, das mit der Vektorsequenz hybridisiert, und einem anderen. Priming-Oligonukleotid, das mit der Insertionssequenz hybridisiert. Alternativ lassen sich geeignete Restriktionsspaltungen zur Verifizierung der Orientierung durchführen. Die Expression der amplifizierten Sequenz führt zur Produktion eines p97- Proteins, dem die hydrophobe Domäne fehlt.
Die Erfindung stellt wie vorstehend erwähnt rekombinante Expressionsvektoren bereit, die entweder synthetische DNA-Fragmente oder solche, die von cDNA herrühren, umfassen, und die p97 oder Derivate davon codieren, die funktionsfähig mit regulatorischen Transkriptions- oder Translationselementen verbunden sind. Geeignete regulatorische Elemente können von einer Anzahl von Quellen stammen, einschließlich Bakterien-, Pilz-, Virus-, Säugetier oder Insektengenen. Die Auswahl geeigneter regulatorischer Elemente hängt von der gussgewählten Wirtszelle ab und kann leicht vom Durchschnittsfächmann bewerkstelligt werden. Beispiele für regulatorische Elemente umfassen: einen Transkriptions-Promotor und -Enhancer oder eine RNA- Polymerase-Bindungssequenz, eine Ribosomen- Bindungssequenz, einschließlich eines Translationsinitiationssignals. Je nach der ausgewählten Wirtszelle und dem eingesetzten Vektor können andere genetische Elemente, wie ein Replikationsursprung, zusätzliche DNA- Restriktionsstellen, Enhancer, Sequenzen, die Transkriptionsinduzierbarkeit verleihen und selektierbare Marker, in den Expressionsvektor eingebracht werden.
p97-codierende DNA-Sequenzen können von einer großen Anzahl prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen exprimiert werden, wie Bakterien-, Säugetier-, Hefe- oder anderen Pilz-, Viren-, Pflanzen- oder Insektenzellen. Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren dieser Zellen zur Expression fremder DNA sind im Stand der Technik bekannt (siehe bspw. Itakura et al., US-Patent 4 704 362; Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929-1933, 1978; Murray et al., US-Patent 4 801 542; Upshall et al., US-Patent 4 935 349; Hagen et al., US-Patent 4 784 950; Axel et al., US- Patent 4 399 216 Goeddel et al., US-Patent 4 766 075: und Sambrook et al., Molekular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, die hiermit alle durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Die bakteriellen Wirtszellen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, umfassen E. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium und verschieden Arten innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, sowie viele andere Bakterienarten, die dem Durchschnittsfachmann geläufig sind. Beispiele für bakterielle Wirtszellen umfassen DH5α (Stratagene, LaJolla, Kalifornien), JM109 ATCC Nr. 53323, HB101 ATCC Nr. 33694 und MN294.
Bakterielle Expressionsvektoren umfassen vorzugsweise einen Promotor, der in der Wirtszelle arbeitet, einen oder mehr selektierbare Phänotypmarker, und einen bakteriellen Replikationsursprung. Beispielhafte Promotoren umfassen die β-Lactamase (Penicillinase) und das Lactose-Promotor- System (siehe Chang et al., Nature 275: 615, 1978), den trp-Promotor (Nichols und Yanofsky, Meth. in Enzymology 101: 155, 1983) und den tac-Promotor (Russell et al., Gene 20: 231, 1982). Beispielhafte selektierbare Marker umfassen verschiedene Antibiotikäresistenzmarker, wie Kanamycin- oder Ampicillin-Resistenzgene. Viele Plasmide, die sich zum Transformieren von Wirtszellen eignen, sind im Stand der Technik bekannt, wie u. a. pBR322 (siehe Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977), die pUC-Plasmide pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (siehe Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983 und Vieira und Messing, Gene 19, 259-268, 1982), und pNH8A, pNH16a, pNH18a und Bluescript M13 (Stratagene, LaJolla, Kalif.).
Hefe- und Pilz-Wirtszellen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, umfassen u. a. Saccharomyces cerevisiae, die Gattung Pichia oder Kluyveromyces und verschiedene Arten der Gattung Aspergillus. Geeignete Expressionsvektoren für Hefe und Pilze umfassen u. a. YCp50 (ATCC Nr. 37419) für Hefe, und den amdS-Klonierungsvektor pV3 (Turnbull, Bio/Technology 7: 169, 1989). Protokolle für die Transformation von Hefe sind ebenfalls dem Durchschnittsfachmann bekannt. Die Transformation lässt sich bspw. leicht durch Herstellung von Sphäroplasten von Hefe mit. DNA bewerkstelligen (siehe Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929, 1978) oder durch Behandlung mit alkalischen Salzen, wie LiCl (siehe Itoh et al., J. Bacteriology 153: 163, 1983). Die Transformation von Pilzen kann ebenfalls mit Polyethylenglycol, wie von Cullen et al., (Bio/Technology 5: 369, 1987) beschrieben, durchgeführt werden.
Säugetierzellen, die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, umfassen u. a. COS- (bspw. ATCC Nr. CRL 1650 oder 1651), BHK- (bspw. ATCC Nr. CRL 6281), CHO- (ATCC Nr. CCL 61), HeLa- (bspw. ATCC Nr. CCL 2), 293- (ATCC Nr. 1573) und NS-1-Zellen. Geeignete Expressionsvektoren zur Steuerung der Expression in Säugetierzellen umfassen im Allgemeinen einen Promotor, sowie andere Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen. Allgemeine Promotoren umfassen SV40, MMTV, Metallothionein-1, Adenovirus Ela, CMV, "Immediate Early", Immunglobulin-Schwere-Ketten- Promotor und Enhancer, sowie RSV-LTR. Protokolle für die Transfektion von Säugetierzellen sind dem Durchschnittsfachmann geläufig. Beispielhafte Verfahren umfassen die Calciumphosphat-vermittelte Elektroporation, retrovirale und durch Protoplastenfusion vermittelte Transfektion (siehe Sambrook et al., siehe oben).
Vor dem Hintergrund der hier vermittelten Lehren können Promotoren, Terminatoren und Verfahren zum Einbringen von Expressionsvektoren eines geeigneten Typs in Pflanzen-, Vogel- und Insektenzellen leicht verwirklicht werden. Bei einer Ausführungsform können p97 oder Derivate davon aus Pflanzenzellen exprimiert werden (siehe Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987, das einen Überblick über die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes-Vektoren gibt; siehe ebenfalls Zambryski et al., Genetic Engineering, Principles and Methods, Hollaender and Setlow (Hrsg.), Bd. VI, S. 253-278, Plenum Press, New York, 1984, das die Verwendung von Expressionsvektoren für Pflanzenzellen beschreibt, wie u. a. pAS2022, pAS2023 und pAS2034).
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird p97 aus Baculoviren (Siehe Beispiel 2 unten) exprimiert (siehe ebenfalls Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47, 1988, Atkinson et al., Petic. Sci. 28: 215-224, 1990). Die Verwendung von Baculoviren, wie AcMNPV ist besonders bevorzugt aufgrund der Expression von GPI-gespaltenen Formen von p97 aus Insekten-Wirtszellen.
p97 lässt sich durch Züchten der vorstehend beschriebenen Wirts-Vektorsysteme herstellen, damit man rekombinantes p97 exprimiert. Rekombinant erzeugtes p97 lässt sich zudem wie nachstehend eingehend beschrieben weiter reinigen.
Alternativ kann p97 in nichtmenschlichen transgenen Tieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen und Schweinen exprimiert werden (siehe Hammer et al., (Nature 315: 680-683, 1985), Palmiter et al., (Science 222: 809-814, 1983), Brinster et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985), Palmiter und Brinster (Cell. 41: 343- 345, 1985) und US-Patent 4 736 866). Kurz gesagt wird eine Expressionseinheit mit einer DNA-Sequenz, die zusammen mit geeignet positionierten Kontrollsequenzen exprimiert werden soll, in Pronuclei befruchteter Eier eingebracht. Die Einbringung von DNA erfolgt gewöhnlich durch Mikroinjektion. Die Einbringung der injizierten DNA wird durch Blot- Analyse der DNA aus Gewebeproben, meist Proben aus Schwanzgewebe, nachgewiesen. Die eingebrachte DNA wird vorzugsweise in die Keimbahn des Tiers eingebracht, so dass sie auf die Nachkommen des Tiers übertragen wird. Gewebespezifische Expression wird erzielt durch die Verwendung eines gewebespezifischen Promotors oder durch Verwendung eines induzierbaren Promotors, wie eines Metallothionein-Gen-Promotors (Palmiter et al., 1983, siehe oben), der eine regulierte Expression des Transgens ermöglicht. Tiere, die eine gewebespezifische Expression von p97 ermöglichen (bspw. im Gehirn), lassen sich als Krankheitsmodelle für Alzheimerkrankheit verwenden. Alternativ können künstliche Hefechromosomen (yeast artificial chromosomes, YACs) zur Einbringung von DNA in embryostämmige Stammzellen durch Fusion mit Hefesphäroplasten verwendet werden, die das YAC tragen (siehe Capecchi, Nature 362: 255-258, 1993 Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993). Mit diesen Verfahren lassen sich Tiere entwickeln, die p97 in Gewebe (bspw. Gehirn) exprimieren, und die sich daher als Krankheitsmodell für Alzheimer-Krankheit eignen. Teere, die kein p97 produzieren, lassen sich daher entwickeln, damit man die Funktion von p97 untersuchen kann.

KONTINUIERLICHES VERFAHREN ZUR PRODUKTION VON PROTEINEN MIT GPI-ANKER

Die Erfindung stellt ein semikontinuierliches Verfahren zur Gewinnung heterologer Proteine bei steigenden Konzentrationen und Reinheiten bereit. Proteine, die über GPI-Anker an Säuger-Zellmembranen gebunden sind, lassen sich selektiv in den Überstand freisetzen durch Enzyme, die eine Spezifität gegenüber GPI-Bindungen besitzen und die oben eingehend erläutert sind. Die Erfinder haben bestimmt, dass dieses Verfahren reproduzierbar ist und zur Gewinnung erhöhter Proteinmengen verwendbar ist. Die Zellen lassen sich wiederholt ernten durch trennendes Zellwachstum und Proteinexpression aus der Enzymbehandlung. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich mit einer Kultur von Zellen durchführen, die ein Protein mit GPI-Anker exprimieren, vorzugsweise einer Zeltlinie, die gentechnisch so verändert wurde, dass sich das GPI-Anker-Protein gewinnen lässt. Proteine mit GPI-Anker, die sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellen lassen, umfassen hydrolytische Enzyme, wie bspw. alkalische Phosphatase, 5'- Nucleotidase, Acetylcholinesterase (AChE), Trehalase, alkalische Phosphodiesterase I, gp63-Proteine, Dipeptidase, p76-Proteinase, Aminopeptidase P, Lipoprotein-Lipase Säugetier-Antigen, wie bspw. Thy-1, Thy-3, RT-6, Qa, Ly-6, MEM-43, Carcinoembryonisches Antigen (CEA), NCA, Blast-1, MRC OX-45, CD14, Mo3, CD48; Protözoen-Antigene, wie bspw. Ssp-4, das 90 kDa-Glycoprotein, Variantes Oberflächen- Glycoprotein (VSG) Procyclin, Oberflächenantigene, 195- kDa-Antigen, Transferrinrezeptor, P30; Proteine der Zell- Zell-Wechselwirkung, bspw. LFA-3, Heparansulfat- Proteoglycan, Nervenzelt-Adhäysionsmolekül, Kontaktstelle A, PH-20, F11 und Decay-Accelerating Fact6r (DAF), 130 kDa-Hepatom-Glycoprotein, 34-kDa-Wachstumsfaktor, Scrapie- Prionprotein, GP-2, CD16 (Fcγ-Rezeptor III), Oligodendrozyten-Myelin-Protein, Antigen 117, 125-kDa-Glycoprotein C8-Bindungsprotein, Folatbindungsprotein Sgp-1, Sgp-2, 26- kDa-Glycoprotein, 150-kDa-Bindungsprotein, 82 und 68-kDa- Proteine, Oberflächenantigene, I-Antigen-Glycoprotein GP- 3, vorzugsweise p97.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden CHO-Zellen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie die p97 mit GPI-Anker exprimieren, in Kultur gezüchtet. Das GPI-Anker-Protein kann durch kurze Inkubation mit einem Enzym, das den GPI-Anker spalten kann, geerntet werden, wobei diese Enzyme im Stand der Technik bekannt sind (Ferguson, M. J. Ann. Rev. Biochem. 57: 285-320, 1988) und Beispiele oben beschrieben sind. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise PI-PLC oder GPI-PLC verwendet. Das gespaltene lösliche Protein lässt sich aus dem Medium gewinnen und die Zellen zur weiteren Expression des Proteins zum Wachstumsmedium rezyklieren. Die Wachstums- und Erntezyklen lassen sich wiederholen, bis hinreichende Proteinmengen erhalten werden.

REINIGUNG VON P97

p97 und Derivate davon, sowie lösliches p97 können vor dem Hintergrund der hier bereitgestellten Lehren leicht isoliert werden. p97 kann zusammengefasst entweder aus Überständen gereinigt werden, die solubilisiertes p97 enthalten, oder aus gezüchtetten Wirts-Vektorsystemen, wie vorstehend beschrieben. Eine Anzahl Reinigungsschritte lässt sich entweder allein oder in Kombination zur Reinigung von p97 verwenden. Überstände, die bspw. durch Solubilisierung von p97 oder aus Wirts-Vektor-Kulturen wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, lassen sich leicht aufkonzentrieren mit herkömmlich verfügbaren Proteinkonzentrationsfiltern, wie bspw. einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, oder durch "Aussalzen" des Proteins und anschließende Dialyse. Neben dem Konzentrieren können die Überstände (oder Konzentrate) auf eine Affinitäts-Reinigungsmatrix aufgetragen werden, wie einem anti-p97-Antikörper, der an einen geeigneten Träger gebunden ist. Alternativ kann ein Anionen-Austauschharz eingesetzt werden, bspw. eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl-(DEAE)-Gruppen. Beispielhafte Matrizen umfassen Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Typen, die gewöhnlich bei der Proteinreinigung eingesetzt werden. Entsprechend lassen sich Kationenaustauscher einsetzen, die verschiedene unlösliche Matrizen, wie Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen verwenden.
Schließlich können eine oder mehrere Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Schritte (RP- HPLC) eingesetzt werden, die hydrophobe RP-HPLC-Medien verwenden, bspw. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, damit eine Glucagon- Rezeptor-Zusammensetzung weiter gereinigt wird.
Erfindungsgemäß bedeutet "isoliert" oder "gereinigt", wie es hier zur Definition der Reinheit von p97 verwendet wird, dass das Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen natürlichen oder endogenen Ursprungs ist, und dass es weniger als etwa 1 Masse-% Proteinverunreinigungen aufgrund von Rückständen bei den Produktionsverfahren enthält. p97 kann als "isoliert" angesehen werden, wenn es als einzelne Proteinbande nach SDS-PAGE und anschließender Färbung mit Coomassie Blue nachweisbar ist.

PRÄPARATION DER ANTIKÖRPER

Im Stand der Technik gibt es Antikörper, die gegenüber p97 reaktiv sind. Beispiele umfassen L235 (ATCC Nr. HB 8466; siehe Real et al., Cancer Res. 45: 4401-4411, 1985), 4.1, 8.2, 96.5 und 118.1 (siehe Brown et al., J. Imm. 127 (2): 539-546, 1981 und Brown et al., PNAS USA 78(1): 539-543, 1981) und 33B6E4.
Alternativ lassen sich p97 oder Derivate davon, lösliches p97 oder Zellen, die p97 auf ihrer Oberfläche (einschließlich Zellen, die mit p97-DNA transfiziert sind) zur Herstellung von Antikörpern verwenden. Antikörper umfassen im Rahmen der Erfindung monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, Antikörperfragmente (bspw. Fab und F(ab')&sub2; und rekombinant erzeugte Bindungspartner. Antikörper sind gegenüber p97 reaktiv, wenn es mit einer Ka größer gleich 10&supmin;&sup7; M bindet. Der Fachmann weiß, dass sich Antikörper entwickeln lassen, die nicht nur einen Liganden, wie p97, binden, sondern die zudem die biologische Aktivität des Liganden blockieren (bspw. durch Blockieren der Bindung von Eisen oder des Transferrinrezeptors an p97).
Polyklonale Antikörper werden vom Fachmann leicht aus einer Anzahl warmblütiger Tiere isoliert, wie Pferden, Kühen, verschiedenen Geflügelsorten, Kaninchen, Mäusen oder Ratten. Zusammengefasst wird p97 zur Immunisierung des Tiers durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare oder subcutane Injektionen eines Adjuvans, wie Freund'sches komplettes oder inkomplettes Adjuvans, verwendet. Nach mehreren Booster-Immunisierungen, werden Proben gesammelt und auf Reaktivität gegenüber p97 untersucht. Besonders bevorzugte polyklonale Antiseren geben bei einem dieser Tests ein Signal, das mindestens dreimal größer als der Hintergrund ist. Sobald der Titer des Tiers ein Plateau hinsichtlich seiner Reaktivität gegenüber p97 erreicht hat, lassen sich größere Mengen Antiseren erhalten durch schwaches Bluten oder durch Ausbluten des Tiers.
Monoklonale Antikörper lassen sich ebenfalls unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erhalten (siehe US- Patent Nr. RE 32011, 4 902 614, 4 543 439 und 4 411 993, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind; siehe ebenfalls Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol (Hrsg.), 1980, und Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow and Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, die ebenfalls durch Bezugnahme hier aufgenommen sind).
Bei einer Ausführungsform wird einem Versuchstier, wie einer Ratte oder Maus, p97 injiziert. p97 kann mit einem Adjuvans gemischt werden, wie Freund'schem kompletten oder inkompletten Adjuvans, damit die resultierende Immunantwort verstärkt wird. Ein bis drei Wochen nach der Erstimmunisierung kann das Tief, erneut mit einer weiteren Boosterimmunisierung immunisiert werden und auf Reaktivität gegenüber p97 unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Tests untersucht werden. Sobald die Reaktivität des Tiers gegenüber p97 ein Plateau erreicht hat, wird dieses getötet, und die Organe, die viele B-Zellen enthalten, wie Milz und Lymphknoten, werden geerntet.
Zellen, die aus dem immunisierten Tier erhalten werden, lassen sich durch Transfektion mit einem Virus, wie Epstein Barr Virus (EBV) immortalisieren (siehe Glasky und Reading, Hybridoma 8(4): 377-389, 1989). Alternativ werden bei einer bevorzugten Ausführungsform die erhaltenen Milz- und/oder Lymphknoten-Zellsuspensionen mit einer geeigneten Myelomzelle fusioniert, so dass man ein "Hybridom" erhält, das monoklonalen Antikörper sezerniert. Geeignete Myelomlinien umfassen bspw. NS-1 (ATCC Nr. TIB 18) und P3X63- Ag 8.653 (ATCC Nr. CRL 1580).
Nach der Fusion werden die Zellen in Kulturplatten untergebracht, die ein geeignetes Medium enthalten, wie RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas), sowie zusätzliche Inhaltsstoffe, wie fötales Rinderserum (FBS, d. h. von Hyclone, Logan, Utah oder JRH Biosciences). Zudem sollte das Medium ein Reagenz enthalten, das selektiv das Wachstum der fusionierten Milz- und Myelomzellen ermöglicht, wie HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) (Sigma Chemical Co. St. Louis, Missouri). Nach etwa 7 Tagen können die resultierenden fusionierten Zellen oder Hybridome auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen p97 untersucht werden. Eine große Anzahl von Tests kann zur Bestimmung des Vorhandensein von Antikörpern gegen p97 verwendet werden, einschließlich bspw. Gegenstrom-Immunelektrophorese, Radioimmuntests, Radioimmunfällungen, Enzymimmuntests (ELI- SA), Dot-Blot-Assays, Inhibitions- oder Kompetitions- Assays und Sandwich-Assays (siehe US-Patent 4 376 110 und 4 186 530; siehe ebenfalls Antibodies: A Laboratory Manual. Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Nach mehreren klonalen Verdünnungen und erneuten Assays lässt sich ein Hybridom isolieren, das Antikörper gegen p97 produziert.
Andere Verfahren lassen sich ebenfalls zur Konstruktion monoklonaler Antikörper einsetzen (siehe William D. Huse et al., "Generation of a haYge Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246: 1275-1281, Dezember 1989; siehe ebenfalls L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region- Specific cDMA Library"; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732, August 1989; siehe ebenfalls Michelle Alting- Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1-9, Januar 1990; Diese Literaturstellen beschreiben ein kommerzielles System, das von Stratacyte, LaJolla, Kalifornien erhältlich ist. Dies ermöglicht die Produktion von Antikörpern über Rekombinationstechniken). Die mRNA wird zusammengefasst äüs einer B-Zellpopulation isoliert, und zur Erzeugung von Schwere- und Leichte- Ketten-Immunglobulin-cDMA-Expressionsbanken in λImmuno- Zap(H)- und λImmunoZap(L)-Vektoren verwendet. Diese Vektoren lassen sich einzeln oder coexprimiert screenen, so dass man Fab-Fragmente oder Antikörper erhält (siehe Huse et al., oben; siehe ebenfalls Sastry et al., oben). Positive Plaques lassen sich anschließend in ein nichtlytisches Plasmid umwandeln, das eine hochgradige Expression monoklonaler Antikörperfragmente aus E. coli ermöglicht.
Entsprechend lassen sich Bindungspartner konstruieren, wobei DNA-Rekombinationstechniken verwendent werden, damit man die variablen Regionen eines Gens einbringt, das einen spezifisch bindenden Antikörper codiert. Bei einer Ausführungsform werden die Gene, die die variable Region aus einem Hybridom codieren, das einen monoklonalen Antikörper von Interesse produziert, mit Nukleotid-Primern für die variable Region amplifiziert. Diese Primer lassen sich vom Fachmann synthetisieren oder können kommerziell erworben werden. Stratacyte (LaJolla, Kalif.) vertreibt Primer für variable Regionen aus Maus und Mensch, wie u. a. Primer für VHa-, VHb-, VHC-, VHd-. CH1-. VL- und CL-Regionen. Diese Primer lassen sich zum Amplifizieren der variablen Regionen der schweren und leichten Kette verwenden, die dann in Vektoren, wie ImmunoZAPTM H bzw. ImmunoZAPTM L (Stratacyte) eingebracht werden. Diese Vektoren werden dann zur Expression in E. coli eingebracht. Mit diesen Techniken werden große Mengen eines Einkettenproteins produziert, das eine Fusion der VH- und VL-Domänen enthält (siehe Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Diese Verfahren lassen sich zudem zur Änderung eines "Maus"-Antikörpers in einen "Mensch"-Antikörper verwenden, ohne dass die Bindungsspezifität des Antikörpers verändert wird.
Geeignete Antikörper oder Bindungspartner lassen sich nach ihrere Gewinnung durch viele, dem Fachmann geläufige Verfahren isolieren oder reinigen (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Geeignete Verfahren umfassen Peptid- oder Proteinaffinitätssäulen, HPLC oder RP-HPLC, Reinigung auf Protein A- oder Protein G-Säulen oder eine Kombination dieser Techniken.

MARKIERUNG VON p97

p97, lösliches p97, gespaltenes p97 und p97 mit GPI- Anker und Derivate davon, lösliches p97 und Antikörper, die oben beschrieben sind, lassen sich mit einer Anzahl von Molekülen markieren, einschließlich bspw. fluoreszierender Moleküle, Toxine, Substanzen mit Therapiewirkung, d. h. Therapeutika, lumineszierender Moleküle, Enzyme und Radionuklide. Beispiele für fluoreszierende Moleküle umfassen Fluorescein, Phycoerythrin, Rhodamin, Texasrot und Luciferase. Beispiele für Toxine umfassen Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Gelonin, Antivirus- Protein aus Kermesbeere, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin A. Beispiele für Radionuklide umfassen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99 m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au- 199, Pb-203, At-211, Pb-212 und Bi-212. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerettich-Peroxidase, Biotin, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; und ein Beispiel für ein lumineszierende Material umfasst Luminol. Zudem können p97 oder die vorstehend beschriebenen Antikörper ebenfalls markiert oder an einen Partner eines Liganden-Bindungspaars konjugiert werden. Beispiele umfassen Biotin-Avidin und Riboflavin- Riboflavin-Bindungsprotein.
Verfahren zum Konjugieren oder Markieren von p97 oder den vorstehend genannten Antikörpern mit den oben erwähnten entsprechenden Markierungen lassen sich leicht vom Fachmann vornehmen (siehe Trichothecene Antibody Conjugate, US-Patent 4 744 981; Antibody Conjugate, US-Patent 5 106 951; Fluorogenic Materials ans Labelling Techniques, US-Patent 4 018 884; Metal Radionuclide Labelled Proteins for Diagnosis and Therapy, US-Patent 4 897 255; und Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, US-Patent 4 988 496; siehe ebenfalls Inman, Methods In Enzymology, Bd. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Teil B, Jakoby und Wichek (Hrsg), Academic Press, New York, S. 30, 1974; siehe ebenfalls Wilchek und Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications, "Anal Biochem. 171: 1-32, 1988).
Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung werden Transferrin, Transferrinrezeptor oder Antikörper gegen den Transferrinrezeptor mit Verfahren markiert, die es im Stand der Technik gibt und die kurz bereits oben erwähnt wurden.

p97-VERMITTELTER EISENTRANSPORT

A. Behandlung von Zuständen, einschließlich Störungen des Eisenmetabolismus.
Die Erfindung stellt wie bereits angesprochen ein Verfahren zum Behandeln von Zuständen bereit, einschließlich Störungen des Eisenmetabolismus, durch Modulieren des p97-vermittelten Transportes und der Eisenaufnahme. p97, Agonisten, Antagonisten und Stimulatoren von p97, wie u. a. Antikörper gegen p97 und antisense-p97, lassen sich zur Modulation des p97-vermittelten Transportes und der Eisenaufnahme verwenden. Antikörper gegen p97 und ihre Herstellung sind vorstehend beschrieben. Andere Substanzen, die p97 beeinflussen, d. h. Agonisten, Antagonisten und Stimulatoren von p97 lassen sich identifizieren, indem die Wirkung der Substanz auf die Bindungsaktivität von p97 oder des Transferrinrezeptors oder die Wirkung der Substanz auf die Expression von p97 in den Zellen bestimmt wird, wie u. a. in Zellen, die derart gentechnisch verändert wurden, dass sie p97 exprimieren, wie p97aWTBc3, p97aWTBc7 und SEK-MEL-28.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifizierung von Stimulatoren, Agonisten oder Antagonisten von p97, umfassend das Umsetzen einer Substanz, von der angenommen wird, dass es sich um einen Stimulator, Agonist oder Antagonist von p97 handelt, mit p97 und Eisen unter Bedingungen, dass p97 an das Eisen bindet; Messen der Menge des an das Eisen gebundenen p97 und Bestimmen der Wirkung der Substanz durch Vergleich der Menge des an das Eisen gebundenen Menge p97 mit einer für eine Kontrolle bestimmten Menge. Das erfindungsgemäße Verfahren kann die vorstehend beschriebenen Eisenbindungsassays verwenden. Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete p97 kann das p97 mit GPI-Anker, lösliche p97, gespaltene p97 oder Derivate davon sein, vorzugsweise rekombinantes p97. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich die an Eisen gebundene Menge p97 bestimmen durch Messen der Menge p97, welches an Eisen gebunden ist, des ungebundenen p97 oder ungebundenen Eisen. An Eisen gebundenes p97 kann durch herkömmliche Isolierungstechniken isoliert werden, bspw. durch Aussalzen, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyacrylamidgelelektrophorese, Agglutinierung oder Kombinationen davon. Zur Erleichterung der Messung von an Eisen gebundenem p97 oder von ungebundenem p97 lassen sich Antikörper gegen p97 verwenden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren von Stimulatoren, Agonisten oder Antagonisten von p97, umfassend das Umsetzen einer Substanz, von der angenommen wird, dass es sich um einen Stimulator, Agonisten oder Antagonisten von p97 handelt, mit p97 und dem Transferrinrezeptor unter solchen Bedingungen, dass p97 an den Transferrinrezeptor bindet; Messen der an den Transferrinrezeptor gebundenen Menge p97; und Bestimmen der Wirkung der Substanz durch Vergleichen der Menge des an den Transferrinrezeptor gebundenen p97 mit einer für eine Kontrolle bestimmten Menge. Das ebenfalls bei diesem Verfahren verwendete p97 umfasst p97 mit GPI-Anker, lösliches p97 oder gespaltenes p97 oder Derivate davon, vorzugsweise rekombinantes p97. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich die an den Transferrinrezeptor gebundene Menge p97 bestimmen durch Messen der Menge p97, welche an den Transferrinrezeptor gebunden ist, von ungebundenem p97 oder ungebundenem Transferrinrezeptor. Das an den Transferrinrezeptor gebundene p97 lässt sich durch herkömmliche Isolierungsverfahren isolieren, bspw. Aussalzen, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyacrylamidgelelektrophorese, Agglutinierung oder Kombinationen davon. Zur Erleichterung der Messung von an den Transferrinrezeptor gebundenem p97 oder von ungebundenem p97 oder ungebundenem Transferrinrezeptor lassen sich Antikörper gegen p97 oder Transferrinrezeptor verwenden, die vorstehend beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung von Stimulatoren, Agonisten oder Antagonisten von p97, umfassend das Umsetzen einer Substanz, von der angenommen wird, dass es sich um einen Stimulator, Agonisten oder Antagonisten von p97 handelt, mit einer Zelle, die p97 exprimiert, Messen der von der Zelle exprimierten Menge p97 und Bestimmen der Wirkung der Substanz durch Vergleich der Menge der p97-Expression mit einer Menge, die für eine Kontrolle bestimmt wird. Das bei diesem Verfahren verwendbare p97 umfasst p97 mit GPI-Anker, lösliches p97, gespaltenes p97 oder Derivate davon, vorzugsweise rekombinantes p97. p97-exprimierende Zellen, die sich beim erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen, umfassen p97aWTBc3, p97aWTBc7 und SK-MEL-28. Die Menge des auf der Zelle exprimierten p97 lässt sich bestimmen durch Verwendung von Verfahren des Standes der Technik, vorzugsweise können markierte Antikörper gegen p97 zur Messung der p97-Expression verwendet werden.
Zustände, die Störungen des Eisenmetabolismus umfassungen und sich mit den erfindungsgemäßen Verfahren behandeln lassen, sind u. a. solche, die mit einer übermäßigen Eisenabsorption aus der Nahrung einhergehen oder solche, die eine regelmäßige Behandlung durch Bluttransfusion erfordern (bspw. dyserythropoietische Anämien, insbesondere Thalassämie-Störungen). Beispiele für solche Zustände sind Hämochromatose, neurodegenerative Erkrankungen (bspw. Alheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Parkinson- Krankheit), ischämischerGewebeschaden, Herzerkrankung und Tumore, Entzündung und Ifilfektionen (siehe Pippard, J. Clinical Use of Iron Chelation in Iron in Immunity, Cancer and Inflammation Hrsg. M. de Sousa und J. H. Brock, 1989, John Wiley & Sons, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist).
Hämochromatose ist eine Absorptionserkrankung beim Menschen, die die Asorption und Ablagerung einer überschüssigen Menge Eisen umfasst, welche das Gewebe schädigt (Smith, L. H., Western J. Med. 153: 296-308, 1990). Es ist unwahrscheinlich, dass der Defekt, der sogar bei 1 von 20 Personen vorkommt, ein Strukturdefekt im p97-Molekül ist, da das p97-Molekül beim Menschen auf Chromosom 3 codiert wird, wohingegen das Hämochromatose-Gen mit dem Ferritin- und dem HLA-A-Gen auf Chromosom 6 gekoppelt ist (Zappone, E. et al., Hum. Genet. 86(6): 557-61, 1991). Der Defekt wirkt jedoch trans und kann die p97-Expression beeinflussen. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Diagnostizieren von Hämochromatose durch Testen auf gesteigerte p97- Expression von betroffenen Zellen und auf gesteigerte Mengen an löslichem p97 in Körperflüssigkeiten bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls p97, Antagonisten oder Agonisten von p97 zur Behandlung von Hämochromatose bereit. Die Wirksamkeit der Behandlung lässt sich an Tiermodellen zur Hämochromatose testen, wie am Hypotransferrinämie- Nagermodell, beschrieben in Craven, C. M. et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA: 3457-3461, 1987.
Die Erfindung stellt p97, Antagonisten oder Agonisten von p97 zur Behandlung von traumatischer und ischämischer Gewebeschädigung bereit, wie solchen, die aus Herzleiden und Schlaganfällen herrühren. Die Ablagerung von Eisen, die auf einem Zelltod beruht, kann zur Bildung von hochreaktivem und toxischem Superoxid oder freien Hydroxylradikalen führen, die eine weitere Gewebecshädigung erleichtern. Die Verfügbarkeit und Abundanz von Eisen kann somit die Überlebensfähigkeit von beschädigtem Gewebe stark verändern. Die Wirksamkeit von p97, Antagonisten oder Agonisten von p97 als Behandlung von traumatischem oder ischämischem Gewebeschaden kann in Experimenten mit perfundierten Organen, wie Herz und Lunge, getestet werden, die nach Transplantation an einer Reperfusionsverletzung aus der eisenvermittelten Bildung freier Hydroxylradikale leiden.
Erfindungsgemäße Verbindungen lassen sich ebenfalls in Tiermodellen von Herz- und Schlaganfall-Erkrankung untersuchen, wie dem Levine-Modell (Levine, S., Amer. J. Pathol. 36: 1-17, 1960) oder dem Kolenmonoxid-Hypoxie- Oligämie-Modell, beschrieben in MacMillan V. Brain Research 151: 353-368, 1978.
Rasch proliferierende maligne Zellen haben einen gesteigerten Eisenbedarf und müssen wirksame Mechanismen für den Eisentransport besitzen. Ein Antikörper-Ricin- Konjugat, hergestellt aus einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch für den Transferrinrezeptor ist, wurde zur Hemmung der Proteinsynthese und Verursachung von Zelltod in einer menschlichen leukämischen Zelllinie verwendet (Trowbridge, I. S. und Domingo, D. L., Cancer Surveys 1: 543-556. Antikörper gegen den Transferrinrezeptor wurden ebenfalls als pharmakologische Anti-Tumormittel zur direkten Blockierung der Zellproliferation verwendet (Trowbridge, I. S. und Lopez, F. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79: 1175-1179, 1982). Antikörper gegen den Transferrinrezeptor hemmen das Wachstum von Melanomzellen nicht signifikant (Trowbridge, I. S. et al., Methods in Enzymol. 14: 265-279.
Die Erfindung hat gezeigt, dass p97, ein melanomassoziiertes Antigen eine Rolle beim Transport und der zellulären Aufnahme von Eisen spielt. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Hemmung der Proteinsynthese und des Tumorwachstums und zum Abtöten von Tumorzellen bereit, die p97 exprimieren, wie Melanomzellen, indem die p97- vermittelte Eisenaufnahme gestört wird, bspw. durch Zufuhr von Antagonisten der p97-vermittelten Eisenaufnahme. Man erwägt ebenfalls das spezifische Anzielen und Abtöten von p97-exprimierenden Tumorzellen mit monoklonalen p97- spezifischen Antikörpern, wie L235. Antikörper gegen p-97 lassen sich auch mit einer Markierung, vorzugsweise Toxin, am stärksten bevorzugt einem cytotoxischen Mittel, konjugieren. Mittel, die gegen Tumorzellen cytotoxisch sind, und die sich an Antikörper konjugieren lassen, gibt es im Stand der Technik und umfassen herkömmliche cytotoxische Medikamente, wie Daunomycin oder Adriamycin und verschie- Jene Toxine pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs, wie Ricin, Abrin oder Diphtherie-Toxin (Trowbridge, I. S. und Domingo, D. L., Cancer Surveys 1: 543-556).
Die Erfindung zeigt, dass das melanomassoziierte p-97 am Transport und der Aufnahme von Eisen beteiligt ist, und stellt eine Behandlung von. Melanom durch Modulieren des Eisentransportes mit p97-Antagonisten, Antikörpern gegen p97 und mit anderen Verbindungen bereit, die sich zur Eisenentfernung eignen, wie Eisenchelatoren. Im Stand der Technik gibt es Eisenchelatoren, die Liganden an Eisen binden und umfassen Lactoferrin, Ferritin, Porphyrin und Ovotransferrin.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, die sich zur Behandlung von Melanomen eignen. Wie bereits erwähnt wurde p97 ursprünglich als Zelloberflächenmarker entdeckt, der mit Hautkrebs beim Menschen einhergeht. Bei einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln von Hautkrebs bereitgestellt, umfassend das Verabreichen eines Toxins, das mit löslichem p97 konjugiert ist. Verschiedene Toxine können an lösliches p97 konjugiert werden, wie bspw. bakterielle Exotoxine und Pflanzentoxine. Besonders bevorzugte Toxine umfassen Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Gelonin, Antivirus-Protein aus Kermesbeere, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin A.
Alternativ kann Hautkrebs ebenfalls behandelt oder diagnostiziert werden, indem radiaktiv markiertes lösliches p97 einem Patienten verabreicht wird. Das lösliche p97 kann entweder direkt radioaktiv markiert werden oder mit einer Radioaktivmarkierung konjugiert werden. Bevorzugte Radionuklide sind u. a. Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99 m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I- 131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, 20 Pb-212 und Bi-212.

B. Schutz von Organen

Die Transplantation von Organen ist eine definitive Behandlung für Patienten mit Erkrankungen des Endstadiums von Leber, Niere, Herz und Pankreas. Es treten jedoch einige Probleme bei der Ex-vivo-Lagerung von Leichenorganen und somit bei der Lebensfähigkeit von Organtransplantaten auf. Ein solches Problem ist die Beschädigung des Organs durch Eisen. p97 lässt sich folglich in Organschutzlösungen zur Steuerung der Eisenmengen und somit zur Verbesserung des Organschutzes verwenden.
Die Erfindung betrifft daher eine Zusammensetzung zum Schutz eines Organs, das zur Transplantation vorgesehen ist, umfassend p97 oder ein Derivat davon in einer pharmazeutisch verträglichen Organschutzlösung.
Die hier verwendeten Begriffe "Schutz" oder "schützen" umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Perfusion, Flushing und Aufbewahren eines zur Transplantation vorgesehenen Organs.
Die in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verwendete pharmazeutisch verträgliche Organschutzlösung kann eine beliebige üblicherweise verwendete Schutzlösung sein. Die Inhaltsstoffe beispielhafter gewöhnlich verwendeter Schutzläsungen sind beschrieben im US-Patent 4 920 004; Collins et al., Lancet 2: 1219, 1969; Sacks, S. A., Lancet 1: 1024, 1973; Siegel, N. J. et al., Am. J. Physiol. 245: F530, 1983: Stromski, M. E. et al., Am. J. Physiol. 250: F834, 1986; Sumpio, B. E. et al., Am. J. Physiol., 247: R1047; Stromski, M. E. et al., Am. J. Physiol., 250: F834, 1986); Belzer et al., Transpl. Proc. 16: 161, 1984; US- Patent 4 920 004; US-Patent 4 798 824 und 4 873 230 und US-Patent 4 879 283 (Die Lösung der Universität Wisconsin oder UW-Lösung).
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Schutz eines zur Transplantation vorgesehenen Organs mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung. Ein Organ kann gewöhnlich beim Ernten und nach seiner Entnahme aus dem Spender mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung gespült werden. Das Organ wird dann in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung unter hypothermen Bedingungen aufbewahrt. Alternativ kann das Organ nach dem ersten Spülen an eine Pumpe angeschlossen werden, wobei eine kalte Spülung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kontinuierlich durch das Organ zirkuliert wird. Vor der Transplantation kann das Organ erneut mit der Zusammensetzung gespült werden.
Das erfindungsgemäße Schutzverfahren und die erfindungsgemäße Schutz-Zusammensetzung lassen sich zum Schützen eines zur Transplantation vorgesehenen Organs verwenden, vorzugsweise eines intraabdominalen Organs, wie der Leber, Pankreas und der Niere.

C. Zusammensetzungen und Verfahren zur Medikamentenabgabe

Ein Haupthindernis bei der Untersuchung von Medikamenten bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit und anderer neurologischer Zustände ist das Fehlen einer effizienten nicht-invasiven Maßnahme zur Abgabe von Medikamenten oder Chemotherapeutika über die Blut-Hirnschranke. Der Transport von Medikamenten und gelösten Stoffen in das Gehirn aus dem Blut wird durch die eingeschränkte Permeabilität der Endothelwand in den Gehirnkapillaren eingeschränkt, und zwar aufgrund schwacher Endothelbindungen und weil wässrige Poren in den Endothelzellen fehlen (Pardridge, W. M. et al., J. Pharmacol. & Expt. Therapeut. 253: 884-891, 1990). Die Erfindung stellt einen Mechanismus zur Abgabe von aus dem Blut stammenden Stoffen über die Blut- Hirnschranke in das Gehirn bereit. Die Erfinder haben gezeigt, dass p97 auf der Oberfläche der Endothelzellen von Gehirnkapillaren in einem Muster exprimiert wird, dass dem des Transferrinrezeptors ähnelt. p97 auf den Endothelzelle scheint am Transport von Eisen über die Blut-Hirn-Schranke beteiligt zu sein, und zwar möglicherweise über eine Wechselwirkung mit dem Transferrinrezeptor.
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Abgabe von Stoffen in das Gehirn aizs dem Blut über den p97- vermittelten Aufnahmemechanismus. Die Abgabe- Zusammensetzung kann das mit p97 konjugierte Mittel enthalten; ein p97-Fusionsprotein, umfassend p97 oder einen Abschnitt davon, fusioniert mit dem Mittel; oder eine zur Bindung von p97 befähigte Substanz, bspw. anti-p97- Antikörper, konjugiert an das Mittel und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.
p97, das sich in den erfindungsgemäßen Abgabezusammensetzungen verwenden lässt, umfasst lösliches p97, gespaltenes p97 und Derivate und Teile davon. Antikörper gegen p97, die sich in der Abgabe-Zusammensetzung verwenden lassen, sind vorstehend beschrieben. Beispiele für p97-Fusionsproteine umfassen ein p97- Nervenwachstumsfaktor-Fusionsprotein, ein p97-Ig- Fusionsprotein oder einen anti-p97-Antikörper- Nervenwachstumsfaktor oder ein Ig-Fusionsprotein.
Mittel, die sich in der erfindungsgemäßen Abgabezusammensetzung verwenden lassen, dienen der Behandlung neurologischer Leiden oder sind solche, von denen man annimt, dass sie eine Wirkung gegen neurologische Leiden besitzen. Neurologische Leiden, die sich mit den erfindungsgemäßen Abgabe-Zusammensetzungen behandeln lassen, umfassen solche Leiden, die gegenüber in das Gehirn abgegebene Therapeutika empfänglich sind und umfassen Gehirntumore, neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington), Demyelinisierungserkrankungen (bspw. Multiple Sklerose), amyotrophe Lateralsklerose, bakterielle und virale Infektionen und Defizienzerkrankungen (z. B. Wernicke-Krankheit und ernährungsbedingte Polyneuropathie).
Geeignete cytotoxische Therapeutika zur Behandlung von Tumoren sind in der Anmeldung andernorts erläutert.
Mögliche Therapeutika, die sich in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Behandlung von Alzheimer- Krankheit verwenden lassen, umfassen Eisensequestrierungs- Verbindungen, wie Eisenchelatoren, und entzündungshemmende Medikamente. Proteine, wie Wachstumsfaktoren, einschließlich Nervenwachstumsfaktor, aus Gehirn stammender neurotropher Faktor und Lymphokine, einschließlich Gamma- Interferon, Tumornekrosefaktor, Interleukinen, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF, werden ebenfalls als Therapeutika zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Abgabezusammensetzungen in Betracht gezogen. Cholinerge Neurone des basalen Vorderhirns, die bei Alzheimer-Krankheit degenerieren, hängen bekanntlich vom Nervenwachstumsfaktor zum Überleben ab. Der Nervenwachstumsfaktor rettet zudem degenerierende cholinerge Neurone im Vorderhirn (Hefti, F. J. Neurosci. 6: 2155, 1986).
Die Abgabe-Zusammensetzungen lassen sich mit Verfahren des Standes der Technik herstellen. Antikörper und Therapeutika, bei denen es sich um Proteine handelt, können z. B. durch Verfahren des Standes der Technik, wie durch Einbringen einer Sulfhydrylgruppe in den Antikörper und die Einbringung eines Vernetzers, der eine reaktive Thiolgruppe enthält, über die Carboxylgruppen an das Proteinmittel konjugiert werden (Wawizynczak, E. J. und Thorpe, P. E. in Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer, C. W. Vogel (Hrsg.) Oxford University Press, 1987, S. 28-55; und Blair, A. H. und T. I. Ghose, J. Immunol. Methods 59: 129, 1983). Ein p97-Fusionsprotein, das p97 oder einen Teil davon umfasst und mit dem Mittel fusioniert ist, lässt sich mit den hier beschriebenen Verfahren herstellen.
Die erfindungsgemäßen Abgabe-Zusammensetzungen lassen sich auf ihre Fähigkeit zur Durchquerung der Blut- Hirnschranke untersuchen und stellen die gewünschte pharmakologische Wirkung bereit, wobei In-vitro- und In-vivo- Modelle der Blut-Hirnschranke bereitgestellt werden. Beispiele für In-vitro-Modelle umfassen Endothelzelllinien von Rinderkapillaren, die in Kultur ein Endothel-Monolager mit einer hohen Resistenz gegen Medikamente und den Transport von gelösten Substanzen ausprägen (Pardridge, W. M. et al., J. Pharmacol. & Expt. Therapeut. 253: 884-891, 1990). Beispiele für In-vivo-Modelle der Blut-Hirnschranke umfassen intraoculare Transplantate des Septumgewebes bei Ratten. Das transplantierte Gewebe entwickelt den für die Blut-Hirn-Schranke charakteristischen Endothel- und Astrocyten-Mechanismus.
Die Erfindung zieht auch ein Verfahren zur Abgabe eines selektierten Mittels über die Blut-Hirn-Schranke in Betracht, umfassend das Verabreichen einer erfindungsgemäßen Abgabe-Zusammensetzung, die das Mittel enthält. Jeder Verabreichungsweg, der die Zusammensetzung im Blutstrom verdünnt, lässt sich verwenden. Die Zusammensetzung lässt sich vorzugsweise peripher verabreichen, und am stärksten bevorzugt intravenös oder durch ein Herzkatheter. Die zu verabreichenden Dosierungen hängen vom einzelnen Bedarf, von der gewünschten Wirkung und vom ausgewählten Verabreichungsweg ab.

BEOBACHTUNG DER ALZHEIMER-KRANKHEIT

Die Erfindung stellt Verfahren zum Beobachten und Diagnostizieren der Alzheimer-Krankheit in einem Patienten bereit, sowie Zusammensetzungen und Verfahren, die sich zum Behandeln von Alzheimer-Krankheit eignen. Diese Zusammensetzungen und Verfahren beruhen auf dem Befund der Erfinder, dass p97 und der Transferrinrezeptor auf Mikrogliazellen, die mit Amyloid-Plaques in einem Alzheimer- Patient assiziiert sind, gefunden werden und auf der Entdeckung, dass eine lösliche Form von p97 in der Cerebrospinalflüssigkeit eines Alzheimer-Patienten nachgewiesen werden kann.
Zum Beobachten oder Diagnostizieren von Alzheimer- Krankheit lässt sich das Vorhandensein von p97 in vielen Quellen des Körpers nachweisen, einschließlich Geweben und Flüssigkeiten.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden Verfahren zum Beobachten von Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend den Schritt Nachweisen von vorhandenem p97 oder Transferrinrezeptoren auf Mikrogliazellen, die mit Amyloid-Plaques in einem Patienten assoziiert sind. Proben lassen sich kurz gesagt aus einem Patient erhalten entweder durch Biopsie (bspw. via Computertomographie (CT) gesteuerte stereotaktische Biopsie, siehe Alesch et al., Acta Neurochir. (Wien) Suppl. 53: 33-36, 1991 Lazareff Acta Neurochir. (Wien) 113 (1-2): 82-83, 1992; Marks et al., N. Z. Med. J. 105 (929): 85-86, 1992; Yeo et al., Singapore Med. J. 32(5): 307-311, 1992) oder nach Autopsie, und zum Färben gemäß Standard-Histopathologie-Verfahren (s. bspw. Beispiel 8 unten) präparieren.
Mikrogliazellen, die mit Amyloid-Plaques einhergehen, lassen sich leicht vor dem Hintergrund der hier bereitgestellten Offenbarung identifizieren (siehe ebenfalls Basic Histopathology, Wheator Hrsg. Churchill Livingstone, New York; Color Atlas of Histology, Gartner Hrsg. Williams und Wilkins, Baltimore, MD.; Histology, Ross Hrsg. Harper und Row, San Francisco, CA.; Elbe, "Early Diagnosis of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease: Current Research in Early Diagnosis, siehe oben; Beyreuther et al., "Mechanisms of amyloid deposition in Alzheimer's disease, "Ann. N.Y. Acad. Sci. 640: 129-139, 1991; Kawai et al., "Subcellular localization of amyloid precursor protein in senile plaques of Alzheimer's disease", Am. J. Pathol. 140 (4): 947-958, 1992).
Besonders bevorzugte Verfahren zum Identifizieren von Mikrogliazelhen, die mit Amyloiti-Plaques einhergehen, sind eingehender im nachstehenden Beispiel 8 beschrieben. Wie in Fig. 19A, sind Mikrogliazellen (MC), die mit einem anti-p97-Antikörper gefärbt werden, direkt mit Amyloid- Plaques (P) assoziiert. Blutgefäße sind als "BV" bezeichnet. Das Färben von Mikrogliazellen mit Antitransferrinrezeptor-Antikörpern statt der anti-p97-Antikörper erzeugt ähnliche Ergebnisse wie in Fig. 19A. Normale Mikrogliazellen können zwar bspw. bis zu 300-400 Transferrinrezeptoren auf der Zelloberfläche aufweisen, jedoch haben Mikrogliazellen aus einem Alzheimer-Patienten gewöhnlich 5000 oder mehr Transferrinrezeptoren auf der Zelloberfläche. Die erhöhte Anzahl Transferrinrezeptoren oder p97 auf Mikrogliazellen eines Alzheimer-Patienten ermöglicht ein Sichtbarmachen der Mikrogliazellen beim Färben, wohingegen Mikrogliazellen aus einem normalen Patienten nicht gefärbt werden (siehe Fig. 19C). Es versteht sich daher im Rahmen der Erfindung, dass das Vorhandensein von p97 oder von Transferrinrezeptoren nachgewiesen wird, wenn die Mikrogliazellen durch Färben mit anti-p97- oder anti- Transferrin-Antikörpern sichtbar gemacht werden können.
Proben, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurden, lassen sich mit anti-p97-Antikörpern oder mit anti- Transferrinrezeptor-Antikörpern leicht färben. Anti-p97- Antikörper, wie L235, sind eingehender oben beschrieben. Anti-Transferrinrezeptor-Antikörper lassen sich leicht herstellen mit ähnlichen Verfahren wie vorstehend beschrieben, oder sie lassen sich kommerziell erwerben. Beispielhafte anti-Transferrinrezeptor-Antikörper umfassen OKT 9 (ATCC Nr. CRL 8021), SE9C11 (ATCC Nr. HB 21), L5.1 (ATCC Nr. HB 84), R17 217.1.3 (ATCC Nr. TIB 219) und R17 208.2 (ATCC Nr. TIB 220) (Cell Immunol. 83: 14-25, 1984; J. Cell. Physiol. 112: 403-410, 1982; und Blood 59: 671- 678, 1982). Schließlich lassen sich anti-β-Amyloidplaque- Antikörper ebenfalls leicht mit ähnlichen Techniken wie oben beschrieben erhalten (siehe ebenfalls Allsop et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2790-2794, 1988; Arai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2249-2253, 1990; Benowitz et al., Exp: Neurol. 106: 237-250, 1989; Cole et al., Neurobiol. Aging'12: 85-91, 1991; Cras et al., Am. J': Pathol. 137: 241-246, 1990; Currie et al., Neuropathol. Exp. Neurol. 48: 328, 1989; Ghiso et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163: 430-437, 19$9; Ishii et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 15: 135-147, 1989; Joachim et al., Am. J. Pathol. 138: 373-384, 1991; Kametani et al., Biomed. Res. 10: 179-183, 1989; und Palmert, Biochem. Biophys. Res. Commun. 156: 432-437, 1988).
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zum Beobachten der Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend den Schritt Nachweisen des Vorhandenseins von löslichem p97 in einem Patienten. Das Vorhandensein von p97 lässt sich aus einer Anzahl von Körperflüssigkeiten bestimmen, einschließlich bspw. Urin, Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) und Blut. Bei einer Ausführungsform wird kurz gesagt einem Patient eine Flüssigkeitsprobe entnommen und auf das Vorhandensein von löslichem p97 untersucht. Es lässt sich eine Anzahl von Assays verwenden, einschließlich bspw. Gegenstrom- Immunelektrophorese (CIEP), Radioimmungssays, Radioimmunfällungen und Enzymimmuntests (ELISA), Dot-Blot-Assays, Inhibitions- oder Kompetitions-Assays und Sandwich-Assays (siehe US-Patent 4 376 110 und 4 486 530; siehe ebenfalls Antibodies: A Laboratory Manual, oben).
Bei einer Ausführungsform werden 100 λl eines antip97-Antikörpers, wie L235, in einer Platte mit 96 Vertiefungen über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am darauffolgenden Tag wird die Platte gespült und dann mit 200 λl 5% PBS/BSA 30 min bei 37ºC inkubiert. Die Platte wird dann gewaschen, und 100 ul einer Verdünnungsreihe der Patientenflüssigkeit in 1% PBS/BSA (zusammen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen) wird in die Vertiefungen der Platte überführt. Die Platte wird 1 Std. bei 37ºC inkubiert, und dann dreimal mit 1% PBS/BSA gewaschen. 100 ul eines weiteren anti-p97-Antikörpers, wie 96,5, verdünnt in 1% PBS/BSA, wird dann 30 min. bei 37ºC in den Vertiefungen inkubiert und dann dreimal mit 1% PBS/BSA gewaschen. 100 ul Meerrettich-Peroxidase-Ziege-anti-Maus-IgG, verdünnt in 1% PBS/BSA, wird dann in der Vertiefung 30 min inkubiert und anschließend dreimal mit 1% PBS/BSA gewaschen. Jeweils 100 ul pro Vertiefung O-Phenylendiomin (OPD)- Substratlösung (1 mg/ml OPD (00-2003, Zymed), 0, 001% H&sub2;O&sub2;, in 0,1 M Citratpuffer pH-Wert 4,5) wird in die Vertiefungen gegeben. Die Platten werden nach 15 min auf einem Titertek Multi-scan Plattenlesegerät (Flow Laboratories) bei 450 nm gelesen. Das Vorhandensein von löslichem p97 in der Körperflüssigkeit wird durch das Vorhandensein und das Ausmaß der Farbe im Vergleich zu den negativen Kontrollen angezeigt.
Die Erfindung betrifft auch einen bispezifischen Antikörper, der an Mikrogliazellen bindet, welche das Amyloid-Protein ablagern und das p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimieren, sowie an eine Markierung bindet, die vorzugsweise eine nachweisbare Substanz ist, wie ein fluoreszierendes Molekül, lumineszierendes Molekül, Enzym und ein Radionuklid, von denen Beispiele hier angegeben sind.
Bispezifische Antikörper lassen sich durch Bilden von Hybrid-Hybridomas herstellen. Hybrid-Hybridomas lassen sich mit Verfahren des Standes der Technik herstellen, wie bspw. offenbart in Staerz & Bevan (1986, PNAS (USA) 83: 1453) und Staerz & Bevan (1986, Immunology Today, 7: 241). Gewöhnlich wird ein Hybrid-Hybridoma erhalten durch Fusionieren einer ersten Zeltlinie, die einen ersten monoklonalen Antikörper produziert, der an Mikrogliazellen binden kann, die p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimieren kann, mit einer zweiten Zeltlinie, welche einen zweiten monoklonalen Antikörper produziert, der an eine Markierung - vorzugsweise eine nachweisbare Substanz - bindet. Der erste monoklonale Antikörper kann spezifisch für p97 oder den Transferrinrezeptor sein. Die bispezifischen Antikörper können ebenfalls durch chemische Maßnahmen mittels Verfahren konstruiert werden, wie beschrieben von Staerz et al., (1985, Nature, 314: 628) und Perez et al., (1985 Nature 316: 354).
Bispezifische Chimäre monoklonale Antikörper mit einer varialen Region eines Antikörpers, bspw. Maus- Antikörpers, der spezifisch für p97 und/oder den Transferrinrezeptor ist, einer variablen Region eines Antikörpers, der an eine Markierung, vorzugsweise eine nachweisbare Substanz bindet, und mit konstanten Regionen von menschlichem Immunglobulin, wie Igel-, IgG2-, IgG3- und IgG4- Antikörper, lassen sich ebenfalls wie vorstehend beschrieben konstruieren.
Die Erfindung betrifft weiter einen tetrameren immunologischen Komplex aus einem ersten monoklonalen Antikörper, der an Mikrogliazellen bindet, die p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimieren, und einem zweiten monoklonalen Antikörper, der an eine Markierung, vorzugsweise eine nachweisbare Substanz bindet, wobei der erste und der zweite Antikörper aus der gleichen Tierart stammen, und die so konjugiert sind, dass sie ein cyclisches Tetramer bilden mit zwei monoklonalen Antikörpern einer zweiten Tierart gegen das Fc-Fragment der Antikörper der ersten Tierart.
Ein tetramerer immunologischer Komplex lässt sich herstellen durch Herstellen eines ersten monoklonalen Antikörpers, der an Mikrogliazellen bindet, die p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprzmieren, und eines zweiten monoklonalen Antikörpers, der an eine Markierung, vorzugsweise eine nachweisbare Substanz, binden kann. Der erste und der zweite Antikörper stammen aus einer ersten Tierart. Der erste und der zweite Antikörper werden mit einer etwa äquimolaren Menge Antikörper einer zweiten Tierart umgesetzt, die gegen die Fc-Fragmente der Antikörper der ersten Tierart oder die Fab-Fragmente dieser Antikörper gerichtet sind. Der entstandene tetramere Komplex wird dann isoliert (siehe US-Patent 4 868 109 an Lansdrop für eine Beschreibung der Verfahren zur Herstellung tetramerer Antikörper-Komplexe). Der erste monoklonale Antikörper kann spezifisch für p97 oder den Transferrinrezeptor sein.
Die Markierung sollte die Produktion der Antikörper provozieren können, damit der erfindungsgemäße bispezifische Antikörper und die erfindungsgemäßen tetramer en Antikörper-Komplexe hergestellt werden. Beispiele für nachweisbare Substanzen, die die Produktion von Antikörpern provozieren können, sind Enzyme, wie Meerettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase und Galactosidase, Beispiele für Toxine, die die Produkte der Antikörper provozieren können, sind Radionnukleotide, Diphtherie-Toxin und Ricin oder die bereits beschriebenen abgeschwächten Derivate davon. Man kann cytotoxische Zellen, wie Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, NK-Zellen, LAK-Zellen und große granuläre Lymphozyten als Markierung verwenden. Man nimmt an, dass der Antikörper gegen den Fc-Rezeptor auf cytotoxischen Zellen gerichtet ist.
Die erfindungsgemäßen bispezifischen Antikörper und tetrameren Antikörperkomplexe, dre an die Markierung, d. h. vorzugsweise an eine nachweisbäre Substanz, gekoppelt sind, können zur Identifizierung von Mikrogliazellen, die mit Alzheimer-Krankheit einhergehen, verwendet werden.
Die Erfindung geht auch davon aus, dass die vorstehend genannten Verfahren zum Diagnostizieren und Beobachten der Alzheimer-Krankheit zusammen mit anderen Diagnoseverfahren zum Einsatz kommen können. Beta-Amyloidprotein wird als Konjugat mit Elastase in die Zellen aufgenommen.
Insbesondere lässt sich Beta-Amyloidbindende Elastase zusammen mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwenden, damit man erkrankte Mikrogliazellen anspricht.
Die Erfindung stellt zudem, ein Verfahren zum Reinigen von Mikrogliazellen bereit, die mit den beta-Amyloid- Plaques bei Alzheimer-Krankheit einhergehen, so dass man eine gereinigte Population erkrankter Zellen erhält, die sich zum Testen auf Substanzen verwenden lassen, welche sich zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit eignen. Die Zellpopulation lässt sich mit Verfahren des Standes der Technik reinigen. Die Zellpopulation wird vorzugsweise mit einer Substanz gereinigt, die p97 oder den Transferrinrezeptor spezifisch binden kann. Bei einer Ausführungsform wird die Zellpopulation durch Affinitätschromatographie gereinigt, die irrmobilisierte anti-p97-Antikörper einsetzt, damit man Mikrogliazellen, die hohe Mengen oberflächenassoziiertes p97 exprimieren, selektiv bindet. Die gereinigte Zeltpopulation lässt sich transformieren, so dass eine Zeltlinie von Alzheimer Mikrogliazellen erhalten wird. Makrophagen lassen sich erfolgreich mit Verfahren des Standes der Technik immortalisieren, bspw. mit dem SV- 40-Virus (Kreuzburg-Duffy, U. und MacDonald, C., Immunol. 72: 368-372, 1991). Die Erfindung erwägt somit die Herstellung von Makrophagenzelllinien, die erhöhte p97- Spiegel aufweisen, welche für ein erkranktes Gehirn bei Alzheimer-Krankheit charakteristisch sind. Diese Zelllinie eignet sich besonders zur weiteren Charakterisierung des Krankheitsstadiums und zur Bereitstellung eines in vitro- Systems zur Untersuchung von Substanzen, die sich zur Behandlung der Erkrankung als Therapie eignen. Das Verfahren kann ebenfalls zum Spülen von Knochenmarkszellen von Mikrogliazellen verwendet werden, die mit den Beta-Amyloid- Plaques bei Alzheimer-Krankheit einhergehen.
Man geht davon aus, dass das Vorhandensein von p97 auf den bei der Alzheimer-Krankheit vorkommenden Mikrogliazellen anzeigt, dass p97 ebenfalls ein geeigneter Marker für aktivierte Makrophagen oder Monocyten ist. Folglich kann p97 ein allgemeiner Indikator für die Erkrankung und insbesondere der Entzündung sein. Die vorstehend beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen zum Beobachten und Diagnostizieren der Alzheimer-Krankheit können zum Beobachten und zum Diagnostizieren der Krankheitsstadien und insbesondere der Entzündungszustände verwendet werden, wie rheumatoider Arthritis, pulmonärer Vaskulitis, allergischer Enzephalomyelitis, Allotransplantat-Abstoßung, chemischer Gewebeverletzung. (Siehe Pippard, M. J. s.oben).
Man geht auch davon aus, dass p97 zum Spülen von Knochenmark von p97-positiven Knochenkarkszellen verwendet werden kann. Die vorstehend beschriebenen Verfahren für Mikrogliazellen, die bei der Alzheimer-Krankheit vorkommen, lassen sich zum Spülen von Knochenmarkszellen verwenden.

BEHANDLUNG DER ALZHEIMER-KRANKHEIT

Die Erfindung stellt wie bereits erwähnt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die sich zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit eignen. Mikrogliazellen werden als Verursacher der Alzheimer-Krankheit angesehen (Schnabel, J. Science 260: 1719-1720, 1993). Der Befund der Erfinder, dass Mikroglieazellen, welche das Amyloidprotein ablagern, einen hohen Proteinspiegel, d. h. von p97 und Transferrinrezeptor aufweisen, die beim Eisenhaushalt vermitteln, legt nahe, dass die Alzheimer-Krankheit durch Abreichern von Eisen aus den Mikrogliazellen behandelt werden kann. Eisen lässt sich aus den Mikrogliazellen mit p97, Transferrin, Transferrinrezeptor, Antikörpern gegen p97 oder Transferrinrezeptor und Eisenchelatoren, wie Lactoferrin, Ferritin, Desferrithiocin und Ovotransferrin, abreichern (Siehe Pippard, M. J. siehe oben).
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend das Verabreichen eines Transferrinrezeptor-Blockierungsmittels an einen Patienten. Transferrin-Blockierungsmittel lassen sich leicht vom Fachmann anhand der hier bereitgestellten Offenbarung identifizieren. Sie umfassen bspw. Antikörper, die Transferrin und den Transferrinrezeptor blockieren. Transferrinrezeptorblockierende Antikörper lassen sich leicht mit den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern erhalten (bspw. durch Immunisierung von Mäusen mit dem Transferrinrezeptor oder mit Zellen, die den Transferrinrezeptor tragen), und durch Testen auf die Blockierung der Transferrin-Transferrinrezeptor-Bindung (bspw. durch Kompetitionsassays).
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend das Verabreichen eines Antikörpers, der die Bindung von p97 an Eisen blockiert, an einen Patienten. Antikörper, die die p97-Bindung an Eisen blockieren, lassen sich leicht wie vorstehend beschrieben herstellen (bspw. durch Immunisieren von Mäusen mit p97) und durch Untersuchung auf Antikörper, die die Bindung von p97 an Eisen kompetitiv hemmen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereitgestellt, umfassend den Schritt Verabreichen von markiertem p97 oder Transferrinrezeptor an einen Patienten. Der Transferrinrezeptor oder p97 wird vorzugsweise wie vorstehend beschrieben mit einem Toxin markiert, damit man Mikrogliazellen, welche mit Amyloid-Plaques einhergehen, bei einem Patienten zerstört. Beispiele für geeignete Toxin umfassen Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Gelonin, Antivirusprotein aus Kermesbeere, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas Exotoxin A.
Die Erfinder haben wie vorstehend erläutert p97 und den Transferrinrezeptor als spezifische Marker für Mikrogliazellen identifiziert, die bei Nervenzellen mit Beta- Amyloid-Schaden im Gehirn von Alzheimer-Patienten vorkommen. Die Mikrogliazellen, die mit Amyloidplaques assoziiert sind, können mit Substanzen angesteuert werden, die p97 oder den Transferrinrezeptor binden können. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereit, umfassend das Verabreichen einer Substanz, die p97 oder den Transferrinrezeptor, welche mit einer Markierung konjugiert sind, binden kann, vorzugsweise eine Substanz mit therapeutischer Wirkung oder ein Toxin wie oben beschrieben. Die Substanz kann ein Antikörper gegen p97 oder gegen den Transferrinrezeptor sein, deren Beispiele oben beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft auch einen bispezifischen Antikörper, der an eine Mikrogliazelle binden kann, welche das Amyloidprotein ablagert, welches p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimiert, und an eine Markierung binden kann, vorzugsweise eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Wirkung. Beispiele für toxische Substanzen und Substanzen mit therapeutischer Wirkung bei der Alzheimer-Krankheit sind hier beschrieben. Man beachte, dass die toxische Substanz ebenfalls eine cytotoxische Zelle, wie vorstehend beschrieben, ist. Der bispezifische Antikörper sollte die Mikrogliazelle und die toxische Substanz vernetzen können. Ist die Markierung eine cytotoxische Zelle, erleichtert das Vernetzen der Nlikrogliazelle und der cytotoxischen Zelle die Lyse der Mikrogliazelle.
Der bispezifische Antikörper lässt sich wie vorstehend eingehend beschrieben herstellen. Gewöhnlich wird ein Hybrid-Hybridom hergestellt aus einer Fusion zwischen einer ersten Zeltlinie, die einen ersten monoklonalen Antikörper produziert, welcher an eine p97 und/oder Transferrinrezeptor exprimierende Mikrogliazelle binden kann, und einer zweiten Zeltlinie, die einen zweiten monoklonalen Antikörper produziert, der an eine Markierung binden kann, vorzugsweise eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität.
Die Erfindung betrifft zudem einen tetreameren immunologischen Komplex aus einem ersten monoklonalen Antikörper, der an eine p97 oder den Transferrinrezeptor exprimierende Mikrogliazelle binden kann, und einem zweiten monolonalen Antikörper, der an eine Markierung, vorzugsweise eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Wirkung, binden kann, wobei der erste und der zweite Antikörper aus einer ersten Tierart stammt, und die so konjugiert sind, dass ein cyclisches Tetramer mit zwei monoklonalen Antikörpern aus einer zweiten Tierart erzeugt wird, die gegen das Fc-Fragment der Antikörper aus der ersten Tierart gerichtet sind.
Der tetramere immunologische Komplex kann wie vorstehend beschrieben hergestellt werden. Gewöhnlich wird ein erster monoklonaler Antikörper, der an eine p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimierende Mikrogliazelle binden kann, und ein zweiter monoklonaler Antikörper, der an eine Markierung - vorzugsweise eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität binden kann - wobei der erste und der zweite Antikörper aus einer ersten Tierart stammen, mit einer etwa äquimolaren Menge Antikörper aus einer zweiten Tierart umgesetzt, die gegen die Fc- Fragmente der Antikörper der ersten Tierart gerichtet sind, und der gebildeten tetramere Komplex wird isoliert.
Die erfindungsgemäßen bispezifischen Antikörper und tetrameren immunologischen Komplexe, die gegen eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität gerichtet sind, welche an die Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität gekoppelt sind, lassen sich zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit verwenden. Folglich stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend bispezifische Antikörper oder tetramere immunologische Komplexe in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wobei die bispezifischen Antikörper oder tetrameren immunologischen Komplexe an eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität und an eine Mikrogliazelle binden können, die p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimieren.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirkenden Menge der bispezifischen Antikörper oder tetrameren immunologischen Komplexe, die für eine Substanz mit toxischer oder therapeutischer Aktivität und für Mikrogliazellen, die p97 und/oder den Transferrinrezeptor exprimieren, spezifisch sind, und die an die Substanz gekoppelt sind, an einen Patienten, der diese Behandlung braucht, und Beobachten des weiteren Verlaufs des Erkrankungsstadiums und - wenn gewünscht - wiederholen der Verabreichung.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung können die viralen Vektoren zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit verwendet werden. Bei einer Ausführungsform der Erfindung werden virale Vektoren verwendet, so dass man die Expression von p97-antisense-RNA steuert und die Expression von p97 unterbindet. Im Stand der Technik gibt es virale Vektoren, die sich zur Verwendung bei der Erfindung eignen, einschließlich rekombinanten Vaccinia-Virusvektoren (US- Patente 4 603 112 und 4 769 330), rekombinanten Pockenvirusvektoren (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/01973), und vorzugsweise Retrovirusvektoren ("Recombinant Retroviruses with Arnphotropic und Ecotropic Host Ranges", PCT- Veröffentlichung Nr. WO 90/02806; "Retroviral Packaging Cell Lines and Processes of Using Same", PCT- Veröffentlichung Nr. WO 89/07150; und "Antisense RNA for Treatment of Retroviral Disease States", PCT Veröffentlichung Nr. WO 87103451).
Erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzungen (wie bspw. markiertes p97, markierter anti-p97-Antikörper, p97-Fusionsproteine, p97, konjugiert an ein Mittel, bispezifische Antikörper, tetrarciere Antikörper-Komplexe, Transferrinrezeptor-Blockierungsmittel, und Antikörper, die die Bindung von p97 an Eisen blockieren) können an einen Patienten zur Behandlung auf eine der Indikation entsprechenden Weise verabreicht werden. Die vorstehend beschriebenen therapeutischen Zusammensetzungen werden in Form eines Arzneimittels verabreicht, das ein gereinigtes Protein zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern, Exzipienten oder Verdünnungsmitteln umfasst. Diese Träger sind für den Empfänger in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch. Gewöhnlich umfasst die Herstellung dieser Zusammensetzungen das Zusammenführen des Therapeutikums mit Puffern, Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, niedermolekularen (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptiden, Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrinen, Chelatbildnern, wie EDTA, Glutathion, und anderen Stabilisatoren und Exzipienten. Neutral gepufferte Salzlösung oder Salzlösung im Gemisch mit nichtspezifischem Serumalbumin sind beispielhafte geeignete Verdünnungsmittel. Die Menge und Frequenz der Verabreichung hängt natürlich von solchen Faktoren ab, wie der Beschaffenheit und der Schwere der behandelten Indikation, der gewünschten Reaktion, dem Zustand des Patienten usw. Die Zusammensetzungen werden gewöhnlich durch Bolusinjektion, kontinuierliche Infusion, verzögerte Freisetzung aus Implantaten oder mittels anderer geeigneter Techniken verabreicht. Die Arzneimittel werden jedoch vorzugsweise direkt in die Cerebrospinalflüssigkeit abgegeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit über Knochenmarktransplantation. Knochenmarktransplantationen werden bei Patienten durchgeführt, deren Immun- und Blutbildungssystem durch Leukämie, Krebs, Chemotherapie, Strahlentherapie und dergleichen zerstört wurde. Stammzelltransplantationen können ebenfalls metabolische Störungen von Makrophagen, wie Osteoporose und schwere Gaucher-Krankheit, behandeln (Goldie, D. W. Scientific American, Dezember 1991, S. 86-93. Auf der Basis des erfindungsgemäßen Befundes, dass Mikrogliazellen, die mit Beta-Amyloidplaques in Alzheimer- Gehirn einhergehen, einen sehr hohen Expressionsgrad von p97 haben, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit durch Knochenmark- Transplantation bereit, wodurch der Patient genetisch veränderte Makrophagenpopulationen erhält. Mikrogliazellen sind Makrophagen, die das Gehirn bevölkern. Man nimmt bspw. an, dass die eigenen Myeloid-Stammzellen des Patienten genetisch verändert werden, so dass Makrophagen produziert werden, die nach der autologen Transpläntation Chemotherapeutika im Gehirn exprimieren. Stammzellen können vor der Transplantation zur Expression eines Chemotherapeutikums unter der Kontrolle eines Makrophagenspezifischen Promotors transformiert werden. Antagonisten von p97 und andere Verbindungen, die die Zellen an Eisen verarmen, sind Beispiele für geeignete Chemotherapeutika. Geeignete Chemotherapeutika können ebenfalls aus den vorstehend erläuterten cytotoxischen anti-Tumormedikamenten und Medikamenten, die Entzündung und Wachstum hemmen, ausgewählt werden. Entzündungshemmende Medikamente gibt es ebenfalls im Stand der Technik und werden bei der Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendet (Schnabel, J. Science 260: 1719-1720, 1993). Beispiele für entzündungshemmende Medikamente umfassen nichtsteroide entzündungshemmende Verbindungen, wie Indomethacin und aspirinartige Verbindungen.

BEOBACHTUNG UND BEHANDLUNG VON ZUSTÄNDEN, EINSCHLIESSLICH AKTIVIERTER PERICYTEN

Eine Untersuchung der Photographien von Alzheimer- Gehirnschnitten, die mit anti-p97-Antikörper gefärbt waren, zeigt anscheinend das Vorhandensein dunkel gefärbter Pericyten, die mit den Kapillar-Endothelzellen einhergehen. Dies legt nahe, dass diese Pericyten für p97 positiv sind. Somit kann p97 ein Marker für Pericyten sein, die mit den Endothelzellen der Gehirnkapillaren einhergehen, und kann ebenfalls ein spezifischer Marker für aktivierte Pericyten und Pericyten in Alzheimer-Gehirnen sein. Interessanterweise ist das Anschwellen der mit den Gehirn- Endothelzellen einhergehenden Pericyten zuvor mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht worden.
Pericyten sind multipotente Zellen, die eng mit den Endothelzellen der Mikrogefäße assoziiert sind und im Zentralnervensystem phagozytisch sind. Pericyten bilden enge Bindungen mit Endothelzellen und spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Regulation der Epithelzellen und beim Kapillarenwachstum, bspw. bei der Wundheilung und bei der Vaskularisierung der Tumore. Im Gehirn sind Pericyten besonders mit der Blut-Hirnschranke assoziiert und bilden eine sekundäre Verteidigungslinie durch phagozytierende Materialien, die die Blut-Hirnschranke durchqueren (Sims, D. E. Can. J. Cardiol. 7: 431-443, 1991). Pericyten konzentrieren runde Endothelzell-Bindungen und weisen eine kontraktile Reaktion auf Entzündung auf. Pericyten sind auf Endothelzellen von Gehirnkapillaren bei Alzheimer- Patienten zahlreicher, was zu einer drastischen Veränderung der Morphologie der cerebralen Mikrogefäße führt (Sims, D. E., Can. J. Cardiol. 7: 431-443, 1991).
Die Erfindung zeigt, dass p97 ein Marker für Pericyten, aktivierte Pericyten, Tumorvaskularisierung und Alzheimer-Gehirne sein kann. Sie lässt sich darum zur Beobachtung und Diagnostizierung von Zuständen verwenden, an denen aktivierte Pericyten wie hier beschrieben beteiligt sind. Man geht ebenfalls davon aus, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die p97 wie hier beschrieben verwenden, vorzugsweise Zusammensetzungen, welche Substanzen umfassen, die an p97, konjugiert an ein Toxin oder eine Substanz mit therapeutischer Aktivität, binden können, zur Behandlung von Zuständen, an denen aktivierte Pericyten beteiligt sind, wie Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Tumoren mit aktiver Vaskularisierung, Entzündungsleiden und neurologischen Störungen, geeignet sind.
Die nachstehenden Beispiele werden lediglich zur Veranschaulichung gegeben und sollen nicht einschränkend sein.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

TRANSFEKTION VON ZELLEN MIT p97-cDNA

Die Ovarzellinien des Chinesischen Hamsters ("CHO") WTB (Wildtyp) und TRVB (Transferrinrezeptor minus) (siehe McGraw et al., J. Cell. Biol. 105(1): 207-214, 1987) wurden auf 60 mm Kulturschalen plattiert. Hams F12-Medium, angereichert mit 10% FBS, 20 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin, 100 ug Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, wurde zur Erhaltung der Zelllinien vor dem Verfahren verwendet. Insbesondere die TRVb-1-Linie, die kein Hamster-TR, aber das transfizierte menschliche TR exprimiert, wurde in den gleichen Medien unter Zugabe von 100 ug/ml G418-Sulfat (Gibco) aufrecht erhalten. Die Zellen wurden bei 37ºC in einer feuchten Umgebung mit 5% CO&sub2; inkubiert, bis sie 80 bis 85% konfluent waren.
Gemischte DNA (27 ug pSVp97a (ATCC Nr. CRL 9304) in 3 ul, 0,5 ug pWJ218 (siehe Fig. 3) in 0,5 ul und 46,5 ul sterilem destilliertem Wasser) wurde mit 50 ul LipofectinTM-Reagenz (Life Technologies Inc./Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg MD) gemäß den Herstellerangaben vereinigt. Die Zellen wurden dann zweimal mit 3 ml serumfreiem Hams-F12-Medium gewaschen, in 3,0 ml Medium resuspendiert und vorsichtig in Gewebekulturschalen aufgewirbelt. Insbesondere die Plasmide pSV2 p97a, ein menschlicher p97-Expressionsvektor mit dem gesamten codierenden Bereich der vom SV40-Early-Promotor (ATCC Nr. 9304) gesteuerten p97-cDMA und pWJ218, mit dem G1418-Resistenzgen wurden in den Zelllinien durch das LipoFectinTM-Verfahren (Gibco, New York) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren kotransfiziert. Die Zellen wurden dann 36 Std. bei 37ºC in einer feuchten Umgebung mit 5% CO&sub2; inkubiert.
Ein gleiches Volumen Hams-F12-Medium mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und 1600 ug/ml G418 (Geneticin/Gibco) wurde zu den Gewebekulturschalen gegeben. Die Zellen wurden gewaschen, und die Medien (Harns F12 mit sämtlichen Anreicherungen, einschließlich 10% FBS und 800 ug/ml G418) täglich eine Woche gewechselt. Unter Verwendung des antip97-Antikörpers L235 (L235 ist insbesondere ein monoklonaler IgG-Antikörper, der von der Hybridom-Zelllinie ATCC Nr. HB 8446 sezerniert wird) wurden Zellpopulationen, die p97 exprimieren, mittels Durchflusszytometrie ("FACS") analysiert. Positive Zellpopulationen wurden dann weiter nach Zellen sortiert, die höhere Mengen p97 exprimieren.
Die Zellen wurden insbesondere gezählt (10&sup6; Zellen/Rohr) und zweimal in fluoreszenzaktiviertem Zellsortierungs- ("FACS")-Puffer, bestehend aus DMEM mit 0,5% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES und 20 mM NaN&sub3;, gewaschen. Die Zellen wurden mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern 45 min bei 4ºC inkubiert, dann gewaschen und mit dem geeigneten fluoreszierenden Sekundärantikörper 45 min bei 4ºC markiert. Die Zellen wurden dann in 1,5% (Vol./Vol.) p-Formaldehyd in PBS gewaschen und fixiert. Ein FACScan- Durchflusscytometer von Becton-Dickinson wurde zur Messung von 5000 Ereignissen pro Probe verwendet. Die Fluoreszenzintensitäten wurden in Bezug auf die unbehandelten Kontrollproben normalisiert. Die nachfolgenden Primärantikörper wurden zu immunhistochemischen Untersuchungen verwendet: anti- Mensch-MTf (L235, 1 : 1000 Verdünnung, monoklonales Maus-Igel, ATCC (HB104); anti-Mensch Tf (A-061, 1 : 1000 Verdünnung, Kaninchen, Polyklonal, DAKO); und anti-Mensch TR (OKT 9, 1 : 1000 Verdünnung, Maus monoklonäl, IgG&sub1;, ATCC CRL 8021). Gewebekulturüberstände oder über Protein-G-Säule (Pharmacia) gereinigte Präparate wurden als Quelle für Antikörper in den Experimenten verwendet. Positive Zellpopulationen wurden dann weiter nach Zellen sortiert, die höhere Mengen p97 exprimieren.
Positive Zellen wurden dann durch einschränkende Verdünnung subkloniert. Die resultierenden Zelllinien wurden nochmals mittels FACS analysiert, damit eine hohe p97- Expression gewährleistet war. Zwei Klone, die hohe p97- Mengen stabil exprimierten, wurden isoliert: p97aWTBc3 und p97aWTBc7.

BEISPIEL 2

EXPRESSION VON P97 AUF DER OBERFLÄCHE VON MIT p97-cDNA TRANSFIZIERTEN ZELLEN

A. Herstellung von Plasmid D5-9(+)

Der Expressiansvektor pVL1393 (siehe Luckow, "Cloning and Expression of Heterologous in Insect Cells with Baculovirus Vectors", Cloning Techniques and Applications, S. 122-123) wurde mit SmaI gespalten und dann mittels Phosphatase aus Kalbsdarm ("CIP") zur Verhinderung von Selbstligation gespalten.
Menschliche p97-cDNA aus Plasmid pSV2p97a wurde amplifiziert, und es wurde eine Minipräparation von Plasmid- DNA vorgenommen. Plasmid-DNA wurde dann mit HindIII und NruI gespalten, und ein 233 bp-Fragment wurde aus einem 1% Agarosegel in TAE isoliert. Der bei der HindIII-Spaltung entstandene 3'-Überhang wurde aufgefüllt, und das Fragment wurde gereinigt.
Das HindIII-NruI-p97-Fragment und der CIP- linearisierte pVL1393/SmaI-Vektor wurden ligiert und zur Transformation kompetenter DH5α-Zellen verwendet (Hanahan, D. DNA-Cloning Vol 1, A Practical Approach Series, Glover, Hrsg., Kapitel 6, S. 10&supmin;135, IRL Press, 1985). Positive Klone wurden ausgestochen, und Plasmid-DNA wurde aus Minipräparationen jedes Klons erzeugt. Ein besonders bevorzugtes Plasmid, D5-9(+) ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.

B. Transfektion von Sf9-Zellen

Spodoptera frugiperda oder "Sf9"-Zellen (ATCC Nr. CRL. 1711) wurden wie vorstehend beschrieben mit einem Gemisch von genomischer AcMNPV-Wildtyp-DNA und D5-9(+)-Plasmid-DNA transfiziert, und zwar im Wesentlichen nach dem Verfahren von Summers und Smith (A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin Nr. 1555, 1988 (1988; Abschnitt 4.4.1 Transfection of Sf9-Cells - Method I), wodurch das menschliche p97-Gen in das AcMNPV-Genom eingebracht wird.
Menschliche p97-rekombinante Viren wurden mit einem von Summers and Smith, siehe oben, beschriebenen Plaque- Assay gereinigt. Es wurden drei Plaque-Assay-Runden durchgeführt, so dass die rekombinanten Viren mit dem p97-Gen isoliert wurden. Diese umfassten: Runde 1: 10&supmin;&sup5;, Verdünnungen des Transfektionsgemischs: Runde 2: 10&supmin;¹, 10&supmin;², Verdünnungen der in Runde 1 ausgestochenen Plaques; und Runde 3: 10&supmin;³, 10&supmin;&sup4;, Verdünnungen der in Runde 1 ausgestochenen Plaques.

C. Ergebnisse

SK-MEL-28-Zellen (die bekanntlich p97 exprimieren, und die zum besseren Verständnis eine menschliche Melanom- Zelllinie ATCC HTB72 sind), nicht infizierte Sf9-Zellen, mit Wildtyp-AcMNPV infizierte Sf9-Zellen, und mit p97- rekombinantem Virus infiziertes Sf9 (p97 Bl-1 und p97 B-2- 1) wurden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) analysiert, so dass man p97-Expression auf der Zelloberfläche nachweisen konnte. Hybridom-Überstand aus anti-P97-Antikörper L235 wurde als Erstantikörper, und Ziege-anti-Maus(GAM)-IgG-FITC-Antikörper wurden als Zweitantikörper verwendet. Kontrollen wurden ohne fluoreszierenden Antikörper ("NFA") und mit PI-PLC (das den GPI- Anker spaltet, wobei p97 von der. Zelloberfläche abgegeben wird) behandelt.
Wie aus Tabelle I unten ersichtlich ist, waren SK-MEL- 28-Zellen und die mit p97-rekombinantem Virus infizierten Sf9-Zellen (p97 B-1-1 und p97 B-2-1) positiv in Bezug auf p97-Expression, wohingegen die nicht-infizierten Sf9-Zellen und die mit Wildtp-Virus infizierten Sf9-Zellen nicht positiv waren. Wurden die Proben zudem 60 min bei 37ºC mit PI- PLC vorinkubiert und dann mit den Erst- und Zweitantikörpern markiert, wurde die Menge p97 auf der Oberfläche von SK-MEL- 28-Zellen und auf der Oberfläche von mit p97-rekombinantem Virus infizierten Sf9-Zellen drastisch reduziert. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass das auf der Oberfläche von Sf9-Zellen exprimierte p97 wie bei SK-MEL-28-Zellen über einen Lipid-Anker auf der Oberfläche von Sf9-Zellen befestigt ist.

BEISPIEL 3

FREISETZUNG VON P97 DURCH BAKTERIELLES PI-PLC IN TRANSFIZIERTEN ZELLLINIEN

A. Wirkung von PI-PLC auf Zellen

PI-PLC wurde hergestellt, indem zuerst eine Kultur von Bacillus subtilis (BG2320) mit dem PI-PLC-Gen aus Bacillus thuringiensis transfiziert wurde. PI-PLC wurde dann aus den Überständen von transfizierten Zellen im wesentlichen nach dem von Low et al., in J. Immunol. Methods 113: 101-111, 1988, beschriebenen Verfahren gereinigt.
Insbesondere B. subtilis (BG2320), transfiziert mit dem Gen für PI-PLC aus B. thuringiensis (Renner et al., Nucleic Acids Research 16: 10383, 1988), wurde mit einem Verfahren, das demjenigen zur Anzucht von B. thuringiensis angepasst wurde, gezüchtet, (Low et al., J. Immunol. Methods 113: 101-111, 1988). Das Wachstumsmedium mit 10 g/l Polypepton; 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 0,4 g/l Na&sub2;HPO&sub4; und 15 ug/ml Chloramphenicol (pH-Wert mit NaOH eingestellt auf 7,0) wurde mit 1,5-3% (Vol./Vol.) einer Übernacht-Vorkultur (anfangs). D.&sub6;&sub0;&sub0; = 0,1) beimpft. Die Zellen wurden 6 bis 12 Std. in Erlenmeyer-Kolben bei 37ºC gezüchtet und bei 150 U/min geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand durch eine 0,2 um Membran (VacuCap, Gelman Sciences, MI) filtriert. Der Überstand wurde mit einer Ultrafiltrationszelle (Modell 8400, Amicon Corp. MA) und einem 10000 MW YM10- Ultrafilter (Amicon, MA) 20-fach konzentriert. Die konzentrierte Enzymlösung wurde dann zweimal mit 5 Volumina PBS in der Ultrafiltrationszelle gewaschen. Die Enzymlösung wurde untersucht und in 1 ml-Aliquots bei -20ºC aufbewahrt. Wenn das Enzym erforderlich war, wurde das gefrorene PI-PLC rasch aufgetaut und in PBS auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt. Sämtliche, bei dieser Untersuchung verwendeten Enzymproben kamen von der gleichen 2- Liter-Batch-Fermentation.
SK-MEL-28 (ATCC Nr. HTB 72)-Zellen und p97aWTBc3- Zellen (hergestellt wie vorstehend beschrieben) wurden gezüchtet, gezählt, in Röhrchen überführt (106 Zellen/Röhrchen) und zweimal mit FACS-Puffer (DMEM mit 0,5% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES und 20 mM NaN3) gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 Std. bei 37ºC mit gereinigter Phosphatidylinositol-spezifischer Phospholipase C (PI-PLC) bei einer Konzentration von 1,7 U/10&sup6; Zellen in FACS-Puffer inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, und mit anti-p97-Antikörper L235 45 min bei 4ºC gefärbt. Die Zellen wurden erneut in FACS-Puffer gewaschen und dann mit fluoreszierendem Ziege-anti-Maus-IgG 45 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann in 1,5% (Vol./Vol) p-Formaldehyd in PBS gewaschen und fixiert.
Ein Becton-Dickinson FACScan-Durchflusscytometer wurde zur Messung von 5000 Ereignissen pro Probe verwendet. Die Daten aus einzelnen Experimenten wurden insbesondere mit ungefärbten negativen Kontrollen verglichen und die Werte als Prozentsatz unbehandelter positiver Kontrollen ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 dargestellt. Den Fig. 5(c) und (d) zufolge wurde eine signifikant höhere Fluoreszenzaktivität für SK-MEL-28-Zellen und p97aWTBc3-Zellen erhalten, die nicht mit PI-PLC behandelt worden waren, als diejenigen, die behandelt wurden (Fig. 5e und f).
Kontrollzellen, die nicht mit anti-p97-Antikörpern gefärbt wurden (Fig. 5a und 5b), zeigten nur Hintergrund-Fluoreszenz. Daher ergab die Behandlung der SK-MEL- 28- und der p97a WTBc3-Zellen mit bakteriellem PI-PLC ein Absinken der p97-Expression an der Zeltoberfläche.

B. Pronasebehandlung der Zellen

Zur Bestimmung, ob bakterielles PI-PLC eine nichtspezifische Pronase enthielt, wurde Pronase zur Behandlung von Zellen verwendet, die entweder auf p97 oder den Transferrinrezeptor gefärbt wurden. Die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben behandelt, außer, dass die Zellen 1 Std. in FACS-Puffer bei 37ºC mit 1 mg/ml Pronase (eine Protease Typ XIV aus Streptomyces griseus (Sigma Chemical Co.)) statt mit PI-PLC inkubiert wurden.
Bei dieser Untersuchung wurden auch EL-4-Zellen getestet, die die Thy-1- und Transferrinrezeptorproteine auf ihrer Zeltoberfläche exprimierten. EL-4-Zellen sind Maus- Lymphomzellen (ATCC TIB 39). Thy-1 ist bekanntlich über einen GPI-Anker an der Zeltoberfläche verankert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 für SK-MEL-28, EL-4, p97aWTBc3 und p97aWTBc7-Zellen dargestellt. Für diese Experimente wurde p97 mit dem monoklonalen Antikörper L235 markiert, und der Transferrinrezeptor wurde mit monoklonalem OKT9 markiert. Thy-1 wurde mit dem T24/37.1-MAb (erhalten von Dr. R. Hyman, The Salk Institute, San Diego, CA) markiert, wohingegen der Transferrinrezeptor aus Maus mit dem monoklonalen Antikörper λE1/9.9.3 (erhalten von Dr. F. Takei, the University of British Columbia, Canada) markiert wurde. Geeignete fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper wurden gemäß dem Primärantikörpertyp verwendet. Die Ergebnisse wurden von logarithmischen in lineare Werte umgewandelt, und zwar mit der Formel: lineare mittlere Fluoreszenz = 10(log mittlere Fluoreszenz/256 Kanäle) Die Fluoreszenzintesitäten wurden in Bezug auf ungefärbte Kontrollproben und die Werte, ausgedrückt als Prozentsätze (± SA) von unbehandelten gefärbten Kontrollproben, normalisiert.
Wie in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt, waren sowohl das p97-Protein auf SK-MEL-28-Zellen als auch das Thy-1-Protein auf den EL-4-Zellen empfindlich gegenüber den Wirkungen von PI-PLC, jedoch nicht gegenüber den Wirkungen der Pronase. Die Transferrinrezeptoren auf den SK- MEL-28-Zellen und den EL-4-Zellen waren sensitiv gegenüber Pronase, aber nicht PI-PLC.
Diese Daten zeigen ebenfalls, dass das Ausmaß der p97-Expression auf SK-MEL-Zellen durch Behandlung mit bakteriellem PI-PLC von den Anfangswerten auf 10% gesenkt wurde. Die Expression des menschlichen Transferrinrezeptors (TR) auf SK-MEL-28-Zellen wurden durch Behandlung mit bakteriellem PI-PLC überhaupt nicht verändert.

BEISPIEL 4

AFFINITÄTSREINIGUNG VON p97

A. Herstellung der Affinitätsmatrix

p97 wurde im Wesentlichen wie unten beschrieben affinitätsgereinigt. Hierzu wurden kurz gesagt 2 ml Mischperlen (Protein-A-Sepharose CL-4B, Pharmacia #17-0963-03) aus dem Gefäß entnommen und dreimal in 5 ml 0,1 M Borat (pH- Wert 8,2) gewaschen. Die Perlen wurden dann in 6 ml Borat (pH-Wert 8,2), das 2,5 mg Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch, #315-005-003) enthielt, resuspendiert, und 60 min bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Die Perlen wurden dann 3 min bei 1800 U/min zentrifugiert, gefolgt von drei Zyklen. Waschen mit 5 ml 0,1 M Borat (pH-Wert 8,2).
L35-Hybridom-Überstand (Maus-anti-Mensch-p97-IgG) wurde zu den Perlen gegeben, und 60 min bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Die Perlen wurden dann wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und dreimal in 5 ml 0,1 M Borat (pH-Wert 8,2) gewaschen, gefolgt von dreimaligem Waschen in 5. ml 0,2 M Triethanolamin (pH-Wert 8,2). Die Perlen wurden dann in 20 ml Dimethylpimelidat-HCl in 0,2 M Triethanolamin resuspendiert, und anschließend 1 min zentrifugiert (500 · g). Die Zellen wurden in 20 ml 20 mM Ethanolamin (pH-Wert 8,2) resuspendiert und 5 min bei 22ºC inkubiert. Die Perlen wurden dann dreimal mit 5 ml 0,1 M Borat (pH-Wert 8,2) gewaschen und bei 4ºC in 5 ml 0,1 M Borat mit 20 mM Azid aufbewahrt.

B. Reinigung von p97 auf der Affinitätssäule

p97aTRV6c3-Zellen wurden bis zu 75-95%iger Konfluenz in Hams-Medium, angereichert mit LBS, HEPES, L-Glu, FEMS und 800 ug G418, gezüchtet. 100 ml Medium wurde mit einer Amicon Centriprep 30 eingeengt und mittels Affinitätschrofinatographie wie vorstehend beschrieben gereinigt. Eine Affinitätssäule zur Reinigung von p97 wurde im Wesentlichen wie in J. Biol. Chem. 257: 10766-10769, 1982 beschrieben hergestellt. Die Perlen (wie oben hergestellt) wurden kurz gesagt mit 0,1 M Boratpuffer (10 ml) gewaschen und zur Herstellung der Affinitätssäule verwendet. Die Säule wurde dann mit 2 ml Elutionspuffer, 0,05 Diethylamin, pH-Wert 11,5, mit 0,5% Natriumdesoxycholat, voreluiert, und dann wurde eine Probe des Gewebekulturmediums von Zellen durch die Säule geleitet. Die Säule wurde dann nacheinander mit 5 ml Puffer B (0,2% NP-40, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5), 5 ml Puffer C (0; 2% NP-40, 0,5 M NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) und 5 ml Puffer D (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5) gewaschen. Fünf ml Elutionspuffer wurde dann zugegeben, und 1 ml-Aliquots wurden gesammelt. 100 ul 0,5 M NaH&sub2;PO&sub4; wurden jeweils zu den Aliquots gegeben, damit die Proben neutral wurden.
Die Reinheit wurde getestet mittels PAGE (mit Coomassie Blue, Silberfärbung oder Autoradiographie), und Spektralphotometrie. Die Fig. 34 zeigt die Reinigung von p-97.

BEISPIEL 5

ZELLOBERFLÄCHEN-BIOTINYLIERUNG, PI-PLC-BEHANDLUNG UND IMMUNFÄLLUNG

Die Wirkung von bakteriellem PI-PLC und die Spezifizität des monoklonalen Antikörpers L235 wurde gemäß Fig. 6 weiter charakterisiert, wobei Oberflächenproteine aus WTB (Spur 1), p97aWTBc7 (Spur 2) oder SK-MEL-28-Zellen (Spur 3) mit Biotin markiert wurden, gefolgt von einer Immunfällung von p97 und Analyse durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen.
Die Oberflächenproteine von 3,0 · 10&sup6; SK-MEL-28- Zellen wurden mit 0,2 mg Biotinamidocaproat-N- Hydroxysuccinimid-Ester (Biotin, Sigma) im Wesentlichen wie von Boxberg et al., (Eur. J. Biochem. 190: 249-256, 1990) beschrieben, markiert. Die Zellen wurden mehrmals in DMEM gewaschen und auf zwei Proben aufgeteilt, die 60 min bei 6ºC in Gegenwart bzw. Abwesenheit von PI-PLC (1,7 U/10&sup6; Zellen) inkubiert wurden. Der Zellüberstand und das Zellpellet wurden nacheinander verarbeitet. Die Zellen wurden nochmals in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM Phenylmethylsulfonylchlorid (PMSF) und 100 ug Lysin gewaschen und lysiert, damit man das überschüssige freie Biotin blockiert. Der gleiche Puffer wurde zum Überstand gegeben. Die Proben wurden 10 min bei 4ºC und 12000 g zentrifugiert, so dass die Zellkerne und Zelttrümmer entfernt wurden. Die Proben wurden 2 Std. mit gewaschener Protein-A-Agarose vorgeklärt.
Das p97 wurde mit Antikörper L235 immungefällt, gefolgt von Protein A-Agarose, vorbeschichtet mit Kaninchenanti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch). Nach der Immunfällung wurden die Perlen sechsmal in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0,5% NP-40 gewaschen. Die Proteine wurden aus den Perlen in Natriumdodecylsulfat- (SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(PAGE)-Ladungspuffer eluiert, und auf einem 8%igen SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Elektroblotting auf Immobilon-Membranen (Millipore) übertragen und mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin (Jackson ImmunoResearch) und Chemilumineszenz-ECL-Western-Blot- Erfassungssystem (Amersham) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen nachgewiesen.
Der Fig. 6 zufolge wurde ein einzelnes Protein von 95-97000 Dalton Molekülmasse immungefällt in Spur 2 (p97aWTBc7) und in kleineren Mengen in Spur 3 (SK-MEL-28), jedoch nicht in Spur 1 (WTB). Die PI-PLC-Behandlung der Zellen ergab eine geringere Menge Protein, und zwar aufgrund eines großen Proteinverlusts aus der Zelloberfläche (Vergleiche Fig. 6A, Spuren 2 (+) und (-)), was anschließend im Zellüberstand erhalten wurde (Fig. 6B). Unter den bei diesen Experiment verwendeten Bedingungen konnte kein Unterschied bei der Molekülmasse zwischen der mit der Plasmamembran assoziierten Form und der freigesetzten Form nachgewiesen werden.

BEISPIEL 6

BIOSYNTHETISCHE MARKIERUNG MIT [³H]-ETHANOLAMIN

Zur Bestimmung, ob die Abnahme der nach der bakteriellen PI-PLC-Behandlung beobachteten p97-Expression eine indirekte Wirkung aufgrund der Assoziation von p97 mit einem anderen PI-PLC-sensitiven Protein an der Zelloberfläche erfolgte, wurden SK-MEL-28-Zellen mit [³H]-Ethanolamin biosynthetisch markiert, was bekanntlich eine Komponente der Phospholipideinheit der Proteine mit GPI-Anker ist.
SK-MEL-28-Zelllinien-M'onolayer wurden 24 Std. mit [³H]-Ethan-1-ol-2-amin-Hydrochlorid (20 uCl/ml, 30,4 Cl/mmol, Amersham) in DMEM mit 5% dialysiertem FBS, 20 mM HEPES, 100 U/ml Penicillin, 100 ugJml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 5,0 · 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol biosynthetisch markiert. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0,5% NP-40 mit 20 ug/ml PMSF lysiert. Die Lysate und die Zellüberstände wurden dann durch Zentrifuation, insbesondere 1 Std. bei 100000, vor der Immunfällung geklärt. Die verwendeten Primärantikörper waren L235 für p97 und OKT9 für menschliches TR. Protein-A-Agarose (BioRad), beschichtet mit Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörper (Jackson ImmunoResearch) wurde zu den Proben gegeben und 8 Std. bei 4ºC inkubiert. Der erhaltene Komplex wurde in 50 mM Tris- HCl, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl, 2mM EDTA, und 0,5% NP-40 gewaschen und in SDS-Ladungspuffer resuspendiert. Die Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einem 10- 15% Gradienten-SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Nach dem Fixieren wurde das Gel mit AmplifyTM (Amersham) behandelt, getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen.
Der Fig. 7 zufolge wurde p97 in den Spuren 1 und 2 mit dem anti-p97-Antikörper L235 immungefällt, und ist aufgrund der Markierung durch [³H]-Ethanolamin sichtbar. Der menschliche Transferrinrezeptor wurde dagegen mit demanti-Transferrinrezeptor-Antikörper OKT9 in den Spuren 3 und 4 immungefällt, ist jedoch nicht sichtbar, da es nicht mit [³H]-Ethanolamin markiert winde:
WTB-Zellen (Spuren 1, 2) und p97aWTBc3-Zellen (Spuren 3, 4) wurden mit [³H]-Ethanolamin gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren biosynthetisch markiert. Proteine wurden dann durch den anti-p97-Antikörper L235 (Spuren 1 und 3), und den anti-Transferrinrezeptor-Antikörper (Spuren 2 und 4) gefällt. Der Fig. 8 zufolge fiel nur Protein (p97) aus der p97aWTBc3-Zelllinie aus und wurde mit [³H]- Ethanolamin markiert.

BEISPIEL 7

PHASENTRENNUNG VON p97 IN TRITON X-114

Diese Technik der Phasentrennung in Triton X-114 kann zur Bestimmung des amphipathischen oder hydrophilen Charakters eines Proteins verwendet werden und eignet sich besonders zur Identifizierung von Proteinen mit GPI-Anker. Diese Technik beruht auf der Fähigkeit des Detergenzes Triton-X-114 zur Aufteilung in zwei Phasen: eine detergenzreiche Phase und eine detergenzarme Phase. Amphipathische Proteine, die einen hydrophoben Membrananker besitzen, wie einen GPI-Anker, wandern in die detergenzreiche Phase, wohingegen hydrophile Protein in die wässrige Phase wandern.
Zur Untersuchung, ob sich p97 in Triton-X-114 verteilt, wurden die Zelloberflächenproteine von 8,0 · 10&sup6; SK-MEL-28-Zellen mit 0,4 mg Biotin (Sigma) wie oben beschrieben markiert, wobei nach den Verfahren vorgegangen wurden, beschrieben in von Bonberg, Y. et al., (Eur. J. Biochem. siehe oben). Die Zellen wurden mehrmals in DMEM gewaschen, in zwei Proben unterteilt, die 60 min bei 6ºC in Gegenwart bzw. Abwesenheit von PI-PLC (1,7 U/10&sup6; Zellen) inkubiert wurden. Der Zellüberstand und das Zellpellet wurden nacheinander verarbeitet. Die Zellen wurden nochmals in einem Puffer mit 10 mM Tris-HCl pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-114, 1 mM PMSF und 100 ug/ml Lysin gewaschen und lysiert, so dass Biotin blockiert wurde. Triton X-114. (Sigma) wurde wie von Bordier (J. Biol. Chem. 256: 1604-1607, 1981) beschrieben vorkondensiert. Der gleiche Puffer wurde zum Überstand gegeben. Die Proben wurden 10 min bei 4ºC und 12000 g zentrifugiert, so dass die Zellkerne und die Zelttrümmer entfernt wurden. Die Phasentrennung wurde durch Inkubation bei 30ºC, gefolgt von einer Zentrifugation für 3 min (3000 g) bei Raumtemperatur erzielt. Die Proben wurden dreimal reextrahiert, damit die Trennung verbessert wurde und die entsprechenden Phasen vereinigt wurden.
Die Proben wurden 2 Std. mit gewaschener Protein-A- Agarose gewaschen und anschließend in zwei Hälften zur Immunfällung von p97 und den Transferrinrezeptor mittels monoklonalen L235- und OKT9-Antikörpern aufgeteilt, gefolgt von Protein-A-Agarose, vorbeschichtet mit Kaninchen- anti-Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch). Nach der Immunfällung wurden die Proben sechsmal in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0,5% NP-40 gewaschen. Die Proteine wurden von den Perlen in SDS-PAGE-Ladungspuffer eluiert, und auf einem 8% SDS-PAGE-Gel unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Elektroblotting auf Immobilonmembranen (Millipore) übertragen, und mittels Peroxidase-konjugiertem Streptavidin (Jackson ImmunoResearch) und dem Chemilumineszenz ECL Western-Blot- Erfassungssystem (Amersham) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen nachgewiesen.
Fig. 9 zeigt Ergebnisse von Zellen, die in DMEM gewaschen wurden und in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von PI-PLC (1,7 U/10&sup6; Zellen) 60 min bei 6ºC inkubiert wurden. Proteine aus dem Zellpellet (P) oder dem Zellüberstand (S) wurden in Triton-X-114-Lösung getrennt, und p97 und TR wurden aus der wässrigen Phase (A) oder der Detergenzphase (D) immungefällt. Die Fig. 9 zeigt, dass sämtliche p97-Moleküle, die an der Oberfläche von unbehandelten menschlichen Melanom-SK-MEL-28-Zellen exprimiert wurden, in die detergenzreiche Phase verteilt wurden. Kein p97 wurde in den Überständen unbehandelter Zellen nachgewiesen. Die Behandlung mit bakteriellem PI-PLC bewirkte die Verteilung von p97 in die wässrige Phase der Zellüberstand-Probe, was anzeigt, dass das Protein aus der Plasmamembran gespalten und als hydrophile Form abgegeben wurde. Kein p97 konnte in dem mit bakteriellem PI-PLC behandelten Zellpellet nachgewiesen werden, was anzeigt, dass die meisten Moleküle gegenüber bakteriellem PI-PLC empfindlich sind und dass p97 nicht gleichzeitig in einer Transmembran- und einer Form mit GPI-Anker an der Zeltoberfläche exprimiert wird. TR, das über ein hydrophobes Peptid- Segment in der Plasmamembran eingelassen ist, wird im Gegensatz zu p97 nicht von bakteriellem PI-PLC beeinträchtigt. Die amphiphile Struktur bewirkt, dass das Protein nach der Trennung in beide Phasen verteilt wird.

BEISPIEL 8

SPEZIFITÄT DES ANTI-P97-ANTIKÖRPERS L235 UND DES ANTITRANSFERRINREZEPTOR-ANTIKÖRPERS OKT9

A. Zeltoberflächen-Expression

Die Reaktivitäten der anti-p97-Antikörper L235 und OKT 9 wurden bestätigt. Die Zelloberflächenexpression von menschlichem p97 und menschlichem TR wurde durch Färben der SK-MEL-28-Zellen mit dem L235- und OKT9-MAb und Analyse durch FACS wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. Aas menschliche p97-Molekül wurde viel stärker als das menschliche TR exprimiert. Die Expression von p97 durch die p97aWTBc3-Zelllinie (s. Beispiel 1, erneute Herstellung von p97aWTBc3) war beträchtlich höher als bei der SK- MEL-28-Zelllinie (Fig. 10). Die Spezifität des L235-MAb gegen p97 wurde durch das Fehlen der Reaktivität gegen die parenterale (nicht transfizierte) CHO-Zelllinie WTB bestätigt. Zugleich wurde die Spezifität des OKT9-MAb für menschliches TR gezeigt. Die Reaktivität, die bei der SK- MEL-28-Linie deutlich auftritt, fehlt bei den. Linien WTB und p97aWTBc3, ist jedoch in der TRVb-1-Linie vorhanden.

B. Biosynthetische Markierung

Die Schicksale von p97 und TR nach der biosynthetischen Markierung von SK-MEL-28, WTB und p97aWTBc3-Zellen wurden ebenfalls untersucht. SK-MEL-28, WTB und die p97- transfizierten p97aWTBc3-Zellen wurden auf Petrischalen gezüchtet, bis 80-90%ige Konfluenz erreicht wurde. Die Zellen wurden dann in Minimalmedium ohne Methionin 1 Std. vor der Markierung behandelt. Die biosynthetische Markierung von Zellen erfolgte während 15 min mit 2 ml 150 uCl/ml [³&sup5;S]Methionin je Petri-Schale. Die Zellen wurden dann mit normalem Medium mit einem Überschuss an nicht radioaktiv markiertem Methionin zu verschiedenen Zeiten gechased. An jedem Zeitpunkt wurde eine gesonderte Petrischale verwendet. Die Zellen wurden in 20 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA und 1% NP-40 mit 20 ug/ml PMSF lysiert. Die Lysate und die Zellüberstände wurden dann vor der Immunfällung durch Zentrifugation geklärt. Die verwendeten Primärantikörper waren L235 und OKT9 wie oben beschrieben. Die Immunfällung und die SDS-PAGE- Analyse wurden wie in Kvist et al., (1982, Cell 29, 61-69) beschrieben, durchgeführt.
Der L235-MAb erkannte ein Protein mit einem MW von 93 kDa (Fig. 11, Spur 1), das zu einem höheren MW von 95 kDa nach 6 Std. Chase prozessiert wurde (Fig. 11, Spuren 1, 2). Dieses Protein trat nicht bei WTB-Zellen (Fig. 11, Spuren 1, 2) auf. Eine erheblich größere Menge dieses Proteins kommt in den p97-transfizierten CHO-Zellen, p97aWTBc3 (Fig. 11, Spuren 1, 2) vor, wobei dieses Protein als p97 identifiziert wurde: Eine sezernierte Form von p97 war zudem im Zellüberstand nach 6 Std. Chase zugegen (Fig. 11, Spur 4). Der OKT9-MAb erkannte ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht in SK-MEL-28-Zellen, die der reduzierten Form des menschlichen TR entsprach (Fig. 11, Spuren 5, 6). Der menschliche TR trat nicht im Zellüberstand auf (Fig. 11, Spuren 7, 8). Die L235- und OKT9- MAb kreuzreagierten auf keinen Fall mit Hamster p97 und TR in der CHO-Linie WTB.
Diese Daten bestätigen einzeln und zusammen die Spezifität des L235-Antikörpers für p97. Sie bestätigen auch, dass p97 und TR synthetisiert und zur Zelloberfläche transportiert wurden. Eine Form von p97 wurde ebenfalls im Medium identifiziert.

BEISPIEL 9

BIOSYNTHESE UND TRANSPORT VON P97

A. [³&sup5;S]-Methionin-Pulse-Chase-Experimente

Zur Untersuchung der Biosynthese und des Transports von p97 in Melanomzellen wurden Pulse-Chase-Experimente durchgeführt. Die SK-MEL-28-Zellen wurden mit 150 uCl/ml [³&sup5;S] Methionin 15 min markiert, gewaschen und anschließend mit normalem Medium, das einen Überschuss nicht radioaktives Methionin enthielt, zu verschiedenen Zeiten markiert. An jedem Zeitpunkt wuren die Überstände von den 0Zellkulturen in einer gesonderten Petrischale gesammelt, und die Zellen wurden in einem nicht-ionischen Detergens (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA und 1% NP-40 mit 20 ug/ml PM : F) lysiert. Die Lysate und Zellüberstände wurden dann durch Zentrifugation (100000 für 1 Std.) geklärt und anschließend immungefällt. Die verwendeeten Primärantikörper waren L235, der p97 erkennt, und OKT9, der menschlichen Transferrinrezeptor erkennt. Das p97-Molkül und als Kontrolle, das TR, wurden aus dem Zelllysat (Fig. 12, Spuren 1-7) und aus dem Gewebekulturüberstand (Fig. 12, Spuren 8-14) immungefällt und durch SDS- PAGE analysiert.
Der Fig. 12 zufolge wurde das p97-Molekül während des Chase zu einer Form mit höherem Molekulargewicht prozessiert (Fig. 12, Spuren 1-7). Die Prozessierung von p97 ist bis zu viermal langsamer als die Prozessierung von TR (Fig. 12, Spuren 1-7). Zudem wurde p97 in das Medium sezerniert (Fig. 12, Spuren 8-14), wobei kein TR im Medium vorkam. Das Erscheinen der sezernierten Form lässt sich nach nur 1 Std. Chase auf einem überexponierten Gel nachweisen, was anzeigt, dass die Transportgeschwindigkeit der sezernierten Form mit der der membranassoziierten Form vergleichbar ist.

B. Endo-H-Spaltung beim [³&sup5;S]-Methionin-Pulse-Chase

Der Transport der Glycoproteine lässt sich durch Modifikation ihrer Glycane bei der nachfolgenden Exposition gegenüber golgispezifischen Enzymen bestimmen, die resistent gegenüber Endoglycosidase H (Endo H) werden. SK-MEL- 28-Zellen wurden 15 min mit [³&sup5;S]-Methionin markiert, und mit einem Überschuss an unmarkiertem Methionin für die unten in Fig. 13 angegebene Dauer gechased, lysiert, und mit L235-MAb (p97) und OKT9-MAb (TR) wie vorstehend beschrieben immungefällt. Die Präzipitate wurden mit 5 mM Endo H (Boehringer Mannheim) 20 Std, bei 37ºC gespalten und wie vorstehend beschrieben analysiert. Die Autoradiogramme wurden nach dreitägiger Exposition des Gels entwickelt.
Der Fig. 13 zufolge sind die meisten p97-Moleküle nach 4 Std. Chase Endo-H-resistent (Fig. 13, Spur 6). Dagegen sind nur 1 Std. Chase nötig, damit der TR gegenüber Endo-H-Spaltung resistent wird (Fig. 13, Spur 4). Die Transportgeschwindigkeit der sezernierten Form und der Form mit GPI-Anker von p97 ist viel lagsamer als die Transportgeschwindigkeit von TR. Dieser Unterschied zeigt, dass p97 zur Erzielung einer Conformation oder einer Struktur, die den Transport durch den Golgi-Apparat und zur Zeltoberfläche ermöglicht, viel mehr Zeit benötigte. Die sezernierte Form von p97 ist resistent gegenüber Endo- H-Spaltung, was anzeigt, dass die lösliche Form den normalen sekretorischen Weg zum Transport zur Zeltoberfläche nimmt. SK-MEL-28-Zellen wurden 15 min mit 200 uCl/ml 355- Methionin pulsmarkiert und mit einem Überschuss an nicht radioaktivem Methionin 0 min. 30 min. 1, 2, 4, 8 oder 24 Std. gechased. Proteine wurden mit L235- und OKT9- Antikörpern immungefällt, wobei eine Protein-A-Sepharose verwendet wurde, die mit Kaninchen-anti-Maus-IgG vorbeschichtet war. Die Zellen wurden vor der Pulse-Chase- Markierung mit Minimalmedium ohne Methionin vorbehandelt. Radioaktive Zelllysate und Zellüberstände wurden mit normalem Kaninchenserum vorgeklärt und dann immungefällt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 35 gezeigt. Die obere Bande entspricht der löslichen Form und ist gegenüber Endo-H- Spaltung resistent.

C. Triton-X-114-Phasentrennung von [³&sup5;S]-Methioninmarkierten SK-MEL-28-Zellen

Die sezernierte p97-Form wurde durch Triton-X-114- Phasentrennung des Zellüberstands analysiert. SK-MEL-28- Zellen wurden 30 min mit [³&sup5;S]-Methionin markiert und mit einem Überschuss an nicht radioaktivem Methionin für die in Fig. 14 oben angegebene Dauer gechased. Die wässrige (A) und Detergenz-Phase (D) aus dem Medium wurden nach der Triton-X-114-Phasentrennung analysiert, mit L235-MAb (p97) immungefällt und auf SDS-PAGE wie vorstehend beschrieben aufgetrennt. Das Autoradiogramm wurde nach viertägiger Exposition des Gels entwickelt.
Der Fig. 14 zufolge verteilte sich das nach einem 4Std. Puls und einem 24 Std. Chase in das Zeltmedium sezernierte p97 in die wässrige Phase, was zeigt, dass diese Form keinen hydrophoben Schwanz hat. Nach 24 Std. Markierung mit [³H]-Ethanolamin und 30-tägiger Exposition konnte kein Ethanolaminmarkiertes p97 im Medium von p97- transfizierten p97aWTBc3-Zellen (Fig. 15, Spuren 3 und 4) und SK-MEL-28-Zellen (Fig. 15, Spuren 7 und 8) nachgewiesen werden. Es ist eindeutig, dass [³H]-Ethanolaminmarkiertes p97 (Fig. 15, Spuren 1, 2 und 6) zugegen ist, das mit den Detergenz-Lysaten der p97aWTBc3- und SK-MEL- 28-Zellen assoziiert ist, jedoch wird die sezernierte p97- Form nicht markiert. Bei einem ähnlichen Experiment mit [³&sup5;S] Methionin-Markierung ist die sezernierte Form nach einer dreitägigen Exposition einer 15minütigen Markierung eindeutig vorhanden (Fig. 12).
Zur Bestimmung, ob die sezernierte p97-Form aus der Freisetzung von Zelloberflächen-p97 mit GPI-Anker oder von einer synthetisierten, ins Medium sezernierten löslichen Form stammte, wurde das Schicksal von biotinyliertem Zelloberflächen-p97 untersucht (Fig. 16). Biotinyliertes Zelloberflächen-p97 und TR wurden in normalem Medium gechased und nach Immunfällung, Elektroblotting und Nachweis durch Peroxidase-konjugiertes Streptavidin und das Chemilumineszent-ECL-Western-Blot-Erfassungssystem durch SDS- PAGE analysiert. Die wässrige und die Detergenz-Phase von Triton-X-114 aus Zelllysat und Medium wurden dann analysiert.
Der Fig. 16 zufolge wurde kein p97 im Medium nach 6 Std. Chase (Fig. 16, Spuren 11 und 12) angereichert ( Fig. 16, Spuren 11 und 12). p97 war wie TR immer mit Zellen assoziiert und wurde immer in die Detergenzphase verteilt, was auf ein hydrophobes Protein schließen lässt (Fig. 16, Spuren 2, 6, und 10). Es schienen daher zwei p97-Formen synthetisiert zu werden, eine ist durch einen GPI-Anker an die Membran gebunden und verbleibt auf der Zeltoberfläche, und die zweite Form wird ins Medium sezerniert.

BEISPIEL 10

LOKALISATION VON P97 IN GEHIRNSCHNITTEN DURCH INDIREKTE IMMUNPEROXIDASE

A. Expression des Transferrinrezeptors und p97 in Gehirngeweben von Gesunden und Alzheimer-Patienten

Es wurden 30 Gehirne untersucht, nämlich 7 mit Alzheimer-Krankheit (AD) (Alter 67-81 Jahre), 5 mit Parkinson-Krankheit (PD) (Alter 69-7H Jahre) (von denen 3 AD- Änderungen hatten), 3 mit fortschreitender supranukleärer Lähmung (PSP) (Alter 60-66 Jahre), 3 mit Chorea Huntington (HD) (Alter 49-63), 2 mit Multipler Sklerose (MS) (Alter 56-66), 4 mit amyotropher lateraler Sklerose (ALS) (Alter 48-81) und 7 nicht-neurologische Kontrollen (Alter 54-82 Jahre). In allen Fällen wurden die Gehirne 2-32 Std. nach dem Tod erhalten. Kleine Blöcke wurden seziert aus verschiedenen Gehirnregionen nicht-neurologischer Fälle, und zwar angulare, entorhinale Kortizes und Hippocampus von AD, angulare entorhinale Kortizes, Hippocampus und Substantia nigra von PD, präzentraler Kortex, Basalganglien von PSP, Striatum von HD, cerebrale weiße Substanz mit MS- Plaques und präzentralem Gyrus und Rückenmark Von ALS. Diese Blöcke wurden zwei Tage in phosphatgepufförtem 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden sie in eine Erhaltungslösung aus 15% Sacchärose in 0,1 M Phosphat- Puffer, pH-Wert 7,4, überführt und bis zur Verwendung kalt gehalten. Die Schnitte wurden mit einem Gefriermikrotom bei 30 mm Dicke geschnitten und durch einzelne oder doppelte immunhistochemische Verfahren gefärbt (McGeer et al., 1992), wobei Primärantikörper verwendet wurden. Die Antikörper und ihre Verdünnungen waren: anti-Mensch-p97, 1 : 1000 (monoklonaler Maus-L235, American Type Cell Culture HB 8446; R-17, 1 : 10000 (polyklonaler Kaninchen-anti-BAP- Antkörper, freundlicherweise überlassen von Dr. Ishii); anti-HLA-DR-Antikörper, 1 : 1000; anti-Mensch- Transferrinrezeptor-Antikörper OKT9, American Type Cell Culture CRL 8021). Die Spezifitäten des monoklonalen L235-Antikörpers und des monöklonalen OKT9-Mab-Antikörpers für p97 bzw. TR wurden zum besseren Verständnis wie hier beschrieben bestätigt.

B. Expression von p97 und TR in gesunden und AD-Gehirnen

Immunhistologische Verfahren wurden zur Untersuchung der Verteilung von p97 und TR in einem gesunden menschlichen Gehirn verwendet. Die Färbung von menschlichem Kontroll-Gehirngewbe mit L235 (Fig. 17a), A-061 (Fig. 17b) und OKT9-MAb (Fig. 17c) ist gezeigt. In menschlichem Kontrollgehirngewebe (Cortex) wurde das Kapillar-Endothel stark mit L235 (Fig. 17a) und OKT9 (Fig. 17c) gefärbt. Das Färbungsmuster, das mit dem anti-Transferrin-MAb erhalten wurde, ist dagegen vollkommen anders und nicht auf diese Strukturen begrenzt (Fig. 17e).
Die eingeschränkte Färbung mit A-061-MAb ist auf kleine runde Oligodendrocyten begrenzt, wie vorher vorgeschlagen (Connor et al., 1990). Diese Daten belegen die gleichzeitige Expression von TR und p97 auf Kapillar- Endothel in normalem Gehirn, das die Blut-Hirnschranke ausmacht. Tf wird nicht zusammen mit TR oder p97 gefunden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktionen von p97 und TR eng miteinander verzahnt sind.
Das identische Expressionsmuster von TR und p97 wurde weiter in neuropathologischem Gehirngewebe untersucht. Ein Vergleich von normalem und AD-Gehirngeweben, die auf MTf und TR gefärbt wurden, zeigten wiederum die gleichzeitige Expression von p97 und TR.
Die Fig. 17A zeigt, dass normale angulare cortikale graue Substanz mit anti-p97-MAb gefärbt wurde. Nur das Kapillar- Endothel war positiv. Fig. 17B zeigt, dass angulare cortikale graue Substanz, die mit anti-p97-MAb gefärbt wurde, und daneben einige Mikrofilia, positiv gefärbt wurden (Pfeile). Die Fig. 17C zeigt einen Schnitt nahe Schnitt 17A, der mit anti-Transferrinrezeptor MAb gefärbt wurde. Wie in Fig. 17A ist nur das Kapillarendothel positiv. Die Fig. 17D zeigt einen nahen Schnitt zu B, der mit anti- Transferrinrezeptor MAb gefärbt wurde. Wie in B sind Kapillare und einige Mikrofilia (Pfeile) positiv. Die Fig. 17E zeigt einen normalen angularen Cortex, der mit polyklonalem anti-Transferrin-Antikörper gefärbt wurde. Das spärliche Cytoplasma einiger weniger Zellen, welche Oligodendrocyten (Pfeile) ähneln, waren positiv. Fig. 17F zeigt einen angularen Cortex von einem mit polyklonalem anti-Transferrin-Antikörper gefärbten Alzheimer-Gehirn. Spärlich vorkommende Zellen, die Oligodendrocyten ähneln (Pfeile) und seltene Zellen, die Mikroglia ähneln, waren positiv.
Die Bindung des OKT9-Antikörpers an Kapillar- Endothelzellen in Alzheimer-Gehirnen ist identisch mit der bei Kontrollgehirnen, jedoch wird daneben ein Teil der Mikrogliazellen ebenfalls gefärbt. Der anti-Transferrin-MAb färbte dagegen nicht die Kapillaren und färbte nur gelegentlich Oligodendrocyten und Mikroglia in der weißen Substanz (Fig. 17F). Das Färben der Schnitte aus AD- und normalen Geweben aus der gleichen Region des Gehirn-Cortex mit dem L235-MAb ergab, dass die Verteilung von p97 identisch mit dem von TR war (Fig. 17c, 17d). Mikrogliazellen und Endothelzellen wurden markiert. Bei Experimenten mit anderen pathologisch beeinträchtigtem Gehirngewebe mit PD, PSP, HD, MS oder ALS erfolgte weder mit L235- noch mit OKT9-MAb Mikrogliafärbung. Bei Kontrollexperimenten, bei denen der Primärantikörper weggelassen wurde, erfolgte keine Färbung von Zellen oder anderen Strukturen bei AD- oder Kontroll-Gehirngewebe. Diese Daten stützen die einzigartigen und identischen Verteilungen von p97 und TR in AD-Gewebe.
Bei der Untersuchung der vorstehend genannten Gehirnschnitte stellte sich heraus, dass die Markierung der Alzheimer-Gehirnschnitte mit anti-p97-Antikörper eine identische Verteilung wie die der Transferrinrezeptorspezifischen Antikörper ergab. Tatsächlich wurden jedoch Mikroglia- und Endothelzellen markiert. Bei Kontrollen nur mit Sekundärantikörpern erfolgte jedoch keine Markierung irgendwelcher Zellen oder Strukturen beim Gehirn von Gesunden oder Alzheimer-Patienten.
Zur Definition von Strukturen die p97 in Kapillaren exprimieren wurde Elektronenmikroskopie eingesetzt. Gehirngewebe wurde zur Elektronenmikroskopie wie in Beispiel 10D beschrieben präpariert. Die DAB-Reaktionsprodukte in den mit anti-p97-Antikörpern gefärbten Schnitten traten im Cytoplasma auf und waren an die Membran von Endothelzellen gebunden (Fig. 18). Diese Ergebnisse, die das Vorhandensein von p97 auf der Oberfläche von Kapillarzellen und im Cytoplasma von Kapillarzellen veranschaulichen, zeigen eine Rolle für p97 beim Transport durch das Gehirn-Endothel. In Fig. 18 sind Kapillarzellen CP-markiert, rote Blutzellen sind RBC-markiert, und das Cytoplasma ist CYT- markiert.
Zusammengefasst scheint die Expression von p97 und Transferrinrezeptoren durch Mikrogliazellen bei Gehirnschnitten von Alzheimer-Patienten spezifisch für diese neurologische Störung zu sein. Keine Mikrogliafärbung wurde bei Gehirnschnitten mit PD, PSP, HD, MS oder ALS beobachtet.

C. Expression des p97-Antigens ist auf Mikrogliazellen beschränkt, die mit Amyloid-Plaques assoziiert sind

Zur Bestimmung der Häufigkeit und der Verteilung von Mikrogliazellen, welche p97- oder Transferrinrezeptor- Moleküle exprimieren, wurden Doppelmarkierungsexperimente mit Antikörpern durchgeführt, welche mit β-Arnyloid-Protein ("BAP") oder HLA-DR-Molekülen reagieren. Die Fig. 191 zeigt die Doppelmarkierung von Beta-Amyloid-Protein (BAP) und HLA-DR. Die BAP-Markierung erscheint als diffuse Plaques. Mikrogliazellen im Gewebe wurden klar vom HLA-DR- reaktiven Antikörper markiert, einschließlich solchen Zellen, die nicht mit Amyloid-Plaques assoziiert sind.
Bei Doppelmarkierungsuntersuchungen mit BAP-reaktiven Antikörpern erscheint ein unterschiedliches Muster. Der p97-reaktive Antikörper identifiziert selektiv diejenigen Mikrogliazellen, die mit dem senilen Plaque einhergehen. Dies scheint durchgehend bei den bisher untersuchten AD- Geweben zu sein. Darüber hinaus scheinen die Mikrogliazellen, die p97 exprimieren, mit Blutgefäßen assoziiert zu sein. Der Grund dafür ist unklar. Doppelmarkierungsexperimente mit Antikörpern gegen BAP und den Transferrinrezeptor ergaben ein ähnliches Muster wie das bei dem p97- reaktiven Antikörper.
Mikrogliazellen, die mit anti-p97 oder -Transferrinrezeptor gefärbt wurden, wurden alles in allem nur in den Kortizes und im Hippokampus von AD-Fällen oder in Fällen mit PD und AD nachgewiesen. Verglichen mit der HLA-DR- Färbung, die hauptsächlich mit allen Mikroglia reagierte, ergab der anti-p97-Antikörper weniger reaktive Mikroglia, die nur mit BAP einhergingen. Die Fortsätze dieser Mikroglia waren häufig an Kapillaren gebunden.

D. Verteilung des p97-Moleküls auf/in Endothelzellen und Mikrogliazellen von Alzheimer-Gehirn im Elektronenmikroskop

Zur Bestimmung der Zellstrukturen, die das p97- Molekül im AD-Gehirn exprimieren, wurde die Verteilung des p97-Moleküls durch Elektronenmikroskopie bestimmt.
Zur Elektronenmikroskopie wurde Entorhinalkortex- Blöcke von zwei AD-Fällen in 1% Glutaraldehyd/44% Paraformaldehyd in 0,1M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 24 Std. bei 4ºC fixiert und anschließend in 15% Saccharose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, mehrere Tage bei der gleichen Temperatur getaucht. Die Schnitte wurden mit dem Vibratom bei 50 mm Dicke erstellt und mit anti-p97 (L235, 1 : 1000) 5 Tage bei 4ºC inkubiert. Sie wurden dann mit dem geeigneten Vectastatin und mit ABC-Zweitantikörpersystemen behandelt. Nach der Diaminobenzidin-(DAB)-Reaktion wurden die Schnitte mit Osmiumtetroxid behandelt und in Epon eingebettet. Ultradünnschnitte wurden geschnitten und mit einem Phillips EM201-Elektronenmikroskop ohne Gegenfärbung untersucht.
DAB-reaktive Produkte wurden im Elektronenmikroskop in der Membran und in cytoplasmatischen Strukturen von Endothelzellen beobachtet, die mit anti-p97-Antikörper markiert waren (Fig. 19D und 19E). In Mikrogliazellen, welche Amyloidfasern produzierten, war die Reaktivität auf die Zellmembran eingeschränkt (Fig. 19F und 19 G). Die Mehrheit des p97-Molküls scheint somit an der Plasmamembran in beiden Zelltypen exprimiert zu werden. Daneben scheint p97 im Inneren von Endothelzellen exprimiert zu werden. Dies stimmt damit überein, dass das p97-Molekül von Gliazellen produziert wird und durch Endothelzellen transportiert wird.

E. PI-PLC-Behandlung von Gehirnschnitten mit Alzheimer- Krankheit.

Den Fig. 19L (keine PI-PLC-Behandlung) und 19M (PI-PLC-Behandlung) zufolge, verhinderte eine PI-PLC- Behandlung ein Sichtbarwerden von Mikrogliazellen in Gewebeschnitten, die mit anti-p97-Antikörpern gefärbt wurden. Als zusätzliche Kontrolle wurden anti-p97-Antikörper mit p97 absorbiert und zum Färben von Alzheimer- Gehirnschnitten verwendet. Der Fig. 19N zufolge wurden Mikrogliazellen oder Blutgefäße offensichtlich nicht gefärbt.

BEISPIEL 11

NACHWEIS VON P97 IN ALZHEIMER-GEHIRN (MEMBRAN- UND CYTOPLASMA-FRAKTIONEN) DURCH WESTERN-BLOTS

Eine Western-Blotanalyse wurde unter nicht- reduzierenden Bedingungen durchgeführt, damit man die Identität des L235-Antigens zeigt, die in den Gewebeschnitten von Alzheimer-Gehirn und p97-haltigen Zelllinen (SK-MEL-28, p97aWTBce) erkannt wurden.
Hierzu wurden SK-MEL-28, WTB- und p97aWTBc3- Zellkulturen gezüchtet, gewaschen und anschließend in nichtionischem Detergenz, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,2, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40 und 20 ug/ml PMSF lysiert. Die aus Alzheimer-Gehirnen isolierten Cytoplasmafraktionen wurden homogenisiert und dann durch Zentrifugation für 10 min bei 4ºC und 10000 · g vorgeklärt. Die Membran- und Cytoplasma-Fraktionen wurden dann durch 60minütige Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation bei 4ºC und 100000 · g aufgetrennt. Die Zell-Cytoplasma- und Membran-Proben wurden dann durch Western-Blotting analysiert. Die Proteine wurden auf einem 5-10% SDS-Gel unter nicht-reduzierenden Bedingungen getrennt und dann durch Elektroblotting auf Immobilon-Membranen (Millipore) übertragen. Nach Inkubation für 1 Std. in Blockierungspuffer (2% BSA, 0,05% Tween-20, 2,5 · 10&supmin;&sup4; M Thimerosal in PBS), wurden die Membranen dreimal in Waschpuffer (0,1% BSA, 0,05% Tween-20, 2,5 · 10&supmin;&sup4; M Thimerosal in PBS) gewaschen und dann 1 Std. mit L235-Gewebekultur-Überstand als Erstantikörper inkubiert. Nach weiterem Waschen der Membranen wurden diese 1 Std. mit Sekundärantikörper, einer 1 : 10000-Verdünnung von Eselanti-Maus-IgG, konjugiert mit Meerettich-Peroxidas (Jackson ImmunoResearch, 1 : 10000-Verdünnung) inkubiert. Die Spezifität des Zweitantikörpers wurde bestimmt nach Inkubation mit L235 als Erstantikörper oder ohne Erstantikörper. Nach dem Waschen wurden die Kroteine durch Chemilumineszenz unter Verwendung des ECL-Western-Blotting- Erfassungssystems (Amersham) nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 20 gezeigt. Eine spezifische Bande mit dem gleichen Molekulargewicht wie p97 in SK-MEL-28- und p97aWTBc3-Zellen kann in der Membran- und der Cytoplasmafraktion von Alzheimer-Gehirngeweben nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass das gleiche Molekül vom monoklonalen L235-Antikörper in Gehirngewebe und auf Zelllinien erkannt wird. Diese Molekül ist p97.

BEISPIEL 12

NACHWEIS VON P97 IN CEREBROSPINALFLÜSSIGKEIT VON AD- PATIENTEN

Proben von CSF aus der Cerbrospinalflüssigkeit (1-2 ml) wurden aus 8 AD-Patienten und normalen Patienten durch Lumbalpunktion erhalten. Die Proben wurden durch Gefriertrocknung bei 135ºC eingeengt. Die Proben wurden mittels BioRad-Minigelsystem wie folgt analysiert. Das Protein wurde auf einem SDS-PAGE-Gel (10% SDS-Laufgel und 5% Stapelgel) unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Proben wurden 5 min bei 95ºC gekocht und dann in 20 ul Ladepuffer (2M Tris-HCl, pH-Wert 8,8 mit Saccharose und EDTA) überführt. Die Gele wurden entnommen und durch Elektroblotting auf Iminobilon-Membranen (Millipore) überführt und über Nacht getrocknet.
Das Western-Blotting erfolgte im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Die Membranen wurden insbesondere in Methanol befeuchtet, 1 Std. mit Western- Blockierungspuffer inkubiert und 1 Std. bei Raumtemperatur mit 100 ul L235 oder OKT9 als Erstantikörper in 20 ml Waschpuffer inkubiert. Die Membranen wurden dreimal in Waschpuffer gewaschen und mit Zweitantikörper inkubiert: Eselanti-Maus-IgG/HRPO (1 : 5000) oder Ziege-anti-Maus- Ig/Biotin (1 : 10000), für 1 Std. bei Raumtemperatur. Die Membranen wurden dreimal in Waschpuffer und weiter in PBS gewaschen und in Streptavidin-Meerettich-Peroxidase (1 : 5000) 30 min inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Proteine durch Chemilumineszenz mit dem ECL-Western- Blotting-Erfassungssystem (Amersham) nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 21 gezeigt. Banden, die p97 entsprachen, sind in Fig. 21 gezeigt, welche den L235- Filter zeigt. p97 wurde nicht in der Erstantikörperkontrolle von Fig. 21C gezeigt. Banden, die p97 entsprachen wurden ausschließlich im L235-Filter gefunden, was das Vorhandensein von p97 im CSF von Alzheimer-Patienten zeigt. Die Ergebnisse der Kontrollindividuen zeigten keine p97 entsprechende Bande. Die Fig. 21B zeigt keine Bande im OKT9-Filter. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von p97 im CSF ein geeignetes Diagnostikum für Alzheimer-Patienten ist.

BEISPIEL 13

IDENTIFIZIERUNG VON LÖSLICHEN FORMEN DES P97/TRANSFERRINREZEPTORS

SK-MEL-28-Zellen wurden mit 200 uCi/ml [³&sup5;S]-Methionin gepulst und zweimal mit eiskältem Biotinylierungspuffer gewaschen. Zelloberflächenantigene wurden mit NHS-LC- Biotin (100 ug/ml) Sulfosuccinimidyl-6- (biotinamido)hexanoat (Pierce) biotinyliert. 2 ml eiskalte Biotinylierungslösung wurde 5 min verwendet. Die Zellen wurden dreimal in normalem Medium mit einem Überschuss an nicht-radioaktivem Methionin gewaschen und 0, 1, 4, 8 oder 24 Std. gechased. Nach dem Chase wurde der Überstand gesammelt, und die Zellen wurden in Solubilisierungspuffer mit PMF und Lys (0,1 mg/ml) lysiert. Der Zellüberstand und das Lysat wurden mit L235 oder OKT9 wie vorstehend beschrieben immungefällt und unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf einem BioRad-Minigel (10% SDS-PAGE) aufgetrennt. Das Protein wurde auf Nitrocellulose geblottet, und die Membran wurde mit einem Autoradiographiefilm zum Nachweisen von readioaktiven Proteinen exponiert. Biotinylierte Proteine wurden nach den vorstehend beschriebenen Verfahren durch Western-Blots nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 22 gezeigt. Fig. 22A zeigt, dass p97, markiert mit [³&sup5;S]-Methionin, im Überstand (CS) und im Zelllysat (CL) nachgewiesen wurde. Lösliches p97 wurde im Überstand von 4-24 Std. Chase nachgewiesen. Überraschenderweise wurde TR, markiert mit [35S]- Methionin ebenfalls im Überstand (CS) und im Zelllysat(CL) nachgewiesen. Das Vorhandensein von markiertem TR im Überstand nach 6-24 Std. Chase lässt schließen, dass es eine lösliche TR-Form gibt. Die Ergebnisse bestätigten, dass die lösliche p97-Form nicht von membrangebundenem p97 stammt, sondern woanders herkommen muss. Der Fig. 22C zufolge war das im Überstand nachgewiesene lösliche p97 nicht biotinyliert und entsprach somit nicht dem membrangebundenen p97, das von der Zelloberfläche freigesetzt wurde. Fig. 22D zeigt die Biotinylierungsmarkierung von TR. Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von löslichen Formen von p97 und dem Transferrinrezeptor.

BEISPIEL 14

SEMIKONTINUIERLICHES VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG P97 AUS CHO-ZELLEN

A. Zeltlinie

Die CHO-Zeltlinie, WTB (erhalten von Dr. Maxfield, New York Universität), wurde mitndem p97-Expressionsvektor pSV2p97a und dem G418-Resistenzvektor pWJ218, wie in Beispiel 1 beschrieben cotransfiziert. CHO-Zellen wurden ebenfalls an das Suspensionswachstum in serumfreiem Medium CHO-S-SFM (Gibco) angepasst. Zellen wurden entweder in 75 cm² T-Kolben (Gibco) oder 250 und 500 ml Drehkolben (Bellco) gezüchtet. Sämtliche Zelllinien wurden bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; inkubiert. Haftende Linien wurden nötigenfalls durch Behandlung mit Versen (Salzlösung von 2 mg/ml EDTA) losgelöst. Die Zelldichte und die Überlebensfähigkeit wurden mit einem Hämocytometer und Trypan-Blau-Ausschluss bestimmt.

B. Monoklonale Antikörper gegen p97

Zwei Maus-Hybridom-Zelllinien, die monoklonale Antikörper gegen p97 produzierten, wurden in 500 ml Drehkolben gezüchtet. Hybridom 33B6E4 (ein Geschenk von Dr. Shuen- Kuei Liao, Biotherapeutic, Franklin) wurde in DMEM, angereichert mit 10% FCS, 1% Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 0,8 mg/ml Geneticin, gezüchtet. L235 (ATCC HB8446 L235 (M19)) wurde in RPMI, angereichert mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 10% FCS, 1% Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutainin, 2 mM L-Prolin und 0,1 mg/ml Penicillin/Streptomycin, gezüchtet. Diese Hybridome benötigten anfangs eine Feeder- Schicht aus unbestrahlten embryonalen Fibroblastenzellen (ATCC X-56). L235-Zellen wurden später selektiert zum Wachstum ohne Hilfe einer Feeder-Schicht und in serumfreien Medien, HYBRIDOMA-SFM (Gibco).
Beide Zelllinien wurden gezüchtet, bis ihre Lebensfähigkeit unter 50% fiel. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand durch eine 0,2 um Membran (VacuCap, Gelman Sciences, MI) filtriert. Die monoklonalen Antikörper wurden dann mit einer Protein-G- Affinitätssäule (MAbTrap G, Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. N. J.) gereinigt und letztere auf 1-2 mg/ml mit 10000 MW Ultrafilter konzentriert (Centricon-10, Amicon Division, MA).

C. Durchflusszytometrie

Die Zelloberflächenexpression von p97 wurde mittels Immunfluoreszenzmarkierung und einem nicht-sortierenden Durchflusszytometer-Analysegerät (FACScan, Becton Dickinson) wie in Beispiel 1 beschrieben beobachtet. Die Zellen wurden mit primärem Antikörper (33B6E4) 45 min bei 4ºC markiert. Die Zellen wurden wieder in FACS-Puffer gewaschen und mit dem fluoreszenzmarkierten Zweitantikörper (Ziege-anti-Maus-IgG-FITC-Konjugat, Gibco) 45 min bei 4ºC inkubiert. Die Zellen wurden dann in PBS gewaschen und in 1,5% (Vol./Vol.) p-Formaldehyd in PBS gewaschen.
Das FACScan Durchflusszytometer maß 5000 Ereignisse pro Probe. Die Daten aus einzelnen Experimenten wurden mit ungefärbten Kontrollen verglichen und die Werte entweder als mittlere Fluoreszenz pro Zelle oder im Fall von PI- PLC-behandelten Zellen als Prozentsätze unbehandelter Kontrollen ausgedrückt. Durch Vergleich der mittleren Fluoreszenz/Zelle mit dem durch PI-PLC freigesetzten p97 wurde eine lineare Beziehung zwischen mittlerer Fluoreszenz/Zelle und mittlerem p97/Zelle gefunden.

D. Messung von dem in der PI-PLC-Lösung gewonnenen p97

Die Konzentration von dem durch PI-PLC freigesetzten p97 wurde mit einem Pandex Fluoreszenzkonzentrationsanalysegerät (Idexx, Ltd., Portland, OR) bestimmt. Dies ist ein rasches Immunfluoreszenzverfahren, beschrieben in Jolley, M. J. Immunol. Methods 67: 21-35, 1984, wobei Carboxylpolystyrol-Fängerteilchen (0,8 um, 0,25% Vol./Vol., Idexx), beschichtet mit anti-p97 IgG (ATCC-HB8446 L235 (M19)) verwendet wurde. Diese "aktivierte" Festphase wirkte als spezifisches Adsorptionsmittel für p97. Ein zweites anti-p97- IgG (33B6E4) wurde mit Fluorescinisothiocyanat (Sigma Chemical Co.) markiert. Die Proben wurden nach Jervis und Kilburn (Biotechnol. Prog. 7: 28-32, 1991) untersucht.

E. p97-Standard

p97 wurde aus dem Überstand von PI-PLC-behandelten CHO-Zellen durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Etwa 109 Zellen wurden mit 1,0 ml 0,1 U PI-PLC/ml in PBS behandelt und 1 Std. bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand durch eine 0,2 um-Membran (Acrodisc 25, Gelman Sciences, MI). Das Filtrat wurde auf eine Säule (1 · 10 cm) mit 33B6E4-Mab, immobilisiert auf Afft-Gel 10 (Bio-Rad, CA) aufgetragen, die vorher in PBS, pH-Wert 7,2, gewaschen und regeneriert worden war. Das gebundene p97 wurde mit 0,1 M Citronensäure, pH-Wert 3,0, eluiert, und anschließend mit 1 M Tris-HCl, pH-Wert 9,0, neutralisiert. Das gereinigte p97 wurde mit einer Ultrafiltrationsmembran, Ausschlussgrenze 30000 MW (Centricon-30, Amicon Division, MA), weiter konzentriert, und dann in PBS dialysiert und steril filtriert. Es stellte sich heraus, dass die p97-Probe gemäß SDS-PAGE rein war. Ein homogenes Phastgel 12,5% Polyacrylamidgel wurde auf dem PhastSystemTM (Pharmacia LKB-Biotechnology) gefahren und mit Silber gefärbt. Die Konzentration von p97 wurde mit dem p97-Extinktionskoeffizient bei 280 nm von E1% 12,0 cm&supmin;¹ bestimmt.

F. Produktion von PI-PLC

B. subtilis (BG2320), transfiziert mit dem Gen für PI-PLC von B. thuringiensis wurde mit einem Verfahren gezüchtet, das von dem von Low, M. G. et al., J. Immunol. Methods 113: 101-111, 1988 beschriebenen und vorher zur Anzucht von B. thuringiensis verwendeten Verfahren hergeleitet wurde. Das Wachstumsmedium mit 10 g/l Polypepton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 0, 4 g/l Na&sub2;HPO&sub4; und 15 ug/ml Chloramphenicol (pH-Wert mit NaOH eingestellt auf 7,0) wurde mit 1,5-3% (Vol./Vol.) einer Übernacht-Vorkultur (anfangs O. D.600 - 0,1) beimpft. Die Zellen wurden in Erlenmeyerkolben gezüchtet und 6 bis 12 Std. bei 150 U/min und 37ºC geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand durch eine 0,2 um Mmebran (VacuCap, Gelman Sciences, MI) filtriert. Der Überstand wurde mit einer Ultrafiltrationszelle (Mädel 8400, Amicon Corp., MA) und einem 10000 YM10-Ultrafilter (Amicon, MA) 20fach verdünnt. Die konzentrierte Enzymlösung wurde dann zweimal mit 5 Volumina PBS in der Ultrafiltrationszelle gewaschen. Die Enzymlösung wurde untersucht und in 1 ml Aliquots bei -20ºC aufbewahrt. Wenn das Enzym benötigt wurde, wurde das gefrorene PI-PLC rasch aufgetaut und in PBS auf die angegebenen Konzentrationen verdünnt. Sämtliche in dieser Untersuchung verwendeten Enzymproben stammten aus der gleichen 2-Liter-Batch-Fermentation.

G. PI-PLC-Assay

Eine PI-PLC-Einheit ist definiert als die Enzymaktivität, die 1 umol Phosphatidylinositol pro min bei einem pH-Wert 7,5 und 37ºC hydrolysiert. Phosphatidylinositol, gelöst in detergenshaltigem Puffer wurde mit der PI-PLC- Probe inkubiert. Das freigesetzte Diglycerid wurde anschließend durch Zugabe von Lipase zu freien Fettsäuren und Glycerin hydrolysiert. Die Glycerinkonzentration wurde dann enzymatisch bestimmt (Assay Nr. 5646, Boehringer, Biochemica) bestimmt.

H. PI-PLC-Behandlung und Proteinernte

Etwa 25 ml einer 1-2 · 10&sup6;-Suspension Zellen/ml wurden 5 min bei 1300 U/min zentrifugiert un zweimal mit 5 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 0,5 ml PI-PLC in PBS (10 mU/ml) resuspendiert und 30 min bei 37ºC unter periodischer Bewegung inkubiert. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Der Überstand wurde 20 min bei 10000 U/min weiter zentrifugiert, durch eine 0,2 um-Membran (Acrodisc 25, Gelman Sciences, MI) filtriert und bei -20ºC vor dem Untersuchen von p97 aufbewahrt. Eine Probe wurde mit einer 3000 MW- Ultrafiltrationsmembran (Centricon-3) für SDS-PAGE-Analyse 5fach eingeengt.
Die enzymbehandelten Zellen wurden dann zweimal mit 15 ml PBS und einmal mit 15 ml CHO-S-SFM-Medium gewaschen. Eine Probe der Zellen wurde zur FACScan-Analyse präpariert und der Rest in frichem CHO-S-SFM-Medium bei etwa 0,5-1,0 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden dann für eine bestimmte Dauer gezüchtet, bevor die Proteinernte wiederholt wurde. Die Zelldichte, Lebensfähigkeit und Glucosekonzentration der Medien würden vor jeder Proteinernte bestimmt.

I. Expression von p97

CHO-Zellen, transfiziert mit p97-cDNA und selektiert in Geneticin, wurden zur p97-Expression mittels Durchflusszytometrie analysiert. Etwa 2% der gesamten Population exprimierte p97 (Fig. 23). In Fig. 23 zeigt Schaubild A logarithmisch aufgetragene Fluoreszenzprofile untransfizierter Zelllinien-WTB, B zeigt Massen transfizierter Zellen, C zeigt sortierte Zellen und D zeigt subklonierte Zellen. Diese p97-exprimierenden Zellen, wurden mit Hilfe von fluoreszenzaktivertem Zell-Sorting zehnfach angereichert. Die sortierte Population (etwa 20% exprimierende Zellen) wurde mittels eingeschränkter Verdünnung und den isolierten Klonen mit der höchsten p97-Expressionrate weiter subkloniert (Fig. 23).
p97-exprimierende Suspensions-CHO-Klone wurden in 75 cm²-T-Kolben und 500 ml Drehkolben mittels serumfreiem Medium gezüchtet. Das Wachstumsprofil für Zellen, die in einem 500 ml Drehkolben gezüchtet wurden, ist in Fig. 24 gezeigt. Die Zellen erreichten eine Maximalkonzentration von mehr als 6 · 10&sup6; lebensfähigen Zellen/ml in 6 Tagen von einer Impfgutmenge vin 1,5 · 10&sup5; Zellen/ml bei einer mittleren Verdopplungszeit von 26 Std. Die Lebensfähigkeit fiel drastisch nach 9 Tagen, wenn die Glucosemengen auf etwa 0,2 mg/ml gefallen waren. Die Zelloberflächenexpression von p97 pro Zelle wurde mittels Durchflusszytometrie- Analyse unter Verwendung FITC-konjugierter Antikörper gegen p97 (Fig. 25) beobachtet. Die Zelloberflächenexpression von p97 variierte mit der Phase des Zellwachstums. Die maximale Zelloberflächenexpression erfolgte nach 3 Tagen Wachstum bei einer Zelldichte von 1 · 10&sup6; Zellen/ml, wonach ein stetiges Absinken der zeltspezifischen Expression auftrat. Dieser Abfall lässt sich z.Tl. durch die Reduktion der durchschnittlichen Zeltoberfläche erklären, wenn die Zeltlebensfähigkeit sinkt oder wenn durch Zelttod p97 freigesetzt wird. Der mittlere Zeltdurchmesser fiel von 15 um beim exponentiellen Wachstum auf 13 um in der stationären Phase, wobei zugleich die Lebensfähigkeit entsprechend von 99% auf 90% fiel.
Eine kleine Menge lösliches sezerniertes p97 wurde im Überstand am Ende der exponentiellen Zellwachstumsphase nachgewisen. Bei Verwendung des Proteinernteverfahrens mit kontrollierter Freisetzung wurde sezerniertes p97 mit dem verbrauchten Medium verworfen und somit nicht gewonnen. Dieser p97-Verlust konnte minimiert werden, wenn die Zellen vor der stationären Zellwachstumsphase geerntet wurden. Dieses lösliche p97 resultierte aus der Freisetzung von membrangebundenem Protein, was für die durchschnittliche Abnahme der Fluoreszenz pro Zelle verantwortlich sein könnte, oder von der Freisetzung einer löslichen p97-Form, die vorher nicht glipiert wurde.

J. PI-PLC-Behandlung

Zelloberflächen-p97 wurde mittels Durchflusszytometrie beobachtet, und das durch PI-PLC-Behandlung solubilisierte Protein wurde mit einem Immunabsorptionsas say untersucht. Die Wirkung der Enzymkonzentration auf den Prozentsatz der Proteinentfernung für eine 30minütige Inkubationsdauer ist in Fig. 26 gezeigt. Die Zellen (10&sup8; Zellen/ml) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Enzym in PBS behandelt. Eine Enzymkonzentration von 10mU/ml erwies sich als ausreichend für die Entfernung von mindestens 90% glipiertem p97 von der Zeltoberfläche. Dies entspricht einer Ausbeute von 4 bis 5 · 10&sup7; ug p97 pro lebensfähiger Zelle. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass die Zellen nach der Enzymbehandlung lebensfähig blieben. Die Zeltlebensfähigkeit blieb für Inkubationszeiten bis zu einer Std. über 95%, wonach diese aber sank. Die PI-PLC- Konzentration von 10 mU/ml entspricht etwa 0,02 ug/ml³ und trägt somit zu einer sehr geringen Menge an p97- kontaminierendem Protein bei, das mit mehr als 1-40 ug/ml- Konzentrationen geerntet wurde (siehe unten).
Die Reinheit des erhaltenen p97 wurde anhand einer Bio-Rad-Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration mit Albumin als Standard auf 30% geschätzt. Die verunreinigenden Proteine umfassen andere glipierte Proteine, die aus der Zeltoberfläche durch die Wirkunis der PI-PLC entfernt werden.

K. Protein-Reexpression

Zur Entwicklung eines semikontinuierlichen p97-Ernte- Verfahrens wurde die Gewinnung PI-PLC-behandelter Zellen und die Reexpression von p97 untersucht. Enzymbehandelte Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und in frischem Medium resuspendiert. Nach der Behandlung mit PI-PLC hatte sowohl die Suspensions- als auch die Haftklone die gleichen Verdopplungszeiten wie die unbehandelten Zellen. Oberflächenreexpression von p97 wurde mittels Durchflusszytometrie beobachtet, und die Zellen erhielten 95% ihrer Proteinexpression innerhalb von 2 Tagen (Fig. 27).

L. Zyklisches Ernten von p97

Nachdem erreicht wurde, dass ein 30minütiger Inkubationszeitraum mit 10 mU/ml PI-PLC in PBS ausreichend war, damit mindestens 90% des glipierten p97 von transfizierten CHO-Zellen entfernt wurden (Fig. 26) und dass Zellen ihre Lebensfähigkeit behielten und ihre p97-Expression nach Enzymbehandlung behielten konnten, wurde bestimmt, ob das Ausmaß der Proteinexpression und die Zeltlebensfähigkeit durch wiederholtes Ernten beeinträchtigt wird.
Die Zellen wurden in Suspension bis zu 1-2 · 106 Zellen/ml gezüchtet und dann zentrifugiert und mit PBS gewaschen. Etwa 0,5 · 10&sup8; Zellen wurden mit 1 ml PI-PLC in PBS (10 mU/ml) behandelt. Nach 30 min Inkubation wurden die Zellen wiederum zentrifugiert, zweimal in PBS gewaschen und anschließend in frischem Medium bei einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml gewaschen. Die Zellen wurden einer weiteren Enzymbehandlung in 24-, 48- oder 72 Std.- Intervallen unterworfen. Die Fig. 28 zeigt die kumulative Proteinproduktion pro Zelle für sämtliche Zykluszeiten. Der 24 Std.-Zyklus erzeugte die Maximalmenge Protein. Je nach Mediumgebrauch zeigte jedoch der 48 Std.-Zyklus eine größere p97-Ausbeute (0,33 mg p97/g verbrauchte Glucose). Die Zelllebensfähigkeit, Zelldichte, zellspezifische p97- Produktion und der zeltspezifische Glucoseverbrauch wurden für jeden Erntezyklus beobachtet und erwiesen sich für die Dauer der Experimente als relativ stabil (Fig. 29).
Die Konzentration von p97, gewonnen nach jedem 48 Std. Ernte-Zyklus, ist in der Fig. 30 gezeigt. Über einen 44-Tages-Zeitraum mit über 20-Enzymbehandlungen blieb die p97-Produktion etwa 30 ug/ml. Es schien keinen Abfall in der Produktivität über die Dauer des Experimentes zu geben. In Fig. 30 ist ebenfalls gezeigt, dass die Suspensions-CHO-Zellen eine stetige Menge von 1 bis 2 ug/ml p97 in das Wachstumsmedium abgaben. Dies kann als Verlust von einem Produktionsstandpunkt angesehen werden, da das sezernierte p97 mit dem verbrauchten Medium verworfen wird. Es wurde jedoch beobachtet, dass das Ausmaß der Basissekretion von dem selektierten transfizierten CHO-Zeltklon abhängt. Ein weiterer Klon sezernierte keine nachweisbaren Mengen p97 und konnte zu Pxoduktionszwecken verwendet werden.
Die Wirksamkeit der verschiedenen Verfahren zur Gewinnung von p97 werden in Tabelle 3 verglichen. Die direkte Zugabe von PI-PLC zu hafteneden CHO-Zellen, die mit 10s Serum wachsen, führten zur Gewinnung von 1,2 ug/ml p97 im Medium, das eine verunreinigende Proteinmenge von etwa 5,4 mg/ml enthielt. Dies entspricht einer Reinheit von 0,02% auf der Basis von Gesamtprotein. Wurden Suspensionszellen, die in serumfreiem Medium wuchsen, mit Enzym behandelt, wurden die Ergebnisse erheblich verbessert. Etwa 3 ug/ml p97 wurde in einem Medium erhalten, das 380 ug/ml Protein enthielt, was einer Reinheit von etwa 1% entspricht. Der Vorteil des cyclischen Ernteverfahrens wurde gezeigt durch den Befund, dass p97 nicht nur in höheren Konzentrationen gewonnen wurde (30 ug/ml), sondern mit einem tausendfachen Anstieg der Reinheit auf 30%. Das in Fig. 31 gezeigte silbergefärbte SDS-PAGE-Gel vergleicht das in PI-PLC/PBS- Lösung (Spuren 3 und 4) geerntete p97 mit einem direkt in CHO-S-SFM-serumfreies Wachstumsmedium freigesetzten p97 (Spur 2).

BEISPIEL 15

ZELLOBERFLÄCHEN-P97 BINDET EISEN

Die folgenden Zelllinien wurden wie hier beschrieben gezüchtet: TRVb (ohne TR), TRVb-1 (menschliches transfiziertes TR), p97aTRVbc3 (menschliches transfiziertes p-97) und p97aTRVb15 (menschliches transfiziertes p97 und TR). Die Zellen wurden gewaschen und gezählt. Etwa 6-10 · 10&sup6; Zellen wurden 0, 2, 6, 10 oder 14 Std. mit 1 ul [&sup5;&sup5;Fe] in FeCl-Salz inkubiert. 200 ul Zellen und Medium wurden an jedem Zeitpunkt entnommen und mit Maximalgeschwindigkeit 2 min bei 4ºC zentrifugiert, und die pelletierten Zellen und der Überstand in Szintillationsgefäße abgetrennt. Die [&sup5;&sup5;Fe]-Mengen in den Gefäßen für sämtliche Zeitpunkte wurden in einem Szintillationszähler gemessen.
Die Experimente wurden mit dem zusätzlichen Schritt PI-PLC-Behandlung (1 Std. bei 37ºC) der Zellen wiederholt und das Medium zu jedem Zeitpunkt, wie vorstehend beschrieben, entfernt. Nach der PI-PLC-Behandlung wurden die Zellen und das Medium durch Zentrifugation getrennt, und anschließend erfolgte eine Szintillationszählung. Die Ergebnisse sind in den Fig. 32 und 33 gezeigt. Die Fig. 32 und 33A zeigen, dass die TRVB-Zelllinie mit p97 die meisten Zählimpulse über 6 Std. aufwies, was zeigt, dass markiertes Eisen an p97 gebunden wurde. Nach der PI-PLC- Behandlung sanken die mit der p97-haltigen Zelllinie assoziierten Zählimpulse (Fig. 33B), was bestätigt, dass das Zelloberflächen-p97 mit GPI-Anker Eisen bindet.
Aus dem Vorhergehenden lässt sich schließen, dass zwar verschiedene Ausführungsformen der Erfindung für Veranschaulichungszwecke beschrieben wurden, sich jedoch verschiedene Modifikationen vornehmen lassen, ohne dass vom Geist und Umfang der Erfindung abgewichen wird. Folglich wird die Erfindung außer durch die beigefügten Patentansprüche nicht eingeschränkt.

TABELLE 1 - FACS-ERLEBNISSE

PROBE FLUORESZENZ - umgewandelter linearer Wert

SK. MEL.28 - NFA 0.00
SR. MEL.28 - + anti-p97 127.92
SR. MEL.28 - +.FI-PLL + anti-p97 4.52
nicht infiz. Sf9 -NFA 0.00
nicht infiz. Sf9 - + anti-p97 0.70
nicht infiz. Sf9 - + PI-PLC + anti-p97 0.96
AcMNPC (WT) - NFA 0.00
AcMNPC (WT) - + anti-p97 -0.06
AcMNPC (WT) - + PI-PLC + anti-p97 -0.06
p97 B-1-1 - NFA 0.00
p97 B-1-1 - + anti-p97 111.66
p97 B-1-1 - + PI-PLC + anti-p97 5.74
p97 B-2-1 - NFA 0.00
p97 B-2-1 - + anti-p97 97.38
p97 B-2-1 - + PI-PLC + anti.-p97 6.85 TABELLE 2 TABELLE 3

Claims

1. Verfahren zur Diagnose und Beobachtung der Alzheimer- Krankheit, dadurch gekennzeichnet, dass die Gegenwart von p97 in einer Untersuchungsprobe des Patienten bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

a) Nehmen einer Untersuchungsprobe des Patienten,

b) Bestimmen der Gegenwart von p97 in der Untersuchungsprobe,

c) Vergleichen des p97-Spiegels in der Untersuchungsprobe mit dem p97-Spiegel in einer Vergleichsprobe,

wobei der p97-Spiegel in der Untersuchungsprobe ein Diagnostikum für die Alzheimer-Krankheit ist.

3. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 und 2, wobei die Gegenwart an löslichem p97 bestimmt wird.

4. Verfahren nach irgendeinem Anspruch 1 bis 3, wobei die Untersuchungsprobe eine Blutprobe ist.

5. Verfahren nach irgendeinem Anspruch 1 bis 4, wobei der p97-Spiegel in der Untersuchungsprobe bestimmt wird mit einem Radioimmunoassay, einem kompetitiven Assays oder einem ELISA (enzyme linked immunosorbant assay).

6. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch 1 bis 5, umfassend das Bestimmen der Gegenwart von p97 auf Mikroglialzellen, die mit den Amyloidplaques im Patienten assozieren.

7. Verfahren nach irgendeinem Anspruch 1 bis 6, zudem umfassend entsprechende Bestimmungen der Gegenwart von Transferrin-Rezeptoren.

8. Verwendung von löslichem p97-Protein in einem Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch.

9. Verwendung von isoliertem p97 mit einem Glycosylphosphatidylinositol-Anker in einem Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9.

10. Verwendung von Anti-p97-Antikörper in einem Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch.