DE69230180T2

DE69230180T2 - Neuartige hefestämme zur herstellung von xylitol

Info

Publication number: DE69230180T2
Application number: DE69230180T
Authority: DE
Inventors: Juha Apajalahti; Matti Leisola
Original assignee: Xyrofin Oy
Current assignee: Xyrofin Oy
Priority date: 1991-07-01
Filing date: 1992-06-30
Publication date: 2000-03-23
Anticipated expiration: 2012-07-01
Also published as: FR2678637B1; CA2112374A1; CA2112374C; FR2678637A1; ES2140411T3; WO1993001299A1; EP0604429A1; EP0604429B1; DE69230180D1; US6271007B1; JPH07500492A; JP3331343B2; ATE185841T1; FI913197A0

Description

ERFINDUNGSGEBIET

Die Erfindung betrifft das Gebiet der metabolischen Modifizierung.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Xylit unter Einsatz neuer Hefestämme, in denen der Xylit-Metabolismus modifiziert ist. Die Erfindung betrifft weiterhin neue Hefestämme und ein Verfahren zur Herstellung solcher Stämme.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Xylit wird gewöhnlich durch Verfahren hergestellt, in denen zu Beginn ein xylanhaltiges Material hydrolysiert wird, um eine Monosaccharidmischung herzustellen, die Xylose enthält. Die Xylose wird dann im allgemeinen in Gegenwart eines Nickelkatalysators zu Xylit reduziert. Eine Vielzahl von Verfahren dieses Typs wurde in der dieses Gebiet betreffenden Literatur beschrieben. Die US-PSen Nummern 3,784,408, 4,066,711, 4,075,406, 4,008,285 und 3,586,537 können als Beispiele genannt werden.
Alle diese Verfahren des Standes der Technik sind jedoch mehrstufige Verfahren, die relativ kostenintensiv sind und eine relativ geringe Effektivität aufweisen. Die größten Probleme bestehen darin, eine wirksame und vollständige Trennung der Xylose von anderen Nebenprodukten der Hydrolyse vorzunehmen. Die Reinigung ist sehr anspruchsvoll, da die in der Reduktionsreaktion der Xylose eingesetzten Katalysatoren sehr empfindlich sind. Andererseits hängt die Reinheit des Endproduktes in hohem Ausmaß davon ab, wie gut das Xylit von den anderen Produkten, die in der Reduktionsreaktion hergestellt werden, getrennt werden kann.
Die Herstellung von Xylit durch ein biotechnologisches Verfahren ist sehr erstrebenswert, wenn ein solches Verfahren in der Lage ist, ein Produkt sehr hoher Qualität durch ein vergleichsweise kostengünstiges Verfahren zur Verfügung zu stellen. Um jedoch Xylit durch Hefefermentation für die obengenannten Zwecke herzustellen, muss ein Hefestamm gefunden werden, der nicht pathogen ist, und der die von der Lebensmittelindustrie gestellten Anforderungen erfüllt. Um weiterhin hohe Ausbeuten an Xylit mit Hilfe der Hefefermentation zu erzielen, ist es notwendig, eine Hefe einzusetzen, die in der Lage ist, Xylose zu Xylit zu reduzieren.
Vorzugsweise sollte ein solcher Stamm in der weiteren metabolischen Umwandlung von Xylit relativ unwirksam sein.
Viele Hefestämme produzieren Reduktaseenzyme, die die Reduktion von Zuckern zu den entsprechenden Zuckeralkoholen katalysieren. Viele Hefen sind auch in der Lage, im Anfangsschritt ihres Xylosemetabolismus Xylose zu Xylit zu reduzieren, und verschiedene Hefestämme sind in der Lage, Xylose als einzige Quelle ihres Kohlenstoff- und Energiehaushaltes zu nutzen. Der Reaktionsweg oder -pfad der Xylosenutzbarmachung für die Hefe ist im folgenden dargestellt: Xylit wird in einem ersten Schritt synthetisiert, indem Xylose mit Hilfe von Xylosereduktase zu Xylit reduziert wird. Xylit wird dann in einer Serie von aufeinanderfolgenden Schritten metabolisiert (nutzbar gemacht). Als erstes wird Xylit durch Xylit-Dehydrogenase zu Xylulose oxidiert, Xylulose wird durch Xylulosekinase (auch Xylulokinase genannt) zu Xylulose-5-phosphat phosphoryliert, und dann wird ein Teil des Xylulose-5-phosphates über verschiedene Zwischenstufen in Pyruvat und Ethanol umgewandelt. Die resultierenden Hauptprodukte und Nebenprodukte variieren in Abhängigkeit vom Hefestamm und den Fermentationsbedingungen. Die Reaktionen sind nicht eng gekoppelt und demzufolge wird immer etwas Xylit im Medium produziert.
Im allgemeinen ist die Forschung auf diesem Gebiet auf Versuche gerichtet, Hefestämme zu identifizieren, die über eine erhöhte Fähigkeit verfügen, mehr Alkohol als Xylit herzustellen. Ungeachtet dessen, ist die Xylit-Produktion ein relativ häufiges Merkmal von Xylose nutzenden Hefen. Zum Beispiel produzieren 44 Hefen aus fünf Gattungen (Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia und Pachysolen) in Kulturmedien 42 etwas Xylit (Barbosa, M. F. S., et al., J. Indust. Microbiol. 3: 241-251 (1988) und Enzyme Microb. Technol. 20: 66-81 (1988)).
Es wurde vorgeschlagen, solche Stämme für die industrielle Produktion von Xylit einzusetzen. Zum Beispiel wurde der industrielle Einsatz von Candida tropicalis, Candida guillermondii und Candida parapsilosis vorgeschlagen (PCT-Veröffentlichung WO90/8193, C. tropicalis, WO91/0740, C. tropicalis und WO88/5467, C. guillermondii und FR-OS 2641545, C. parapsilosis). Alle die obengenannten Candida-Stämme sind jedoch potentiell pathogen und erfüllen nicht die von der Lebensmittelindustrie gestellten Anforderungen. Barbosa et al., J. Industr. Microbiol. 3: 241-2151 (1988) beschreibt Hefen, die hinsichtlich der Herstellung von Xylit untersucht wurden. Die Stämme, die akzeptable Ausbeuten ergaben, waren jedoch auch alle potentiell pathogen. Demzufolge wurden keine nicht pathogenen Hefestämme, die für die Herstellung von Xylit einsetzbar sind, beschrieben, die in der Lebensmittelindustrie und/oder zur Herstellung von Xylit in großem Ausmaß einsetzbar sind.
Zusätzlich ist die industrielle Produktion von Xylit durch enzymatische Umwandlung von Xylose nur profitabel, wenn die Ausbeute sehr hoch ist. Natürliche Hefestämme können dieses jedoch nicht erreichen. Das Studium verschiedener Hefestämme bei optimalen Reaktionsbedingungen führte zum Ergebnis, dass bestimmte Candida tropicalis-Stämme die beste Ausbeute an Xylit ergaben. Wie jedoch oben ausgeführt, sind die Stämme dieser Hefeart potentiell pathogen und können daher nicht in der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden. Arten, die für die Lebensmittelindustrie akzeptabel sind, schließen Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis und Kluyveromyces marxianus ein. Saccharomyces cervisiae exprimiert normalerweise keine Enzyme des Xylosereaktionsweges, obwohl Hallborn, J. et al., Bio/Technology 9: 1090 (1991) den Einsatz geklonter Xylosereduktasegene aus Pichia stipitis zum Aufbau von Saccharomyces cerevisiae-Stämmen nutzt, die in der Lage sind, Xylose mit einer behaupteten Ausbeute von 95% in Xylit umzuwandeln.
Mutanten, deren Xyloseverwertung mangelhaft ausgeprägt ist, wurden beschrieben. Hagedorn, J. et al., Curr. Genet. 16: 27-33 (1989) offenbart, dass Mutanten der Hefe P. stipitis identifiziert wurden, die nicht in der Lage waren, Xylose als einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, und die entweder einen Mangel an Xyloseresuktase oder Xylit-Dehydrogenase aufwiesen. James, A. P. et al., Appl. Environ. Microbiol. 55: 2871-2876 (1989) offenbart Mutanten der Hefe Pachysolen tannophilus, die nicht in der Lage sind, D-Xylose zu metabolisieren. Stevis, P. E. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 20: 327-334 (1989) offenbart die Herstellung von Hefe- Xyulokinase-Mutanten durch rekombinante DNA-Techniken.
Gong, Ch. et al. Biotechnol. Lett. 3: 125-130 (1981) beschreibt zwei Hefemutanten, die mit HXP 1 und HXP 2 bezeichnet wurden, die wirksam Xylit herstellen, und durch UV-Mutagenese eines wilden Stammes von Candida tropicalis erhalten wurden, der ursprünglich in der Lage war, D-Xylose in Xylit zu metabolisieren.
Die Hefen Candida utilis und Kluyveromyces marxianus besitzen die natürlich induzierbaren Enzyme Xylosereduktase, Xylit-Dehydrogenase und Xylulosekinase, die für den Abbau von Xylose notwendig sind. Versuche, die chemische und physikalische Umgebung von Candida utilis und Kluyveromyces marxianus so einzustellen, dass die Xylit-Ausbeute erhöht wird, waren jedoch nicht erfolgreich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun herausgefunden, dass der Xylit-Metabolismus von Hefen modifiziert werden kann, so dass neue Hefestämme entwickelt werden, die Xylit in hohen Ausbeuten herstellen.
Daher ist die Erfindung als erstes auf neue Hefestämme gerichtet, wobei diese Hefestämme in der Lage sind, Xylit aus Xylose zu synthetisieren, jedoch einen Mangel an einem oder mehreren Enzymen des Xylit-Metabolismus aufweisen, so dass Xylit im Kulturmedium akkumuliert und hieraus gewonnen werden kann.
Die Erfindung ist weiterhin auf Verfahren zur Herstellung von Xylit unter Einsatz solcher Hefestämme gerichtet.
Die Erfindung ist weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Hefestämme gerichtet, die in der Lage sind, Xylose zu reduzieren, und die nicht oder mangelhaft in der Lage sind, Xylit- Dehydrogenase und/oder Xylulosekinase zu exprimieren.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Die erfindungsgemäßen modifizierten Hefestämme können Xylit aus Xylose synthetisieren, es mangelt ihnen jedoch an einem oder mehreren Enzymen der Xylit-Verwertung, so dass Xylit im Medium akkumuliert, wenn modifizierte Hefewirtszellen auf Xylose wachsen. Somit ist die Xylosereduktase-Aktivität in den neuen Stämmen vorhanden, der Xylit-Metabolismus ist jedoch merklich verringert. Dementsprechend sind die neuen Stämme nicht in der Lage, Xylose als ihre einzige Kohlenstoffquelle zu nutzen, auch wenn Xylose die Aktivität der Xylosereduktase, und somit die Umwandlung von Xylose in Xylit induziert.
Der Reaktionsweg der Xylosereduktion ist nachstehend gezeigt.
Xylosereduktase katalysiert die Reaktion:
Das erste Enzym der Xylit-Verwertung, Xylit-Dehydrogenase, katalysiert die Reaktion:
Die neuen Hefestämme, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, produzieren Xylit aus Xylose, wenn eine andere Kohlenstoff- und Energiequelle zum Wachstum und zur Erhaltung der Hefestämme dem Nährmedium zugefügt wurde. Unter Kulturbedingungen, unter denen es erwünscht ist, Xylit aus Xylose herzustellen, sind die erfindungsgemäßen Wirtszellen genetisch nicht in der Lage, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen, da sie genetisch nicht in der Lage sind, Xylit vollständig zu metabolisieren. Da die Stämme nicht in der Lage sind, Xylit zu metabolisieren, wird Xylit im Nährmedium angereichert. Unter "genetisch nicht in der Lage" wird verstanden, dass die natürliche Hefe-DNA so verändert wurde, dass modifizierte Hefewirtszellen resultieren, die eine gewünschte Mutation oder eine andere genetische Veränderung besitzen, die stabil vererbt wird.
Somit weisen die erfindungsgemäßen modifizierten Hefestämme eine hohe Glucosemetabolisierungs- und Xylosereduktionsrate, jedoch gleichzeitig einen merklich reduzierten oxidativen Umsatz von Xylit in Xylulose auf. Die neuen Stämme sind somit sehr effektive Xylit-Produzenten. Viele Hefestämme sind bekannt, die Xylose nutzen, einschließlich z. B. C. frarell (wie FTI- 20038); C. guilliermondii (wie FTI-20037, IZ-803, IZ-1739, IZ-1231, IZ- 1322, IZ-1239, IZ-1422, c-138, 17-07 und IZ-1735); C. intermedia (wie RJ- 245); C. pseudotropicalis (wie IZ-431 und 1006); C. tropicalis (wie 1004, IZ-1824, IZ-1958 und 53-51); C. utilis (wie FTI-20039, 74-64, 1009, EQ2, IZ-1166, IZ-1840 und IZ-1841); H. anomala (wie IZ-1420, IZ-229, IZ-781, IZ- 1033, RJ-510, IZ-271, IZ-1224, IZ-1260 und FTPTAT-106); K. fragilis (wie FTI-20066); K. marxianus (wie IZ-1821, 145, IZ-1339, 276 und IZ-619); Pach. tannophilus (wie NRRL Y2460); P. butonii (wie 68-1111) und P. stipitis (wie 79-261). Solche Hefen können aus einer Vielzahl von Quellen, z. B. dem ATCC, dem NRRL, dem Agronomic Institute (UNICAMP, Campinas, Brasilien); der Foundation for Industrial Technology (FTI, Säo Paulo, Brasilien); dem Microbiology Institute (UFRJ, Rio de Janeiro) und dem Zymotechnic Institute (ESALQ, Piracicaba) erhalten werden. Alle können auf Agar-Schrägkulturen oder -platten, wie im Stand beschrieben, z. B. in einem Medium, das 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton und 20 g/l D-Glucose enthält, kultiviert werden (Barbosa, M. F. S. et al., J. Indust. Microbiol. 3: 241-251 (1988)).
Wenn nicht pathogene Originalstämme für die Herstellung der neuen Stämme eingesetzt werden, erfüllen die resultierenden Mutanten auch die speziellen Anforderungen, die sowohl hinsichtlich Qualität als auch Ausbeute von der Lebensmittelindustrie gestellt werden. Bevorzugt wird eine Hefe der Gattung Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia oder Pachysolen eingesetzt, und insbesondere Candida utilis oder Kluyveromyces marxianus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Kluyveromyces marxianus var. marxianus-Stamm (wie Stamm CBSC12) oder Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus (wie ATCC 16045) oder Kluyveromyces marxianus var. lactis eingesetzt. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind zur Modifizierung jeglicher Hefen anwendbar, wenn es gewünscht ist, eine Hefe herzustellen oder zu identifizieren, die in der Lage ist, Xylit zu produzieren, der es jedoch an einem oder mehreren Enzymen der Xylit- Verwertung mangelt. Die unten beispielhaft genannten Verfahren, in denen die Hefe Kluyveromyces marxianus als Modell und Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, sind auf die Modifizierung anderer Hefearten erweiterbar und anwendbar, um modifizierte erfindungsgemäße Hefewirtszellen zu erhalten.
Kluyveromyces marxianus ist eine allgemein bekannte, nicht pathogene Hefe, die in der Lebensmittelindustries vielfältig eingesetzt wird. Die Hefe wurde z. B. in The Yeasts, A Taxonomic Study, ed. N. J. W. Kreger-von Rij, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1984) beschrieben, worin auch Synomyme dieser Hefe auf Seite 234 angegeben sind.
Der wilde Stamm verwendet normalerweise Glucose als seine Energiequelle, er ist jedoch auch in der Lage, Xylose zu metabolisieren. Andere Hefen, die die speziellen Anforderungen der Lebensmittelindustrie erfüllen, wie bestimmte Candida-Stämme, können ebenfalls für den erfindungsgemäßen Zweck eingesetzt werden.
Vorzugsweise sind die Gene, deren Expression erwünschterweise inaktiviert werden soll, jene, die in natürlichen Hefewirtszellen für Xylit-Dehydrogenase und Xylulosekinase codieren. Diese Gene sind bevorzugt, da sie im allgemeinen den einzigen Pfad des Xylit-Metabolismus in den Wirtszellen darstellen. Daher führt die Blockierung der Expression eines (oder beider) Enzyme zur endgültigen Blockierung der Xylit-Verwertung und erlaubt die Xylit-Akkumulation im Medium, wenn die Wirtszellen in Gegenwart von Xylose gezüchtet werden.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen können durch jedes Verfahren hergestellt werden, das den Xylit-Metabolismus in der oben beschriebenen Weise blockiert. In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung neuer Hefestämme dadurch charakterisiert, dass der Ausgangsstamm in einem Nährmedium kultiviert wird, das assimilierbare Kohlenstoff- und Energiequellen enthält, eine Mutagenbehandlung und gegebenenfalls eine Behandlung mit einem Mittel, das die Chromosomenteilung oder die Mikrotubulusbildung beeinflusst, auf dem Nährboden durchgeführt wird, die Mutanten mit einem Antibiotikum angereichert werden, und die Hefestämme, die einen mangelhaften Xylit-Metabolismus aufweisen, identifiziert und geerntet werden.
In dieser Ausführungsform wird die Mutagenese z. B. mittels chemischer oder physikalischer Behandlung erzielt. Beispiele geeigneter chemischer Mutagene sind Basenanaloga wie 5'-Bromuracil, 2'-Aminopurin und 5'- Deoxyuridin, Deaminierungsmittel wie Salpetersäure und Hydroxylamin, Alkylierungsmittel wie Ethylmethansulfonat und Nitrosoguanidin, und Acridinderivate wie Acriflavin und Ethidiumbromid. Protokolle für den Einsatz dieser Mittel sind im Stand der Technik bekannt.
Beispiele geeigneter physikalischer Mutageneseverfahren schließen z. B. UV- und Röntgenstrahlung ein. Protokolle für den Einsatz dieser Mittel sind auch im Stand der Technik bekannt.
Gegebenenfalls kann die Hefe mit einem Mittel behandelt werden, das die Chromosomenteilung oder die Mikrotubulusbildung im Mitosezyklus beeinflusst. Der Einsatz von Benomyl ist eine bevorzugte Ausführungsform. Durch diese Behandlung wird das Chromosom, das die gewünschte Mutation aufweist, aus den vorhandenen homologen Chromosomen isoliert. Für haploide Hefestämme ist diese Behandlung nicht notwendig.
Letztendlich werden die durch ein oben beschriebenes chemisches oder physikalisches Verfahren modifizierten Hefen auf jene untersucht, in denen die gewünschten Eigenschaften der erfindungsgemäßen modifizierten Hefewirtszellen vorliegen. Eine Anreicherung der auxotrophen Zellen mit einem Antibiotikum wie Nystatin, das nur die Zellen tötet, die einen aktiven Metabolismus aufweisen, kann angewendet werden. Die Behandlung wird in Gegenwart von Xylose durchgeführt. Das Kulturmedium kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren direkt hinsichtlich der Xylose-Menge untersucht werden, um die besten Hefeproduzenten zu bestimmen.
Somit können die neuen Hefestämme durch Kultivierung des Ausgangsstammes in herkömmlicher Weise in einem geeigneten Nährmedium hergestellt werden. Eine Mutagenbehandlung kann durch chemische oder physikalische Verfahren, z. B. unter Einsatz eines Mutagens, das eine Insertion oder Deletion erzeugt, wie Acrifalvin oder Proflavin, eines Mutagens, das eine Punktmutation erzeugt, Ethylmethansulfonat, UV-Strahlung oder äquivalente Methoden, auf der erhaltenen Kultur durchgeführt werden. Nach der optionalen Benomyl-Behandlung können die Mutanten z. B. durch Behandlung durch Nystatin angereichert werden, und schließlich werden die Hefestämme selektiert, indem sie auf Cellulose reichem und Glucose armen Agar kultieviert werden. Die sehr kleinen Kolonien, die einen mangelhaften Xylose-Metabolismus aufweisen, werden ausgelesen, und reine Kulturen werden mittels herkömmlicher Techniken hieraus gebildet. Der Vorteil, der mit dem Einsatz chemischer oder physikalischer Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszellen verbunden ist, besteht darin, dass diese Verfahren auf jegliche Ausgangshefearten anwendbar sind, und die Auswahlmethoden (Untersuchung auf Xylit-Produktion im Medium) auch auf jegliche Hefearten einfach anwendbar sind. Für die in den Beispielen beschriebenen Verfahren kann z. B. erwartet werden, dass nicht nur mit den beispielhaften Arten erfindungsgemäße Wirtzellen zur Verfügung gestellt werden, sondern auch mit jeglichen anderen Hefewirtszellen, die die natürliche Eigenschaft besitzen, Xylose zu metabolisieren.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszellen schließt den Einsatz rekombinanter DNA-Techniken ein. In einer ersten Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz, die ein Enzym des Xylit- Metabolismus codiert, so verändert, dass die Codierungsinformation in diesem Gen zerstört wird, und das veränderte Gen wird im Austausch gegen das natürliche Hefegen unter Einsatz von homologen Rekombinations- oder Gendissoziationstechniken in das Hefechromosom eingefügt. Beispiele von Genen, die in dieser Weise beeinflusst werden können, schließen Xylit- Dehydrogenase und Xylulosekinase ein. Bevorzugt ist Xylit-Dehydrogenase das Ziel der Inaktivierung, da sie das erste Enzym der Xylit-Verwertung darstellt. Die Inaktivierung der Xylulosekinase ist ausreichend, um hohe Xylit-Ausbeuten zu sichern, da das Gleichgewicht der reversiblen Reaktion, die durch die Xylit-Dehydrogenase katalysiert wird, unter Bedingungen, die im Inneren der Hefezelle vorliegen, sehr stark in Richtung des Xylits verschoben wird. Wenn Gene, die für beide Enzyme codieren, das Ziel der Inaktivierung sind, wird jegliche verbleibende, geringfügige Expression einer aktiven Form (oder eines Fragments) der Xylit-Dehydrogenase in den Wirtszellen durch den Mangel and Xylulosekinase-Aktivität kompensiert.
Die Verfahren zum Klonen dieser Gene aus Hefen sind im Stand der Technik bekannt (s. Beispiele). Die Gene, die für Xylit-Dehydrogenase oder Xylolosekinase codieren, können z. B. durch Komplementation der entsprechenden Mutationen in Escherichia coli oder Hefe geklont werden. Die geklonten Gene werden durch Einfügen einer in Hefen auswählbaren DNA- Sequenz in die codierende Region der geklonten Gene, bevorzugt in einem Abstand von nicht weniger als einigen hundert Basenpaaren vom jeweiligen Ende der geklonten Gene, modifiziert. Der auswählbare Marker (bevorzugt ein dominanter Marker, der einen Antibiotika-resistenten Phenotyp verleiht) kann entweder an einer geeigneten Restriktionsstelle eingefügt oder verändert werden, um ein Fragment im dissoziierten Gen zu ersetzen. Die resultierende Plasmidstruktur wird in Bakteriein vervielfältigt. Geeignete Restriktionsenzyme werden dann eingesetzt, um ein DNA-Fragment auszuschneiden, das an seinen beiden Enden die Xylit-Dehydrogenase (oder Xylulosekinase)-Gensequenzen aufweist, und ein in Hefe auswählbarer Marker wird in der mittleren Region eingesetzt. Dieses DNA-Fragment wird nachfolgend eingesetzt, um einem Hefestamm Antibiotika-Resistenz zu verleihen. Individuelle transformierte Klone werden dahingehend überprüft, ob sie die Fähigkeit aufweisen, auf Platten, die Xylose als einzige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen. Eine erfolgreiche Gen-Dissoziation kann zum Schluss durch Messen der entsprechenden Enzymaktivität im transformierten Stamm und/oder durch Analysieren der Struktur der relevanten Region des Hefechromosoms durch ein Verfahren, das als "Southern Blot Hybridisierung" bekannt ist, bestätigt werden.
Eine geeignete Modifikation ist z. B. der Ersatz eines internen Fragmentes des geklonten Gens mit einem dominaten Auswahlmarker für Hefen. DNA, die für das bakterielle Kanamycin-Resistenzgen oder Bleomycin- Resistenzgen codiert, ist ein Beispiel für geeignete dominante Auswahlmarker für Hefen. Solche Konstrukte können an Hefepromotorsequenzen gebunden werden, oder können einen Hefepromotor benutzen, der auf der Seite der homologen Rekombination vorliegt. Wenn der Promotor des Gens genutzt wird, dessen codierende Sequenz unterbrochen ist, werden nur die Transformanten ausgewählt, die die codierende Sequenz so einbauen, dass der gewünschte Translationsleserahmen ausgewählt wird. Somit ist es meist einfacher, eine Promotorsequenz zur Verfügung zu stellen, die Bereits mit dem Konstrukt verbunden ist. Jedes andere Gen, das eine Auswahl der Zellen, die die transformierte DNA enthalten, erlaubt, kann anstelle des Genes für die Antibiotika-Resistenz eingesetzt werden, z. B. ein Gen, das für ein essentielles Protein codiert.
Eine Transformation der Hefezellen mit einem linearen DNA-Fragment, das eine Teilsequenz des gewünschten Zieles (wie eine Teilsequenz des Xylit-Dehydrogenase- oder Xylulosekinase-Gens) an beiden DNA-Enden und innerhalb des Fragmentes einen selektiven Marker aufweist, kann ausgeführt werden. Eine solche Transformation führt bekanntermaßen zu einem hohen Anteil der Transformanten, die eine Deletionsmutation im entsprechenden Gen aufweisen.
Wenn es alternativ gewünscht wird, die ursprüngliche Fähigkeit der Hefe Xylit-Dehydrogenase und/oder Xylulosekinase zu exprimieren, zu erhalten, können alternative rekombinante Verfahren eingesetzt werden, die eine selektive Inhibierung der Expression eines Zielenzyms zur Verfügung stellen. Solche Verfahren schließen den Aufbau einer antisense-RNA oder eines Ribozyms, die oder das gegen ein geeignetes gewünschtes Ziel gerichtet ist, wie die mRNA, die für Xylit-Dehydrogenase oder Xylulosekinase codiert, ein. Ein DNA-Konstrukt, das eine antisense-RNA codiert, besitzt eine DNA-Sequenz, die zur Sequenz der Ziel-mRNA komplementär ist und eine ausreichende Länge aufweist, um eine solche Ziel- mRNA zu erkennen und damit zu hybridisieren, so dass die Translation der Ziel-mRNA in der Wirtszelle verhindert wird. Ein DNA-Konstrukt, das ein geeignetes Ribozym codiert, besitzt auch eine ausreichende DNA-Sequenz, um mit der Ziel-mRNA zu hybridisieren; ist es jedoch einmal mit einer solchen mRNA hybridisiert, katalysiert die Ribozym-Aktivität die Spaltung der mRNA an der Stelle, die die Fähigkeit einer solchen mRNA die Translation des aktiven hierin codierten Proteins (s. z. B. EP 321,201) fördert. Das antisense-RNA-Konstrukt oder die Ribozymsequenz kann an eine geeignete Hefepromotorsequenz durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gebunden werden, und in die Hefewirtszellen genetisch stabil durch gewöhnliche Transformationstechniken, die auch im Stand der Technik bekannt sind, transformiert werden. Die Expression solcher Konstrukte wird durch die Eigenschaften des gebundenen Hefepromotors bestimmt und kann in verschiedenen Nährmedien wie gewünscht konstitutiv oder induzierbar oder reprimierbar sein. Der Vorteil solcher Konstrukte besteht darin, dass die Fähigkeit der natürlichen Wirtzelle das Ziel-Enzym zu exprimieren, nicht zerstört wird. Der Vorteil, die Expression solcher Konstrukte in einer An/Aus-Weise regulierbar zu gestalten, besteht darin, dass die Fähigkeit der Wirtszelle, das Ziel zu exprimieren, hochgradig konstrolliert werden kann, so dass die Expression des Ziels nur verhindert wird, wenn es für die Xylit-Synthese eingesetzt werden soll.
Die Wirksamkeit der neuen Hefestämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut sind, kann durch Überexprimieren von Xylose-Reduktase, die aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Hefestamm geklont wurde, weiter verbessert werden. Das Verfahren des Klonens des Xylose-Reduktase- Gens aus Hefe wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (Hallborn, J. et al., Bio/Technology 9: 1090-1094 (1991); Takuma et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 28/29: 327-340 (1991) und Strasser et al., DE 40 09 676 (1991)). Das Verfahren zum Einsatz dieses geklonten Gens zur Xylose-Xylit-Umwandlung in Hefe wurde ebenfalls beschrieben (Hallborn, J. et al., Bio/Technology 9: 1090-1094 (1991)). Das geklonte Xylose-Reduktase-Gen kann auf einen geeigneten Vektor transferiert werden, der in der Lage ist, sich in den ausgewählten Hefespezies zu vermehren. Zum Beispiel sind pKD1 basierende Vektoren der bevorzugte Vektortyp für eine hochgradige Expression in K. marxianus (Bianchi, M. M. et al., Curr. Genet. 12: 185-192 (1987)). Das Xylose-Reduktase-Gen kann gegen einen anderen Promotor, der bekannterweise wirksam in der ausgewählten Hefe funktioniert, ausgetauscht werden. Die mutierten Hefestämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, können dann als Wirtszellen für die Transformation mit (einem) Vektor(en), die die Überexpression des Xylose-Reduktase-Gens bereitstellen, eingesetzt werden.
Gemäß allen Ausführungsformen, unabhängig von der Herstellungsweise, sind die erfindungsgemäßen resultierenden neuen Hefestämme durch eine merklich verringerte Fähigkeit, Xylit zu metabolisieren, gekennzeichnet, wenn sie mit natürlichen Hefestämmen verglichen werden. Das ist darauf zurückzuführen, dass ein oder mehrere der Enzyme des Xylit-Metabolismus, wie die Xylit-Dehydrogenase-Aktivität und/oder die Xylulosekinase-Aktivität modifiziert wurden, so dass die Expression solcher Enzyme im Ergebnis der Modifikation der Hefe entweder verschwindet oder abnimmt (entweder dauerhaft oder in regulierbarer Art und Weise). Eine jegliche Kohlenstoffquelle, die von den Wirtszellen zur Energieproduktion genutzt werden kann, kann eingesetzt werden, um das Wachstum der erfindungsgemäßen Hefe zu unterstützen und die Reduktionsäquivalente für Reduktion von Xylose zur Verfügung zu stellen. Diese Funktion (Lieferung des Reduktionspotentials) ist vielleicht bedeutender für das erfindungsgemäße Verfahren als die Unterstützung des Wachstums der Wirtszelle. Zum Beispiel wird dem Nährmedium als Energiequelle bevorzugt Glucose in den Mengen, die im Stand der Technik als notwendig für die Unterstützung des Wachstums in der Wirtszelle bekannt sind, zugefügt. Wachstumsbedingungen hinsichtlich Belüftung und Rühren sollten optimal für die Wirtszelle sein.
Wenn den erfindungsgemäßen Wirtszellen Xylose zur Verfügung gestellt wird, wird der Xylosekohlenstoff im wesentlichen als Xylit "gefangen" und steht für die Energiegewinnung der Wirtszelle nicht zur Verfügung. Aufgrund dieser Eigenschaft sind die erfindungsgemäßen neuen Stämme für die Xylit- Produktion sehr nützlich. Wenn die mutierten erfindungsgemäßen Stämme in einer Xylose-reichen Nährlösung kultiviert werden, wandeln sie Xylose mit hoher Effizienz in Xylit um. Ihre Umwandlungseffizienz und ihr Nutzen für ein gewünschtes Verfahren kann durch Einsatz jeglicher xylosehaltiger Lösungen und Hydrolysate, z. B. reiner Xyloselösungen oder Abfallösungen aus der holzverarbeitenden Industrie, wie gebrauchte Mahlflüssigkeit oder Kochflüssigkeit, oder Xylose-reiche Teile hiervon, abgeschätzt werden. Die effektivsten Xylit-Produzenten werden geerntet und für die Herstellung von Xylit in industriellem Maßstab eingesetzt.
Somit werden neue Stämme, die Xylose mit hoher Ausbeute in Xylit metabolisieren, im Ergebnis der oben beschriebenen Behandlung(en) erhalten. Da der Xylit-Metabolismus der Stämme mangelhaft ist, zersetzen (abbauen oder metabolisieren oder verwenden) die Stämme Xylit nicht, sondern Xylit wird im Nährmedium angereichert und z. B. chromatographisch nach den Entfernen der Hefezellen gewonnen. Jedes Verfahren, das im Stand der Technik zur Reinigung des Xylits vom Nährmedium bekannt ist, kann eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht beschränken sollen, detailliert beschrieben. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, dass das Verfahren nicht hinsichtlich der Xylit- Produktion optimiert wurde, sondern dahingehend, dass die Unterschiede in den Hefestämmen hervorgehoben werden.

BEISPIEL 1

Erzeugung neuer Hefestämme

Kluyveromyces marxianus ATCC 8608 wurde auf einem YDP-, DYM- oder DYM- Tartrat-Medium bei 30ºC und einem pH von 6.0 kultiviert. YDP (1.000 ml) enthielt 10 g Hefeextrakt, 20 g Glucose und 20 g Pepton. DYM (1.000 ml) enthielt 5,0 g (NH&sub2;)&sub2;SO&sub4;, 1,0 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,1 g NaCl und 0,1 g CaCl&sub2;-2H&sub2;O. DYM-Tartrat enthielt 7,1 g Na&sub2;SO&sub4;, 27,6 g (NH&sub4;)&sub2;-Tartrat, 6,8 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,1 g NaCl und 0,1 g CaCl&sub2;-2H&sub2;O. DYM und DYM-Tartrat wurden mit einer Spurenelementlösung (1 : 1000), einer Vitaminlösung (1 : 100) und einer Kohlenstoffquelle angereichert, die beiden letzteren wurden nach Behandlung im Autoklaven zugefügt. Die Zucker und Zuckeralkohole wurden separat in einer 20%igen (Gew/VOl) Lösung im Autoklaven behandelt, und die Vitaminmischung wurde durch Filtration sterilisiert. Die Vitaminlösung (1000 ml) enthielt 100 mg L-Histidin-HCl·H&sub2;O, 0,2 mg Biotin, 40 mg Calciumpantothenat, 0,2 mg Folsäure, 200 mg Inositol, 40 mg Niacin, 20 mg p-Aminobenzoesäure, 40 mg Pyridoxin·HCl, 20 mg Riboflavin und 40 mg Thiamin·HCl. Die Spurenelementmischung (1000 ml) wies 500 mg H&sub3;BO&sub3;, 40 mg CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 100 mg KI, 200 mg FeCl&sub3;·6H&sub2;O, 400 mg MnSO&sub4;·H&sub2;O, 200 mg Na&sub2;MoO&sub4;2H&sub2;O und 400 mg ZnSO&sub4;·7H&sub2;O auf.

A. Mutagen-Behandlung

a) 100 ml DYM-Glucose (1% Gew/Vol) mit 0,001% (Gew./Vol.) Acriflavin wurde mit Kluyveromyces marxianus ATCC 8608 geimpft und in einem Schüttler drei Tage gezüchtet. Die Zellen wurden geschleudert, mit 100 ml sterilem 0,9%igem NaCl gewaschen und erneut in 500 ml frischem YDP suspendiert. Die über Nacht gezüchteten Kulturen wurden weiterhin in DYM, das 2% Glucose enthielt, überführt, um in der Benomyl-Behandlung eingesetzt zu werden.
b) Für die Ethylmethansulfonat(EMS)-Mutagenese wurden die über Nacht auf YDP gezüchteten Kulturen geschleudert und auf eine Zelldichte von 2 · 10&sup9;/ml konzentriert. EMS wurde bis zur Endkonzentration von 30 mg/ml zugefügt, und die Suspension wurde für 2 Stunden 15 Minuten inkubiert. Diese Behandlung tötete etwa 70% der Hefe. 2 ml der mutagenisierten Zellsuspension wurden mit frischem YDP auf 100 ml verdünnt, für zwei Tage gezüchtet und dann in DYM, das Glucose enthielt, für die Benomylbehandlung überführt.
c) Entsprechend kann jede chemische oder physikalische Mutagenesemethode angewendet werden. Die Dosierung wird so optimiert, dass die Totesrate der Mikroben zwischen 10 und 100% liegt. Nach der Behandlung werdend die Mikroben in ein Kulturmedium oder eine Kulturstelle überführt, worin das Wachstum optimal ist. Dann fährt man mit Schritt B fort.

B. Benomyl-Behandlung

Zellen, die mit Acriflavin oder EMS mutagenisiert und nachfolgend in glusosehaltigem DYM gezüchtet wurden, wurden mittels Zentrifugieren geerntet und zu einem frischen YDP-Medium gefügt, so dass eine Zelldichte von 108/ml erhalten wurde. Benomyl (10 mg/ml) wurde in Dimethylsulfoxid gelöst, durch Filtration sterilisiert und in die Zellsuspension eingeführt, um eine End-Benomylkonzentration von 100 ug/ml zu ergeben. Die Kulturen wurden bei 30ºC für zwei Tage geschüttelt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren geerntet, zweimal mit sterilem 0,9%igem NaCl gewaschen und erneut in 5-fachem Volumen von frischem YDP suspendiert. Nach zweitägiger Inkubation wurden die Kulturen in glucosehaltiges DYM überführt, um zur Nystatin-Anreicherung eingesetzt zu werden. Die Wirksamkeit der Benomyl- Behandlung wurde mikroskopisch verfolgt, indem die Häufigkeit von Zellen mit zwei Kernen bestimmt wurde. Vor der mikroskopischen Untersuchung wurden die Hefezellen mit Essigsäure-Formaldehyd-Alkohol fixiert und mit HCl- Giemsa gefärbt, wie durch Streiblova detailliert in (Yeast, A Practical Approach, ed. I. Campbell und J. A. Duffus, IRL Press, Oxford (1988)) beschrieben. Entsprechend können einige andere Verbindungen, die die Chromosomenteilung oder die Mikrotobulusbildung beeinflussen, eingesetzt werden.

C. Antibiotika-Anreicherung

Auf Glucose gewachsene, mutagenisierte und mit Benomyl behandelte Zellen wurden geschleudert, mit einer Salzlösung gewaschen und erneut in DYM, das keine Kohlenstoffquelle enthielt, suspendiert, so dass eine Zelldichte von 107/ml erhalten wurde. Nach 8 bis 15 Stunden ohne Nährstoffe wurde 1 g Xylose pro 100 ml Zellsuspension zugefügt. Nystatin wurde in Ethanol suspendiert (1 mg/ml), um Mikroorganismen abzutöten (es kann aufgrund seiner geringen Löslichkeit nicht filtriert werden) Die Suspension wurde mit sterilem Wasser 1 : 10 verdünnt und 15 Stunden nach der Xylosezugabe zu den Kulturen zugefügt (10% Vol/Vol). Um den Abtötungseffekt zu fördern, wurde eine weitere Menge einer Kohlenstoffquelle zusammen mit dem Nystatin zugefügt. Die Inkubation wurde bei 30ºC in einem Schüttler für 2 weitere Stunden fortgesetzt, danach wurden die Zellen geerntet und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden dann im ursprünglichen Volumen des YDP-Mediums suspendiert. Nachdem die lebenden Hefezellen gewonnen wurden (1 bis 3 Tage), wurde die Kultur in DYM, das als einzige Kohlenstoffquelle Glucose enthielt, überführt. Die Todesrate während der Nystatin-Behandlung wurde durch Plattenzählung (YDP-Medium) vor und nach der Behandlung verfolgt; mehr als 99,999% der Zellen wurden abgetötet. In Abwesenheit einer Kohlenstoffquelle tötet das Nystatin 0 bis 40% der Zellen. Entsprechend kann ein anderes Antibiotikum, dessen Abtötungswirkung nur auf wachsende Zellen gerichtet ist, eingesetzt werden.

D. Regional ausgerichtete Mutagenese

Das Verfahren zum Klonen der Hefe-Xylit-Dehydrogenase wurde beschrieben (Kötter, P. et al., Curr. Genet. 18: 493-500 (1990)), ebenso ein Verfahren zum Klonen des Xylulosekinase-Gens aus verschiedenen Hefearten (Ho, N. W. Y. et al., Enzyme Microbiol. Technol. 11: 417-421 (1989); Stevis, E. P. et al., Applied and Environmental Microbiol. 53: 2975-2977 (1987)). Eine geeignete Quelle eines dominanten selektiven Markers für die integrative Transformation von Hefe ist z. B. das Plasmid pUT332 (Gatignol, A. et al., Gene 91: 35-41 (1990)). Der Einbau eines Plasmids, das den Phleomycin-Resistenzmarker enthält, in das Xylit-Dehydrogenase-Gen kann durch herkömmliche rekombinante DNA-Verfahren durchgeführt werden. Eine Vielzahl von Transformationsverfahren kann zur Einführung der mutierten Allele des Xylit-katabolisierenden Gens in das Hefechromosom genutzt werden, z. B. die Transformation von mit Lithiumchlorid behandelten Hefezellen oder die Transformation von Hefespheroplasten, die durch Auflösen von Hefezellwänden mit einem geeigneten Enzympräparat (z. B. Lyticase) hergestellt wurden. Für einige Hefestämme ist Elektroporation die bevorzugte Transformationsmethode. Die Transformanten werden auf den angereicherten Nährplatten, die 5 bis 20 ug Phleomycin pro ml enthalten, gesammelt und auf ihre Fähigkeit, Xylit zu synthetisieren untersucht.

E. Untersuchung der Mutanten

Potentielle Mutanten aus der Nystatin-Behandlung wurden auf DYM-Agar, das 100 mg Glucose und 10 g Xylose pro Liter enthielt, gegeben. Entsprechend bildeten die Mutanten, die nicht in der Lage waren, Xylose als Kohlenstoffquelle zu verwerten, nur kleine Kolonien. Xylosemetabolisierende Hefen waren hinsichtlich des verfügbaren Kohlenstoffes nicht eingeschränkt und wuchsen daher zu großen Kolonien. Kleine Kolonien wurden ausgelesen und auf YDP-Agar rekultiviert. Die Fähigkeit der isolierten Mutantenstämme auf Glucose, Xylose und Xylulose zu wachsen, wurde als erstes durch Züchten des Impfmaterials über Nacht im YDP- Flüssigmedium bestimmt. Ein Anteil der Kultur wurde dann in ein 25 ml DYM- Tartrat-Medium mit verschiedenen Kohlenstoffquellen (Glucose, Xylose oder Xylulose) überführt. Nach 2 oder 3 Tagen wurde das Wachstum der Mutanten und das der wilden Stämme bei A600 gemessen. Potentiell nützliche Mutanten wuchsen leicht auf Glucose, waren jedoch nicht in der Lage, Xylose zu verwerten. Die Stämme, die diese Eigenschaft aufwiesen, wurden zu weiteren Charakterisierung entnommen.
Die Mutantenstämme, die für weitere Studien ausgewählt wurden, wurden über Nacht im YDP-Medium kultiviert und dann in ein Medium überführt, das 0,5 bis 1,0% Glucose als Wachstumssubstrat und 1,0 bis 5,0% Xylose, das als Substrat für die Xylit-Produktion diente, enthielt. Die Kulturen wurden 3 und 7 Tage nach dem Beimpfen für die Zucker- und Zuckeralkohol-Analyse beprobt. Die Proben wurden durch 0,2 um Filter gegeben, um Zellen und Ausfällungen zu entfernen, die Filtrate wurde verdünnt und mittels HPLC analysiert. Die eingesetzte Säule war ein starker Kationenaustauscher in Ca²&spplus;-Form (Länge 25 cm, Durchmesser 8 mm), vorbehandelt mit Bio-Rad® Aminex MicroGuard (Richmond, CA, USA)-Entaschungspatronen, Die Temperatur der Säule betrug 85ºC, und sie wurde mit Wasser bei einer Geschwindigkeit von 0,6 ml/min eluiert. Das Injektionsvolumen betrug 10 ul und die Elution der Verbindungen wurde mittels eines RI-Detektors verfolgt. Das externe Standardverfahren wurde eingesetzt.
Auch Kluyveromyces marxianus, var. marxianus, z. B. Stamm CBSC12, var. bulgaricus, z. B. Stamm ATCC 16045, und var. lactis-Stämme, die Xylose verwerten, sind geeignete Ausgangsstämme. Entsprechend kann jede andere K. marxianus Unterart oder jeder andere K. marxianus Unterstamm, der auf Xylose wächst, für die Herstellung von Mutanten eingesetzt werden. Als erstes wird die Mutagenisierung des Hefestammes mit einem Mutagen optimiert. Durch Variation der Behandlungszeit oder Intensität (z. B. Konzentration des chemischen Mutagens, Intensität oder Abstand für UV- Bestrahlung), wird eine Abtötungsdosis für mehr als 10%, jedoch weniger als 100% der Organismen bestimmt. Die mutagenisierten Hefen werden in Gegenwart von Benomyl oder anderen Verbindungen, die die Mikrotubulus- Bildung beeinflussen (sublethale Konzentration) gezüchtet. Haploide Hefestämme benötigen keine Benomyl- oder äquivalente Behandlung. Die Kultur wird in ein frisches Nährmedium überführt, das eine Kohlenstoffquelle als Nährsubstrat einsetzt, die auch die gewünschten Mutanten wachsen lässt. Nachdem das Wachstum begonnen hat, werden die Zellen zum Fasten in ein Medium, das keine Kohlenstoffquelle enthält, überführt. Xylose oder Xylit und ein Antibiotikum (z. B. Nystatin), das die wachsenden Zellen abtötet, werden zugefügt. Die Konzentration des Antibiotikums und die Behandlungszeit werden im voraus dahingehend optimiert, dass die Behandlung in Gegenwart von Xylose etwa 100% der nicht mutagenisierten Zellen, jedoch ohne Kohlenstoffquelle weniger als 90% abtötet. Zellen, die auf Xylose oder Xylit wachsen, werden abgetötet, die gewünschten Mutanten bleiben jedoch am Leben. Mutanten der gewünschten Art werden aus den lebenden Zellen selektiert, wie oben beschrieben.
Die enzymatische Aktivität der Hefen und ihre Fähigkeit, Xylit zu produzieren, wurden in der in Beispielen 2 bis 4 beschriebenen Weise untersucht.

BEISPIEL 2

Enzymatische Aktivität des neuen Hefestammes

Die Aktivitäten der bedeutendsten Enzyme, die den Xylose/Xylit- Metabolismus beeinflussen, wurden für den Ausgangsstamm und die neuen Hefestämme folgendermaßen bestimmt.
Ein Stamm Kluyveromyces marxianus, der als Impfmaterial für einen Liter DYM-Tartrat-Medium mit 10 g Xylose und 20 g Glucose als Kohlenstoffquellen und/oder Induktoren eingesetzt wird, wurde über Nacht in 50 ml YDP-Medium gezüchtet. Nach 2 Züchtungstagen wurde die Kultur zentrifugiert, und die Pellets wurden mit Sorensen-Phosphatpuffer, pH 7, gewaschen, um restlichen Zucker zu entfernen. Die Zellen wurde im gleichen Puffer erneut suspendiert und aufgebrochen, indem sie fünfmal bei -20ºC durch eine X-Presse gegeben wurden. DNase-Typ I (50 mg/ml) wurde zum geschmolzenen Extrakt gefügt, und die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der erhaltene Rohextrakt wurde bei 185000 · g für 60 Minuten zentrifugiert. Die gesuchten Enzyme waren löslich und verblieben im Überstand. Die Proteinkonzentration wurde mittels des Lowry-Verfahrens bestimmt (J. Biol. Chem. 193 : 265-275 (1951)).
Die Xylose-Reduktase-Aktivität wurde spektrophotometrisch bei 340 nm durch Verfolgen der Oxidation von NADPH bestimmt. Die Reaktionsmischung enthielt 700 ul 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, 100 ul 100 mM Xylose, 100 ul eines verdünnten Zellextraktes und 100 ul 1 mM NADPH. Die Reaktion wurde durch Zufügen des reduzierten Nucleotids gestartet und für 2 Minuten verfolgt. Die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion wurde zur Bestimmung der spezifischen Xylose-Reduktase-Aktivität benutzt.
Die Xylit-Dehydrogenase-Aktivität wurde durch Verfolgen der Oxidation von NADH in NAD verfolgt, welche an die Reduktion von Xylulose zu Xylit gekoppelt ist. Die Untersuchung wurde ähnlich wie die Xylose-Reduktase- Untersuchung durchgeführt, mit der Ausnahme, dass anstelle von Xylose und NADPH Xylulose und NADH eingesetzt wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

BEISPIEL 3

Bildung von Xylit mit den neuen Hefestämmen

Die Fermentationen wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise in einem Schüttelgefäß unter Einsatz einer wässrigen Xylose-Lösung als Xylose- Quelle durchgeführt. Glucose wurde zur Fermentationslösung als Energie- und Kohlenstoffquelle zugefügt. Die Behälter wurden gerührt und wirksam belüftet.
Die mit dem Ausgangsstamm und den neuen mutierten Hefestämmen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Xylit-Dehydrogenase-Aktivitäten von Kluyveromyces marxianus-Stämmen, kultiviert in Schüttelbehältnissen
Die mit den Mutanten II-1 bis II-6 erhaltenen Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit einer Mutation des Xylulosekinase-Gens, da diese Wirtszellen noch Xylit-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen.

BEISPIEL 4

Xylit-Bildung in größerem Maßstab

Die Fähigkeit des Ausgangsstammes und der neuen Hefestämme, Xylit in einem Verfahren größeren Ausmaßes herzustellen, wurde auch untersucht. Alle für die Fermentation eingesetzten Chemikalien waren technisch rein. Pulpelösung aus Sulphitverfahren, die zwei verschiedene Hartholzarten einsetzen, wurde als Xylosequelle genutzt.
Das Impfmaterial wurde kultiviert, indem eine Hefekolonie in eine YM- Lösung (100 ml) überführt wurde, und die Kultur für einen Tag bei 30ºC in einem Schüttler (200 rpm) kultiviert wurde. Die Kultur wurde dann in ein mit 900 ml NH&sub4;- Tartrat gepuffertes Substrat, das einen pH von 6,0 aufwies und 30 g/l Glucose enthielt, überführt. Das Impfmaterial wurde erneut für einen Tag bei 30ºC in einem Schüttler (200 rpm) gezüchtet und dann aseptisch in einen Fermenter überführt.
Xylose, Xylit, Ethanol und Glucose wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch HPLC analysiert. Die Zellmasse wurde durch Trockengewichtmessung bestimmt. Die Fermentationslösung wurde zentrifugiert, die Zellmasse wurde mit Wasser gewaschen und über Nacht bei 105ºC getrocknet.
Die volumetrische Xylit-Produktionsrate wurde derart bestimmt, dass die Zeit, die für den Beginn des Xylose-Verbrauches notwendig ist, nicht berücksichtigt wurde. Die Xylit-Ausbeute wurde als Verhältnis von hergestelltem Xylit zu verbrauchter Xylose errechnet.
Folgende Fermentationsparameter wurden angewendet: pH 6,0 (25%ige NaOH), Rühren bei 500 rpm, Belüftung 4,0 Nl/min (vvm) und Temperatur 30ºC. Ein Nährmedium der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet:
240 g Glucose
250 g CSL (Getreidewaschlösung; 45,5% d.s.)
20 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;
20 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;
8 g KH&sub2;PO&sub4;
8 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O
5 Liter H&sub2;O
etwa 600 g / 5 Liter Xylose (12-13%)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Fähigkeit von Kluyveromyces marxianus-Stämmen in größerem Ausmaß Xylit herzustellen
Die spezifische Xylit-Herstellungsrate ist in Klammern angegeben (g Xylit/g Hefe).
Die Ergebnisse zeigen, dass die neuen Hefestämme hervorragende Xylit- Produzenten, verglichen mit dem Ausgangsstamm, sind.
Somit wurden unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens verschiedene mutierte Kluyveromyces marxianus-Stämme erhalten, die eine merklich verringerte spezifische Aktivität der Xylit-Dehydrogenase (XDH) oder der Xylulosekinase oder beider im Vergleich zu herkömmlichen Hefestämmen aufweisen, und die mehr Xylit aus Xylose produzieren können als diese.

BEISPIEL 5

Bildung von antisense-RNA-Hefestämmen durch rekominante DNA-Verfahren

Das Hefe-Xylit-Dehydrogenase-Gen oder das Xylulosekinase-Gen der gewünschten Hefewirtszelle kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren zum Klonen dieser Gene geklont werden (Kötter, P. et al., Curr. Genet. 18: 493-500 (1990); Ho, N. W. Y. et al., Enzyme Microbiol. Technol. 11: 417-421 (1989); Stevis, P. E. et al., Applied and Environmental Microbiol. 53: 2975-2977 (1987)). Alternativ kann ein geklontes Gen der Xylit-Dehydrogenase oder Xylulosekinase aus einer ersten Hefeart eingesetzt werden, um das Gen einer zweiten Hefeart zu identifizieren und zu klonen, sofern solche Gene ausreichend komplementär sind, so dass sie kreuzhybridisiert werden können, wie z. B. in vorläufigen Experimenten gezeigt, die geklonte DNA der ersten Hefewirtszellen als Sonde für die Hybridisierung mit restriktionsverdauter genomischer DNA der zweiten gewünschten Hefewirtszelle unter Einsatz der Southern-Blot-Analyse einsetzen.
Aus der geklonten DNA wird eine komplementäre Sequenz vorhergesagt, die mit der codierenden Sequenz des gewünschten Enzyms hybridisieren wird. Diese Sequenz kann in vitro chemisch synthetisiert werden, wie in Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, M. J. Gait, eds., IRL Press, Oxford, 1984, beschrieben. Die antisense-Sequenz kann auch ohne Kenntnis der genauen codierenden Sequenz aus jeder geklonten DNA erhalten werden, die auf die gewünschte Gensequenz gerichtet ist. Diese geklonte DNA ist bevorzugt in Doppelstrangform, worin ein Strang der "sense" (oder codierende)-Strang und ein Strang der "antisense" (oder nicht codierende)- Strang ist. Antisense-Konstrukte können unter Einsatz der oben beschriebenen Techniken und gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden, indem eine solche Doppelstrang-DNA so an den gewünschten Hefepromotor gekoppelt wird, dass die Transkription einer RNA, die eine antisense- Sequenz (nicht-codierend) besitzt, erfolgt. Die antisense-DNA wird bevorzugt an eine Sequenz gekoppelt, die den Hefe-Xylit-Dehydrogenase- Promotor oder den Hefe-Xylulosekinase-Promotor zur Verfügung stellt, so dass die Expression der antisense-RNA unter denjenigen Bedingungen stattfindet, unter denen die Expression der mRNA für das Zielenzym verläuft.
Solche antisense-Konstrukte können auf Vektoren zur Verfügung gestellt werden, in Hefewirtszellen, z. B. einer Hefe der Gattung Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia oder Pachysolen, und bevorzugt Kluyveromyces marxianus und Candida utilis, und besonders bevorzugt Kluyveromyces marxianus var. marxianus, Klyuveromyces marxianus var. bulgaricus und Klyuveromyces marxianus var. lactis, transformiert werden und auf einem Antibiotikum, z. B. wie vorangehend beschrieben Nystatin, gezüchtet werden. Die Hefen werden wie vorangehend beschrieben, gezüchtet und mutierte Stämme, die nicht in der Lage sind, Xylose für ihr Wachstum zu nutzen, oder die sehr schlecht auf Xylose wachsen, die jedoch in der Lage sind, auf Glucose zu wachsen, werden für weitere Untersuchungen ausgewählt.

BEISPIEL 6

Herstellung von Ribozym-Hefestämmen durch rekombinante DNA-Verfahren

Das Hefe-Xylit-Dehydrogenase-Gen oder das Xylulosekinase-Gen der gewünschten Hefewirtszelle kann gemäß der im Stand der Technik bekannten Verfahren geklont werden (Kötter, P. et al., Curr. Genet. 18: 493-500 (1990); Ho, N. W. Y. et al., Enzyme Microbiol. Technol. 11: 417-421 (1989); Stevis, P. E. et al., Applied and Environmental Microbiol. 53: 2975-2977 (1987)).
Alternativ kann ein geklontes Gen der Xylit-Dehydrogenase oder Xylulosekinase einer Hefeart eingesetzt werden, um das Gen aus einer anderen Hefeart zu identifizieren und zu klonen, falls solche Gene ausreichend komplementär sind, so dass sie kreuzhybridisiert werden können, z. B. wie in vorläufigen Experimenten, die geklonte DNA aus ersten Hefewirtszellen als Sonde für die Hybridisierung mit restriktionsverdauter genomischer DNA für die zweiten gewünschten Hefewirtszellen unter Einsatz der Southern-Blot-Analyse.
Eine komplementäre Sequenz wird aus der Sequenz der geklonten DNA vorhergesagt, die mit der kodierenden Sequenz des gewünschten Enzyms, wie mit dem antisense-RNA-Konstrukt, hybridisieren wird. Diese Sequenz kann in vitro chemisch synthetisiert werden, wie in Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, M. J. Gait, eds., IRL Press, Oxford, 1984, beschrieben ist. Solche DNA wird bevorzugt aus geklonter DNA in Doppelstrangform erhalten, worin ein Strang ein "sense" (oder codierender) Strang und ein Strang ein "antisense" (oder nicht codierender) Strang ist.
Das erfindungsgemäße Ribozym-Konstrukt enthält die katalytische Aktivität eines Ribozyms, wie Tetrahymena Ribozym, wie durch EP 321,201 offenbart, und eine ausreichende Länge einer antisense-RNA-Sequenz, die gegen die mRNA einer gewünschten Ziel-mRNA gerichtet ist, so dass das erfindungsgemäße antisense-RNA-Konstrukt mit der Ziel-mRNA hybridisiert und das Ribozym so platziert, dass die mRNA in eine Form gespalten wird, die zu klein ist, um ein aktives Enzym zu liefern.
Ribozym-Konsstrukte können unter Einsatz der oben beschriebenen Techniken und im Stand der Technik bekannten Techniken hergestellt werden, indem eine solche Doppelstrang-DNA in einer Weise an den gewünschten Hefepromotor gebunden wird, dass die Transkription der Ribozym-antisense- RNA erfolgt. Bevorzugt wird die Ribozym-antisense-DNA an eine Sequenz gebunden, die den Hefe-Xylit-Dehydrogenase-Promotor oder den Hefe- Xylulosekinase-Promotor zur Verfügung stellt, so dass die Expression der Ribozym-antisense-RNA unter den Bedingungen stattfindet, unter denen die Expression der mRNA des Zielenzyms verläuft.
Solche Ribozym-Konstrukte können auf Vektoren zur Verfügung gestellt werden, in Hefewirtszellen, z. B. einer Hefe der Gattung Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia oder Pachysolen, und bevorzugt Kluyveromyces marxianus und Candida utilis, und besonders bevorzugt Kluyveromyces marxianus var. marxianus, Klyuveromyces marxianus var. bulgaricus und Klyuveromyces marxianus var. lactis, transformiert werden und auf einem Antibiotikum, z. B. wie vorangehend beschrieben Nystatin, gezüchtet werden. Die Hefen werden wie voranstehend beschrieben gezüchtet, und mutierte Stämme, die nicht in der Lage sind, Xylose für ihr Wachstum zu nutzen, oder die sehr schlecht auf Xylose wachsen, jedoch in der Lage sind, auf Glucose zu wachsen, werden für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Xylit durch Hefewirtszellen, wobei das genannte Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a. Auswählen von Hefewirtszellen, die Xylit synthetisieren und metabolisieren können, wobei die genannten Hefewirtszellen aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Candida, Hansenula, Kluyveromyces und Pichia ausgewählt werden;

b. Modifizieren der Expression eines oder mehrerer Enzyme, die am genannten Xylit-Metabolismus in der genannten Hefe des Schrittes (a) beteiligt sind, so dass der genannte Metabolismus des genannten Xylits verringert oder ausgeschaltet wird;

c. Züchten der genannten Hefe des Schrittes (b) unter effektiven Belüftungsbedingungen zur Synthese und Anreicherung des genannten Xylits und

d. Gewinnen des genannten in Schritt (c) hergestellten Xylits.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Hefestämme nicht pathogen sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die genannte Modifikation des Schrittes (b) die Expression des Genes, das Xylit- Dehydrogenase oder Xylulosekinase oder sowohl Xylit-Dehydrogenase als auch Xylulosekinase codiert, ausschaltet oder verringert.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die genannte Modifikation des Schrittes (b) umfasst, dass die genannte Hefe einem Mutagen oder ein Mittel, das die Chromosomenteilung oder Mikrotubulus- Bildung beeinflusst, ausgesetzt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das genannte Mittel, das die Chromosomen-Teilung oder Mikrotubulus-Bildung beeinflusst Benomyl ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die genannte Modifikation des Schrittes (b) die Behandlung mit einem Mittel, das eine Insertion, eine Deletion oder eine Punktmutation in einem Gen der genannten Hefe verursacht, umfasst.

7. Verfahren gemäß Ansprüchen 4 bis 6, worin das genannte Mittel aus der Gruppe, bestehend aus Acriflavin, Ethylmethansulfonat, UV- Strahlung und Röntgenstrahlung ausgewählt wird.

8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 7, worin die genannte Modifikation des Schrittes (b) das Modifizieren der Fähigkeit der Hefewirtszellen ein oder mehrere Enzyme zu exprimieren, die am genannten Xylit-Metabolismus teilnehmen, durch genetische Verfahren, bevorzugt durch Genspaltung, umfasst.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, worin das genannte genetische Verfahren die Transformation der genannten Hefe des Schrittes (a) mit einem rekombinanten DNA-Konstrukt, das ein Ribozym oder eine antisense-RNA codiert, die gegen ein Enzym des genannten Xylit-Metabolismus gerichtet sind, umfasst.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die genannte Hefe aus der Gruppe, bestehend aus Kluyveromyces marxianus und Candida utilis ausgewählt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die genannte Kluyveromyces marxianus aus der Gruppe, bestehend aus Kluyveromyces marxianus var. marxianus, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus und Kluyveromyces marxianus var. lactis ausgewählt wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die genannten Hefen aus Mutanten ausgewählt werden, in denen das Xylulosekinase-Gen und/oder das Xylit-Dehydrogenase-Gen mutiert ist.

13. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12, worin das genannte Verfahren weiterhin das Züchten der genannten Hefe des Schrittes (b) in einem Antibiotikum, bevorzugt Nystatin, umfasst.

14. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 12, worin der genannte Schritt (b) weiterhin das Züchten und die Auswahl in einem xylosereichen und glucosearmen Nährmedium umfasst.

15. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 14, worin im Schritt (c) das Substrat eine xylosehaltige Lösung ist.

16. Modifizierter Hefestamm, der, verglichen mit dem entsprechenden natürlichen Hefestamm, eine verringerte Fähigkeit aufweist, Xylit zu metabolisieren, und in der Lage ist, Xylit in einem Medium anzureichern, das zur Züchtung des genannten Hefestammes eingesetzt wird, und der durch ein Verfahren hergestellt wird, das die folgenden Schritte umfasst:

a. Auswählen einer Hefe, die Xylit synthetisieren und metabolisieren kann, wobei die genannten Hefewirtszellen aus der Gruppe, bestehend aus den Gattungen Candida, Hansenula, Kluyveromyces und Pichia ausgewählt werden;

c. Züchten der genannten Hefe des Schrittes (b) unter Bedingungen, die die Auswahl der genannten Hefe erlauben.

17. Modifizierter Hefestamm gemäß Anspruch 16, worin die genannte Hefe aus der Gruppe, bestehend aus Kluyveromyces marxianus und Candida utilis ausgewählt wird.

18. Modifizierter Hefestamm gemäß Anspruch 17, worin die genannte Kluyveromyces marxianus aus der Gruppe, bestehend aus Kluyveromyces marxianus var. marxianus, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus und Kluyveromyces marxianus var. lactis ausgewählt wird.