DE69330031T2

DE69330031T2 - Rekombinanter antikörper gerichtet gegen das feline herpesvirus-1 und dafür kodierendes genfragment

Info

Publication number: DE69330031T2
Application number: DE69330031T
Authority: DE
Inventors: Kazuhiko Kimachi; Hiroaki Maeda; Kiyoto Nishiyama; Sachio Tokiyoshi
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1992-11-28
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 2001-07-19
Anticipated expiration: 2013-11-26
Also published as: WO1994012661A1; EP0671472B1; CA2150346A1; JPH06217786A; JP3919830B2; EP0671472A4; AU5596194A; CA2150346C; US5760185A; ES2160115T3; EP0671472A1; AU674043B2; DE69330031D1; ATE199745T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen, felinen, monoklonalen Antikörper für die Diagnose, Behandlung und Prävention einer Infektion mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1). Insbesondere betrifft die Erfindung einen felinisierten, gegen FHV-1 gerichteten, rekombinanten Antikörper, bei dem eine konstante Region eines Maus-typischen, FHV-1-neutralisierenden monoklonalen Antikörpers gegen die konstante Region eines Katzen-Antikörpers ersetzt ist, und ein für diesen Antikörper kodierendes Genfragment.
Katzen sind Tiere, die vom Menschen von frühester Zeit an als Haustiere ins Herz geschlossen wurden. In jüngerer Zeit wurden sie als Begleiter-Spezies Mitglieder der menschlichen Gesellschaft. Weiterhin haben Katzen bisher den Menschen große Dienste als Versuchstiere in verschiedenen Bereichen erwiesen, wie der Medizin, der Pharmazeutik, der Veterinärmedizin und Psychologie von Landwirtschaftstieren. In den vergangenen Jahren stieg der Beitrag von Katzen weiter durch die Verwendung von SPF-Katzen in einem wirksamen Assay oder Sicherheitstest für Arzneimittel. In jedem Fall ist ein besseres Wissen über Katzenerkrankungen, insbesondere infektiöse Erkrankungen, nötig und die Bereitstellung von Verfahren für die Diagnose, Behandlung und Prävention dieser Erkrankungen ist erforderlich.
Viele virale Erkrankungen von Katzen sind bekannt. Darunter ist eine Erkrankung der oberen Atemwege, die durch FHV-1 hervorgerufen wird, akut und zeigt eine hohe Sterblichkeitsrate. Für diese Erkrankung gibt es kein spezifisches Arzneimittel für eine Behandlung, sondern nur eine symptomatische Behandlung für die Prävention einer Sekundärinfektion durch die Verwendung von Antibiotika, Sulfonamiden, usw. Somit besteht das Problem des konventionellen Behandlungsverfahrens.
Bisher wurden ein Hyper-Immunserum oder ein aus einem Serum stammendes Immunoglobulin als Medikament für die Behandlung von viralen Erkrankungen verwendet und sie zeigten zufriedenstellende Ergebnisse. Neuerdings sind jedoch Serummaterialien aus Katzen kaum mehr verfügbar, aufgrund der zunehmenden Einstellung, Tieren kein Leid zuzufügen.
Somit kann dieses Behandlungsverfahren nicht angewandt werden, obwohl es wünschenswert wäre. Dementsprechend wird anstelle des konventionellen Hyper-Immunserums ein monoklonaler Antikörper, der FHV-1 neutralisieren kann, möglicherweise stark zur Behandlung von FHV-1-Infektionen beitragen.
Es gibt mehrere neutralisierende monoklonale Antikörper gegen FHV-1. Jedoch sind alle bisher beschriebenen monoklonalen Antikörper aus einem Maus-Hybridom abgeleitet. Falls diese Antikörper als Medikament einer Katze verabreicht werden, werden sie ein schwächeres Bindevermögen an Komplement oder immunokompetenten Zellen mit einem Fc-Rezeptor, die im Blut vorkommen, als die der gleichen Spezies (Katze) zeigen, da sie ein heterologes Protein darstellen. Sie scheinen auch kaum eine Zerstörung von Zellen durch "Antikörper + Komplement" oder Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, eine Zell-vermittelte Zerstörung von Zellen, zu induzieren. Es ist bekannt, dass diese beiden Immunreaktionen zusätzlich zur Wirkung eines Antikörpers alleine wichtig für die Prävention von FHV-1-Infektion und die Neutralisation von Virus sind (Horimoto T. et al., Jpn. J. Vet. Sci. 51, Seite 1025, 1989). Daher ist es möglich, dass die gewöhnlichen Maus-Antikörper keine wirksamen Ergebnisse bei einer Behandlung zeigen können.
Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass die Maus-Antikörper, die als heterologes Protein erkannt werden, Nebenwirkungen hervorrufen, wie einen anaphylaktischen Schock oder Serumerkrankungen oder dass sie eine verkürzte Halbwertszeit zeigen, was in einer erniedrigten Wirksamkeit bei der Behandlung resultiert. Daher waren die gewöhnlichen monoklonalen Antikörper aus Maus bei einer Verabreichung niemals zufriedenstellend und ein felinisierter monoklonaler Antikörper hätte verwendet werden sollen.
Die Erfinder haben einen monoklonalen Antikörper aus Maus, JH2, der einen FHV-1-Virusstamm neutralisiert, hergestellt, haben die Nukleotidsequenz eines für die variable Region (V-Region) des Antikörpers kodierenden Gens identifiziert und haben eine spezifische Aminosäuresequenz in der V-Region des Antikörpers gefunden, die stark an der Neutralisation von FHV-1 beteiligt ist. Die Erfinder haben sodann einen Vektor, der einen Anti-FHV-1-chimären Antikörper mit einer FHV-1-neutralisierenden Aktivität exprimiert, durch Ligation des Gens für die V-Region des Antikörpers, das für den FHV-1-neutralisierenden Antikörper kodiert, mit einem Genfragment, das für eine konstante Region eines felinen Antikörpers kodiert und das die Erfinder zuvor gefunden hatten (EP-A-0 417 486), konstruiert, um diesen Maus-typischen monoklonalen Antikörper zu felinisieren. Die Erfinder haben diesen Vektor exprimiert und erhielten den Anti-FHV-1-chimären Antikörper. Daher ist eine erfindungsgemäße Aufgabe die Bereitstellung eines neuen Anti-FHV-1-felinisierten chimären Antikörpers, der mit Hilfe der Gentechnik durch Austausch der konstanten Region des Maus-typischen Antikörpers gegen die konstante Region eines felinen Antikörpers hergestellt wird. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung eines für diesen Antikörper kodierenden Genfragments, das für die Herstellung des Antikörpers verwendet werden kann. Somit ist es nun möglich, einen Anti-FHV-1-Antikörper als Mittel in der Diagnose, Behandlung und Prävention einzusetzen, der gegen FHV-1-Infektion wirksam ist und keine Nebenwirkungen hat.

Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Ergebnis einer Agarose-Gelelektrophorese der VH- und Vκ-Gene des Anti- FHV-1-Antikörpers, JH2, die durch PCR amplifiziert wurden.
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des in Beispiel (3) erhaltenen VH-Gens und die durch das Gen kodierte Aminosäuresequenz.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz des in Beispiel (4) erhaltenen Vκ-Gens und die durch das Gen kodierte Aminosäuresequenz.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines Homologievergleichs der VH-Region von JH2 mit der anderer Antikörper auf der Aminosäureebene.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse eines Homologievergleichs der Vκ-Region von JH2 mit der anderer Antikörper auf der Aminosäureebene.
Fig. 6 zeigt eine Restriktionsenzym-Kartierung eines Vektors, der die H-Kette eines Anti- FHV-1-chimären Antikörpers exprimiert.
Fig. 7 zeigt eine Restriktionsenzym-Kartierung eines Vektors, der die L-Kette eines Anti- FHV-1-chimären Antikörpers exprimiert.
Fig. 8 zeigt die Reaktivität des erfindungsgemäßen chimären Antikörpers mit einem Anti- Katzen-Antikörper.
Fig. 9 zeigt die Bindung des erfindungsgemäßen chimären Antikörpers an FHV-1.
Fig. 10 zeigt die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen chimären Antikörpers für zwangsweise mit FHV-1 des K1-Stamms infizierte Katzen.
Fig. 11 zeigt die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen chimären Antikörpers für zwangsweise mit FHV-1 des K1-Stamms infizierte SPF-Katzen.

Bevorzugte Ausführungsform

Die Erfinder haben zuerst Lymphozyten aus Mäusen, die mit FHV-1-K1-Viruspartikeln immunisiert worden waren, und Myelomazellen aus Mäusen in gewöhnlicher Weise fusioniert. Als Ergebnis der Klonierung betreffend die Virus-neutralisierende Aktivität im Kulturüberstand der Hybridomazellen haben die Erfinder eine Antikörper-produzierende Zelle, JH2, bereitgestellt, die einen bezüglich der FHV-1-neutralisierenden Aktivität ziemlich guten monoklonalen Antikörper produziert.
Es ist allgemein bekannt, dass die Spezifität eines Antikörpers gegen ein Antigen auf Aminosäuren in der variablen (V) Region eines Antikörpers beruht. Daher haben die Erfinder die Aminosäuren untersucht, die die V-Region von JH2 bilden. Die Aminosäuresequenz wurde durch Klonierung eines Gens, das für die V-Region des Antikörpers kodiert, und Untersuchung seiner Nukleotidsequenz bestimmt.
Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass die V-Region die in den Fig. 3 und 4 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt. Im allgemeinen gibt es etwa 200 VH-, etwa 10 D- und 4 JH- Gene im Genbereich für die H-Kette eines Antikörpers. Weiterhin gibt es etwa 200 Vκ- und 4 Jκ-Gene in einem Genbereich für die L (κ)-Kette. Es ist bekannt, dass bei der Differenzierung von B-Zellen jeweils ein Gen aus diesen V(D)J-Genfragmenten ausgewählt und umgeordnet wird, um ein Gen zu bilden, das für die Aminosäuresequenz einer gesamten variablen Region kodiert. Das Anfügen einer N-Sequenz und somatische Mutationen ergeben eine Vielzahl von variablen Regionen eines Antikörpers. Das Gen für die variable Region von JH2 der vorliegenden Erfindung ist einzigartig und ist aus einer derartigen Vielfalt ausgewählt. Die in den Figuren gezeigte CDR ist eine wichtige Region für eine Bindung an ein Antigen. Auch im Fall von JH2 scheint die Aminosäuresequenz dieser sechs CDR-Regionen an FHV zu binden, um eine Neutralisierungsreaktion zu induzieren. Insbesondere wurde durch Homologievergleich mit variablen Regionen anderer Antikörper gefunden, dass "Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe" in CDR3 der H-Kette eine einzigartige Aminosäuresequenz ist.
Entsprechend sind die Aminosäuren von CDR3 der H-Kette und anderer CDR-Regionen der H- und L-Kette stark in die Binde- und Neutralisierungsreaktionen mit FHV-1 einbezogen. Dies wurde zuerst durch Isolation des Gens für die variable Region des JH2-Antikörpers gezeigt. Die Bestimmung der Nukleotid- und Aminosäuresequenz des JH2-Antikörpers ermöglicht weiterhin, basierend auf diesen Sequenzen, eine Verstärkung der Antigen-bindenden Aktivität und die Felinisierung der V-Region selbst. Ein Antikörper oder ein Peptid mit einer derartigen Aminosäuresequenz ist vermutlich für die Behandlung, Diagnose und Prävention von FHV-1-Infektion verwendbar.
Das Genfragment, das für die V-Region des Antikörpers mit einer neutralisierenden Aktivität gegen FHV-1 kodiert und erfindungsgemäß bereitgestellt wurde, besitzt die nachstehenden Eigenschaften.
In dem Genfragment, das für VH oder einen Teil davon des Antikörpers kodiert, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, kodiert die für CDR3 des Antikörpers kodierende Nukleotidsequenz für die nachstehende Aminosäuresequenz:
Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe.
Ein bevorzugtes Genfragment von VH mit einer für eine derartige Sequenz kodierenden Nukleotidsequenz umfasst ein Genfragment, bei dem die für CDRs 1 bis 3 des Antikörpers kodierenden Nukleotidsequenzen für die nachstehenden Aminosäuresequenzen kodieren:
CDR1: LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly
CDR2: HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer
CDR3: SerGlnIleTyrFheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe
Weiterhin umfasst beispielsweise eine bevorzugte Sequenz des vorstehend genannten VH- Genfragments eine Nukleotidsequenz, die für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, insbesondere die Aminosäurepositionen 20 bis 143 von SEQ ID NO: 1. Eine spezifische Nukleotidsequenz umfasst z. B. die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz.
Weiterhin umfasst ein Genfragment, das für VL oder einen Teil davon des Antikörpers kodiert, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, ein Genfragment, bei dem die für CDRs 1 bis 3 des Antikörpers kodierenden Nukleotidsequenzen für die nachstehenden Aminosäuresequenzen kodieren:
CDR1: ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis
CDR2: AlaSerGlnSerIleSerGly
CDR3: GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr
Weiterhin umfasst eine bevorzugte Sequenz des vorstehenden VL-Genfragments beispielsweise eine Nukleotidsequenz, die für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, insbesondere die Aminosäurepositionen 21 bis 127 von SEQ ID NO: 2. Eine spezifische Nukleotidsequenz umfasst z. B. die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 gezeigt Nukleotidsequenz.
Es scheint schwierig zu sein, den Maus-typischen Antikörper JH2 für eine Behandlung von FHV-1-Infektion im Hinblick auf die Verminderung der Effizienz, der Nebenwirkungen, der verkürzten Halbwertszeit, usw. direkt an Katzen zu verabreichen. Dies beruht darauf, dass der Antikörper ein für Katzen heterologes Protein ist, das aus Mäusen stammt. Somit kann man vorhersagen, dass der Antikörper nicht an Komplement oder immunokompetente Zellen mit einem Katzen-Fc-Rezeptor binden kann und daher kann ADCC oder CDC kaum induziert werden. Wenn man bedenkt, dass diese Aktivitäten stark an der Virus-Neutralisation bei einer FHV-lnfektion beteiligt sind, muss der Antikörper eine aus Katzen stammende Fc- Region besitzen.
Weiterhin wird der Antikörper möglicherweise schnell aus dem Körper entfernt, falls er als heterologes Protein im Körper eine immunogene Wirkung hat, was die Halbwertszeit verringert, oder er kann Nebenwirkungen hervorrufen wie eine Serumerkrankung. Man vermutet, dass die immunogene Wirkung eines Antikörper-Moleküls in der Fc-Region lokalisiert ist. Daher besitzt die Fc-Region bevorzugt die Aminosäuresequenz eines aus Katzen stammenden Antikörper-Moleküls als homologes Protein.
Die Erfinder haben nun erfolgreich einen felinisierten JH2-Antikörper durch Austausch der konstanten Region des JH2-Antikörpers durch die aus Katzen mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellt.
Ein derartiger felinisierter Antikörper, d. h. ein anti-FHV-1-chimärer Antikörper, kann durch Ligation des Gens für die konstante Region des Katzen-Antikörpers, des CH- und CL-Gens, an das stromabwärts (3'-Stelle) gelegene Ende des vorstehend genannten Gens, das für VH des anti-FHV-1-Antikörpers und das VL-Gen kodiert, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, hergestellt werden, um ein Strukturgen für die H-Kette und L-Kette des Antikörpers zu konstruieren, das für den felinisierten Antikörper, d. h. den felinisierten chimären Antikörper, kodiert, und Expression des Strukturgens in einer geeigneten tierischen Zelle.
Das Gen, das für eine derartige konstante Region eines felinen Antikörpers kodiert, wurde zuvor von den Erfindern gefunden (Japanische Patentveröffentlichungs-Nr. 3-123488, 3- 201986 und 3-72873). Eine Nukleotidsequenz des Gens, das für eine konstante Region eines derartigen felinen Antikörpers kodiert, umfasst als für CH kodierendes Genfragment, die eines Genfragments, das für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. Eine spezifische Nukleotidsequenz des Gens umfasst die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 gezeigte Nukleotidsequenz. Eine Nukleotidsequenz eines für CK kodierenden Gens umfasst die eines Genfragments, das für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. Eine spezifische Nukleotidsequenz des Gens umfasst die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 gezeigte Nukleotidsequenz. Eine Nukleotidsequenz eines Gens, das für Cλ kodiert, umfasst die eines Genfragments, das für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. Eine spezifische Nukleotidsequenz des Gens umfasst die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 gezeigte Nukleotidsequenz.
Zusätzlich zur Produktion des chimären Antikörpers, umfassend die von Mäusen abstammende V-Region und die von Katzen abstammende C-Region, wie vorstehend erwähnt, kann auch das Genfragment, das für die V-Region des erfindungsgemäßen Antikörpers mit einer neutralisierenden Aktivität gegen FHV-1 kodiert, für die Herstellung eines neu geformten Antikörpers verwendet werden, bei dem eine Gerüst (FR)-Region der V-Region auch durch die eines Antikörpers von Tieren außer einer Maus (im Fall der vorliegenden Erfindung stammt sie von einem felinen Antikörper) ersetzt wird. Bisher wurde noch keine vollständige Aminosäuresequenz einer allgemeinen FR-Region einer V-Region eines felinen Antikörpers beschrieben. Jedoch wurde eine Teilsequenz bereits beschrieben (Keho, J. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69, Seite 2052, 1972). Basierend auf diesen Sequenzen und der Aminosäuresequenz der konstanten Region eines felinen Antikörpers, die die Erfinder zuvor gefunden hatten, wird es möglich sein, einen geeigneten Primer für eine Klonierung des Gens herzustellen, das für die V-Region eines felinen Antikörpers kodiert, und die Aminosäuresequenz dieser FR-Region zu bestimmen. Ein neu hergestellter Antikörper kann im wesentlichen in bekannter Weise hergestellt werden (vgl. z. B. die Japanische Patentveröffentlichungs-Nr. 62-296890). Das dafür verwendete erfindungsgemäße Genfragment enthält als Teil eines Gens, das für die VH-Kette und die VL-Kette kodiert, wenigstens eine Nukleotidsequenz, die für die nachstehende Aminosäuresequenz kodiert:
Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe.
Vorzugsweise kodieren Nukleinsäuresequenzen, die für CDRs in der V-Region des neu hergestellten Antikörpers kodieren, für die nachstehenden Aminosäuresequenzen der VH-Kette bzw. der VL-Kette:

VH-Kette:

CDR1: LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly
CDR2: HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer
CDR3: SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe

VL-Kette:

CDR1: ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis
CDR2: AlaSerGlnSerIleSerGly
CDR3: GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr
Zusätzlich fanden die Erfinder zuvor, dass bei der Herstellung des vorstehend erwähnten neu geformten Antikörpers manchmal ein Antikörper mit der ausgezeichneten Spezifität eines ursprünglichen monoklonalen Antikörpers hergestellt werden kann durch Austausch eines Teils der FR-Region der V-Region, die benachbart zu den CDRs liegt, mit der aus Mäusen abstammenden, zusätzlich zum Austausch von CDRs in der V-Region mit den aus Mäusen abstammenden. Das bedeutet, dass durch Austausch eines Teils der FR-Region der V-Region durch den aus Mäusen stammenden Teil, wobei auf die in Fig. 2 für die VH- Kette beschriebene Aminosäuresequenz und die in Fig. 3 für die VL-Kette beschriebene Aminosäuresequenz verwiesen wird, ein neu geformter Antikörper möglicherweise hergestellt werden kann, der besser ist als der neu geformte Antikörper, bei dem nur die CDRs durch die aus Mäusen stammenden ersetzt wurden.
Wie vorstehend erwähnt wird das Strukturgen, das für den felinisierten anti-FHV-1-rekombinanten Antikörper (genannt chimärer Antikörper) kodiert, durch die Konstruktion eines Strukturgens einer V-Region für einen chimären oder neu geformten Antikörper hergestellt. Dabei wird das Gen verwendet, das für die variable Region des erfindungsgemäßen FHV-1- Antikörpers kodiert, und dieses Strukturgen wird mit dem Gen ligiert, das für die konstante Region eines felinen Antikörpers kodiert und das die Erfinder zuvor gefunden hatten. Der erfindungsgemäße rekombinante Antikörper, der durch Ligation dieses Strukturgens an das stromabwärts gelegene Ende einer geeigneten Promotorsequenz und Expression des resultierenden Gens in einer tierischen Zelle in an sich bekannter Weise erhalten wurde, behielt die ausgezeichnete neutralisierende Aktivität des Maus-typischen Antikörpers JH2. Bei einer Verabreichung an FHV-infizierte Katzen linderte der erfindungsgemäße rekombinante Antikörper die Erkrankung ohne signifikante Nebenwirkungen hervorzurufen. E. A. Emini et al. untersuchten die präventive Wirkung eines monoklonalen Antikörpers gegen HIV-Infektion bei Schimpansen. Sie fanden heraus, dass ein humanisierter chimärer Antikörper eine HIV- Infektion verhindern konnte (E. A. Emini et al., Nature 355, Seite 728, 1992), jedoch nicht der ursprüngliche Maus-typische Antikörper (E. A. Emini et al., J. Virol. 64, Seite 3674, 1990). Dies beruht anscheinend darauf, dass der letztere Fc-Region-abhängige ADCC oder CDC- Aktivitäten nicht induzieren konnte und eine verkürzte Halbwertszeit zeigte.
Genauso scheint bei der Wirksamkeit des FH2-Antikörpers bei FHV-infizierten Katzen, die erfindungsgemäß gefunden wurde, der Maus-typische Antikörper eine schwache Wirkung zu haben. Die Wirkung kann jedoch nur durch den felinisierten Antikörper erfolgen, ähnlich wie im vorstehend genannten früheren Fall.
Somit kann der anti-FHV-1-chimäre Antikörper FH2 der vorliegenden Erfindung als ein wesentliches Medikament für die Behandlung und Prävention von FHV-1-Infektion verwendet werden.
Die Erfindung wird detaillierter durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.

Beispiel

(1) Herstellung von Hybridomazellen, die einen FHV-1-neutralisierenden monoklonalen Antikörper produzieren

Ein Kulturüberstand von mit FHV-1 infizierten FL-Zellen (feline Lungenzellen) wurde mit Ammoniumsulfat präzipitiert. Nach einer Dialyse wurde der Niederschlag in Phosphatpuffer resuspendiert und peritoneal an eine BALB/c-Maus für eine Immunisierung zusammen mit komplettem Freundschen Adjuvans verabreicht. Nach 2 Wochen wurden Maus-Lymphozyten und Maus-Myelomazellen (P3U1) durch das Polyethylenglykol-Verfahren für die Herstellung von Hybridomazellen fusioniert. Eine Klonierung erfolgte in Anbetracht der Virusneutralisierenden Aktivität der Kulturüberstände der Hybridomazellen und dabei wurden vier FHV-1-neutralisierende monoklonale Antikörper-produzierende Zellen gefunden. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die minimal wirksame Konzentration eines jeden monoklonalen Antikörpers, die für die Neutralisation von 10 TCID&sub5;&sub0; FHV-1 notwendig war. Unter diesen monoklonalen Antikörpern neutralisierte der JH2-Antikörper am stärksten den FHV-1-K1- Stamm. Tabelle 1

(2) Isolierung des Gens für die variable Region des anti-FHV-1-Antikörpers (JH2)

Gesamt-RNA wurde aus 1 bis 0,5 · 10&sup7; Zellen (Hybridomazellen) extrahiert und mit einer Oligo-dT-Säule (hergestellt von Stratagene, Poly(A) Quick mRNA Purification Kit) gereinigt. Eine einzelsträngige cDNA wurde mit reverser Transkriptase synthetisiert (Takara; alle Reagenzien für die gentechnologischen Verfahren wurden von Takara hergestellt, es sei denn, es ist anders erwähnt).
Oligonukleotide als 5'-Primer an der Leitregion (MHL34, MKL104) und als 3'-Primer an der J- Region (MHJ3, MKJ124) wurden synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer sind wie folgt:

Primer für die Amplifikation der VH-Kette

MHL34: TCTAGAAGCTTGCCGCCACCATGGGCAGACTTACATTTCCATT
MHJ3: GAAGATCTGGATCCACTCACCTGCAGAGACAGTGA

Primer für die Amplifikation der Vκ-Kette

MKL104: GGAATTCAAGCTTGCCGCCACCATGGT(T/A)T(C/T)CTCACCTCAG
MKJ124: CTAGATCTGGATCCACTTACGTTT(T/G)ATTTCCA(A/G)CTT
50 pmol Primer wurden zu 20 ng cDNA hinzugegeben. Eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) erfolgte über 30 Zyklen, wobei jeder Zyklus 1 Minute bei 94ºC, 1 Minute bei 55ºC und 1 Minute bei 72ºC umfasste, um das Gen für die variable Region (VH, Vκ), das von beiden 30 Primern flankiert wurde, zu amplifizieren. Fig. 1 zeigt ein Agarosegelelektrophoresemuster der amplifizierten Genfragmente. Die Größe der VH (H-Kette)- und Vκ (L-Kette)-Gene betrug jeweils etwa 400 bp und entsprach den erwarteten Banden.

(3) Bestimmung der Nukleotidseguenz

Die Nukleotidsequenz eines jeden in Beispiel 2 ampflizierten Genfragments wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Die VH- und Vκ-Genfragmente wurden in pUC18 kloniert und die Nukleotidsequenzen durch das Didesoxy-Verfahren unter Verwendung von Sequenase Ver. 2 (hergestellt von USB) bestimmt.
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des VH-Gens des JH2-Antikörpers und die von diesem Gen kodierte Aminosäuresequenz. Das Gen besaß einen offenen Leserahmen (ORF) und bewahrte ein Cys für die Bildung einer Domänenstruktur. Es war somit für eine Expression geeignet. Es wurde auch herausgefunden, dass eine Umordnung an JH3 erfolgte. Dann wurde ein Homologievergleich für die durch dieses Gen kodierte Aminosäuresequenz mit der GENETYX-CD (Software) als Software und der GeneBank-Datenbank durchgeführt. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass die Antikörper 1 bis 4, die zur VHIII/J606-Familie gehörten, stark homologe VH-Sequenzen besaßen (Fig. 4). In Fig. 4 zeigt die Kennzeichnung (*) eine Aminosäure, die zu der anderer VHs homolog ist, und der nichtgekennzeichnete Bereich stellt eine Aminosäuresequenz dar, die nur in JH2 gefunden wurde. Insbesondere stellt der unterstrichene Teil eine neue Aminosäuresequenz dar, die bisher nie beschrieben wurde, und sie ist für den JH2-Antikörper charakteristisch.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz des Vκ-Gens des JH2-Antikörpers und die durch dieses Gen kodierte Aminosäuresequenz. Wie im Falle der H-Kette besaß dieses Gen einen ORF und bewahrte ein Cys für die Bildung einer Domänenstruktur. Es war somit für eine Expression geeignet. Man fand auch heraus, dass eine Umordnung an Jκ1 erfolgte. Fig. 5 zeigt die Ergebnisse eines Homologievergleichs. Vκ von JH2 zeigte auch Homologie zu anderen Vκ.
Das heißt, es schien, dass der unterstrichene Teil in der VH-Kette spezifisch für den JH2- Antikörper ist und eine wichtige Aminosäuresequenz darstellt, die für die Antigen-Bindeaktivität verantwortlich ist.

(4) Herstellung der Gene für die anti-FHV-1-chimären Antikörper

Die Gene für die variable Region, die durch PCR amplifiziert wurden, wurden mit dem Gen, das für die konstante Region der γ-Kette des felinen Antikörpers CB25γ (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-201986) oder mit dem Gen, das für die konstante Region der κ-Kette des felinen Antikörpers CEK kodiert (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 3-123488), ligiert. Der Hühner-β-Aktin-Promotor (Japanische Patentanmeldung Nr. 1-309785) wurde als Expressionspromotor und das neo- (Southern, P. J., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327, 1982) oder dhfr-Gen (Stark, G. R. und Wahl, G. M., Annu. Rev. Biochem. 53, Seite 447, 1984) als Selektionsmarker verwendet. Fig. 6 und Fig. 7 zeigen Restriktionsenzymkartierungen der hergestellten Vektoren, für die H-Kette bzw. L-Kette des chimären Antikörpers.

(5) Herstellung von stabilen Transformanten

Jeweils 10 ug des Gens, das für die H-Kette und L (κ)-Kette des chimären Antikörpers, wie in Fig. 6 und Fig. 7 gezeigt, kodiert, wurde mit Pvul gespalten und 2 · 10&sup6; Maus-Myelomazellen P3-X63-Ag8-6.5.3 (ATCC CRL1580) wurden mit den gespaltenen Produkten mittels Lipofektin (hergestellt von BRL) co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden in 5% FCS/RPMI1640-Selektionsmedium mit 0,25 · 10&supmin;&sup7; M Methotrexat (MTX) für eine Selektion resistenter Stämme (Transformanten) kultiviert.
Zellen, die den chimären Antikörper produzierten, wurden durch ein begrenztes Verdünnungsverfahren im Hinblick auf im Kulturüberstand exprimiertes felines IgG kloniert, um eine Expressionszelle, FH2, zu gewinnen. Die Eigenschaften dieser Zelle wurden wie nachstehend beschrieben analysiert.

(6) Reaktion mit anti-felinem Antikörper

Kulturüberstände von FH2 (Zellen, die den chimären Antikörper exprimieren) und JH2 (Zellen, die den monoklonalen Antikörper aus Maus exprimieren) wurden zu einer Mikrotiterplatte hinzugegeben, auf der anti-feliner Antikörper (E. Y. LABS. INC.) immobilisiert worden war, und die Reaktion erfolgte 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Waschen der Platte wurde HRP-anti-feliner Antikörper (E. Y. LABS. INC.) 1 Stunde bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Nach erneutem Waschen der Platte erfolgte eine Farbentwicklung mit TMBZ und die Absorption bei 450 nm wurde gemessen, um die Reaktivität mit anti-felinem Antikörper zu analysieren (Fig. 8).
Der Kulturüberstand von FH2 reagierte mit dem anti-felinen Antikörper in einer konzentrationsabhängigen Weise, während der Kulturüberstand von JH2, die den Antikörper aus Maus exprimiert, nicht mit anti-felinem Antikörper reagierte. Dies zeigte, dass der von FH2-Zellen exprimierte chimäre Antikörper ein feliner Antikörper ist.

(7) Identifikation von chimärem Antikörper durch SDS-PAGE

Der chimäre Antikörper wurde aus dem Kulturüberstand mit Protein A (hergestellt von Bio Rad, MAPS-II) gereinigt. Der gereinigte chimäre Antikörper wurde einem 12,5%igen SDS- PAGE unterzogen und mit felinem IgG (polyklonaler Antikörper) verglichen. Das Molekulargewicht des gereinigten Antikörpers wurde mit einem vorgefärbten Marker, hergestellt von Bio Rad, bestimmt.
Der chimäre Antikörper zeigte Banden bei 5 · 10&sup4; für die H-Kette und 2,5 · 10&sup4; für die L- Kette unter reduzierenden Bedingungen und eine Bande bei etwa 1,5 · 10&sup5; unter nichtreduzierenden Bedingungen. Dies zeigte, dass die H- und L-Ketten ein H2L2-Dimer bilden, das die gleiche Form wie IgG besitzt, das in einem Katzenkörper vorhanden ist.

(8) Reaktion mit FHV-1-Viruspartikel

Sodann wurde die Antigen-bindende Aktivität des chimären Antikörpers untersucht. Der Kulturüberstand (von FH2 und JH2) wurde zu einer Mikrotiterplatte hinzugegeben, auf der FHV-1-K1 (Rohprodukt, erhalten durch Ammoniumsulfatfällung) immobilisiert worden war. Nach einem Waschen der Platte wurde entweder mit HRP-anti-felinem Antikörper oder HRP-anti-Maus-Antikörper zur Reaktion gebracht. Eine Farbentwicklung erfolgte mit TBMZ und die Reaktivität mit. FHV-1-Viruspartikel wurde untersucht. Ähnlich wie der Maus-Antikörper JH2 reagierte FH2-Antikörper spezifisch mit FHV-1-K1. Jedoch reagierten die für andere Viren spezifischen rekombinanten chimären Antikörper (Antikörper mit der gleichen felinen konstanten Region und verschiedenen variablen Regionen aus Maus) nicht (Fig. 9).

(9) Neutralisationstest gegen FHV-1-Virus

Sodann wurde die Neutralisationsaktivität des chimären Antikörpers gegen FHV-1 untersucht. Der Kulturüberstand (von FH2 und JH2) wurde mit 100 TCID&sub5;&sub0; FHV-1-Virus 6 Stunden bei 4ºC zur Reaktion gebracht. 0,25 · 10&sup5; CRFK-Zellen wurden hinzugegeben und 2 Tage bei 37ºC kultiviert. CPE (Zellabrundung) wurde beobachtet und die minimal wirksame Konzentration für eine Neutralisation wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass der FH2-Antikörper FHV-1 bei 1,95 ug/ml neutralisiert.

Tabelle 2

Antikörper minimal wirksame Konzentration für eine Neutralisation (ug/ml)

Chimärer Antikörper (FH2) 1,95
Maus-Antikörper (JH2) 1,25

(10) Wirksamkeit und Sicherheit von FH2 in Katzen, die zwangsweise mit FHV infiziert wurden

Katzen mit einem Gewicht von 1,5 bis 3,0 kg wurden zwangsweise mit 10&sup4; TCID&sub5;&sub0; FHV-1-K1 über die Nase infiziert. Am zweiten Tag wurden 30 und 10 mg/kg FH2 über die Jugularvene verabreicht. Die allgemeinen klinischen Zustände wie Gewicht, Temperatur, Menge der aufgenommenen Nahrung, Menge des Trinkwassers und der Körperflüssigkeiten und respiratorische Schädigungen wie Risse, Konjunktivitis, Rhinorrhoe, Schnupfen und Husten wurden während des zeitlichen Verlaufs beobachtet und als 0 für keine Symptome, 1 für leichte Symptome, 2 für mäßige Symptome und 3 für schwere Symptome aufgezeichnet. Bei beiden Gruppen, denen 10 und 30 mg/kg verabreicht worden war, verbesserten sich die Symptome (Fig. 10). Dann wurden die SPF-Katzen mit einem Gewicht von 1,4 bis 2,3 kg zwangsweise mit 10&sup4; TCID&sub5;&sub0; des FHV-1-K1-Stamms infiziert. Am zweiten Tag wurden 30 und 10 mg/kg FH2 über die Jugularvene verabreicht und der klinische Zustand beobachtet. Der weitere Verlauf der Symptome wurde in der Gruppe, der FH2 verabreicht worden war, gehemmt (Fig. 11). Das zeigt die in vivo-Verwendbarkeit von FH2 gegen FHV-Infektion.
Zusätzlich wurden nach Verabreichung von FH2 keine Nebenwirkungen wie Durchfall, Erbrechen oder andere Schockähnliche Symptome beobachtet und somit wurde die Sicherheit von FH2 bestätigt.
Basierend auf den vorstehend beschriebenen Ergebnissen kann der FH2-Antikörper als Mittel für die Diagnostik, Behandlung und Prävention, das gegen FHV-1-Infektion ohne Nebenwirkungen wirksam ist, eingesetzt werden.

Industrielle Anwendbarkeit

Der erfindungsgemäße feline monoklonale Antikörper ist wirksam gegen feline Herpesvirus- 1-Infektion und ist als Mittel gegen diese Erkrankungen in der Diagnostik, Behandlung und Prävention anwendbar.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID NO: 1

LÄNGE DER SEQUENZ: 429
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
MERKMAL
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Maus SEQUENZ

SEQ ID NO: 2

LÄNGE DER SEQUENZ: 381
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
MERKMAL
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Maus SEQUENZ

SEQ ID NO: 3

LÄNGE DER SEQUENZ: 1005
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
MERKMAL
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Katze SEQUENZ

SEQ ID NO: 4

LÄNGE DER SEQUENZ: 337
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: genomische DNA
MERKMAL
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Katze SEQUENZ

SEQ. ID NO: 5

LÄNGE DER SEQUENZ: 318
ART DER SEQUENZ: Nukleinsäure
STRANGFORM: Doppelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA zu mRNA
MERKMAL
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT
ORGANISMUS: Katze SEQUENZ

Claims

1. Rekombinanter, durch gentechnologische Verfahren hergestellter Antikörper, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, wobei ein Teil der Aminosäuresequenz der komplementaritätsbestimmenden Region 3 (CDR3) von VH die nachstehende Aminosäuresequenz besitzt: Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe.

2. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei CDRs in VH und VL dis nachstehenden Aminosäuresequenzen aufweisen:

VH;

CDR1: LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly

CDR2: HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer

CDR3: SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe

VL;

CDR1: ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis

CDR2: AlaSerGlnSerIleSerGly

CDR3: GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr

3. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei VH und VL die Aminosäuresequenzen der Aminosäurepositionen 20 bis 143 von SEQ ID NO: 1 des Sequenzprotokolls bzw. der Aminosäurepositionen 21 bis 127 von SEQ ID NO: 2 besitzen.

4. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der konstanten Region des Antikörpers von einem felinen Antikörper abgeleitet ist.

5. Antikörper gemäß Anspruch 4, wobei die Aminosäuresequenz der konstanten Region der H-Kette des Antikörpers die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 beschriebene und die Aminosäuresequenz der konstanten Region der L-Kette des Antikörpers die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 beschriebene ist.

6. Genfragment, kodierend für VH oder einen Teil davon eines Antikörpers, der spezifisch mit FHV-1 reagiert, bei dem ein Teil der für CDR3 kodierenden Nukleotidsequenz eine für die nachstehende Aminosäuresequenz kodierende Nukleotidsequenz ist: Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe.

7. Genfragment gemäß Anspruch 6, wobei die für CDRs 1-3 kodierenden Nukleotidsequenzen jeweils für die nachstehenden Aminosäuresequenzen kodieren:

CDR1: LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly

CDR2: HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer

CDR3: SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe

8. Genfragment gemäß Anspruch 6, wobei die für VH des Antikörpers kodierende Nukleotidsequenz für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 beschriebene Aminosäuresequenz kodiert.

9. Genfragment gemäß Anspruch 6, wobei die für VH des Antikörpers kodierende Nukleotidsequenz die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 1 beschriebene Nukleotidsequenz ist.

10. Genfragment, kodierend für VL des Antikörpers, wobei die für CDRs 1-3 kodierenden Nukleotidsequenzen jeweils für die nachstehenden Aminosäuresequenzen kodieren:

CDR1: ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis

CDR2: AlaSerGlnSerIleSerGly

CDR3: GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr

11. Genfragment gemäß Anspruch 10, wobei die für VL des Antikörpers kodierende Nukleotidsequenz für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 beschriebene Aminosäuresequenz kodiert.

12. Genfragment gemäß Anspruch 10, wobei die für VL des Antikörpers kodierende Nukleotidsequenz die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 2 beschriebene Nukleotidsequenz ist.

13. Rekombinantes Genfragment, kodierend für die H-Kette eines felinen chimären Antikörpers, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, wobei das Genfragment das Genfragment gemäß Anspruch 6 umfasst, an dessen stromabwärts (3'-Stelle) gelegenem Ende ein Genfragment gebunden ist, das für die konstante Region der H-Kette eines felinen Antikörpers kodiert.

14. Rekombinantes Genfragment gemäß Anspruch 13, wobei das für die konstante Region der H-Kette eines felinen Antikörpers kodierende Genfragment eine Nukleotidsequenz besitzt, die für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.

15. Rekombinantes Genfragment, kodierend für die L-Kette eines felinen chimären Antikörpers, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, wobei das Genfragment das Genfragment gemäß Anspruch 10 umfasst, an dessen stromabwärts (3'-Stelle) gelegenem Ende ein Genfragment gebunden ist, das für die konstante Region der κ-Kette eines felinen Antikörpers kodiert.

16. Rekombinantes Genfragment gemäß Anspruch 15, wobei das für die konstante Region der κ-Kette eines felinen Antikörpers kodierende Genfragment eine Nukleotidsequenz besitzt, die für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.

17. Rekombinantes Genfragment, kodierend für die L-Kette eines felinen chimären Antikörpers, der spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagiert, wobei das Genfragment das Genfragment gemäß Anspruch 10 umfasst, an dessen stromabwärts (3'-Stelle) gelegenem Ende ein Genfragment gebunden ist, das für die konstante Region der κ-Kette eines felinen Antikörpers kodiert.

18. Rekombinantes Genfragment gemäß Anspruch 17, wobei das für die konstante Region der λ-Kette eines felinen Antikörpers kodierende Genfragment eine Nukleotidsequenz besitzt, die für die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 5 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.

19. Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Verwendung als aktive therapeutische Substanz.

20. Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung von Infektionen durch das feline Herpesvirus-1 (FHV-1).

21. Verwendung eines Genfragments gemäß einem der Ansprüche 6 bis 18 für die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit felinem Herpesvirus-1 (FHV-1) reagieren.