DE69306803T2

DE69306803T2 - Kleinzelliger lungenkarzinom-spezifischer antikörper und antigenen

Info

Publication number: DE69306803T2
Application number: DE69306803T
Authority: DE
Inventors: Rolf Stahel
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1992-09-17
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2013-07-31
Also published as: CA2144750A1; WO1994006929A1; AU683845B2; ATE146528T1; EP0662147B1; EP0662147A1; US5614373A; AU4705293A; DE69306803D1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Tumorantigen und Antikörper, gerichtet gegen dieses Antigen, sowie deren Verwendung in Diagnostik und Therapie des kleinzelligen Lungenkarzinoms.
Das kleinzellige Lungenkarzinom neigt zu frühzeitiger Metastasenbildung. Deswegen führt eine chirurgische, radiologische oder chemotherapeutische Behandlung in einer Vielzahl von Fällen nur zu einer vorübergehenden Heilung. Bei Rückfällen tritt als Komplikation Therapieresistenz gegen zuvor wirksame Therapien, wie z.B. Bestrahlung und Chemotherapie, auf. Deswegen wird erwogen, zukünftig den Patienten nach der konventionellen Behandlung des Primärtumors einer gezielten Nachbehandlung mit Antikörpern oder antikörperkonjugierten Wirkstoffen zu unterziehen. Auch wären markierte Antikörper hilfreich für die Darstellung von Metastasen mittels bildgebender Verfahren oder für die Untersuchung von Tumorgewebe mittels histologischer Techniken.
Eine Anzahl von Antigenen, die von Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms exprimiert werden, sind bekannt; entsprechend der Übereinkunft, die auf Fachkongressen (First and Second International Workshop on Lung Gancer Antigens; Brit. J. Cancer (1991) 63 (suppl. ), Seite 10-19); J. Nat. Cancer Inst. (1991) 83, 609-612) getroffen wurden, werden diese in sieben Gruppen eingeteilt. Antikörper gegen diese Antigene sind ebenfalls bekannt. In Veröffentlichungen, die sich auf kleinzelliges Lungenkarzinom beziehen, wird das Adhäsionsmolekül von neuralen Zellen (neural cell adhesion molecule; NCAM) als wichtiges Antigen angesehen, das in Cancer Research 48, Seiten 4318 - 4323 (1988), in EP-A-0 443 599, in EP-A-0 323 802, in EP-A-0 356 397, in J. Patholog. 159, Seiten 23 - 28 (1989), in Europ. J. Cancer 27, Seiten 431 - 435 (1991) und in Cancer Research 50, Seiten 1102 - 1106 (1990) offenbart wird. Diese Dokumente offenbaren außerdem monoklonale Antikörper gegen verschiedene Epitope von NCAM; diese Antikörper weisen sehr starke Unterschiede auf bezüglich ihres Vermögens, Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms spezifisch zu erkennen. Im Tiermodell wurden diese Antikörper vereinzelt zur Lokalisation von Tumorzellen eingesetzt.
Wichtige bisher bekannte Antigene des kleinzelligen Lungenkarzinoms sind das Adhäsionsmolekül von neuralen Zellen (neural cell adhesion molecule; NCAM), sowie Antigene der cluster 2 und w4. Weitere Antigene sind Mucine, das Lewisy-Antigen, sowie die Antigene des ABO- Blutgruppensystems. Antikörper gegen NCAM und gegen cluster w4 Antigene binden auch an Leukozyten. Antikörper gegen cluster 2 Antigene binden auch an epitheliales Gewebe. Deswegen sind derartige Antikörper nicht geeignet für systemische Applikationen, wie sie für eine immunologische Tumortherapie wünschenswert wären. Weiterhin ist eine hohe Avidität zu dem jeweiligen Antigen nützlich, damit der Antikörper im Tumorgewebe stark angereichert wird.
Bisher aufgefundene Antigene mit einer relativen Spezifität für Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms und Antikörper, die gegen diese Antigene gerichtet sind, sind nicht ausreichend selektiv. Sie erlauben nicht die sichere Erkennung von Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms. Für immunologische Behandlungsmethoden dieser Erkrankung sind Spezifität bisher bekannter Tumorantigene und Avidität der bisher bekannten Antikörper ebenfalls unzureichend. Aufgabe der Erfindung ist es, neue Antikörper gegen Tumorantigene des kleinzelligen Lungenkarzinoms bereitzustellen, um Diagnose und Therapie dieser Krebserkrankung zu verbessern. Antikörper gegen derartige Antigene sollen sich durch eine hohe Avidität auszeichnen.
Erfindungsgemäß wird ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der an ein Antigen aus kleinzelligem Lungenkarzinom spezifisch und mit hoher Avidität bindet. Dieser Antikörper bindet nicht an Leukozyten oder gesunde Nieren- oder Lungenepithelzellen.
Gegenstand der Erfindung ist folglich ein muriner monoklonaler Antikörper mit der Bezeichnung SEN7, sowie eine Hybridomzellinie mit der Bezeichnung SEN7.2a.4 und der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2050, welche den monoklonalen Antikörper SEN7 sezerniert.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin humanisierte Antikörper mit murinen hypervariablen Domänen und humanen framework- und konstanten Domänen, dadurch gekennzeichnet, daß hypervariable Domänen aus dem monoklonalen Antikörper SEN7 enthalten sind.
Gegenstand der Erfindung sind auch Antikörperkonjugate, insbesondere Konjugate mit einem Toxin, einem Radioisotop oder/und einem Markierungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörperkomponente der Antikörper SEN7 oder ein humanisierter Antikörper mit der hypervariablen Domäne des Antikörpers SEN7 enthalten ist.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des Antikörpers SEN7 oder eines humanisierten Antikörpers mit der hypervariablen Domäne des Antikörpers SEN7 und/oder eines Antikörperkonjugates, das als Antikörperkomponente den Antikörper SEN7 oder einen humanisierten Antikörper mit der hypervariablen Domäne des Antikörpers SEN7 enthält, zur Herstellung eines Präparates für die Behandlung und/oder Diagnose von kleinzelligem Lungenkarzinom.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des Antikörpers SEN7 oder eines humanisierten Antikörpers mit der hypervariablen Domäne des Antikörpers SEN7 und/oder eines Antikörperkonjugates, das als Antikörperkomponente den Antikörper SEN7 oder einen humanisierten Antikörper mit der hypervariablen Domäne des Antikörpers SEN7 enthält, für die Behandlung und/oder Diagnose von kleinzelligem Lungenkarzinom.
Üblicherweise werden monoklonale Antikörper aus Nagetierzellen, insbesondere aus Zellen von Mäusen, gewonnen. Diese Antikörper rufen bei der in-vivo Anwendung am Menschen unerwünschte Immunreaktionen hervor. Um diese unerwünschten Immunreaktionen zu vermeiden, werden Antikörper, die für in-vivo Anwendungen am Menschen vorgesehen sind, so modifiziert, daß das Immunsystem des Menschen diese nicht mehr als fremd erkennt. Zu den für diese Zwecke üblichen Modifikationsverfahren gehört das CDR-grafting (Jones, P.T. et al. (1986) Nature 321 14-17; Kettleborough, C.A. et al. (1991) Protein Engineering 4, 773-783). Weitere mögliche Modifikationsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Derartig modifizierte Antikörper werden erfindungsgemäß als humanisierte Antikörper bezeichnet.
Um den analytischen Nachweis von Antikörpern zu erlauben, werden diese mit Markierungsmitteln (Tracern) verbunden. Beispielsweise können Antikörper mit Radioisotopen markiert werden: Üblich sind für diese Zwecke Radioisotope des Yttriums, des Rheniums und des Technetiums und insbesondere J-125 und J-131, sowie In-111. Die Verfahren zur Isotopenmarkierung und weitere zur Markierung geeignete Radioisotope sind dem Fachmann bekannt. Neben diesen radioaktiven Markierungsmitteln sind weitere nicht-isotopische Markierungsmittel dem Fachmann geläufig. Diese werden bei analytischen Aufgaben häufig bevorzugt. Markierungen sind beispielsweise mit fluoreszierenden Stoffen, wie z. B. Fluoreszein, oder auch mit Enzymen, wie z. B. Peroxidase oder Alkalischer Phosphatase möglich. Die Auswahl von geeigneten fluoreszierenden Stoffen oder von Enzymen und die notwendigen Nachweismethoden sind dem Fachmann bekannt. In vielen Fällen ist es sinnvoll, die Markierungsmittel nicht direkt mit dem Antikörper, sondern indirekt mittels zusätzlicher stark bindender Liganden zu verbinden. Für diesen Zweck haben sich insbesondere die Kombinationen Biotin/Avidin oder Biotin/ Streptavidin bewährt.
Die Auswahl derartiger Liganden und die notwendigen Bindungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Erfindungsgemäß wird entsprechend dieser Beispiele unter dem Begriff Markierungsmittel sowohl die bei direkten Markierungsverfahren benutzten Markierungsmittel als auch die bei indirekten Markierungsverfahren benutzten Kombinationen unter Einschluß der bindenden Liganden verstanden.
Bei manchen immunologischen Therapieverfahren wird direkt die biologische Wirkung der Antikörper ausgenutzt. Bei anderen immunologischen Therapieverfahren werden zusätzlich oder auch ausschließlich Verbindungen eingesetzt, die das kranke Gewebe schädigen sollen. Diese Schädigung kann beispielsweise durch radioaktiv strahlende Isotope, wie z. B. J-131 oder J-125 oder durch zellschädigende Substanzen, zu denen pflanzliche oder bakterielle Toxine und Cytostatika gehören, wie z. B. Ricin A oder Gelonin, erfolgen. Weitere geeignete radioaktive Isotope und weitere geeignete zellschädigende Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Die Gesamtheit dieser Stoffe wird erfindungsgemäß unter dem Begriff Toxine zusammengefaßt. Der Antikörper transportiert das Toxin zu dem vorgesehenen Wirkungsort, z. B. dem Tumor, wo dieses die erkrankten Zellen zum Absterben bringt.
Für die Versuche, die zur Bereitstellung des erfindungsgemäßen Antigens und der gegen dieses gerichtete Antikörper führten, wurden Mäuse immunisiert. Als Immunogen dienten Zellen aus kleinzelligem Lungenkarzinom, die zuvor mit Neuraminidase behandelt worden waren. Dazu dienten insbesondere Zellen der humanen Zellinie 5W2. Bei der Untersuchung der resultierenden murinen monoklonalen Antikörpern wurde eine Zellinie aufgefunden, die einen Antikörper des Isotyps Ig Gl, der SEN7 genannt wurde, sezernierte. Dieser Antikörper reagierte mit allen untersuchten (15) Zellinien des kleinzelligen Lungenkarzinoms. Keine Reaktion wurde mit Zellinien des Pflasterzellkarzinoms der Lunge (3) und des Adenokarzinoms der Lunge (3) beobachtet. Es erwies sich, daß dieser Antikörper spezifisch ist für ein bisher nicht bekanntes Epitop des neuronalen Zell-Adhesions-Moleküls (NCAM), das keiner der bisher bekannten Gruppen zugehörig ist. Die Zellinie, die den Antikörper SEN7 sezerniert, ist unter der Bezeichnung SEN7.2a.4 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM; Braunschweig, DE) hinterlegt (Hinterlegungsnummer DSM ACC 2050).
Im folgenden wird die Charakterisierung des neuen Epitops des NCAM- Moleküls, das durch den monoklonalen Antikörper SEN7 erkannt wird, beschrieben. Auch der Antikörper SEN7 wird charakterisiert. Weitere experimentelle Einzelheiten finden sich in den Beispielen. Die grundlegenden biochemischen Methoden für die Antikörpergewinnung und - isolierung, für die Charakterisierung von Antikörper und Antigen, für die Derivatisierung mit radioaktiven Isotopen sind dem Fachmann bekannt und sind in Handbüchern und Übersichtsartikeln, beispielsweise in Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow und Lane (eds) (1988), Cold Spring Harbor Laboratory) dargestellt. Ebenso sind darin übliche Verfahrensvarianten dargestellt.
Für die Immunisierung von Mäusen (BALB/c) wurden Zellen von kleinzelligem Lungenkarzinom (Zellinie SW2) mit Neuraminidase behandelt. Einzelheiten derartiger Verfahren und geeignete Immunisierungsschemata sind dem Fachmann aus der Literatur, beispielsweise aus Int. J. Cancer 35, 11-17 (1985) und Cancer Research 48, 412-417 (1988), bekannt. Als Fusionspartner diente die Zellinie P3 X63 Ag8.653.
Die fusionierten Zellen wurden kultiviert, kloniert und die Klone erneut kultiviert. Die erzeugten Antikörper wurden mittels indirekter Immunfluoreszenz auf die Bindung von unbehandelten und mit Neuraminidase behandelten SW2-Zellen untersucht. Weiterhin wurden Zellinien ausgewählt, deren Antikörper nicht mit Zellen aus Knochenmark oder mit Leukozyten reagierten. Dabei kann die Bindung des Antikörpers an die Zellen mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern nachgewiesen werden.
Der derartig isolierte Antikörper SEN7 wurde typisiert und erwies sich als zum Ig Gl-Isotyp gehörig.
Zellen, die SEN7 produzieren, wurden in einem Hohlfasersystem kultiviert. Aus dem Kulturfiltrat wurden die Antikörper durch Affinitätschromatographie an einer Protein-A Säule gereinigt.
Um das Antigen zu charakterisieren, das durch den Antikörper SEN7 erkannt wird, wurde eine Western Blot Analyse ausgeführt. Die Zellinie 0H3, die aus kleinzelligem Lungenkarzinom stammt, und die mit dem Antikörper SEN7 reagiert, dient als Quelle für das Antigen. Oberflächenantigene der Zellen wurden jeweils durch Detergensbehandlung in Anwesenheit einer Mischung von verschiedenen Proteaseninhibitoren extrahiert. Die Extrakte wurden nach bekannter Methode durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat aufgetrennt. Die auf diese Art aufgetrennten Fraktionen reagierten nicht mit dem Antikörper SEN7. Deswegen wurden die aufgetrennten Fraktionen zunächst nach bekannten Methoden mit Harnstoff renaturiert. Nach dieser Behandlung wurde eine auffällige Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 180000 Dalton sichtbar. Diese Bande war im Fall der Zellinien SW2 und OH3 unter nicht-reduzierenden Bedingungen vorhanden; sie fehlte in der Negativkontrolle (ohne ersten Antikörper).
Zur weiteren Charakterisierung des Antigens wurden SW2 Zellen in Gegenwart von Tunicamycin kultiviert. Dabei wird die Biosynthese von stickstoffgebundenen Kohlenhydraten inhibiert. FACScan Analyse von derartig kultivierten Zellen reagierten nicht mit dem Antikörper SEN7. Das Epitop, an das der Antikörper SEN7 bindet, enthält folglich ein an Asparagin gebundenes Oligosaccharid. Das Antigen ist folglich ein Glykoprotein.
Zur Charakterisierung des Antikörpers wurde eine Verdünnungsreihe von SW2 Zellen mit isotopenmarkiertem Antikörper behandelt. Anschließend wurde durch Messung der Radioaktivität der freie und der an die Zellen gebundene Anteil des Antikörpers bestimmt. Die Auswertung der Daten ergab, daß der Antikörper mit einer Affinitätskonstante Ka= 2 x 10&sup9; M&supmin;¹ bindet, und daß etwa 200 000 Bindungsstellen pro Zelle vorhanden sind.
Um die Bindungsspezifität des Antikörpers SEN7 zu bestimmen, wurden Untersuchungen mittels indirekter Immunfluoreszenz an lebensfähigen Zellen von verschiedenen Karzinomzellinien ausgeführt. Alle 16 untersuchten Zellinien von kleinzelligem Lungenkarzinom reagierten positiv. Keine Anfärbung wurde bei drei untersuchten Zellinien beobachtet (U1752, HOTZ und L Xl; Plattenepithelkarzinom der Lunge (squamous cell carcinoma), beziehungsweise undifferenziertes karzinom der Lunge). Gleiches gilt für drei weitere untersuchte Zellinien (A125, 5LC52 und A549; Adenokarzinome ).
Untersuchungen an Leukozyten und peripheren Blutlymphozyten wiesen nach, daß der Antikörper nicht an diese Zellen bindet. Bei weiteren Untersuchungen mittels Hämagglutination wurde auch festgestellt, daß keine Bindung an Erythrozyten stattfindet. Im Gegensatz zu bekannten Antikörpern gegen Antigengruppen cluster-1 und cluster-w4, die nichtselektiv mit Leukozyten und Lymphozyten reagieren, reagiert der erfindungsgemäße Antikörper nicht mit diesen Zellen. Das erfindungsgemäße Epitop von NCAM kommt also auf der Oberfläche dieser Zellen nicht vor.
Weiter wurden Gewebeproben von Tumoren und von gesundem Gewebe mittels der bekannten Immunperoxidasefärbung untersucht: Kleinzelliges Lungenkarzinom, beziehungsweise -carcinoid reagierten positiv (sechs von sieben, beziehungsweise zwei von drei Proben). Alle anderen untersuchten Tumorgewebe (Adenokarzinom, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Nierenkrebs und Lymphom) gaben keine Reaktion. In gesunden Geweben von Schilddrüse, Nebenniere, Muskel, Hoden, peripheren Nerven, Rückenmark, Gehirn und Hirnanhangdrüse reagierten einzelne Zelltypen positiv. Vollständig negativ war die Reaktion mit gesunden Geweben aus Haut, Bronchien, Lunge, Niere, Leber, Dickdarm, Lymphknoten und Pankreas.
Als ein Modellsystem für bildgebende Verfahren und für die therapeutische Anwendung wurde an xenograft-tragenden Mäusen die Verteilung des Antikörpers bestimmt. Dazu wurden in Mäuse jeweils 10&sup7; gewaschene Zellen der Zellinie SW2 subkutan injiziert. Die Untersuchungen wurden begonnen, sobald die Tumoren ein ungefähres Gewicht von 100 mg erreicht hatten. Zu diesem Zeitpunkt wurde den Tieren eine Mischung von gleichen Teilen SEN7 Antikörper (¹²&sup5;I-markiert) und als Kontrolle MG-1 Antikörper (¹³¹I-markiert) injiziert. Der Kontrollantikörper gehört wie der Antikörper SEN7 zu der Klasse Ig Gl. Die Organverteilung der beiden Antikörper wurde über einen Zeitraum von mehreren Tagen bestimmt. Der Antikörper wurde aus dem Blutkreislauf in den Tumor aufgenommen: Nach dem dritten Tag wurde im Tumor eine drei- bis fünffach höhere Konzentration an Antikörper SEN7 als im Blut gemessen. Diese Aufnahme war spezifisch: Verglichen mit der Konzentration im Tumor war die Konzentration in der Leber (Ort von unspezifischen Abbaureaktionen) zwischen fünfzehn- und fünfundzwanzigmal kleiner. Der Anteil der injizierten Dosis, bezogen auf das Frischgewicht des Organs, betrug im Maximum 32 %.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung in weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeine Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, sowie der korrespondierenden Anmeldungen DE 42 31 066, eingereicht am 17. September 1992 und DE 43 14 870, eingereicht am 05. Mai 1993, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Erläuterung der Erfindung und stellen keine Begrenzung des Erfindungsgegenstandes dar.
Es werden folgende Abkürzungen benutzt:
PBS: phosphatgepufferter Kochsalzlösung (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;)
BSA: Rinderserumalbumin
TCA: Trichloressigsäure
DMSO: Dimethylsulfoxid
DMF: Dimethylformamid
TBS-Puffer: TRIS-Puffer (50 mM; pH 7,3) enthaltend 1 M NaCl
Für die Anzucht der Hybridomazellinien wird, wenn nicht anders beschrieben, ein Medium auf der Grundlage von RPMI 1640 Medium mit folgenden Zusätzen benutzt: 10 % (v/v) fetales Kälberserum, 10 % (v/v) Supplement Hl (BM-Condimed , Fa. Boehringer Mannheim), 1 % (v/v) L-Glutamin, sowie 1 % (v/v) einer Insulin-Oxalacetat-Pyruvat-Lösung (Zu 80 ml H&sub2;O werden 1,5 mg cis-Oxalessigsäure, 0,5 g Natriumpyruvat und 2000 Einheiten Insulin zugefügt; anschließend wird HCl hinzugefügt, bis die Lösung klar ist (pH 3-4) und die Lösung auf 100 ml mit H&sub2;O aufgefüllt).
Inkubationen werden, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur (R.T.; 15-28 ºC) ausgeführt.

Beispiel 1: Bereitstellung der Hybridomzellinie SEN7.2a.4, die den Antikörper SEN7 sezerniert.

Die Immunisierung von Mäusen (BALB/c) wird nach dem Verfahren von Stahel, R.A. et al. (1985) Int. J. Cancer 35, 11-17, ausgeführt. Zellen von kleinzelligem Lungenkarzinom (Zellinie 5W2; Dana Farber Institute, Boston/MA/USA) werden mit Neuraminidase aus Clostridium perfringens behandelt (2 Stunden bei 37 º C; 1 Enzymeinheit Neuraminidase/10&sup6; Zellen).
Nach der Immunisierung wird, wie in der oben zitierten Veröffentlichung beschrieben, weiter vorgegangen. Zellen der Zellinie P3X63-Ag8.b53 dienen als Fusionspartner.
Die fusionierten Zellen werden kultiviert, kloniert und die Klone erneut kultiviert. Die erzeugten Antikörper werden mittels indirekter Immunfluoreszenz auf die Bindung von unbehandelten und mit Neuraminidase behandelten SW2-Zellen untersucht. Es werden Zellinien ausgewählt, deren Antikörper nicht mit Zellen aus Knochenmark oder mit Leukozyten reagieren. Für die Immunfluoreszenzuntersuchung werden jeweils 2 x 10&sup5; Zellen (Tumor-, Knochenmark- oder Blutzellen) in ein Teströhrchen aliquotiert und mit 10&supmin;&sup7; M des zu untersuchenden Antikörpers in 25 µl PBS unter Zusatz von 0,1 % Natriumazid für eine Stunde bei 4 ºC inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und mit 50 µl einer Lösung, die fluoreszeinmarkiertem anti-Maus Antikörper (Ziege) enthält, behandelt und erneut gewaschen. Durch die Fluoreszenz kann die Bindung des Antikörpers an die Zellen nachgewiesen werden.
Der derartig isolierte Antikörper wird SEN7 genannt. Er gehört zum Isotyp IgGl/kappa, wie Untersuchungen mittels Teststäbchen (Amersham, GB) zeigen.

Beispiel 2: Gewinnung und Reinigung des Antikörpers SEN7

Zellen der Zellinie SEN7.2a.4 werden in einem Hohlfasersystem Acusyst, Technomara, CH) in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10 Vol.-% fötalem Kälberserum und 2 mM L-Glutamin kultiviert. Aus dem Kulturfiltrat werden die Antikörper an einer Protein-A Säule (BIO-RAD, Richmond/CA, USA) adsorbiert. Dazu wird das Kulturfiltrat in 50 mM Tris-HCl (pH 8,9) mit 3,3 M NaCl auf die Säule aufgegeben und die Säule anschließend mit 50 m M Tris-HCl (pH 8,9) mit 3,3 M NaCl gespült, bis das Eluat proteinfrei ist.Die gebundenen IgG-Antikörper werden mit 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6,0) mit 150 mM NaCl eluiert. Das Eluat wird gegen 25 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,5) dialysiert und auf eine Ionenaustauschsäule (Mono- S , Pharmacia,Uppsala,SE) aufgetragen und mittels eines NaCl- Gradienten eluiert.
Die auf diese Art erhaltene Antikörperpräparation erweist sich als einheitlich bei der Untersuchung mittels SDS-PAGE und isoelektrischer Fokussierung.

Beispiel 3: Isotopenmarkierung des Antikörpers SEN7

Für die Markierung mit ¹²&sup5;I werden 40 µg Iodo Gen (Fa. Pierce, UK) in 50 µl Chloroform gelöst. Die Lösung wird in einem 1,5 ml-Gefäß zur Trockne eingeengt. In dieses Gefäß werden eine Lösung von 100 µg SEN7 Antikörper in 50 µl PBS, sowie eine Lösung, die 200 µCi eines ¹²&sup5;I- Jodidsalzes enthält, gegeben. Die Reaktionsmischung wird fünf Minuten gerührt.
Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe von 50 µl einer gesättigten Lösung von Tyrosin (Fa. Fluka) in PBS abgestoppt. Einer Säule gefüllt mit SEPHADEX G-25 wird mit einer Lösung von BSA (10 g/1) in PBS äquilibriert und dient zum Abtrennen des Jod, das nicht an Protein gebunden wurde.
Die radiochemische Reinheit des markierten Proteins wird mittels TCA- Fällung bestimmt und ist größer als 95 %.
In analoger Weise wird das Jodisotop ¹³¹I eingeführt. Dieselbe Reaktion wird auch benutzt, um von anderen Antikörpern (z.B. MG-1) isotopenmarkierte Derivate herzustellen.

Beispiel 4: Western Blot Analyse des SEN7 Antigens

Um das Antigen zu isolieren, das durch den Antikörper SEN7 erkannt wird, wird eine Western Blot Analyse ausgeführt. Die Zellinie 0H3, die aus kleinzelligem Lungenkarzinom stammt, und die mit dem Antikörper SEN7 reagiert, dient als Quelle für das Antigen.
10&sup7; Zellen werden in PBS mit Zusatz von 45 mM 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio] propansulfonat (CHAPS) und 0,1 % NaN&sub3;, sowie einer Mischung von verschiedenen Proteaseninhibitoren (0,1 mM 1,10- Phenantrolin, 0,1 mM 3,4-Dichlorisocumarin, 0,05 mM N-[N-(L-3-trans carboxyran-2-carbonyl)-L-leucyl]-agmatin (E-64), 50 µg/ml pepstatin A und 0,1 mg/ml Calpain Inhibitor Peptid) bei 0 ºC eine Stunde extrahiert.
Dazu werden die Suspensionen kurz mittels eines Vortexmischers gemischt. Anschließend wird der Extrakt durch Zentrifugation (1 h; 100 000 xg) von den Zelltrümmern abgetrennt. Die Extrakte werden durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (7,5 %) im Puffersystem von O'Farrel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat aufgetrennt. Die Gele werden jeweils 30 Minuten in 6 M, 3 M und 1,5 M Harnstoff, anschließend in Wasser und in Transferpuffer (pH 10,5; 10 mM 3-(Cyclohexylamino]-1- propansulfonsäure, 10 % Methanol) renaturiert. Die Proteine werden anschließend durch Elektrophorese auf eine Immun-Lite P Membran (BioRGG, CH) mit 100 Vh transferiert. Die Membran wird, wie von Johnson, D.A. et al. (1984) Gene Anal. Tech., l, 328-334 beschrieben, mit 50 g/1 Magermilchpulver in PBS vorbehandelt und anschließend mit affinitätsgereinigtem SEN7 mit einer Konzentration von 10&supmin;&sup7; M bei 4 ºC über Nacht inkubiert. Nichtgebundener Antikörper wird mit einer Lösung von 0,5 g/1 TWEEN 20 in PBS ausgewaschen. Die Gele werden mit einer Lösung von Ziegen anti-Maus Ig G, das mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, behandelt. Nach dem Spülen werden die Banden durch Inkubation mit einem lichtemitierenden Substrat auf Röntgenfilm sichtbar gemacht.
Man beobachtet eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 180 000. Diese Bande ist im Fall der Zellinie OH3 unter nichtreduzierenden Bedingungen vorhanden; sie fehlt in der Negativkontrolle ohne ersten Antikörper.

Beispiel 5: Bestimmung der Bindungskonstanten von SEN7

Eine Verdünnungsreihe von SW2 Zellen in 100 µl PBS unter Zusatz von 1 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Natriumazid, beginnend bei 10&sup7; Zellen, wird hergestellt. Jede Verdünnung wird mit 40 ng nach Beispiel 3 isotopenmarkiertem Antikörper bei 4 ºC zwei Stunden behandelt. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und durch Messung der Radioaktivität der freie und der an die Zellen gebundene Anteil des Antikörpers bestimmt.
Die Auswertung der Daten ergibt, daß der Antikörper mit einer Affinitätskonstante Ka= 2 x 10&sup9; M&supmin;¹ bindet, und daß etwa 200 000 Bindungsstellen pro Zelle vorhanden sind.

Beispiel 6: Reaktion von Antikörper SEN7 mit NCAM-transfizierten Zellen

Die Reaktion vom Antikörper SEN7 wurde auf Zellen untersucht, die mit einer komplementären DNA transfiziert wurden. Diese cDNA kodiert für ein 140 000 Dalton Isoform eines humanen NCAM (Neuronales Zell Adhesionsmolekül) aus der kleinzelligen Bronchuskarzinoma Zellinie SW2. Diese stabilen Transfektanten wurden folgendermaßen hergestellt.
Die kodierende Region für die 140 000 Dalton Isoform von NCAM wurde mittels der PCR-Methode (Polymerase-Ketten-Reaktion) aus cDNA kloniert. Die polyA+RNA, aus der die cDNA synthetisiert wurde, stammte aus der humanen kleinzelligen Bronchuskarzinoma Zellinie SW2. Drei überlappende DNA-Fragmente wurden hergestellt und jedes wurde anschließend in pSK+Bluescript (Stratagene GMBH, Zürich) kloniert und sequenziert. Fragment 1 wurde mittels Restriktionsenzymen (EcoRI/Not I) geschnitten und das geschnittene Stück isoliert. Fragment 2 wurde mit EcoRI/BstBI geschnitten und isoliert, Fragment 3 wurde mittels BstBI/Not I geschnitten und isoliert. Diese drei geschnittenen Bruchstücke wurden wieder zusammengehängt und ergaben die kodierende Sequenz des humanen 140 000 Dalton NCAM. Dieser Klon wurden anschließend in den eukaryotischen Expressionsvektor pRC/CMV (Invitrogen, Heidelberg) subkloniert mittels HindIII/NotI Restriktionsenzymen.
Die Transfektion in eine Maus-pre-B-Zellinie B-300.19 (Reth et al., 1986, Nature 322: 840-842) wurde mittels Elektroporation vorgenommen. Dazu wurden 40 ng nichtgeschnittenes Plasmid in 10&sup7; Maus-Zellen eingeschleust. Die Zellen wurden anschließend auf Geneticin-Resistenz selektioniert; der verwendete Vektor enthält ein Geneticin-Resistenzgen. Die resistenten Klone wurden auf Oberflächenexpression von NCAM untersucht. Ein Klon mit besonders hoher und uniformer Expression von NCAM wurde selektioniert.
Dieser Klon war positiv mit dem Antikörper SEN7 und anderen bekannten anti-NCAM Antikörpern. Dieser Klon war negativ mit einem anti-Cluster- w4/CD24 Antikörper SWA11.

Beispiel 7: Kompetition von Antikörper SEN7 und anderen NCAM Antikörpern

Die Reaktion von NCAM Antikörper, die drei unterschiedliche Epitope auf kleinzelligen Bronchuskarzinomen erkennen (Moolenaar, C.E.C.K. et al., Cancer Res. 50: 1102-1106, 1990; Hida, T. et al., Br. J. Cancer, 63: Suppl. XIV, 24-28, 1991), wurde auf ihre blockierende Wirkung der SEN7- Bindung auf Bronchuskarzinoma-Zellen untersucht. In einem Radioimmunoexperiment wurden 10&sup5; Zellen zuerst mit einem Überschuß vom kompetitierenden ersten NCAM-Antikörper behandelt.
Anschließend wurden die Zellen mit ¹²&sup5;I-markierten Antikörper SEN7 (mit halber Sättigungskonzentration) inkubiert. Nichtgebundener Antikörper wurde ausgewaschen und die noch gebundene Radioaktivität wurde bestimmt. Wie aus der folgenden Tabelle 1 ersichtlich ist, wurde keine oder nur geringfügige Kompetition der anderen Antikörper mit SEN7 um die Bindung an Tumorzellen festgestellt. Tabelle 1: Bindungskompetition auf kleinzelligen Bronchuskarzinomazellen 15 zwischen dem radioaktiv markierten SEN7 Antikörper und nichtmarkierten Antikörpern gegen NCAMa)
a) Anteil der Bindung von SEN7 in %
b) Gebundener erster (kompetitierender) Antikörper wurde mittels ¹²&sup5;I markiertem Schaf-anti-Maus Antikörper quantifiziert.

Beispiel 8: Immunoperoxidasefärbung von Geweben

Gewebeproben von Tumoren und von gesunden Gewebe werden mittels der Immunperoxidasefärbung untersucht: Gefrierschnitte (Dicke 5 µm) werden angefertigt und auf mit Leim beschichteten Objekträger aufgezogen. Nach einer Vorbehandlung mit 0,3 % (v/v) H&sub2;O&sub2; in Methanol und mit Schweineserum (2 %) werden die Schnitte mit einer Lösung von SEN7 überschichtet und eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Schnitte werden anschließend gewaschen und zunächst mit peroxidasekonjugiertem anti-Maus Kaninchenserum, dann mit peroxidasekonjugiertem anti-Kaninchen Schweineserum behandelt. Die Peroxidase wird mit 3,3'-Diaminobenzidin als chromogenem Substrat sichtbar gemacht. Die Schnitte werden mit Hämatoxilin gegengefärbt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt: Tabelle 2: Tabelle 2 (Fortsetzung):

Beispiel 9: Xenograft-Untersuchung an Mäusen

Vorbereitung:

In weibliche ICR nu/nu Mäuse (4-6 Wochen alt), die pathogenfrei ernährt werden, werden jeweils 10&sup7; gewaschene Zellen der Zellinie SW2 subkutan injiziert. Die Untersuchungen werden begonnen, sobald die Tumoren ein ungefähres Gewicht von 100 mg erreichten (etwa zwei bis drei Wochen nach der Injektion).

Ausführung:

Den Tieren wird eine Mischung von gleichen Teilen SEN7 Antikörper (6 µg/Tier; mit 12 µCi ¹²&sup5;I-markiert) und als Kontrolle MG-1 Antikörper (6 µg/Tier; mit 12 µCi ¹³¹I-markiert) i.v. injiziert. Der Kontrollantikörper gehört wie der Antikörper SEN7 zu der Klasse Ig G1.
Jeweils vier Mäuse werden nach 2, 4 und 7 Tagen getötet und die verschiedenen Organe mit PBS gewaschen und gewogen. Mit einem Zweikanalgammazähler werden die beiden Antikörper gemessen (15- 80 keV und 260-470 keV). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt: Tabelle 3
a) Mittelwert±Standardabweichung (n = 3 oder 4)

Claims

1. Muriner monoklonaler Antikörper, der von der unter der Nummer DSM ACC 2050 hinterlegten Zellinie sezerniert wird.

2. Hybridomzellinie mit der Bezeichnung SEN7.2a.4 und der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2050, welche den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 sezerniert.

3. Humanisierter Antikörper mit humanen framework- und konstanten Domänen und den hypervariablen Domänen des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1.

4. Antikörperkonjugat, dadurch gekennzeichnet, daß als Antikörperkomponente ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 3 enthalten ist.

5. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 3, oder eines Antikörperkonjugates nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Präparates zur Behandlung und/oder Diagnose von kleinzelligem Lungenkarzinom.