-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte pharmazeutische
Formulierung, die ein Humanwachstumshormonderivat umfasst.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Die
Wachstumshormone (growth hormone, GH) des Menschen und der gängigen Haustiere
sind Proteine mit etwa 191 Aminosäuren, die vom Hypophysenvorderlappen
synthetisiert und sezerniert werden. Das Humanwachstumshormon besteht
aus 191 Aminosäuren.
-
Das
Wachstumshormon ist ein Schlüsselhormon,
das nicht nur an der Steuerung des Körperwachstums, sondern auch
an der Steuerung des Stoffwechsels von Proteinen, Kohlenhydraten
und Lipiden beteiligt ist. Die Hauptwirkung des Wachstumshormons
besteht in der Wachstumsförderung.
-
Die
durch das Wachstumshormon beeinflussten Organsysteme schließen Skelett,
Bindegewebe, Muskeln und innere Organe, wie Leber, Darm und Nieren,
ein.
-
Bis
zur Entwicklung der rekombinanten Technologie und des Klonierens
des Wachstumshormongens, die nunmehr eine Produktion z.B. von Humanwachstumhormon
(hGH) und Met-hGH im industriellen Maßstab zur Folge haben, konnte
Humanwachstumshormon nur durch Extraktion aus der Hypophyse von
menschlichen Leichen erhalten werden. Das sehr beschränkte Angebot
von Wachstumshormonen schränkte
dessen Verwendung auf die Förderung
des Längenwachstums
in der Kindheit und Pubertät
zur Behandlung von Zwergwuchs ein, obwohl unter anderem eine Behandlung
von Kleinwuchs (aufgrund eines Wachstumshormonmangels, normalem
Kleinwuchs und Turner-Syndrom), von Wachstumshormonmangel bei Erwachsenen, Unfruchtbarkeit,
Behandlung von Verbrennungen, Wundheilung, Dystrophie, Knochenverwachsung,
Osteoporose, gestreuter Magenblutung und Pseudoarthrose vorgeschlagen
wurde.
-
Weiterhin
wurde das Wachstumshormon zur Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit
von Haustieren oder zur Verminderung des Fettanteils bei Tieren,
die für
den menschlichen Konsum geschlachtet werden sollen, vorgeschlagen.
-
Pharmazeutische
Wachstumshormonpräparate
neigen zur Instabilität.
Abbauprodukte, wie deamidierte oder sulfoxidierte Produkte und Dimer-
oder Polymerformen, werden insbesondere in Wachstumshormonlösungen erzeugt.
-
Die überwiegenden
Abbaureaktionen von hGH sind 1) die Deamidierung durch direkte Hydrolyse
oder über
eine cyclische Succinimid-Zwischenstufe zum Bilden von verschiedenen
Mengen an L-Asp-hGH, L-Iso-Asp-hGH, D-Asp-hGH und D-Iso-Asp-hGH (Lit.
1), 2) die Oxidation dieser Methioninreste an den Positionen 14
und 125 (Lit. 4-9) und 3) die Spaltung der Peptidbindungen.
-
Eine
Deamidierung findet insbesondere am Asn in Position 149 statt.
-
hGH
wird an den Positionen 14 und 125, insbesondere in Lösung ziemlich
leicht oxidiert (4-8).
-
Die
Oxidation von hGH in lösungbildenden
Sulfoxiden erfolgt normalerweise aufgrund des im Präparat gelösten Sauerstoffs.
Die Löslichkeit
von Sauerstoff in destilliertem Wasser beträgt etwa 200 μm (9). Da
die Konzentration von hGH in einem 4 IU/ml umfassenden Präparat 1,3
mg/ml, entsprechend 60 nM hGH, beträgt, wird Sauerstoff bei normalen
Lagerbedingungen in einem Überschuss
von etwa dem 3000-fachen der stöchiometrischen
Menge zur Oxidation von hGH vorliegen. Der Versuch, das Problem
durch Entgasen der Puffer vor dem Abzapfen und Verpacken der Präparate zu
lösen,
ist nicht machbar.
-
Gegenwärtig wird
nicht angenommen, dass diese Abbauprodukte eine toxische oder veränderte biologische
Aktivität
oder veränderte
Rezeptorbindungseigenschaften aufweisen, jedoch gibt es dahingehende Hinweise,
dass die Konformationsstabilität
der Sulfoxide, verglichen mit nativem hGH, reduziert ist.
-
Zur
Entwicklung eines stabilen gelösten
hGH umfassenden Präparats
ist es von Wichtigkeit, die Bildungsgeschwindigkeit von Sulfoxiden
sowie Mittel zur Steuerung der Oxidation zu kennen.
-
Die
Kinetik des Abbaus hängt
von der Temperatur, dem pH-Wert und verschiedenen Zusätzen oder Hilfsstoffen
in der hGH-Formulierung ab.
-
Aufgrund
der Instabilität
wird Wachstumshormon gegenwärtig
in lyophilisierter Form bei 4°C
lyophilisiert und gelagert, bis es zur Verwendung zur ursprünglichen
Konzentration gelöst
wird, um den Abbau zu minimieren.
-
Die
hGH umfassenden lyophilisierten pharmazeutischen Präparate werden
gegenwärtig
vom Patienten zur ursprünglichen
Konzentration gelöst,
und dann bei niedriger Temperatur, häufig bei etwa 4°C im Kühlschrank,
als Lösung
während
der Verwendungsdauer bis zu 14 Tage lang aufbewahrt, wobei währenddessen ein
gewisser Abbau stattfindet.
-
Weiterhin
bereitet das Verfahren des Lösens
des lyophilisierten Wachstumshormons zur ursprünglichen Konzentration dem
Patienten Schwierigkeiten gerne Schwierigkeiten.
-
Folglich
ist es gegenwärtig
bevorzugt, das Wachstumshormon so spät wie möglich vor der Verwendung zur
ursprünglichen
Konzentration zu lösen
und das Präparat
in lyophilisiertem Zustand zu lagern und zu versenden. Die Kette
vom Hersteller zur Apotheke eignet sich zur Handhabung der Präparate bei
einer gesteuerten niedrigen Temperatur, z.B. von 4°C, was eine
lange Lagerzeit von bis zu zwei Jahren erlaubt.
-
Jedoch
erfordern die längere
Verwendung von Pen-Systemen zur Selbstmedikation und das erweiterte
Verwendungsgebiet ein Präparat,
das für
eine ausreichend lange Zeitdauer beim Endanwender unter Bedingungen,
in welchen eine „ausreichende" Kühlung nicht
immer verfügbar
ist, stabil ist.
-
Vorzugsweise
sollte ein Präparat
beim Endanwender für
eine Dauer von etwa einem Monat und zusätzlich für eine Dauer von einem Monat
zur ursprünglichen
Konzentration gelöstem
Zustand in einer Pen-Vorrichtung für die beabsichtigte Verwendungsdauer
einer Patrone in lyophilisiertem Zustand stabil sein.
-
Folglich
besteht ein Bedarf an stabileren Wachstumshormonpräparaten,
die bei relativer hoher Temperatur für eine Dauer in lyophilisiertem
Zustand und zusätzlich
für eine
Verwendungsdauer bei relativ hoher Temperatur in Lösung stabil
sind. Eine derartige Stabilisierung ist von sehr großer Wichtigkeit,
wenn die Verabreichung des Wachstumshormons von den Arztpraxen zu
den Wohnstätten
der zu behandelnden Personen verlagert wird, wo eine wie vorstehend
angegebene optimale Lagerung nicht verfügbar sein mag.
-
Weiterhin
erfordert die Verlagerung des Verabreichungsmusters für Wachstumshormon
zu der Verwendung von Pen-Vorrichtungen ein stabiles gelöstes Wachstumshormon
umfassendes Präparat
zum Erleichtern der durch den Patienten durchzuführenden Handhabung. Ein stabiles
gelöstes
Wachstumshormon umfassendes Präparat
kann gebrauchsfertig in Form von Patronen hergestellt werden, die
in die von dem Patienten verwendete Pen-Vorrichtung passen, der
dann das erneute Lösen
des Präparats
zur ursprünglichen
Konzentration vermeiden kann und daher nicht im Besitz eines lyophilisierten
Präparats,
eines geeigneten Vehikulums zum Lösen zur ursprünglichen
Konzentration sowie der nötigen
Erfahrung und sterilen Ausrüstung
zum sterilen Lösen
des Präparats
zur ursprünglichen
Konzentration sein muss.
-
Aus
Sicherheitsgründen
ist es auch erwünscht,
das Lösen
eines lyophilisierten Präparats
zur ursprünglichen
Konzentration unmittelbar vor der Verwendung des Präparats zu
vermeiden.
-
Weiterhin
wäre es
auch von Vorteil, den Lyophilisierungsschritt bei der Herstellung
von Wachstumshormonpräparaten
zu vermeiden. Eine Lyophilisierung ist ein zeitaufwendiges und teures
Verfahren und stellt aufgrund der begrenzten Kapazität des Gefriertrockners
auch häufig
einen „Engpass" bei der Herstellung
dar.
-
Folglich
besteht die Notwendigkeit des Reduzierens der Abbauprozesse, um
es zu ermöglichen,
dass gelöste
hGH-Präparate
während
ihrer Lagerzeit und während
der Verwendungsdauer bis zu einen Monat lang stabil sind.
-
Frühere Versuche
zum Stabilisieren von hGH waren beim Verhindern der Dimerbildung
nicht sehr erfolgreich. Die mit der Dimerbildung verbundenen Probleme
sind z.B. in Becker, G. W., Biotechnology and Applied Biochemistry
9, 478 (1987), angegeben.
-
Die
Internationale Patentveröffentlichung
Nr.
WO 89/09614 und
die
Australische Patentanmeldung
Nr. 30771/89 offenbaren eine stabile pharmazeutische Formulierung,
die Humanwachstumshormon, Glycin und Mannit enthält. Ein derartiges Präparat zeigt
während
der normalen Verarbeitung und Lagerung in lyophilisiertem Zustand
sowie in der Verwendungsdauer nach dem Lösen zur ursprünglichen
Konzentration eine verbesserte Stabilität.
-
Die
veröffentlichte
Europäische Patentanmeldung Nr. 303
746 offenbart, dass tierisches Wachstumshormon mit verschiedenen
Stabilisatoren zum Erhalt einer verminderten Bildung von unlöslichen
Bestandteilen und einer Bewahrung der löslichen Aktivität in wässrigen
Umgebungen, wie Stabilisatoren, einschließend bestimmte Polyole, Aminosäuren, Polymere
von Aminosäuren
mit einer geladenen Seitengruppe bei physiologischem pH-Wert, und
Cholinsalze, stabilisiert werden kann. Polyole sind ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus nicht-reduzierenden
Zuckeren, Zuckeralkoholen, Zuckersäuren, Pentaerythritol, Lactose,
wasserlöslichen
Dextranen und Ficoll; Aminosäuren
sind ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Glycin, Sarcosin, Lysin oder Salzen
davon, Serin, Arginin oder Salzen davon, Betain, N,N-Dimethylglycin,
Aspartamsäure
oder Salzen davon, Glutaminsäure
oder Salzen davon; ein Polymer einer Aminosäure mit einer geladenen Seitengruppe
bei physiologischem pH-Wert kann ausgewählt sein aus Polylysin, Polyaspartamsäure, Polyglutaminsäure, Polyarginin,
Polyhistidin, Polyornithin und Salzen davon; und Cholinderivate
sind ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Cholinchlorid, Cholindihydrogencitrat,
Cholinbitartrat, Cholinbicarbonat, Tricholincitrat, Cholinascorbat,
Cholinborat, Cholingluconat, Cholinphosphat, Di(cholin)sulfat und
Dicholinmucat.
-
EP 374120 offenbart ein stabilisiertes
Wachstumshormonpräparat,
umfassend einen gepufferten Polyolexzipienten, umfassend ein Polyol
mit drei Hydroxygruppen und einen Puffer zum Erzielen eines pH-Werts in
einem Bereich, in welchem das Wachstumshormon seine Bioaktivität für eine ausreichende
Zeitdauer beibehält.
Histidin ist als Puffer für
ein Polyol mit drei Hydroxygruppen erwähnt.
-
US 4,917,685 offenbart eine
stabilisierte wachstumsfördernde
Formulierung, umfassend ein Wachstumshormon und einen Stabilisator,
ausgewählt
aus bestimmten Polyolen, Aminosäuren
und Cholinderivaten. Die Formulierung kann in Form einer wässrigen
Lösung
vorliegen.
-
US 4,815,568 offenbart eine
stabilisierte wachstumsfördernde
Formulierung, umfassend ein Wachstumshormon und einen Stabilisator,
ausgewählt
aus bestimmten Aminosäuren,
Aminosäurepolymeren
und Cholinderivaten. Die Formulierung kann in Form einer wässrigen
Lösung
vorliegen.
-
JP-A-63115821 offenbart
eine pulverförmige
Zusammensetzung, enthaltend Wachstumshormon, eine basische Aminosäure (z.B.
Histidin) und/oder ein Salz davon. Die Zusammensetzung ist zur Verabreichung
im Nasen/Luftröhrenraum
vorgesehen.
-
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Es
wurde nun überraschend
gefunden, dass ein Präparat
eines Humanwachstumshormonderivats, umfassend Histidin, als Zusatz
oder Puffersubstanz in einer Menge von 0,1 bis 12 mg Histidin oder
einem Derivat davon pro mg Wachstumshormonderivat eine sehr hohe
Stabilität
gegenüber
Deamidierung, Oxidation und Spaltung von Peptidbindungen aufweist.
Die Stabilität
des Produkts ermöglicht
die Lagerung und den Versand davon in Form eines gelösten Präparats.
-
EP 303746 erwähnt Polyhistidin
als potenziellen Stabilisator für
tierisches Wachstumshormon, jedoch gibt es keinen Hinweis dafür, ob es
ein tierisches Wachstumshormon oder ein Humanwachstumshormon stabilisiert.
-
EP 374120 lehrt, dass Histidinhydrochlorid
als Puffer zum Puffer eines Polyols mit drei Hydroxygruppen zum
Verbessern der Stabilität
eines Wachstumshormonpräparats
in Form einer eine hohe Konzentration an Wachstumshormon und ein
Polyol als Stabilisator umfassenden Lösung verwendet werden kann.
Histidinhydrochlorid muss in einer Menge von etwa 3 Gew.-% der Lösung, entsprechend
einer Konzentration von ~0,15 M Histidinhydrochloridlösung, zugesetzt
werden.
-
EP 374120 lehrt auch, dass
Histidin allein einem Wachstumshormonpräparat keine chemische und physikalische
Stabilität
verleiht.
-
Das
Präparat
der Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat eines Humanwachstumshormonderivats
in Form einer gepufferten wässrigen
Lösung
des Wachstumshormonderivats, gepuffert mit Histidinpuffer und mit
einem pH-Wert von 5-8.
Histidin liegt im Präparat
in einer Menge von 0,1 bis 12 mg Histidin pro mg hGH-Derivat vor.
Ein derartiges Präparat
liegt in gebrauchsfertiger Form vor und kann als wässrige Lösung ohne
jeglichen deutlichen Abbau gelagert und versandt werden. L-Histidin
weist einen pKA-Wert von 6,0 auf und ist dementsprechend selbst
im fraglichen pH-Intervall als Puffer geeignet.
-
Präparate mit
einem pH-Wert von 6 bis 7,5 sind bevorzugt.
-
In
pharmazeutischen Präparaten
der Erfindung beträgt
die Histidinkonzentration vorzugsweise 1 mM bis 100 mM. Stärker bevorzugt
beträgt
die Histidinkonzentration 2 bis 20 mM.
-
Das
Wachstumshormonderivat in pharmazeutischen Präparaten der Erfindung ist ausgewählt aus: verkürzten Formen
von Humanwachstumshormon, wobei ein oder mehrere Aminosäurerest(e),
der (die) im hGH vorliegt (vorliegen), deletiert worden ist (sind);
hGH-Analoga, wobei ein oder mehrere Aminosäurerest(e) im nativen Molekül durch
einen anderen Aminosäurerest
(vorzugsweise den Rest einer natürlich
vorkommenden Aminosäure,
sofern die Substitution keinerlei nachteilige Wirkung, wie Antigenität oder reduzierte
Wirkung, aufweist) substituiert worden ist (sind), und N- oder C-terminal
verlängerten
Formen von hGH (wie Met-hGH, Met-Glu-Ala-Glu-hGH oder Ala-Glu-hGH).
-
Der
Histidingehalt in den Präparaten
der Erfindung wird unter Verwendung des Molekulargewichts von Histidin
selbst berechnet.
-
Im
vorliegenden Zusammenhang wird eine „hohe Stabilität" erhalten, wenn das
Präparat
stabiler ist als herkömmliche
Formulierungen, die Phosphatpuffer umfassen.
-
EXPERIMENTALTEIL
-
Die
nachstehenden Beispiele, die hGH an sich betreffen, sind eingeschlossen,
um die stabilisierende Wirkung von Histidin (His) auf die hGH-Polypeptidkette
in wässriger
Lösung
zu veranschaulichen.
-
BEISPIEL 1
-
Reduktion der Deamidierung.
-
Die
Deamidierungsgeschwindigkeit wurde bei 37°C für 4 IU und 12 IU umfassende
hGH-Präparate, bei
einem pH-Wert von 6,5 in His-Puffer, verglichen mit Phosphatpuffer
beim selben pH-Wert, überprüft.
-
Das
4 IU umfassende hGH-Präparat
mit der Zusammensetzung A wurde durch Lösen von 13,3 mg biosynthetischem
hGH in 10 ml 10 mM Histidinpuffer, hergestellt durch Lösen von
15,5 mg Histidin in 10 ml 0,9% Benzylalkohol enthaltendem entionisiertem
Wasser, und Zugeben von 0,1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,5,
hergestellt. Das 12 IU umfassende Präparat wurde durch Lösen von
40 mg hGH in den gleichen wie vorstehend angegebenen Bestandteilen
hergestellt.
-
Das
4 IU umfassende hGH-Präparat
mit der Zusammensetzung B wurde durch Lösen von 13,3 mg biosynthetischem
hGH in 10 ml 10 mM Dinatriumphosphat, hergestellt durch Lösen von
17,8 mg Dinatriumhydrogenphosphat in 10 ml 0,9 Vol.-% Benzylalkohol
enthaltendem entionisiertem Wasser, und Zugeben von 0,1 N Phosphorsäure auf
einen pH-Wert von 6,5, hergestellt. Das 12 IU umfassende Präparat wurde
durch Lösen von
40 mg hGH in den gleichen wie vorstehend angegebenen Bestandteilen
hergestellt.
- Zusammensetzung A:
- 10 mM His
- 0,9% Benzylalkohol
- HCl auf pH 6,5
- Zusammensetzung B:
- 10 mM Dinatriumphosphat
- 0,9% Benzylalkohol
- Phosphorsäure
auf pH 6,5
-
Die
Präparate
wurden durch IE-HPLC auf ihren Gehalt an Desamido-hGH unmit telbar
nach dem Lösen
zur ursprünglichen
Konzentration und nach 7 Tagen bei 37°C überprüft. Die Ergebnisse sind aus
der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich. TABELLE Deamidierung
| | Präparat | | Desamido |
| | | % | |
| Puffer
A | 4
IU/ml | | 1,7 |
| Start | 12
IU/ml | | 2,1 |
| | | | |
| Puffer
A | 4
IU/ml | | 10,1 |
| 7 Tage
bei 37°C | 12
IU/ml | | 10,4 |
| | | | |
| Puffer
B | 4
IU/ml | | 1,8 |
| Start | 12
IU/ml | | 2,3 |
| | | | |
| Puffer
B | 4
IU/ml | | 16,9 |
| 7 Tage
bei 37°C | 12
IU/ml | | 14,9 |
-
Aus
den vorstehende Figuren scheint es, dass die Deamidierung von hGH
bei 37°C
in Histidinpuffer, verglichen mit Phosphatpuffer, deutlich reduziert
ist.
-
BEISPIEL 2
-
Reduktion der Deamidierung in Gegenwart
von Histidin oder Histidinderivaten.
-
Die
Deamidierungsgeschwindigkeit wurde bei 25°C für 6 IU hGH umfassende hGH-Präparate bei
pH 6,5 und bei PH 7,3 in 5 mM, 10 mM und 100 mM His-Puffer, verglichen
mit 8 mM Phosphatpuffer beim selben pH-Wert, überprüft. Weiterhin wurden die Histidinderivate
His-Gly, His-Ala, His-Leu, His-Lys, His-Phe, His-Ser, Histidinmethylester, Histidinol,
Imidazol, Imidazol-4-essigsäure
und Histamin getestet.
-
Die
hGH-Präparate
wurden durch Lösen
von 20 mg biosynthetischem hGH in 10 ml Histidinpuffer mit der gewünschten
Stärke,
hergestellt durch Lösen
von 7,8 mg, 15,5 mg bzw. 155,2 mg Histidin in 10 ml 0,9 Vol.-% Benzylalkohol
enthaltendem entionisiertem Wasser, und Zugeben von 0,1 N Salzsäure auf
den genannten pH-Wert hergestellt.
-
Die
in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführten hGH-Formulierungen wurden
bei 25°C
gelagert und nach 14 Tagen und 30 Tagen durch IE-HPLC auf den Desamidogehalt
analysiert. Die Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle 2
ersichtlich. Tabelle 2 Gehalt an Desamido-hGH, wie bestimmt durch
IE-HPLC als Funktion der Formulierung und der Zeit in Lösung bei
25°C:
| Formulierung
(*) | Bildung
einer Desamido-Verbindung bei 25°C |
| | 14
Tage (') | 30
Tage |
| 5
mM His, pH 6,5 | 6,5 | 9,1 |
| 5
mM His, pH 7,3 | 11,0 | 17,4 |
| 10
mM His, pH 6,5 | 6,8 | 9,7 |
| 10
mM His, pH 7,3 | 11,3 | 16,6 |
| 100
mM His, pH 6,5 | 9,8 | 15,2 |
| 100
mM His, pH 7,3 | 19,3 | 28,8 |
| 8
mM Di-Na-Phosphat, pH 6,5 | 7,8 | 10,8 |
| 8
mM Di-Na-Phosphat, pH 7,3 | 15,2 | 20,3 |
| 8
mM Di-Na-Phosphat, pH 6,5, | 9,4 | 13,2 |
| 0,3%
m-Cresol | | |
| 10
mM Asp, pH 6,5 | 21,7 | nb |
| 10
mM Glu, pH 6,5 | 14,8 | nb |
| 10
mM His-Gly, pH 6,2 | 5,6 | 8,1 |
| 10
mM His-Ala, pH 6,5 | 6,2 | 8,5 |
| 10
mM His-Leu, pH 6,5 | 8,8 | 12,3 |
| 10
mM His-Lys, pH 6,5 | 8,6 | 12,0 |
| 10
mM His-Phe, pH 6,5 | 7,5 | 11,3 |
| 10
mM His-Ser, pH 6,3 | 22,0 | nb |
| 10
mM His-Methylester, pH 6,5 | 4,6 | 5,2 |
| 10
mM Histidinol, pH 6,5 | 27,4 | nb |
| 10
mM Imidazol, pH 6,5 | 9,2 | 12,2 |
| 10
mM Imidazo1-4-essigsäure, pH
6,5 | 10,3 | 14,2 |
| 10
mM Histamin, pH 6,5 | 9,8 | 12,2 |
- *: Umfasst 0,9% Benzylalkohol, außer bei
Formulierung Nr. 9. Der Gehalt an Desamido-hGH im Ausgangsmaterial
betrug: 2,1%
-
Aus
der vorstehenden Tabelle 2 ist es ersichtlich, dass die Deamidierung
von hGH durch die Zugabe von Histidin, verglichen mit Phosphatpuffer,
bei pH 6,5 und 7,3 um etwa 20% reduziert ist. Weiterhin führt eine Reduktion
des pH-Werts von 7,3, bei welchem es sich um den üblichen
pH-Wert von kommerziellen hGH-Präparaten
handelt, auf 6,5 an sich zu einer Reduktion der Deamidierungsgeschwindigkeit
um 50%.
-
Histidinol
scheint die Präparate
unter den Testbedingungen nicht zu stabilisieren, und die Zugabe
von Histidin in größeren Mengen
erhöht
nicht die gewünschte
Wirkung, sondern beeinträchtigt
sie eher.
-
Es
ist ersichtlich, dass vergleichbare Ergebnisse unter Verwendung
von Histidinanaloga, wie Imidazol, Histamin und Imidazol-4-essigsäure sowie
des Histidinmethylesters erhalten werden, was zur alleinigen Bildung
von 3,1% Desamido-hGH
nach 30 Tagen bei 25°C
führt,
wodurch eine Lagerzeit des Präparats
von 3-4 Monaten erhalten wird.
-
Die
Zugabe von Asp oder Glu erhöht
die Deamidierungsgeschwindigkeit, verglichen mit Phosphat bei pH
6,5.
-
Die
Zugabe von Dipeptiden des Typs His-X zeigt eine positive Wirkung
für His-Gly und His-Ala,
wohingegen His-Ser die Stabilität
gegenüber
Deamidierung reduziert.
-
Die
vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die Deamidierungsgeschwindigkeit
durch Senken des pH-Werts und durch Zugabe von Histidin in geringer
Konzentration, vorzugsweise von etwa 5 mM-10 mM, reduziert wird.
Die Deaidierungs geschwindigkeit kann durch Senken des pH-Werts und
Ersetzen des Phosphatpuffers durch Histidin um mehr als 50% reduziert
werden.
-
Die
Verwendung von m-Cresol oder Benzylalkohol als Konservierungsmittel
scheint keinen Einfluss auf die Deamidierungsgeschwindigkeit auszuüben.
-
Eine
Spaltungsbildung (Hydrolyse von Peptidbindungen) wird durch Histidin
bei pH 6,5, verglichen mit Phosphat, reduziert.
-
BEISPIEL 3
-
Reduktion der Bildung von Sulfoxid
-
Die
Abhängigkeit
vom pH-Wert und vom Puffertyp wurde überprüft.
-
Abhängigkeit
vom pH-Wert:
-
Formulierung:
-
Ein
kommerzielles hGH-Präparat
(Norditropin
®,
12 IU/ml), umfassend Bicarbonat, Glycin und Mannit + 0,9% Benzylalkohol,
wurde unter Verwendung von 0,1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,3,
8,0, 7,5, 7,0, 6,5 und 6,0 eingestellt, und die Proben wurden bei
37°C stehen
gelassen. Eine Analyse wurde durch RP-HPLC nach 0, 7 und 14 Tagen durchgeführt. Die
Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle 3 ersichtlich. Tabelle 3 Bildung von Sulfoxid
| Probe | Temperatur °C | Tage | Sulfoxid
% |
| pH
8,37 | - | 0 | 1,0 |
| pH
8,37 | 37 | 7 | 9,0 |
| pH
8,04 | 37 | 7 | 8,7 |
| pH
7,52 | 37 | 7 | 8,3 |
| pH
7,01 | 37 | 7 | 7,7 |
| pH
6,52 | 37 | 7 | 6,5 |
| pH
6,02 | 37 | 7 | 4,8 |
| pH
8,37 | 37 | 14 | 14,9 |
| pH
8,04 | 37 | 14 | 14,5 |
| pH
7,52 | 37 | 14 | 14,0 |
| pH
7,01 | 37 | 14 | 12,9 |
| pH
6,52 | 37 | 14 | 11,1 |
| pH
6,02 | 37 | 14 | 7,7 |
-
Wie
es zu begrüßen ist,
wird die Bildung von Sulfoxid von hGH reduziert, wenn der pH-Wert
von 8,4 auf 6,0 gesenkt wird.
-
Puffertyp, pH:
-
Ein
12 mg/ml destilliertes Wasser umfassendes B-hGH-Präparat wurde
im Verhältnis
von 1:10 mit verschiedenen Puffer in einer Konzentration von 15
mM und wahlweise zugesetztem(n) weiterem(n) Zusatz (Zusätzen) verdünnt. Die
Proben wurden bei 25°C
stehen gelassen, und eine Analyse durch RP-HPLC wurde nach 10 und
34 Tagen durchgeführt.
Die Ergebnisse der RP-HPLC und optionale Zusätze sind aus der nachstehenden
Tabelle 4 ersichtlich.
-
Tabelle
4 Bildung von Sulfoxid
| Puffer | pH | Zusatz | Sulfoxidiert |
| | | | 10
Tage | 34
Tage |
| | | | % |
| Phosphat | 7,3 | - | 1,9 | 5,5 |
| Histidin | 7,3 | - | 0,9 | 2,4 |
| Histidin | 6,9 | - | 0,9 | 2,0 |
| Histidin | 6,5 | - | 0,8 | 1,9 |
| Histidin | 7,3 | 18
mM Met | 0,8 | 2,0 |
| Histidin | 7,3 | 18
mM Cys | 2,4 | 2,9 |
| Histidin | 7,3 | 0,42
mM Toc. | 1,1 | 3,0 |
| Histidin | 7,3 | 9%
Ethanol | 1,3 | 4,2 |
| Histidin | 7,3 | 18
mM Asc. | 41 | nb |
| Histidin | 7,3 | 0,8%
NaCl | 1,3 | 3,5 |
| Toc.: Tocoferol;
Asc.: Ascorbinsäure |
-
Verglichen
mit Phosphatpuffer, wird eine deutliche Reduktion der Bildung eines
sulfoxidierten B-hGH im Histidinpuffer (pH 7,3) beobachtet. Eine
Reduktion der Bildung von Sulfoxid wird durch einen fallenden pH-Wert
im His-Puffer beobachtet.
-
Keine
weitere Wirkung wurde durch Zugabe von Antioxidationsmitteln oder
anderen Zusätzen
erhalten.
-
BEISPIEL 4
-
In
analoger Weise wie in BEISPIEL 1 beschrieben, wurde biosynthetisches
Humanwachstumshormon in einer Konzentration von 6 IU/ml in 0,9%
Benzylalkohol bei pH 6,5 in verschiedenen Histidinkonzentrationen, 0,
1, 2, 5, 10, 20, 30, 50 oder 100 mM, formuliert.
-
Die
Proben wurden für
eine Dauer von 7 Tagen bei 37°C
gelagert und auf den Gehalt an Desamido-, oxidierten Formen und
Dimeren und Polymeren in derselben Weise, wie vorstehend beschrieben
analysiert. Die Ergebnisse sind aus der nachstehende Tabelle 5 ersichtlich,
wobei der Gehalt an Desamido-hGH, Dimeren und Polymeren und oxidierten
Formen durch IE-HPLC, GP-HPLC und RP-HPLC bestimmt und der Gehalt
an gespaltenen Formen von hGH durch IE-HPLC gemessen wird.
-
Die
Dimermenge ist gering, wenn die Konzentration 1 mM Histidin oder
darüber
beträgt,
zur Bildung von Desamido-Verbindungen liefern Histidinkonzentrationen
von bis zu 30 mM akzeptable Ergebnisse, und zur Bildung von oxidierten
Formen sind Histidinkonzentrationen unter 20 mM bevorzugt. Ein Gesamtoptimum
ist für
eine Histidinkonzentration von 5 mM ersichtlich. Tabelle 5
| Konzentration
von Histidin mM | Menge
an Desamido in % | Menge
an Dimer in % | Menge
an Polymeren in % | Menge
an oxidierten Formen in % | Gespaltene Formen
in % | pH |
| 0 | 7,7 | 0,7 | <0,2 | 1,5 | 1,4 | 6,3 |
| 1 | 7,9 | 0,4 | <0,2 | 1,5 | 1,2 | 6,4 |
| 2 | 8,7 | 0,3 | <0,2 | 1,6 | 1,2 | 6,5 |
| 5 | 9,6 | 0,4 | <0,2 | 1,7 | n.n. | 6,6 |
| 10 | 10,8 | 0,4 | <0,2 | 1,7 | n.n. | 6,6 |
| 20 | 11,6 | 0,4 | <0,2 | 2,0 | n.n. | 6,6 |
| 30 | 12,0 | 0,3 | <0,2 | 2,1 | n.n. | 6,6 |
| 50 | 14,4 | 0,5 | <0,2 | 3,8 | n.b. | 6,6 |
| 100 | 17,0 | 0,3 | <0,2 | 2,6 | n.b. | 6,6 |
-
LITERATURANGABEN
-
- 1) Y.-C. J. Wang und M. A. Hanson. Parenteral Formulations
of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers. J. Parenteral
Science and Technology 42 (Suppl.) (1988) 53-525.
- 2) M. C. Manning, K. Patel, R. T. Borchardt. Stability of Protein
Pharmaceuticals. Pharmaceutical Research 6 (11) (1989) 903-918.
- 3) B. A. Johnson, J. M. Shirokawa, W. S. Hancock, M. W. Spellman,
L. J. Basa und D. W. Asward. J. Biol. Chem. 264, 1462-71 (1989).
- 4) L. C. Teh et al., J. Biol. Chem., 262, 785-794 (1987).
- 5) G. W. Becker et al., Biotech. Appl. Biochem., 10, 326-337
(1988).
- 6) R. A. Houghten et al., Arch. Biochem. Biophys., 178, 350-355
(1977).
- 7) R. M. Riggin et al., Anal. Biochem., 167, 199-209 (1987).
- 8) P. Gellerfors et al., Acta Paediatr. Scand (Suppl.), 370,
93-100 (1990).
- 9) M. J. Kaufman, Pharm. Res., 7 (3) 289-292 (1990).