DE69231106T2

DE69231106T2 - Verfahren zur Vorbereitung von Organen auf Langzeitkonservierung und Transplantation

Info

Publication number: DE69231106T2
Application number: DE69231106T
Authority: DE
Inventors: Gregory M. Fahy; Bijan S. Khirabadi
Original assignee: American National Red Cross
Current assignee: American National Red Cross
Priority date: 1991-07-08
Filing date: 1992-07-07
Publication date: 2001-02-01
Anticipated expiration: 2012-07-08
Also published as: DE69231106D1; EP0594733A4; JPH07500815A; US5472876A; EP0594733A1; CA2113119A1; EP0800765A3; US5217860A; EP0800765B1; CA2113119C; WO1993000808A1; EP0800765A2; ATE193181T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Perfusion von Organen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Einleitung und Entfernung von Gefrierschutzmitteln in für eine Vitrifizierung geeigneten Konzentrationen in und aus isolierten Organen oder Geweben zur Konservierung und nachfolgenden Transplantation mittels einer computergestützten Vorrichtung.

Hintergrund der Erfindung

Eine Kryokonservierung (d. h. eine Konservierung bei sehr niedrigen Temperaturen) würde für Transplantationschirurgen die Einrichtung von Organbanken ermöglichen, wie dies zur Zeit bereits mit Blutbanken der Fall ist. Die Hauptschwierigkeit bei einer Krykonservierung ist darin zu sehen, daß man die Organe mit hohen Konzentrationen an Gefrierschutzmitteln perfundieren muß (wasserlösliche organische Moleküle, welche während des Abkühlens auf sehr niedrige Temperaturen Verletzungen beim Einfrieren möglichst klein halten oder gar verhindern). Bis heute wurden zur Durchführung einer derartigen Perfusion weder eine Vorrichtung noch ein Verfahren entwickelt, welche völlig zufriedenstellend gewesen wären. Dies verhinderte die Einrichtung existenzfähiger Organbanken, mit denen man potentiell Leben retten könnte.
Vorrichtungen und Verfahren zur Perfusion von Organen mit einem vor Kälteschaden schützenden Mittel wurden in der Literatur schon seit den frühen siebziger Jahren beschrieben. (Siehe: Pegg, D. E., Banking of Cells, Tissues and Organs at Low Temperatures, Current Trends in Cryobiology, A. U. Smith, Hrsg., Plenum Press, New York, 1970: Seiten 153-180 und insbesondere Seiten 175-177; sowie Pegg, D. E., Perfusion of Rabbit Kidneys with Cryoprotective Agents, Cryobiology 9: 411-419, 1972).
In dem zuerst von Pegg beschriebenen Gerät arbeiteten zwei Perfusionskreisläufe gleichzeitig, der eine mit und der andere ohne ein Gefrierschutzmittel. Durch plötzliches Umschalten von dem Kreislauf mit dem vor Kälteschaden schützenden Mittel in den Kreislauf ohne ein Gefrierschutzmittel und wieder zurück wurde das Gefrierschutzmittel zugeführt und wieder entfernt. Die Überwachung des Druckes wurde nicht beschrieben und die Daten wurden in einen Datenlogger eingegeben, welcher einen Lochstreifen ausgab, der dann mit einem programmierbaren Wang Tischrechner weiterverarbeitet wurde. Die Versuchsergebnisse waren dürftig. Die beschriebene Ausstattung und Technik wurden von Pegg und seinen Mitarbeitern als unzulänglich angesehen, welche sie dann später wesentlich abwandelten.
1973 beschrieben G. J. Sherwood und J. R. Flower in Organ Preservation (D. E. Pegg, Hrsg., Churchill Livingstone, London, 1973, Seiten 152-174) vier mögliche Perfusionssysteme, wobei unbekannt ist, ob auch nur eines davon gebaut wurde. Das erste System bestand aus einer Anzahl von direkt über einen Mehrweghahn mit dem Organ verbundenen Behältern, wobei lediglich über direktes Umschalten von einem Behälter zum anderen schrittweise Veränderungen durchgeführt wurden.
Im zweiten System wurden durch Messung der Fließrate von einem ein Verdünnungsmittel enthaltenden Behälter und von einem Behälter mit einem Gefrierschutzstoff-Konzentrat zu einer Mischkammer und sodann weiter zur Niere Konzentrationsänderungen veranlaßt. Eine getrennte Pumpe zur Regulierung der Fließrate zur Niere war nicht zwischengeschaltet. Die Regelung des Gesamtflusses erfolgte über den Ausstoß der für das Vermischen verwendeten Pumpen. Der Einsatz eines Wärmeaustauschers erfolgte eher vor als nach dem Filter und eine arterielle Regelung gab es überhaupt nicht. Wie weiter unten deutlich werden wird, bestand die einzige Ähnlichkeit zwischen diesem System und der vorliegenden Erfindung in der Verwendung von zwei Sensoren für die Konzentration, der eine im arteriellen und der andere im venösen Gefäßsystem der Niere. Es wurde dafür gesorgt, daß sich die Flußgeschwindigkeit im Organ ändern konnte, um Unterschiede in der Konzentration von Arterien und Venen (A- V-Konzentrationen) möglichst klein zu halten. Die Konzentrationsbestimmung im Kreislauf vor und hinter der Niere erfolgt in Analogie zur Verwendung eines Refraktometers und eines Differentialrefraktometers in der vorliegenden Erfindung, ist jedoch bei weitem nicht so effektiv. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung machten die Erfahrung, daß für eine größere Genauigkeit die Verwendung eines Differentialrefraktometers erforderlich ist. Das Konzept, den A-V-Gradienten eines Organs mittels Kontrolle der Fließgeschwindigkeit im Organ zu überwachen, ist dem System der vorliegenden Erfindung unterlegen.
Auch das dritte von Sherwood und Mitarbeitern beschriebene System wies keine Perfusionspumpe für die Niere auf. Zur Rezirkulation des Perfusats vom Filter wurde vielmehr ein "Rückschlagventil" verwendet, und zwar derart, daß der erwünschte Perfusionsdruck zur Niere aufrechterhalten wurde. Wie beim zweiten System von Sherwood befindet sich der Wärmeaustauscher in der Nähe des Filters und eine Blasenfalle ist nicht vorhanden. Die Perfusatkonzentration im Behälter wird geregelt, indem wie im zweiten System von Sherwood der Zusatz an Gefrierschutzstoff oder Verdünnungsmittel gemessen wird. Falls der Fluß vom Organ nicht im Kreislauf umgepumpt wird, ergeben sich beim Aufrechterhalten und Regeln von Volumen und Konzentration des Perfusats Probleme. Keine dieser Eigenheiten ist erwünscht.
Das vierte System wurde von Pegg im Anhang zur Hauptschrift vorgestellt. In diesem System wird das Perfusat mittels der Schwerkraft direkt vom Mischbehälter über einen Wärmeaustauscher zur Niere geleitet und tritt nach Durchgang durch die Niere wieder in den Behälter ein. Die Konzentration wird ermittelt, indem auch die Flüssigkeit direkt und separat vom Behälter zum Refraktometer und zurück gepumpt wird.
Über Abänderungen und zusätzliche Details wurde 1977 berichtet (Pegg, D. E. und Wustemann, M. T., Perfusion of Rabbit Kidneys with Glycerol Solutions at 5ºC). Zur Regelung der Konzentration wurden im Gerät ein Mischbehälter und ein Behälter für die Zugabe von Glycerinkonzentrat oder Glycerin-freiem Perfusat zum Mischbehälter verwendet. Während der Perfusion wurde das Volumen des Mischbehälters konstant gehalten, was beim Auswaschen des Gefrierschutzstoffs einen exponentiellen Anstieg für die Zugabegeschwindigkeit des Verdünnungsmittels erforderlich machte, um eine lineare Konzentrationsänderung aufrechtzuerhalten. Das konstante Volumen im Mischbehälter und das Vorhandensein nur eines Abgabebehälters ließen eine plötzliche Änderung der Konzentration des Perfusats nicht zu. Alle Bauteile des Systemkreises mit Ausnahme der Niere und eines vor der Niere angeordneten Wärmaustauschers waren bei Raumtemperatur auf einem Labortisch untergebracht, wobei der Behälter bei einer konstanten Temperatur von 30ºC gehalten wurde. Die Niere und der Wärmeaustauscher waren in einem Styroporbehältnis untergebracht, dessen Innentemperatur nicht überwacht wurde. Trotz fehlender Überwachung der die Niere umgebenden Lufttemperatur wurde nur die arterielle Temperatur gemessen, nicht jedoch die venöse Temperatur oder gar die Temperatur an der Oberfläche der Niere. Die Verwendung eines Styroporbehälters ließ auch keine Perfusion unter sterilen Bedingungen zu. Die einzige Möglichkeit, die Flußgeschwindigkeit durch das Organ zu messen, bestand darin, die ausgangsseitige Umwälzpumpe auszuschalten und manuell die zum Ansammeln eines vorgegebenen Flüssigkeitsvolumenes im ausgangsseitigen Behälter erforderliche Zeit aufzuzeichnen, da es im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung keine spezielle Perfusionspumpe für die Versorgung des Organs gab. Der Druck wurde nicht auf Grundlage des Nierenwiderstandes geregelt, sondern auf Grundlage des vereinten Widerstandes von Niere und eines manuell einstellbaren Umlenkventils, welches verwendet wurde, damit das Perfusat schnell durch den Wärmeaustauscher und zurück zum Mischbehälter umgewälzt werden konnte. Der Drucksensor wurde an der Arterienkanüle angebracht und verursacht dort einen Totraum für die Flüssigkeit, was ein manuelles Reinigen erforderlich macht sowie möglicherweise das Einführen eines unerwünschten Zusatzes an unvermischter Totraumflüssigkeit in die Arterienkanüle zur Folge hat. Die Druckregelung erfolgte mittels einer speziell hergestellten Druckregelungseinheit, dessen elektrische Schaltung in einer früheren Veröffentlichung beschrieben wurde (D. E. Pegg und C. J. Green, Renal Preservation by Hypothermic Perfusion. 1. The importance of pressure-control, Cryobiology 10: 56-66, 1973). Die arterielle, jedoch nicht die venöse Konzentration wurde gemessen. Eine Computerkontrolle oder -regelung wurde nicht eingesetzt. Die Konzentration wurde geregelt, indem die Ausgabe des aufzeichnenden Refraktometers zum Vergleich mit der Ausgabe eines Rampengenerators mit linearem Spannungsverlauf in einen "Programmregler" eingegeben und die Fließgeschwindigkeit des Konzentrats oder Verdünnungsmittels passend eingestellt wurde. Die Glycerinkonzentrationen wurden in Fünfminutenabständen sowohl am Mischbehälter als auch an der arteriellen Probenöffnung per Hand gemessen: offensichtlich wurde der Refraktometer nicht zum Senden eines meßbaren Signals an ein Aufzeichnungsgerät eingesetzt. Die Temperatur und der Fluß wurden in Fünfminutenabständen aufgezeichnet. Der arterielle Druck und das Gewicht der Niere wurden als Kurvenzüge auf dem Papierstreifen eines Aufzeichnungsgerätes wiedergegeben. Keine dieser Eigenheiten ist erwünscht.
Weitere Verbesserungen wurden von Jacobsen, LA., Pegg D. E., Wusteman, M. C. und Ribinson, S. M., Transplantation of Rabbit Kidneys Perfused with Glycerol Solutions at 10ºC, Cryobiology 15: 18-26, 1978 beschrieben. Es wurde eine Blasenfalle hinzugefügt und die Probenöffnung am Nierenbypass weggelassen (stattdessen wurde die Konzentration am distalen Ende der Bypassleitung gemessen) und die Temperatur wurde als Kurvenzug auf dem Papierstreifen eines Aufzeichnungsgeräts anstatt alle fünf Minuten per Hand aufgezeichnet. Zudem berichteten diese Autoren, daß die Konzentration im Bypass um 5 Minuten hinter der Konzentration im Behälter hinterherhinkte (gegenüber 3 Minuten oder weniger bei der arteriellen Konzentration in der vorliegenden Erfindung) und daß nach Zugabe von 5 Litern Verdünnungsmittel zum Mischbehälter die Endkonzentration für das Gefrierschutzmittel nicht auf unter 70 mMol gesenkt werden konnte (gegenüber Endkonzentrationen von nahezu 0 in der vorliegenden Erfindung, wobei weniger als 3 Liter Verdünnungsmittel und Spitzenkonzentrationen an Gefrierschutzmittel von nahezu dem zweifachen der von Jacobsen und Mitarbeitern verwendeten eingesetzt wurden).
Im gleichen Jahr berichtete Jacobsen auch von einer Variation am System (Jacobsen, I. A., Distribution and Removal of Glycerol by Vascular Albumin Perfusion in Rabbit Kidneys, Cryobiology 15: 302-311, 1978). Jacobsen maß zwar die die Niere während der Perfusion umgebenden Lufttemperaturen, hat diese jedoch nicht mitgeteilt. Er verkleinerte das Volumen des Mischbehälters auf 70 ml, was einen kleinen Anteil an den 400 ml des Gesamtvolumens für den Kreislauf ausmachte. Es sieht so aus, als wäre ausgangsseitig kein elektronischer Refraktometer eingesetzt worden, um direkt die Glycerinkonzentration zu ermitteln und die Zugabe und das Auswaschen zu überwachen. Stattdessen wurden die errechneten Werte für die Fließgeschwindigkeiten des Konzentrats und des Verdünnungsmittels mit Tusche auf ein Papier aufgetragen und mit einem Leeds and Northrup Trendtrak Programmgerät eingelesen, welches sodann die Pumpe für das Konzentrat/Verdünnungsmittel steuerte. Trotz des kleinen Kreislaufvolumens betrug die kleinste erreichbare Konzentration ungefähr 100 mM.
Über zusätzliche Abänderungen des gleichen Systems wurde von Armitage und Mitarbeitern im Jahre 1981 berichtet (W. J. Armitage, G. Matthes und D. E. Pegg, Seleno-dl-methionine Reduces Freezing Injury in Hearts Protected with Ethanediol, Cryobiology 18: 370-377, 1981). Im wesentlichen wurde der gesamte vorher verwendete Perfusionskreislauf in einem gekühlten Raum untergebracht. Anstelle eines Rampensteuergeräts für die Spannung wurde ein Ventilstößel eingesetzt. Dabei war es jedoch erneut erforderlich, die nötigen Geschwindigkeiten für den Zusatz von Glycerin oder des Verdünnungsmittels unter Verwendung theoretischer Gleichungen zu berechnen, um die Nocke sauber zurechtzuschneiden, was zu Fehlern beim Erreichen des erwünschten Konzentrations/Zeit-abhängigen Ablaufs führen kann. Schließlich erfolgte eine Abänderung, bei welcher ein zusätzlicher Behälter in den Kreislauf eingefügt wurde. Der Zugriff auf diesen Behälter erfolgte offensichtlich mittels eines manuell zu bedienenden Absperrhahns (die Art der Umschaltung vom und zum Behälter wurde nicht genau erklärt) und der Einsatz des neuen Behälters ging auf Kosten der Möglichkeit, das Perfusat zu filtrieren oder es durch eine Blasenfalle zu leiten. Der neue Behälter wurde nicht zur Konzentrationsänderung des Gefrierschutzmittels eingesetzt, er wurde vielmehr dazu verwendet, die ionische Zusammensetzung des Mediums nach der Zugabe des Gefrierschutzmittels zu ändern. Das Volumen des Mischbehälters wurde auf 500 ml festgesetzt, womit man eine Endkonzentration für das Gefrierschutzmittel von 40 mM erreichen konnte.
Nach Kenntnisstand der Erfinder der vorliegenden Erfindung stellen die oben beschriebenen Kreisläufe den derzeitigen Stand der Technik zur Perfusion mit einem Gefrierschutzmittel dar.
Ein von den Erfindern der vorliegenden Erfindung zuvor beschriebenes ähnliches Verfahren zum Schutz von Organen bei kryogenen Temperaturen befaßte sich eher mit einer Vitrifizierung als mit einem Einfrieren der Organe während des Abkühlvorgangs. Eine Vitrifizierung oder ein Verfestigen ohne Vereisung läßt sich an lebenden Systemen dadurch bewerkstelligen, daß man große Teile des Wassers in diesen Systemen durch Gefrierschutzmittel (auch als Gefrierschutzstoffe bezeichnet) ersetzt, in deren Gegenwart ein Auskristallisieren verhindert wird. Mit den bekannten Techniken war es jedoch nicht möglich, genügend hohe Konzentrationen an Gefrierschutzstoff einzusetzen, ohne das Organ dadurch abzutöten. Eine Vitrifizierung erfordert typischerweise Konzentrationen an Gefrierschutzmittel von über 6 M, während die Schwellenkonzentration zum Überleben eines Organs bei etwa 4 Mol liegt.
Ein möglicherweise von Gefrierschutzstoffen verursachter Schadenstyp ist eine osmotische Schädigung. Cryobiologen erfuhren von den osmotischen Wirkungen von Gefrierschutzstoffen in den 50er Jahren und erkannten die Notwendigkeit, diese Wirkungen zu überwachen, um während Zugabe und Entnahme von Gefrierschutzstoffen an isolierten Zellen und Geweben unnötige Schäden zu vermeiden. Ähnliche Erfahrungen wurden gemacht, als die Cryobiologen auf Untersuchungen der Perfusion von ganzen Organen mit Gefrierschutzmitteln übergingen. Es war wichtig, daß sich die Aufmerksamkeit auf die Osmose zu richtete, um zu verstehen, wie sich bei Organen eine gewisse Toleranz gegenüber der Zufuhr eines Gefrierschutzmittels ausbildet. Doch trotz der Anstrengungen bei der Überwachung der zerstörerischen osmotischen Wirkungen von Gefrierschutzstoffen sind immer noch Toleranzschwellen gegenüber Gefrierschutzstoffen zu beobachten. Es treten ernste inhärente toxische Wirkungen von Gefrierschutzstoffen auf, welche unabhängig von den vorübergehenden osmotischen Wirkungen dieser chemischen Stoffe sind.
Die Erfinder und Andere haben in Studien Verfahren zur Kontrolle der nicht osmotischen, inhärenten Toxizität von Gefrierschutzmitteln untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß verschiedene Techniken allein und in Kombination wirksam sein können. Diese sind (a) wenn Organe höchsten Konzentrationen ausgesetzt werden, dann sind die Temperaturen herabzusetzen; (b) die Verwendung spezifischer Kombinationen von Gefrierschutzstoffen, deren gegenseitige Wirkungen die jeweiligen Toxizitäten aufheben; (c) die Organe Gefrierschutzstoffen in Trägerlösungen auszusetzen, welche für diese besonderen Gefrierschutzstoffe optimiert sind; (d) die Verwendung nicht penetrierender Stoffe, welche einen Teil der sonst benötigten penetrierenden Stoffe ersetzen können, wodurch das Zellinnere davon verschont wird, einem zusätzlichen intrazellulären Mittel ausgesetzt zu werden; und (e) Minimierung der Zeit, die innerhalb des Konzentrationsbereichs der schnellen zeitabhängigen Toxizität verbracht wird. Mittel, mit deren Hilfe diese Prinzipien auf ganze Organe angewandt werden können, so daß sie mit vitrifizierbaren Lösungen ohne zugrundezugehen behandelt werden können, waren jedoch nicht sicher oder standen nicht zur Verfügung.
Einige dieser Techniken stehen auf potentiellem Kriegsfuß mit der Notwendigkeit, die osmotischen Kräfte zu kontrollieren. Beispielsweise verringern verminderte Temperaturen auch die Ein- und Ausflußgeschwindigkeit von Gefrierschutzstoffen, wodurch dann die osmostischen Wirkungen verlängert und intensiviert werden. Auf ähnliche Weise werden die potentiellen osmotischen Wirkungen maximiert, wenn die Zeit, über welche die Organe den Gefrierschutzstoffen ausgesetzt wird, minimiert wird. Zwischen der Kontrolle eines osmotischen Schadens und der Kontrolle der Toxizität muß somit Ausgeglichenheit erreicht werden. Passende Mittel, um diesem Gleichgewichtszustand zu kommen, sind in der Literatur nicht beschrieben. Es trifft auch zu, daß in einigen Fällen eine Intensivierung der osmotischen Effekte von Gefrierschutzstoffen durch eine Minimierung der Zeit, über welche das biologische Material diesen Mitteln ausgesetzt wird, günstig und ergänzend zur damit erzielten verringerten Toxizität sein kann, doch sind sichere Mittel, mit welchen dies mit ganzen Organen erzielt werden könnte, nicht beschrieben worden.
Mit einer Organkonservierung bei kryogenen Temperaturen könnte man den Verlust an wertvollen menschlichen Organen deutlich reduzieren und eine bessere Anpassung zwischen Spender und Empfänger erleichtern, ein Faktor, der trotz der jüngsten Fortschritte bei der Kontrolle zur Abstoßung immer noch an Bedeutung zunimmt. Siehe: Takiff, H. und Mitarbeiter, Transplantation 47: 102-105 (1989); Gilks, W. R. und Mitarbeiter, Transplantation 43: 669-674 (1987). Gemäß jüngerer Arbeiten zur Induktion der Toleranz von transplantierten Organen benötigt das Immunsystem eines Wirts 20-200 Tage für seine "Umschulung", um ein Transplantat als "Selbst" zu erkennen, eine Zeit, die nur zur Verfügung steht, wenn man in der Lage ist, das Totorgan einer Kältekonservierung zu unterziehen. Siehe: Posselt, A. M. und Mitarbeiter, Science 249: 1293-1295 (1990); Remuzzi, G. und Mitarbeiter, The Lancet 337: 750-752 (1991).
Ein Haupthindernis bei Untersuchungen zur Kältekonservierung von Organen bestand im Fehlen einer geeigneten Ausrüstung zur Überwachung von Perfusionsparametern, wie der Konzentrations-Zeit-Verlauf des Gefrierschutzstoffs, der Druck und die Temperatur. Vorher beschriebene Standard-Perfusionsgeräte waren für diese Anwendung nicht ausgelegt und nicht in der Lage, den hier angesprochenen Erfordernissen Rechnung zu tragen. Diesbezügliche Patente sind:
US-Patent Nr. 3,753,865 von Belzer und Mitarbeitern,
US-Patent Nr. 3,772,153 von De Roissart und Mitarbeitern,
US-Patent Nr. 3,843,455 von Bier,
US-Patent Nr. 3,892,628 von Thome und Mitarbeitern,
US-Patent Nr. 3,914,954 von Doerig, R. K.,
US-Patent Nr. 3,995,444 von Clark und Mitarbeitern,
US-Patent Nr. 4,629,686 von Gruenberg, M. L.,
US-Patent Nr. 4,837,390 von Reneau, R. P.
Mit den in der Vergangenheit beschriebenen Ausstattungen für Anwendungen in der Kältekonservierung ließen sich nur relativ einfache Versuchsprotokolle durchführen, die oft unhandlich in der Ausführung waren. Lediglich Adern und Harness beschrieben den Einsatz eines Computers zur Perfusion von Organen mit einem Gefrierschutzstoff. Siehe: Adern, C. G. und Mitarbeiter, J. Biomed. Engeneering 3: 134-139, 1981. Ihre spezielle Ausführung wies jedoch einige gravierende Mängel auf, welche seiner Verwendbarkeit Grenzen setzte.
Die vorliegende Erfindung überwindet im wesentlichen sämtliche Unzulänglichkeiten der bekannten Vorrichtungen und Verfahren.

Zusammenfassung der Erfindung

In allgemeinster Form betrifft die vorliegende Erfindung eine computergesteuerte Vorrichtung und ein Verfahren zur Perfusion eines biologischen Organs, wie z. B. ein Herz, eine Niere, eine Leber, usw. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine Anzahl von Flüssigkeitsbehältern sowie eine Organbox zur Aufnahme des biologischen Organs. Ein erster Durchflußweg für die Flüssigkeit ist als Schleife gekennzeichnet, ausgehend von der Anzahl Behältern zu benötigten Sensoren und Mitteln zur Temperatureinstellung und wieder zurück zu der Anzahl von Behältern. Die Behälter lassen sich selektiv mit dem ersten Durchflußweg für die Flüssigkeit verbinden. In den ersten Durchflußweg für die Flüssigkeit sind Pumpenmittel zwischengeschaltet, um Flüssigkeit vom ersten Durchflußweg für die Flüssigkeit in einen zweiten Durchflußweg für die Flüssigkeit zu pumpen. Der Organbehälter liegt in diesem zweiten Durchflußweg für die Flüssigkeit. Auch im zweiten Durchflußweg für die Flüssigkeit können Pumpenmittel enthalten sein, um Flüssigkeit vom Organbehälter zu einem oder mehreren der Behälter oder zum Abfluß zu pumpen. Einer oder mehrere Sensoren sind auf den Durchflußwegen für die Flüssigkeit angebracht, um jeweils mindestens die Konzentration, die Temperatur, den pH-Wert oder den Druck der in dem ersten und zweiten Durchflußweg fließenden Flüssigkeit zu messen. Meßmittel sind auf den Durchflußwegen für die Flüssigkeit angebracht, um stromauf und stromab vom Organbehälter - in Stromrichtung gesehen - die Konzentrations- und Temperaturunterschiede zu bestimmen. Der (die) Sensor(en) und die Meßmittel sind mit einem programmierbaren Computer verbunden, um einen kontinuierlichen Informationsfluß von dem (den) Sensor(en) zum Computer herzustellen. Der Computer schließlich ist mit dem Auswahlmittel und dem Pumpenmittel für eine kontinuierliche selktive Überwachung (a) des Flüssigkeitsflusses von jedem der Behälter zu den einzelnen Durchflußwegen für die Flüssigkeit, und (b) mindestens jeweils der Konzentration, der Temperatur, dem Druck oder dem pH-Wert der im zweiten Durchflußweg fließenden Flüssigkeit gemäß einem vorherbestimmten Computerprogramm ohne den Eingriff einer Bedienungsperson verbunden.
Ein zusätzliches erfindungsgemäßes Merkmal kann in einem im ersten Durchgangsweg für die Flüssigkeit untergebrachten Wärmeaustauscher bestehen, um die Temperatur der in diesem Durchgangsweg fließenden Flüssigkeit einzustellen. Ein zweiter Wärmeaustauscher kann im zweiten Durchgangsweg für die Flüssigkeit untergebracht sein, um die Temperatur der im zweiten Durchgangsweg fließenden Flüssigkeit einzustellen. Ein dritter Durchgangsweg für eine Flüssigkeit kann zwischen dem Organbehälter und der Anzahl von Behältern existieren. Eine dritte Pumpe kann in den dritten Durchgangsweg eingeschaltet sein, um Flüssigkeit vom Organbehälter zu einem oder mehreren der Behälter zu pumpen.

Eigenschaften und Vorteile der Erfindung

Die Erfindung weist eine Vielzahl von Eigenschaften und Vorteilen auf, von denen die wichtigsten sind:
1. Mit ihr läßt sich die Konzentration eines Gefrierschutzstoffs oder jeder anderen Flüssigkeit oder Medikaments im Perfusat eines Organs gemäß einer großen Bandbreite vorbestimmter Konzentrations/Zeit-Abläufe mehr oder weniger unabhängig von der Fließgeschwindigkeit des Perfusats durch das Organ steuern, wobei dafür gesorgt ist, daß sich die Konzentrationen anderer Arzneimittel oder osmotischer Mittel gleichzeitig ändern lassen. Schrittweise Änderungen der Konzentration sind möglich. Es besteht auch die Möglichkeit, Konzentrationen effektiv auf Null zu bringen.
2. Es ist vorgesehen, die Konzentration, den pH-Wert, die Temperatur des Perfusats und andere Parameter mittels in-line-Messung zu ermitteln, so daß keine Sensoren in den Behältern für das Perfusat oder Messungen per Hand benötigt werden.
3. Mit ihr lassen sich Unterschiede zwischen der Konzentration des überwachten Gefrierschutzstoffs und der Konzentration des Gefrierschutzstoffs in den Behältern für das Perfusat minimieren, indem die für das Wandern des Perfusats von den Behältern zu den Sensoren für das Perfusat und wieder zurück zu den Behältern benötigte Zeit möglichst klein gehalten wird.
4. Mit ihr lassen sich Unterschiede zwischen der Konzentration des überwachten Gefrierschutzstoffs und der Konzentration des gerade durch das Organ perfundierten Gefrierschutzstoffs minimieren, indem die vom Perfusat zum Wandern vom Hauptflüssigkeitskreislauf zum perfundierten Organ (oder superfundierten Gewebe) benötigte Zeit möglichst klein gehalten wird.
5. Mit ihr läßt sich der Unterschied zwischen arterieller und venöser Konzentration des Gefrierschutzstoffs über das Organ hinweg als Meßziffer für das Ausmaß der (oder die Möglichkeit für eine) Gleichgewichtseinstellung des Organs mit Gefrierschutzstoff aufzeichnen.
6. Mit ihr läßt sich die Organtemperatur im wesentlichen unabhängig vom Fluß durch das Organ steuern und nach Gutdünken variieren.
7. Mit ihr läßt sich der Perfusionsdruck regeln, entweder indem er konstant gehalten oder wie erwünscht verändert wird und, falls erwünscht, läßt sich die Pulsation möglichst klein halten.
8. Sie schützt vor einer Perfusion mit unvermischter Lösung und Luft(blasen) in das Organ.
9. Sie hat mit dem Computer eine Schnittstelle zur Perfusionskontrolle, zur Ermöglichung einer Echtzeitaufzeichnung, Sichtanzeige, Verarbeitung und Aufzeichnung der Daten, zur Kalibrierung der Sensoren und Pumpen, zum Reinigen, Desinfizieren und Primen des Perfusionskreislaufs sowie zum Informieren und Alarmieren der Bedienungsperson, falls nötig.
10. Sie eignet sich zur Perfusion und zum Gefrierschutz von Organen äußerst unterschiedlicher Größe, z. B. aller Größen zwischen einem Rattenherzen und einer menschlichen Leber, und eignet sich auch zur Superfusion von Geweben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt in einem Diagramm sämtliche Strömungswege für die Flüssigkeit der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung.
Fig. 2A-C zeigen jeweils in Seiten-, Drauf und Unteransicht einen in der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung als Speicher R1 verwendeten Zweikammer- Gradientenmischer.
Fig. 3A-C zeigen jeweils in Seiten-, Drauf und Unteransicht einen in der erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung als Speicher R3 verwendeten Dreikammer- Gradientenmischer.
Fig. 4A-C zeigen jeweils in Vorder-, Seiten- und Hinteransicht den in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten HBM, Fig. 4D zeigt den Hauptbereich der Mischeinheit des HBM und Fig. 4E zeigt in Draufsicht den Boden des HBM.
Fig. 5 zeigt das Aussehen eines typischen Protokolls zum Einführen und Entfernen von Gefrierschutzmittel, wie es auf dem Monitor des Computers während der Perfusion zu sehen ist.
Fig. 6A-E zeigen ein Flußdiagramm für die Maßnahmen zur Organperfusion mit Gefrieschutzmittel.
Fig. 7A-B zeigt ein Flußdiagramm für das Perfusionsverfahren ohne Gefrierschutzstoff.
Fig. 8 zeigt die Tätigkeit (Kontrolle von Serum-Kreatinin) von nach Perfusion mit VS4 transplantierten Nieren von Kaninchen.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform und beste Methode

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die die erfindungsgemäßen Grundprinzipien und und Merkmale aufweisende Vorrichtung in einem (in Fig. 1 zweifach gestrichelt wiedergegebenen) gekühlten Behältnis enthalten. Das gekühlte Behältnis weist zwei Seiten auf, die Behälter/Solenoid-Seite und die Organ/Refraktometer-Seite. Die Vorderseite des Behältnisses ist mit aus jeweils zwei Scheiben bestehenden durchsichtigen Türen versehen, wobei sich zwischen den jeweils ca. 2,54 cm (1 Zoll) voneinander beabstandeten Scheiben ein Isoliergas befindet (dessen Druck und/oder Feuchtigkeit falls erforderlich herabgesetzt werden können), um das Kondensieren von Feuchtigkeit auf den Türen zu vermeiden und einen Wärmeverlust des Behältnisses möglichst gering zu halten. Die organseitige Tür ist zur Bildung einer zweiteiliegen Tür ("Dutch door") geteilt. Dadurch läßt sich der obere Teil der organseitigen Tür öffnen und schließen, um das Organ in das System einzuführen und wieder zu entnehmen, ohne daß sich dabei die Temperatur unterhalb des oberen Türabschnitts verändert, wo der Organbehälter und der größte Teil der restlichen Ausrüstung untergebracht sind. Das Behältnis kann auch auf der Behälterseite eine zweiteilige Tür aufweisen, um den Operateur in die Lage zu versetzen, alle erforderlichen Einstellungen vorzunehmen (z. B. Zugabe von Flüssigkeit zu den Behältern, Umschalten der oberen Flüssigkeitsleitungen, usw.), ohne dabei die Temperatur im Behältnis in unnötigem Maße zu beeinflussen.
Die Hauptmerkmale der Erfindung und die Verfahrensweise sind im Schaltschema für den Fluß in Fig. 1 wiedergegeben. Alle für eine Zirkulation durch das System zur Verfügung stehende Flüssigkeit wird mittels einer Kreislaufpumpe 102 je nach dem computergesteuerten Betätigungsmuster der Dreiweg-Solenoidventile S1, S2 und S3 durch die Flüssigkeitsaufnahmeleitungen U1, U2, U3 oder U4 in den Hauptkreislauf gepumpt. Die Aufnahmeleitungen U1-U4 werden durch genormte Schnell-Trennkupplungen für Rohrleitungen entweder mit den jeweils von den Behältern R1-R4 kommenden Flüssigkeitszulieferleitungen D1-D4 oder mit den Reinigunggefäßen C1-C4 verbunden. Durch Abklemmen von D1-D4 und deren Entkoppeln von den Aufnahmeleitungen U1-U4 lassen sich die Leitungen U1-U2, wie durch die gebogenen Pfeile angedeutet, an die Reinigungsgefäße C1-C4 anschließen. Obwohl dies zur Zeit manuell geschieht, ist es für einen Fachmann auf dem betreffenden Gebiet leicht einzusehen, daß sich zur automatischen Durchführung dieser Aufgabe auch geeignete Ventile, Schläuche und Überwachungseinrichtungen einsetzen lassen.
In der zur Zeit gebauten Ausführungsform der Erfindung werden die Behälter R1-R4 von einem dicken durchsichtigen Konstoffbrett gehalten, von welchem vier magnetische Rührtische herabhängen, welche die vier Behälter umrühren. Ein sorgfältiges Rühren von R1, R3 und R4 ist für die Erstellung eines sauberen Konzentrations-Zeit-Gradienten notwendig. Der An/Aus-Zustand und die Rührgeschwindigkeiten der Rührtische werden unabhängig voneinander gesteuert.
Die Gefäße C1-C4 führen zu den Quellanschlüssen für steriles (destilliertes) Wasser, Luft und Desinfektionsmittel. Die Solenoidventile S0 und S00 liegen auf den Zuführungsleitungen dieser Quellen und dienen dazu, sicherzustellen, daß keine Spuren von Infektionsmittel aus Versehen in das Perfusionssystem gelangen können. Das Solenoid 50 regelt, ob Luft oder Flüssigkeit zur Reinigung in den Perfusionkreislauf eintritt, während das Solenoid S00 darüber befindet, ob die ausgewählte Flüssigkeit Wasser oder Desinfektionsmittel ist. Die Aufspaltung der Hauptreinigungsleitung in vier voneinander unabhängige Kanäle außerhalb des Behältnisses anstatt unmittelbar vor Erreichen von C1-C4 stellt sicher, daß jeder Kanal von den jeweils anderen unabhängig ist, d. h. daß er keiner schwerwiegenden Querverunreinigung unterliegt, die aus einer Rückdiffusion von ungereinigter Lösung aus den Flüssigkeitsaufnahmeleitungen U1-U4 in die zu den Reinigungsgefäßen C1-C4 führenden Reinigungsleitungen stammt.
Das destillierte Wasser und das Desinfektionsmittel werden in das System über ein Sterilfilter F4 eingebracht, während Luft über ein Luftfilter F5 in das System gelangt. Das derzeitige Infektionsmittel der Wahl ist ein klinisch erprobtes kaltes Sterilisationsmittel für Dialyseapparate, wie z. B. Actril. Das Reinigungsverfahren besteht aus einem Auswaschen des Perfusats aus dem System mittels Wasser und dann einem Ersatz des Wassers durch Sterilisationsmittel. Vor der darauffolgenden Perfusion wird das Sterilisationsmittel aus dem System mit Wasser ausgewaschen und das Wasser dann mit Luft aus dem System ausgetrieben. Das Sytem wird sodann durch Verdrängung der Luft durch ein geeignetes Perfusat geprimed. Der Luftstrom dient dazu, evtl. Überreste von noch verbleibenden, im Waschwasser gelösten Spuren von Sterilisationsmittel zu vermeiden und jegliche Verdünnung der Primingflüssigkeit mit Wasser zu unterbinden (d. h. die für die Verdrängung des Wassers aus dem System benötigte Menge an Primingflüssigkeit zu reduzieren), um eine visuelle Begutachtung darüber zu ermöglichen, ob das Primen vollständig ist und das Überlaufen von Wasser im Behältnis zu verringern, wenn die Behälter, Filter und die Organbox nach dem Reinigen aber vor dem Primen in das System eingebracht werden. Falls erwünscht, kann das Durchblasen von Luft jedoch auch entfallen. Der Luftfilter wird dazu verwendet, um, falls erforderlich, eine Verunreinigung mit in der Luft befindlichen Krankheitserregern zu verhindern.
Normalerweise leiten die Solenoidventile S9-S12 die Flüssigkeit entweder zu den Behältern R1-R4 oder zum Abfluß. Die Behälter R1-R4 lassen sich auch durch Abnehmen der Rezirkulationsleitungen RL5-RL8 von den Behältern R1-R4 vom System abkoppeln und (wie durch die gebogenen Pfeile angedeutet) jeweils an die Abflußgefäße W1-W4 ankoppeln, wodurch erreicht wird, daß man die Behälter R1-R4 zur Reinigung, Sterilisation und Wiederbefüllung aus dem System entnehmen kann. Wenn die Behälter entnommen sind, leiten die Ventile S9-S12 die Flüssigkeit zu den Abflußgefäßen W1-W4. Die den Abflußgefäßen W1-W4 entsprechenden vier Abflußleitungen werden zu einer einzigen gemeinsamen Abflußleitung LW zusammengefaßt. Auf der gemeinsamen Abflußleitung sitzt ein Zweiweg-Solenoidventil S16. Wenn die Abflußgefäße nicht in Gebrauch sind, wird die gemeinsame Abflußleitung durch Schließen des Ventils S16 blockiert, um jegliches Rückfließen von Abfluß oder Krankheitserregern in das sterile Behältnis zu verhindern.
Mit dem Einsatz dieses Systems von Aufnahmeleitungen U1-U4, welche alternativ an die Zufuhrleitungen für die Behälter D1-D4 oder die Reinigungsgefäße C1-C4 angeschlossen werden, in Kombination mit den Rezirkulationsleitungen RLS-RL8, die ihrerseits alternativ mit den (nicht in der Figur gezeigten) internen Rückführleitungen zu den Behältern oder mit den Abflußgefäßen W1-W4 verbunden werden, kann man eine vollständige Sterilisierung des Perfusionskreislaufs erzielen. Die unverbundenen Enden der Aufnahmeleitungen U1-U4, der Zuführungsleitungen D1-D4, der Reinigungsgefäße C1-C4 sowie der Abflußgefäße W1-W4 lassen sich sterilisieren, indem sie mit Desinfektionsmittel abgerieben werden, wenn das Schlauchsystem von einer Alternativstellung in die andere umgeschaltet wird. Das Umschalten des Schlauchsystems erfolgt während einer intermittierenden Beaufschlagung des Schlauchsystems mit Druck, damit es während des Umschaltens versperrt ist, um ein Lecken der Flüssigkeit sowie die zusätzliche Gefahr einer Kontamination zu vermeiden.
Die aus den Behältern R1-R4 oder aus den Gefäßen C1-C4 abgezogene Flüssigkeit wird je nach Betätigungsstellung der Solenoidventile S4 bis S7 durch einen von mehreren Filtern F1, F2 und F3 geleitet. Diese Betätigungsmuster werden weiter unten genauer beschrieben. Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, daß ein einzelner Filter F1 oder zwei parallel geschaltete Filter F1, F1' für die meisten Untersuchungen ausreicht (was die Verwendung der Ventile S4-S7 zu einer fakultativen Maßnahme macht, wie dies durch die gestrichelten Linien angedeutet wird), da sich gedachte schrittweise Änderungen in den Konzentrationen auch bewirken lassen, wenn im Kreislauf nur ein Filter oder zwei parallel geschaltete Filter enthalten sind.
Erwünschterweise soll der Abstand zwischen dem Kopf der Kreislaufpumpe 102 und den Solenoiden S1-S7 möglichst klein sein, um den Totraum und die Totzeit für den Kreislauf sowie den Einfluß der Viskosität des Perfusats möglichst klein zu halten.
Die Filter sind zur Sterilisierung des Perfusats befähigt und autiklavierbar. Alle Filterhalter lassen sich zum Reinigen und Sterilisieren aus dem System mit Hilfe der in Fig. 1 gezeigten Schnell-Trennkupplungen entnehmen. Entlüftungsleitungen V1-V3 führen zu außerhalb des gekühlten Bereichs des Behältnisses 100 angebrachten Solenoidventilen S13-S15. Diese Entlüftungsleitungen werden während des Primens und Reinigens des Systems computergesteuert geöffnet und geschlossen, damit Luft entweichen kann und dadurch verhindert wird, daß die Filter verstopfen oder beschädigt werden. Für eine Notentlüftung des Kreislaufs ist ist eine (nur für S13 gezeigte) per Hand bedienbare Umgehung von V1-V3 vorgesehen. Wie ersichtlich, ist eine über die Filter F1-F3 hinausgehende Entlüftung des Systems nicht möglich, falls die Filter F1-F3 im Kreislauf enthalten sind. Falls daher verfahrensmäßig ein Entleeren mit Luft vorgesehen ist, müssen die Filter F1-F3 entfernt werden, bevor das Austreiben des Sterilisierungsmittels beginnt.
In der zur Zeit bevorzugten Ausführungsform ist in jedem Filterhalter ein Filter mit 90 mm Durchmesser und einer Porengröße von 0,22 u untergebracht. Ein Filter dieser Größe läßt bei 0ºC genügend Vitrifizierungslösung hindurch, um bei darüberliegendem 1,2 u Filter und einem Grobfilter zur Vermeidung von Verstopfungen eine Kaninchenniere erfolgreich perfundieren zu können. In der Standardausrüstung für die operative Version werden zwei parallel geschaltete identische Filter verwendet. Dies ist notwendig, damit der für menschliche Organe erforderliche Fluß angepasst werden kann; dies bietet einen Sicherheitsfaktor gegen unbeabsichtigt in die arterielle Flüssigkeit eingeführte Luft; auch das Risiko eines Druckabfalls in der Nähe der Filter wird möglichst klein gehalten. Diese kontinuierliche Filtersterilisation und Nachsterilisation des Perfusats während der Sterilisation kann als Sicherheit für vorsterilisierte Lösungen für den Fall dienen, daß, aus welchen Gründen auch immer, während der Perfusion eine Kontamination auftritt.
Hat die Flüssigkeit aus dem ausgewählten Behälter den geeigneten Filter passiert, wird sie in einem Wärmeaustauscher 104 einer vorläufigen Temperaturbehandlung unterzogen und sodann zu einer so nahe wie möglich am Organ gelegenen Position transportiert, wo sie auf eine T-förmige Rohrverbindung T1 trifft. Der Hauptteil des Stromes wird passiv über den Weg L1 ("Refraktometer-Schleife") zu einem zur Prozeßsteuerung ausgelegten Durchflußrefraktometer 106 geleitet, der den Brechungsindex der Flüssigkeit und damit die Konzentration an Gefrierschutzmittel ermittelt. Der restliche Strom wird mittels einer Organpumpe 108 durch eine Organ-Schleife L2 geleitet. Die Geschwindigkeit der Organpumpe ist computergeregelt, um trotz der Variationsbreite für den vaskulären Organwiderstand den gewünschten Perfusionsdruck für das Organ aufrechtzuerhalten. Durch Änderung der Förderhöhe der Pumpe und des hindurchgehenden Schlauchdurchmessers läßt sich ein breiter Durchflußbereich erstellen, der ausreicht, um Organe in einem breiten Größenspektrum zu perfundieren; damit ließen sich Organe, die so klein sind wie Rattenherzen und so groß wie menschliche Nieren erfolgreich perfundieren.
Die von der Kreislaufpumpe 102 gelieferte Flußmenge, welche sowohl die Refraktometerschleife L1 als auch die Organschleife L2 versorgt, muß groß genug sein, um sowohl jederzeit über der durch das Organ fließenden Flußmenge zu liegen als auch sicherzustellen, daß für den Refraktometer 106 und andere, allgemein als 110 bezeichnete in- line-Sensoren ein genügend großer Fluß zur Verfügung steht, um genaue Meßwerte für die Temperatur, den pH-Wert und andere gewünschte Parameter des Perfusats nehmen zu können. Der Fluß muß auch groß genug sein, um sowohl die "Totzeit" zwischen den Änderungen für die Behälterkonzentrationen und den Änderungen der gemessenen Konzentration und anderer ermittelter Parameter in der Refraktometerschleife als auch die "Totzeit" zwischen dem Behälter und dem Organ möglichst klein zu halten. Der von der Kreislaufpumpe zur Verfügung gestellte Fluß wird auch sowohl durch die Anforderung eingeschränkt, zu verhindern, daß die Flüssigkeit mit einer Geschwindigkeit durch die Filter fließt, welche die Durchflußkapazität von Filter und Zuführungsleitungen übersteigt, als auch durch die Beschränkungen, welche durch Wärmeentwicklung und Verschleiß der mit der Pumpe verbundenen Leitungsschläuche auferlegt werden. Gewöhnlich wird die Umdrehungsgeschwindigkeit der Kreislaufpumpe während einer Versuchsdurchführung nicht verändert, weshalb gewöhnlich keine Computersteuerung erforderlich ist, obwohl eine Computersteuerung als Option zur Verfügung steht.
Nach Durchgang durch die Organpumpe 108 passiert das Perfusat einen zweiten Wärmeaustauscher 112, mit welchem die Endeinstellung der Temperatur für das Perfusat erfolgt. Dies geschieht durch Einstellen der Fließgeschwindigkeit von sowohl warmer als auch kalter Flüssigkeit, welche von einem kalten und warmen Bad 114 bzw. 116 kommen, unter Verwendung (nicht gezeigter) computergesteuerter Pumpen zwischen dem Wärmeaustauscher 112 und den Bädern 114, 116.
Der Computer kann den Fluß durch sowohl die Kalt- als auch Warmleitung verändern, um so die Temperatur des Perfusats in der arteriellen Leitung und daher auch im Abfluß des Organs einzustellen. Die Temperaturen in der arteriellen Leitung und im Abfluß liefern einen Hinweis auf die jeweilige Organtemperatur. Durch Regelung der Fließgeschwindigkeit von kalter und warmer Badflüssigkeit läßt sich die Organtemperatur unabhängig vom Fluß durch das Organ einstellen, vorausgesetzt die Fließgeschwindigkeit liegt nicht nahe Null. Die Erfahrung hat gezeigt, daß sich erfindungsgemäß arterielle und venöse Temperaturen erreichen lassen, die mindestens so kalt wie -6ºC und mindestens so hoch wie 25ºC sind. Das allgemeine Herunterkühlen des Behältnisses für Perfusionen unter Null stellt keine Alternative zum Wärmeaustauschersystem dar, da ein Herunterkühlen des Behältnisses auf Temperaturen unter Null ein Einfrieren der verdünnteren Lösungen in den Schlauchleitungen bewirkt. Ein eigenes Isolieren und Kühlen des Organbehälters ist jedoch von theoretischem Wert und kann wahlweise erfolgen.
Unmittelbar vor Eintritt in den Organbehälter wird das auf definierte Temperatur eingestellte Perfusat entgast und in einer Blasenfallen-/Misch-Vorrichtung vermischt. Arterielle und venöse, in Fig. 1 allgemein mit "T" bezeichnete Temperatursonden sind durch einfache Löcher in der Wand des Organbehälters 122 geführt. Der Druck und wahlweise die Temperatur werden in der Blasenfalle gemessen. Obwohl in der Zeichnung zum leichteren Verständnis getrennt eingezeichnet, sind die Blasenfalle und der Mixer 120 in Wirklichkeit ein integraler Bestandteil des Wärmeaustauschers 112, so daß der Wärmeaustausch während der Durchführung des Entgasens und Mischens weiter gesteuert wird. Die Erfahrung hat gezeigt, daß das Vermischen wegen der Neigung der verdünnten Lösungen, sich den konzentrierteren dichten Lösungen zu überschichten, wichtig ist. Genauere Angaben zum speziellen Aufbau der Wärmeaustausch-Blasenfallen-/Misch-Vorrichtung (HBM) werden weiter unten gemacht.
Unter normalen Umständen wird die aus diesem zweiten Wärmeaustauscher 112 austretende Kühlflüssigkeit dazu verwendet, das durch den vorhergehenden Wärmeaustauscher 104 hindurchfließende Perfusat zu kühlen. Diese Kühlflüssigkeit fließt sodann zu einem die Solenoide S1-S12 enthaltenden Solenoid-Formrahmen 118 weiter, um die vor seiner Rückführung zum Kältebad von diesen Solenoiden abgegebene Wärme aufzunehmen.
Der Formrahmen 118 ist mit einem internen Leitungssystem für die Flüssigkeit zur Aufnahme der von den Solenoiden abgegebenen Wärme ausgestattet, und kann entweder aus Metall oder Kunsstoff bestehen. Die Solenoide sind vorzugsweise Dreiweg-Kolbensolenoide von 3-7 Watt (oder mehr) mit einem möglichst kleinen inneren Flüssigkeitsvolumen und Öffnungen in der Größe von 0,4 cm (0,156 Zoll) und Durchflußwerten (Cv-Werten) > 0,16 oder mehr (z. B. NR (Neptun Research) Modell 648T003, ausgestattet mit RC-Abfallschaltungen und Spulen von 3 Watt), welches Drücken bis ca. 500 mgHg standhält. Solenoide mit Öffnungen von 0,159 cm (1/16 Zoll) und Cv-Werten von 0,01 bis 0,03 (z. B. Modell 20-2-3 von Valcor) sind nicht völlig zufriedenstellend, und zwar wegen der hohen Viskosität der für eine Kältekonservierung verwendeten Lösungen (es ergeben sich Schwierigkeiten beim Ansaugen visköser Flüssigkeit durch S1-S3), wegen der zur Kontrolle der Totzeiten und zur Perfusion großer Organe erwünschten hohen Flüsse, wegen der Möglichkeit des Verstopfens sowie wegen der Druckentwicklung zwischen der Leitungspumpe und S8-S12. Das genaue Betätigungsmuster und die Anordnung der Solenoide auf den Schläuchen wird weiter unten genauer beschrieben.
Bei Verwendung eines (nicht gezeigten) Absperrhahns in einer der Kühlleitungen kann man, falls erwünscht, den in-line-Wärmeaustauscher umgehen. Ist die Kühlfunktion des Solenoid- Formrahmens 118 in Betrieb, wird der Abfluß vor Rückführung zum Kältebad zum Kühlsystem des Solenoid-Formrahmens geleitet. Ein Verteilerblock für den Abfluß (EDB) 114 (Fig. 1) ist mit der Ausgangsseite des Organbehälters 122 verbunden. Der EDB ist so konstruiert, daß immer eine kleine Menge des Abflusses am Boden des Blockes vorhanden ist. Dieser Abfluß oder die Restflüssigkeit wird von der Zweikanal-"Delta-R1-Pumpe" 126 abgezogen und zum Differentialrefraktometer ("Delta-R1-Meter") 130 geleitet, wo der Brechungsinex mit demjenigen des von der Refraktometerschleife L1 kommenden (mit gleicher Geschwindigkeit wie die abfliessende venöse Probe umgepumpten) arteriellen Perfusats verglichen und ein Differenzensignal gebildet. Der EDB 124 wird auch von der Rezirkulationspumpe 128 für den Abluß entleert. Mit dem EDB 124 läßt sich somit der Abluß mit oder ohne die Maßnahme rezirkulieren, mit welcher er zunächst mit Hilfe der Delt-RI- Pumpe 126 an ein Differentialrefraktometer 130 geliefert wird. Das Differentialrefraktometer 130 sendet ein Signal an den Computer, welcher eine Bestimmung der Konzentrationsunterschiede zwischen der Flüssigkeit in der Refraktometerschleife L1 und dem Organ-Abfluß in der Organschleife L2 vornimmt. Die von dieser unorthodoxen Verwendung des Differentialrefraktometers stammende nichtlineare Basislinie wird von der Software für die Durchführung des Perfusionsprogramms verwendet. Da die Flüssigkeit in der Refraktometerschleife ungefähr die Konzentration der in die Arterie des Organs einfließenden Flüssigkeit aufweist, liefert der Delta-RI-Output ein Maß für den quer durch das Organ verlaufenden Konzentrationsgradienten. Ist dieser Gradient groß (entweder in positiver oder negativer Richtung), ist das Organ von einer Gleichgewichtseinstellung noch weit entfernt. Wenn der Gradient Null ist, befindet sich das Organ, zumindest über weite Teile, im osmotischen Gleichgewicht mit dem Perfusat.
Der gesamte Abfluß aus dem Organ (zusammen mit der von der Delta-RI-Pumpe zurückgehaltenen arteriellen Flüssigkeit) wird schließlich von der Rezirkulationspumpe 128 gesammelt und an das Solenoid 58 weitergeleitet, welches regelt, ob der Abfluß zu den Behältern rezirkuliert oder als Abfall verworfen wird. Der an einen Behälter zurückzuführende Abfluß wird mit der durch die Refraktometerschleife L1 fließenden Flüssigkeit an einer T-Verbindung T2 vereinigt. Wie oben ausgeführt, wird die Rückführung zum richtigen Behälter sodann über die Betätigung der Solenoide S9 bis S12 geregelt.
Der Fluß der Rezirkulationspumpe 128 braucht ebenso wie bei der Kreislaufpumpe 102 nicht eingestellt zu werden. Er wird normalerweise auf einen Wert festgesetzt, der ausreicht, um über dem Maximalwert für die stationäre Strömung durch die Organpumpe 108 zu liegen. Da der Ausfluß der Rezirkulationspumpe über dem der Organpumpe liegt, wird kontinuierlich Luft in das zum Solenoid S8 und gewöhnlich zu den Behältern R1-R4 führende Schlauchsystem eingeführt. Vorsichtsmaßnahmen, um eine darauf zurückzuführende übermäßige Blasenbildung in den Behältern zu vermeiden, werden weiter unten besprochen.
Obwohl die Geschwindigkeit der Delta-RI-Pumpe veränderbar ist, wird sie während einer Versuchsdurchführung gewöhnlich konstant gehalten. In der gegenwärtigen Betriebsversion wird sie nicht computergesteuert, in einigen Fällen wäre eine Computersteuerung aber eine wünschenswerte Möglichkeit. In der Delta-RI-Pumpe werden sehr kleine Schlauchdurchmesser verwendet, um Verzögerungen bei der Durchgangszeit zu verringern. Diese kleinen Schlauchabmessungen sind von besonderer Besdeutung, weil die Fließgeschwindigkeit durch den Delta-RI-Kreislauf durch die geringste Fließgeschwindigkeit durch das Organ, welche sehr klein sein kann, sowie durch die begrenzte Länge der Durchflußwege in herkömmlichen Differentialrefraktometern eingeschränkt wird.
Die Rückführung des Refraktometeroutputs zur Abflußleitung des Organs liegt nahe bei der Rezirkulationspumpe für den Abfluß. Anders als eine von der Pumpe entfernte Anordnung stellt diese Anordnung einen steten Fluß durch den Differentialrefraktometer sicher, während sich bei einer distalen Anordnung, wegen eines höheren ausgangsseitigen Drucks, der Fluß durch den Differentialrefraktometer verhindern oder verändern läßt.
Die gegenwärtige Betriebsversion der erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet im gesamten System Schläuche aus Silastic® mit 0,3175 cm (1/8 Zoll) Durchmesser, was ausreicht, die erforderlichen Flüsse anzupassen, weshalb sie bevorzugt sind. Silastic® ist mit dem kalten Sterilisationsmittel Actril kompatibel, durchsichtig (für die Sichtbarmachung des Flusses von Bedeutung, um Probleme zu erkennen und auf Anzeichen mikrobiellen Wachstums zu überwachen), unempfindlich gegenüber allgemeinen Gefrierschutzmitteln, wie z. B. Dimethylsulfoxid, und genügend weich für eine leichte Handhabung. Silastic® sollte jedoch nicht in solchen Kreisläufen zur Anwendung kommen, welche mit Silicon-haltigen Kühlflüssigkeiten in Kontakt kommen, da diese Schläuche aus Silastic® anschwellen lassen und schwächen.
Der Behälter R1 ist als Gradientenmischer ausgebildet (Fig. 2). Der Gradientenmischer besteht im wesentlichen aus zwei konzentrischen Zylindern, einem Außenzylinder 200 und einem Innenzylinder 201. Eine Flüssigkeitsverbindung 205 läßt unter dem Einfluß der Schwerkraft infolge einer Volumenverminderung im Innenzylinder Flüssigkeit vom Außenzylinder 200 zum Innenzylinder 201 fließen. Die konzentrische Anordnung für die Flüssigkeitskompartimente ist äußerst raumsparend. Die Leitung 204 zum Liefern der Flüssigkeit entspricht der Leitung D1 in Fig. 1. Die gezeigte Einheit ist eine Abänderung eines käuflich erhältlichen Gradientenmischers. Die für einen erfindungsgemäßen Einsatz erforderlichen Abänderungen sind wie folgt:
1) Der in einem käuflichen Gerät normalerweise für die Regelung des Flusses vom Ausßenzylinder zum Innenzylinder verwendete Absperrhahn ist durch ein Zweiweg-(an/aus)- Solenoid-Quetschventil 202 ausgetauscht (zur Zeit das Modell 100P2WNC der Biochem. Valve Corp.). Für diese Anwendung ist ein Quetschventil gegenüber einem Kolbenventil bevorzugt, und zwar wegen des kleinen zum Bewegen der Flüssigkeit zur Verfügung stehenden Druckunterschiedes und der daraus resultierenden Notwendigkeit für einen großen Arbeitsdurchmesser für die Flüssigkeitsleitung. Es ist auch bevorzugt, weil es sich leicht vom Schlauchsystem abtrennen läßt, nämlich dann, wenn der Behälter zur Reinigung aus dem Behältnis entnommen werden soll, wobei das Solenoid zurückbleibt. Die Unterseite des Gradientenmischers wurde bei 203 abgeändert, um Platz für das Solenoid zu schaffen, damit dieses zur genauen Ausrichtung auf einem Sockel befestigt werden kann. Um ein übermäßiges Erwärmen der Behälterflüssigkeiten zu vermeiden, ist das Solenoid mit genügendem Abstand zum Behälter angeordnet.
2) Der Durchmesser für die Flüssigkeitsverbindung 205 vom Außenzylinder 200 zum Innenzylinder 201 ist vergrößert worden, damit die für eine Organkonservierung benötigten viskosen Lösungen mit geeigneter Schnelligkeit hindurchfließen können. Ein Innendurchmesser von 0,3175 bis 0,476 cm (1/8 bis 3/16 Zoll) ist hierfür geeignet.
3) Es wurde ein Deckel 206 vorgesehen. Der Deckel weist nach außen eine Auskragung 207 auf, die verhindert, daß sich der Deckel nach dem Aufsetzen auf den Zylinder seitlich verschieben kann. Der Deckel weist eingebaute Fülltrichter für den Außen- 208a und den Innenzylinder 208b sowie eine Rückführungsöffnung 209 auf.
4) Die Trichter 208a und 208b münden nach innen in die Befüllungsrohre 210a und 210b. Die inneren Füllrohre sind vorzugsweise starre Hohlstäbe, die gleich neben der Wand des Innen- und Außenzylinders angeordnet sind und in 1-2 cm Abständen von Löchern 211a bzw. 211b durchbrochen sind, die einen Durchmesser von ca. 3 mm aufweisen. Die Funktion der Befüllungsrohre besteht darin, das Auftreten von Blasen zu reduzieren, wenn die Rückführflüssigkeit auf die Flüssigkeitsoberfläche im Behälter trifft. Der Grund für die Durchbohrungen ist darin zu suchen, daß die Luft aus dem Rohr durch die Löcher entweichen und am Boden des Behälters keine Blasen bilden kann. Diese Funktionen sind für proteinhaltige Perfusate von besonderer Bedeutung, weil Proteine dazu neigen, Blasen zu stabilisieren.
5) Es wurde eine Füllstandsmarkierung vorgesehen, damit der Behälter reproduzierbar bis zu dem gleichen, vorbestimmten Volumen befüllt werden kann. Je nach den Einzelheiten der Anwendung kann die Bedienungsperson ihre eigene Füllstandsmarkierung anbringen. Die Gradientenmischer weisen Grobgraduierungen auf (waagerechte Linien sowohl auf dem Innen- als auch Außenzylinder, die ausgezogen sind, um Parallaxenfehler beim Ablesen des Flüssigkeitsspiegels im jeweiligen Zylinder zu vermeiden), die für einen Gradientenmischer von 2 Litern ungefähr 0,5 cm voneinander beabstandet sind. Diese Graduierungen sind auch deshalb von Bedeutung, damit sich geringfügige, absichtliche Abweichungen im Flüssigkeitsspiegel zwischen Innen- und Außenzylinder ausbilden können, welche nötig sind, damit sich Lösungen mit weit auseinanderliegenden unterschiedlichen Dichten, wie z. B. das gefrierschutzmittelfreie Perfusat und die Vitrifizierungslösung, nicht vorzeitig vermischen. Sie erlauben auch eine grobe quantitative Überprüfung durch die Bedienungsperson, ob sich der Gradient, wie auf dem Computerbildschirm angezeigt, aufbaut.
6) Die Kunstoffzusammensetzung käuflicher Gradientenmischer kann bei einigen Arten von Gefrierschutzmitteln Probleme bereiten, welche möglicherweise den Kunststoff angreifen. Bevorzugterweise werden daher Behälter aus durchsichtigem Material (z. B. Glas, Plexiglas und dergl.) eingesetzt, das sich mit den Stoffen des Gefrierschutzmittels verträgt, oder es werden Behälter eingesetzt, deren Oberflächen zur Verhinderung eines Angriffs silikonisiert oder anderweitig behandelt worden sind. Erfahrungsgemäß wurde gefunden, daß Acryl ein geeignetes Material darstellt.
7) Der Behälter R1 enthält einen Rührstab 212. Der Rührstab ist in einer Einfassung 213 untergebracht, die an einem frei drehbaren senkrechten Stift 214 befestigt ist, welcher sich vom Behälterdeckel bis zum Rühstab erstreckt, um zu verhindern, daß sich die Einfassung und damit auch der Rührstab seitlich bewegen. Diese Abänderung ist notwendig, damit ein Rattern verhindert wird und daher nur eine geringfügige Durchmischung erfolgt, während die Perfusionsmaschine unbeaufsichtigt ist. Die eher oben als unten erfolgte Lagerbefestigung verhindert, daß das Perfusat durch Reibung unnötigerweise erwärmt wird und vermeidet Probleme beim Spülen/Reinigen.
Auch der Behälter R3 ist als Gradientenmischer ausgebildet. Die Einzelheiten des Behälters R3 sind in Fig. 3 wiedergegeben. In der Zeichnung sind die Elemente, welche im wesentlichen die gleichen wie im Behälter R1 sind, mit dem gleichen Bezugszeichen versehen, mit der Ausnahme, daß für die erste Ziffer anstelle eine "2" eine "3" steht. Der Behälter R3 enthält eine Außenkammer 315 (R3&sub3;), eine Innenkammer 318 (R3&sub1;) und eine dritte Zwischenkammer 316 (R3&sub2;). Die Zwischenkammer 316 ist mit der Innenkammer 318 über eine von einem Solenoid 317 (SR3&sub1;) gesteuerte Flüssigkeitsleitung 320 verbunden. Die Kammer 316 steht auch mit der Außenkammer 315 über eine von einem Solenoid 319 (SR3&sub2;) gesteuerte Flüssigkeitsleitung 321 in Verbindung. Die Verwendung einer Außenkammer ist nötig, wenn die Konzentration auf Null oder nahe Null verringert wird, aus Gründen, die weiter unten mit Bezugnahme auf die Funktion der Gradientenpumpe und die Wirkungsweise des Gradientenmischers diskutiert werden. Die Notwendigkeit einer Außenkammer ist gegenüber einem größeren Flüssigkeitsvolumen in der mittleren Kammer bevorzugt, weil eine Vergrößerung des Flüssigkeitsvolumens in der mittleren Kammer bewirkt, daß das durch eine konstante Ausflußgeschwindigkeit der Flüssigkeit im Innenzylinder verursachte Konzentrationsprofil der aus dem Gradientenmischer zum Ausgang fließenden Flüssigkeit nicht-linear wird, was eine Regelung der Konzentration in Abhängigkeit von der Zeit kompliziert. Was noch wichtiger ist, ist die Tatsache, daß eine zu große Menge an Flüssigkeit in der mittleren Kammer im Vergleich zur in der Außenkammer nach der eigentlichen Entleerung der inneren und mittleren Kammern erforderlichen Flüssigkeitsmenge benötigt würde, um die Konzentration auf Null zu bringen.
Eine Automatisierung des Behälters R3 stellt einige Probleme, die aber teilweise durch den Einsatz von Software und teilweise durch die spezielle Konstruktion von R3 überwunden werden. Mit der Betätigung des Solenoids SR3&sub2; wird speziell bewirkt, daß die Flüssigkeit in der Außenkammer (R3&sub3;) zunächst in die mittlere Kammer (R3&sub2;) und von dieser Kammer dann in den Innenzylinder (R3&sub1;) fließen kann. Dies geschieht deshalb, weil der zwischen R3&sub3; und R3&sub2; auftretende Spitzendruck groß ist, wenn R3&sub1; und R3&sub2; nahezu leer sind, was der Fall ist, wenn SR3&sub2; aktiviert wird. Zu diesem Zeitpunkt ist R3&sub3; immer noch gefüllt. Dieser hohe Spitzendruck bewirkt, daß Flüssigkeit zu schnell in R3&sub1; hineinfließt, falls R3&sub3; direkt mit R3&sub1; verbunden ist, anstatt daß R3&sub2; als Puffer zwischen R3&sub3; und R3&sub1; eingesetzt wird. Durch Einstellung der Füllhöhe in R3&sub3; läßt sich der Fluß auch teilweise regeln. Aber selbst mit diesen beiden Vorsichtsmaßnahmen ist noch eine weitere Regelung des Flusses erforderlich, indem für SR3&sub2; ein geeigneter Arbeitszyklus angewendet wird. Der Fluß zu R3&sub1; sollte zunächst langsam sein und sollte mit zunehmender Annäherung der Konzentration an Null immer schneller werden, während ein passiver Fluß unter Einwirkung der Schwerkraft am Anfang immer am schnellsten und am Ende am langsamsten ist, wenn der Fluß nicht über einen zielgerichteten Arbeitszyklus derartig dosiert wird, wie er gerade an SR3&sub2; vollzogen wird.
Die restlichen Abänderungen an R3 sind die gleichen wie bei R1.
Der Behälter R4 ist ein Gradientenmischer der gleichen Bauart wie R1.
Ein wichtiges Bauteil des Flüssigkreislaufs ist die mit dem Kreislauf über die Leitung P1 verbundene Gradientenpumpe 123 (Fig. 1). Die Funktion der Gradientenpumpe besteht darin, allmähliche Konzentrationsänderungen in geeigneten Behältern innerhalb des Gehäuses zu ermöglichen. Das dies durchführende Verfahren wird weiter unten beschrieben. Die Abzweigung der Leitung P1 zur Gradientenpumpe am Punkt T3A gerade nach dem Punkt, wo sich die Refraktometerschleife L1 und die Organschleife L2 wieder vereinen, stellt eine Sondereinrichtung dar, um sicherzustellen, daß ein Teil der von der Rezirkulationspumpe 128 für den Organabfluß eingeführten Luft entfernt wird und die daher zu einer Reduzierung der Blasenbildung in der Behälterflüssigkeit beiträgt.
Eine bessere Option ist die gegenwärtig angewandte, welche darin besteht, keine Luft in die Leitung P1 hineinzulassen. Dies wird dadurch erreicht, daß P1 mit Punkt T3B verbunden wird und hat die völlige Kontrolle des zeitabhängigen Konzentrationsverlaufs zur Folge. Das Problem der Blasenbildung wird überwunden, indem die Geschwindigkeit der Rezirkulationspumpe kontinuierlich so geregelt wird, daß sie nur geringfügig über der von den vereinigten Flüssen aus der Organpumpe 108 und der Delta-R.I.-Pumpe 126 liegt, damit nur wenig Luft eintreten kann. Eine direkte Verbindung des Rezirkulationsoutputs von S8 mit P1 ohne Regelung der Geschwindigkeit von Pumpe 128 hat eine Verschlechterung des Konzentrationsverlaufs über die Zeit zur Folge und ist daher nicht zu empfehlen.
Die Bedeutung der Gradientenpumpe 123 liegt in der Entfernung eines Teils der Rezirkulationsflüssigkeit aus dem Kreislauf. Diese Entfernung von Flüssigkeit bewirkt, daß die Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit zurück zum Ursprungsbehälter geringer ist als die Fließgeschwindigkeit der von diesem Behälter kommenden Flüssigkeit zum Kreislauf. Dies bewirkt, daß der Pegel im Innenzylinder des Behälters (R1, R3 oder R4) sinkt. Diese Absenkung des Flüssigkeitspegels im Innenzylinder bewirkt seinerseits, daß die Flüssigkeit in der äußeren oder mittleren Kammer in den Innenzylinder fließt, damit die beiden Pegel etwa auf gleichem Niveau gehalten werden. Somit werden die beiden voneinander verschiedenen Konzentrationen in den beiden Zylindern im Innenzylinder miteinander vermischt, wodurch sich ein Konzentrationsgradient aufbaut, der sodann an den restlichen Kreislauf abgegeben wird. Auf diese Art und Weise bewirkt die Gradientenpumpe die erwünschten allmählichen Konzentrationsänderungen, welche das Organ und den Refraktometer erreichen. Eine ggf erforderliche Einstellung der Gradientenpumpengeschwindigkeit erfolgt über den Computer.
Das zugrundeliegende Prinzip ist das eines gewöhnlichen Lineargradientenmischers, in welchem der Teil des Kreislaufs extern zum Grandientenmischer in erster Annäherung als Extravolumen im Innenzylinder betrachtet werden kann. Die Entnahme und das Verwerfen von Flüssigkeit aus dem Innenzylinder mit konstanter Geschwindigkeit bewirken einen linearen Anstieg der molaren Konzentration mit der Zeit, trotz Gegenwart des restlichen Kreislaufs und der Rezirkulation von Flüssigkeit zurück zum Behälter. Anders als bei einem gewöhnlichen Gradientenmischer jedoch wird die Konzentration der Flüssigkeit, welche den Gradientenmischer in dem Augenblick verläßt, wo das Volumen im Gradientenmischer Null wird, nicht gleich der Konzentration im äußeren (oder mittleren) Zylinder des Gradientenmischers sein. Damit man sich daher bei Verwendung eines gewöhnlichen Zweikammer-Gradientenmischers beim Auswaschen des Gefrierschutzmittels einer Konzentration von Null annähert, muß dem Außenzylinder zusätzliche Flüssigkeit zugeführt werden, während man normal fortfährt, Flüssigkeit aus dem Innenzylinder zu verwerfen. Aus diesem Grunde wurde R3 dahingehend abgeändert, daß er drei Kammern aufweist: die zur Fortsetzung des Auswaschens der Gefrierschutzflüssigkeit benötigte Extraflüssigkeit kann vom Computer aus dieser dritten Kammer zugesetzt werden, ohne daß man dabei einer Bedienungsperson bedürfte, was die Temperaturregelung gefährden und Ungenauigkeiten mit sich bringen könnte. Während der Einführung des Gefrierschutzmittels kann andererseits die erwünschte Endkonzentration immer erreicht werden, wenn in der Außenkammer eine Konzentration verwendet wird, welche beträchtlich über der im Kreislauf erwünschten Endkonzentration für den Gradienten liegt.
Einzelheiten für das HBM-Wärmeaustauschersystem sind in den Fig. 4A-E wiedergegeben.
Das Perfusat tritt in den HBM durch eine Eingangsöffnung 403 ein, wird durch einen Zentralkanal 400 geleitet und verläßt den HBM über eine Auslaßöffnung 406. Auf beiden Seiten des zentralen Perfusatwegs befinden sich separate Kammern zur Temperaturregelung. Die beiden innersten Temperaturkontrollkammern (eine auf jeder Seite des Perfusatweges) werden zur Zirkulation von Kühlmittel verwendet, während die Außenkammern 402 jeweils einen Fließweg für die Flüssigkeit mit Raumtemperatur zur Kompensation des Kühlmittels darstellen. (Für spezielle Anwendungen, wie z. B. bei normothermer Perfusion, lassen sich diese Wege umkehren).
Die Richtung des Flusses für kalte Flüssigkeit ist wahlweise. Es wurde gefunden, daß eine passende Temperaturführung dann vorliegt, wenn alle Flüssigkeiten (Perfusate, Kühlmittel und Erwärmungsflüssigkeit), trotz des Fehlens eines Gegenstromwärmeaustauschers, in die gleiche Richtung (flußauf) fließen. Auf diese Art wird vermieden, daß sich Luft oder Kohlendioxid in den Außenkammern ansammelt.
Das Perfusat tritt am Boden durch die Einlaßöffnung 403 ein und wird zick-zack-förmig nach oben geleitet. Es fließt oben in einen kleinen Behälter mit darüberliegendem Luftraum: dies ist der Bereich der Blasenfalle 404. Das Perfusat wird sodann unter der Blasenfalle entlanggeführt und erreicht dann einen Perfusatmischbereich 405, bevor es schließlich weiter zum arteriellen Ausgang geleitet wird.
Am Boden der Einheit trennen sich die Eingänge für kalte 407 und warme 408 Flüssigkeit jeweils in zwei Kanäle auf. An den Ausgängen 410, 411 für warme bzw. kalte Flüssigkeit kommen jeweils aus zwei Kanälen gesammelte Flüssigkeiten an, so daß jeder Kanal der gleichen Art (d. h. jeder Kanal für kalte bzw. warme Flüssigkeit) jeweils von gleicher Länge ist und nominal von Anfang bis Ende die gleiche Druckdifferenz aufweist, so daß die Fließgeschwindigkeit durch jeweils gleichartige Kanäle ungefähr gleich sein sollte.
Sämtliche Wege für kalte und warme Flüssigkeit weisen hinten an der Einheit eine gewisse Länge flexibler Schläuche 412 auf. Diese Schlauchabschnitte dienen zwei Zwecken. Erstens wird durch Einführung eines Luftspalts zwischen den vier Kanälen der Wärmeaustausch zwischen ihnen möglichst klein gehalten. Dies ist besonders erwünscht, wenn sämtliche warmen und kalten Flüssigkeiten in die zum Fluß des Perfusats entgegengesetzte Richtung fließen (d. h. in orthograde Richtung) und noch kein Wärmeaustausch mit dem Perfusat stattgefunden hat. Zweitens läßt sich jeder Schlauch abklemmen. Falls zufällig ein Kanal für kalte Flüssigkeit oder einer für warme Flüssigkeit alle gelieferte kalte oder warme Flüssigkeit aufnehmen sollte, während der andere Kanal "Luft tankt", läßt sich diese Situation damit beheben, daß der Kanal, welcher den gesamten Fluß aufgenommen hat, abgeklemmt und die Luft aus dem inaktiven Kanal vertrieben wird, wodurch jeder Kanal voll funktionsfähig gemacht wird und ein gleicher Fluß aufrechterhalten wird.
Weil die Flüssigkeit, welche die Temperatur einstellt, in orthograder Betriebsart in den Wärmeaustauscherabschnitt der Einheit oben eintritt und und am Boden austritt ist es erforderlich, nach der Installierung die Pumpen für die kalte und heiße Flüssigkeit in retrograder Richtung laufen zu lassen, um alle Luft aus den Kanälen für kalte und warme Flüssigkeit auszutreiben. Dies wird erreicht, wenn die Rohre für kalte und warme Flüssigkeit, die zum Bad hin und wieder weg führen, einen Innendurchmesser von nicht mehr als 0,3175 cm (1/8 Zoll) aufweisen, da der Flüssigkeitsstrom bei diesem Durchmesser die Luft aus den Rohren eher vertreibt, als daß sie flußauf in entgegengesetzter Richtung zum Flüssigkeitsstrom fließt oder sonstwie in verschiedenen Teilen des Schlauchsystems verbleibt. Wird also die Pumpenrichtung wieder von der retrograden in die orthograde Richtung umgekehrt, ist keine Luft mehr im Rohrsystem enthalten und keine in den Wärmeaustauschkammern der Einheit eingeschlossen.
Um als Wärmeaustauscher dienen zu können, ist das Zick-Zack-Muster zusätzlich so ausgebildet, daß das Vermischen von zuvor perfundiertem dichten Perfusat erzwungen wird oder, wenn die Dichte des Perfusats eher zu- als abnimmt, das Perfusat mit der geringeren Dichte aus dem Weg für das Perfusat vertrieben wird.
Sobald das Perfusat aus dem zick-zack-förmigen Wärmeaustauscherbereich austritt, kommt es durch Eingangsbereich 418 in die Blasenfalle 404. Das Perfusat verläßt die Blasenfalle durch den Ausgangsbereich 419. Das Zickzack-Muster ist auch so gemacht, daß alle Luftblasen den Wärmeaustauscherbereich verlassen und in den Bereich der Blasenfalle gelangen können. Der Abschnitt für die Blasenfalle weist die folgenden Merkmale auf:
1. Sein Volumen ist groß genug, um die Pulswirkung der Perfusionspumpe auf ein Minimum zu beschränken, da der Schock einer jeden Auslenkung sich über ein relativ großes Luftvolumen verteilt. Dies vereinfacht die Druckregelung und -messung und kann sich auf das Organ weniger schädlich auswirken.
2. Sein Volumen ist genügend klein, um das Flüssigkeitsvolumen in der Blasenfalle möglichst klein zu halten, wodurch die Totzeit und das Totvolumen zwischen der Organpumpe und dem Organ selbst möglichst klein gehalten wird. Ein möglichst kleines Volumen ist auch insofern wünschenswert, weil dadurch ein Überschichten von verdünnterem Perfusat über dichteres Perfusat minimiert wird.
3. Es ist eine Öffnung 413 zur Druckmessung vorgesehen. Die Öffnung 413 weist keine Flüssigkeitsverbindung mit dem Perfusat auf, wodurch eine "Sackgasse" vermieden wird, in welcher sich Flüssigkeit nicht richtig vermischen könnte oder in welche Desinfektionsmittel nicht gelangte oder darin eingeschlossen werden könnte.
4. Der Deckel 414 der Blasenfalle kann zum Reinigen abgenommen werden.
5. Es ist eine Entlüftungsöffnung vorgesehen, die dazu dient, den Flüssigkeitsspiegel in der Blasenfalle so einzustellen, daß er für die Funktion als Blasenfalle das Minimum und zur Dämpfung der Druckwellen das Maximum darstellt. Die Schlauchleitungen von diesen Entlüftungen führen aus dem Behältnis heraus, wodurch man Einstellungen vornehmen kann, ohne dabei die Tür des Behältnisses öffnen zu müssen. Die gleiche Öffnung führt auch zum elektronischen Meßwandler für den Druck.
6. Es ist eine dritte Öffnung durch den Deckel der Blasenfalle vorgesehen, um Arzneimittel, Markerstoffe für die Gefäße, Fixiermittel und dergl. einzuführen.
7. Die Wände der Blasenfalle sind in der Nähe des Eingangs- 418 bzw. Ausgangspunktes 419 abgeschrägt, um einen gewissen Grad an Durchmischung des Perfusats zu erhalten, wenn es sowohl in die Blasenfalle ein- als auch aus ihr wieder austritt und um das Volumen der Schichten mit verdünntem Perfusat, welches sich dem dichteren Perfusat überschichtet hat, aufzureißen und möglichst klein zu halten.
8. Es besteht die Option, Sonden, wie z. B. eine Temperatursonde über die Öffnungen des Blasenfallendeckels einzuführen, um im Perfusat Messungen vorzunehmen, ohne dauernd den Sensor einführen zu müssen: die Öffnung besteht aus einem flexiblen Schlauch, der an einem Kunststoffnippel mit Gewinde befestigt ist. Eine Sonde kann frei eingeführt oder herausgezogen und der Schlauch mit Arterienklemmen oder ähnlichen Klemmen zum druckdichten Abdichten abgeklemmt werden. Dies vereinfacht das Entnehmen und Wiedereinsetzen des HBM für den Fall einer Reinigung, ermöglicht eine gewisse Flexibilität bei Auswahl der Sonde und eröffnet die Möglichkeit, die Sonde anderweitig für sonstige Messungen einzusetzen.
Nach Verlassen der Blasenfalle wird das Perfusat zu einem Mischbereich 450 geleitet (siehe Fig. 4D). Die Grundeinheit des aus drei Einheiten bestehenden Mischwegs besteht aus einem engen, waagerecht verlaufenden Eintrittsbereich HE, der in einen "breiten" Basalbereich BA mündet, welcher sich nach oben in einen Flußreduzierbereich FR erstreckt und in einem zum nächsten waagerechten Eintrittsbereich absteigenden D endet. Die in HE eintretende Flüssigkeit wird durch eine zu kleine Öffnung gezwungen, als daß sich eine nennenswerte Schicht von Flüssigkeit niedriger Dichte einer Flüssigkeitkeit hoher Dichte überschichten könnte, insbesondere wenn man die unmittelbar vor HE benötigte rechtwinklige Richtungsänderung berücksichtigt. In BA einfließende Flüssigkeit kann, falls sie eine geringere Dichte hat, unmittelbar in FR aufsteigen. Ist sie dichter, kann sie in die Wand W gespült werden und längs dieser Wand nach oben steigen. Wenn sie in FR angekommen ist, wird die dichtere Flüssigkeit jedoch in Richtung auf die direkt von HE aufsteigende weniger dichte Flüssigkeit beschleunigt, was Turbulenzen und eine Vermischung hervorruft. Falls BA sich mit dichtem Perfusat anfüllt, sollte die Geschwindigkeit der bei FR direkt nach oben in Richtung auf D aufsteigenden Flüssigkeit die dichte Flüssigkeit dazu veranlassen, sich mit jeder bei FR überschichteten Flüssigkeit mit niedriger Dichte zu vermischen. Desweiteren sollte der enge absteigende Weg D überschichtete Flüssigkeit zusammen mit dichterer Flüssigkeit über den Winkel hinabziehen, wobei wiederum stagnierende Schichten daran gehindert werden, fortzubestehen. In der Praxis genügen drei solcher, wie in Fig. 4B gezeigt, hintereinander angeordneter Mischeinheiten, um am Anfang nur äußerst geringfügig durchmischtes Perfusat, wie es häufig beim plötzlichen Anheben und Absenken der Gefrierschutzmittelkonzentration auftritt, zu durchmischen. Eine abschließende Funktion der Mischeinheiten besteht darin, für alle kleinen Blasen, die, aus welchen Gründen auch immer, im Blasenfallenabschnitt nicht entfernt wurden, als Falle zu dienen. (Blasen im Mischbereich werden jedoch von einer Bedienungsperson vor Beginn der Organperfusion leicht vertrieben).
Nachdem das Perfusat den Mischbereich verlassen hat, wird es abwärts zu einer Auslaßöffnung 406 geleitet, welche direkt zum Organ führt. Der Weg von der abschließenden Mischeinheit zur Öffnung 406 verläuft absichtlich in einem Winkel zur Waagerechten, um dadurch eine letzte Möglichkeit zu schaffen, Blasen daran zu hindern, das Organ zu erreichen, da eine Blase, um das Organ zu erreichen, entgegen der Neigung aufwärts zu steigen, in diesem Weg nach unten sinken müßte.
Der Mischbereich und die nachfolgenden Bereiche werden von Luft befreit, indem der an der Öffnung 406 angebrachte Auslaßschlauch bei geöffneter Entlüftung abgeklemmt wird, bis sich in der Blasenfalle ungefähr 1,27 cm (1/2 Zoll) Flüssigkeit angesammelt hat. Die Entlüftung wird sodann verschlossen, bis der Druck ca. 8 · 10³ - 16 · 10³ Pa (60-120 mmHg) erreicht hat. Schließlich wird die Flüssigkeit nochmals ungehindert durch die Öffnung 406 fließen gelassen. Die durch den Mischbereich und aus der Öffnung 406 herausströmende Flüssigkeit vertreibt alle Luft aus dem Flüssigkeitsweg von der Blasenfalle bis zur Öffnung 406. Evtl. verbleibende Luft läßt sich durch Wiederholung des Verfahrens entfernen. Nach Vertreibung der Luft wird die Entlüftung geöffnet, damit nicht benötigte Flüssigkeit in der Blasenfalle unter Einfluß der Schwerkraft aus der Blasenfalle abfließen kann, womit man eine abschließende Füllstandshöhe von ungefähr 0,3175 cm (1/8 Zoll) erreicht. Bevor die Luft aus der Leitung vertrieben ist, läßt sich eine abschließende Füllstandshöhe von 0,3175 cm (1/8 Zoll) nicht einstellen, da nicht genug Volumen vorhanden ist, um das Wiederbefüllen des Mischbereichs mit Luft aus der Blasenfalle während des Luftentleerungsvorgangs zu vermeiden.
Der HBM ist so beschaffen, daß er zum Reinigen nur selten entnommen werden muß. Das Desinfizieren und die Entfernung des Desinfektionsmittels aus dem Blasenfallenbereich erfolgen automatisch, erfordern aber danach dennoch die Aufmerksamkeit des Bedienungspersonals, um sicherzustellen, daß sämtliche ganz außen exponierten Oberflächen desinfiziert und später von Desinfektionsmittel wieder frei gewaschen sind, ohne dadurch die nach außen führenden Leitungen zu kontaminieren.
Nachdem das Perfusat durch die Öffnung 406 die HBM-Einheit verlassen hat, wird es in das Organ im Organbehälter 122 geleitet. In bevorzugter Ausführungsform umfaßt der Organbehälter eine Box mit aufklappbarem Deckel, einen Anschlag für den Deckel, einen Griff am Deckel, einen abgeschrägten Boden, speziell schräg verlaufende Füße, thermoelektrisch betätigte arterielle und venöse Eingänge, einen Einlaß für das Perfusat sowie einen im Fuß gegenüber dem Einlaß angeordneten Ausgang für den Abfluß. Die Neigung des Bodens verläuft abwärts, sowohl von rechts nach links als auch von hinten nach vorn, um sicherzustellen, daß sämtliche Flüssigkeit zu dem am Fuß befindlichen Auslaß fließt, so daß sich anderswo im Behälter nur sehr wenig Flüssigkeit ansammeln kann. Eine Nadelsonde istd direkt durch die Wand der arteriellen Leitung eingeführt. Eine zweite Sonde ist direkt in dem vom Organ kommenden Flüssigkeitsstrom angeordnet. Typischerweise unterscheiden sich die arterielle und venöse Temperatur nur um Zehntelgrade, beide sind jedoch für die Qualitätsüberwachung nützlich. Im Organbehälter kann auch eine weiche gitterförmige Auflage für das Organ, ähnlich der in der Organkassette von Walters eingesetzten, verwendet werden oder das Organ kann direkt auf dem Boden des Organbehälters aufliegen oder auf einer speziell dafür entworfenen unabhängigen und herausnehmbaren Unterlage.
Der Organbehälter 122 und die Organpumpe 108 sind möglichst nahe beieinander angeordnet, um Totzeiten und Totvolumina zwischen den beiden zu verringern, und das von der Organpumpe zum Organbehälter führende Schlauchsystem ist so gewählt, daß es aus den gleichen Gründen einen möglichst kleinen Innendurchmesser aufweist.
Der größte Teil des Perfusats geht nicht, wie oben beschrieben, durch die Organschleife L2, sondern fließt stattdessen von den Filtern zu dem in-line-analogen Refraktometer 106. Die zur Zeit erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform verwendet einen abgeänderten Refraktometer, der von der Anacon Corporation bezogen werden kann. Insbesondere werden eher Schlauchein- und -auslässe mit kleinem Durchmesser verwendet als die sehr großen standardisierten Rohranschlüsse von Anacon.
Für die Erfindungszwecke geeignete Abänderungen des Refraktometer-Meßkopfs können die folgenden Abweichungen von der normal erhältlichen Einheit von Anacon aufweisen:
1. Das Innenvolumen des Flüssigkeitsweges könnte auf ein Minimum beschränkt sein.
2. Zur Zeit ist es erforderlich, den Luftraum der Einheit mit einem langsamen Strom trockenen Stickstoffs zu durchblasen, um wegen der im Behältnis herrschenden niedrigen Temperatur und hohen Feuchtigkeit eine Kondenswasserbildung zu verhindern. In einer abgeänderten Version könnte der elektronische Bereich der Meßeinrichtung mit einem darin befindlichen Trockenmittel hermetisch abgeschlossen sein, um nicht mehr auf das Durchblasen von Stickstoff angewiesen zu sein.
Die Erfindung erlaubt dem Bedienungspersonal den Zugriff auf Behälter in jedem Stadium und auch sonst das Verfahren so zu gestalten, wie es ihm am besten dünkt. Dem Bedienungspersonal steht es sogar frei, Solenoideinstellungen nach Wunsch vorzunehmen. Nichtsdestoweniger wird in der folgenden Nominalanwendung das zur Lieferung von Flüssigkeit von und zu jedem einzelnen Behälter und Filter erforderliche Bedienungsschema beschrieben. Es wird auch das "Standardprotokoll" für die Organperfusion mit Gefrierschutzmittel und für die Reinigung des Systems beschrieben, zu deren Ausführung das System in erster Linie ausgelegt war.
Das Solenoid S1 läßt Flüssigkeit von R1 ein, wenn es ausgeschaltet ist, und von R2, wenn es eingeschaltet ist. Das Solenoid S2 steht für R3 offen, wenn es nicht mit Strom beaufschlagt ist, und für R4, wenn es unter Strom steht. Der Ausfluß von S1 und S2 geht nach S3, welches Flüssigkeit von S1 (d. h. von R1 oder R2) aufnimmt, wenn es im Ruhezustand ist, und Flüssigkeit von S2 (d. h. von R3 oder R4) aufnimmt, wenn es aktiviert ist. Der gemeinsame (immer offene) Ausgang von S3 führt zur Kreislaufpumpe 102, welche sodann dem vom Solenoid ausgewählten Behälter Flüssigkeit entnimmt.
Sollen unterschiedliche Filter enthalten sein, dann wird der Ausfluß von der Kreislaufpumpe 102 zur (immer offenen) gemeinsamen Öffnung von S4 geleitet. Wenn S4 nicht unter Strom steht, fließt sein Output zum Filter F1. Der Rückfluß von Filter F1 wird zur normalerweise offenen Eingangsöffnung von S5 geführt und verläßt dieses durch den gemeinsamen Ausgang zur Refraktometerschleife L1 und zur Organschleife L2. Steht andererseits S4 unter Strom, wird der Ausfluß zur gemeinsamen Eingangsöffnung von S6 geleitet. Wenn S6 im Ruhezustand ist, wird sein Ausfluß zu Filter F2 geleitet und der Rückfluß von Filter F2 fließt durch den normalerweise offenen Eingang von S7 in dieses hinein. Der Ausfluß von S7 wandert zum normalerweise geschlossenen Eingang von S5, welches zur Aufnahme dieses Ausflusses unter Strom gesetzt werden muß. Ist die Flüssigkeit erst einmal in S5 hineingeflossen, verläßt sie den gemeinsamen Ausgang von S5 in Richtung auf die Refraktometerschleife und die Organschleife. Sind schließlich S4 und auch S6 mit Strom beaufschlagt, wird die Flüssigkeit durch beide Ventile geleitet und erreicht den Filter F3. Der Rückfluß von Filter F3 erfolgt über die unter Strom stehenden Solenoide S7 und S5 und geht wie oben zu den beiden Schleifen L1 und L2. Wie bereits weiter oben beschrieben ist der Einsatz der Filter F2 und F3 und daher auch der Solenoide S4, S5, S6 und S7 wahlweise und ist in erster Linie dann angezeigt, wenn sehr plötzliche Änderungen von einer Lösung zur anderen erforderlich werden, oder wenn insbesondere schwere, teilchenförmige Verunreinigungen entfernt werden müssen.
Der Ausfluß aus dem Organ fließt schließlich zu S8 zurück. Bei aktiviertem S8 wird die Flüssigkeit verworfen. Bei nicht aktiviertem S8 wird die von S8 kommende Flüssigkeit mit Flüssigkeit von der Refraktometerschleife vereinigt und zu einem gewünschten Behälter zurückgeleitet.
Die durch die Refraktometerschleife fließende Flüssigkeit fließt daraufhin zu den Solenoiden S9, S10, S11 und S12 und sodann zur Abfallflüssigkeit, falls keines dieser Solenoide unter Strom steht. Eine Beaufschlagung von S9 mit Strom lenkt den Fluß zur Rezirkulationsleitung mit R1. Eine Aktivierung von S10 (ohne Aktivierung von S9) lenkt den Fluß zu R2. Auf ähnliche Weise bewirkt eine selektive Aktivierung von S11 bzw. S12 eine Rezirkulation der Flüssigkeit zu R3 bzw. R4.
Es gibt zwei Hauptverfahren für die solenoidbetätigte Flüssigkeitsregulierung, eines für die eigentlichen Perfusionen und eines für die Reinigung und das Priming des Systems. Typischerweise erfolgt der Perfusionsvorgang in der Reihenfolge von R1 zu R4, während beim Priming in umgekehrter Reihenfolge verfahren werden muß, um die Flüssigkeitsaufnahme und die Flüssigkeits-Rezirkulationsleitungen für die Behälter R2-R4 (sowie wahlweise die Filter F2 und F3 mit den daran angeschlossenen Leitungen) zu befüllen, während am Ende des Priming- (oder Reinigungs-) Verfahrens der Kreislauf mit (typischerweise) von R1 (oder C1) stammender Flüssigkeit gefüllt gelassen wird. Die typische Reihenfolge der für das Priming (oder Reinigen) erforderlichen Aktivierung der Solenoide wird im Folgenden beschrieben.
Ist nur F1 (und nicht F2) vorhanden, dann kann das Priming (und Reinigen) in beliebiger Reihenfolge der Behälter erfolgen, vorausgesetzt, daß im Falle des Priming der letzte Behälter dem für die nachfolgende Perfusion verwendeten ersten Behälter entspricht.

ABFOLGE DER SOLENOIDEINSTELLUNGEN BEIM STANDARDISIERTEN REINIGEN/PRIMING

(Benutzungsanweisungen: Entfernung des Perfusats mit sterilfiltriertem Wasser am Ende des Versuchs; Ersatz des Reinigungswassers durch Sterilisierungslösung zwischen den Perfusionen; Entfernung des Desinfektionsmittels mit sterilfiltriertem destilliertem Wasser; Entfernung des Wassers mit Luft; Entfernung der Luft mit Behälterflüssigkeit, d. h. Priming des Systems).
* Erfolgt die obige Abfolge mit Behälterflüssigkeit, sind S0 und S00 ausgeschaltet. S0 und S00 sind auch ausgeschaltet, wenn die obige Abfolge mit Wasser durchgeführt wird und die Reinigungsbecken C1-C4 sind mit den Aufnahmeleitungen U1-U4 verbunden. Falls die obige Abfolge mit Desinfektionsmittel durchgeführt, ist S0 ausgeschaltet und S00 eingeschaltet. Wird die Abfolge mit Luft durchgeführt, ist S0 eingeschaltet und S00 ausgeschaltet.
** S13 (und wahlweise S14 und S15), das (die) Solenoid(e) zur Entlüftung des (der) Filter(s), ist für einen Teil dieses Schrittes eingeschaltet und den Rest dieses Schrittes ausgeschaltet: es ist gerade genügend lange eingeschaltet, um die Luft aus der Leitung zu vertreiben (gewöhnlich 60 sec in Schritt 1 und 30 sec für jeden der folgenden, mit** gekennzeichneten Schritte). Falls keine Filter im System enthalten sind, läßt sich programmieren, daß dies nicht geschieht.
*** dieser Schritt entfällt beim Priming des Systems.
Anmerkung: Das Wasserkontroll-Solenoid S16 ist eingeschaltet (Abfallschlauchleitung geöffnet zur Abgabe von Flüssigkeit zum Abfall) bei den Schritten 2, 4, 6, 8 und 9 und ausgeschaltet bei allen anderen Schritten.
Das Standardverfahren zur Betätigung der Solenoide zur Entnahme von Flüssigkeit aus den Behältern R1-R4 und zur Erstellung eines Gradienten für eine normale Perfusion wird wie im Folgenden beschrieben durchgeführt (unter der Annahme, daß (1) die wahlweisen Filter F2 und F3 eingesetzt sind, (2) die Solenoide zur Regelung des Gradienten auf einfache und typische Art und Weise eingesetzt werden und (3) als R2 ein Gradientenmischer verwendet wird). Die Maßnahme, einen geschlossenen Strömungsweg nach Umschaltung von einem Behälter auf einen anderen zu schaffen erfolgt deshalb, damit vermieden wird, daß eine Lösung mit unerwünschter Zusammensetzung zum neuen Behälter zurückfließen kann, bevor dessen Inhalt die vorherige Lösung aus dem Strömungsweg vertrieben hat. Falls es beim Rückfluß der vorherigen Lösung keine Probleme gibt, kann die Vorsichtsmaßnahme einer verzögerten Rückströmung entfallen. ABFOLGE DER SOLENOIDEINSTELLUNGEN FÜR STANDARDISIERTE PERFUSION
* Bei normalen Perfusionen sind die Selonoide S0, S00 und S13-S16 nie aktiviert.
** Dieser Schritt verhindert, daß Flüssigkeit aus dem vorherigen Behälter, die anfangs immer in der Leitung zwischen dem neuen Behälter und dem zuvor mit Flüssigkeit aus dem neuen Behälter äquilibrierten Filter vorkommt, den zuvor äquilibrierten (neuen) Filter kontaminiert.
*** Wie in der Beschreibung angegeben, muß auf die Aktivierung von SR32 am Anfang immer ein Arbeitszyklus folgen, der damit endet, daß SR32 bis zum Einsatz von R3 ständig aktiviert bleibt. Je nach den Anforderung des Arbeitszyklus wird darin zwischen den Solenoiden S12 und S13 hin-und-her-geschaltet.
Die Anzahl für die Behälter könnte kleiner oder größer sein als hier angegeben mit entsprechender Änderung für die Solenoid-Nummer. Desweiteren braucht die Anzahl der Lagen R1-R4 nicht der obigen Beschreibung zu entsprechen. Die Grenzen könnten durch mindestens einen Behälter und vielleicht höchstens acht Behälter angegeben sein, wobei jeder Behälter ein bis vier Kammern aufweisen könnte. Die Obergrenzen ergeben sich zum Teil aus den Abhängigkeiten vom Volumen und der Verdrängung und zum Teil aus der Schwierigkeit, ein Verfahren abzubilden, das so komplex ist, daß es zu seiner Steuerung einer größeren Anzahl von Behältern bedarf.
Eine weitere Abänderung würde darin bestehen, Behälter mit unterschiedlichem Fassungsvermögen an unterschiedlichen Positionen zu verwenden (anstelle der hier bevorzugten Ausführungsform könnte z. B. ein Zweiliterbehälter, dann ein Einliterbehälter, dann ein Dreiliterbehälter, dann ein Einliterbehälter usw. vorliegen).
Im Prinzip ließe sich der Verzicht auf einzelne Behälter zugunsten eines Mehrkammerbehälters vorstellen, welcher z. B. aus 4 bis 20 konzentrischen Zylindern besteht, von denen jeder von Solenoiden oder sogar von extern zum temperaturüberwachten Bereich angebrachten manuell zu bedienenden Hebeln aktiviert wird und alle von einem einzelnen zentralen Rührtisch aus gerührt werden. Plötzliche oder schrittweise Konzentrationsänderungen ließen sich dann noch durchführen, falls die schrittweise Änderung nicht über den gerührten Zentralbereich erfolgte. Auch die relativen Positionen der Behälter zueinander könnten sich ändern.
Der Sensor für die arterielle Konzentration könnte eher proximal als distal zum Ursprung der Organschleife im Strömungskreis angebracht sein, sollte jedoch nicht proximal zu den Filtern angeordnet sein.
Als Warnvorrichtung könnte ein Drucksensor zur Messung des sich bei den Filtern auf Seiten der Kreislaufpumpe aufbauenden Druckes enthalten sein.

Beschreibung des Verfahrens

Das vollständige Verfahren zur Kältekonservierung bei Verwendung der oben beschriebenen Apparatur umfaßt vier Abschnitte. Der erste Abschnitt besteht in einer Vorbehandlung des Organs vor seiner Entnahme. Der zweite Abschnitt bersteht in der Auswahl der vor Kälteschaden schützenden Mittel. Der dritte Abschnitt besteht im aktuellen Protokoll zur Einführung und Entfernung des Gefrierschutzmittels. Der letzte Abschnitt schließlich besteht in einer Behandlung von Organ und Empfänger nach der Transplantation.

Abschnitt 1: Organvorbehandlung mit vor Kälteschaden schützenden Mitteln in-vivo und Bergung des Organs

Der Spender wird auf normale Weise vorbehandelt, mit Ausnahme der Infusion mit Iloprost, welches ein relativ langlebiges Analogon des PGI2 darstellt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden heraus, daß Iloprost entweder nach intravenöser Injektion in den systemischen Kreislauf oder nach direkter Verabreichung in die Arterie (oder Pfortader) bestimmter in Frage kommender Organe die Toxizität von nachher anzutreffendem Gefrierschutzmittel zu blockieren vermag. Für beide Verabreichungswege scheint die Dosis der Wahl für Ilosprost 25 ug/kg zu sein, obwohl zur Zeit die direkte intraarterielle Infusion bevorzugt ist, damit die Exposition des Organs gegenüber dem Wirkstoff möglichst groß ist, während die durch Iloprost hervorgerufene systemische Hypotonie möglichst klein gehalten wird. 15 ug/kg sind ebenfalls wirksam, scheinen aber weniger wirksam zu sein als 25 ug/kg. Je nach Art, Infusionsgeschwindigkeit, Operationsdauer usw. liegen für diese Anmeldung die verträglichen Grenzen für die Iloprostkonzentration bei 5 bis 75 ug/kg. Iloprost wird über einen Zeitraum von 20 min infundiert; bei verstorbenen Organspendern liegen die verträglichen Grenzen für die Infusionsdauer bei 1-60 min. Im letzteren Fall würde z. B. eine vertretbare Abänderung darin bestehen, Iloprost kurzzeitig zu infundieren, um das Organ vor warmer Ischämie während der Organentnahme zu schützen, um sodann die kurze Exposition auszugleichen, indem mit Iloprost-haltiger Lösung über einen genügenden Zeitraum (5-40 min) bei höheren oder kalten Temperaturen perfundiert wird. Die zweite Variation dient dazu, Iloprost bei relativ niedriger Konzentration über einen relativ langen Zeitraum (12-60 min) zu infundieren, um den hypotonen Zustand möglichst klein zu halten; Infusionen bei Spendern über einen längeren Zeitraum als 60 min sind unpraktisch.
Nach Vorbehandlung mit Iloprost in-vivo werden die betroffenen Organe in situ mit Euro- Collins-Lösung, UW-Lösung oder einer vergleichbar wirksamen Lösung entweder gleichzeitig oder gestaffelt durchspült, damit sich alle Organe schnell stabilisieren und dadurch Konflikte bei der Organentnahme vermieden werden. (Sollten normotherme Konservierungstechniken die hypotherme Konservierung für Herzen verdrängen, kann das Herz eher mit warmer als mit kalter Lösung durchspült werden). Die Spüllösung(en) sollte(n) anfangs Iloprost (am besten 1 ug/kg in verträglichen Grenzen von 0-10 ug/ml), Antikoagulantien (z. B. Heparin, in der vorliegenden Anmeldung 10000 Einheiten/Liter, wobei vertretbare Variationen zwischen 100-20000 Einheiten/Liter liegen), Vasodilatatoren (z. B. Papaverin, am besten 40-90 mg/l, vertretbare Grenzen 0-80 mg/l) sowie weitere erwünschte Mittel enthalten, es sollte jedoch eine zweite Spüllösung eingesetzt werden, um alle diese Stoffe wieder auszuspülen sobald das Kühlen und das Auswaschen des Blutes abgeschlossen sind. Das entnommene Organ (mit Ausnahme von Organen, deren Erhalt am besten mittels normothermer Perfusion erfolgt), sollten in eine in einem Eisbad gehaltene Spüllösung überführt und zu einer Perfusionsmaschine transportiert werden, die zum Einbringen und Entfernen von Gefrierschutzmitteln in der oben beschriebenen Weise geeignet ist.

Abschnitt 2: Gefrierschutzmittel: Formulierungen für die Vitrifizierungslösungen VS4, VS41A, VS5 und VS51A

Alle Versuche wurden unter Verwendung der als VS4 oder VS41A bekannten Lösungen durchgeführt. VS4 setzt sich aus Dimethylsulfoxid (D), Formamid (F) und 1,2-Propandiol (P) derart zusammen, daß das Molverhältnis D zu F 1 : 1 beträgt, die Gesamtmasse D + F + P pro Liter 490 g und die gesamte Masse von P pro Liter 150 g sind. Somit ergeben sich pro Liter D + F = 340 g, F = 124,33 g und D = 215,67 g. Auf Grundlage der weiter unten beschriebenen Ergebnisse ist diese Mischung von Gefrierschutzstoffen bevorzugt. Vertretbare Änderungen der Verhältnisse von D, F und P sind: das Gewichtsverhältnis D : F kann so niedrig wie 1,4 und so hoch wie 3,5 sein; für das erstere sollte das Verhältnis von P : (D + F) auf 18,34 angehoben und/oder die Gesamtkonzentration unter Zugabe von zusätzlichem P auf 50-51% w/v erhöht werden.
Bei langsamen Kühlgeschwindigkeiten (5-10ºC/min) vitrifiziert VS4 bei einem angelegten hydrostatischen Druck von 1000 atm, jedoch nicht bei normalem Umgebungsdruck. Für Umgebungsdrucke ist die als VS41A bekannte Formulierung erforderlich ("1A" steht für 1 Atmosphäre). V41A erhält man mittels Multiplikation aller sich zu VS4 zusammensetzenden Massen mit 55/49: somit beträgt die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe in VS41A 550 Gramm/Liter gegenüber 490 Gramm/Liter für VS4.
Infolge der herausragenden Fähigkeit des Formamids, in Nierengewebe einzudringen, der Fähigkeit des Dimethylsulfoxids, die Toxizität des Formamids zu hemmen, dem ausgewogenen Gleichgewicht zwischen den drei Bestandteilen (Maximierung der Neigung zur Vitrifizierung bei gleichzeitiger Minimierung von sowohl Toxizität als auch der Konzentration der gelösten Stoffe), dem Fehlen eines Kolloids (typische Kolloidkonzentrationen von ca. 4-7% w/v erhöhen die Viskosität unannehmbar), der außerordentlichen langsam Geschwindigkeit für die Devitrifizierung dieser Lösungen bei geeigneten Drücken (1000 atm bzw. 1 atm) und der guten Stabilität von VS41A bei -135ºC während mindestens 6 Monaten Lagerungszeit, scheinen VS4 und VS41A besonders verträglich zu sein.
Die zur Organperfusion eingesetzten Gefrierschutzmittel müssen, je nach der Toleranz des Organs für hohe Drücke und hohe Konzentrationen an Gefrierschutzmittel, zwischen die von VS4 und VS41A repräsentierten Grenzen eingestellt werden, um zwischen dem Druck und der zur Aufrechterhaltung der Vitrifizierbarkeit erforderlichen Konzentration einen optimalen Kompromiß zu erzielen. Beispielsweise sollte eine Organ, das keine 1000 atm, dafür aber 500 atm aushält, mit einer zwischen VS4 und VS41A liegenden Lösung perfundiert werden (d. h. D + F + P insgesamt 520 Gramm/Liter), wobei die relativen Verhältnisse von D, F und P unverändert bleiben. Sehr große Organe, für die bei Umgebungsdruck äußerst langsame Abkühlgeschwindigkeiten nötig sind, sollten mit Konzentrationen über 550 Gramm/Liter bis zu einem Maximum von ca. 660 Gramm/Liter perfundiert werden, um bei diesen sehr langsamen Abkühlgeschwindigkeiten bei Umgebungsdruck die Vitrifizierbarkeit sicherzustellen. Bei höheren Drücken werden mit abnehmender Kühlgeschwindigkeit ähnliche Proportionszuwächse für die Konzentration der gelösten Stoffe erforderlich.
Neuere Versuche (siehe Ergebnisse weiter unten) mit Nierenschnitten zeigen, daß eine mit VS4 identische Formulierung, aber mit 2,3-Butandiol anstelle von 1,2-Propandiol, wobei 2,3- Butandiol aus einer Mischung der dextro- und levo-Rotationsformen mit geringfügig vorkommender meso-Form (< 5% w/w) besteht, eine der mit VS4 erzielten Lebensfähigkeit identische Lebensfähgkeit aufweist. Diese als VS5 bekannte Formulierung kann eine größere Stabilität als VS4 aufweisen. Auf ähnliche Weise ist VS51A wie das oben beschriebene VS41A zusammengesetzt, mit der Ausnahme, daß 1,2-Propandiol durch Dextrose und linksdrehende Isomere des 2,3-Butandiols (< 5% w/w meso-Form) ersetzt ist. Wie in der obigen Beschreibung von VS4 und VS41A können auch zwischen VS5 und VS51A liegende Variationen zum Einsatz kommen.
Alle Gefrierschutzmittellösungen müssen neben den Gefrieschutzstoffen selbst langsam penetrierende gelöste Stoffe aufweisen, welche die "Carrier-" oder "Vehikel-"Lösung für die Gefrierschutzstoffe enthalten. Typische Beispiele stellen die UW-Lösung, die Euro-Collins- Lösung sowie die Nieren-Konservierungslösung 2 (RPS-2) dar. Man glaubt, daß die Euro- Collins-Lösung und möglicherweise auch die RPS- Lösung als Carrier-Lösungen für Nieren UW überlegen sind, während das Gegenteil wahrscheinlich für Lebern zutrifft und bei Herzen am besten keiner dieser besonderen Carrier zum Einsatz kommt. Am besten erwies sich der Einsatz von Euro Collins als Carrier-Lösung der Wahl.

Abschnitt 3: Protokoll zur Einführung und Entfernung des Gefrierschutzmittels.

Ein typisches zur Zeit im Labor der Erfinder verwendetes Protokoll zur Einführung und Entfernung von Gefrierschutzmittel, mit welchem nach dem Auswaschen des Gefrierschutzmittels, der Transplatation und dem funktionellen und histologischen Weiterverfolgen über einen längeren Zeitraum eine zuverlässige Überlebensrate mit hoher Qualität erzielt werden konnte, wird in Fig. 5 wiedergegeben und genauer in den Flußschemata der Fig. 6A-E beschrieben.
Perfusionsdruck. Das Organ wird bei einem Druck perfundiert, der ausreicht, um über dem kritischen Schließdruck zu liegen aber andererseits niedrig genug ist, eine unnötige Beschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden. Der Perfusionsdruck liegt am besten bei 40 mm Hg, ohne nennenswerte Pulsation. Ein erwünschter Bereich für vertretbare Drücke wurde für unterschiedliche Arten, einschließlich Mensch, zu 20-70 mm Hg gefunden.
Beginn der Perfusion. Am besten erfolgt protokollgemäß eine Perfusion über einen Zeitraum von 15 min. um Basislinienwerte für den Gefäßwiderstand sowie Kalibrierungen (für den Druck und Brechungsindex) zu erstellen und um zu gewährleisten, daß das Blut vollständig ausgewaschen wird sowie zur thermischen Gleichgewichtseinstellung des Organs. Klinisch gesehen ist die Perfusionszeit zu Beginn willkürlich und kann eingestellt werden (von 2 Minuten bis zu 1 bis 2 tagen oder mehr), um den Erfordernissen für die Organentnahme und den Transport nachzukommen. Im Labor der Erfinder wird als Perfusat in diesem Stadium eine Euro-Collins-Lösung verwendet. Je nach den Anforderungen des Krankenhauses oder des Organentnahmeteams könnte dieses anfängliche Perfusat auch eine UW-Lösung oder eine andere klinisch eingestellte stabilisierende Lösung sein.
Anfangstemperatur. Die für die Organentnahme und den Transport benötigte Anfangstemperatur braucht nicht mit der unmittelbar vor Einführung des Kälteschutzmittels eingestellten Temperatur identisch zu sein. Beispielsweise lassen sich die meisten Organe verschiffen, wenn sie bei 0ºC von zerstoßenem Eis umgeben sind, während andere Organe verschifft werden, indem sie bei normothermer Temperatur (37ºC) perfundiert werden. Sind die Organe jedoch für die Verabreichung des Gefrierschutzmittels bereit, wird eine vorher ausgewählte, standardisierte Perfusionstemperatur eingestellt. Die Perfusionstemperatur zu Beginn ist am besten 3,5 bis 4ºC mit vertretbaren Grenzen von 0-15ºC. Die Erfinder glauben, daß Organe, für welche eine normotherme Perfusion für den besten Langzeiterhalt erforderlich ist, nichtsdestoweniger bis in denselben Temperaturbereich abgekühlt und ähnlich den hypothermisch konservierten Organen behandelt werden können, ohne während der für dieses Verfahren benötigten relativ kurzen Zeiten Schaden zu nehmen.
Erste Anhebung der Konzentration des Gefrierschutzmittels. Nach der Basislinienperfusion zu Beginn wird die Gefrierschutzmittelkonzentration mit konstanter Geschwindigkeit bis zur Erstellung eines ersten Konzentrationsplateaus erhöht. Bei Verwendung einer Gefrierschutzmittelmischung vom VS4-Typ werden die Anteile der verschiedenen Gefrierschutzstoffe in der Mischung konstant gehalten, während man die Gesamtkonzentration sich verändern läßt. Die Geschwindigkeit für die Erhöhung der Gesamtkonzentration für Lösungen des VS4-Typs wird am besten auf 51 mM/min (3,06 M/h) festgesetzt, wobei vertretbare Änderung im Bereich von 35-75 mM/min liegen. Diese Geschwindigkeiten liegen beträchtlich über den in bekannten Verfahren für Glycerin und Propylenglykol benutzten Geschwindigkeiten von 30 mM/min. von denen man glaubt, daß sie für in Vitrifizierungslösungen gelöste Stoffe unnötiger- und unerwünschterweise langsam sind. Eine lineare Anhebung der Konzentration führt zu einer Gleigewichtseinstellung ohne unnötig große osmotische Belastungen.
Erstes Konzentrationsplateau. Das erste Plateau wird am besten zu 25% w/v Gesamtkonzentration an Gefrierschutzmittel (250 Gramm/Liter oder ca. 3,8 molar) festgesetzt, wobei vertretbare Variationen im Bereich von 20-32% w/v oder w/w liegen. Das erste Plateau sollte auf ein Niveau festgesetzt werden, das nahe der Hälfte der Konzentration für die abschließende Vitrifizierungskonzentration liegt: niedrigere Niveaus für das erste Plateau erhöhen die osmotische Belastung bei der nachfolgenden Perfusion mit Vitrifizierungslösung, während wesentlich höhere Niveaus für das erste Plateau wegen der zu langen Zeiträume, in denen das Organ dem konzentrierten Gefrierschutzmittel ausgesetzt wird, eine Erhöhung der Toxizität bewirken. Die Dauer für das erste Plateau wird am besten auf 10 min. festgesetzt, mit vertretbaren Variationen zwischen 5 bis 30 min. je nach Perfusionsdruck (und damit der Fließgeschwindigkeit durch das Organ), dem Gefäßwiderstand und der Organpermeabilität für das Gefrierschutzmittel. Die Dauer sollte lange genug sein, damit sich im Organ ein osmotisches Gleichgewicht mit dem arteriellen Perfusat einstellen kann, wie dies durch einen arteriovenösen Konzentrationsunterschied von Null (oder praktisch Null) angezeigt wird, damit eine unnötige osmotische Belastung beim nachfolgenden Sprung auf die Konzentration der Vitrifizierungslösung möglichst klein gehalten wird.
Temperaturerniedrigung während der ersten Konzentrationserhöhung. Gleichzeitig mit der Konzentrationserhöhung wird die Temperatur erniedrigt, um das Organ vor der chemischen Toxizität des Gefrierschutzmittels zu schützen. Am besten wird mit der Temperaturerniedrigung dann begonnen, wenn die arterielle Konzentration des Gefrierschutzmittels bei 1,3 Mol angekommen ist; vertretbare Grenzen sind 0,5 molar bis 3,5 molar. Die Erniedrigung der Temperatur wird beendet, wenn die arterielle Konzentration das erste Konzentrationsplateau erreicht hat (wie oben beschrieben am besten bei 25% (3,8 M) und zwischen 20.32%, oder in den Grenzen von ca. 3-4,9 M für die gelösten Stoffe). Die Konzentrationsänderung während des Abkühlvorgangs beträgt somit am besten 2,5 M und kann zwischen ca. 1 M und 4,4 M variieren.
Wie oben beschrieben sollte die Vorkühltemperatur in den Grenzen von 0-15ºC liegen. Die Temperatur nach dem Abkühlen sollte in den Bereich von -13ºC bis +5ºC fallen. Das Abkühlen sollte nicht bis unter den Gefrierpunkt des Organs fortgesetzt werden. Gegenwärtig sollte die Endtemperatur am besten bei -1,5ºC liegen, was einen Abfall um 5ºC gegenüber der Ausgangstemperatur und eine Abkühlgeschwindigkeit von ca. 0,25ºC/min bedeutet. Die innerhalb der obigen Grenzen mögliche maximale Abkühlgeschwindigkeit ist 2,1ºC/min, welche langsam genug sein sollte, um einen möglichen thermischen Schock für das Organ zu vermeiden. Der kleinst mögliche Temperaturabfall während des Abkühlens ist 2ºC, der größt mögliche Temperaturabfall 28ºC.
Perfusion mit der Vitrifizierungslösung, zweites Konzentrationsplateau. Eine schrittweise Änderung der Konzentration vom erstsen Konzentrationsplateau zur Vitrifizierungslösung ist erforderlich, um die Zeit zu überwachen, welche das Organ dem höher konzentrierten Gefrierschutzmittel ausgesetzt ist. Wie oben beschrieben beträgt die beste Konzentration für die Vitrifizierungslösung 490-550 Gramm/Liter oder ca. 7,5-8,4 M für Lösungen des VS4- Typs (welche sich bis zu 600 Gramm/Liter für schwer vitrifizierbare Materialien, wie z. B. die Leber, belaufen kann). Für Lösungen des VS5-Typs können die Endkonzentrationen geringfügig auf ca. 480-540 Gramm/Liter gesenkt werden. Für Vitrifizierungslösungen, die nicht vom VS4-Typ sind, liegen die Grenzen für die Konzentration im vorliegenden Verfahren bei 40-60% w/v Gefrierschutzmittel. Am besten wird die Konzentration 20 Minuten lang konstant bei der Vitrifizierungskonzentration gehalten, mit vertretbarer Variation zwischen 10-50 Minuten. Zur Entfernung von nichtvitrifizierbarem Wasser aus den Zellen und den Zellzwischenräumen muß die Konzentration genügend lange konstant gehalten werden, d. h. lange genug für das Organ, um möglichst nahe an das osmotische Gleichgewicht mit dem Perfusat heranzukommen.
Temperatur während der Perfusion mit Vitrifitierungslösung. Während die Konzentration auf das Niveau für die Vitrifizierung angehoben wird, wird die Temperatur am besten bei 0 bis -5ºC konstant gehalten (zur Zeit liegt die Temperatur der Wahl bei -1,5ºC).
Temperaturkonstanz ist eher als eine erneute Absenkung der Temperatur erwünscht, um die Viskosität zu regeln: da die Viskosität mit abnehmender Temperatur zunimmt, muß auch der effektive Widerstand des Organs zunehmen, was seinerseits die Geschwindigkeiten für die Einstellung des osmotischen Gleichgewichts für das Organ herabsetzt, was wiederum bedingt, daß das Organ dem Gefrierschutzmittel über längere Zeiträume ausgesetzt wird, was dann möglicherweise am Gefäßendothel größeren Schaden verursacht. Niedrigere Temperaturen erhöhen auch die Wahrscheinlichkeit für einen "Kühlschaden". Eine vertretbare Variation würde jedoch darin bestehen, die Temperatur dann weiter abzusenken, wenn der Konzentrationssprung zur Vitrifizierungslösung beginnt oder kurz danach, insbesondere bei Organen, die nahe an den oberen Grenzwerten für die Temperatur bis zu diesem Punkt und besonders bei Konzentrationen über 49% w/v perfundiert werden, sowie bei Organen, die besonders empfindlich gegenüber der Toxizität des Gefrierschutzmittels sind und zur Unterdrückung dieser Toxizität niedrigere Temperaturen erfordern. Obwohl VS41A und VS51A Gefrierpunkte nahe -40ºC aufweisen, sind so niedrige Perfusionstemperaturen nicht Gegenstand des vorliegenden Verfahrens, da so niedrige Temperaturen unnötig, hinderlich und höchstwahrscheinlich kontraproduktiv erscheinen. Während der Perfusion mit Vitrifizierungslösung wird daher die verfahrensgemäße Untergrenze für die Temperatur auf nur -20ºC festgesetzt und als Obergrenze werden +5ºC in Reserve gehalten, was ein beschränktes zusätzliche Abkühlen während der Perfusion mit Vitrifizierungslösung erlaubt.
Der nächste Schritt in jedem praktischen Vitrifizierungsverfahren besteht darin, das Organ aus der Perfusionsmaschine zu entnehmen und es mit oder ohne vorherige Druckbeaufschlagung auf kryogene Temperaturen abzukühlen. Nach Erwärmen des Organs muß es jedoch wieder in die Perfusionsmaschine zurückgesetzt werden, um mit dem in Fig. 5 gezeigten Typ für ein Perfusionsprotokoll am Anfang des dritten Konzentrationsplateaus fortzufahren.
Erste Konzentrationserniedrigung: Drittes Konzentrationsplateau. Für die Konzentration zur Einstellung des dritten Konzentrationsplateaus werden am besten 30% w/v (300 Gramm/Liter; 4,6 M) gemäß VS4 gelöste Stoffe gewählt (D, F und P in den gewöhnlichen Anteilen), wobei vertretbare Konzentrationen zwischen 20-35% (w/v oder w/w) an Gefrierschutzmittel liegen (grob geschätzt 3 bis 3,5 M). Die Konzentration in diesem Stadium sollte nicht unter 40% (2/5) der Konzentration für die Vitrifizierungslösung liegen, um einen osmotischen Schaden zu vermeidern; die Konzentration am dritten Plateau beträgt mehr als 3/5 der Konzentration des zweiten Plateaus.
Im Perfusat für das dritte Plateau (obwohl nicht in Fig. 5 gezeigt) ist ein "osmotisches Puffermittel" enthalten (nicht penetrierende, extrazelluläre, niedermolekulare gelöste Stoffe, die der osmotischen Wirkung von größeren intrazellulären/extrazellulären Konzentrationen an Gefrierschutzmittel während des Verfahrens, wo das Gefrierschutzmittel ausfließt, entgegenwirken). Bevorzugte osmotische Puffermittel sind Raffinose oder Sucrose. Obwohl Mannit in praktisch allen Versuchen der Erfinder erfolgreich eingesetzt worden war, wurde gefunden, daß Mannit in Nierenzellen eindringt, wo es zerstörerisch wirken kann. Mannit und selbst Sucrose sind für die Leber ungeeignet, weil deren Zellen für beide Stoffe weitaus permeabler sind, als bei den meisten Zellen von Säugerorganen.
Die Konzentration für den osmotischen Puffer am bevorzugten 30%-Plateau für die Auswaschlösung ist 250 mM. In Protokollvarianten mit niedrigeren Konzentrationen für das dritte Plateau (z. B. 20% w/v Gefrierschutzmittel) wird mehr osmotischer Puffer benötigt (bis zu einer oberen Grenze von 1000 mM). In Varianten mit höheren Konzentrationen für das dritte Plateau (z. B. 35% w/v Gefrierschutzmittel) wird weniger osmotischer Puffer benötigt (bis zu einer unteren Grenze von ca. 150 mM). Die Gegenwart von osmotischen Puffern innerhalb dieser Grenzen ist nötig, um den sonst schädlichen osmotischen Wirkungen eines großen schrittweisen Abfalls in der Konzentration von eindringendem Gefrierschutzmittel entgegenzuwirken. Die Dauer für das dritte Konzentrationsplateau beträgt am besten 16 min (vertretbare Grenzwerte = 5-40 min), was gerade genug Zeit ist, damit das Organ mit dem Auswaschperfusat ein osmotisches Gleichgewicht einstellt.
Temperatur während des dritten Konzentrationsplateaus. Die Wahl für die Perfusionmsternperatur während des dritten Plateaus hängt von der vorausgehenden Temperaturführung ab. Am besten wird eine Temperatur von -1,5ºC beibehalten. Die einzigen Fälle, wo sich die Temperatur während des zweiten und dritten Konzentrationsplateaus unterscheidet, sind Variationen, wo die Temperatur während der Perfusion auf dem zweiten Plateau auf Werte unter oder nahe an den Gefrierpunkt des Perfusats für das dritte Plateau abgesenkt wird oder wenn ein Abkühlschaden eine zusätzliche Erwärmung erforderlich macht, um den Gesamtschaden möglichst klein zu halten. Bei diesen Variationen wird die Temperatur am dritten Plateau auf den kleinstmöglichen, einer möglichst geringen Schädigung entsprechenden Wert festgesetzt und das Organ sodann vor seiner Perfusion bei der Perfusatkonzentration für das dritte Plateau auf diese Temperatur erwärmt.
Allmähliche Verringerung der Konzentration auf Null. Der nächste Prozesschritt besteht in der allmählichen Absenkung der Konzentration des Gefrierschutzmittels auf Null oder praktisch Null. Am besten geschieht dies bei konstanter Geschwindigkeit von ca. -43 mM/min (vertretbare Variationen sind -31 bis -65 mM/min). Eine vertretbare Variation besteht auch in einem Konzentrationsmuster mit nicht konstantem Abfall (schneller Abfall bei hohen Konzentrationen, langsamer Abfall bei niedrigen Konzentrationen), z. B. ein linearer Abfall mit dem 1,5-fachen des linearen Durchschnittswerts für das erste Drittel des Auswaschvorgangs gefolgt von einem linearen Abfall mit dem 0,68-fachen des linearen Durchschnittswerts für die weiteren zwei Drittel des Auswaschvorgangs.
Mit fallenden Konzentrationen des penetrierenden Gefrierschutzmittels sinkt auch die Konzentration des osmotischen Puffers anteilig und erreicht eine von Null verschiedene Konzentration für den osmotischen Puffer, wenn die Konzentration des penetrierenden Gefrierschutzschmittels bei Null angekommen ist. Diese von Null verschiedene Endkonzentration für den osmotischen Puffer liegt am besten bei 50 mM und kann innerhalb vertretbarer Grenzen von 25 mM bis 500 mM variieren. Während der Verringerung der Gefrierschutzmittelkonzentration verringern sich auch die über die Membran wirkenden, dem Transmembran-Konzentrationsgradienten für das Gefrierschutzmittel zuzuschreibenden absoluten osmotischen Kräfte, wodurch die Anforderung an den Einsatz osmotischer Puffer geringer wird. Die Verminderung der Konzentration der osmotischen Puffer während des Auswaschens des Gefrierschutzmittels dient also dazu, den vom osmotischen Puffer verursachten osmotischen Schaden sowohl während des Auswaschens als auch danach möglichst klein zu halten und ferner dazu, eine mögliche zelluläre Aufnahme der normalerweise nicht penetrierenden osmotischen Puffermittel zu reduzieren. Kein vorheriges Perfusionsverfahren hat jemals beim Auswaschens des Gefrierschutzmittels Gebrauch vom "Prinzip des abfallenden osmotischen Puffers" gemacht.
Temperaturführung während des allmählichen Auswaschens des Gefrierschutzmittels. Während des Auswaschens des Gefrierschutzmittels wird die Temperatur zur Erleichterung des Auswaschens, zur Verringerung der osmotischen Kräfte und zur Wiederherstellung der für ein Organ ohne Gefrierschutzmittel geeigneten Perfusionstemperatur angehoben. Am besten fängt man mit der Temperaturerhöhung an, wenn die Konzentration auf 4,7 M gefallen ist und fährt linear mit dem Konzentrationsabfall fort, bis die anfängliche Perfusionstemperatur erreicht ist, wenn die arterielle Konzentration 1,3 bis 0,8 M erreicht (1ºC pro 0,68 bis 0,78 M Konzentrationserhöhung; 3,4 bis 3,9 M Konzentrationsänderung während des Erwärmens). Vertretbare Variationen für die Konzentration, bei welcher die Temperatur anfangs erhöht wird, sind 2,5 bis 5,5 M und für die Konzentration, bei welcher die Temperaturerhöhung abgeschlossen ist, 0,5 bis 4,5 M.
Auswaschen des osmotischen Puffers. Den abschließenden Verfahrensschritt bildet das Auswaschen des osmotischen Puffers. Zur Zeit werden am Ende des Auswaschens des Gefrierschutzmittels am besten 50 mM Sucrose erreicht. Obwohl es hinnehmbar ist, während der kurzen Übergangszeiten vor der Transplantation solche niedrigen Konzentrationen an osmotischem Puffer im Organ zu belassen, ist davon auszugehen, daß während des Blutrückflusses der osmotische Puffer im Interstitium (OB) eine osmotische Ausdehnung des Zwischenzellraumes verursacht, was eine zeitweilige Beeinträchtigung der Organperfusion in vivo zur Folge hat. Bei höheren OB-Konzentrationen (> 100 mM) wird dieser Effekt unannehmbar, was ein Auswaschen des OB vor der Transplantation erfordert. Wenn OB über längere Zeit vor der Transplation im Organ belassen wird, tritt das weitere Problem auf, daß möglicherweise OB in die Zellen des Organs eintritt, was zur Folge hat, daß die Zellen anschwellen und sich das Perfundieren nach der Transplantation verschlechtert. 50 mM Mannitol wurden von den Erfindern typischerweise über einen Zeitraum von 30 min ausgewaschen, was sich nach der Transplantation als völlig erfolgreich erwies. Höhere Konzentrationen an OB (bis zu 500 mM) können je nach dem Perfusionswiderstand in Folge der OB-Verdünnung während längerer Zeiträume (30-90 min) ausgewaschen werden. Die Dauer für den Perfusionsabschnitt nach dem Auswaschen, welcher das Auswaschen des osmotischen Puffers sowie die nachfolgende Perfusion mit einem nicht osmotisch wirkenden Mittel umfaßt, ist für medizinische Zwecke auf die logistischen Erfordernisse für den Transport und die Transplantation des Organs einstellbar.

Abschnitt 4: Behandlung von Organ und Empfänger während der Transplantation und danach.

Es ist wichtig, daß der Empfänger kurz vor Öffnung der Gefäßklemmen Aspirin (Acetylsalicylat, 1,3 mg/kg) und Heparin (100-250 Einheiten/kg) erhält, wobei sowohl höhere als auch niedrigere Konzentrationen zu Gefäßverschluß und -versagen führen. Am besten werden 2 mg/kg bzw. 200 Einheiten/kg gegeben. Es kann auch hilfreich sein, allmählich Iloprost (50-40 mg/kg, i. v.) zu reinfundieren, wobei 5 min vor dem Öffnen der Klemmen begonnen wird und mindestens weitere 15 min fortgefahren wird, um Verletzungen durch Reperfusion vorzubeugen, wie z. B. durch temporären Sauestoffmangel und Entzündungsreaktionen entstandene Schäden. Am besten werden 7-10 ug/kg Iloprost i. v. infundiert, wobei 5 min vor der Revaskularisation begonnen und bis 15 min nach der Revaskularisation fortgefahren wird. Bei Verwendung von Ca-Kanal-Blockern konnte keine Wirkung beobachtet werden.

Verfahren zur Kontrolle der Perfusionen (ohne Gefrierschutzmittel).

Mit der oben beschrieben Ausrüstung läßt sich außer Protokollen für die Kältekonservierung von Organen auch eine große Bandbreite von Protokollen für herkömmliche hypotherme und normotherme Organkonservierung erstellen. Darüber hinaus ist auch eine große Bandbreite von normotherm-pharmakologischen, physiologischen und pathophysiologischen Protokollen möglich. Von den Erfindern werden viele dieser Möglichkeiten veranschaulicht, indem die für die Ausführung vieler dieser Protokolle erforderlichen Schritte in den Fig. 7A-7B beschrieben werden, die für sich selbst sprechen.

Ergebnisse

Fig. 8 zeigt die postoperativen Serum-Kreatinin-Spiegel von Kaninchen, welche zuvor mit VS4 in Euro-Collins-Lösung perfundierte Nieren empfangen hatten. Vor ihrer Entnahme waren die Organe in vivo mit Null, 15 und 25 ug/kg durch systemische intravenöse Infusion über einen Zeitraum von 20 min verabreichtes Iloprost behandelt worden. Die Nieren dieser drei Gruppen wurden jeweils VS4 bei +2, 0-2 und -1-6ºC ausgesetzt. Die Perfusionstemperatur am Anfang und Ende betrug in allen Fällen 2ºC. Die Überlebensraten für die Kaninchen in diesen drei Gruppen waren jeweils 5/16 (31%), 6/10 (60%) und 10/10 (100%). Es sind nur Daten für Kaninchen enthalten, welche die erste Nacht nach der Operation überlebten. Die Überlebensraten der Kaninchen hingen völlig von der Funktion der zuvor mit VS4 perfundierten Niere ab: während der Transplatation wurde eine kontralaterale Nephrektomie unternommen und keine Dialyseunterstützung versucht. Langzeit- Gewebsuntersuchungen an diesen Kaninchen zeigten schlechte Ergebnisse ohne Iloprost, geringfügig bessere mit niedrig dosiertem Iloprost und normale mit der höheren Iloprost- Dosis und den niedrigsten Perfusionstemperaturen. Die Ergebnisse für die Perfusionskontrollen mit Euro-Collins (ohne Gefrierschutzmittel) sind ebenfalls in Fig. 8 wiedergegeben (unterste Kurve). Obwohl die Schädigung in der besten VS4-Gruppe höher ist als in der Kontrollgruppe, scheinen alle Schädigungen innerhalb kurzer Zeit nach der Operation vollständig reversibel zu sein.

Tabelle 1: Lebensfähigkeit der Schnitte von mit VS4 behandelten Nieren im Vergleich mit solchen, die mit VS5 behandelt worden waren

Behandlung K/Na-Verhältnis des Gewebes (Mittelwert +/- SEM)
VS4 3,43 +/- 0,07
VS5 3,27 +/- 0,12
p > 0,05
K/Na-Verhältnis, gemessen nach dem Auswaschen des Gefrierschutzmittels und der Inkubation des Rindenschnittes bei 25ºC über einen Zeitraum von 90 min. um den aktiven Transport von K&spplus; und Na&spplus; zu ermöglichen.

Claims

1. Verfahren zur Vorbereitung von Organen oder Geweben für eine Langzeitkonservierung durch Einführen einer zur Vitrifizierung ausreichenden Konzentration eines vor Kälteschaden schützenden Mittels und nachfolgender Vorbereitung der Organe oder Gewebe für eine Transplantation durch Entfernung des vor Kälteschaden schützenden Mittels in den Schritten:

(a) zuerst Perfusion des Organs oder Superfusion des Gewebes ohne das vor Kälteschaden schützende Mittel;

(b) Zugabe einer Lösung mit dem vor Kälteschaden schützenden Mittel zum Organ oder Gewebe und schrittweise Erhöhung der Konzentration des vor Kälteschaden schützenden Mittels auf ein erstes vorbestimmtes Niveau unter gleichzeitigem Senken der Temperatur des Organs oder Gewebes;

(c) Verhinderung eines Anstiegs der Konzentration des vor Kälteschaden schützenden Mittels über einen genügend langen Zeitraum, damit sich ein annähernd osmotisches Gleichgewicht des Organs oder Gewebes einstellen kann;

(d) Erhöhung der Konzentration des vor Kälteschaden schützenden Mittels in der Lösung auf einen über dem ersten vorbestimmten Niveau liegenden, zur Vitrifizierung benötigten Gehalt und Halten der Lösung bei dieser höheren Konzentration bis sich ein annähernd osmotisches Gleichgewicht des Organs oder Gewebes eingestellt hat;

(e) Perfusion des Organs oder Superfusion des Gewebes mit einer verringerten, nicht zur Vitrifizierung ausreichenden Konzentration des vor Kälteschaden schützenden Mittels zusammen mit einem nicht eindringenden osmotischen Puffer, solange, bis eine Pufferkonzentration erreicht ist, bei der sich ein annähernd osmotisches Gleichgewicht des Organs oder Gewebes einstellt;

(f) Auswaschen von nahezu dem gesamten vor Kälteschaden schützenden Mittel unter Absenkung der Konzentration an osmotischem Puffer auf ein zweites, von Null verschiedenes, im wesentlichen unter dem Wert für die erste Pufferkonzentration liegendes Niveau unter gleichzeitigem Erhöhung der Temperatur des Organs oder Gewebes; und

(g) Perfusion des Organs oder Superfusion des Gewebes bis soviel osmotischer Puffer entfernt ist, daß das Organ oder Gewebe für eine Transplantation geeignet ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das vor Kälteschaden schützende Mittel eine im wesentlichen aus Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol bestehende Lösung umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das vor Kälteschaden schützende Mittel eine im wesentlichen aus Dimethylsulfoxid, Formamid und 2,3-Butandiol bestehende Lösung umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Organ eine Niere ist.

5. Verwendung eines vor Kälteschaden schützenden Mittels zur Herstellung eines Mittels für die vor Entnahme eines Organs aus einem Spender erfolgende in-vivo-Vorbehandlung dieses Organs für das Konservierungsverfahren nach Anspruch 1.

6. Verwendung eines Entzündungshemmers und eines Gerinnungshemmers zur Herstellung eines Mittels für die Behandlung eines Organtransplantat-Empfängers über einen ersten vorbestimmten Zeitraum vor der Transplantation eines nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 vorbereiteten Organs.